JP2001503995A - 安定なトランスジェニック植物内のキメラＧａ１４転写因子による特異的遺伝子活性化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｇａｌ４キメラ転写因子を利用する、安定に形質転換されたトランスジェニック植物細胞内での遺伝子発現を調節するための方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 安定なトランスジェニック植物内のキメラＧａｌ４転写因子による特異的遺伝子 活性化 発明の分野 本発明は、２構成成分系を用いる導入遺伝子発現の調節法、ならびに一層具体 的には、１）Ｇａｌ４結合部位および場合によっては追加的調節要素を含むプロ モーター、および２）Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを含 むキメラ転写因子を含む、安定に形質転換された植物に特異的な系に関する。 発明の背景 病害虫耐性を初めとする多種多様の形質についての作物の改善、ならびに油、 スターチ、もしくは蛋白質組成のような殻粒品質の改善は、新規もしくは改変さ せた遺伝子（導入遺伝子）を植物ゲノム内に導入することにより達成され得る。 導入遺伝子を初めとする遺伝子の発現は一般的には、蛋白質／ＤＮＡおよび蛋白 質／蛋白質相互作用という複合体の組み合わせを通してプロモーターにより制御 される。プロモーターは、構成的であるか、または発生中の特異的組織もしくは 時期に限定されるかのいずれかとなる発現様式を伝達することができる。導入遺 伝子発現のための現存のプロモーターを用いることで達成可能となる発現の種類 には限界がある。一つの限界は達成可能な発現レベルである。プロモーター強度 に限界があるため、導入された遺伝子の比較的高い発現を必要とする形質を取得 するのは困難である。第二の限界は、利用される特別 なプロモーターにより付与される発現のパターンは、同一のプロモーター依存的 発現パターンが世代から世代へと付与されてゆくという点で非柔軟的となること である。 所定の形質を伝達するためには、形質伝達性導入遺伝子発現を後の世代では違 う様式で行うように調節する能力を有することが所望される。種子の生育能にと って有害な副作用を有するが、それが子実産物においては所望される形質がその 一例である。例えば殻粒内に、種子の生育能にとっては有害である、蛋白質、ス ターチ、もしくは他の物質（更なる栽培のために種子が利用されることのない産 物）を産生させるために植物種子を使用することが企図され得る。この場合には 、殻粒生産の時期になるまで育種系統内では不活性状態をとる形質付与性導入遺 伝子を保持することが所望される。その後にその殻粒内で形質遺伝子を活性化さ せるためには新規の種類の発現系が必要とされる。 導入遺伝子発現の現行法におけるもう一つの限界は、トランスジェニック殻粒 内では複数の導入遺伝子を調和させた状態で調節することが出来ないことである 。複数の遺伝子の調和的調節を指令する同一プロモーターの多重コピーは、リピ ート誘導性遺伝子サイレンシング（ｒｅｐｅａｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）（Ｙｅ ａｎｄ Ｓｉｇｎｅｒ，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０８８１−１０８８６）もしくは 別の同時サプレッション手段を介する遺伝子不活化をもたらし得る。従って、複 数の導入遺伝子を調和的に調節する手段が所望される。 転写活性化は、エンハンサーおよびプロモーター要素と相互作用する転写因子 を介して最初に介在を受ける。そういったＤＮＡ要素への転写 因子の結合が転写開始のための重要な段階を構成する。転写因子の構造および機 能の解析により、これら蛋白質の内の多くは、特異的ＤＮＡ結合ドメインおよび 個別かつ独立して作用する活性化ドメインでできているモジュラー蛋白質構造を 有すること（すなわち、そういった蛋白質はモジュラーであることがしばしばで ある）が判明している。研究者により、ヘテロドメインを組み合わせることがで き、得られる合成アクチベーターは哺乳類細胞内で機能性を示すことが見いださ れている。こういったアクチベーターの一例は、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン のＶＰ１６の活性化ドメインとの融合により産生される蛋白質である。 各転写因子はプロモーター内の特異的結合配列に結合し、そして転写複合体の 一部であるコアクチベーターおよび／または蛋白質との相互作用を通して、リン クされているコーディング領域の発現を活性化させる。異なる蛋白質に由来する ＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインをリンクさせてキメラ転写因子を産生する ことができる。これまでに調査されている一つの転写因子は酵母の転写因子Ｇａ ｌ４であり、これはＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインよりなる。天然の Ｇａｌ４は８８１のアミノ酸からなる蛋白質であり、これは酵母であるＳ．ケレ ビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるガラクトース異化作用に必要 とされる遺伝子の転写アクチベーターである。蛋白質はＵＡＳ_Gと称される上流 活性化配列に特異的に結合し、そして互いに異なる様式で転写される遺伝子ＧＡ Ｌ１およびＧＡＬ１０の転写を活性化させる。 ２構成成分転写因子／標的プロモーター系を用いると、現存のプロモーターで の導入遺伝子発現の既述の限界に対処することができる。例えば、Ｇａｌ４ Ｄ ＮＡ結合ドメインを含むキメラ転写因子を、２構成成 分遺伝子発現系の基本として用いることができる。事実、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合 ドメインおよび多種多様の活性化ドメインを含むキメラ転写因子がトランジエン トアッセイにおいて植物細胞にうまく用いられているが、安定な形質転換体には なっていない。 それ自体の活性化ドメインの内の一つもしくは二つに融合させた酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインは、タバコのプロトプラストにおけるトランジエントアッ セイではプロモーター内にＧａｌ４結合部位が存在する状態で、クロラムフェニ コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子の発現を活性化 することができた（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３４，ｐ ６３１−６３３）。この発現レベルはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターにより指令 されるものに類似していた。Ｇａ１４ ＤＮＡ結合ドメインおよび大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡ断片によりコードされる活性化ドメインからなるキメラ転写 因子も発現を活性化させた。 Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン、およびＧＢＦ１のプロリンリッチ活性化ドメ イン（これはアラビドプシス サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉ ａｎａ ）のＧ−ｂｏｘ結合転写因子である）からなるキメラ転写因子はダイズ細 胞培養プロトプラストを用いるトランジエントアッセイにおいて検査した際には 、Ｇａｌ４結合部位がプロモーター内に存在する状態でルシフェラーゼレポータ ー遺伝子の発現を活性化させた（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２ ＥＭＢＯ Ｊ １１ ｐ１２７５−１２８９）。活性化された発現はＧａｌ４ ／大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）活性化ドメイン因子によりもたらされたものより劣 っていた。未処理Ｇａｌ４蛋白質によっては活性化は全く観察されず、こ の現象は不十分な翻訳もしくは蛋白質の不安定性による可能性があることによる と推測された。 Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインおよびＰｖＡｌｆの活性化ドメイン（このＰｖ Ａｌｆはファセオルス ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ） の種子特異的転写因子である）からなるキメラ転写因子はＧａｌ４結合部位がプ ロモーター内に存在する状態ではインゲンマメの子葉細胞内でのトランジエント アッセイではＣＡＴレポーター遺伝子の発現を活性化した（Ｂｏｂｂ ｅｔ ａ ｌ．，１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｊ．８ ｐ１０１−１１３）。 Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインの影響は、ＧＵＳとＮＰＴＩＩレポーター遺伝 子を含み、Ｇａｌ４部位がそれらのプロモーター内に存在する安定に形質転換さ れたタバコ植物においては全く検出されなかった（Ｒｅｕｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ ．，１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １４ ｐ７７３−７７ ６）。Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン蛋白質の発現は全く検出されなかった。 １９９６年８月９日に開示されたカナダ特許出願第２，１５０，０３９号は、 天然のＧａｌ４をトランスアクチベーターとして用いるトランスジェニック植物 における遺伝子発現を制御する方法を記載している。具体的にはこの特許出願は 、Ｇａｌ４部位がプロモーター内に存在するＧＵＳレポーター遺伝子が、構成的 ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターから発現されるＧａｌ４蛋白質による標的化を受け る例を開示している。これら２つの構成成分はアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏ ｐｓｉｓ ）の根細胞内に同時導入され、そしてカルス培養物から成長する葉組織 をアッセイした。この葉物質をＧＵＳについてのみ染色した際には、葉脈がレポ ーター活性の発現について陽性であった。これらの結果は葉全体および全ての組 織における構成的発現の期待とは一致しない。言い換えると、予期された結果は 、ＧＵＳの発現は３５Ｓプロモーターから直接発現されるＧＵＳの例とは区別出 来ないはずであった（Ｂｅｎｆｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ ９：１６８ ５−１６９６（１９９０）；Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１３ ：８１０−８１２（１９８５））。従って葉脈内でのみ検出された発現は、３５ Ｓプロモーターにより制御される記載の系の機能にはよらないことが可能性とし て考えられる。葉脈内での発現は、葉脈内での発現を指令する内因性調節配列へ の隣接するＧＵＳの組込みによるものであるかも知れず（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ９：１ ７９７−１８１０；Ｔｏｐｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｊ ．５：８９５−９０３）、あるいはＧＵＳコーディング領域に操作的に連結され るプロモーターからのバックグラウンド発現によるものであるかも知れない。Ｇ ａｌ４トランスアクチベーターが発現され、そしてＧＵＳ発現を制御するように 機能しているということは全く示されておらず、なぜならＧａｌ４トランスアク チベーターは同時導入され、そしてＧａｌ４部位プロモーターを活性化させるた めに個別に添加されないためである。この結果により先に論議されるように他の 研究者により見いだされたものと同様に、Ｇａｌ４でのトランス活性化系の不首 尾が示される。 Ｇａｌ４キメラ転写因子／標的プロモーター系はトランジエントアッセイでは 植物細胞内で機能しうることが知られているものの、安定に形質転換された植物 内でのこの種の系を使用する試みについての失敗例も しくは決定的でない例のみが報告されているに過ぎない。従って２構成成分系に ついて導入遺伝子発現を調節する必要性が依然として存在する。このような系が 利用可能であれば、１９９２年５月２９日に公開された国際公開第ＷＯ ９２／ ０８３４１号を有するＰＣＴ出願（この開示は引用により本明細書に取り込まれ る）に記載されているもののような他の技術を用いて生産場所においてのみその 形質遺伝子の発現を誘導することができる。他の場合には、２構成成分系を用い て所望の組織もしくは細胞種類特異性を有するプロモーターからの発現レベルを 、その所望される組織もしくは細胞種類特異性を保持しながら増幅させることが できてよい。２構成成分系を用いて更には複数の導入遺伝子を調和的に調節して よい。更には、例えば高リシンおよび／またはメチオニン含有量を有する蛋白質 の発現のような形質を達成するためには高レベル蛋白質産物が必要とされ、そし てそれがその後に種子のアミノ酸構成成分を改善することが出来る特性のためは 、既知のプロモーターではこれまでには取得されなかった発現レベルを達成する 発現系が所望される。 発明の要約 本発明は、 ａ）５’−３’方向で （１）少なくとも一つのＧａｌ４結合配列に操作的に連結されるプロモータ ー； （２）プロモーターに操作的に連結されたコーディング配列もしくはその相 補体；および （３）コーディング配列もしくはその相補体に操作的に連結されたポリアデ ニル化シグナル配列；ただしそのプロモーターが最小プロモー ターである場合には、Ｇａｌ４結合配列はその最小プロモーターの上流に位置す る： を含む第一キメラ遺伝子；ならびに ｂ）５’−３’方向で （１）プロモーター； （２）Ｇａｌ４転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮ Ａ配列； （３）（２）のＤＮＡ配列に操作的に連結される転写活性化ドメインをコー ドするＤＮＡ配列；および （４）（３）のＤＮＡ配列に操作的に連結されるポリアデニル化シグナル配 列； を含む第二キメラ遺伝子、 を植物細胞のゲノム内へ組み入れることを含む、安定に形質転換させたトランス ジェニック植物細胞内での遺伝子発現を調節するための方法に関し、この場合、 第二キメラ遺伝子の発現は第一キメラ遺伝子の発現を調節する。 他の態様では、第一遺伝子は更には少なくとも一つの調節因子を含むことがで きる。 図面および配列表の簡単な説明 本特許出願は、カラーで仕上げられた少なくとも一つの図面を含む。カラー図 面（一つもしくは複数）を伴う本特許のコピーは、請求および必要料金の支払い により、特許商標庁により提供されるであろう。 図１は、ｐＧＥＭ９Ｚｆ内にキメラＧ４Ｇ遺伝子を含むプラスミドｐＧ４Ｇの 地図である。Ｇ４Ｇ遺伝子は、Ｇａｌ４結合部位、−６５ファ セオリンプロモーター領域およびリーダー、ＧＵＳコーディング領域、ならびに ファセオリン３’ポリアデニル化シグナル配列領域からなる。 図２は、プラスミドｐＰｈＧ４Ｇの地図である。これはｐＧ４Ｇからの改変物 であり；Ｇ４Ｇ遺伝子の上流に添加されたファセオリンプロモーターの５’上流 領域からの追加的配列を有する。 図３は、本研究に用いられる合成プロモーターとの比較を行い、そしてＧａｌ ４要素間と他の調節要素との組み合わせ物示す図である。 図４は、プラスミドｐＰｈ／Ｐ−Ｇ４Ａｌｆの地図である。これは、キメラＰ ｈ／Ｐ−Ｇａｌ４−ＰｖＡｌｆ遺伝子が既に導入されているプラスミドｐＵＣ１ ８である。このキメラ遺伝子は、ファセオリンプロモーターおよびリーダー、Ｇ ａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）、ＰｖＡｌｆ活性化ドメイン（ＡＤ）、な らびにファセオリン３’シグナル配列領域からなる。 図５は、プラスミドｐ３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆの地図である。これは、キメラｐ３ ５Ｓ−Ｇａｌ４−ＰｖＡｌｆ遺伝子が既に導入してあるプラスミドｐＵＣ１８で ある。このキメラ遺伝子は図３に示されているものと同様のものであるが、ファ セオリンプロモーターに代わる３５Ｓプロモーターおよびクロロフィルａ／ｂ結 合性蛋白質リーダーの置換を伴う。 図６は、ｐＰｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６の地図である。これは、キメラＰｈ／Ｐ− Ｇａｌ４−ＰＶ１６遺伝子が既に導入してあるプラスミドｐＵＣ１８である。こ のキメラ遺伝子は図３に示されているものと同様のものであるが、ＰｖＡｌｆ活 性化ドメインに代わるＶＰ１６活性化ドメインの置換を伴う。 図７は、プラスミドｐ３５Ｓ−Ｇａ４ＶＰ１６の地図である。これは、 キメラｐ３５Ｓ−Ｇａｌ４−ＶＰ１６遺伝子が既に挿入されているプラスミドｐ ＵＣ１８である。この遺伝子は図４に示されているものと同じであるが、ＰｖＡ ｌｆ活性化ドメインに代わるＶＰ１６活性化ドメインの置換を伴う。 図８は、この研究に用いられるキメラＧａｌ４アクチベーターをコードする異 なる発現カセットを示す。 図９は、トランスジェニックタバコ種子内でのキメラトランスアクチベーター Ｐｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６によるｐＺＢＬ３からのＧＵＳレポーター遺伝子の特異 的活性化を証明する蛍光アッセイの結果を示す。遺伝交雑物を、異なるレポータ ー系統（ｐＺＢＬ２ ２Ｃ、１１Ａ、４Ｂ；ｐＺＢＬ３ ２Ａ、６Ａ、４Ｂ、３ Ｄ）ならびに異なるＰｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６エフェクター系統（１４Ａ、１５Ａ 、および１３Ｂ）との間に作成した。 図１０は、トランスジェニックタバコ種子内でのキメラトランスアクチベータ ー３５Ｓ−Ｇ４ＶＰ１６によるｐＺＢＬ３からのＧＵＳレポーター遺伝子の特異 的活性化を証明する蛍光アッセイの結果を示す。遺伝交雑物を、異なるレポータ ー株（ｐＺＢＬ２ ２Ｃ、１１Ａ、４Ｂ；ｐＺＢＬ３ ２Ａ、６Ａ、４Ｂ、３Ｄ ）ならびに異なる３５Ｓ−Ｇ４ＶＰ１６エフェクター系統（１２Ａ、５Ａ、およ び２０Ａ）との間に作成した。 図１１は、トランスジェニックタバコ種子内でのＰｈ／Ｐ−Ｇ４Ａｌｆによる ｐＺＢＬ３からのＧＵＳレポーター遺伝子の特異的活性化を証明する蛍光アッセ イの結果を示す。遺伝交雑物を、異なるレポーター系統（ｐＺＢＬ２ ２Ｃ、１ １Ａ、４Ｂ；ｐＺＢＬ３ ２Ａ、６Ａ、４Ｂ、 ３Ｄ）ならびに異なるＰｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６エフェクター系統（１７Ａ、１４ Ａ、および３Ｂ）との間に作成した。 図１２は、トランスジェニックタバコ種子内での３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆによるｐ ＺＢＬ３からのＧＵＳレポーター遺伝子の特異的活性化を証明する蛍光アッセイ の結果を示す。遺伝交雑物を、異なるレポーター系統（ｐＺＢＬ２ ２Ｃ、１１ Ａ、４Ｂ；ｐＺＢＬ３ ２Ａ、６Ａ、４Ｂ、３Ｄ）ならびに異なる３５Ｓ−Ｇ４ Ａｌｆエフェクター系統（１Ａ、４Ａ、および１Ｂ）との間に作成した。 図１３は、トランスジェニックタバコ種子内でのＰｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６によ るｐＺＢＬ５およびｐＺＢＬ６からのＧＵＳレポーター遺伝子の特異的活性化を 証明する蛍光アッセイの結果を示す。遺伝交雑物を、異なるレポーター系統（ｐ ＺＢＬ５ ３Ｆ、２Ｃ、１Ｅ；ｐＺＢＬ６３Ｂ、４Ｆ、８Ｅ）ならびに異なるＰ ｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６エフェクター系統（１４Ａ、１５Ａ、および１３Ｂ）との 間に作成した。−４１０Ｐｈ／Ｐ−ＧＵＳを含む一つの高度に発現されるトラン スジェニック系統を、高レベルの種子特異的発現を生じる対照として用いた。３ ５Ｓ−ＧＵＳの一つの高度に発現されるトランスジェニック系統も対照として用 いた。 図１４は、トランスジェニックタバコ種子内での３５Ｓ−Ｇ４ＶＰ１６による ｐＺＢＬ５およびｐＺＢＬ６からのＧＵＳレポーター遺伝子の特異的活性化を証 明する蛍光アッセイの結果を示す。遺伝交雑物を、異なるレポーター系統（ｐＺ ＢＬ５ ３Ｆ、２Ｃ、１Ｅ；ｐＺＢＬ６ ３Ｂ、４Ｆ、８Ｅ）ならびに異なる３ ５Ｓ−Ｇ４ＶＰ１６エフェクター系統（１２Ａ、５Ａ、および２０Ａ）との間に 作成した。−４１０Ｐｈ／ Ｐ−ＧＵＳを含む一つの高度に発現されるトランスジェニック系統を、高レベル の種子特異的発現を生じる対照として用いた。３５Ｓ−ＧＵＳの一つの高度に発 現されるトランスジェニック系統も対照として用いた。 図１５は、トランスジェニックタバコ種子内でのＰｈ／Ｐ−Ｇ４Ａｌｆによる ｐＺＢＬ５およびｐＺＢＬ６からのＧＵＳレポーター遺伝子の特異的活性化を証 明する蛍光アッセイの結果を示す。遺伝交雑物を、異なるレポーター系統（ｐＺ ＢＬ５ ３Ｆ、２Ｃ、１Ｅ；ｐＺＢＬ６ ３Ｂ、４Ｆ、８Ｅ）ならびに異なるＰ ｈ／Ｐ−Ｇ４Ａ１ｆエフェクター系統（１７Ａ、１４Ａ、および３Ｂ）との間に 作成した。−４１０Ｐｈ／Ｐ−ＧＵＳを含む一つの高度に発現されるトランスジ ェニック系統を、高レベルの種子特異的発現を生じる対照として用いた。３５Ｓ −ＧＵＳの一つの高度に発現されるトランスジェニック系統も対照として用いた 。 図１６は、トランスジェニックタバコ種子内での３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆによるｐ ＺＢＬ５およびｐＺＢＬ６からのＧＵＳレポーター遺伝子の特異的活性化を証明 する蛍光アッセイの結果を示す。遺伝交雑物を、異なるレポーター系統（ｐＺＢ Ｌ５ ３Ｆ、２Ｃ、１Ｅ；ｐＺＢＬ６ ３Ｂ、４Ｆ、８Ｅ）ならびに異なる３５ Ｓ−Ｇ４Ａｌｆエフェクター系統（１Ａ、４Ａ、および１Ｂ）との間に作成した 。−４１０Ｐｈ／Ｐ−ＧＵＳを含む一つの高度に発現されるトランスジェニック 系統を、高レベルの種子特異的発現を生じる対照として用いた。３５Ｓ−ＧＵＳ の一つの高度に発現されるトランスジェニック系統も対照として用いた。 図１７は、トランスジェニックタバコ種子内でのＰｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６によ るｐＺＢＬ７、ｐＺＢＬ８、ｐＺＢＬ９、およびｐＺＢＬ１０からのＧＵＳレポ ーター遺伝子の特異的活性化を証明する蛍光アッセイ の結果を示す。遺伝交雑物を、異なるレポーター系統（ｐＺＢＬ７ １Ａ：ｐＺ ＢＬ８ ４Ａ、１Ｄ；ｐＺＢＬ９ ３Ｆ、４Ｆ、７Ａ；およびｐＺＢＬ１０ １ １Ｈ、６Ｄ、７Ｃ）ならびに異なるＰｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６エフェクター系統（ １４Ａ、１５Ａ、および１３Ｂ）との間に作成した。−４１０Ｐｈ／Ｐ−ＧＵＳ を含む一つの高度に発現されるトランスジェニック系統を、高レベルの種子特異 的発現を生じる対照として用いた。３５Ｓ−ＧＵＳの一つの高度に発現されるト ランスジェニック系統も対照として用いた。 図１８は、トランスジェニックタバコ種子内での３５Ｓ−Ｇ４ＶＰ１６による ｐＺＢＬ７、ｐＺＢＬ８、ｐＺＢＬ９、およびｐＺＢＬ１０からのＧＵＳレポー ター遺伝子の特異的活性化を証明する蛍光アッセイの結果を示す。遺伝交雑物を 、異なるレポーター系統（ｐＺＢＬ７ １Ａ；ｐＺＢＬ８ ４Ａ、１Ｄ；ｐＺＢ Ｌ９ ３Ｆ、４Ｆ、７Ａ；およびｐＺＢＬ１０ １１Ｈ、６Ｄ、７Ｃ）ならびに 異なる３５Ｓ−Ｇ４ＶＰ１６エフェクター系統（１２Ａ、５Ａ、および２０Ａ） との間に作成した。−４１０Ｐｈ／Ｐ−ＧＵＳを含む一つの高度に発現されるト ランスジェニック系統を、高レベルの種子特異的発現を生じる対照として用いた 。３５Ｓ−ＧＵＳの一つの高度に発現されるトランスジェニック系統も対照とし て用いた。 図１９は、トランスジェニックタバコ種子内でのＰｈ／Ｐ−Ｇ４Ａｌｆによる ｐＺＢＬ７、ｐＺＢＬ８、ｐＺＢＬ９、およびｐＺＢＬ１０からのＧＵＳレポー ター遺伝子の特異的活性化を証明する蛍光アッセイの結果を示す。遺伝交雑物を 、異なるレポーター系統（ｐＺＢＬ７ １Ａ；ｐＺＢＬ８ ４Ａ、１Ｄ；ｐＺＢ Ｌ９ ３Ｆ、４Ｆ、７Ａ；およびｐ ＺＢＬ１０ １１Ｈ、６Ｄ、７Ｃ）ならびに異なるＰｈ／Ｐ−Ｇ４Ａｌｆエフェ クター系統（１７Ａ、１４Ａ、および３Ｂ）との間に作成した。ー４１０Ｐｈ／ Ｐ−ＧＵＳを含む一つの高度に発現されるトランスジェニック系統を、高レベル の種子特異的発現を生じる対照として用いた。３５Ｓ−ＧＵＳの一つの高度に発 現されるトランスジェニック系統も対照として用いた。 図２０は、トランスジェニックタバコ種子内での３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆによるｐ ＺＢＬ７、ｐＺＢＬ８、ｐＺＢＬ９、およびｐＺＢＬ１０からのＧＵＳレポータ ー遺伝子の特異的活性化を証明する蛍光アッセイの結果を示す。遺伝交雑物を、 異なるレポーター系統（ｐＺＢＬ７ １Ａ；ｐＺＢＬ８ ４Ａ、１Ｄ；ｐＺＢＬ ９ ３Ｆ、４Ｆ、７Ａ；およびｐＺＢＬ１０ １１Ｈ、６Ｄ、７Ｃ）ならびに異 なる３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆエフェクター系統（１Ａ、４Ａ、および１Ｂ）との間に 作成した。−４１０Ｐｈ／Ｐ−ＧＵＳを含む一つの高度に発現されるトランスジ ェニック系統を、高レベルの種子特異的発現を生じる対照として用いた。３５Ｓ −ＧＵＳの一つの高度に発現されるトランスジェニック系統も対照として用いた 。 図２１は、トランスジェニックタバコ実生内での３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆもしくは ３５Ｓ−Ｇ４ＶＰ１６による−６５−ＧＵＳおよびＰｈＧ４ＧからのＧＵＳレポ ーター遺伝子の特異的活性化を証明する蛍光アッセイの結果を示す。遺伝交雑物 を、異なるレポーター系統（−６５−ＧＵＳ ５Ｃ、ＰｈＧ４Ｇ １７Ｃ、５Ａ ）ならびに異なる３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆ系統（１Ａ、１Ｂ、４Ａ）もしくは３５Ｓ −Ｇ４ＶＰ１６エフェクター系統（１２Ａ、５Ａ、２１Ａ、および２０Ａ）との 間に作成した。３ ５Ｓ−ＧＵＳを含む一つの高度に発現されるトランスジェニック系統を、高レベ ルの種子特異的発現を生じる対照として用いた。 配列番号１は、Ｇａｌ４結合部位のための共通配列である。 配列番号２〜６は、サッカロミセス ケレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内のガラクトース異化のための遺伝子のプロモー ター内に見いだされる天然に存在するＧａｌ４結合部位の配列である。 配列番号７は、実施例３に用いられるＲＹ−Ｇ−ｂｏｘ−ＲＹ要素のコア配列 である。 配列番号８は、グリシニン２プロモーター内に見いだされるＣＡＣＡｂｏｘの 配列である。 配列番号９はレグミンｂｏｘ要素の配列である。 配列番号１０〜１２は、異なるレグミンおよびグリシニン遺伝子のプロモータ ー内の既知の様々なＲＹ ｂｏｘの配列である。 配列番号１３は、実施例４に用いられるＧｙ２要素のコア配列である。 配列番号１４〜１６は、ＡＢＡおよびＶＰ１に応答性を付与することが知られ ているＤＮＡセグメントである。 配列番号１７は、実施例５に用いられるＥｍ調節要素のコア配列である。 配列番号１８は、実施例６に用いられるＣ１調節要素のコア配列である。 配列番号１９は、実施例７に用いられるＧ−ｂｏｘ調節要素である。 配列番号２０および２１は、実施例８に用いられるＣＨＳ Ｕｎｉｔ１調節要 素の重要構成成分である。 配列番号２２は、実施例７に用いられるＣＨＳ Ｕｎｉｔ１である。 配列番号２３および２４は、実施例１に記載されるＧａｌ４結合部位カッセッ トを形成するのに用いられるオリゴヌクレオチドである。 配列番号２５および２６は、実施例３に記載される種子特異的ＲＹ−Ｇ−ｂｏ ｘ−ＲＹ調節要素カセットを形成するのに用いられるオリゴヌクレオチドである 。 配列番号２７および２８は、実施例４に記載されるグリシニン２調節要素カセ ットを形成するのに用いられるオリゴヌクレオチドである。 配列番号２９および３０は、実施例５に記載されるＥｍ調節要素カセットを形 成するのに用いられるオリゴヌクレオチドである。 配列番号３１および３２は、実施例６に記載されるＣ１調節要素カセットを形 成するのに用いられるオリゴヌクレオチドである。 配列番号３３および３４は、実施例７に記載される構成的Ｇ−ｂｏｘ調節要素 を形成するのに用いられるオリゴヌクレオチドである。 配列番号３５および３６は、実施例８に記載されるＣＨＳ Ｕｎｉｔ１調節要 素カセットを形成するのに用いられるオリゴヌクレオチドである。 生物学的寄託 以下のプラスミドはブダペスト条約（ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔ ｙ）の規約にのっとり、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖ ｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２、に寄託してあり、以下の受託番号 がつけられている：プラスミド 受託番号 寄託日 ｐＺＢＬ１ ＡＴＣＣ ２０９１２８ １９９７年６月２４日 発明の詳細な記述 用語「本質的に類似する」は、一つもしくは複数のヌクレオチド塩基内での変 化がＤＮＡ結合ドメインの結合の際、核酸断片の機能に本質的には影響を及ぼさ ない核酸断片を意味する。「実質的に類似する」は更には、一つもしくは複数の アミノ酸の置換をもたらすが、ＤＮＡ配列によりコードされる蛋白質の機能特性 には影響を及ぼさない一つもしくは複数のヌクレオチド塩基内の一つの改変をも 意味する。従って「本質的に類似する」アミノ酸配列は、等価な機能を有する蛋 白質を特定するものである。従って、本発明は特定の例示配列より多くのものを 包含する。 用語「遺伝子」は、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および 後（３’非コーディング配列）にある調節配列を初めとする特別な蛋白質もしく は機能的ＲＮＡを発現する核酸断片を意味する。「キメラ遺伝子」は、天然には 一緒には見いだされない調節配列とコーディング配列、または天然には隣接しな い蛋白質の部分もしくは天然には隣接しないプロモーターの部分をコードする配 列を含むいずれかの遺伝子を意味する。従ってキメラ遺伝子は、異なる起源に由 来する調節配列およびコーディング配列、または同一の起源に由来するが、天然 に見いだされるものとは違った様式に配置されている調節配列およびコーディン グ配列を含んでよい。「内因性遺伝子」は、ある生物のゲノム内の天然の位置に 存在する生来の遺伝子を意味する。「外来性」遺伝子は、宿主生物内には通常は 見いだされないが、遺伝子導入により宿主生物内に導入される遺伝子を意味する 。外来性遺伝子は、非生来遺伝子もしくはキメ ラ遺伝子内に挿入される生来遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手 法によりゲノム内に導入されている遺伝子である。 「コーディング配列」は、特異的アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味 する。「調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、 配列内、もしくは配列の下流（３’非コーディング配列）に位置するヌクレオチ ド配列を意味し、そしてこれは会合するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセ シングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼす。調節配列は、プロモーター 、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化シグナル配列を含む。 「プロモーター」は、コーディング配列もしくは機能的ＲＮＡの発現を調節す ることに関与するＤＮＡ配列を意味する。一般的にはコーディング配列はプロモ ーター配列の３’側に位置する。「プロモーター」は、ＴＡＴＡ−ｂｏｘを含ん でなるＤＮＡ配列である最小プロモーターおよび転写開始の部位を特定するため に作用する他の配列を含み、ここに発現の調節を目的として調節要素が付加され る。「プロモーター」は更には、最小プロモーターに加え、コーディング配列も しくは機能的ＲＮＡの発現を調節することが可能な調節要素を含むヌクレオチド 配列をも意味する。この種類のプロモーターは、近位および一層遠位にある上流 要素からなり、後者の要素はエンハンサーと称されることがしばしばある。従っ て「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、そし てそのプロモーターの生来の要素もしくはプロモーターレベルもしくはプロモー ターの組織特異性を増強するために挿入された異種要素であってよい。プロモー ターは、生来の遺伝子からその全体が由来するか、または天然に見いだされる異 なるプロモーターに由来する異 なる要素からできているか、または合成ＤＮＡセグメントを含んでいてさえよい 。当業者には、異なるプロモーターは異なる組織もしくは細胞の種類内での、ま たは発生の異なる段階で、または異なる環境条件に応答して、ある遺伝子の発現 を指令しうるものと理解される。たいていの時期において、たいていの細胞の種 類で遺伝子を発現させるプロモーターは共通して「構成的プロモーター」と称さ れる。植物細胞で有用な様々な種類の新規プロモーターは常時発見されており； 多数の例が、Ｏｋａｍｕｒｏ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ １５：１−８２，１９８９による編集物に見いだ しうる。更には、たいていの場合においては制御配列の明確な境界は完全には特 定されていないため、様々な長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し うるものと理解される。 「調節要素」は、プロモーター活性を決定する際に役割を演じるＤＮＡ配列を 意味し、すなわち調節要素は調節配列の活性を決定する際に役割を演じることが できる。調節要素は、発現のレベル、発現の組織／細胞の種類の特異性、および ／または発育に際しての発現のタイミングに影響を及ぼしうる。「調節要素」は プロモーターの一部であってよいか、または最小プロモーターの上流に位置して よい。調節要素として見なされるＤＮＡ配列は、転写因子の結合のための標的部 位であるとして示されている配列、ならびに特性は特定されてはいないが、それ がプロモーターから欠損すると発現に影響が及ぼされるために、ある機能を有す ることが知られている配列を含む。「構成的」調節要素は、植物のたいていの組 織に、植物発育周期のたいていの時期を通して発現を指令するものである。「種 子特異的」調節要素は、種子の発育の間に種子組織内で の発現を指令するものである。種子組織の異なる種類、もしくは種子発育の異な る段階において発現を指令してよい、異なる種類の種子特異的調節要素が存在す る。 「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列との 間に位置するＤＮＡ配列を意味する。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流 の完全にプロセシングされたｍＲＮＡ内に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲ ＮＡへの初期転写物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性、もしくは翻訳効率に影 響を及ぼしてよい。（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ｆｏｓｔｅｒ，Ｇ．Ｄ．（１ ９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２２５）。 「３’非コーディング配列」は、コーディング配列の下流に位置するＤＮＡ配 列を意味し、そしてポリアデニル化シグナル配列およびｍＲＮＡプロセシングも しくは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配 列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常はポリアデニル酸部分（ｔｒａｃｔ） のｍＲＮＡ前駆体の３’末端への添加に影響を及ぼすことを特徴とする。異なる ３’非コーディング配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐ ｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１−６８０，１９８９、により例示される。 用語「操作的に連結される」は、あるものの機能がもう一方により影響を受け るような、ある単一核酸断片上の核酸配列の会合を意味する。例えば、あるプロ モーターが、あるコーディング配列に操作的に連結されているとは、そのプロモ ーターがそのコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、 そのコーディング配列は、そのプロモーターの転写制御下にある）場合である。 コーディング配列は、セン スもしくはアンチセンス方向で調節配列に操作的に連結され得る。 用語「機能的ＲＮＡ」は本明細書で用いられる際には、アンチセンスＲＮＡ、 リボザイム、もしくは翻訳されない他のＲＮＡを意味する。 用語「発現」は本明細書に用いられる場合には、センス（ｍＲＮＡ）もしくは アンチセンスＲＮＡの転写を意味する。発現は更には、ｍＲＮＡのポリペプチド への翻訳をも意味する。 本明細書に用いられる際には、「Ｇａｌ４結合部位」は、配列番号１に示され るヌクレオチド配列、またはＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインが結合し得る本質的 に類似するいずれかの配列を意味する。言い換えると、用語「Ｇａｌ４結合部位 」および「Ｇａｌ４結合配列」は本明細書では互換可能に用いられる。 Ｇａｌ４結合部位は、酵母ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０遺伝子の発現を制御する上 流活性化配列（Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ） （ＵＡＳ_G）内に見いだされる４つのＧａｌ４部位およびＧＡＬ７プロモーター 内に見いだされる一つのＧａｌ４部位からなる共通配列である（Ｇｉｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｃｅｌｌ ４０：７６７−７７４）。もともとの Ｇａｌ４部位配列は配列番号２〜６に示される。 これらの異なる配列は、Ｇａｌ４の結合能力を維持しながらもＧａｌ４結合部位 内に作成し得る変異物の幾つかを示し、そして本質的には類似する配列と見なさ れる。 本明細書に用いられる際には「Ｇａｌ４結合部位プロモーター」は、少なくと も一つのＧａｌ４部位に操作的に連結されるプロモーターを意味する。従って「 Ｇａｌ４結合部位プロモーター」は、限定されるものではないが、少なくとも一 つのＧａｌ４結合配列と最小プロモーター、少なくとも一つのＧａｌ４結合配列 および最小プロモーターを有する追加的調節要素、少なくとも一つのＧａｌ４結 合配列が添加されているプロモーター、または少なくとも一つのＧａｌ４結合配 列および追加的調節要素が添加されているプロモーターなどの組み合わせ物を含 んでよい。 本明細書に用いられる際には「活性化ドメイン」は、転写に対して剌激効果を 有する蛋白質ドメインを意味する。天然の活性化ドメインはＤＮＡ結合ドメイン に融合し得る転写因子の部分であり、そして転写刺激効果を有することが示され ている。天然の活性化ドメインは改変させることができ、この場合、アミノ酸は 転写刺激効果を変化させることなく置換もしくは欠失を受ける（Ｃｒｅｓｓ ａ ｎｄ Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：８７−９ ０；Ｄｒｙｓｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：１２２０−１２３３）。 「形質転換」は、宿主生物のゲノム内への核酸断片の移行を意味し、これによ り遺伝的に安定な遺伝形質がもたらされる。形質転換を受けた核酸断片を含む宿 主生物体は、「トランスジェニック」生物として引用される。植物の形質転換の 方法の例は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）により介在される形質転換（Ｄｅ Ｂｌａｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：２７７）、および粒 子加速化もしくは「遺伝子銃」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９ ８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４ ５，０５０号）を含む。 本発明は、安定に形質転換された植物内で機能するＧａｌ４キメラ転写因子／ 標的プロモーター系を初めて提供する。具体的には本発明は、植物細胞のゲノム 内に： ａ）５’−３’方向で （１）少なくとも一つのＧａｌ４結合配列に操作的に連結されるプロモータ ー； （２）プロモーターに操作的に連結されたコーディング配列もしくはその相 捕体；および （３）コーディング配列もしくはその相補物に操作的に連結されたポリアデ ニル化シグナル配列；ただしそのプロモーターが最小プロモーターである場合に は、Ｇａｌ４結合配列はその最小プロモーターの上流に位置する； を含む第一キメラ遺伝子；ならびに ｂ）５’−３’方向で （１）プロモーター； （２）Ｇａｌ４転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮ Ａ配列； （３）（２）のＤＮＡ配列に操作的に連結される転写活性化ドメインをコー ドするＤＮＡ配列；および （４）（３）のＤＮＡ配列に操作的に連結されるポリアデニル化シグナル配 列； を含む第二キメラ遺伝子、 が組み入れられることを含む、安定に形質転換させたトランスジェニック植物細 胞内での遺伝子発現を調節する方法に関し、この場合、第二キメラ遺伝子の発現 が第一キメラ遺伝子の発現を調節する。 他の態様では、第一遺伝子は更には少なくとも一つの調節要素を含み得る。 第一キメラ遺伝子内のＧａｌ４結合部位プロモーターは、第二キメラ遺伝子に より産生されるキメラ転写因子の存在下で活性化される。あるプロモーター中で のＤＮＡ結合部位の多重コピーの存在がプロモーターの有効性を増大することが できることは当業者にはよく知られている（Ｃａｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９ ０ Ｎａｔｕｒｅ ３４５：３６１）。従って第一キメラ遺伝子中のＧａｌ４結 合部位プロモーターは、配列番号１に記載される配列、もしくは本質的には類似 する配列を有する少なくとも一つのＧａｌ４結合部位を含む。キメラ転写因子を コードする第二キメラ遺伝子は、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインをコードする配 列（これはＧａｌ４蛋白質の内の少なくともアミノ末端１４７アミノ酸を含む） もしくは本質的に類似する配列を含む。この活性化ドメインは、転写を刺激する ことができるいずれかのアミノ酸配列であり得る。活性化ドメインは一般的には 転写因子もしくはコアクチベーターに由来し、そして転写にかかわる他の蛋白質 と相互作用する蛋白質の部分であり、そのことにより転写過程を刺激する。従っ て、転写を刺激することができるいずれかの活性化ドメインを用いて本発明を実 施することがで きる。好ましい活性化ドメインは酸性転写活性化ドメインであるはずである。こ のような活性化ドメインは、限定される訳ではないが、単純疱疹ウイルスＶＰ１ ６蛋白質からのもの（Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｇｅ ｎｅｓ Ｄｅｖ．２：７１８）およびファセオルス ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏ ｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＰｖＡｌｆ蛋白質からのもの（Ｂｏｂｂ ｅｔ ａ ｌ．，１９５５ Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ８：１０１）を含むこ とができる。例えば双子葉植物もしくは単子葉植物細胞のような、現在形質転換 することができるか、もしくは将来形質転換可能となるであろういずれかの植物 細胞を用いて本発明を実施することができる。双子葉植物細胞の例は、限定され る訳ではないが、ダイズ、トマト、ジャガイモ、タバコ、ナタネの脂肪種子、ヒ マワリ、綿、アルファルファ、エンドウ、テンサイ、ヒヨコマメ、レンズマメ、 ハウチマメ、リママメを含む。単子葉植物細胞の例は、限定される訳ではないが 、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、米、オオモロコシを含む。 Ｇａｌ４結合部位プロモーターを含む第一キメラ遺伝子、およびキメラＧａｌ ４ ＤＮＡ結合ドメイン／活性化ドメイン転写因子をコードする第二キメラ遺伝 子を、当業者にはよく知られる技術を用いて植物細胞のゲノム内に導入すること ができる。これらの方法は、限定される訳ではないが、（１）例えば粒子衝撃も しくは電気穿孔のような直接ＤＮＡ取り込み（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９ ８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３：米国特許第４，９４ ５，０５０号）、ならびに（２）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ）により媒介される形質転換（Ｄｅ Ｂｌａｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，（１ ９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：２７７）を含む。 目的の遺伝子に操作的に連結されるＧａｌ４結合部位プロモーターを含む第一 キメラ遺伝子および、Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン／活性化ドメイン転写因子 を含む第二キメラ遺伝子は、本発明を実施するために用いられる２つの個別の構 成成分である。これらキメラ遺伝子の各々を、一つの構成成分を宿す形質転換体 が第二構成成分を宿す形質転換体から区別されるように植物種のゲノム内に個別 に形質転換させることができる。その後にこの２つの構成成分を、２つの個別の 構成成分を宿す２つの形質転換体の遺伝交雑により、一つの植物のゲノム内に合 わせ入れることができる。従って第一および第二キメラ遺伝子は、（ａ）第一構 築物で植物細胞を形質転換すること、（ｂ）第二構築物で第二植物細胞を形質転 換すること、（ｃ）（ａ）および（ｂ）における形質転換植物細胞から繁殖力の ある成熟した植物を育てること、ならびに（ｄ）形質転換植物を遺伝的に交雑さ せて、そのゲノムが第一および第二構築物を含む子孫を産生すること、により植 物細胞のゲノム内に合わせ入れることができる。 別法では、この２つの構築物は、同一細胞内に同時に両方の構成成分を形質転 換させることにより同一ゲノム内に一緒に導入されてよい。更に別の手法は、一 つの構成成分を単独でゲノム内に形質転換させ、その後に既にその第一構成成分 を宿す細胞の第二構成成分での形質転換を行うことである。 従って別の態様では、本発明は本発明の方法を用いて形質転換される植物、お よびそのような植物から取得される種子に関する。 Ｇａｌ４結合部位プロモーターを含む導入遺伝子の転写を調節する目 的には、このプロモーターを、非翻訳リーダー、コーディング領域、３’非翻訳 配列、およびポリアデニル化シグナル配列に操作的に連結させる。別法では、コ ーディング領域を機能的ＲＮＡを産生する配列により置換させてよく、次にはそ の機能的ＲＮＡがアンチセンス、同時抑制、もしくは他の遺伝子発現技術により 遺伝子発現の調節を媒介してよい。 キメラＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン／活性化ドメイン転写因子は、いずれか の構成的、組織特異的、もしくは発育的に調節されるプロモーターにより調節さ れてよい。この調節因子が次には、Ｇａｌ４結合部位プロモーター、すなわち少 なくとも一つのＧａｌ４結合配列に操作的に連結されるプロモーター、を含む導 入遺伝子の発現を調節する。Ｇａｌ４結合部位プロモーターは最低でも、少なく とも一つのＧａｌ４結合部位、およびＴＡＴＡ ｂｏｘを含む。追加的要素がＧ ａｌ４結合部位プロモーター内に存在してよく、その例はＣＡＡＴ ｂｏｘ、ま たはキメラＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン／活性化ドメイン転写因子以外の一つ もしくは複数の転写因子のための結合部位である。動物系では、同一プロモータ ーへの転写因子の幾つかの組み合わせ物の標的化が、発現レベルに対して相乗作 用を奏しうることが知られている（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｎａｔｕ ｒｅ ３４５：３５９）。 本２構成成分系による遺伝子活性化の更なる増強は、Ｇａｌ４結合部位プロモ ーター内もしくは最小プロモーターの上流の他の調節要素の添加により取得する ことができる。このような追加的調節要素は限定される訳ではないが、種子特異 的要素、構成的要素、およびエンハンサーであり得る。種子発生中の遺伝子の発 現を調節することに関与する多種多様の要素が同定されている。例えば、ＲＹ− Ｇ−ｂｏｘ−ＲＹ調節要素 は種子貯蔵蛋白質およびレクチン遺伝子プロモーター内に共通に見いだされてお り、そしてダイズグリシニンおよびβ−コングリシニン種子貯蔵蛋白質プロモー ター、ならびにインゲンマメ（Ｆｒｅｎｃｈ ｂｅａｎ）β−ファセオリン種子 貯蔵蛋白質プロモーター内での種子特異的遺伝子発現の正の調節にとって必要で ある（Ｌｅｌｉｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐ１ａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ ｌ．９８：３８７−３９１：Ｂｕｓｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１ ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１４６９−１４７６；Ｋａｗａｇｏｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｊ．５：８８５−８９０；Ｂｏｂｂ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：６４１−６４７；Ｄｉｃ ｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ １６：３７１；Ｆｕｊｉｗａｒａ ａｎｄ Ｂｅａｃｈｙ １９９ ４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４：２６１−２７２ ；Ｃｈａｍｂｅｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９：９３７−９４９）。異なる天然のプロモータ ー内に見いだされるＲＹ−Ｇ−ｂｏｘ−ＲＹ要素の配列は変異を有するが、特別 なヌクレオチド配列：ＣＡＴＧＣＡＷ（「ＲＹ」の特徴）およびＣＡＣＧＴＧ（ 「Ｇ−ｂｏｘ」）の存在により識別され得る。配列番号７に示されるＲＹ−Ｇ− ｂｏｘ−ＲＹ要素、または本質的に類似する配列の一つもしくは複数のコピーを Ｇａｌ４結合部位プロモーター内もしくは最小プロモーターの上流に導入して、 植物内の種子特異的遺伝子発現のレベルを増加させることができる。 ダイズグリシニン２遺伝子プロモーターからのグリシニン２（Ｇｙ２）調節要素 はＣＡＣＡ要素とレグミンｂｏｘの両方を含み、そしてこのプロモーターの高レ ベルでの種子特異的遺伝子発現にとって必要である（Ｌｅｌｉｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９８：３８７−３９１）。Ｃ ＡＣＡおよびレグミンｂｏｘ要素として認識されるヌクレオチドは各々配列番号 ８および９に示される。 異なるレグミンおよびグリシニン遺伝子のプロモーター内にはレグミンｂｏｘの ＲＹ ｂｏｘ内に変異が存在する。例が配列番号１０〜１２に示される（Ｄｉｃ ｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．１６：３７１）。 配列番号１３に示されるＧｙ２要素、もしくは本質的に類似する配列の一つもし くは複数のコピーをＧａｌ４結合部位と組み合わせて用いても、植物内の種子特 異的遺伝子発現レベルを増加させることができる。 小麦のＥｍ遺伝子プロモーターからの、Ｅｍ１ａ、Ｅｍ２、およびＥｍ１ｂ要 素を初めとするＥｍ調節要素はアブシシン酸（ＡＢＡ）による調節に、そしてト ウモロコシのプロトプラストを用いる一過性アッセイではトウモロコシ転写因子 ＶＰ１に強力に連結している（Ｍａｒｃｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｐ ｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：９６９− ９７６；Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：１ ５１１−１５１８）。ＡＢＡおよびＶＰ１の両方が種子生育中の遺伝子発現の調 節に関与している。ＡＢＡおよびＶＰ１応答性要素として認識される核酸セグメ ントが配列番号１４〜１６に示される。 配列番号１７に示されるＥｍ要素、または本質的に類似する配列の一つもしくは 複数のコピーをＧａｌ４結合部位と組み合わせて用いても、植物内での種子特異 的遺伝子発現のレベルを増加させることができる。 トウモロコシＣ１遺伝子プロモーターからのＧＴ要素およびＳｐｈ１要素を初 めとするＣ１調節要素は、ＡＢＡ調節とＶＰ１トランス−活性化とに必須である （Ｈａｔｔｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ ｅｎｔ ６：６０９−６１８；Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：１１７１−１１７９）。配列番号１８に示されるＣ１要素、また は本質的に類似する配列の一つもしくは複数のコピーをＧａｌ４結合部位と組み 合わせて用いても、植物内での種子特異的遺伝子発現のレベルを増加させること ができる。 Ｇ−ｂｏｘ（ＣＡＣＧＴＧ）は多くの多様な植物遺伝子プロモーター内に見い だされる６量体要素である。標的部位に対して異なる結合特異性および親和性を 有する多くの異なる種類のＧ−ｂｏｘ結合因子が存在 する。ＡＣＧＴコアをフランクする配列はＧ−ｂｏｘ結合因子の結合特異性に影 響を及ぼす（Ｍｅｎｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＴＩＢＳ ２０：５０ ６−５１０；Ｋａｔａｇｉｒｉ ａｎｄ Ｃｈｕａ，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：２２−２７；Ｆｏｓｔｅr ａｎｄ Ｃｈｕａ， １９９４，ＦＡＳＥＢ ８：１９２−２００）。配列番号１９に示されるＧ−ｂ ｏｘモチーフを含むＤＮＡセグメント、または本質的に類似する配列の一つもし くは複数のコピーをＧａｌ４結合部位と組み合わせて用いても、植物内での構成 的遺伝子発現もしくは組織特異的遺伝子発現のレベルを増加させることができる 。 異なるＧ−ｂｏｘ配列とＧａｌ４結合部位との間の組み合わせにより、異なる組 織および器官内での植物遺伝子発現の多様性および特異性をもたらすことができ る。パセリからのカルコンシンターゼ遺伝子プロモーターのＣＨＳ Ｕｎｉｔ１ は、光応答性における特異的遺伝子活性化に必要とされる光誘導性要素である（ Ｗｅｉｓｓｈａａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１７７７ −１７８６；Ｍｅｎｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＴＩＢＳ ２０：５０ ６−５１０）。光応答性にとって重要であるとして認識されるこの要素のヌクレ オチドが配列番号２０および２１に示される。 配列番号２２に示されるＣＨＳ Ｕｎｉｔ１、または本質的に類似する配列の一 つもしくは複数のコピーを、特にＧａｌ４結合部位と組み合わせた形で用いて構 成的遺伝子発現のレベルを増加させることができる。 該２構成成分系により遺伝子活性化を改善することができる別の種類の調節要 素はエンハンサー要素である。いずれかのエンハンサーを、Ｇａｌ４結合部位プ ロモーター（場合によってはＲＹ−Ｇ−ｂｏｘ−ＲＹ要素を含む）、Ｇｙ２要素 、Ｅｍ要素、Ｃ１要素、Ｇ−ｂｏｘ要素、もしくはＣＨＳ Ｕｎｉｔ１要素に添 加することができる。エンハンサーの例は、ファセオリンプロモーターからのＡ Ｔリッチエンハンサー（ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６ ｐ４１３−４２３；ｖａｎ ｄｅ ｒ Ｇｅｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３３：５５３−５５７）、オクトピンシンターゼ遺伝子からの ＯＣＳエンハンサー（Ｇｒｅｖｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３、Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １：４９９−５１ １）、およびカリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｍｏｓ ａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）３５Ｓ プロモーターからのエンハンサー（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：２６３−２７２）である。 本明細書に用いられる標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該 技術分野ではよく知られており、そして、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓ ｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８ ９（本明細書中これ以降は「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）に一層完全に記載される。 本キメラ遺伝子を含むプラスミドベクターは、当業者によく知られる従来の技 術を用いて構築される。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換させ るのに用いられる方法および所望される選択マーカーに依存する。当業者は、そ のキメラ遺伝子を含む宿主細胞をうまく形質転換、選択、および増殖させる目的 でプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝子因子をよく認識してい る。当業者は更には、異なる独立の形質転換現象が発現の異なるレベルおよびパ ターンをもたらし（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１− ２４１８、１９８５；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．，ＭＧＧ ２１８： ７８−８６，１９８９）、そしてそのため所望される発現レベルおよびパターン を提示する系統を取得する目的には複数の現象をスクリーニングしなければなら ないことをも認識するであろう。このようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）分析、ｍＲＮＡ発現のノザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）分析、 蛋白質発現のウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）分析、もしくは表現型分析のような 、当業者によく知られる従来の技術を用いて達成されてよい。 本発明は、安定に形質転換された植物内での導入遺伝子発現を調節する方法を 提供することにより導入遺伝子の発現の有用な方法に改良を加える。本発明の方 法は、１）共通に用いられる高度に発現される種子貯蔵蛋白質遺伝子プロモータ ーから発現されるレベルより高い発現レベル、２）交雑後の穀物内の発現の活性 化、３）複数の導入遺伝子の同調調節、および４）組織特異的もしくは発生的に 調節されるプロモーターの発現 パターンを維持しながらの発現レベルの増幅、を達成するための方法を提供する 。 実施例 本発明は更には、以下の実施例に特定され、それらの実施例中では、他に特に 記載がない限り全ての割合およびパーセンテージは重量によるものであり、そし て度数は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示しながらも 説明のみとして与えられることは理解されるべきである。先の論議およびこれら の実施例から当業者は本発明の主要な特徴を確認することができ、そして本発明 の精神および範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更物および改変物を、 様々な使用法および条件にそれらを適用させることを目的として作成することが できる。 実施例１ Ｇａｌ４結合部位プロモーター−ＧＵＳレポーター遺伝子の構築 ４つのＧａｌ４結合部位および５’〜−６５にまで伸長するファセオリン最小 プロモーターからなるプロモーターを、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コ ーディング領域およびファセオリン３’ポリアデニル化シグナル配列領域の５’ 側に構築した。Ｇ４Ｇと称されるこのキメラ遺伝子の４つのセグメントは以下の ものでできている：（１）配列番号１に記載されるＧａｌ４ ＤＮＡ結合部位の 共通配列の４つのコピーを含むオリゴヌクレオチド（Ｂｒａｓｓｅｌｍａｎ ｅ ｔ ａｌ．，１９９３、ＰＮＡＳ ９０：１６５７）および末端制限部位。これ らのオリゴヌクレオチドは、配列番号２３および２４に示される配列を有する。 これら２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングからもたらされる二本鎖ＤＮＡ 断片は、５’ＢａｍＨＩ部位および３’ＰｓｔＩ部位を有する。 （２）ファセオリンプロモーターの−６５から転写開始部位に関する＋７７まで 伸長するＮｓｉＩ−ＮｃｏＩ断片。このＮｃｏＩ部位は予め加えられている（Ｓ ｌｉｇｈｔｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｍ ａｎ Ｂ１６：１）。ＰｓｔＩおよびＮｓｉＩ末端をアニールし、そして制限部 位を再生させることなく連結させる。 （３）ウイダ（ｕｉｄａ）コーディング領域を含むＮｃｉＩ−ＥｃｏＲＩ断片（ ＧＵＳ；Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ＥＭＢＯ Ｊ ６：３ ９０１）。（４）ファセオリンポリアデニル化シグナル配列領域を含む１．２ｋ ｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｓｌｉｇｈｔｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９ ９１ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｍａｎ Ｂ１６：１）。プラスミドｐＧ ＥＭ９Ｚｆ内の５’ＢａｍＨＩ部位に添加されたＮｏｔＩおよびＸｂａＩを有す るキメラＧ４Ｇ遺伝子はｐＧ４Ｇと称される（図１）。 このキメラ遺伝子を、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片として、ＨｉｎｄＩＩＩ部位 の３’側のＳａｌＩ部位の添加の後にアグロバクテリウム ツ メファキエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のバ イナリーベクターｐＺＢＬ１内にクローン化してｐＺＢＬ３を作成した。ｐＺＢ Ｌ１はｐＢＲ３２２からの複製起点、細菌性ｎｐｔＩカナマイシン耐性遺伝子、 シュードモナス アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓ ａ ）プラスミドｐＶＳ１の複製起点および安定化起点（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ． ，１９８４）、ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｌｚｅｎら、１９８５、により記載されるＴ −ＤＮＡ境界（この場合、右側の境界断片の一部であるＯＣＳエンハンサー（Ｏ ＣＳプロモーターの−３２０〜−１１６に伸展する；Ｇｒｅｖｅ ｅｔ ａｌ． ，１９８３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ ｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １：４９９−５１１）が除去されている）、およびカ ナマイシン耐性植物選択マーカーとして作用するためのＮｏｓ／Ｐ−ｎｐｔＩＩ −Ｏｃｓ３’遺伝子を含む。プラスミドｐＺＢＬ１はＡＴＣＣに寄託してあり、 そして受託番号２０９１２８を有する。 プロモーター内のＧａｌ４結合部位を有する第二キメラ遺伝子は。４つのＧａ ｌ４結合部位の５’側に位置するＤＮＡ断片の添加を用いてＧ４Ｇと同一の様式 で構築した。この追加的ＤＮＡ断片はファセオリンプロモーターの上流部分に由 来し、そして−１４７１のＥｃｏＲＩ部位と−３９１にあるＮｓｉＩ部位とが結 合する１．０８キロベースのＤＮＡ断片であり、そしてマトリックス付着領域お よびＡＴリッチエンハンサーを含む（Ｔｉｍ Ｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ Ａ ＆ Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから取得した；ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６ ｐ４１３−４２ ３，ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅｓｔ ａｎｄ Ｈａｌｌ，１９９７，Ｐｌ ａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３３：５５３−５５７）。この ＤＮＡ断片の部分配列（−８９０〜−３９１）が利用可能であり（ＧｅｎＢａｎ ｋ 受託番号＃Ｊ０１２６３ Ｍ１３７５８）、これから完全なＥｃｏＲＩ−Ｎ ｓｉ Ｉ断片を単離するためにプローブを作成することができる。これらの配列を 含むＰｓｔＩ（ポリリンカー部位）−ＮｓｉＩ断片を、ＮｏｔＩ−ＸｂａＩ断片 として除去し、そしてその後にＧ４Ｇ遺伝子に添加してＰｈＧ４Ｇを作成できる ように、ｐＧＥＭ９ＺｆベクターのＮｓｉＩ部位内にクローン化した。バイナリ ーベクター中にＰｈＧ４Ｇ遺伝子を構築するためには、まずＢａｍＨＩ部位をＰ ｈＧ４Ｇ遺伝子の５’側に添加し、そしてその後にファセオリンプロモーター上 流配列（Ｐｈ５’）を含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片を、バイナリーｐＺＢＬ ３ベクター内のＧａｌ４部位の上流のＢａｍＨＩ部位内にクローン化してｐＺＢ Ｌ７を形成した。Ｐｈ５’断片の正しい方向を制限酵素分析により確認した。 ＧＵＳコーディング領域に融合されたファセオリン−６５最小プロモーターお よびファセオリン３’ポリアデニル化シグナル配列領域からなる対照構築物であ る−６５−ＧＵＳは、ファセオリン−６５プロモーターおよびＧＵＳコーディン グ領域を含むＮｓｉＩ−ＸｂａＩ断片を、ファセオリン３’領域を含むＸｂａＩ −ＨｉｎｄＩＩＩ断片と共にｐＳＰ７２ベクターのＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩ Ｉ部位内に融合させることにより作成した。Ｇａｌ４部位を全く有さないこのキ メラ遺伝子をＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片として、バイナリーベクターｐＺＢＬ１ 内のＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位内にクローン化させてｐＺＢＬ２を作成した 。 実施例２ キメラＧａｌ４転写アクチベーターの構築 キメラＧａｌ４−ＰｖＡｌｆ転写アクチベーターは、−４１０ファセオリンプ ロモーター（Ｐｈ／Ｐ−Ｇ４Ａｌｆ）もしくは３５Ｓプロモーター−Ｃａｂリー ダー（３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆ）のいずれかの制御下で構築した。Ｐｈ／Ｐ−Ｇ４Ａ ｌｆキメラアクチベーター遺伝子は４つのセグメント：（１）−４１０にまで伸 長し、そして＋７７までのリーダー配列を含むファセオリンプロモーターの４９ ４ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｃｏＩ断片（Ｓｌｉｇｈｔｏｍ ｅｔ ａｌ．，１ ９９１ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｍａｎ Ｂ１６：１）、（２）Ｇａｌ ４ ＤＮＡドメインのＮ−末端１４７アミノ酸をコードするＮｃｏＩ−ＳｍａＩ 断片（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３４：６３１）、（３ ）ＰｖＡｌｆ活性化ドメインのＮ末端２４３アミノ酸をコードするＳｍａＩ−Ｓ ａｌ Ｉ断片（Ｂｏｂｂ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｐｌａｎｔ Ｊ ８ ｐ１０ １−１１３）、（４）ファセオリン３’配列を含む１．２ｋｂのＳａｌＩ−Ｈｉ ｎｄ ＩＩＩ断片、を有する。３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆキメラアクチベーター遺伝子内 では、３５ＳプロモーターおよびＣａｂリーダーからなる１．４ｋｂのＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＮｃｏＩ断片を用いてＰｈ／Ｐ−Ｇ４Ａｌｆキメラ遺伝子中の−４１０ ファセオリンプロモーターおよびリーダー配列を置換した。ＣａＭＶ ３５Ｓプ ロモーター＋クロロフィルａ／ｂ結合性蛋白質（ｃａｂ）リーダーは、ｃａｂ遺 伝子２２Ｌに由来する６０ｂｐの非翻訳リーダーＤＮＡ断片に操作的に連結され る転写開始部位を８ｂｐ越える（３’側に）ところにまで伸長する３５Ｓプロモ ーター配列を含む（Ｈａｒｐｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８８ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ ．Ｇｅｎｅｔ ２１２：１８２）。 他のキメラＧａｌ４−ＶＰ１６転写アクチベーターも、−４１０ファセオリン プロモーター（Ｐｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６）もしくは３５Ｓプロモーター−Ｃａｂ リーダー（３５Ｓ−Ｇ４ＶＰ１６）のいずれかの制御下で作成した。Ｇａｌ４ ＤＮＡ結合性ドメインのＮ−末端１４７アミノ酸および単純疱疹（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスＶＰ１６活性化ドメインのＣ−末端７８アミノ酸（ Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅ ｖ．２：７１８）の双方をコードする６９６ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ（Ｂａ ｍ ＨＩ平滑末端化させてあるもの）断片をＰｈ／Ｐ−Ｇ４Ａｌｆもしくは３５Ｓ −Ｇ４ＡｌｆのＮｃｏＩ部位およびＳｍａＩ部位内にクローン化させてＧ４Ａｌ ｆセグメントを置換した。 各キメラアクチベーター遺伝子をまずＨｉｎｄＩＩＩ断片として、ＢａｍＨＩ とＸｂａＩポリリンカー部位の間に付加された第二ＫｐｎＩ部位を有するｐＳＫ ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位内にクローン化した。その後にこのキメラアクチ ベーター発現カセットをＫｐｎＩ断片として切り出し、そしてバイナリーベクタ ーｐＺ５ＫＡＤのＫｐｎＩ部位内にクローン化してｐＺ５ＫＡＤ−Ｐｈ／Ｐ−Ｇ ４Ａｌｆ、ｐＺ５ＫＡＤ−３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆ、ｐＺ５ＫＡＤ−Ｐｈ／Ｐ−Ｇ４ ＶＰ１６、ｐＺ５ＫＡＤ−３５Ｓ−Ｇ４ＶＰ１６を作成した。このバイナリーベ クターｐＺ５ＫＡＤはＰＢＲ３２２からの複製起点、細菌性カナマイシンｎｐｔ Ｉ耐性遺伝子、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）プラスミドｐＶＳ１ の複製および安定化領域（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、Ｔ−ＤＮＡボ ーダー（ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、ならびにス ルホニル尿素耐性植物選択マーカーとして作用 させるための３５Ｓ／Ｐ−ＡＬＳ^R−ＡＬＳ３’遺伝子を含む。 各バイナリーベクター構築物をアグロバクテリウム ツメファキエンス（Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４内に形質転 換させ、その後にそれをタバコの葉組織の接種に用いた。トランスジェニックタ バコ植物は本質的にはＤｅ Ｂｌａｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７ Ｍｅｔｈ ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：２７７、の手法により取得した。形質転換された苗 状の選択は、２０〜５０ｐｐｂのクロロスルフォンもしくは１００ｍｇのカナマ イシン／ｌ上でのいずれかで実施した。苗状を、２０ｍｇのクロロスルフォン／ ｌもしくは１００ｍｇカナマイシン／ｌのいずれかの上で根付かせた。 実施例３ 種子特異的ＲＹ−Ｇ−ｂｏｘ−ＲＹ調節要素のＧａｌ４結合部位プロモーターへ の添加 ２コピーのＲＹ−Ｇ−ｂｏｘ−ＲＹ要素共通配列（Ｃｏｎｃｅｉｃａｏ ａｎ ｄ Ｋｒｅｂｂｅｒｓ，１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｊ．５：４９３−５０５；Ｂｕ ｓｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１ ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１４６９−１４７９ ；Ｋａｗａｇｏｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｊ．５：８８５−８ ９０；Ｂｏｂｂ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓｅａｒｃｈ ２５：６４１−６４７；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１ ９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：３７１；Ｆｕ ｊｉｗａｒａ ａｎｄ Ｂｅａｃｈｙ １９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４：２６１−２７２；Ｃａｍｂｅｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ １９：９３７−９４９）および末端制限ＢａｍＨＩ部位を含むオリ ゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、配列番号２５およ び２６に示される配列を有する。これら２本のオリゴヌクレオチドのアニーリングによりもたらされる二本鎖ＤＮ Ａ断片は、５’および３’の両末端にＢａｍＨＩ部位を有する。５’ＢａｍＨＩ 部位は完全なものであり、これをクローニングの後に再びＢａｍＨＩで切断する ことができる。３’ＢａｍＨＩ部位は連結用にのみ用いることができる。アニー ルされたＤＮＡ断片を直接、Ｇ４ＧのＧａｌ４結合部位の４つのコピーの上流のＢａｍ ＨＩ部位内にクローン化して、（ＲＹ−Ｇ−Ｂｏｘ−ＲＹ）₂−Ｇ４Ｇを 形成した。Ｇａｌ４部位の上流のこのＲＹ−Ｇ−ｂｏｘ−ＲＹ要素の直接の方向 をＢａｍＨＩ消化により確認した。キメラ（ＲＹ−Ｇ−ｂｏｘ−ＲＹ）₂−Ｇ４ Ｇ遺伝子をＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片としてバイナリーベクターｐＺＢＬ１内に クローン化して、実施例１に記載される要領でｐＺＢＬ４を作成した。 実施例４ グリシニン２調節要素のＧａｌ４結合部位プロモーターへの添加 マメ科植物のグリシニン２遺伝子からのグリシニン（Ｇｌｙｃｉｎｉ ｎ）２（Ｇｙ２）要素（ＣＡＣＡ要素プラスレグミンｂｏｘ）（Ｌｅｌｉｅｖｒ ｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９８：３８ ７−３９１）を２コピー、および末端制限ＢａｍＨＩ部位を含むオリゴヌクレオ チドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドは配列番号２７および２８に示さ れる配列を有する。 これら２本のオリゴヌクレオチドのアニーリングによりもたらされる二本鎖Ｄ ＮＡ断片は、５’および３’の両末端にＢａｍＨＩ部位を有する。 アニールされたＤＮＡ断片をＧ４Ｇ内の４コピー分のＧａｌ４結合部位の上流 のＢａｍＨＩ部位中に直接クローン化して、実施例３に記載される要領で（Ｇｙ ２）₂−Ｇ４Ｇを形成した。 実施例５ ＡＢＡ−およびＶＰＩ−により調節されるＥｍ調節要素のＧａｌ４結合部位プ ロモーターへの添加 ２コピーのＥｍ要素共通配列（小麦Ｅｍプロモーターの転写開始部位から、 −１５２〜−７８に伸長する；Ｍａｃｒｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐ ｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：９６９−９７６；Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：１５１１−１５１８）お よび末端制限ＢａｍＨＩ部位を有するオリゴヌクレオチドを設計した。これらの オリゴヌクレオチドは配列番号２９および３０に示される配列を有する。これら２本のオリゴヌクレオチドのアニーリングによりもたらされる二本鎖ＤＮ Ａ断片は、５’および３’の両末端にＢａｍＨＩ部位を有する。アニールされた ＤＮＡ断片をＧ４Ｇ内の４コピーのＧａｌ４結合部位の上流のＢａｍＨＩ部位中 に直接クローン化して、実施例３に記載される要領で（Ｅｍ）₂−Ｇ４Ｇを形成 した。このキメラ（Ｅｍ）₂−Ｇ４Ｇ遺伝子をＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片として バイナリーベクターｐＺＢＬ１内にクローン化して、実施例１に記載される要領 でｐＺＢＬ５を作成した。 実施例６ ＡＢＡ−およびＶＰ１−により調節されるＣ１調節要素のＧａｌ４結合 部位プロモーターへの添加 ２コピーのＣ１要素（ＧＴ−要素およびＳｐｈＩ要素を含む）（Ｈａｔｔｏｒ ｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：６ ０９−６１８；Ｋａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８： １１７１−１１７９）、および末端制限ＢａｍＨＩ部位を含むオリゴヌクレオチ ドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドは配列番号３１および３２に示され る配列を有する。これら２本のオリゴヌクレオチドのアニーリングによりもたらされる二本鎖ＤＮ Ａ断片は、５’および３’の両末端にＢａｍＨＩ部位を有する。アニールされた ＤＮＡ断片をＧ４Ｇ内の４コピーのＧａｌ４結合部位の上流のＢａｍＨＩ部位中 に直接クローン化して、実施例３に記載される要領で（Ｃ１）₂−Ｇ４Ｇを形成 した。 実施例７ 構成的Ｇ−ｂｏｘ調節要素のＧａｌ４結合部位プロモーターへの添加 ４コピーのＧ−ｂｏｘ要素、ＴＣＣＡＣＧＴＧＧＣ（Ｍｅｎｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＴＩＢＳ ２０：５０６−５１０；Ｋａｔａｇｉｒｉ ａｎ ｄ Ｃｈｕａ，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：２２− ２７；Ｆｏｓｔｅｒ ａｎｄ Ｃｈｕａ，１ ９９４，ＦＡＳＥＢ ８：１９２−２９９）および末端制限ＢａｍＨＩ部位を含 むオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドは配列番号３３ および３４に示される配列を有する。 これら２本のオリゴヌクレオチドのアニーリングによりもたらされる二本鎖ＤＮ Ａ断片は、５’および３’の両末端にＢａｍＨＩ部位を有する。アニールされた ＤＮＡ断片をＧ４Ｇ内の４コピーのＧａｌ４結合部位の上流のＢａｍＨＩ部位中 に直接クローン化して、実施例３に記載される要領で（Ｇ−ｂｏｘ）₄−Ｇ４Ｇ を形成した。このキメラ（Ｇ−ｂｏｘ）₄−Ｇ４Ｇ遺伝子をＢａｍＨＩ−Ｓａｌ Ｉ断片としてバイナリーベクターｐＺＢＬ１内にクローン化して、実施例１に記 載される要領でｐＺＢＬ６を作成した。 実施例８ 光誘導性ＣＨＳ Ｕｎｉｔ１調節要素のＧａｌ４結合部位プロモーターへの添加 パセリからのカルコンシターゼ遺伝子のＣＨＳ Ｕｎｉｔ１要素の２コピー（ ｂｏｘ１およびｂｏｘＩＩを含む；Ｗｅｉｓｓｈａａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９ １，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：１７７７−１７８６；Ｍｅｎｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ． ，１９９５，ＴＩＢＳ ２０：５０６−５１ ０）および末端制限ＢａｍＨＩ部位を含むオリゴヌクレオチドを設計した。これ らのオリゴヌクレオチドは配列番号３５および３６に示される配列を有する。 ＣＧＳ Ｕｎｉｔ１要素の各コピーには下線を施し、そして保存されるヌクレオ チドは太文字でタイプしてある。これら２本のオリゴヌクレオチドのアニーリン グによりもたらされる二本鎖ＤＮＡ断片は、５’および３’の両末端にＢａｍＨ Ｉ部位を有する。アニールされたＤＮＡ断片をＧ４Ｇ内の４コピーのＧａｌ４結 合部位の上流のＢａｍＨＩ部位中に直接クローン化して、実施例３に記載される 要領で（ＣＨＳ−Ｕｎｉｔ１）₂−Ｇ４Ｇを形成した。 実施例９ ファセオリンＡＴ−リッチエンハンサーの(ＲＹ−Ｇ−ｂｏｘ−ＲＹ)₂−Ｇａｌ ４結合部位プロモーターへの添加 追加的エンハンサーＤＮＡ断片を（ＲＹ−Ｇ−ｂｏｘ−ＲＹ）₂−Ｇａｌ４結 合部位の上流に導入した。実施例１に示されるように、このＡＴ−リッチエンハ ンサーは、−１４７１のＥｃｏＲＩ部位から−３９１ のＮｓｉＩ部位にまで伸長し、そしてマトリックス連結領域およびＡＴ−リッチ エハンサー（Ｔｉｍ Ｈａｌｌ、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙよ り取得した；ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６ ｐ４１３−４２３；ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｅｅ ｓｔ ａｎｄ Ｈａｌｌ，１９９７，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ ｌｏｇｙ ３３：５５３−５５７）を含むファセオリンプロモーター（Ｐｈ５’ ）の上流部分から由来していた。バイナリーベクター内にＰｈ５’−（ＲＹ−Ｇ −Ｂｏｘ−ＲＹ）₂−Ｇ４Ｇを構築するため、実施例１に記載される要領でＰｈ ５’を含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片をバイナリーｐＺＢＬ４ベクター中の（ ＲＹ−Ｇ−ｂｏｘ−ＲＹ）₂−Ｇａｌ４の上流のＢａｍＨＩ部位内にクローン化 させてｐＺＢＬ８を形成した。Ｐｈ５’断片の正しい方向を制限酵素分析により 確認した。 実施例１０ ファセオリンＡＴ−リッチエンハンサーの（Ｅｍ）₂−Ｇａｌ４結合部位プロモ ーターへの添加 実施例９における要領で、ファセオリンＡＴ−リッチエンハンサーは（Ｅｍ）₂ −Ｇａｌ４結合部位プロモーター−ＧＵＳレポーター遺伝子内にも導入した。 バイナリーベクター内にＰｈ５’−（Ｅｍ）₂−Ｇ４Ｇ遺伝子を構築するため、 実施例１に記載される要領でＰｈ５’を含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片をバイ ナリーｐＺＢＬ５ベクター内の（Ｅｍ）₂−Ｇａｌ４部位の上流のＢａｍＨＩ部 位内にクローン化してｐＺＢＬ９を形成した。Ｐｈ５’断片の正しい方向を制限 酵素分析により確認した。実施例１１ ファセオリンＡＴ−リッチエンハンサーの（Ｇ−ｂｏｘ）₄−Ｇａｌ４結合部位 プロモーターへの添加 実施例９における要領で、ファセオリンＡＴ−リッチエンハンサーは（Ｇ−ｂ ｏｘ）₄−Ｇａｌ４結合部位プロモーター−ＧＵＳレポーター遺伝子内にも導入 した。バイナリーベクター内にＰｈ５’−（Ｇ−ｂｏｘ）₄−Ｇ４Ｇ遺伝子を構 築するため、実施例１に記載される要領でＰｈ５’を含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨ Ｉ断片をバイナリーｐＺＢＬ６ベクター内の（Ｇ−ｂｏｘ）₄−Ｇａｌ４部位の 上流のＢａｍＨＩ部位内にクローン化してｐＺＢＬ１０を形成した。Ｐｈ５’断 片の正しい方向を制限酵素分析により確認した。 実施例１２ トランスジェニックタバコ植物の遺伝交雑 初期形質転換体を土壌に移し、そして１４時間２１℃での昼および１０時間１ ８℃での夜周期に維持してあり約８０％の相対湿度、白色蛍光と白熱光との混合 光下にある成長用チャンバー内で成長させた。植物は成熟するまで成長させ、そ して手作業での授粉を、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｄ．Ｆ．Ｍａｔｚ ｉｎｇｅｒによる、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｐｌａｎｔ ｓ Ｗ．Ｒ．Ｆｅｈｒ ａｎｄ Ｈ．Ｈ．Ｈａｄｌｅｙ，ｅｄｓ，ｐｐ６５７− ６６８（１９８０）、の手法の僅かな改変法を用いて実施した。簡潔には、雌の 親として用いられる予定の植物からの花を開花期の一日前に選択し；花冠を縦方 向に分割し、葯を除去し、柱頭を、その植物に関して開花させた雄親植物からの 花からの花粉で授粉させた。混入性花粉が柱頭に到達する のを防ぐため、一端がモデリング用クレー（ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｃｌａｙ）には め込まれている４ｃｍの長さのカクテル撹拌機を柱頭および花柱の上に走らせ、 そして花冠により適切な場所に保持した。各花には名札をつけた。さく果を成熟 するまで成長させ、そしてその後に収穫した。 遺伝交雑はＲ０世代（初期形質転換体）で、キメラ転写因子を保持するエフェ クター植物と、Ｇａｌ４結合部位プロモーター−ＧＵＳ遺伝子を保持するレポー ター植物との間で実施した。レポーター遺伝子を含む３つの独立するトランスジ ェニックタバコ植物を個別に、エフェクター遺伝子を保持する３つの個別のトラ ンスジェニック系統に交雑させた。レポーター植物は、エフェクターの非存在下 での遺伝子発現レベルについての対照として作用する野生型タバコ植物にも交雑 させた。 実施例１３ 種子内での導入遺伝子発現のアッセイ 遺伝交雑からのＦ₁種子をＧＵＳ活性について分析した。各試料につき約１０ ０個の種子（３０ｍｇ）を迅速に液体Ｎ₂中で凍結し、そして０．５ｍｌ ＧＵ Ｓ溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄／Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７、１０ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％ サルコシル（Ｓａｒ ｋｏｓｙｌ）、１０ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール（Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈ ａｎｏｌ））中で挽いた。１５分の４℃での高速遠心の後には上清を回収し、そ してアッセイまで−７０℃に保存した。ＧＵＳアッセイについては、２５μｌの ＧＵＳ溶解緩衝液を最初に、９６−ウエル蛍光分光分析用マイクロタイタープレ ート（Ｔｉｔｒｅｔｅｋ Ｆｌｕｏｒｏｐｌａｔｅ；ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃ ａｌｓ）の各々のウエル中に添加した。各試料抽出物の１マイ クロリットルを各ウエル中の２５μｌのＧＵＳ溶解緩衝液中に添加した。新しく 調製したＭＵＧ基質（ＧＵＳ溶解緩衝液中の１．７ｍＭ ４−メチルウンベリフ ェリル−ｂ−Ｄ−グルクロニド（Ｓｉｇｍａ社））の１５０マイクロリットルを 各ウエルに添加した。この反応を、７５μｌの０．６Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃を、ＭＵＧ 基質の添加後、０、３０、６０、および１２０分目に添加することにより停止さ せた。蛍光を検出し、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−３Ｂ分光光度計 を用いて定量した。試料の活性を、ＭＵ標準の量（ｐモル）を測定された蛍光強 度に対してプロットすることにより構築された標準曲線から決定した。蛋白質ア ッセイを、マイクロタイタープレートプロトコールについての製造業者の手順書 に従い、Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｒ ｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて同一の試料抽出物について実施した。 図９〜１２に示されるように、ファセオリンプロモーターもしくは３５Ｓプロ モーターのいずれかの制御下に置かれるキメラＧ４ＶＰ１６およびＧ４Ａｌｆ転 写因子は、特異的にＧａｌ４結合部位プロモーターを活性化した。この遺伝子活 性化は応答性プロモーター中の特異的Ｇａｌ４結合部位を必要とし、なぜなら遺 伝子活性化は、そのプロモーター中にはＧａｌ４部位を含まない対照であるｐＺ ＢＬ２レポーター系統では検出されなかったためである。 例えば図９ではレーンＩ〜ＬＳは、ｐＺＢＬ３系統２Ａ（これはレポーター遺 伝子、すなわちＧａｌ４結合部位プロモーターにより稼働するＧＵＳ遺伝子を保 持する）を、野生型（ＷＴ）またはＰｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６系統１４Ａ、１５Ａ 、もしくは１３Ｂ（これらは野生型陰性対照 を例外として、種子特異的ファセオリンプロモーターの制御下に置かれるキメラ 転写因子を保持する）のいずれかの植物との交雑からもたらされるＦ₁種子にお けるＧＵＳ活性を示す。従って、レーンＩはキメラ転写因子が提供されない場合 のバックグラウンドレベル発現を示し；Ｊ〜Ｌはその系の両方の構成成分が存在 する場合に取得された発現レベルの範囲を示す。全てが対照より明らかに高く、 キメラ転写因子がバックグラウンドレベル以上に転写を活性化することが示され る。更に進んだ交雑を３つの追加的ｐＺＢＬ３トランスジェニック系統を用いて 行った。レーンＭ〜Ｒは、レポーター系統ｐＺＢＬ３ ６Ａ、４Ｂ、および３Ｄ の、単一のＰｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６系統１４Ａ（レーンＮ、Ｐ、Ｒ）ならびにＷ Ｔ対照（レーンＭ、Ｏ、Ｑ）との交雑の結果を示す。再度キメラ転写因子は全て の交雑物においてバックグラウンドレベルをかなり上回りＧＵＳ発現を活性化さ せた。 この遺伝子活性化系の特異性も示した。レーンＡおよびＢは対照植物ｐＺＢＬ ２ ２Ｃ（Ｇａｌ４結合部位を欠く最小プロモーター）のＷＴもしくはＰｈ／Ｐ −Ｇ４ＶＰ１６系統１４Ａとの交雑からもたらされるＦ₁種子におけるＧＵＳ活 性を示す。レーンＣ〜Ｆは、対照植物ｐＺＢＬ２ １１ＡのＷＴもしくはＰｈ／ Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６系統１４Ａ、１５Ａ、もしくは１３Ｂとの交雑によりもたらさ れるＦ₁種子におけるＧＵＳ活性を示す。レーンＧ〜Ｈは、対照植物ｐＺＢＬ２ ４ＢとＷＴもしくはＰｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６系統１４Ａとの交雑によりもたら されるＦ₁種子におけるＧＵＳ活性を示す。 図１０〜２１は、図９について記載されるものに類似する方法で読まれる。 図１３〜１６に示されるように、ＡＢＡ−およびＶＰ１−により調節されるＥ ｍ要素もしくは構成的に調節されるＧ−ｂｏｘ要素もＧａｌ４結合部位と組み合 わせて用いた。ファセオリンプロモーターもしくは３５Ｓプロモーターの制御下 に置かれるキメラＧ４ＶＰ１６およびＧ４Ａｌｆ転写因子は特異的に、安定なト ランスジェニックタバコ種子内でＧＵＳレポーター遺伝子を発現させるのに用い られる（Ｅｍ）₂−Ｇａｌ４結合部位プロモーター（ｐＺＢＬ５）もしくは（Ｇ −ｂｏｘ）₄−Ｇａｌ４結合部位プロモーター（ｐＺＢＬ６）を活性化させた。 図１３に示されるように、Ｇ−ｂｏｘとＧａｌ４部位とを両方組み合わせること （ｐＺＢＬ６）により付与される遺伝子活性化のレベルは、Ｇａｌ４部位単独（ ｐＺＢＬ３）から取得されるものよりもはるかに大きくなる（図１３におけるレ ーンＮ内のＧＵＳ活性のレベルを図９におけるレーンＮ内のものと比較する）。 レーンＱは、高発現されたＰｈ／Ｐ−ＧＵＳ系統からの種子におけるＧＵＳ活性 のレベルを示す。これは−４１０ファセオリンプロモーターを含む、以前に記載 された（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．１０６ ：４４７）対照Ｐｈ／Ｐ−ＧＵＳ系統である。レーンＲは、Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅ ｔ ａｌ．，１９９２ Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３４：４９、内に記載 されるｐＺ４ｌｏｘＡＧ形質転換体に由来する高発現された３５Ｓ−ＧＵＳ系統 からの種子におけるＧＵＳ活性を示す。図１３レーンＮ、ならびに図１４レーン Ｏ、および図１５レーンＰに示される２構成成分発現系の例での発現レベルはフ ァセオリンプロモーターのものよりも高くなる。これらの図における更に多くの 例での発現は３５Ｓプロモーターのものよりも高くなる。 図１７〜２０は、Ｇａｌ４部位（ｐＺＢＬ７）、（ＲＹ−Ｇ−Ｂｏｘ−ＲＹ）₂ −Ｇａｌ４部位（ｐＺＢＬ８）、（Ｅｍ）₂−Ｇａｌ４部位（ｐＺＢＬ９）、も しくは（Ｇ−ｂｏｘ）₄−Ｇａｌ４部位（ｐＺＢＬ１０）の上流に位置するファ セオリンプロモーターの５’領域からの追加的ＡＴリッチエンハンサーを含むプ ロモーターの活性化を示す。ファセオリンプロモーターもしくは３５Ｓプロモー ターのいずれかの制御下に置かれるキメラＧ４ＶＰ１６およびＧ４Ａｌｆ転写因 子は特異的にｐＺＢＬ７、ｐＺＢＬ８、ｐＺＢＬ９、およびｐＺＢＬ１０内のＧ ａｌ４部位を活性化して安定なトランスジェニックタバコ種子内でＧＵＳレポー ター遺伝子を発現させた。ｐＺＢＬ７、ｐＺＢＬ８、ｐＺＢＬ９、もしくはｐＺ ＢＬ１０のＷＴ植物への交雑からもたらされるＦ₁種子内でのＧＵＳ活性のレベ ルは、これらの植物内のＧＵＳ遺伝子構築物からのバックグラウンド発現レベル を示す。種子特異的要素もしくは構成的要素、およびＡＴ−リッチエンハンサー を含む２構成成分Ｇａｌ４系内では、調節要素は一緒に機能して遺伝子発現を更 に活性化させ、そして遺伝子発現レベルを増加させる。 図９〜２０に示されるように活性化レベルは異なる形質転換系列の間では異な っていた。最大の活性化は、Ｐｈ／Ｐ−Ｇ４ＶＰ１６エフェクター系列（１４Ａ ）もしくはＰｈ／Ｐ−Ｇ４Ａｌｆ系列（１７Ａ）をｐＺＢＬ９ ３Ｆ、４Ｆ、も しくはｐＺＢＬ１０ １１Ｈ、７Ｃレポーター系列と交雑させた場合に達成され た（図１７、レーンＬ、Ｎ、Ｔ、Ｚ、図１９、レーンＬ）。種子内におけるこの ２構成成分Ｇａｌ４系により付与される最善の遺伝子発現レベルは、ファセオリ ンプロモーターにより付与されるものの約３倍高く（図１７におけるレーンＬお よびＡ’を 比較せよ）、そして３５Ｓプロモーターよりも約１５倍高い（図１７のレーンＬ およびＢ’を比較せよ）。同様ではあるもののやや程度が下がるレベルでの活性 化は、３５Ｓ−Ｇ４ＶＰ１６および３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆがエフェクターとして用 いられた場合に達成された（図１８および２０）。 従って、ある活性化ドメインと組合わされ、少なくとも一つのＧａｌ４結合部 位および場合によって存在する追加的調節要素、およびＧａｌ４ ＤＮＡ結合ド メインに基づく本発明の２構成成分遺伝子調節系は、その系の双方の構成成分を 宿す種子内で遺伝子発現を活性化するのに成功した。最も効果的な系列は、高度 な活性を示すファセオリンプロモーターから得られるものよりも３倍高いレベル での発現を指令することができた。 実施例１４ 実生における導入遺伝子発現のアッセイ 遺伝交雑からのＦ₁タバコ実生もＧＵＳ活性について分析した。分析を行った 各交雑物につき約５０の種子を発芽させ、そして室温（２０℃）での１４日間の 蛍光下、湿潤させた砂の上で成長させた。実生（葉および根の両組織を含む）を １．０ｍｌのＧＵＳ溶解緩衝液中で挽いた。ＧＵＳアッセイおよび蛋白質アッセ イを先に記載される要領で実施した。図２１に示されるように、３５Ｓプロモー ターにより稼働されるＧ４ＡｌｆおよびＧ４ＶＰ１６の両方が、安定なトランス ジェニックタバコ実生中での遺伝子発現を活性化させた。最高の活性化レベルは 、３５Ｓ−Ｇ４ＶＰ１６エフェクター系列とＰｈＧ４Ｇ １７Ｃレポーター系列 との間の遺伝交雑により達成された（レーンＯ、Ｐ）。タバコ実生におけ るこの２構成成分Ｇａｌ４遺伝子発現系により付与される最高の遺伝子発現レベ ルは、３５Ｓプロモーターにより付与されるものと同一レベルであった（レーン ＰとＲを比較せよ）。バックグラウンドを上回る活性化は、Ｇａｌ４結合部位が 全く提供されない場合には得られなかった（−６５−５Ｃ、レーンＡ〜Ｄ）。特 異的遺伝子活性化は３５Ｓ−Ｇ４Ａｌｆを有する実生において取得されたものの 、その程度は低めであった（レーンＥ〜Ｌ）。全ての場合において、レポーター もしくはエフェクター系列のいずれかについての異なる個別の形質転換体の使用 が異なる活性化レベルをもたらすことが観察され得る。当業者は、これをトラン スジェニック植物のファミリーにおいて共通に観察される「位置効果」の現れと して認識するであろう（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４ １１−２４１８，１９８５；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．，ＭＧＧ ２ １８：７８−８６，１９８９）。 従って、ある活性化ドメインと組合わされ、少なくとも一つのＧａｌ４結合部 位、および場合によっては存在する追加的調節要素、およびＧａｌ４ ＤＮＡ結 合ドメインに基づく本発明の２構成成分調節系は、この系の双方の構成成分を宿 す実生における遺伝子発現をうまく活性化させた。最も効果的な系列は、高度な 活性を示す３５Ｓプロモーターから取得されるものと同一レベルでの発現を指令 することができた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，Ｉ Ｄ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 安定に形質転換されたトランスジェニック植物細胞内での遺伝子発現を 調節するための： ａ）５’−３’方向で （１）少なくとも一つのＧａｌ４結合配列に操作的に連結されるプロモーター ； （２）プロモーターに操作的に連結されたコーディング配列もしくはその相 補体；および （３）コーディング配列もしくはその相補物に操作的に連結されたポリアデ ニル化シグナル配列；ただしそのプロモーターが最小プロモーターである場合に は、Ｇａｌ４結合配列はその最小プロモーターの上流に位置する； を含む第一キメラ遺伝子；ならびに ｂ）５’−３’方向で （１）プロモーター； （２）Ｇａｌ４転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮ Ａ配列； （３）（２）のＤＮＡ配列に操作的に連結される転写活性化ドメインをコー ドするＤＮＡ配列；および （４）（３）のＤＮＡ配列に操作的に連結されるポリアデニル化シグナル配 列； を含む第二キメラ遺伝子、 を植物細胞のゲノム内に組み入れることを含んでなる方法。 ２． 請求の範囲１に記載の、第一遺伝子が更に少なくとも一つの調節要素を 含む方法。 ３． 請求の範囲１に記載の、第一遺伝子が更に最小プロモーターおよびＧａ ｌ４結合配列の上流に位置する少なくとも一つの調節要素を含む方法。 ４． 請求の範囲２もしくは３に記載の、調節要素が種子特異的要素もしくは 構成的要素からなる群より選択される方法。 ５． 請求の範囲４に記載の、調節要素が更にエンハンサーを含む方法。 ６． 請求の範囲２もしくは３に記載の、調節要素が、ＲＹ−Ｇ−ＢＯＸ−Ｒ Ｙ、Ｅｍ、Ｃ１、Ｇｙ２、Ｇ−Ｂｏｘ、ＣＨＵ Ｕｉｎｔ１、もしくはファセオ リンプロモーターの５’エンハンサーからなる群より選択される方法。 ７． 請求の範囲１、２、もしくは３に記載の、第一および第二構築物を、（ ａ）植物細胞を第一構築物で形質転換し、（ｂ）第二植物細胞を第二構築物で形 質転換し、（ｃ）（ａ）および（ｂ）における形質転換させた細胞から繁殖性を 有する成熟した植物を成長させ、そして（ｄ）形質転換させた植物を遺伝交雑さ せて、ゲノムが第一および第二構築物を含む子孫を産生させることにより植物細 胞内に組み合わせ入れる方法。 ８． 請求の範囲１、２、もしくは３に記載の、転写活性化ドメインが酸性転 写活性化ドメインである方法。 ９． 請求の範囲１、２、もしくは３に記載の、転写活性化ドメインをコード するＤＮＡ配列がＰｖＡｌｆもしくはＰＶ１６からなる群より選択される転写因 子から得られる方法。 １０． 発現が請求の範囲１、２、もしくは３の方法を用いて調節される少なく とも一つの遺伝子を有する形質転換された植物。 １１． 請求の範囲１０の植物から取得される種子。