JP2017193544A - 植物トランス活性化相互作用モチーフおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
ーフおよびその使用」である米国特許仮出願第61/594,245号の利益を主張する
。
の新規のまたは合成の転写因子相互作用モチーフを含むポリペプチド(例えば、融合タン
パク質)に関する。いくつかの実施形態は、対象の核酸を発現するまたは対象の核酸の発
現を増加させるそのようなタンパク質の使用に関する。いくつかの実施形態は、植物トラ
ンス活性化因子由来の新規のまたは合成転写因子相互作用モチーフを含むタンパク質をコ
ードするポリヌクレオチドに関する。特定の例は、本発明のポリペプチドまたはポリヌク
レオチドを含む宿主細胞、組織、および/または生物に関する。
に続くトランスジェニック植物の再生は、植物および植物材料の遺伝的改変を行うのに広
く使用されている。望ましい形質(例えば、改良された栄養価、増加した収量、有害生物
または疾患抵抗性、ストレス耐性、および除草剤抵抗性)を導入するための植物の遺伝子
形質転換は現在では一般的に使用されて、望ましい形質を発現する新たな改良されたトラ
ンスジェニック植物を生産している。DNAは典型的には、真核植物細胞の核または色素
体DNA中に無作為に導入され、次に細胞のDNAに組み込まれた前記DNAを含有する
細胞は単離され、これを使用して安定的に形質転換された植物細胞を生産する。多くの場
合、単一の植物種を遺伝的に操作して、複数のコード配列を導入することにより複数の導
入された形質を発現させるのが望ましく、この配列には類似する(または同一の)調節エ
レメントが含まれうる。
パク質−タンパク質相互作用を含む機構を通じて制御される。そのような相互作用を通じ
て、核酸調節エレメント(例えば、プロモーターおよびエンハンサー)は、構成的または
特異的な発現パターンをコード配列に与えることができる。例えば、プロモーターは、特
定の組織において、特定の発生期間中、または環境刺激に応答して、コード配列の増加し
た転写をもたらしうる。残念ながら、導入遺伝子発現に対する従来のプロモーターの固有
の属性により、宿主細胞においてそのプロモーターを使用して行使することができる発現
制御の範囲は制限される。従来のプロモーターの1つの実際的な制約は、プロモーター強
度の限界のために、および特に強いプロモーターまたは同じプロモーターの多くのコピー
の同一細胞内での同時使用による導入遺伝子発現のサイレンシングのために、導入された
遺伝子の発現レベルを微調整するのが難しいことである。内在性または天然の遺伝子の発
現を開始または増加させることが望ましいこともある。
るいくつかの異なるタンパク質(例えば、ヌクレオソーム再構築複合体、メディエーター
複合体、ならびにTFIIB、TBP、およびTFIIHなどの一般的転写因子)を動員
して、ヌクレオソームアセンブリ/ディスアセンブリ、プレ開始複合体形成、プロモータ
ークリアランス、および/または伸長速度に影響を与えることにより転写を開始するまた
は転写速度を増強することによって機能するタンパク質である。トランス活性化因子とそ
の結合パートナーのタンパク質−タンパク質相互作用は、「トランス活性化ドメイン(T
AD)」として知られるトランス活性化因子内の別々の内部構造エレメントを含む。TA
Dは、一次配列相同性をほとんど共有しておらず標的に結合した場合のみ明確な構造をと
ると考えられている(Sigler (1988) Nature 333:210-2)。TAD内の酸性および疎水性
残基は重要であると考えられている(例えば、Cress and Triezenberg (1991) Science 2
51(4989):87-90を参照されたい)が、活性への個々の残基の寄与は小さいと考えられてい
る(Hall and Struhl (2002) J. Biol. Chem. 277:46043-50)。
細胞においてウイルス前初期遺伝子の転写を刺激するように機能するトランス活性化因子
である。他のトランス活性化因子の場合と同じように、VP16は、高度に酸性であるそ
のTADを含む一連のタンパク質−タンパク質相互作用を通じて転写を活性化する。VP
16の酸性TADは、インビトロでもインビボでもいくつかのパートナータンパク質と相
互作用することが明らかにされている。例えば、VP16のTADは、TFIIHのTf
b1サブユニットと直接相互作用する相互作用モチーフを含有しており(Langlois et al
. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130:10596-604)、この相互作用は、ウイルス前初期遺伝子
の転写の開始と伸長期の両方を活性化するVP16の能力と相関関係にある。
質相互作用モチーフおよびそれをコードする核酸が本明細書では記載されている。これら
の新規の相互作用モチーフは合成TADにおいて利用されて、TADを含むポリペプチド
に遺伝子調節特性を与えうる。例えば、いくつかの実施形態には、DNA結合ドメインポ
リペプチドおよびそのようなTADポリペプチドを含む転写活性化因子融合タンパク質が
含まれる。転写活性化因子融合タンパク質においてTADに融合されている特定のDNA
結合ドメインに応じて、トランス活性化を使用して対象の遺伝子の発現を増加させうる。
例えば、DNA結合ドメインが結合する異種ポリヌクレオチドを対象の遺伝子に作動可能
に連結させ、それによって、その結合が対象の遺伝子の発現を増加させる融合タンパク質
(およびその機能的TAD)を標的化しうる。代わりに、DNA結合ドメインを、対象の
遺伝子に作動可能に連結されている、または近位にある内在性ポリヌクレオチドに結合す
るように操作しうる。転写活性化因子融合タンパク質が標的DNA結合部位に結合すると
、標的DNA結合部位に作動可能に連結されている遺伝子の転写が刺激されうる。
る核酸も本明細書に記載されている。いくつかの例では、合成バリアントTADタンパク
質−タンパク質相互作用モチーフは、1つまたは複数の変異(例えば、保存的変異、また
は相互作用モチーフのオルソログにおいて同定された変異)をトランス活性化因子(例え
ば、植物トランス活性化因子)のTAD中に導入することにより操作される。驚くべきこ
とに、このようにして作製され、バリアント相互作用モチーフを含む合成バリアントTA
Dは、転写活性化因子融合タンパク質におけるDNA結合ドメインに結合されると、非改
変TADとは異なる遺伝子調節特性を与えうる。例えば、バリアント相互作用モチーフを
含む特定の合成バリアントTADは、DNA結合ドメインを含む融合タンパク質において
同じ位置で発現される場合、天然に存在するTAD相互作用モチーフにより与えられる転
写活性化のレベルを増強しうる。
形態では、融合タンパク質は対象の遺伝子の転写を増加させることができ、融合タンパク
質は、TAD相互作用モチーフを含む第二のポリペプチドに作動可能に連結されたDNA
結合ドメインを含む第一のポリペプチドを含む。いくつかの例では、TAD相互作用モチ
ーフは、配列番号10〜16からなるTAD相互作用モチーフの群から選択しうる。例え
ば、限定せずに、TAD相互作用モチーフは、配列番号2〜8および配列番号100〜1
06からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むTAD内に含まれうる。いくつかの例
では、TAD相互作用モチーフは、例えば、限定せずに、配列番号17〜58からなる群
から選択されるアミノ酸配列を有するバリアントTAD相互作用モチーフであってもよい
。例えば、限定せずに、そのようなバリアントTAD相互作用モチーフは、配列番号10
7〜120からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むTAD内に含まれうる。
能に連結されたDNA結合ドメインを含む第一のポリペプチドを含む合成転写活性化因子
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。DNA結合ドメインポリペプ
チドは、特定の標的DNA結合部位に特異的に結合するいかなるDNA結合ドメインであ
ってもよい。例えば、限定せずに、DNA結合ドメインポリペプチドは、ジンクフィンガ
ーDNA結合ドメイン、UPA DNA結合ドメイン、GAL4、TAL、LexA、T
etリプレッサー、LacR、およびステロイドホルモン受容体からなる群から選択され
るポリペプチドであってもよい。特定の例では、DNA結合ドメインコード配列は、配列
番号67、配列番号68、および配列番号99からなる群から選択されうる。特定の例で
は、ポリヌクレオチドは、配列番号67、配列番号68、および配列番号99からなる群
から選択される配列に少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、または10
0%同一であるDNA結合タンパク質コード配列を含みうる。
配列を有するTAD相互作用モチーフまたはバリアントTAD相互作用モチーフをコード
するTAD相互作用モチーフコード配列を含みうる。特定の実施形態には、少なくとも1
つのTAD相互作用モチーフを含む転写活性化因子融合タンパク質をコードするポリヌク
レオチドが含まれる。特定の実施形態には、少なくとも1つのDNA結合ドメインを含む
転写活性化因子融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
ポリヌクレオチドの例には、DNA結合ドメインをコードする少なくとも1つのヌクレオ
チド配列およびTAD相互作用モチーフ(またはそのバリアント)をコードする少なくと
も1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれ、このポリヌクレオチドは、
例えば、限定せずに、配列番号79〜93、配列番号79〜93のうちの1つと実質的に
同一であるヌクレオチド配列、配列番号79〜93のうちの1つに少なくとも80%の配
列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号79〜93のうちの1つに少なくとも85
%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号79〜93のうちの1つに少なくと
も90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号79〜93のうちの1つに少
なくとも95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号79〜93のうちの1
つに少なくとも97%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号79〜93のう
ちの1つに少なくとも98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号79〜9
3のうちの1つに少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号7
9〜93のうちの少なくとも1つに特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレ
オチドの相補体、および配列番号79〜93のうちの少なくとも1つに特異的にハイブリ
ダイズすることができるポリヌクレオチドの逆相補体からなる群から選択される少なくと
も1つのヌクレオチド配列を含む。
ドは、例えば、宿主細胞においてタンパク質を発現させる組換えベクターに組み込むこと
ができる。したがって、いくつかの例には、本発明の少なくとも1つのポリヌクレオチド
を含むベクター、および/またはそのようなベクターが導入されている宿主細胞が含まれ
る。
で使用される場合、「植物遺伝子発現のトランス活性化のための手段」には、配列番号1
0、配列番号11、配列番号14、配列番号15、配列番号22、配列番号28、配列番
号46、および配列番号52からなる群から選択されるポリペプチドが含まれる。いくつ
かの実施形態では、植物遺伝子発現のトランス活性化のための少なくとも1つの手段を含
む合成タンパク質を使用して、植物細胞における対象の遺伝子の発現を調節することがで
きる。
れている。本明細書で使用される場合、「遺伝子発現を増加させるための、ERF2に由
来する手段」には、配列番号17〜22および配列番号121からなる群から選択される
ポリペプチドが含まれる。遺伝子発現を増加させるための、PTI4に由来する手段がさ
らに記載されている。本明細書で使用される場合、「遺伝子発現を増加させるための、P
TI4に由来する手段」には、配列番号23〜28および配列番号122からなる群から
選択されるポリペプチドが含まれる。遺伝子発現を増加させるための、AtERF1に由
来する手段がさらに記載されている。本明細書で使用される場合、「遺伝子発現を増加さ
せるための、AtERF1に由来する手段」には、配列番号29〜34および配列番号1
23からなる群から選択されるポリペプチドが含まれる。遺伝子発現を増加させるための
、ORCA2に由来する手段がさらに記載されている。本明細書で使用される場合、「遺
伝子発現を増加させるための、ORCA2に由来する手段」には、配列番号35〜40お
よび配列番号124からなる群から選択されるポリペプチドが含まれる。遺伝子発現を増
加させるための、DREB1Aに由来する手段がさらに記載されている。本明細書で使用
される場合、「遺伝子発現を増加させるための、DREB1Aに由来する手段」には、配
列番号41〜46および配列番号125からなる群から選択されるポリペプチドが含まれ
る。遺伝子発現を増加させるための、CBF1に由来する手段がさらに記載されている。
本明細書で使用される場合、「遺伝子発現を増加させるための、CBF1に由来する手段
」には、配列番号47〜52および配列番号126からなる群から選択されるポリペプチ
ドが含まれる。遺伝子発現を増加させるための、DOF1に由来する手段がさらに記載さ
れている。本明細書で使用される場合、「遺伝子発現を増加させるための、DOF1に由
来する手段」には、配列番号53〜58および配列番号127からなる群から選択される
ポリペプチドが含まれる。
明細書に記載されている。例では、合成転写活性化因子融合タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドを含む発現ベクターは、融合タンパク質の標的DNA結合部位に作動可能に
連結されている対象の遺伝子を含む宿主細胞(例えば、植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細
胞、および不死化細胞)内に導入しうる。宿主細胞において融合タンパク質が発現し、そ
れに続いて融合タンパク質が作動可能に連結された標的DNA結合部位に結合すると、対
象の遺伝子の転写が開始されるまたは転写が増加しうる。特定の例では、標的DNA結合
部位は、対象の遺伝子に作動可能に連結されるように宿主細胞内に導入することができる
。追加の例では、合成転写活性化因子融合タンパク質は、対象の遺伝子に作動可能に連結
されている標的DNA結合部位に結合するように操作されているDNA結合ドメインポリ
ペプチドを含みうる。
オチドを含むベクターは、このポリヌクレオチドが続いて(例えば、相同組換えを介して
)宿主細胞のゲノムDNA内に組み込まれるように宿主細胞内に導入することができる。
したがって、合成転写活性化因子融合タンパク質、およびさらにそれをコードする核酸は
トランスジェニック生物(例えば、トランスジェニック植物)内に含まれうる。したがっ
て、そのようなトランスジェニック生物も本明細書に記載されている。例では、合成転写
活性化因子融合タンパク質をコードする核酸は、トランスジェニック生物において細胞の
ゲノムに無作為に組み込まれても、または所定の位置で組み込まれてもよい。
象の遺伝子を発現するための方法がさらに記載されている。いくつかの実施形態では、合
成転写活性化因子融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、融合
タンパク質のための標的DNA結合部位に作動可能に連結されている対象の遺伝子を含む
宿主細胞に導入することができる。いくつかの例では、合成転写活性化因子融合タンパク
質は、植物遺伝子発現のトランス活性化のための手段を含む。ベクターが宿主細胞内に導
入された後、対象の遺伝子の発現が開始または増加され、それによって、例えば、融合タ
ンパク質の調節制御に従った量で、宿主細胞において対象の遺伝子の発現産物を産生する
ことができる。そのような発現産物は、当技術分野で公知の任意の方法に従って宿主細胞
から単離および/または精製することができる。
細な説明からさらに明らかになる。
添付の配列表に収載されている核酸配列は、37C.F.R.§1.822に定義され
る通りに、ヌクレオチド塩基を表す標準文字省略形を使用して示されている。それぞれの
核酸配列の1つの鎖のみが示されているが、その相補鎖は表示されている鎖への任意の参
照により含まれると理解されている。添付の配列表では:
メインを示している:GMTHDPVSYGALDVDDFEFEQMFTDALGIDDFGG
メインを示している:NDSEDMLVYGLLKDAFHFDTSSSDLSCLFDFPA
メインを示している:CLTETWGDLPLKVDDSEDMVIYGLLKDALSVGWSPFSFTAG
化ドメインを示している:CFTESWGDLPLKENDSEDMLVYGILNDAFHGG
ドメインを示している:FNENCEEIISPNYASEDLSDIILTDIFKDQDNYEDE
化ドメインを示している:GFDMEETLVEAIYTAEQSENAFYMHDEAMFEMPSLLANMAEGM
メインを示している:EQSEGAFYMDEETMFGMPTLLDNMAEG
メインを示している:SAGKAVLDDEDSFVWPAASFDMGACWAGAGFAD
ンのサブドメインIIを示している:DDFEFEQMFTD
:DAFHFDTSSSD
:DDSEDMVIYGLLKD
いる:ENDSEDMLV
る:EDLSDIILTD
いる:ENAFYMHDEAMFEMP
:DEETMFGMP
:EDSFVWPAASFD
ーフ配列を示している。
ーフ配列を示している。
モチーフ配列を示している
チーフ配列を示している
モチーフ配列を示している
ーフ配列を示している
ーフ配列を示している
るプライマーを示している。
GTGGGAGAGGAGGGTGG
TGGTGGGAGAGGAGGGTGGGAGTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGCTCTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGAGATGTGGTGGGA
GAGGAGGGTGGTCTTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGGGATGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGCCTTGTGGTGGGAGAGGAGGG
TGGAGGTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGCTTAAGCCGC
マーおよびプローブを示している。
マーを示している。
然の植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌクレオチド配列を
示している:GGCATGACCCATGATCCTGTGTCTTATGGAGCCTTGGATGTTGATGACTTTGAGTTTGAGCAGATGTT
CACAGATGCACTGGGCATCGATGACTTTGGTGGA
然の植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌクレオチド配列(
v3)を示している:AATGACTCTGAGGACATGCTGGTGTATGGTTTGCTCAAGGATGCCTTTCACTTTGACACC
TCCAGCTCAGACCTCTCCTGCCTCTTTGACTTCCCAGCC
然の植物トランス活性化相互作用モチーフをコードする合成ヌクレオチド配列(v3)を
示している:TGCCTGACAGAAACTTGGGGAGACTTGCCTCTCAAGGTTGATGACTCTGAGGACATGGTGATCTATGG
TCTGTTGAAGGATGCACTCTCAGTGGGGTGGTCCCCATTCTCTTTCACGGCTGGT
の天然の植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌクレオチド配
列(v3)を示している:TGCTTCACGGAATCCTGGGGAGACCTTCCTTTGAAGGAGAATGACTCTGAGGACAT
GTTGGTGTACGGAATCCTCAATGATGCTTTTCATGGTGGC
天然の植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌクレオチド配列
(v3)を示している:TTCAATGAGAATTGTGAAGAAATCATCTCTCCAAACTACGCATCAGAGGACTTGTCTG
ACATCATCTTGACGGACATCTTCAAGGACCAAGACAACTATGAGGATGAG
の天然の植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌクレオチド配
列(v3)を示している:GGCTTTGACATGGAAGAAACATTGGTGGAGGCCATCTACACTGCTGAACAGAGCGA
GAATGCCTTCTACATGCATGATGAGGCAATGTTTGAGATGCCATCTCTTCTGGCCAACATGGCTGAGGGAATG
然の植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌクレオチド配列(
v3)を示している:GAACAGTCAGAAGGTGCTTTCTACATGGATGAAGAGACCATGTTTGGGATGCCAACCCTT
CTGGATAACATGGCAGAGGGA
然の植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌクレオチド配列(
v3)を示している:TCAGCTGGGAAGGCAGTCTTGGATGATGAGGACAGCTTTGTTTGGCCTGCTGCATCCTTT
GACATGGGTGCCTGCTGGGCTGGAGCTGGCTTTGCTGAC
示的なバリアント植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌクレ
オチド配列(v2)を示している:AATGACTCTGAGGACATGCTGGTGTATGGTTTGCTCAAGGATGATTTC
CACTTTGAGACAATGTTCTCAGACCTGTCCTGCCTCTTTGACTTCCCAGCC
示的なバリアント植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌクレ
オチド配列(v2)を示している:TGCCTGACAGAAACTTGGGGAGACTTGCCTCTCAAGGTTGATGACTTT
GAGTTTGAGATGATGTTCACAGATGCACTCTCAGTGGGGTGGTCCCCATTCTCTTTCACGGCTGGT
の例示的なバリアント植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌ
クレオチド配列(v2)を示している:TGCTTCACGGAATCCTGGGGAGACCTTCCTTTGAAGGAGAATGA
CTTTGAGTTTGAAATGTTCACAGATTACGGAATCCTCAATGATGCTTTTCATGGTGGC
例示的なバリアント植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌク
レオチド配列(v2)を示している:TTCAATGAGAATTGTGAAGAAATCATCTCTCCAAACTACGCATCAG
AGGACTTTGATCTTGAGATGTTGACGGACATCTTCAAGGACCAAGACAACTATGAGGATGAG
の例示的なバリアント植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌ
クレオチド配列(v2)を示している:GGCTTTGACATGGAAGAAACATTGGTGGAGGCCATCTACACTGC
TGAACAGAGCGAGGACTTTGAGTTTGAAGCAATGTTCATGGATTCTCTTCTGGCCAACATGGCTGAGGGAATG
示的なバリアント植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌクレ
オチド配列(v2)を示している:GAACAGTCAGAAGGTGCTTTCTACATGGATGACTTTGAGTTCGAGACA
ATGTTCATGGACACCCTTCTGGATAACATGGCAGAGGGA
示的なバリアント植物トランス活性化ドメイン相互作用モチーフをコードする合成ヌクレ
オチド配列(v2)を示している:TCAGCTGGGAAGGCAGTCTTGGATGATGAGGACTTTGAGTTTGAAGCC
ATGTTCACGGACATGGGTGCCTGCTGGGCTGGAGCTGGCTTTGCTGAC
ライマーおよびプローブを示している。
A DNA結合ドメインと名付けられた直列型反復配列を示している:TATATAAACCTNNCCC
TCT
を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDVDAFHFDTSSSDA
LGIDDFGG
を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDVDDSEDMVIYGLL
KDALGIDDFGG
部)を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDVENDSEDML
VALGIDDFGG
)を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDVEDLSDIILTD
ALGIDDFGG
部)を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDVENAFYMHD
EAMFEMPALGIDDFGG
を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDVDEETMFGMPALG
IDDFGG
を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDVEDSFVWPAASFD
ALGIDDFGG
(下線部)を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDVDD
FHFETMFSDALGIDDFGG
(下線部)を含む追加の例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:NDSEDMLVYG
LLKDDFHFETMFSDLSCLFDFPA
(下線部)を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDVDD
FEFEMMFTDALGIDDFGG
(下線部)を含む追加の例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:CLTETWGDLP
LKVDDFEFEMMFTDALSVGWSPFSFTAG
ーフ(下線部)を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGAL
DVENDFEFEMFTDALGIDDFGG
ーフ(下線部)を含む追加の例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:CFTESW
GDLPLKENDFEFEMFTDYGILNDAFHGG
フ(下線部)を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDV
EDFDLEMLTDALGIDDFGG
フ(下線部)を含む追加の例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:FNENCEEI
ISPNYASEDFDLEMLTDIFKDQDNYEDE
ーフ(下線部)を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGAL
DVEDFEFEAMFMDALGIDDFGG
ーフ(下線部)を含む追加の例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GFDMEE
TLVEAIYTAEQSEDFEFEAMFMDSLLANMAEGM
(下線部)を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDVDD
FEFETMFMDALGIDDFGG
(下線部)を含む追加の例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:EQSEGAFYMD
DFEFETMFMDTLLDNMAEG
(下線部)を含む例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:GMTHDPVSYGALDVED
FEFEAMFTDALGIDDFGG
(下線部)を含む追加の例示的な合成トランス活性化ドメインを示している:SAGKAVLDDE
DFEFEAMFTDMGACWAGAGFAD
配列を示している。
新規の植物トランス活性化ドメイン(TAD)、TAD相互作用モチーフならびに転写
活性化因子として有用である可能性があり、対象の遺伝子の転写活性化のために合成転写
活性化因子融合タンパク質においてDNA結合ポリペプチドと融合しうる前述の合成バリ
アントが本明細書で開示される。本明細書で開示される特定の新規の植物TADおよびT
AD相互作用モチーフは、植物タンパク質であるERF2、PTI4、AtERF1、O
RCA2、DREB1A、CBF1およびDOF1から単離された。本明細書に記載され
る新規の植物TADおよび/またはTAD相互作用モチーフを含む合成転写活性化因子融
合タンパク質は、遺伝子発現を増加させる(例えば、開始させる)ために特定の実施形態
において、種々の細胞(例えば、酵母細胞および植物細胞)において事実上どんな遺伝子
のためにも利用することができる。
様々な異種DNA結合ドメインの1つに融合されると、およびプロモーター領域の異なる
位置に繋ぎ止められると、転写を調節することができる。Hall and Struhl (2002)、上記
。TADは、一次配列相同性をほとんど共有しておらず、標的に結合した場合にのみ明確
な構造をとると考えられている。Sigler (1988)、上記。TAD内の酸性および疎水性残
基は重要であると考えられている(例えば、Cress and Triezenberg (1991)、上記を参照
されたい)が、活性への個々の残基の寄与は小さいと考えられている。Hall and Struhl
(2002)、上記。
強するように機能するかどうかを先験的に予測するのは困難である。このように予測不可
能であることは、少なくとも一部が、一部のTADがその細胞内濃度とそのTADの強度
の両方の機能として「スケルチング(squelching)」をもたらす(例えば、細胞転写機構
の構成成分を滴定することにより)ことがある非常に強力なトランス活性化因子であるこ
との結果でありうる。例えば、米国特許第6,271,341号(段階的遺伝子調節の変
異VP16 TAD)を参照されたい。
作用モチーフはその制御下の遺伝子に非常に異なるレベルの調節を与えるという予想外の
知見が本明細書で開示される。TADを「交換(swapping)」するための一般化可能な戦
略を使用して合成転写活性化因子融合タンパク質を産生すると、驚くべきことに、PTI
4、DREB1A、ERF2およびCBF1から単離される新規のTADおよびTAD相
互作用モチーフは、当技術分野で非常に優れたトランス活性化因子と認識されているVP
16により与えられるよりも、植物細胞において遺伝子転写を大きく増加させることがで
きることが見出された。AtERF1、ORCA2、およびDOF1由来の新規のTAD
およびTAD相互作用モチーフが与える遺伝子転写の増加は少ないことも見出された。
D相互作用モチーフは、天然のTADにより示される遺伝子調節特性をさらに増強または
調整することができるという予想外の知見も本明細書で開示される。例えば、驚くべきこ
とに、バリアントERF2およびCBF1 TAD相互作用モチーフは、植物における対
応する天然の相互作用モチーフよりもその制御下にある遺伝子の顕著に多くの転写をもた
らすことが見出された。
chs カルコンシンターゼ遺伝子
HAS 高親和性部位
HP 加水分解プローブ
HSV 単純ヘルペスウイルス(Herpes Simplex Virus)
MS ムラシゲおよびスクーグ
PNPG p−ニトロフェニル−アルファ−D−グルコピラノシド
PTU 植物転写ユニット
SSC 生理食塩水−クエン酸ナトリウム
TAD トランス活性化ドメイン
TBP TATA−結合タンパク質
T−DNA トランスファーDNA
TFIIB 転写因子IIB
TFIIH 転写因子IIH
Ti 腫瘍誘導(A.ツメファシエンス(A. tumefaciens)由来プラスミド)
UAS 上流活性化配列
VP16 単純ヘルペス(Herpes Simplex)ビリオンタンパク質16
本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、特定の用語について以下に説明す
る。
は細胞内を起源とする物質(例えば、核酸分子およびポリペプチド)のことである。例え
ば、植物細胞において発現される「内在性」ポリペプチドとは、同一種の遺伝的に操作さ
れていない植物と同じ種類の細胞において正常に発現されるポリペプチドのことであって
もよい。同様に、植物細胞に含まれる「内在性」核酸とは、同一種の遺伝的に操作されて
いない植物と同じ種類の細胞において正常に存在する核酸(例えば、ゲノムDNA)のこ
とであってもよい。
「発現」とは、核酸転写単位(例えば、ゲノムDNAまたはcDNAを含む)のコード情
報が細胞の作動的、非作動的、または構造的部分(例えば、タンパク質)に変換されるプ
ロセスのことである。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、そこに含まれる遺伝子の発
現を増加または減少させる作用物質への細胞、組織、または生物の曝露により影響を受け
る可能性がある。遺伝子の発現は、DNAからRNAからタンパク質への経路中のどの場
所でも調節することができる。例えば、転写、翻訳、RNA輸送およびプロセシング、m
RNAなどの中間分子の分解に作用する制御を通じて、または産生された後の特定のタン
パク質分子の活性化、不活性化、区画化、もしくは分解を通じて、または前述のいずれの
組合せによっても遺伝子発現の調節は起こる。遺伝子発現は、限定せずに、ノーザンブロ
ット、RT−PCR、ウェスタンブロット、およびインビトロ、インサイツ、またはイン
ビボタンパク質活性アッセイ(複数可)を含む、当技術分野で公知の方法によりRNAレ
ベルでまたはタンパク質レベルで測定することが可能である。
の開始、ならびに鋳型構築物から産生される発現産物の量の量的増加のことである。いく
つかの実施形態では、TADを含むポリペプチドを使用して核酸からの「発現を増加させ
る」ことができる。そのような実施形態では、発現の増加は、対照において(例えば、植
物トランス活性化ドメインを含むタンパク質の非存在下で構築物から)産生される発現産
物の量と比較することにより決定しうる。
も2つの作動可能に連結されたポリペプチドを含む分子のことである。ある種の例では、
この2つの作動可能に連結されたポリペプチドは(例えば、異なる生物において)異なる
遺伝子産物の一部として正常に発現しうる。追加の例では、この少なくとも2つの作動可
能に連結されたポリペプチドは、異なる遺伝子産物の一部として正常に発現されるポリペ
プチドに由来していてもよい。本明細書に記載される融合タンパク質に存在する作動可能
に連結されたポリペプチドは、典型的には融合タンパク質が発現されることになっている
細胞において少なくとも1つの標的タンパク質または核酸と相互作用をする。例えば、作
動可能に連結されたポリペプチドは、細胞転写機構の1つまたは複数の転写因子(複数可
)もしくはタンパク質性エレメント(複数可)と相互作用してもよいし、または特定のポ
リペプチドもしくは核酸の構造エレメントと相互作用してもよい。
たは細胞内を起源としない物質(例えば、核酸分子およびポリペプチド)のことである。
例えば、植物細胞において発現される「異種」ポリペプチドとは、同一種の遺伝的に操作
されていない植物とは同じ種類の細胞において正常に発現されないポリペプチド(例えば
、同じ生物の異なる細胞または異なる生物の細胞において発現されるポリペプチド)であ
ってもよい。
が天然に存在する生物の細胞における他の生体成分(例えば、他の染色体および染色体外
DNAおよびRNA、ならびにタンパク質)から実質的に分離されている、別個に産生さ
れている、またはそれから離れて精製されていて、同時に前記成分の化学的または機能的
変化をもたらす(例えば、核酸は、この核酸と染色体中の残りのDNAを結びつけている
化学結合を切断することにより染色体から単離されてもよい)。「単離」されている核酸
分子およびタンパク質は、標準精製法により精製された核酸分子およびタンパク質を含ん
でいてもよい。この用語は、宿主細胞において組換え発現により調製される核酸およびタ
ンパク質、ならびに化学的に合成される核酸分子、タンパク質、およびペプチドを包含す
る。
ドであってよく、これにはRNA、cDNA、ゲノムDNAのセンス鎖とアンチセンス鎖
の両方ならびに上記の合成型および混合ポリマーが含まれていてもよい。ヌクレオチドと
は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチ
ドの改変型のことであってもよい。本明細書で使用される「核酸分子」は「核酸」および
「ポリヌクレオチド」と同義である。核酸分子は、他に特に規定されていなければ、通常
少なくとも10塩基長である。この用語には、一本鎖および二本鎖型のDNAが含まれる
。核酸分子は、天然に存在するおよび/または天然には存在しないヌクレオチド連鎖によ
り互いに連結された天然に存在するヌクレオチドと改変されたヌクレオチドのいずれかま
たは両方を含むことができる。
関してならびにアミノ酸配列および/またはポリペプチドの細胞局在に関して特定の系(
例えば、生殖質、変種、優良変種、および/または植物)を原産としない分子である。実
施形態では、外来性もしくは異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、生体系(例え
ば、植物細胞、植物遺伝子、特定の植物種もしくは変種および/または植物染色体)に人
為的に供給されておりその特定の生体系を原産としない分子であってもよい。したがって
、核酸を「外来性」と指定することは、核酸が天然に存在する供給源以外の供給源を起源
としたことを示していてもよく、または核酸が、天然にはない立体配置、遺伝子位置、も
しくはエレメントの配置を有することを示していてもよい。
いて通常見出される染色体または他の遺伝物質に通常存在する核酸エレメント以外の核酸
エレメントを含有しない核酸(例えば、遺伝子)である。内在性遺伝子転写物は、その天
然の染色体遺伝子座でヌクレオチド配列によりコードされており、細胞に人為的に供給さ
れてはいない。
されていることもあれば、または非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含
有していることもある。そのような改変には、例えば、標識、メチル化、天然に存在する
ヌクレオチドのうちの1つまたは複数の類似物での置換、ヌクレオチド間改変(例えば、
非荷電連鎖、例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミド酸、カル
バミン酸、等;荷電連鎖、例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸、等;懸垂部分、
例えば、ペプチド;インターカレーター、例えば、アクリジン、ソラレン、等;キレータ
ー;アルキル化剤;および改変連鎖、例えば、アルファーアノマー核酸、等)が含まれる
。用語「核酸分子」には、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン、環状、お
よびパドロック(padlocked)立体構造を含む、任意のトポロジー立体構造も含まれる。
オチドは比較的短い核酸分子であり、典型的には50またはそれよりも少ない核酸塩基を
含む(しかし、一部のオリゴヌクレオチドは50を超える核酸塩基を含みうる)。オリゴ
ヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチド配列を含むより長い核酸の切断(例えば、制限
消化)により形成されることもあれば、または個々のヌクレオシドホスホロアミダイトか
ら、配列特異的に化学的に合成されることもある。
ーブ配列として使用することができる。前述の内容に従えば、オリゴヌクレオチドプロー
ブは合成的にまたはクローニングにより調製してもよい。適切なクローニングベクターは
当業者には公知である。オリゴヌクレオチドプローブは標識されていてもよいし非標識で
もよい。例えば、限定せずに、ニックトランスレーションによる放射標識、ランダムプラ
イミング、および末端デオキシトランスフェラーゼでのテーリング(tailing)を含む、
核酸分子を標識するための多種多様の技法が存在し、用いられるヌクレオチドは、例えば
、放射性32Pで標識される。使用することができる他の標識には、例えば、限定せずに
、フルオロフォア、酵素、酵素基質、酵素補因子、および酵素阻害剤が含まれる。代わり
に、単独でまたは他の反応性薬剤と併せて、検出可能なシグナルを発生する標識の使用は
、受容体が結合するリガンドで置き換えてもよく、受容体は単独または他の試薬と併せて
のいずれかで、検出可能なシグナルを発生するように標識されている(例えば、上記の標
識により)。例えば、Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9を参
照されたい。
可能である」または「特異的に相補的である」ポリヌクレオチドが含まれる。「特異的に
ハイブリダイズ可能である」および「特異的に相補的である」は、ポリヌクレオチドと特
定のヌクレオチド標的配列を含む核酸分子との間で安定した特異的結合が起こる程度の十
分な相補性を示す用語である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにそ
の標的配列に100%相補的である必要はない。核酸分子は、特異的結合が望ましい条件
下で、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非標的配列への核
酸の非特異的結合を回避する程度の十分な相補性がある場合には特異的にハイブリダイズ
可能である。
ブリダイゼーション法の性質およびハイブリダイズする核酸配列の組成と長さに応じて変
化する。一般的には、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーションバッフ
ァーのイオン強度(特に、Na+および/またはMg++濃度)がハイブリダイゼーショ
ンのストリンジェンシーに寄与するが、洗浄回数もストリンジェンシーに影響する。特定
のストリンジェンシー度を得るのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は当
業者には公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laborato
ry Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring H
arbor, NY, 1989, chapters 9 and 11;およびHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid H
ybridization, IRL Press, Oxford, 1985で考察されている。核酸のハイブリダイゼーシ
ョンに関するさらに詳細な指示と手引きは、例えば、Tijssen, “Overview of principle
s of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” in Laborator
y Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic A
cid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993;およびAusubel et al., Eds., Cu
rrent Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Int
erscience, NY, 1995に見ることができる。
分子とDNA標的の間のミスマッチが25%未満である場合にのみハイブリダイゼーショ
ンが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は特定レベルのストリンジェン
シーをさらに含む。したがって、本明細書で使用される場合、「穏やかなストリンジェン
シー」条件は、配列ミスマッチが25%を超える分子ではハイブリダイズしない条件であ
り、「中間のストリンジェンシー」はミスマッチが15%を超える分子ではハイブリダイ
ズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」の条件はミスマッチが10%を超える配
列ではハイブリダイズしない条件である。「超高ストリンジェンシー」の条件は、ミスマ
ッチが6%を超える配列ではハイブリダイズしない条件である。
スハイブリダイゼーションバッファー(Sigma−Aldrich)中65℃で1時間
のハイブリダイゼーション、続いて0.1×SSC/0.1%SDS中65℃での40分
間連続洗浄である。
クレオチド配列と機能的な関係がある場合、第二のヌクレオチド配列とまたは第二のヌク
レオチド配列に「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターは、それがコード
配列の転写または発現に影響を与える場合コード配列に作動可能に連結されている。組換
え産生される場合、作動可能に連結されたヌクレオチド配列は一般に連続しており、必要
に応じて同一リーディングフレームにおいて2つのタンパク質コード領域を結合させる。
しかし、ヌクレオチド配列は作動可能に連結されるのに連続している必要はない。
れる場合、調節配列は連結されたコード配列の発現に影響を与えることを意味する。「調
節配列」または「制御エレメント」とは、転写の時機およびレベル/量、RNAプロセシ
ングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列
のことである。従来の調節配列は、5’非翻訳領域、プロモーター、翻訳リーダー配列、
イントロン、エンハンサー、ステムループ構造、リプレッサー結合配列、終止配列、ポリ
アデニル化認識配列、等を含みうる。特定の調節配列は、それに作動可能に連結されたコ
ード配列の上流および/または下流に位置していることがある。さらに、コード配列に作
動可能に連結された特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖上に位置しうる
。コード配列に「作動可能に連結」しうるエレメントは、プロモーターまたは他の従来の
調節配列に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、トランス活性化タンパク質
のDNA結合ドメインは、トランス活性化タンパク質がプロモーターもしくは他の調節領
域、またはそれに結合している分子(例えば、転写因子)と相互作用して転写に影響を与
えるように、プロモーターまたは他の調節領域の近位にあるヌクレオチド配列に結合して
もよい。そのような例では、トランス活性化タンパク質がそのDNA結合ドメインを通じ
て結合しているヌクレオチド配列は、プロモーターまたは他の調節配列の制御下でコード
配列に「作動可能に連結」している。
用語「作動可能に連結した」とは、単一分子(例えば、融合タンパク質)に、それぞれの
ポリペプチドがその意図される機能を果たすことができるように繋がっている少なくとも
2つのポリペプチドのことである。典型的には、この少なくとも2つのポリペプチドはペ
プチド結合を通じて共有結合している。作動可能に連結されたポリペプチドを含む融合タ
ンパク質は、標準組換えDNA技法により産生することができる。例えば、第一のポリペ
プチドをコードするDNA分子は第二のポリペプチドをコードする別のDNA分子にライ
ゲーションされていてよく、こうして得られるハイブリッドDNA分子は宿主細胞におい
て発現され、第一および第二のポリペプチドを含む融合タンパク質を産生することができ
る。特定の例では、この2つのDNA分子は、ライゲーション後に、コードされたポリペ
プチドの翻訳フレームが変更されない(すなわち、DNA分子がインフレームで互いにラ
イゲーションされている)ように、5’から3’方向に互いにライゲーションすることが
できる。
、転写開始の上流にあり、RNAポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に
関与して転写をもたらすことができる領域のことである。プロモーターは細胞内での発現
のためにコード配列に作動可能に連結していてもよく、またはプロモーターは、細胞内で
の発現のためにコード配列に作動可能に連結されていてもよいシグナル配列をコードする
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されていてもよい。「植物プロモーター」は植物細胞
において転写を開始することができるプロモーターであってよい。
種子、繊維、木部導管、仮導管、または厚壁組織において優先的に転写を開始するプロモ
ーターが含まれる。そのようなプロモーターは、「組織優先的(tissue-preferred)」と
呼ばれる。ある特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは「組織特異的」と
呼ばれる。「細胞型特異的」プロモーターは主として、1つまたは複数の器官中のある特
定の細胞型において、例えば、限定せずに、根または葉中の血管細胞において転写をもた
らす。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターには、ファゼオリン遺伝子由来
のプロモーターなどの根優先的プロモーター、キャブまたはルビスコ由来のプロモーター
などの葉特異的光誘導プロモーター、LAT52由来のプロモーターなどの葯特異的プロ
モーター、Zm13由来のプロモーターなどの花粉特異的プロモーター、およびapg由
来のプロモーターなどの小胞子優先的プロモーターが含まれるが、これらに限定されない
。
et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366を参照されたい。誘導性プロモーターによ
り転写を開始することができる環境条件の例には、例えば、限定せずに、嫌気性条件およ
び光の存在が含まれる。誘導性プロモーターを使用すれば、転写速度は誘導物質に応答し
て増加する。例示的な誘導性プロモーターには、銅に応答するACEI系由来のプロモー
ター、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤(herbicide safener)に応答するトウモロ
コシ由来のIn2遺伝子、Tn10由来のTetリプレッサー、およびその転写活性が糖
質コルチコステロイドホルモンにより誘導することができるステロイドホルモン遺伝子由
来の誘導性プロモーター(Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421
)が含まれるが、これらに限定されない。
プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターは、大半の環境条件下で活性
であることができるプロモーターである。例示的な構成的プロモーターには、CaMV由
来の35Sプロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター、イネアクチン遺伝子由
来のプロモーター、ユビキチンプロモーター、pEMU、MAS、トウモロコシH3ヒス
トンプロモーター、およびALSプロモーター、セイヨウアブラナ(Brassica napus)A
LS3構造遺伝子の5’側Xbal/NcoI断片(または前記Xbal/NcoI断片
へのヌクレオチド配列類似性)(国際PCT出願第WO96/30530号)が含まれる
が、これらに限定されない。
おいて利用することができる。例えば、合成転写活性化因子融合タンパク質の活性により
調節されることになる遺伝子を提供することができ(例えば、宿主細胞において)、この
遺伝子はプロモーターに作動可能に連結されている。
れる用語「配列同一性」または「同一性」とは、指定された比較ウィンドウにわたり最大
一致になるようにアライメントさせた場合同じである2つの配列中の残基のことであって
もよい。
って2つの最適に整列された配列(例えば、核酸配列およびアミノ酸配列)を比較するこ
とにより決定される値のことであってもよく、比較ウィンドウにおける配列の一部は、こ
の2つの配列の最適アライメントの基準配列(付加も欠失も含まない)と比べた場合、付
加または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでいてもよい。百分率は、同一のヌクレオチ
ドまたはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して適合する位置の数を出
し、適合する位置の数を比較ウィンドウの位置の総数で割って、その結果に100を掛け
て、配列同一性の百分率を出すことにより計算される。
なプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981)
Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearso
n and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (19
88) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988
) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-
65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FE
MS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列アライメント法および相同性計
算の詳細な検討は、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に見出
すことができる。
nment Search Tool(BLAST(商標)、Altschul et al. (1990))
は、いくつかの配列解析プログラムと接続して使用するために、国立バイオテクノロジー
情報センター(Bethesda、MD)を含むいくつかの供給源からおよびインターネ
ット上で入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は
、インターネット上のBLAST(商標)の「ヘルプ」欄で入手可能である。核酸配列の
比較では、BLAST(商標)(Blastn)プログラムの「Blast2配列」機能
をデフォルトパラメータを使用して用いることができる。基準配列にはるかに大きな類似
性を有する核酸配列は、この方法により評価される場合には、百分率同一性の増加を示す
ことになる。
85%を超えて同一である配列のことであってもよい。例えば、実質的に同一のヌクレオ
チド配列は、基準配列に少なくとも85.5%、少なくとも86%、少なくとも87%、
少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくと
も92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%
、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5
%同一であってもよい。
じクラスの別のアミノ酸と置換されている置換のことである。非保存的アミノ酸置換は、
残基が同じクラスに分類されない置換、例えば、塩基性アミノ酸での中性または非極性ア
ミノ酸の置換である。保存的置換を実施する目的で定義されうるアミノ酸のクラスは当技
術分野では公知である。
肪族アミノ酸との置換が含まれる。例えば、第一のアミノ酸がGly、Ala、Pro、
Ile、Leu、Val、およびMetのうちの1つである場合、この第一のアミノ酸は
Gly、Ala、Pro、Ile、Leu、Val、およびMetから選択される第二の
異なるアミノ酸により置き換えられてもよい。特定の例では、第一のアミノ酸がGly、
Ala、Pro、Ile、Leu、およびValのうちの1つである場合、この第一のア
ミノ酸はGly、Ala、Pro、Ile、Leu、およびValから選択される第二の
異なるアミノ酸により置き換えられてもよい。疎水性脂肪族アミノ酸の置換を伴う特定の
例では、第一のアミノ酸がAla、Pro、Ile、Leu、およびValのうちの1つ
である場合、この第一のアミノ酸はAla、Pro、Ile、Leu、およびValから
選択される第二の異なるアミノ酸により置き換えられてもよい。
香族アミノ酸との置換が含まれる。例えば、第一のアミノ酸がHis、Phe、Trp、
およびTyrのうちの1つである場合、この第一のアミノ酸はHis、Phe、Trp、
およびTyrから選択される第二の異なるアミノ酸により置き換えられてもよい。非荷電
芳香族アミノ酸の置換を伴う特定の例では、第一のアミノ酸がPhe、Trp、およびT
yrのうちの1つである場合、この第一のアミノ酸はPhe、Trp、およびTyrから
選択される第二の異なるアミノ酸により置き換えられてもよい。
水性アミノ酸との置換が含まれる。例えば、第一のアミノ酸がAla、Val、Ile、
Leu、Met、Phe、Tyr、およびTrpのうちの1つである場合、この第一のア
ミノ酸はAla、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、およびTrpから
選択される第二の異なるアミノ酸により置き換えられてもよい。非芳香族、疎水性アミノ
酸の置換を伴う特定の例では、第一のアミノ酸がAla、Val、Ile、Leu、およ
びMetのうちの1つである場合、この第一のアミノ酸はAla、Val、Ile、Le
u、およびMetから選択される第二の異なるアミノ酸により置き換えられてもよい。
アミノ酸との置換が含まれる。例えば、第一のアミノ酸がSer、Thr、Asn、Gl
n、Cys、Gly、Pro、Arg、His、Lys、Asp、およびGluのうちの
1つである場合、この第一のアミノ酸はSer、Thr、Asn、Gln、Cys、Gl
y、Pro、Arg、His、Lys、Asp、およびGluから選択される第二の異な
るアミノ酸により置き換えられてもよい。非荷電、極性アミノ酸の置換を伴う特定の例で
は、第一のアミノ酸がSer、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、およびPro
のうちの1つである場合、この第一のアミノ酸はSer、Thr、Asn、Gln、Cy
s、Gly、およびProから選択される第二の異なるアミノ酸により置き換えられても
よい。荷電、極性アミノ酸の置換を伴う特定の例では、第一のアミノ酸がHis、Arg
、Lys、Asp、およびGluのうちの1つである場合、この第一のアミノ酸はHis
、Arg、Lys、Asp、およびGluから選択される第二の異なるアミノ酸により置
き換えられてもよい。荷電、極性アミノ酸の置換を伴う追加の例では、第一のアミノ酸が
Arg、Lys、Asp、およびGluのうちの1つである場合、この第一のアミノ酸は
Arg、Lys、Asp、およびGluから選択される第二の異なるアミノ酸により置き
換えられてもよい。正荷電(塩基性)、極性アミノ酸の置換を伴う特定の例では、第一の
アミノ酸がHis、Arg、およびLysのうちの1つである場合、この第一のアミノ酸
はHis、Arg、およびLysから選択される第二の異なるアミノ酸により置き換えら
れてもよい。正に荷電した極性アミノ酸の置換を伴う追加の例では、第一のアミノ酸がA
rgまたはLysである場合、この第一のアミノ酸はArgおよびLysのうちのもう一
方のアミノ酸により置き換えられてもよい。負に荷電した(酸性)極性アミノ酸の置換を
伴う特定の例では、第一のアミノ酸がAspまたはGluである場合、この第一のアミノ
酸はAspおよびGluのうちのもう一方のアミノ酸により置き換えられてもよい。正に
荷電した極性アミノ酸以外の極性アミノ酸の置換を伴う特定の例では、第一のアミノ酸が
Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Asp、およびGluのう
ちの1つである場合、この第一のアミノ酸はSer、Thr、Asn、Gln、Cys、
Gly、Pro、Asp、およびGluから選択される第二の異なるアミノ酸により置き
換えられてもよい。負に荷電した極性アミノ酸以外の極性アミノ酸の置換を伴う特定の例
では、第一のアミノ酸がSer、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、A
rg、His、およびLysのうちの1つである場合、この第一のアミノ酸はSer、T
hr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Arg、His、およびLysから選
択される第二の異なるアミノ酸により置き換えられてもよい。
異なる電気的に中性のアミノ酸との置換が含まれる。例えば、第一のアミノ酸がGly、
Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、およびTyrのうちの1つである場合、この
第一のアミノ酸はGly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、およびTyrから
選択される第二の異なるアミノ酸により置き換えられてもよい。
極性アミノ酸との置換が含まれる。例えば、第一のアミノ酸がAla、Val、Leu、
Ile、Phe、Trp、Pro、およびMetのうちの1つである場合、この第一のア
ミノ酸はAla、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、およびMetから
選択される第二の異なるアミノ酸により置き換えられてもよい。
の第二のアミノ酸の選択は、第一および第二のアミノ酸の両方が属する前述のクラスの数
を最大にするために行いうる。したがって、第一のアミノ酸がSer(極性、非芳香族お
よび電気的に中性のアミノ酸)である場合、第二のアミノ酸は別の極性アミノ酸(すなわ
ち、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Arg、His、Lys、As
p、またはGlu)、別の非芳香族アミノ酸(すなわち、Thr、Asn、Gln、Cy
s、Gly、Pro、Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ala、Ile、Le
u、Val、またはMet)、または別の電気的に中性のアミノ酸(すなわち、Gly、
Thr、Cys、Asn、Gln、またはTyr)であってもよい。しかし、この場合の
第二のアミノ酸はThr、Asn、Gln、Cys、およびGlyのうちの1つであるの
が好ましいことがある。なぜならば、これらのアミノ酸は極性、非芳香族性、および電気
的中性に従ってすべての分類を共有しているからである。保存的置換において使用される
特定の第二のアミノ酸を選択するのに場合により使用してもよい追加の基準は当技術分野
では公知である。例えば、Thr、Asn、Gln、Cys、およびGlyがSerの保
存的置換において使用されるのに利用可能である場合、Cysは望ましくない架橋および
/またはジスルフィド結合の形成を回避するためには選択から除外するのがよい。同様に
、Glyは、アルキル側鎖を欠いているので、選択から除外するのがよい。この場合、T
hrは、例えば、側鎖ヒドロキシル基の機能性を保持するために選択してもよい。しかし
、保存的置換において使用される特定の第二のアミノ酸の選択は、最終的には当業者の裁
量に任せられる。
タンパク質の化学的修飾を意味する。
ク質」(または「トランス活性化因子」または「転写活性化因子タンパク質」または「転
写活性化因子融合タンパク質」)とは、核酸エレメントに結合し、この核酸エレメントに
作動可能に連結されているポリヌクレオチド(例えば、対象の遺伝子)の転写を開始また
は増強するポリペプチドのことである。ある種の生物原産であるトランス活性化タンパク
質には、例えば、限定せずに、ジンクフィンガーDNA結合タンパク質、UPA DNA
結合ドメイン、GAL4、およびTALが含まれる。本発明の特定の実施形態には、DN
A結合タンパク質由来の少なくとも1つのDNA結合ドメインおよび植物トランス活性化
ドメイン由来の相互作用モチーフを含む合成融合タンパク質トランス活性化因子が含まれ
る。
合、用語「特異的結合」とは、安定して特異的な結合が結合パートナー(複数可)と起こ
るが、特異的に結合するポリペプチドにより認識される特異的アミノ酸配列または特異的
ヌクレオチド配列を欠く他の分子とは起こらないほど、ポリペプチドまたはタンパク質ド
メインとその結合パートナー(複数可)(例えば、特定のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド(複数可)または特定のヌクレオチド配列を含む核酸(複数可))との間の十分に強力
な相互作用のことである。安定して特異的な結合は、「プルダウン」アッセイ(例えば、
GSTプルダウン)、酵母2ハイブリッドアッセイ、酵母3ハイブリッドアッセイ、EL
ISA、等などの当業者には常用の技法により確かめることができる。互いへの「特異的
結合」という属性を有する分子は互いに「特異的に結合する」と言ってもよい。
分子(複数可)の細胞内への移入のことである。細胞は、核酸分子の細胞ゲノム内への組
込みにより、またはエピソーム複製のどちらかにより、核酸分子が細胞によって安定的に
複製されるようになると、細胞内に移入された核酸分子により「形質転換」される。本明
細書で使用される場合、用語「形質転換」は、核酸分子をそのような細胞に導入すること
ができるすべての技法を包含する。例には、ウイルスベクターでのトランスフェクション
、プラスミドベクターでの形質転換、エレクトロポレーション(Fromm et al. (1986) Na
ture 319:791-3)、リポフェクション(Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84:7413-7)、マイクロインジェクション(Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85
)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介移入(Fraley et al. (1983) Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 80:4803-7)、直接DNA取込み、および微粒子銃(Klein et al. (19
87) Nature 327:70)が含まれるが、これらに限定されない。
成転写活性化因子融合タンパク質を含むポリペプチドをコードする配列であってよい。い
くつかの例では、導入遺伝子は、少なくとも1つの植物TADおよび/または少なくとも
1つのバリアントTADを含む合成転写活性化因子融合タンパク質をコードしていてもよ
い。いくつかの例では、導入遺伝子は対象の遺伝子(例えば、レポーター遺伝子、除草剤
抵抗性を与える遺伝子、および農業的に重要な植物形質に寄与する遺伝子)をコードして
いてもよい。これらのおよび他の例では、導入遺伝子は、導入遺伝子のコード配列に作動
可能に連結された1つまたは複数の調節配列(例えば、プロモーター)を含有していても
よい。本開示の目的のために、用語「トランスジェニック」とは、生物(例えば、植物)
を指すのに使用される場合、外来性核酸配列を含む生物のことである。いくつかの例では
、外来性核酸配列を含む生物は、核酸配列が分子形質転換技法を経て導入された生物であ
ってよい。他の例では、外来性核酸配列を含む生物は、核酸配列が、例えば、植物におい
て遺伝子移入または他家受粉により導入された生物であってもよい。
を産生するために細胞内に導入することができる核酸分子のことである。ベクターは、宿
主細胞においてベクターを複製させる、複製起点などの核酸配列を含みうる。ベクターの
例には、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、および外来性DNAを細胞内に運
ぶウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ベクターは、1つまたは複数の遺伝子
、アンチセンス分子、および/または選択可能マーカー遺伝子ならびに当技術分野で公知
の他の遺伝要素も含んでいてよい。ベクターは細胞を形質導入する、形質転換する、また
は感染して、それによってベクターによりコードされた核酸分子および/またはタンパク
質を細胞に発現させてもよい。ベクターは場合によって、核酸分子の細胞内への進入を達
成するのを支援する物質(例えば、リポソーム、タンパク質被覆、等)を含む。
」、および「その(the)」は、本明細書で使用される場合「少なくとも1つ」を意味
する。
本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。分子生
物学における一般用語の定義は、例えば、Lewin B., Genes V, Oxford University Press
, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecula
r Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびMeyers R.A. (
ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH
Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見ることができる。
本開示は、新規の植物TADおよびそれ由来のタンパク質−タンパク質相互作用モチー
フ、ならびにそれをコードする核酸を提供する。植物タンパク質であるERF2(シロイ
ヌナズナ(Arabidopsis thaliana))、PTI4(ジャガイモ(Solanum tuberosum))
、AtERF1(シロイヌナズナ(A. thaliana))、ORCA2(ニチニチソウ(Catha
ranthus roseus))、DREB1A(シロイヌナズナ(A. thaliana))、CBF1(シ
ロイヌナズナ(A. thaliana))、およびDOF1(トウモロコシ(Zea mays))から同
定され単離されたTADを使用して、いくつかの実施形態において異種TAD内に「交換
(swap)」されうる植物TAD相互作用モチーフを同定した、またはこれらのTADを使
用してバリアントTAD相互作用モチーフを産生させた。新たに同定された植物TAD、
その中の相互作用モチーフ、およびそのバリアントTADを特定の実施形態において使用
すれば(例えば、合成転写活性化因子タンパク質に包含することにより)、対象の遺伝子
に新しく望ましい発現調節制御を与えることができる。
よび相互作用モチーフの構造領域は、VP16 TADにおける対応する構造との類似性
により言及される。VP16 TADは2つのサブドメインに分割することができ、それ
ぞれのサブドメインは、DNA結合ドメインに繋ぎ止められると独立して自律的に転写を
活性化することができる。VP16サブドメインは、アミノサブドメイン(または「VP
16トランス活性化サブドメインI」または「VP16412〜456」)およびカルボ
キシルサブドメイン(または「VP16トランス活性化サブドメインII」または「VP
16456〜490」)と呼ばれることもある。VP16はその相互作用ドメインを通じ
て、転写因子IIB(TFIIB)のp62/Tfb1サブユニットを含む、転写に関与
するいくつかの標的タンパク質と相互作用する。
している。例えば、Cress and Triezenberg (1991) Science 251(4989):87-90を参照され
たい。しかし、酸性VP16 TADは、酸性TADにおける規則的二次構造の欠如のせ
いで、他の多くのポリペプチド配列よりも変異誘発に対して寛容性がありうる(Sigler (
1988) Nature 333:210-2)。VP16 TADサブドメインの不定形の性質は、TADが
様々な結合パートナーとの複数のタンパク質/タンパク質相互作用を媒介するのに寄与し
ている可能性があり(Dyson and Wright (2002) Curr. Opin. Struct. Biol. 12(1):54-6
0)、TADサブドメインは、溶液中に遊離している場合よりも標的タンパク質に結合し
ている場合のほうがより秩序立った構造(例えば、短いαヘリックス(Langlois et al.
(2008)、上記))をとる可能性がある。例えば、Garza et al. (2009) Life Sci. 84(7-8
):189-93; Jonker et al. (2005) Biochemistry 44(3):827-39; Langlois et al. (2008)
、上記を参照されたい。
互作用モチーフを含む合成転写活性化因子タンパク質が含まれる。いくつかの例示的な合
成転写活性化因子タンパク質は、植物TAD相互作用モチーフを含み、そのようなタンパ
ク質は、例えば、限定せずに、配列番号2〜8および配列番号100〜106を含む配列
を有しうる。植物TAD相互作用モチーフを含む追加の例示的なTADには、天然のトラ
ンス活性化因子TADに含まれる天然のTAD相互作用モチーフ配列を配列番号10〜1
6のうちの1つで置き換えることにより操作されたTADが含まれる。
ーフ中の類似する位置に見出されるアミノ酸(例えば、基準TAD相互作用モチーフを含
む天然のタンパク質のオルソログ由来の)での置換を含むバリアントTAD相互作用モチ
ーフは新しい特定の遺伝子調節特性をもたらしうるという驚くべき発見を巧みに利用する
。これらの特定の特性は、一定レベルの発現が望まれるポリヌクレオチドの発現に望まし
い可能性がある。例えば、バリアントTAD相互作用モチーフは、それ自体が発現を増強
する天然の基準TADモチーフを超える増強された発現を与えることができ、したがって
最大化された発現が目標となることが多いタンパク質合成および精製反応には望ましい可
能性がある。他の例では、バリアントTAD相互作用モチーフは、最大化よりも少ない発
現が望ましい場合には、天然の基準TADモチーフよりも少ない発現を提供しうる。
転写活性化因子タンパク質が含まれる。いくつかの例では、バリアントTAD相互作用モ
チーフは、配列番号10〜16のうちの1つのバリアントであってもよい。バリアントT
AD相互作用モチーフは天然のTAD相互作用配列のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むが、この配列中の1つまたは複数のアミノ酸は、異なる相同TADにおける対応す
る位置に見出されるアミノ酸に変更されている。バリアントTAD相互作用モチーフは天
然のTAD相互作用配列のアミノ酸配列を有するポリペプチドも含むが、この配列におけ
る1つまたは複数のアミノ酸では保存的置換が行われている。バリアントTAD相互作用
モチーフは、例えば、限定せずに、基準TAD相互作用モチーフ配列(例えば、配列番号
10〜16から選択される配列)に少なくとも95%同一である、基準配列に少なくとも
90%同一である、基準配列に少なくとも85%同一である、基準配列に少なくとも80
%同一である、基準配列に少なくとも75%同一である、基準配列に少なくとも70%同
一である、基準配列に少なくとも65%同一である、基準配列に少なくとも60%同一で
ある、基準配列に少なくとも55%同一である、基準配列に少なくとも50%同一である
、または基準配列に50%未満で同一であってもよい。
例示的なバリアントERF2 TAD相互作用モチーフ)、配列番号23〜28(例示的
なバリアントPTI4 TAD相互作用モチーフ)、配列番号29〜34(例示的なバリ
アントAtERF1 TAD相互作用モチーフ)、配列番号35〜40(例示的なバリア
ントORCA2 TAD相互作用モチーフ)、配列番号41〜46(例示的なバリアント
DREB1A TAD相互作用モチーフ)、配列番号47〜52(例示的なバリアントC
BF1 TAD相互作用モチーフ)、および配列番号53〜58(例示的なバリアントD
OF1 TAD相互作用モチーフ)が含まれる。バリアントTAD相互作用モチーフを含
む例示的なTADには、天然のトランス活性化因子TADに含まれるTAD相互作用モチ
ーフ配列を配列番号17〜58からなる群から選択されるバリアントTADで置き換える
ことにより操作されたTADが含まれる。例えば、バリアントTAD相互作用モチーフを
含む例示的なTADには配列番号107〜120が含まれる。
ミノ酸配列から直ちに同定可能である。例えば、TADまたはTAD相互作用モチーフは
、転写されてmRNAを生成し続いてTADまたはTAD相互作用モチーフのアミノ酸に
翻訳される天然のポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。しかし、当業者であ
れば、遺伝コードの縮重のせいで、同一のポリペプチドをコードする他に多くの等価のポ
リヌクレオチドが存在することを認識している。バリアントTAD相互作用モチーフ(例
えば、配列番号17〜58)は、所望の特定のバリアントのアミノ酸配列からRNAコド
ン表を参照して容易に決定可能であるポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。
特定の実施形態では、TAD相互作用モチーフ(またはそのバリアント)をコードするポ
リヌクレオチドのヌクレオチド配列が、例えば、TAD相互作用モチーフを含むタンパク
質(例えば、融合タンパク質)の発現を最大化または最適化するように、宿主細胞のコド
ン使用に従って組み立てられるのが望ましいことがある。
本開示は、植物TAD相互作用モチーフおよび/またはバリアントTAD相互作用モチ
ーフを含む合成転写活性化因子融合タンパク質も提供する。いくつかの実施形態では、合
成転写活性化因子融合タンパク質は少なくとも1つのDNA結合ドメインをさらに含む。
そのような合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸(例えば、DNA)も提
供される。
DNAに結合する少なくとも第一のポリペプチド(すなわち、「DNA結合ドメイン」)
を含む。合成転写活性化因子融合タンパク質の第一のDNA結合ドメインポリペプチドは
、植物TAD相互作用モチーフまたはバリアントTAD相互作用モチーフを含む少なくと
も第二のポリペプチドに作動可能に連結されうる。いくつかの例では、合成転写活性化因
子融合タンパク質は、融合タンパク質における第一と第二のポリペプチド間に位置するス
ペーサー配列、リーダー配列、融合タンパク質を細胞小器官(例えば、核)に対して標的
化するペプチド、細胞酵素により切断されるポリペプチド、ペプチドタグおよび作動可能
に連結された第一および第二のポリペプチドの機能に干渉しない他のアミノ酸配列などの
、追加のポリペプチドを含みうる。
ペプチドは、融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を作製するために、互いにインフ
レームでライゲーションされている第一および第二のポリペプチドをコードする単一のポ
リヌクレオチドからのその発現により作動可能に連結されてもよい。DNA結合ドメイン
およびTAD相互作用モチーフを含む転写活性化因子融合タンパク質をコードするポリヌ
クレオチドの例には、限定せずに、配列番号79〜93が含まれる。別の実施形態では、
合成転写活性化因子融合タンパク質の第一および第二のポリペプチドは、独立して発現さ
れる第一および第二のポリペプチドの架橋などの他の手段により作動可能に連結されても
よい。
バリアントTAD相互作用モチーフには、セクションIV(上記)に記載されているTA
D相互作用モチーフおよびそのバリアントが含まれる。例えば、合成転写活性化因子融合
タンパク質は、配列番号10〜58からなる群から選択されるポリペプチドを含んでいて
もよい。
ィンガータンパク質由来のジンクフィンガーDNA結合ドメイン(例えば、Z6 DNA
結合ドメイン)が含まれる。個々のジンクフィンガーDNA結合ドメインは広範囲のDN
A部位に対して標的化および結合するように設計することが可能である。例えば、Wu et
al. (2007) Cell. Mol. Life Sci. 64:2933-44を参照されたい。標準Cys2His2、
ならびに非標準Cys3Hisジンクフィンガータンパク質は、αヘリックスを二重らせ
んの主溝内に挿入することによりDNAに結合する。ジンクフィンガードメインによるD
NAの認識はモジュールであり、それぞれのフィンガーは主に標的中の3つの連続する塩
基対に接触し、タンパク質中の少数のキーとなる残基が認識を媒介する。合成転写活性化
因子融合タンパク質中に複数のジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むことにより、
融合タンパク質のDNA結合特異性はさらに増加しうる(および、したがって、それによ
って与えられるどんな遺伝子調節効果の特異性も増加しうる)。例えば、Urnov et al. (
2005) Nature 435:646-51を参照されたい。したがって、1つまたは複数のジンクフィン
ガーDNA結合ドメインは、宿主細胞内に導入された合成転写活性化因子融合タンパク質
が宿主細胞のゲノム内で独特であるDNA配列と相互作用するように、操作し利用するこ
とができる。
cerevisiae)におけるモジュラートランス活性化因子であるGAL4由来のDNA結合ド
メインを含むが、このトランス活性化因子は他の多くの生物におけるトランス活性化因子
としても機能する。例えば、Sadowski et al. (1988) Nature 335:563-4を参照されたい
。この調節系では、出芽酵母(S. cerevisiae)におけるガラクトース代謝経路の酵素を
コードする遺伝子の発現は、利用可能な炭素源により厳密に調節されている(Johnston (
1987) Microbiol. Rev. 51:458-76)。これらの代謝酵素の転写制御は、正の調節タンパ
ク質であるGAL4とGAL4が特異的に結合する17bp対称DNA配列(UAS)の
間の相互作用により媒介される。
は機能的に自律したドメインを含み、その複合活性がインビボでのGAL4の活性を占め
る(Ma & Ptashne (1987) Cell 48:847-53); Brent & Ptashne (1985) Cell 43(3 Pt 2):
729-36)。GAL4のN末端65アミノ酸がGAL4 DNA結合ドメインを構成する(
Keegan et al. (1986) Science 231:699-704; Johnston (1987) Nature 328:353-5)。配
列特異的結合は、DNA結合ドメインに存在する6個のCys残基により配位される2価
陽イオンの存在を必要とする。配位陽イオン含有ドメインはDNAヘリックスの主溝との
直接接触を介して17bp UASのそれぞれの末端で保存されたCCGトリプレットと
相互作用してこれを認識する(Marmorstein et al. (1992) Nature 356:408-14)。タン
パク質のDNA結合機能が、活性化ドメインが転写を指示することができるように、C末
端転写活性化ドメインをプロモーターの近傍に配置する。
ば、限定せずに、AVRBS3誘導性遺伝子由来の結合配列、AVRBS3誘導性遺伝子
由来のコンセンサス結合配列またはそれから操作される合成結合配列(例えば、UPA
DNA結合ドメイン;配列番号89)、TAL、LexA(例えば、Brent & Ptashne (1
985)上記を参照されたい)、LacR(例えば、Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol.
10:3343-56; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(12):5072-6を参照さ
れたい)、ステロイドホルモン受容体(Ellliston et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:1
1517-121)、Tetリプレッサー(米国特許第6,271,341号)およびテトラサイ
クリン(Tc)の存在下ではtetオペレーター配列に結合するがTcの非存在下では結
合しない変異Tetリプレッサー、ならびにGAL4、ホルモン受容体およびVP16の
融合物を利用するWang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(17):8180-4に記
載の調節系の構成成分が含まれる。
ーフを含む。例えば、限定せずに、合成転写活性化因子融合タンパク質は2個、3個、4
個、またはそれよりも多いTAD相互作用ドメインを含みうる。いくつかの例では、合成
転写活性化因子融合タンパク質は、複数のDNA結合ドメインを含む。例えば、限定せず
に、合成転写活性化因子融合タンパク質は2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、
9個、10個またはそれよりも多いDNA結合ドメインを含みうる。
いくつかの実施形態では、本開示は、植物TAD相互作用モチーフ、バリアントTAD
相互作用モチーフ、植物TAD、またはバリアントTADをコードする少なくとも1つの
ポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、DNA結合ド
メインをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド配列をさらに含みうる。例えば、
いくつかの実施形態における核酸は、2つのポリヌクレオチド配列が単一の融合タンパク
質の一部として転写されるように、DNA結合ドメインをコードする第二のポリヌクレオ
チド配列にインフレームで融合されている、植物TAD相互作用モチーフ、バリアントT
AD相互作用モチーフ、植物TAD、またはバリアントTADをコードする第一のポリヌ
クレオチド配列を含む。
チーフ、バリアントTAD相互作用モチーフ、植物TAD、またはバリアントTADをコ
ードする第一のポリヌクレオチド配列の最後のコドンと、DNA結合ドメインをコードす
る第二のポリヌクレオチド配列の最初のコドンは、例えば、イントロンまたは「STOP
」をコードすることなくいかなる数のヌクレオチドトリプレットで分離されていてもよい
。同様に、DNA結合ドメインをコードする第一のポリヌクレオチド配列をコードするヌ
クレオチド配列の最後のコドンと植物TAD相互作用モチーフ、バリアントTAD相互作
用モチーフ、植物TAD、またはバリアントTADをコードする第二のポリヌクレオチド
配列の最初のコドンは、いかなる数のヌクレオチドトリプレットで分離されていてもよい
。これらのおよび追加の実施形態では、植物TAD相互作用モチーフ、バリアントTAD
相互作用モチーフ、植物TAD、またはバリアントTADをコードする第一のポリヌクレ
オチド配列の最後(すなわち、核酸配列のもっとも3’側)の最後のコドンとDNA結合
ドメインをコードする第二のポリヌクレオチド配列は、それに直に連続する追加のポリヌ
クレオチドコード配列の最初のコドンとフェイズレジスター(phase-register)で融合さ
れていてもよく、または合成ヌクレオチドリンカー(例えば、融合を実現するのに使用さ
れていた可能性のあるヌクレオチドリンカー)によりコードされる配列などの短いペプチ
ド配列だけによりそれから分離されていてもよい。そのような追加のポリヌクレオチド配
列の例には、例えば、限定せずに、タグ、標的ペプチド、および酵素的切断部位が含まれ
る。同様に、第一および第二のポリヌクレオチド配列のもっとも5’側(核酸配列におい
て)の最初のコドンは、それに直に連続する追加のポリヌクレオチドコード配列の最後の
コドンとフェイズレジスターで融合されていてもよく、または短いペプチド配列だけによ
りそれから分離されていてもよい。
はバリアントTADをコードするポリヌクレオチド配列とDNA結合ドメインをコードす
るポリヌクレオチド配列を分離する配列は、例えば、コードされているアミノ酸配列が融
合タンパク質の翻訳を著しく変更しそうにないような、いかなる配列からなっていてもよ
い。本明細書に開示されるTAD相互作用ドメイン(およびそのバリアント)と既知のD
NA結合ドメインの自律的性質のために、介在配列はこれらの構造体のそれぞれの機能に
例において干渉することはない。
作用モチーフ、植物TAD、またはバリアントTADをコードするポリヌクレオチド配列
を含む核酸分子であって、DNA結合ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含ま
ない核酸分子も含む。そのような核酸分子は、例えば、分子生物学技法においてTAD相
互作用モチーフコード配列の取り扱いを容易にするのに有用である可能性がある。例えば
、いくつかの実施形態では、TAD相互作用モチーフコード配列は、この配列を発現ベク
ター内にサブクローニングするのに適したベクターに導入しうる、またはTAD相互作用
モチーフコード配列は、対象のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたTAD相互作用
モチーフコード配列を含む追加の核酸分子の産生を促進する核酸分子内に導入しうる。
作用モチーフ、植物TAD、またはバリアントTADを含み、少なくとも1つの特定のD
NA結合ドメインをさらに含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列はすべて当
業者であれば直ちに認識するであろう。遺伝コードの縮重は特定のアミノ酸配列に有限数
のコード配列を提供する。本発明の実施形態に従って融合タンパク質をコードする特定の
配列の選択は、実践者の裁量の範囲内である。コード配列が異なれば適用も異なるのが望
ましいこともある。
増強するために、植物TAD相互作用モチーフ、バリアントTAD相互作用モチーフ、植
物TAD、またはバリアントTADをコードするポリヌクレオチド配列のヌクレオチド(
および/またはDNA結合ドメインコード配列のヌクレオチド)を改変するのが望ましい
ことがある。遺伝コードは64の可能なコドンがあって重複しているが、大半の生物はこ
れらのコドンのサブセットを優先的に使用している。種においてもっとも頻繁に利用され
るコドンは最適コドンと呼ばれ、それほど頻繁には利用されないコドンは希少または低使
用コドンに分類される(Zhang et al. (1991) Gene 105:61-72)。コドンは、「コドン最
適化」と呼ばれることもあるプロセスにおける特定の宿主の好ましいコドン使用を反映す
るように置換しうる。特定の原核生物または真核生物宿主により好まれるコドンを含有す
る最適化されたコード配列は、例えば、翻訳速度を高めるようにまたは望ましい特性(例
えば、非最適化配列から産生される転写物と比べて長い半減期)を有する組換えRNA転
写物を産生するように調製しうる。
いくつかの実施形態では、植物TAD相互作用モチーフ(または、バリアントTAD相
互作用モチーフ、植物TAD、もしくはバリアントTAD)をコードする少なくとも1つ
のポリヌクレオチド配列、およびDNA結合ドメインをコードする少なくとも1つのポリ
ヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの融合タンパク質コード核酸分子(複数可)は、
そこでの融合タンパク質の発現のために細胞、組織、または生物内に導入しうる。
プラスミドおよび閉鎖環状プラスミドを含むベクター系でありうる。特定の例では、ベク
ターは発現ベクターであってもよい。特定の実施形態に従った核酸配列は、例えば、この
核酸配列が1つまたは複数の調節配列に作動可能に連結されるように、ベクター内に挿入
することができる。多くのベクターがこの目的のために利用可能であり、特定のベクター
の選択は、例えば、ベクター内に挿入される核酸のサイズ、ベクターで形質転換される特
定の宿主細胞、および/または発現されるのが望ましい融合タンパク質の量に依存するこ
とがある。ベクターは典型的には、様々な構成成分を含有し、その素性はベクターの機能
(例えば、DNAの増幅およびDNAの発現)、およびベクターが適合する特定の宿主細
胞(複数可)に依存する。
、少なくとも1つの植物TAD相互作用モチーフ、バリアントTAD相互作用モチーフ、
植物TAD、またはバリアントTADを含む融合タンパク質をコードする1つまたは複数
のヌクレオチド配列(複数可)に作動可能に連結された少なくとも1つの調節配列を含む
ヌクレオチド配列を含む植物形質転換ベクターを含みうる。この1つまたは複数のヌクレ
オチド配列(複数可)は、融合タンパク質を産生する植物細胞、組織、または生物におい
て調節配列(複数可)の制御下で、発現されうる。
た、少なくとも1つの植物TAD相互作用モチーフ、バリアントTAD相互作用モチーフ
、植物TAD、またはバリアントTADを含む融合タンパク質をコードする1つまたは複
数のヌクレオチド配列(複数可)に作動可能に連結された調節配列は、核酸分子が増幅さ
れることになる細菌細胞、または核酸分子が発現されることになる植物細胞などの宿主細
胞において機能するプロモーター配列でもよい。
誘導性、ウイルス、合成、または構成的であるプロモーターが含まれ、そのすべてが当技
術分野では周知である。本発明の実施形態において有用でありうるプロモーターの非限定
的例は、米国特許第6,437,217号(トウモロコシRS81プロモーター)、米国
特許第5,641,876号(イネアクチンプロモーター)、米国特許第6,426,4
46号(トウモロコシRS324プロモーター)、米国特許第6,429,362号(ト
ウモロコシPR−1プロモーター)、米国特許第6,232,526号(トウモロコシA
3プロモーター)、米国特許第6,177,611号(構成的トウモロコシプロモーター
);米国特許第5,322,938号、米国特許第5,352,605号、米国特許第5
,359,142号、および米国特許第5,530,196号(35Sプロモーター);
米国特許第6,433,252号(トウモロコシL3オレオシンプロモーター)、米国特
許第6,429,357号(イネアクチン2プロモーター、およびイネアクチン2イント
ロン)、米国特許第6,294,714号(光誘導性プロモーター)、米国特許第6,1
40,078号(塩誘導性プロモーター)、米国特許第6,252,138号(病原体誘
導性プロモーター)、米国特許第6,175,060号(亜リン酸欠乏誘導性プロモータ
ー)、米国特許第6,388,170号(二方向性プロモーター)、米国特許第6,63
5,806号(ガンマコイキシン(coixin)プロモーター)、ならびに米国特許出願第0
9/757,089号(トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター)により提供され
る。
t et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9)、オクトピンシンターゼ
(OCS)プロモーター(アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tume
faciens)の腫瘍誘発プラスミド上に担持されている)、カリフラワーモザイクウイルス
(CaMV)19Sプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター(Lawton et al. (1
987) Plant Mol. Biol. 9:315-24)、CaMV 35Sプロモーター(Odell et al. (19
85) Nature 313:810-2)、ゴマノハグサ(figwort)モザイクウイルス35Sプロモータ
ー(Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8)、スクロース
シンターゼプロモーター(Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:41
44-8)、R遺伝子複合体プロモーター(Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83
)、クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子プロモーター、CaMV35S(米国特許
第5,322,938号、米国特許第5,352,605号、米国特許第5,359,1
42号、および米国特許第5,530,196号)、FMV35S(米国特許第6,05
1,753号、および米国特許第5,378,619号)、PC1SVプロモーター(米
国特許第5,850,019号)、SCP1プロモーター(米国特許第6,677,50
3号)、およびAGRtu.nosプロモーター(GenBank受託番号V00087
、Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. (1983) Natu
re 304:184-7)が含まれる。
異的プロモーターは、生物のその他の組織と比べて、プロモーターが特異的である組織に
おいて作動可能に連結されたヌクレオチド配列のより高いレベルの転写を指示するヌクレ
オチド配列である。組織特異的プロモーターの例には限定せずに、タペータム特異的プロ
モーター、葯特異的プロモーター、花粉特異的プロモーター(例えば、米国特許第7,1
41,424号および国際PCT出願第WO 99/042587号を参照されたい)、
胚珠特異的プロモーター(例えば、米国特許出願第2001/047525 A1号を参
照されたい)、果実特異的プロモーター(例えば、米国特許第4,943,674号およ
び米国特許第5,753,475号を参照されたい)、および種子特異的プロモーター(
例えば、米国特許第5,420,034号および米国特許第5,608,152号を参照
されたい)が含まれる。いくつかの実施形態では、発生段階特異的プロモーター(例えば
、発生の後期段階で活性なプロモーター)は、本発明の組成物または方法において使用し
うる。
ーター配列と翻訳リーダー配列として機能するコード配列の間に位置する5’UTRが含
まれる。翻訳リーダー配列は完全にプロセシングされたmRNAに存在し、一次転写物の
プロセシングおよび/またはRNA安定性に影響しうる。翻訳リーダー配列の例には、ト
ウモロコシおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー(米国特許第5,362,8
65号)、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物ルビスコリーダー、ならびにそ
の他が含まれる(例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36
を参照されたい)。5’UTRの非限定的例は、GmHsp(米国特許第5,659,1
22号)、PhDnaK(米国特許第5,362,865号)、AtAnt1、TEV(
Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7)、およびAGRtunos(Ge
nBank受託番号V00087;およびBevan et al. (1983)、上記)により提供され
る。
翻訳配列、3’転写終止領域、またはポリアデニル化領域も含まれる。これらの配列はヌ
クレオチド配列の下流に位置する遺伝要素であり、ポリアデニル化シグナル、および/ま
たは転写もしくはmRNAプロセシングに影響することができる他の調節シグナルを与え
るポリヌクレオチドが含まれる。ポリアデニル化シグナルはmRNA前駆体の3’末端へ
のポリアデニル酸ヌクレオチドの付加を引き起こすように植物において機能する。ポリア
デニル化配列は、種々の植物遺伝子に、またはT−DNA遺伝子に由来することが可能で
ある。3’転写終止領域の非限定的例はノパリンシンターゼ3’領域である(nos 3
’;Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)。様々な3’非翻
訳領域の使用の例は、Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-80に提供されてい
る。ポリアデニル化シグナルの非限定的例には、エンドウ(Pisum sativum)RbcS2
遺伝子(Ps.RbcS2−E9;Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9)およびA
GRtu.nos(GenBank受託番号E01312)由来のシグナルが含まれる。
del (1990) “Gene Expression Technology,” Methods Enzymol. 185, Academic Press,
San Diego, CAに記載されている。
可能な表現型を与える選択可能マーカーを含みうる。選択可能マーカーを使用して、本発
明の核酸分子を含む植物または植物細胞を選択することもできる。マーカーは、殺生物剤
抵抗性、抗生物質抵抗性(例えば、カナマイシン、ジェネテシン(G418)、ブレオマ
イシン、およびハイグロマイシン)、または除草剤抵抗性(例えば、グリホサート)をコ
ードしうる。選択可能マーカーの例には、カナマイシン抵抗性を与え、例えば、カナマイ
シンおよびG418を使用して選択することができるneo遺伝子、ビアラホス抵抗性を
与えるbar遺伝子、グリホサート抵抗性を与える変異EPSPシンターゼ遺伝子、ブロ
モキシニルに対する抵抗性を与えるニトリラーゼ遺伝子、イミダゾリノンまたはスルホニ
ル尿素抵抗性を与える変異アセト乳酸シンターゼ遺伝子(ALS)、およびメトトレキサ
ート抵抗性DHFR遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。例えば、限定せずに、
アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイ
シン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピュー
ロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシン、およびテトラ
サイクリンを含む化学薬剤に対する抵抗性を与える複数の選択可能マーカーが利用可能で
ある。そのような選択可能マーカーの例は、例えば、米国特許第5,550,318号、
米国特許第5,633,435号、米国特許第5,780,708号、および米国特許第
6,118,047号に説明されている。
みうる。スクリーニング可能マーカーを使用すれば発現をモニターすることができる。例
示的なスクリーニング可能マーカーには、様々な発色基質が知られている酵素をコードす
るβグルクロニダーゼまたはuidA遺伝子(GUS)(Jefferson et al. (1987) Plan
t Mol. Biol. Rep. 5:387-405)、植物組織においてアントシアニン色素(赤色)の生成
を調節する産物をコードするR−locus遺伝子(Dellaporta et al. (1988) “Molec
ular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.” In 18th S
tadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds., Plenum, NY (pp. 263
-82))、βラクタマーゼ遺伝子(Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
75:3737-41)、様々な発色基質が知られている酵素をコードする遺伝子(例えば、PA
DAC、発色セファロスポリン)、ルシフェラーゼ遺伝子(Ow et al. (1986) Science 2
34:856-9)、発色カテコールを転換するカテコールジオキシゲナーゼをコードするxyl
E遺伝子(Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55)、アミラーゼ遺伝子(Ikatu
et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2)、チロシンをDOPAおよびドパキノンにまで酸
化し、次にメラニンに凝縮することができる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子(Katz
et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14)、およびαガラクトシダーゼが含ま
れる。
換による(例えば、米国特許第5,508,184号を参照されたい)、乾燥/阻害媒介
DNA取込み(例えば、Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8を参照さ
れたい)、エレクトロポレーションによる(例えば、米国特許第5,384,253号を
参照されたい)、炭化珪素繊維を用いた撹拌による(例えば、米国特許第5,302,5
23号および米国特許第5,464,765号を参照されたい)、アグロバクテリウム(
Agrobacterium)媒介形質転換(例えば、米国特許第5,563,055号、米国特許第
5,591,616号、米国特許第5,693,512号、米国特許第5,824,87
7号、米国特許第5,981,840号、および米国特許第6,384,301号を参照
されたい)およびDNA被覆粒子の加速により(例えば、米国特許第5,015,580
号、米国特許第5,550,318号、米国特許第5,538,880号、米国特許第6
,160,208号、米国特許第6,399,861号、および米国特許第6,403,
865号を参照されたい)DNAを細胞内に導入することができるいかなる方法でも含ま
れる。これらの技法などの技法の適用を通じて、実質的にいかなる種の細胞も安定的に形
質転換することができる。いくつかの実施形態では、形質転換DNAは宿主細胞のゲノム
内に組み込まれる。多細胞種の場合は、トランスジェニク細胞はトランスジェニック生物
に再生することができる。これらの技法のうちのどれでも使用して、例えば、トランスジ
ェニック植物のゲノムに本発明の1つまたは複数の核酸配列を含むトランスジェニック植
物を生産することができる。
クテリウム(Agrobacterium)の天然の形質転換システムに基づいている。A.ツメファ
シエンス(A. tumefaciens)およびA.リゾゲネス(A. rhizogenes)は、植物細胞を遺
伝的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。A.ツメファシエンス(A. tumefaciens
)およびA.リゾゲネス(A. rhizogenes)のそれぞれのTiおよびRiプラスミドは、
植物の遺伝的形質転換の原因となる遺伝子を担持している。Ti(腫瘍誘発性)プラスミ
ドはT−DNAとして知られる大きなセグメントを含有しており、このセグメントは形質
転換された植物に移される。Tiプラスミドの別のセグメントであるvir領域はT−D
NA移入の原因である。T−DNA領域は、それぞれが末端反復ヌクレオチド配列で構成
されている左側および右側ボーダーにより境を接している。いくつかの改変されたバイナ
リーベクターでは、腫瘍誘発性遺伝子は除去されており、vir領域の機能は、T−DN
Aボーダー配列により境を接している外来DNAを移すのに利用される。T領域は、例え
ば、トランスジェニック植物および細胞の効率的回収のための選択可能マーカー、ならび
に本発明の融合タンパク質をコードする核酸などの移入のための挿入配列の複数のクロー
ニング部位を含有していてもよい。
(A. tumefaciens)のTiプラスミド(例えば、米国特許第4,536,475号、米国
特許第4,693,977号、米国特許第4,886,937号、および米国特許第5,
501,967号、ならびに欧州特許EP 0 122 791を参照されたい)または
A.リゾゲネス(A. rhizogenes)のRiプラスミドに由来する。追加の植物形質転換ベ
クターには、例えば、限定せずに、Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13
; Bevan et al. (1983)、上記;Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; および欧
州特許EP 0 120 516に記載されるベクターならびに前述のいずれかに由来す
るベクターが含まれる。植物と天然に相互作用する、シノリゾビウム(Sinorhizobium)
、根粒菌(Rhizobium)、およびメソリゾビウム(Mesorhizobium)などの他の細菌は、多
数の種々の植物への遺伝子移入を媒介するように改変することが可能である。これらの植
物関連共生細菌は、武装解除されたTiプラスミドと適切なバイナリーベクターの両方を
獲得することにより遺伝子移入にコンピテントになることができる。
る培養および植物再生のために同定される。形質転換された細胞を同定する能力を改善す
るために、形質転換体を作製するのに使用されるベクターと一緒に、前述のように、選択
可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子を用いることを望んでもよい。選択可能マ
ーカーを使用する場合には、形質転換された細胞は、この細胞を選択的薬剤(1種または
複数)に曝露することにより潜在的に形質転換された細胞集団内で同定される。スクリー
ニング可能マーカーを使用する場合には、細胞は所望のマーカー遺伝子形質についてスク
リーニングすることができる。
コアー化された細胞は、植物の再生を支持する培地において培養されうる。いくつかの実
施形態では、任意の適切な植物組織培養培地(例えば、MSおよびN6培地)は、成長調
節物質などの物質をさらに含むことにより改変してもよい。組織は、植物再生取組みを開
始するのに十分な組織が入手可能になるまで、または手動選択の繰り返しラウンドに続い
て、この組織の形態が再生に適するようになるまで(例えば、少なくとも2週間)、成長
調節物質を有する基本培地上で維持され、次に苗条形成の助けとなる培地に移されてもよ
い。培養物は、十分な苗条形成が起こるまで定期的に移される。苗条が形成されると、根
形成の助けとなる培地に移される。十分な根が形成されると、植物はさらなる成長および
成熟のために土壌に移すことができる。
ク質を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列)の存在を確かめるため、種々の
アッセイを実施しうる。そのようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッ
ティング、PCR、および核酸塩基配列決定などの分子生物学的アッセイ;例えば、免疫
学的手段(ELISAおよび/またはウェスタンブロット)によりまたは酵素機能により
、タンパク質産物の存在を検出するなどの生化学的アッセイ;葉または根アッセイなどの
植物部分アッセイ;ならびに再生植物体全体の表現型の解析が含まれる。
ドプライマーを使用する、例えば、PCR増幅により分析することができる。PCR遺伝
子型判定は、ゲノム内に組み込まれた対象の核酸分子を含有すると予測される単離された
宿主植物組織由来のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、続いてPCR
増幅産物の標準クローニングおよび配列解析が含まれるがこれらに限定されないと理解さ
れている。PCR遺伝子型判定の方法は十分に記載されており(例えば、Rios, G. et al
. (2002) Plant J. 32:243-53を参照されたい)、細胞培養物を含む、任意の植物種また
は組織型に由来するゲノムDNAに適用してもよい。
スジェニック植物は典型的には、1つの染色体に挿入された単一組換えDNA配列を含有
する。単一組換えDNA配列は「トランスジェニックイベント」または「組込みイベント
」と呼ばれる。そのようなトランスジェニック植物は挿入されたDNA配列に対してヘテ
ロ接合性である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子に関してホモ接合性であるトラン
スジェニック植物は、単一外来性遺伝子配列を含有する独立した分離個体トランスジェニ
ック植物、例えば、F0植物をそれ自体と性的に交配させて(自家受粉)F1種子を生産
することにより得られる。生産されたF1種子の4分の1は、導入遺伝子に関してホモ接
合性になる。F1種子が出芽すれば、典型的には、ヘテロ接合体とホモ接合体の区別を可
能にするSNPアッセイまたは熱増幅アッセイ(すなわち、接合状態アッセイ)を使用し
てヘテロ接合性について試験することが可能である植物をもたらす。
バリアントTAD相互作用モチーフ)および少なくとも1つのDNA結合ドメインを含む
少なくとも1つの合成転写活性化因子融合タンパク質のコピーは、少なくとも1つの合成
転写活性化因子融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核
酸分子(複数可)が導入されている細胞において産生される。それぞれの合成転写活性化
因子融合タンパク質は、様々な形質転換イベントにおいて導入された複数の核酸配列から
、または単一の形質転換イベントにおいて導入された単一の核酸配列から発現されうる。
いくつかの実施形態では、複数のそのような融合タンパク質は単一のプロモーターの制御
下で発現されうる。他の実施形態では、複数のそのような融合タンパク質は複数のプロモ
ーターの制御下で発現されうる。
ック植物は、少なくとも1つのトランスジェニックイベントを有する第一の植物とそのよ
うなイベントを欠く第二の植物を交雑させることによりいくつかの実施形態で調製しうる
。例えば、少なくとも1つの植物TAD相互作用モチーフ(および/またはバリアントT
AD相互作用モチーフ)および少なくとも1つのDNA結合ドメインを含む合成転写活性
化因子融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を、形質転換を受け
入れられる第一の植物系統内に導入してトランスジェニック植物を生産することができ、
そのトランスジェニック植物を第二の植物系統と交雑させて、合成転写活性化因子融合タ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列を第二の植物系統に移入させることができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つの植物TAD相互作用モチーフ(および/ま
たはバリアントTAD相互作用モチーフ)および少なくとも1つのDNA結合ドメインを
含む合成転写活性化因子融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞を
含む植物が提供される。特定の実施形態では、そのような植物は、植物組織または植物細
胞の形質転換、および植物体全体の再生により生産することができる。追加の実施形態で
は、そのような植物は、合成転写活性化因子融合タンパク質をコードするヌクレオチド配
列を含む核酸を生殖質内に移入することを通じて得られる。そのような植物細胞を含む植
物材料も提供される。そのような植物材料はこの植物細胞を含む植物から得られる。
作用モチーフ)および少なくとも1つのDNA結合ドメインを含む合成転写活性化因子融
合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物または植物材
料は以下の特徴、植物の細胞における融合タンパク質の発現、植物の細胞の色素体におけ
る融合タンパク質の発現、植物の細胞の核における融合タンパク質の発現、植物の細胞に
おける融合タンパク質の局在化、植物の細胞のゲノムにおけるヌクレオチド配列の組込み
、植物の細胞の染色体外DNAにおけるこのヌクレオチド配列の存在、および/または植
物の細胞におけるこのヌクレオチド配列に対応するRNA転写物の存在のうちの1つまた
は複数をいくつかの実施形態において示しうる。そのような植物は、コードされた融合タ
ンパク質の発現以外の1つまたは複数の望ましい形質をさらに有しうる。そのような形質
には、その発現が植物の細胞における融合タンパク質により調節される、内在性またはト
ランスジェニックヌクレオチド配列の発現から生じる形質、例えば、限定せずに、昆虫、
他の有害生物、および病原体に対する抵抗性;除草剤に対する耐性;増強された安定性、
収率、または貯蔵寿命;環境耐性;医薬品製造;工業製品製造;ならびに栄養強化が含ま
れる。
きるいかなる植物でもよい。したがって、植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。本
方法において使用可能な双子葉植物の非限定的例には、シロイヌナズナ(Arabidopsis)
、アルファルファ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワ
ー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショ
ウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ(pumpkin)、ダイコン、ナタネ、ホウレンソウ
、ダイズ、カボチャ(squash)、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマト、およびス
イカが含まれる。本方法において使用可能な単子葉植物の非限定的例には、トウモロコシ
、タマネギ、イネ、モロコシ、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、カラスムギ、ライ
コムギ、スイッチグラス、およびシバクサが含まれる。本発明に従ったトランスジェニッ
ク植物はいかなる形態で使用してもまたは栽培してもよい。
はバリアントTAD相互作用モチーフ)および少なくとも1つのDNA結合ドメインを含
む合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列を
含有する商品生産物、例えば、1つまたは複数のそのようなヌクレオチド配列を含有する
組換え植物または種子から生産される商品生産物も提供する。少なくとも1つの植物TA
D相互作用モチーフ(および/またはバリアントTAD相互作用モチーフ)および少なく
とも1つのDNA結合ドメインを含む合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする1
つまたは複数のヌクレオチド配列を含有する商品生産物には、例えば、限定せずに、食品
生産物、粗挽き粉、油、または粉砕もしくは全粒粉またはそのような合成転写活性化因子
融合タンパク質をコードする1つもしくは複数のヌクレオチド配列を含む植物の種子が含
まれる。1つまたは複数の商品または商品生産物における本発明の合成転写活性化因子融
合タンパク質をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列が検出されたら、この商品
または商品生産物が、本発明の合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする1つまた
は複数のヌクレオチド配列を含む植物から少なくとも一部は生産された事実上の証拠であ
る。特定の実施形態では、本発明の商品生産物は、少なくとも1つの植物TAD相互作用
モチーフ(および/またはバリアントTAD相互作用モチーフ)および少なくとも1つの
DNA結合ドメインを含む合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸配列の検
出可能な量を含む。いくつかの実施形態では、そのような商品生産物は、例えば、トラン
スジェニック植物を入手し、それから食物または餌を調製することにより生産しうる。
クレオチド配列を含む導入遺伝子を含むトランスジェニック植物または種子は、RNAi
分子に転写されるトランスジェニックイベント、殺虫タンパク質(例えば、バチルス・チ
ューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)殺虫タンパク質)をコードする遺伝子、除
草剤耐性遺伝子(例えば、グリホサートに対する耐性を与える遺伝子)、およびトランス
ジェニック植物において望ましい表現型(例えば、増加した収量、変化した脂肪酸代謝、
または細胞質雄性不稔の回復)に寄与する遺伝子を限定せずに含む、そのゲノムにおける
少なくとも1つの他のトランスジェニックイベントも含みうる。
クレオチド配列を含む導入遺伝子を含むトランスジェニック植物または種子は、変化した
脂肪酸代謝形質に対する内在性遺伝子標的、乾燥耐性形質に対する内在性遺伝子標的、窒
素利用効率形質に対する内在性遺伝子標的、またはトランスジェニック植物における望ま
しい表現型(例えば、増加した収量、または細胞質雄性不稔の回復)に寄与する他の任意
の内在性遺伝子標的を限定せずに含む、トランスジェニック植物のゲノム内に内在性また
は天然の遺伝子標的を含んでいてもよい。内在性または天然の遺伝子標的は、合成転写活
性化因子融合タンパク質が特異的に結合し、それによって標的遺伝子の転写に影響するヌ
クレオチド配列に作動可能に連結されうる。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つの植物TAD相互作用モチーフ(および/ま
たはバリアントTAD相互作用モチーフ)および少なくとも1つのDNA結合ドメインを
含む合成転写活性化因子融合タンパク質を使用して、細胞において対象のヌクレオチド配
列(例えば、対象の遺伝子)の発現を増加させる(例えば、開始する)ことができる。対
象のヌクレオチド配列は、細胞のゲノムにとっていくつかの実施形態では内在性でありう
る。他の実施形態では、対象のヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの外来性核酸分子
(複数可)が細胞内に導入されている。一般的には、対象のヌクレオチド配列に作動可能
に連結されている第二のヌクレオチド配列は、第二のヌクレオチド配列と融合タンパク質
の間の安定で特異的な結合が起こるように、融合タンパク質のDNA結合ドメインにより
認識されることになる。いくつかの例では、対象のヌクレオチド配列を含む少なくとも1
つの核酸分子(複数可)はそのような第二のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの
例では、対象のヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸分子(複数可)は、対象の
ヌクレオチド配列が宿主細胞にとって内在性である第二のヌクレオチド配列に作動可能に
連結されるように、宿主細胞に導入される。例えば、対象のヌクレオチド配列を含む核酸
分子は、対象のヌクレオチド配列がDNA結合ドメインにより認識される内在性配列に作
動可能に連結されるように、対象のヌクレオチド配列を宿主細胞のゲノム内に挿入する相
同組換えを促進しうる。いくつかの例では、対象のヌクレオチド配列を含む少なくとも1
つの核酸分子(複数可)は、対象のヌクレオチド配列が宿主細胞にとって内在性である第
二のヌクレオチド配列に作動可能に連結されるように、宿主細胞内では内在性であるまた
は天然である。
は、いくつかの例において単一の融合タンパク質の調節制御下で発現させることができる
。他の例では、対象の単一のヌクレオチド配列(例えば、単一の組込みイベント)が調節
され発現される。いくつかの実施形態では、対象の複数のヌクレオチド配列が、単一の核
酸結合部位への本発明の融合タンパク質の結合により調節されうる、例えば、対象の複数
のヌクレオチド配列がすべて、融合タンパク質のDNA結合ドメインが特異的に結合する
同じ第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結されうる。そのような複数を含む対象のヌ
クレオチド配列はある種の例では必ずしも同じではない。したがって、複数の異なる遺伝
子産物は単一の融合タンパク質の調節制御下で発現されうる。
配列の発現産物はマーカー遺伝子産物、例えば、限定せずに、蛍光分子でありうる。その
ような発現産物の発現に関する定量的および定性的観測により、特定のTAD相互作用モ
チーフまたはTAD相互作用モチーフバリアントの特定の調節特性を評価するシステムが
提供されうる。
なくとも1つの植物TAD相互作用モチーフ(および/またはバリアントTAD相互作用
モチーフ)および少なくとも1つのDNA結合ドメインを含む合成転写活性化因子融合タ
ンパク質の調節制御下で発現されうる。特定の例では、合成転写活性化因子融合タンパク
質の調節制御下での発現産物は、限定せずに、この融合タンパク質をコードする核酸が導
入されている宿主細胞において正常に発現される内在性または天然のポリペプチドであっ
てもよい。他の例では、合成転写活性化因子融合タンパク質の調節制御下での発現産物は
、宿主細胞において正常には発現されない異種ポリペプチドであってもよい。例えば、限
定せずに、合成転写活性化因子融合タンパク質の調節制御下での発現産物は、除草剤抵抗
性、ウイルス抵抗性、病原菌抵抗性、昆虫抵抗性、線虫抵抗性、または真菌抵抗性に関与
するポリペプチドであってもよい。例えば、米国特許第5,569,823号、米国特許
第5,304,730号、米国特許第5,495,071号、米国特許第6,329,5
04号、および米国特許第6,337,431号を参照されたい。合成転写活性化因子融
合タンパク質の調節制御下での発現産物は、代わりに、例えば、限定せずに、草勢もしく
は収量に関与するポリペプチド(極端な温度、土壌状態、光レベル、水位、および化学的
環境に対する耐性に関与するポリペプチドを含む)、または対象の形質を含む植物を同定
するためのマーカーとして使用しうるポリペプチド(例えば、選択可能マーカー遺伝子産
物、および種子色に関与するポリペプチド)であってもよい。
(および/またはバリアントTAD相互作用モチーフ)および少なくとも1つのDNA結
合ドメインを含む合成転写活性化因子融合タンパク質の調節制御下にある可能性のあるポ
リペプチドの非限定的例には、アセト乳酸シンターゼ(ALS)、変異ALS、およびA
LSの前駆体(例えば、米国特許第5,013,659号を参照されたい);CP4 E
PSPSまたはクラスIII EPSPSなどのEPSPS(例えば、米国特許第4,9
71,908号および米国特許第6,225,114号を参照されたい);例えば、限定
せずに、光合成、ならびに脂肪酸、アミノ酸、油、アロテノイド(arotenoid)、テルペ
ノイド、およびデンプンの合成を含む、色素体において起こる生理的過程を改変する酵素
が含まれる。特定の実施形態において合成転写活性化因子融合タンパク質の調節制御下に
ある可能性のあるポリペプチドの他の非限定的例には、ゼアキサンチンエポキシダーゼ、
コリンモノオキシゲナーゼ、フェロケラターゼ、オメガ3脂肪酸デサチュラーゼ、グルタ
ミンシンセターゼ、デンプン修飾酵素、必須アミノ酸の合成に関与するポリペプチド、プ
ロビタミンA、ホルモン、Bt毒素、およびタンパク質が含まれる。前述のペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列は当技術分野では入手可能であり、そのようなヌクレオチド配
列は、少なくとも1つの植物TAD相互作用モチーフ(および/またはバリアントTAD
相互作用モチーフ)および作動可能に連結された部位に特異的に結合する少なくとも1つ
のDNA結合ドメインを含む合成転写活性化因子融合タンパク質の調節制御下で発現され
るDNA結合ドメインの特異的結合部位に作動可能に連結されうる。
バリアントヌクレオチド配列は、当業者により同定されうる(例えば、特定のポリペプチ
ドをコードする他の遺伝子と高い相同性を有する遺伝子をクローニングすることにより、
またはDNAコドン縮重を考慮してインシリコ配列生成により)。例えば、宿主生物の好
ましいコドン使用に一致するそのようなバリアントは特定の実施形態では望ましいことが
ある。対象のそのようなバリアントヌクレオチド配列が同定されると、本発明に従った合
成転写活性化因子ポリペプチドにより配列の調節制御を与える核酸分子は、例えば、核酸
分子中の対象のバリアントヌクレオチド配列を、使用される特定の合成転写活性化因子融
合タンパク質内に含まれるDNA結合ドメインの既知の結合部位に作動可能に連結するこ
とにより、設計することができる。本明細書に記載される実施形態では、この核酸分子と
本明細書に記載される特定の合成転写活性化因子融合タンパク質の1つが宿主細胞内に同
時に存在する場合は、対象のそのようなバリアントヌクレオチド配列の発現の驚くべき増
加を観察しうる(例えば、宿主植物細胞において)。
される。本発明者らが先行発明を理由にそのような開示に先行する資格がないことを認め
たと解釈されるものは本明細書にはなにもない。
る。実施例は、例示される特定の特長または実施形態に本開示を限定するものと解釈され
るべきではない。
(実施例)
7つのタンパク質、PTI4(GenBank受託番号ACF57857.1)、ER
F2(GenBank受託番号NP_199533.1)、AtERF1(GenBan
k受託番号NP_567530.4)、ORCA2(GenBank受託番号CAB93
940.1)、DREB1A(GenBank受託番号NP_567720.1)、CB
F1(GenBank受託番号NP_567721.1)、およびDOF1(GenBa
nk受託番号NP_001105709.1)がVP16トランス活性化ドメイン(配列
番号1)に相同であると同定された。VP16トランス活性化ドメイン(配列番号1)の
アミノ酸配列は、これらの推定植物転写活性化因子の領域と配列類似性を共有しており、
VP16配列を使用してそれぞれの活性化因子内でトランス活性化ドメインを位置付けた
。これらの植物活性化因子タンパク質の同定されたトランス活性化ドメインは、配列番号
2(PTI4)、配列番号3(ERF2)、配列番号4(AtERF1)、配列番号5(
ORCA2)、配列番号6(DREB1A)、配列番号7(CBF1)、および配列番号
8(DOF1)である。次に、VP16トランス活性化サブドメインIIの相互作用モチ
ーフ(図1、配列番号9)を使用して、植物トランス活性化ドメインから相互作用モチー
フを位置付けた。図2は、VP16と植物トランス活性化ドメインのアライメントを示し
ており、新規の相互作用モチーフは反転されている。
同定された植物トランス活性化ドメインの相互作用モチーフが改変された。VP16ト
ランス活性化ドメインのサブドメインIIの相互作用モチーフのアミノ酸接触残基を含有
する相互作用モチーフの新しいバリアントが産生された(Langlois et al. (2008) J. Am
. Chem. Soc. 130:10596)。VP16トランス活性化ドメインの6つのアミノ酸接触残基
は、転写因子TFIIHのサブユニットであるTfb1と直接相互作用すると提唱されて
いる(図1)。アミノ酸は新たに同定された植物トランス活性化ドメインの相互作用モチ
ーフ内に導入されて、バリアント配列を生成した。
有する相互作用モチーフを改変すれば、さらに多種多様な転写因子と相互作用して、それ
によりさらに高いレベルのタンパク質発現をもたらすことができる植物活性化因子の改変
された相互作用モチーフが生成されると我々は仮定した。
VP16トランス活性化ドメインのサブドメインIIに対してアライメントされたER
F2中のAsn53からAla85までの領域(図2)は、ERF2の植物トランス活性
化ドメイン配列として同定された。VP16トランス活性化ドメインのサブドメインII
の相互作用モチーフに一致することが分かった領域、すなわち、Asp66からAsp7
6に改変が導入された。VP16トランス活性化ドメインのサブドメインIIの相互作用
モチーフの6接触残基とは異なるアミノ酸残基が改変された。これらの変更によりVP1
6トランス活性化ドメインのサブドメインIIの相互作用モチーフに類似するERF2の
例示的な改変相互作用モチーフ(すなわち、バリアント相互作用モチーフ配列)が生じた
(図3)。
作用モチーフの改変
ERF2に導入された相互作用モチーフに類似するPTI4、AtERF1、ORCA
2、DREB1A、CBF1、およびDOF1相互作用モチーフに改変が導入された。V
P16トランス活性化ドメインのサブドメインIIの相互作用モチーフの6直接接触残基
とは異なる天然の配列のアミノ酸残基が改変され、それにより例示的なバリアント相互作
用モチーフが生成した。これらの変化が導入され、植物バリアント相互作用モチーフはV
P16トランス活性化ドメインのサブドメインIIの相互作用モチーフに類似する(例え
ば、機能的に類似する)ものになった。VP16トランス活性化ドメインのサブドメイン
IIの天然の相互作用モチーフ配列と比べた場合、これらのバリアントまたは改変相互作
用モチーフの例示的な配列は図4〜9に収載されている。
互作用モチーフを試験する
出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)レポーター株
出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)レポーター株を産生して、天然またはバリアン
ト相互作用モチーフのどちらかを含む植物活性化ドメインを試験した。3段階クローニン
グ法により、酵母組込みベクターであるpHO−zBG−MEL1を構築した(図10)
。
Nat. Biotechnol. 26(6):702-8)の2つの別々の断片がPCRにより増幅された。第一の
断片は酵母KanMX発現カセットを含有し、それぞれに5’SpeI、BamHI、N
heI、PacI、BglII、KpnI、および3’EcoRI制限部位を加える、プ
ライマーであるKanMX−For(配列番号59)およびKanMX−Rev(配列番
号60)を使用してpNorMEL1から増幅された。第二の断片は、細菌複製起点によ
り分離されている酵母HO遺伝子座(Voth et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29(12):E
59-9)に外向きに面する相同性アームを含有し、プライマーであるHO−For(配列番
号61)およびHO−Rev(配列番号62)を使用して増幅された。前記2つの断片は
、EcoRI/SpeIで消化され、ライゲーションされてKanMX選択可能HOター
ゲティングベクターを生成した。
(1-2):53-61)はMEL1−For(配列番号63)およびMEL1−Rev(配列番号
64)で増幅されて、KanMX選択可能HOターゲティングベクターのKpnI部位に
クローニングされた。
ity Site)を表して「HAS」と呼ばれる)は外部ベンダー(DNA2.0、Menlo
Park、CA)により新規に合成された。この部位はヒトCCR5遺伝子をターゲテ
ィングするジンクフィンガータンパク質(ZFP)に対する結合部位を含有していた(Pe
rez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:808-16)。HAS断片はプライマーであるHA
S−For−F1(配列番号65)およびHAS−For−R1(配列番号66)を使用
してPCR増幅され、MEL1レポーター遺伝子の上流に位置する、KanMX HO
MEL1ベクターのBamHI−PacI部位にクローニングされた。この最終ベクター
はpHO−zBG−MEL1と命名された(図10)。
同性アームを酵母HO遺伝子座に曝露させ、製造業者が示すプロトコールを使用して、出
芽酵母(S. cerevisiae)株であるBY4741MATα(Invitrogen、Ca
rlsbad、CA)に形質転換された。手短に言えば、3mLの対数期BY4741培
養物はペレット化され、TELバッファー(10mM Tris HCL pH 8.0
、1mM EDTA、100mM酢酸リチウム)中で洗浄された。酵母細胞ペレットは、
3μgの直線化されたpHO−zBG−MEL1を含有する360μLの酵母形質転換液
(33.3% PEG−3350(Sigma−Aldrich、St.Louis、M
O)、0.1M酢酸リチウム(Sigma−Aldrich)、および1×TE中0.2
mg/mLサケ精子DNA(Stratagene、La Jolla、CA))に再懸
濁され、42℃で40分間熱ショックを受けた。酵母細胞は、1mg/LのGeneti
cin(登録商標)(Life Technologies、Carlsbad、CA)
を含有するYPDプレート上での選択に先立って、ペレット化され、洗浄され、2時間富
栄養培地で増殖させた。抵抗性クローンはYPD+Geneticin(登録商標)プレ
ート上で再画線され、その後の形質転換に使用された。
インフレームCCR5ジンクフィンガー結合タンパク質(CCR5−ZFP)−植物ト
ランス活性化相互作用モチーフを含有するDNA構築物が構築された。配列番号80〜9
3に記載されている天然およびバリアント植物トランス活性化相互作用モチーフはBam
HI/HindIII制限酵素断片として動員され、CCR5−ZFPドメインをコード
する配列の下流に直接クローニングされた(Perez et al. (2008)、上記)。得られたZ
FP転写活性化因子発現カセットは、GAL1,10プロモーター(West et al. (1987)
Genes Dev. 1:1118-31)およびCYC1ターミネーター(Osborne et al. (1988) Genes
Dev. 2:766-72)を利用し、酵母pRS315シリーズベクターを基盤としていた。得ら
れたベクターは、CCR5−ZFPとのインフレーム融合物として天然およびバリアント
植物トランス活性化相互作用モチーフを含有していた。
転写活性化因子発現カセット、SGMO VP16−CCR5(配列番号79)およびV
P16v2 CCR5−CCR5が研究で使用された。VP−16転写活性化因子発現カ
セットは両方ともGAL1,10プロモーターにより推進され、CYC1ターミネーター
により停止された。空ベクター対照はCCR5−ZFPドメインのみを含有し、トランス
活性化相互作用モチーフは含有していなかった。
BY4741レポーターライン株の一晩培養物はYPD+Geneticin(登録商
標)において増殖され、ZFP転写活性化因子発現カセットを含有する1μgのベクター
は、96ウェルフォーマットにおいて標準酵母形質転換プロトコールを使用して送達され
た。形質転換はすべて重複して行われた。形質転換された酵母細胞はロイシンを欠く合成
デキストロース培地(SD−Leu)に回収されて、ZFP転写活性化因子発現カセット
を含有するベクターを選択した。72時間後、酵母細胞はSD−Leu中形質転換体の1
対10希釈により濃縮され、さらに24時間増殖させた。次に、酵母細胞はロイシンを欠
く合成ラフィノース培地(SR−Leu)に1対10で希釈され、GAL1,10プロモ
ーターを抑制解除した。24時間後、酵母細胞はペレット化され、ロイシンを欠く合成ガ
ラクトース培地(SG−Leu)に再懸濁された。ガラクトース誘導の0、3、および6
時間後の時点で、110μLの酵母細胞がMEL1アッセイのために収穫された。
釈され、分光光度計を使用して600nmでの光学密度(OD600)が測定された。残
りの10μLの酵母細胞は30℃で1時間90μLのMEL1バッファー(77mM N
a2HPO4、61mMクエン酸、2mg/mL PNPG(Sigma−Aldric
h))中でインキュベートされた。反応は100μLの1M Na2CO3の添加により
停止された。MEL1活性はOD405で評価され、mUはOD405とOD600の測
定値の比に基づく式を使用して計算された(Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26(
6):702-8)。
ー遺伝子の発現レベルは図11に示されている。これらの様々な植物トランス活性化相互
作用モチーフから生じたMEL1タンパク質の発現は、空ベクター対照ならびにVP16
トランス活性化ドメイン(配列番号1)のサブドメインII(VP16(v2)−CCR
5))およびSGMO VP16(SGMO VP16−CCR5)からのMel1の活
性化と比較された。
比べた場合、予想外の高レベルな発現を生じた。さらに、このバリアント植物トランス活
性化相互作用モチーフでのMel1の発現は、天然型のERF2(v3)植物トランス活
性化相互作用モチーフを超える増加をもたらした。
質をVP16トランス活性化ドメイン対照に類似するレベルで発現させた。しかし、PT
I4相互作用モチーフに導入された改変は、天然のPTI4(v3)植物トランス活性化
相互作用モチーフと比べた場合、顕著に高いレベルのMel1発現をもたらした。
2)、DOF1(v3)、DOF1(v2)、DREB1A(v3)、DREB1A(v
2)、CBF1(v3)およびCBF1(v2)植物トランス活性化相互作用モチーフは
、VP16対照と比べた場合、酵母アッセイにおいてMel1の高レベルの発現をもたら
さなかった。しかし、AtERF1、DREB1A、およびCBF1植物トランス活性化
相互作用モチーフは酵母においてMel1の発現を確かに推進した。ORCA2(v3)
およびDOF1(v2)植物トランス活性化相互作用モチーフのみは酵母アッセイにおい
てMel1のいかなる発現ももたらさなかった。
メインにより産生されるMEL1のレベルは、Mel1酵母アッセイにおいて天然(v3
)植物トランス活性化相互作用モチーフと比べた場合、一般的に高かった。酵母アッセイ
においてMel1の発現を推進しなかった唯一の改変植物トランス活性化相互作用モチー
フは、DOF1(v2)相互作用モチーフであった。この植物トランス活性化相互作用モ
チーフは酵母アッセイにおいていかなるMEL1発現も生じなかった。
る植物活性化ドメインの相互作用モチーフの機能
レポーター構築物pDAB9897
Z6 DNA結合ドメインポリヌクレオチド配列の8直列型反復(配列番号67;Yoko
i et al. (2007) Mol Ther. 15(11):1917-23)は、クローニングを容易にするために、S
acII部位を5’および3’末端に付加させて新規に合成された(IDT、Coral
sville、IA)。全8X−Z6結合ドメイン(配列番号68)は続いて、所望の植
物発現エレメントを含有する既存のGateway(登録商標)エントリーベクターにク
ローニングされた。8X−Z6結合部位はSacII断片上に動員され、バックボーンベ
クターに見出される独自のSacII部位を使用して、シロイヌナズナ(Arabidopsis th
aliana)アクチン−2プロモーター(AtAct2プロモーターv2; An et al. (1996)
Plant J. 10:107-21)の直ぐ上流にクローニングされた。それに続いて、gus遺伝子
(GUS; Jefferson (1989) Nature 342:837-8)は、独自のNcoI/SacI部位を
使用してシロイヌナズナ(A.thaliana)アクチン−2プロモーターの直接制御下でこの
ベクターにクローニングされ、NcoI部位のATGコドンが開始コドンを形成した。A
tu ORF23 3’UTR(アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacteriu
m tumefaciens)オープンリーディングフレーム−23、3’非翻訳領域;欧州特許出願
第222493 A1号)を使用して転写を終止させた。
liana)ユビキチン−10プロモーター(At Ubi10プロモーターv2(Callis et
al. (1990) J. Biol. Chem. 265:12486-93))::ホスフィノトリシンアセチルトランス
フェラーゼ遺伝子(pat v3(Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37))::植物
選択のためのアグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefaciens)オープンリーデ
ィングフレーム−1、3’非翻訳領域(AtuORF1 3’UTR v3(Huang et a
l. (1990) J. Bacteriol. 172:1814-22)選択可能マーカーカセットを含有するデスティ
ネーションベクターとのGateway(登録商標)ライゲーションの結果であった。最
終形質転換ベクターは塩基配列決定により確認され、アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス(A.tumefaciens)株であるLBA4404(Invitrogen、Carlsb
ad、CA)中に形質転換された。
換
トランスジェニックレポーター植物イベントを起こすため、プチハバナ(Petit Havana
)タバコ植物から切り取った葉片(1cm2)を、プラスミドであるpDAB9897を
宿すアグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefaciens)株であるLBA4404
の一晩培養物中でインキュベートし、OD600約1.2nmまで増殖させ、無菌フィル
ターペーパー上で吸い取り乾燥させ、次に60×20mm皿(1皿あたり5片)中のMS
培地(Phytotechnology Labs、Shawnee Mission、
KS)および30g/Lスクロース上に置いて、1mg/Lのインドール酢酸および1m
g/Lのベンジアミノプリン(benzyamino purine)を添加してNescofilm(登
録商標)(Karlan Research Products Corporatio
n、Cottonwood、AZ)で密封した。48時間の共培養に続いて、葉片は25
0mg/Lのセフォタキシム(cephotaxime)および5mg/LのBASTA(登録商標
)を有する同じ培地に移された。3〜4週間後、小植物は、葉収穫および分子分析に先立
ってさらに2〜3週間、PhytaTrays(商標)中の250mg/Lのセフォタキ
シムおよび10mg/LのBASTA(登録商標)を有するMS培地に移された。
PCR DNA単離。トランスジェニックタバコ植物組織は新たに生育させた小植物か
ら収穫され、96ウェル収集プレート(Qiagen、Valencia、CA)におい
て少なくとも2日間凍結乾燥させた(Labconco、Kansas City、MO
)。次に、DNAは製造業者の説明書に従って、DNEasy(商標)96ウェル抽出キ
ット(Qiagen)を使用して単離された。組織破壊にはModel 2−96A K
leco(商標)組織粉砕機(Garcia Manufacturing、Visal
ia、CA)が使用された。
収穫され、2mLの円錐チューブ(Eppendorf)において少なくとも2日間凍結
乾燥させた(Labconco、Kansas City、MO)。次に、DNAは製造
業者の説明書に従って、DNEasy(商標)Plant Mini抽出キット(Qia
gen)を使用して単離された。組織破壊にはModel 2−96A Kleco(商
標)組織粉砕機(Garcia Manufacturing)が使用された。
n(登録商標)DNAアッセイキット(Molecular Probes、Invit
rogen、Carlsbad、CA)を使用して定量された。20ng/μLから1.
25ng/μL(連続希釈された)に及ぶ5つの予め定量されたDNA標準が標準曲線作
成のために使用された。試料は先ず、アッセイの線形範囲内にあるように1対10または
1対20の希釈度で希釈され、ゲノムDNAの濃度は製造業者のプロトコールに従って決
定された。次に、Synergy2(商標)プレートリーダー(Biotek、Wino
oski、VT)を使用して蛍光が記録された。ゲノムDNA濃度は、バックグランド蛍
光補正から計算された標準曲線から評価された。次に、TEまたは水を使用して、DNA
は、Biorobot3000(商標)自動化液体ハンドラー(Qiagen)を使用し
てPCRのために共通の濃度10ng/μLまで希釈された。サザン分析のためのDNA
は希釈せずにおいた。
イ(Applied Biosystems、Carlsbad、CA)に類似する多重
DNA加水分解プローブアッセイを使用して組込みコンプレキシティ(integration comp
lexity)について分析された。導入遺伝子インサートのコピー数は、pat導入遺伝子と
内在性タバコ基準遺伝子であるpal(フェニルアラニンアンモニアリアーゼ;GenB
ank受託番号AB008199)の両方について配列特異的プライマーおよびプローブ
を使用して評価された。両遺伝子についてのアッセイは、LightCycler(登録
商標)プローブ設計ソフトウェア2.0(Roche Applied Science
、Indianapolis、IN)を使用して設計された。両遺伝子についてのリアル
タイムPCRは、LightCycler(登録商標)480システム(Roche A
pplied Science)を使用して評価された。
che Applied Science)が、0.4μMのそれぞれのプライマーおよ
び0.2μMのそれぞれのプローブを含有する10μL容積多重反応において1×最終濃
度で調製された(表1)。2段階増幅反応は、58℃で38秒間、伸長物で実施され、蛍
光を取得した。試料はすべて3連で実行され、それぞれの試料の分析に平均Ct値が使用
された。リアルタイムPCRデータの解析は相対定量モジュールによりLightCyc
ler(登録商標)ソフトウェア(Roche Applied Science)を使
用して実施され、ΔΔCt法に基づいている。単一コピー標準物質由来のgDNAの試料
は結果を正規化するために含まれた。単一コピー標準物質イベントはサザン分析により既
に同定されており、pat遺伝子の単一インサートを有することが確かめられていた。
CRによりスクリーニングされた。Blu636(配列番号75)およびBlu637(
配列番号76)プライマーを使用して、正確な増幅によりZ6−Act2/GUS/At
ORF23 PTU(3,771bp)からなる3.7kb産物が得られた。Phusi
on(登録商標)GCマスター混合物(New England Biolabs、Be
verley、MA)は、以下の反応条件、98℃で30秒間、続いて98℃で10秒間
、67℃で30秒間、72℃で2分間、および72℃で10分間の最終伸長を30サイク
ルで使用された。上で詳述したPTU PCR反応に加えて、内在性遺伝子であるchs
(カルコンシンターゼ;GenBank受託番号FJ969391.1)の増幅もゲノム
DNA鋳型の品質を確認するために含まれた。3’CHSフォワード(配列番号77)お
よび3’CHSリバース(配列番号78)プライマーは反応に含まれ、この反応は350
bp増幅産物を産生した。20μLの反応が使用され、最終濃度はトランスジェニックプ
ライマーでは0.5μMおよび内在性基準遺伝子では0.2μMであった。
ンにより、制限酵素であるAseI(New England Biolabs)で完全
に消化された。消化されたDNAは、製造業者が提唱するプロトコールに従って、Qui
ck Precip(商標)溶液(Edge Biosystems、Gaithers
burg、MD)での沈殿により濃縮された。次に、ゲノムDNAは65℃で1時間25
μLの水中に再懸濁された。再懸濁された試料は、1×TAEバッファーで調製された0
.8%アガロースゲル上にローディングされ、1×TAE中1.1V/cmで一晩電気泳
動された。前記ゲルは変性バッファー(0.2M NaOH/0.6M NaCl)中に
30分間浸され、続いて中和バッファー(0.5M Tris−HCl(pH 7.5)
/1.5M NaCl)に30分間浸された。
パータオルを使用して、20×SSCバッファーを一晩ゲルを通して処理されたImmo
bilon(商標)NY+転写膜(Millipore、Billerica、MA)上
に受動的にウィッキングさせることにより実施された。移行に続いて、膜は2×SSCで
短時間洗浄され、Stratalinker(登録商標)1800(Stratagen
e、LaJolla、CA)と架橋され、80℃で3時間真空ベーキングされた。
イゼーションインキュベーター(Robbins Scientific、Sunnyv
ale、CA)を使用してガラス製ローラーボトル中、65℃で1時間プレハイブリダイ
ゼーション液(PerfectHyb(商標)plus、Sigma−Aldrich)
と一緒にインキュベートされた。プローブは、全コード配列を含有するPCR断片から調
製された。PCRアンプリコンは、QiaexII(登録商標)ゲル抽出キット(Qia
gen)を使用して精製され、Random RT Prime−iT(登録商標)標識
キット(Stratagene、La Jolla、CA)により[α32P]dCTP
を標識された。ブロットは、プレハイブリダイゼーション液におよそ200万カウントブ
ロット−1mL−1まで直接添加された変性プローブに65℃で一晩ハイブリダイズされ
た。ハイブリダイゼーションに続いて、ブロットは0.1X SSC/0.1% SDS
を用いて65℃で40分間順次洗浄された。最後に、ブロットは記憶蛍光体画像化スクリ
ーンに曝露され、Molecular Dynamics(商標)Storm(商標)8
60撮像システムを使用して撮像された。正確な単一コピー組込みイベントは、単一ハイ
ブリダイゼーションバンドの同定により確かめられた。
合計で51のBASTA(登録商標)抵抗性植物が生成され、このうち24は、コピー
数の加水分解プローブ分析に基づいて低コンプレキシティ(1〜2コピーのpat)であ
ることが分かった。これらの低コンプレキシティイベントのうち、PCR分析により決定
される場合、18が無傷のPTUを示した。サザンブロット分析に続いて、2つの単一コ
ピー、無傷のPTUイベントが選択され、成熟するまで温室で生育され、そこで自家受粉
させておいた。次にT1種子を収集し、表面殺菌し(20%漂白剤で3分間、続いて2回
の無菌蒸留水すすぎ)、PhytaTrays(商標)(Sigma、St.Louis
、MO)においてMS培地(Phytotechnology Labs、Shawne
e Mission、KS)および30g/Lスクロース上で発芽させた。patコピー
数分析による接合状態スクリーニングに続いて、ホモ接合型T1植物が選択され、成熟す
るまで温室で生育され、そこで自家受粉させておいた。次に、T2種子を収集し、表面殺
菌し、前述と同じように発芽され、植物トランス活性化試験のためにレポーター植物を生
成するのに使用された。
バリアントまたは天然植物トランス活性化相互作用モチーフを含有する植物ZFP−転
写活性化因子構築物が構築された。クローニングのための制限酵素部位BamHI/Sa
cIが隣接する植物トランス活性化相互作用モチーフ(天然と改変バリアントの両方)が
新規に合成された(DNA2.0、Menlo Park、CA)。植物トランス活性化
相互作用モチーフはBamHI/SacI断片上に動員され、既存のGateway(登
録商標)Entryバックボーンベクターに見出される独自のBamHI/SacI部位
を使用してZ6ジンクフィンガーDNA結合ドメインの直ぐ下流にクローニングされた(
Yokoi et al. (2007)、上記)。この段階が完了すると、ZFP転写活性化因子構築物(
植物トランス活性化相互作用モチーフに融合されたZ6 DNAジンクフィンガータンパ
ク質結合ドメインを含有する)は、構成的キャッサバ葉脈モザイクウイルス(Cassava Ve
in Mosaic Virus)プロモーター(CsVMVプロモーターv2; Verdaguer et al. (199
6) Plant Mol. Biol. 31:1129-39)の制御下に置かれ、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンス(A.tumefaciens)由来のORF23 3’UTRを終端とした。最終形質転換ベ
クター(表2)は、植物選択のために、シロイヌナズナ(A. thaliana)ユビキチン−3
プロモーター(At Ubi3プロモーターv2; Callis et al. (1995) Genetics, 139
(2):921-39))/ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼII(HPTII v1; G
ritz et al. (1983) Gene 25(2-3):179-88)/アグロバクテリウム・ツメファシエンス(
A.tumefaciens)オープンリーディングフレーム−24、3’非翻訳領域(Atu OR
F24 3‘UTR v2)カセットを含有するデスティネーションベクターとのGat
eway(登録商標)媒介ライゲーション(Invitrogen、Carlsbad、
CA)から生じた。
ツメファシエンス(A.tumefaciens)株であるLBA4404(Invitrogen)
に形質転換された。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインは含有するがトランス活性化
相互作用モチーフで構成された活性化因子は含まない対照ベクターであるpDAB106
238(図21)が含まれた。この構築物では、ジンクフィンガー結合ドメインは構成的
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefaciens)MASプロモーター(Atu
Masプロモーターv4;米国特許第5,001,060号、米国特許第5,573,9
32号および米国特許第5,290,924号)の制御下に置かれ、アグロバクテリウム
・ツメファシエンス(A.tumefaciens)由来のORF23 3’UTRを終端とした。さ
らに、ベクターは、植物選択のために、シロイヌナズナ(A. thaliana)ユビキチン−3
プロモーター/ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼII/アグロバクテリウム・
ツメファシエンス(A.tumefaciens)オープンリーディングフレーム−24、3’非翻訳
領域カセットを含有している。
ポータータバコ植物から切り取った葉片(1cm2)を、表2に収載されている16のプ
ラスミドのうちの1つを宿すアグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefaciens)
株であるLBA4404(Invitrogen、Carlsbad、CA)の一晩培養
物中でインキュベートし、OD600約1.2nmまで増殖させ、無菌フィルターペーパ
ー上で吸い取り乾燥させ、次に60×20mm皿(1皿あたり5片)中のMS培地(Ph
ytotechnology Labs、Shawnee Mission、KS)およ
び30g/Lスクロース上に置いて、1mg/Lのインドール酢酸および1mg/Lのベ
ンジアミノプリンを添加してNescofilm(登録商標)(Karlan Rese
arch Products Corporation、Cottonwood、AZ)
で密封した。48時間の共培養に続いて、葉片は250mg/Lのセフォタキシムおよび
10mg/Lのハイグロマイシンを有する同じ培地に移された。3〜4週間後、小植物は
、さらに2〜3週間、PhytaTrays(商標)中の250mg/Lのセフォタキシ
ムおよび10mg/Lのハイグロマイシンを有するMS培地に移され、続いて葉収穫およ
びgus発現分析を行った。合計で20〜30の植物イベントが、16の植物転写活性化
因子構築物ごとに生成された。
mRNA単離。トランスジェニックタバコ植物組織は新たに生育している小植物から収
穫され、96ウェル収集プレート(Qiagen)においてドライアイス上で急速冷凍さ
れた。次に、RNAは、製造業者の使用説明書に従って、RNEasy(登録商標)96
ウェル抽出キット(Qiagen)を使用して単離された。組織破壊にはModel 2
−96A Kleco(商標)組織粉砕機(Garcia Manufacturing
)が使用された。
hermo Scientific、Wilmington、DE)を使用して定量化さ
れた。それぞれのウェルはローディングに先立って4μLの無リボヌクレアーゼ水で覆わ
れ、4μLの非希釈試料を定量化する。mRNA濃度は、標準RNA核酸測定法を使用し
て、NanoDrop(商標)8000ソフトウェアから推定された。mRNAは無リボ
ヌクレアーゼ水で約83ng/μLまで手作業で希釈された(hand-diluted)。
登録商標)RTキット(Qiagen、Carlsbad、CA)を使用して希釈mRN
Aから調製された。合計で1μgのmRNAがそれぞれの反応で使用された。完了すると
、cDNAは分析が完了するまで−20℃で貯蔵された。
録商標)アッセイに類似している2つのDNA加水分解プローブアッセイを使用してgu
s遺伝子転写物レベルについて分析された。個々のイベントごとのgus mRNAの定
常状態レベルは、配列特異的プライマーおよびプローブを使用して評価された。前記mR
NAは、内在性タバコ基準遺伝子であるBYEEF(GenBank受託番号GI:92
7382)について定常状態レベルのmRNAを使用して正規化された。両遺伝子につい
てのアッセイは、LightCycler(登録商標)プローブ設計ソフトウェア2.0
(Roche Applied Science)を使用して設計された。両遺伝子につ
いてのリアルタイムPCRはLightCycler(登録商標)480システムを使用
して評価された。gus増幅では、LightCycler(登録商標)480プローブ
マスター混合物が、0.4μMのそれぞれのプライマーおよび0.2μMのプローブを含
有する10μL容積多重反応において1×最終濃度で調製された(表3)。
て3連で非希釈で実行され、それぞれの試料の分析に平均Ct値が使用された。BYEE
F増幅では、LightCycler(登録商標)480プローブマスター混合物が、0
.25μMのそれぞれのプライマー(表3)および0.1μMのUPL 119プローブ
(Roche Applied Science)を含有する10μL容積多重反応にお
いて1×最終濃度で調製された。2段階増幅反応は、58℃で25秒間、伸長物で実施さ
れ、蛍光を取得した。試料はすべて3連で1対10の希釈で実行され、それぞれの試料の
分析に平均Ct値が使用された。リアルタイムPCRデータの解析は相対定量モジュール
を使用するLightCycler(登録商標)ソフトウェアを使用して実施され、ΔΔ
Ct法に基づいている。次に、様々な植物転写活性化因子処理間での相対的発現レベルが
比較された(図29)。
図29は、BYEEF内在性遺伝子発現レベルにより正規化された場合の、様々な植物
トランス活性化相互作用モチーフについてのgus転写物レベルの得られた比を示してい
る。様々な植物トランス活性化相互作用モチーフのgus遺伝子の活性化は空ベクター対
照およびVP16トランス活性化ドメインのサブドメインIIの相互作用モチーフと比較
された。いくつかの植物トランス活性化相互作用モチーフは、VP16トランス活性化因
子のサブドメインIIと比べた場合、予想外に高レベルの発現を示した。例えば、PTI
4、DREB1A、ERF2、およびCBF1植物トランス活性化相互作用モチーフは、
VP16転写活性化ドメインのサブドメインIIよりも多くのgus mRNAを発現し
た。
性化相互作用モチーフにより産生されるmRNAのレベルは、植物トランス活性化相互作
用モチーフ間で異なった。ERF2植物トランス活性化相互作用モチーフの改変型は、E
RF2天然配列相互作用モチーフよりも顕著に多くのgus mRNAを産生した。同様
に、改変されたCBF1植物トランス活性化相互作用モチーフは、CBF1天然配列相互
作用モチーフよりも多くのmRNAを産生した。逆に、PTI4およびDREB1Aトラ
ンス活性化相互作用モチーフ内に導入された改変では、天然型のPTI4およびDREB
1A植物トランス活性化相互作用モチーフと比べた場合、産生されたgus mRNAレ
ベルは低かった。
GAL4結合ドメインを含むレポーター構築物を含有するタバコ系統
レポーター構築物であるpGalGUSは、下に記載される戦略を使用して構築される
。酵母GAL4結合配列および23bpスペーサー領域の6つの直列型繰り返し(Baleja
et al. (1997) J. Biomol. NMR 10:397-401に記載されている)は、クローニングを容易
にするためにSacII部位を加えて新規に合成される(IDT)。6×Gal4結合部
位はSacII断片上に移動され、これを使用して、SacIIでも消化される既存のエ
ントリーベクター由来のZ6結合部位を置き換える。このクローニング段階は、GAL4
結合部位を、gus遺伝子の発現を推進するシロイヌナズナ(Arabidopsis)アクチン2
プロモーターの直ぐ上流に置く。最終形質転換ベクターであるpGalGUS(図30)
は、植物選択に使用されるシロイヌナズナ(Arabidopsis)ユビキチン10プロモーター
−pat遺伝子発現カセットを含有するデスティネーションベクターでのGateway
(登録商標)形質転換反応から生じる。最終形質転換ベクターは、塩基配列決定により確
認され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefaciens)株であるLBA44
04(Invitrogen)中に形質転換される。
トランスジェニックレポーター植物は、上記のプロトコールを使用して作成される。「
pDAB9897を用いたタバコのアグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換
」を参照されたい。
低コンプレキシティコピー数、BASTA(登録商標)抵抗性トランスジェニック植物
が生成され、TaqMan(登録商標)コピー数分析に基づいて同定される。低コンプレ
キシティイベントのうち、PCR分析により決定される場合、サブセットが無傷のPTU
を示す。これらのイベントはサザンブロット分析によりさらに分析される。サザンブロッ
ト分析に続いて、少なくとも1つの単一コピー、無傷のPTUイベントが選択され、温室
で成熟するまで生育され、自家受粉させておく。T1種子が収集され、表面殺菌され、発
芽させる。patコピー数分析による接合状態スクリーニングに続いて、ホモ接合型T1
植物が選択され、温室で成熟するまで生育され、自家受粉させておく。次に、T2種子が
収集され、表面殺菌され、発芽させ(既に記載されている通りに)、これを使用して活性
化因子試験のためにレポーター植物を生成する。
バリアントまたは天然の植物トランス活性化相互作用モチーフを含有する植物GAL4
−転写活性化因子構築物が構築される。実施例4(「植物ZFP−植物転写活性化因子発
現構築物」)に記載される植物ZFP−転写活性化因子発現構築物は、ジンクフィンガー
結合タンパク質ポリヌクレオチド配列の代わりにGAL4結合タンパク質ポリヌクレオチ
ド配列を挿入することにより改変される。ヘミコット(hemicot)植物最適化GAL4
DNA結合ドメインポリヌクレオチド配列(Keegan et al. (1986) Science 231(4739):6
99-704)が、NcoI/BamHI断片としてジンクフィンガー結合タンパク質ポリヌク
レオチド配列の代わりに挿入される。この段階が完了すると、GAL4−転写活性化因子
構築物は構成的キャッサバ葉脈モザイクウイルス(Cassava Vein Mosaic Virus)プロモ
ーターの制御下に置かれ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefaciens)由
来のORF23 3’UTRを終端とする。最終バイナリー形質転換ベクターは、植物選
択のために、シロイヌナズナ(Arabidopsis)ユビキチン3−HptIIカセットを含有
するデスティネーションベクターでのGateway(登録商標)形質転換から生じて、
完成される。最終形質転換ベクターは塩基配列決定により確認され、アグロバクテリウム
・ツメファシエンス(A.tumefaciens)株であるLBA4404(Invitrogen
)中に形質転換される。
例4に記載される一過性形質転換プロトコールが使用される。合計で20〜30の植物イ
ベントが、16のGAL4−転写活性化因子構築物ごとに生成される。
ハイグロマイシン上で選択されるイベントは、2つのDNA加水分解プローブアッセイ
を使用してgus遺伝子転写物レベルについて分析される。個々のイベントごとの定常状
態レベルのgus mRNAは、配列特異的プライマーとプローブを使用して評価される
。イベントごとのmRNAは、内在性タバコ基準遺伝子、例えば、BYEEFの定常状態
レベルのmRNAを使用して正規化される。両遺伝子のアッセイは実施例4に記載される
プロトコールを使用して設計される。リアルタイムPCRデータの解析は、相対定量モジ
ュールを使用するLightCycler(登録商標)ソフトウェアを使用して実施され
、ΔΔCt法に基づいている。様々な活性化因子構築物の相対的発現レベルが比較される
。その結果によれば、植物トランス活性化相互作用モチーフおよびこれらの植物トランス
活性化相互作用モチーフの操作されたバリアントは転写活性化因子として使用することが
でき、遺伝子の転写活性化のためにGAL4結合タンパク質と融合することができること
が示されている。
TAL結合ドメインを含むレポーター構築物を含有するタバコ系統
レポーター構築物であるpTalGUSは下記の戦略を使用して構築される。AVRB
S3−誘導性遺伝子のコンセンサス結合配列から採取され、UPA DNA結合ドメイン
と名付けられた8つの直列型繰り返し配列(TATATAAACCTNNCCCTCT(
配列番号99))(Kay et al. (2009) Plant J. 59(6):859-71)は、クローニングを容
易にするためにSacII部位が付加されて新規に合成される(IDT)。8×UPA結
合部位はSacII断片上に動員され、これを使用して、同様にSacIIで消化される
既存のエントリーベクター由来のZ6結合部位を置き換える。このクローニング段階は、
UPA結合部位を、gus遺伝子の発現を推進するシロイヌナズナ(Arabidopsis)アク
チン2プロモーターの直ぐ上流に置く。最終形質転換ベクターであるpTalGUS(図
31)は、植物選択に使用されるシロイヌナズナ(A. thaliana)ユビキチン10プロモ
ーター/pat遺伝子発現カセットを含有するデスティネーションベクターでのGate
way(登録商標)形質転換反応から生じる。最終形質転換ベクターは、塩基配列決定に
より確認され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A. tumefaciens)株であるL
BA4404(Invitrogen)中に形質転換される。
トランスジェニックレポーター植物は、上記のプロトコールを使用して作成される。「
pDAB9897を用いたタバコのアグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換
」を参照されたい。
低コンプレキシティコピー数、BASTA(登録商標)抵抗性トランスジェニック植物
が生成され、TaqMan(登録商標)コピー数分析を利用して同定される。低コンプレ
キシティイベントのうち、PCR分析により決定される場合、サブセットが無傷のPTU
を示す。これらのイベントはサザンブロット分析によりさらに分析される。サザンブロッ
ト分析に続いて、少なくとも1つの単一コピー、無傷のPTUイベントが選択され、温室
で成熟するまで生育され、自家受粉させておく。T1種子が収集され、表面殺菌され、発
芽する。patコピー数分析による接合状態スクリーニングに続いて、ホモ接合型T1植
物が選択され、温室で成熟するまで生育され、自家受粉させておく。次に、T2種子が収
集され、表面殺菌され、発芽させ(既に記載されている通りに)、これを使用して活性化
因子試験のためにレポーター植物を生成する。
バリアントまたは天然の植物トランス活性化相互作用モチーフを含有する植物TAL−
転写活性化因子構築物が構築される。実施例4に記載される植物ZFP−転写活性化因子
発現構築物は、ジンクフィンガー結合タンパク質ポリヌクレオチド配列の代わりにTAL
結合タンパク質ポリヌクレオチド配列を挿入することにより改変される。DNA結合に必
要な17.5 TAL繰り返しは新規に合成され、トウモロコシ(Zea mays)Opaque
−2核局在化配列(nuclear localization sequence)(Van Eenennaam et al. (2004) M
etabolic Engineering 6:101-8)に融合される。それぞれのドメインの配列は、UPA−
ボックスコンセンサス配列について予測されるように、可変残基(12および13位)で
異なるアミノ酸を利用してDNA結合を指令する(Boch et al. (2009) Science 326(595
9):1509-12)。ヘミコット植物最適化TAL DNA結合ドメインポリヌクレオチド配列
が、NcoI/BamHI断片としてジンクフィンガー結合タンパク質ポリヌクレオチド
配列の代わりに挿入される。この段階が完了すると、TAL−転写活性化因子構築物は構
成的キャッサバ葉脈モザイクウイルス(Cassava Vein Mosaic Virus)プロモーターの制
御下に置かれ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumefaciens)由来のORF
23 3’UTRを終端とする。最終形質転換ベクターは、植物選択のために、シロイヌ
ナズナ(Arabidopsis)ユビキチン3−HptIIカセットを含有するデスティネーショ
ンベクターでのGateway(登録商標)形質転換から完成される。最終形質転換ベク
ターは塩基配列決定により確認され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(A.tumef
aciens)株であるLBA4404(Invitrogen)中に形質転換される。
に4に記載される一過性形質転換プロトコールが使用される。合計で20〜30の植物イ
ベントが、16のTAL−転写活性化因子構築物ごとに生成される。
ハイグロマイシン上で選択されるイベントは、2つのDNA加水分解プローブアッセイ
を使用してgus遺伝子転写物レベルについて分析される。個々のイベントごとのgus
mRNAの定常状態レベルは、配列特異的プライマーとプローブを使用して評価される
。前記mRNAは、内在性タバコ基準遺伝子、例えば、BYEEFのmRNAの定常状態
レベルを使用して正規化される。両遺伝子のアッセイは実施例4に記載されるプロトコー
ルを使用して設計される。リアルタイムPCRデータの解析は、相対定量モジュールを使
用するLightCycler(登録商標)ソフトウェアを使用して実施され、ΔΔCt
法に基づいている。様々な活性化因子構築物の相対的発現レベルが比較される。
本発明は、以下の態様を含む。
[1]
DNA結合ポリペプチド、および 配列番号10〜58からなる群から選択されるトランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドを含む合成転写活性化因子融合タンパク質。
[2]
DNA結合ポリペプチドが、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、AVRBS3誘導性遺伝子由来のコンセンサス結合配列またはそれから操作された合成結合配列、GAL4、TAL、LexA、Tetリプレッサー、LacR、およびステロイドホルモン受容体からなる群から選択される、[1]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[3]
少なくとも1つの追加のDNA結合ポリペプチドを含む、[1]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[4]
配列番号2〜8および配列番号100〜120からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、[1]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[5]
トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号10〜16、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配列番号58からなる群から選択される、[1]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[6]
トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号17、配列番号23、配列番号29、配列番号35、配列番号41、配列番号47、および配列番号53からなる群から選択される、[1]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[7]
トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号18、配列番号24、配列番号30、配列番号36、配列番号42、配列番号48、および配列番号54からなる群から選択される、[1]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[8]
トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号19、配列番号25、配列番号31、配列番号37、配列番号43、配列番号49、および配列番号55からなる群から選択される、[1]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[9]
トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号20、配列番号26、配列番号32、配列番号38、配列番号44、配列番号50、および配列番号56からなる群から選択される、[1]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[10]
トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号21、配列番号27、配列番号33、配列番号39、配列番号45、配列番号51、および配列番号57からなる群から選択される、[1]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[11]
少なくとも1つの追加のトランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドを含む、[1]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[12]
対象のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結している場合、対象のヌクレオチド配列の発現を増加させる合成転写活性化因子融合タンパク質であって、第二のヌクレオチド配列に特異的に結合するDNA結合ポリペプチド、および配列番号10〜16、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配列番号58からなる群から選択されるタンパク質トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドを含む融合タンパク質。
[13]
DNA結合ポリペプチド、および配列番号10〜16、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配列番号58からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%の配列同一性を有するトランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドを含む合成転写活性化因子融合タンパク質。
[14]
トランス活性化ドメイン相互作用ポリペプチドが、配列番号10〜16、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配列番号58からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有する、[13]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[15]
トランス活性化ドメイン相互作用ポリペプチドが、配列番号10〜16、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配列番号58からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%の配列同一性を有する、[13]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[16]
トランス活性化ドメイン相互作用ポリペプチドが、配列番号10〜16、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配列番号58からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも95%の配列同一性を有する、[13]に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。
[17]
合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸であって、DNA結合ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、および配列番号10〜58からなる群から選択されるトランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含み、第一および第二のポリヌクレオチド配列が前記核酸からインフレームでおよび単一転写物で発現される、核酸。
[18]
DNA結合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの追加のポリヌクレオチド配列を含む、[17]に記載の核酸。
[19]
配列番号10〜58からなる群から選択されるトランス活性化ドメイン相互作用ポリペプチドをコードする少なくとも1つの追加のポリヌクレオチド配列を含む、[17]に記載の核酸。
[20]
第一および第二のポリヌクレオチド配列が遺伝子調節エレメントに作動可能に連結されている、[17]に記載の核酸。
[21]
第一および第二のポリヌクレオチド配列が第三のポリヌクレオチド配列により分離されている、[17]に記載の核酸。
[22]
宿主細胞のゲノムに組み込まれている、[17]に記載の核酸。
[23]
宿主細胞が植物細胞である、[22]に記載の核酸。
[24]
DNA結合ポリペプチドが、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、AVRBS3誘導性遺伝子由来のコンセンサス結合配列またはそれから操作された合成結合配列、GAL4、TAL、LexA、Tetリプレッサー、LacR、およびステロイドホルモン受容体からなる群から選択される、[17]に記載の核酸。
[25]
DNA結合ポリペプチドが、配列番号67、配列番号68、および配列番号99からなる群から選択される配列に特異的に結合する、[24]に記載の核酸。
[26]
[17]に記載の核酸を含むベクター。
[27]
選択可能マーカーまたはスクリーニング可能マーカーを含む、[26]に記載のベクター。
[28]
植物発現ベクターである、[26]に記載のベクター。
[29]
合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸であって、DNA結合ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、および配列番号2〜8、配列番号10〜16、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、配列番号58、および配列番号100〜120からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%の配列同一性を有するトランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列を含み、第一および第二のポリヌクレオチド配列が前記核酸からインフレームでおよび単一転写物で発現される、核酸。
[30]
配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[29]に記載の核酸。
[31]
配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも85%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[29]に記載の核酸。
[32]
配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[29]に記載の核酸。
[33]
配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも95%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[29]に記載の核酸。
[34]
配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも97%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[29]に記載の核酸。
[35]
配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも98%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、[29]に記載の核酸。
[36]
配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、[29]に記載の核酸。
[37]
DNA結合ポリペプチドが、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、AVRBS3誘導性遺伝子由来のコンセンサス結合配列またはそれから操作された合成結合配列、GAL4、TAL、LexA、Tetリプレッサー、LacR、およびステロイドホルモン受容体からなる群から選択される、[29]に記載の核酸。
[38]
合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸であって、配列番号80〜93、配列番号80〜93のうちの1つと実質的に同一であるヌクレオチド配列、配列番号80〜93のうちの少なくとも1つに特異的にハイブリダイズ可能であるポリヌクレオチドの相補体、および配列番号80〜93のうちの少なくとも1つに特異的にハイブリダイズ可能であるポリヌクレオチドの逆相補体からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む核酸。
[39]
[17]に記載の核酸を含む細胞。
[40]
植物細胞または酵母細胞である、[39]に記載の細胞。
[41]
[29に記載の核酸を含む細胞。
[42]
植物細胞または酵母細胞である、[41]に記載の細胞。
[43]
[39]に記載の細胞を含む植物組織、植物部分、植物商品生産物、または植物体全体。
[44]
[41]に記載の細胞を含む植物組織、植物部分、植物商品生産物、または植物体全体。
[45]
宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させるための方法であって、DNA結合ポリペプチドに特異的に結合する第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている対象のヌクレオチド配列を含む宿主細胞に、[17]に記載の核酸を導入し、それによって宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させることを含む方法。
[46]
前記核酸を宿主細胞に導入することが、前記核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することを含む、[45]に記載の方法。
[47]
前記核酸が宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、[45]に記載の方法。
[48]
対象のヌクレオチド配列が外来性ヌクレオチド配列である、[45]に記載の方法。
[49]
対象のヌクレオチド配列が内在性ヌクレオチド配列である、[45]に記載の方法。
[50]
前記核酸を宿主細胞に導入することが、前記核酸を含む植物を、宿主細胞を含む植物と交雑させることを含む、[45]に記載の方法。
[51]
宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させるための方法であって、DNA結合ポリペプチドに特異的に結合する第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている対象のヌクレオチド配列を、[17]に記載の核酸を含む宿主細胞に導入し、それによって宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させることを含む方法。
[52]
対象のヌクレオチド配列を宿主細胞に導入することが、対象のヌクレオチド配列を含むベクターを宿主細胞に導入することを含む、[51]に記載の方法。
[53]
前記核酸が宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、[51]に記載の方法。
[54]
第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている対象のヌクレオチド配列が、宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、[51]に記載の方法。
[55]
対象のヌクレオチド配列を宿主細胞に導入することが、対象のヌクレオチド配列を含む植物を、宿主細胞を含む植物と交雑させることを含む、[51]に記載の方法。
[56]
宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させるための方法であって、DNA結合ポリペプチドに特異的に結合する第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている対象のヌクレオチド配列を含む宿主細胞に、[17]に記載の核酸を導入し、それによって宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させることを含む方法。
[57]
合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸であって、DNA結合ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、および植物遺伝子発現のトランス活性化のための手段をコードする第二のポリヌクレオチド配列を含み、第一および第二のポリヌクレオチド配列が前記核酸からインフレームでおよび単一転写物で発現される、核酸。
[58]
宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させるための方法であって、DNA結合ポリペプチドに特異的に結合する第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている対象のヌクレオチド配列を含む宿主細胞に、[57]に記載の核酸を導入し、それによって宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させることを含む方法。
[59]
宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させるための方法であって、DNA結合ポリペプチドに特異的に結合する第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている対象のヌクレオチド配列を、[57]に記載の核酸を含む宿主細胞に導入し、それによって宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させることを含む方法。
[60]
配列番号121〜127からなる群から選択されるトランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
[61]
[60]に記載の核酸に特異的にハイブリダイズ可能である核酸の相補体。
[62]
[60]に記載の核酸に特異的にハイブリダイズ可能である核酸の逆相補体。
[63]
トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配列番号58からなる群から選択される、[60]に記載の核酸。
[64]
配列番号121〜127からなる群から選択されるトランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドを含むポリペプチド。
[65]
トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配列番号58からなる群から選択される、[64]に記載のポリペプチド。
Claims (65)
- DNA結合ポリペプチド、および
配列番号10〜58からなる群から選択されるトランス活性化ドメイン相互作用モチー
フポリペプチド
を含む合成転写活性化因子融合タンパク質。 - DNA結合ポリペプチドが、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、AVRBS3誘導
性遺伝子由来のコンセンサス結合配列またはそれから操作された合成結合配列、GAL4
、TAL、LexA、Tetリプレッサー、LacR、およびステロイドホルモン受容体
からなる群から選択される、請求項1に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。 - 少なくとも1つの追加のDNA結合ポリペプチドを含む、請求項1に記載の合成転写活
性化因子融合タンパク質。 - 配列番号2〜8および配列番号100〜120からなる群から選択されるアミノ酸配列
を含む、請求項1に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。 - トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号10〜16、配列番
号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、お
よび配列番号58からなる群から選択される、請求項1に記載の合成転写活性化因子融合
タンパク質。 - トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号17、配列番号23
、配列番号29、配列番号35、配列番号41、配列番号47、および配列番号53から
なる群から選択される、請求項1に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。 - トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号18、配列番号24
、配列番号30、配列番号36、配列番号42、配列番号48、および配列番号54から
なる群から選択される、請求項1に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。 - トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号19、配列番号25
、配列番号31、配列番号37、配列番号43、配列番号49、および配列番号55から
なる群から選択される、請求項1に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。 - トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号20、配列番号26
、配列番号32、配列番号38、配列番号44、配列番号50、および配列番号56から
なる群から選択される、請求項1に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。 - トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが配列番号21、配列番号27
、配列番号33、配列番号39、配列番号45、配列番号51、および配列番号57から
なる群から選択される、請求項1に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。 - 少なくとも1つの追加のトランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドを含む
、請求項1に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。 - 対象のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結している場合、対
象のヌクレオチド配列の発現を増加させる合成転写活性化因子融合タンパク質であって、
第二のヌクレオチド配列に特異的に結合するDNA結合ポリペプチド、および
配列番号10〜16、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列
番号46、配列番号52、および配列番号58からなる群から選択されるタンパク質トラ
ンス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチド
を含む融合タンパク質。 - DNA結合ポリペプチド、および
配列番号10〜16、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列
番号46、配列番号52、および配列番号58からなる群から選択されるアミノ酸配列に
少なくとも80%の配列同一性を有するトランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペ
プチド
を含む合成転写活性化因子融合タンパク質。 - トランス活性化ドメイン相互作用ポリペプチドが、配列番号10〜16、配列番号22
、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配
列番号58からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有
する、請求項13に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。 - トランス活性化ドメイン相互作用ポリペプチドが、配列番号10〜16、配列番号22
、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配
列番号58からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%の配列同一性を有
する、請求項13に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。 - トランス活性化ドメイン相互作用ポリペプチドが、配列番号10〜16、配列番号22
、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配
列番号58からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも95%の配列同一性を有
する、請求項13に記載の合成転写活性化因子融合タンパク質。 - 合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸であって、
DNA結合ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、および
配列番号10〜58からなる群から選択されるトランス活性化ドメイン相互作用モチーフ
ポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド配列
を含み、第一および第二のポリヌクレオチド配列が前記核酸からインフレームでおよび単
一転写物で発現される、核酸。 - DNA結合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの追加のポリヌクレオチド配列を
含む、請求項17に記載の核酸。 - 配列番号10〜58からなる群から選択されるトランス活性化ドメイン相互作用ポリペ
プチドをコードする少なくとも1つの追加のポリヌクレオチド配列を含む、請求項17に
記載の核酸。 - 第一および第二のポリヌクレオチド配列が遺伝子調節エレメントに作動可能に連結され
ている、請求項17に記載の核酸。 - 第一および第二のポリヌクレオチド配列が第三のポリヌクレオチド配列により分離され
ている、請求項17に記載の核酸。 - 宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項17に記載の核酸。
- 宿主細胞が植物細胞である、請求項22に記載の核酸。
- DNA結合ポリペプチドが、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、AVRBS3誘導
性遺伝子由来のコンセンサス結合配列またはそれから操作された合成結合配列、GAL4
、TAL、LexA、Tetリプレッサー、LacR、およびステロイドホルモン受容体
からなる群から選択される、請求項17に記載の核酸。 - DNA結合ポリペプチドが、配列番号67、配列番号68、および配列番号99からな
る群から選択される配列に特異的に結合する、請求項24に記載の核酸。 - 請求項17に記載の核酸を含むベクター。
- 選択可能マーカーまたはスクリーニング可能マーカーを含む、請求項26に記載のベク
ター。 - 植物発現ベクターである、請求項26に記載のベクター。
- 合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸であって、
DNA結合ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、および
配列番号2〜8、配列番号10〜16、配列番号22、配列番号28、配列番号34、配
列番号40、配列番号46、配列番号52、配列番号58、および配列番号100〜12
0からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%の配列同一性を有するトラ
ンス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチド
配列
を含み、第一および第二のポリヌクレオチド配列が前記核酸からインフレームでおよび単
一転写物で発現される、核酸。 - 配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも80%の
同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の核酸。 - 配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも85%の
同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の核酸。 - 配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも90%の
同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の核酸。 - 配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも95%の
同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の核酸。 - 配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも97%の
同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の核酸。 - 配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも98%の
同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項29に記載の核酸。 - 配列番号80〜93からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項29に
記載の核酸。 - DNA結合ポリペプチドが、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、AVRBS3誘導
性遺伝子由来のコンセンサス結合配列またはそれから操作された合成結合配列、GAL4
、TAL、LexA、Tetリプレッサー、LacR、およびステロイドホルモン受容体
からなる群から選択される、請求項29に記載の核酸。 - 合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸であって、
配列番号80〜93、
配列番号80〜93のうちの1つと実質的に同一であるヌクレオチド配列、
配列番号80〜93のうちの少なくとも1つに特異的にハイブリダイズ可能であるポリヌ
クレオチドの相補体、および
配列番号80〜93のうちの少なくとも1つに特異的にハイブリダイズ可能であるポリヌ
クレオチドの逆相補体
からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む核酸。 - 請求項17に記載の核酸を含む細胞。
- 植物細胞または酵母細胞である、請求項39に記載の細胞。
- 請求項29に記載の核酸を含む細胞。
- 植物細胞または酵母細胞である、請求項41に記載の細胞。
- 請求項39に記載の細胞を含む植物組織、植物部分、植物商品生産物、または植物体全
体。 - 請求項41に記載の細胞を含む植物組織、植物部分、植物商品生産物、または植物体全
体。 - 宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させるための方法であって、
DNA結合ポリペプチドに特異的に結合する第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている対象のヌクレオチド配列を含む宿主細胞に、請求項17に記載の核酸を導入し、
それによって宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させることを含む方
法。 - 前記核酸を宿主細胞に導入することが、前記核酸を含むベクターを宿主細胞に導入する
ことを含む、請求項45に記載の方法。 - 前記核酸が宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項45に記載の方法。
- 対象のヌクレオチド配列が外来性ヌクレオチド配列である、請求項45に記載の方法。
- 対象のヌクレオチド配列が内在性ヌクレオチド配列である、請求項45に記載の方法。
- 前記核酸を宿主細胞に導入することが、前記核酸を含む植物を、宿主細胞を含む植物と
交雑させることを含む、請求項45に記載の方法。 - 宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させるための方法であって、
DNA結合ポリペプチドに特異的に結合する第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている対象のヌクレオチド配列を、請求項17に記載の核酸を含む宿主細胞に導入し、
それによって宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させることを含む方
法。 - 対象のヌクレオチド配列を宿主細胞に導入することが、対象のヌクレオチド配列を含む
ベクターを宿主細胞に導入することを含む、請求項51に記載の方法。 - 前記核酸が宿主細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項51に記載の方法。
- 第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている対象のヌクレオチド配列が、宿主
細胞のゲノムに安定的に組み込まれる、請求項51に記載の方法。 - 対象のヌクレオチド配列を宿主細胞に導入することが、対象のヌクレオチド配列を含む
植物を、宿主細胞を含む植物と交雑させることを含む、請求項51に記載の方法。 - 宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させるための方法であって、
DNA結合ポリペプチドに特異的に結合する第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている対象のヌクレオチド配列を含む宿主細胞に、請求項17に記載の核酸を導入し、
それによって宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させることを含む方
法。 - 合成転写活性化因子融合タンパク質をコードする核酸であって、
DNA結合ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチド配列、および
植物遺伝子発現のトランス活性化のための手段をコードする第二のポリヌクレオチド配列
を含み、第一および第二のポリヌクレオチド配列が前記核酸からインフレームでおよび単
一転写物で発現される、核酸。 - 宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させるための方法であって、
DNA結合ポリペプチドに特異的に結合する第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている対象のヌクレオチド配列を含む宿主細胞に、請求項57に記載の核酸を導入し、
それによって宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させることを含む方
法。 - 宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させるための方法であって、
DNA結合ポリペプチドに特異的に結合する第二のヌクレオチド配列に作動可能に連結さ
れている対象のヌクレオチド配列を、請求項57に記載の核酸を含む宿主細胞に導入し、
それによって宿主細胞において対象のヌクレオチド配列の発現を増加させることを含む方
法。 - 配列番号121〜127からなる群から選択されるトランス活性化ドメイン相互作用モ
チーフポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。 - 請求項60に記載の核酸に特異的にハイブリダイズ可能である核酸の相補体。
- 請求項60に記載の核酸に特異的にハイブリダイズ可能である核酸の逆相補体。
- トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが、配列番号22、配列番号2
8、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配列番号58か
らなる群から選択される、請求項60に記載の核酸。 - 配列番号121〜127からなる群から選択されるトランス活性化ドメイン相互作用モ
チーフポリペプチドを含むポリペプチド。 - トランス活性化ドメイン相互作用モチーフポリペプチドが、配列番号22、配列番号2
8、配列番号34、配列番号40、配列番号46、配列番号52、および配列番号58か
らなる群から選択される、請求項64に記載のポリペプチド。
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