BR102013002576A2

BR102013002576A2 - Motivos de interação de transativação de planta e uso dos mesmos

Info

Publication number: BR102013002576A2
Application number: BRBR102013002576-3A
Authority: BR
Inventors: Joseph Petolino; Jianquan Li; Steven L Evans; Ryan C Blue
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2012-02-02
Filing date: 2013-02-01
Publication date: 2015-09-01
Also published as: AR089877A1; EP2809146B1; CN107556389A; KR102076716B1; CN104202966B; UA117452C2; JP6473477B2; CN107556389B; IL233806B; JP2017176185A; KR20190099541A; JP6208692B2; KR102076725B1; US11603535B2; AU2013214814B2; SA113340251B1; KR102076719B1; TW201336867A; JP2017193544A; WO2013116731A1

Abstract

Motivos de interação de transativação de planta e uso dos mesmos. A presente invenção refere-se a composições e métodos para aumentar a expressão de um polinucleotídeo de interesse. Algumas modalidades dizem respeito aos novos polipeptídeos de transativação e as variantes dos mesmos que foram identificados em plantas, e métodos de utilização do mesmo. As modalidades particulares dizem respeito à utilização de pelo menos um polipeptídeo de ligação ao dna de uma proteína de fusão para atingir pelo menos um polipeptideo de transativação ou variante de um local de ligação especifico de um ácido nucleico que compreende o polinucleotideo de interesse, de tal modo que a sua expressão pode ser aumentada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOTIVOS DE INTERAÇÃO DE TRANSATIVAÇÃO DE PLANTA E USO DOS MESMOS".

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

Este pedido de patente reivindica o benefício do pedido de patente U.S. Provisória n° de série 61 / 594, 245, depositado em 02 de fevereiro de 2012, intitulado "Motivos de interação de transativação de planta e uso dos mesmos".

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a biotecnologia de plantas. As modalidades referem-se a poiipeptídeos {por exemplo, uma proteína de fusão) que compreendem um motivo de interação do fator de transcrição novo ou sintético a partir de um transativador da planta. Algumas modalidades referem-se ao uso de tal proteína ttendo a finalidade de expressar um ácido nucleico de interesse, ou tendo a finalidade de aumentar a expressão de um ácido nucleico de interesse. Algumas modalidades referem-se aos polinucle-otídeos que codificam uma proteína que compreende um motivo de interação do fator de transcrição novo ou sintético a partir de um transativador da planta. Os exemplos particulares dizem respeito a células hospedeiras, tecidos e/ou organismos que compreende um polipeptídeo ou polinucleotídeo da presente invenção.

ANTECEDENTES A introdução de genes clonados e isolados em células de plantas (transformação genética), e a subsequente regeneração de plantas transgênicas, é amplamente utilizada para fazer as modificações genéticas de plantas e materiais de plantas. A transformação genética de plantas para introduzir um traço desejável (por exemplo, a melhoria da qualidade nutricional; rendimento aumentado; praga ou a resistência a doenças; tolerância ao stress, e resistência a herbicida) é normalmente utilizada para a produção de plantas transgênicas novas e melhoradas as quais expressam a caraterística desejável. DNA é tipicamente introduzido de uma maneira aleatória no DNA nuclear ou plasto de uma célula vegetal eucariótica e as células que contêm o DNA integrado no DNA da célula são então isoladas e utilizadas para a produção de células de plantas estavelmente transformadas. Muitas vezes, é desejável manipular geneticamente uma variedade de planta única com a finalidade de expressar mais do que uma caraterístíca introduzida através da introdução de múltiplas sequências de codificação, os quais podem compreender elementos similares (ou idênticos) reguladores. A expressão de transgenes (assim como genes endógenos) é controlada por meio de mecanismos que envolvem as múltiplas interações DNA - proteína e proteína - proteína. Através de tais interações, elementos de ácido nucleico reguladores (por exemplo, promotores e íntensificadores) podem conferir os padrões de expressão de uma sequência de codificação que é ou constitutiva ou especifica. Por exemplo, um promotor pode levar a um aumento da transcrição de uma sequência de codificação em tecidos específicos, durante os períodos de desenvolvimento específicos, ou em resposta a estímulos ambientais. Infelizmente, os atributos inerentes de promotores convencionais de expressão do transgene limitam o intervalo de controle de expressão que pode ser usado para exercer em uma célula hospedeira. Uma limitação prática dos promotores convencionais é que é difícil de ajustar finamente o nível de expressão de um gene introduzido, devido às limitações na força do promotor e ao silenciamento de expressão transgêni-ca por meio dos promotores particularmente fortes ou a utilização simultânea na mesma célúía de muitas cópias do mesmo promotor. Também pode ser desejável para iniciar ou aumentar a expressão de genes endógenos ou nativos.

Transativadores são proteínas que funcionam através do recrutamento através de interações proteína - proteína de um número de diferentes proteínas envolvidas na transcrição do DNA (por exemplo, complexos de remodelação do nucleossoma; mediador do complexo, e fatores de transcrição gerais, como TFUB, TBP, e TFIIH) com a finalidade de iniciar ou de aumentar a taxa de transcrição, afetando a montagem / desmontagem de nucleossoma, formação complexa de pré - iniciação, a liberação de promotor e / ou a taxa de alongamento. As interações proteína - proteína de transativadores e os seus parceiros de ligação discretos envolvem os elementos estru- turais internos dentro dos transativadores conhecidos como "domínios de 7 , transativação (TADs) TADs são pensados em partilhar a homologia da sequência primária e pouco adotam uma estrutura definida somente após ligação a um alvo. Sigler (1988) Nature 333:210 a 2. Embora os resíduos ácidos e hidrofóbicos, dentro dos TADs são pensados em serem importantes (vide, por exemplo, Cress e Triezenberg (1991) Science 251 (4989) : 87 a 90), a contribuição dos resíduos individuais de atividade é considerada pequena. Hall e Struhl (2002) J. Biol. Chem. 277:46043 a 50. A proteína de viriona Herpes Simpíex 16 (VP16) é um transati-vador que funciona para estimular a transcrição dos genes virais precoces imediatos em células infectadas com HSV. Tal como acontece com outros transativadores, VP16 ativa a transcrição através de uma série de interações proteína - proteína envolvendo seu TAD, que é altamente ácidas. O TAD ácida de VP16 foi mostrado para interagir com várias proteínas parceiras tanto in vitro como in vivo . Por exemplo, o TAD de VP16 contém um motivo de interação que interage de uma maneira direta com a subunidade de Tfb1 TFIIH (Langlois et ai.. (2008) J. Am. Chem. Chem. Soe. 130:10596 a 604), e esta interação é correlacionada com a capacidade de VP16 para ativar tanto o início da fase de alongamento e a transcrição de genes virais precoces imediatos.

DESCRIÇÃO São descritos na presente invenção novos motivos de interação proteína - proteína TAD, que têm sido isolados a partir de proteínas de plantas transativadoras, e ácidos nucleicos que codificam para o mesmo. Estes novos motivos de interação podem ser utilizados em um TAD sintético para conferir as propriedades reguladoras de genes em cima de um polipeptídeo que compreende o TAD. Por exemplo, algumas modalidades incluem uma proteína de fusão transcricional de ativador que compreende um domínio de ligação de tal DMA polipeptídeo e um polipeptídeo TAD. Dependendo do domínio de ligação de DNA específico, que é fundida ao TAD na proteína de fusão transcricional de ativador, a transativação pode ser utilizada com a finalidade de aumentar a expressão de um gene de interesse. Por exemplo, um polinucleotídeo heterólogo em que o domínio de ligação a DNA se liga pode ser operativamente ligado ao gene de interesse, visando dessa maneira a proteína de fusão (e seu TAD funcional), a ligação do que irá aumentar a expressão do gene de interesse. De uma maneira alternativa, um domínio de ligação de DNA pode ser manipulado com a finalidade de se ligar um polinucleotídeo endógeno que está de maneira operacional ligado a, ou proxi-mal, o gene de interesse. Após a ligação de uma proteína de fusão transcri-cional de ativador a um local de ligação de DNA alvo, a transcrição de um gene ligado operativamente ao local de ligação de DNA alvo pode ser estimulada.

Também descritos na presente invenção são os motivos de interação proteína - proteína das variantes sintéticas TAD, e ácidos nucleicos que codificam para o mesmo. Em alguns exemplos, o motivo de interação proteína - proteína da variante sintética TAD é desenvolvido através da introdução de uma ou mais mutações (por exemplo, uma mutação conservadora, ou uma mutação identificada em um ortólogo do motivo de interação) na TAD de um transativador (por exemplo, um planta transativadora). De maneira surpreendente, uma variante sintética TAD gerada desta forma, que compreende um motivo de interação variante pode conferir as propriedades reguladoras de genes diferentes do TAD não modificada, quando acopladas a um domínio de ligação a DNA de uma proteína de fusão transcricional ati-vadora. Por exemplo, as variantes sintéticas TADs particulares que compreendem um motivo de interação variante pode aumentar o nível de ativação da transcrição conferido por meio do motivo de interação TAD de ocorrência natural quando expresso na mesma posição em uma proteína de fusão que compreende um domínio de ligação a DNA.

Algumas modalidades incluem uma proteína de fusão sintética ativadora transcricional. Em modalidades particulares, a proteína de fusão pode aumentar a transcrição de um gene de interesse, em que a proteína de fusão compreende um primeiro polipeptídeo que compreende um domínio de ligação de DNA ligado operativamente a um segundo polipeptídeo que compreende um motivo de interação TAD. Em alguns exemplos, o motivo de in- teração TAD pode ser selecionado a partir do grupo de motivos de interação TAD que consistem nas SEQ ID NOs :10 a 16. Por exemplo, e sem limitação, o motivo de interação TAD pode ser composto dentro de um TAD que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :2 a 8 e SEQ ID NOs: 100 a 106. Em alguns exemplos, o motivo de interação TAD pode ser um motivo de interação da variante TAD tendo, por exemplo, e sem limitação, uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :17 a 58. Por exemplo, e sem limitação, um tal motivo de interação da variante TAD pode ser composto dentro de um TAD que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 107 a 120.

Algumas modalidades incluem um polinucleotideo que codifica uma proteína de fusão sintético ativadora transcricional que compreende um primeiro polipeptídeo que compreende um domínio de ligação de DNA operativamente ligado a um segundo polipeptídeo que compreende um motivo de interação TAD. Um domínio de ligação ao DNA de polipeptídeo pode ser qualquer domínio de ligação a DNA que se liga de uma maneira específica a um local particular alvo de ligação de DNA. Por exemplo, e sem limitação, o domínio de ligação a DNA de polipeptídeo pode ser um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em um dedo de zinco de ligação do DNA de domínio; domínio de ligação de DNA UPA; GAL4; TAL; LexA, um repres-sortet; LACR, e um receptor de hormônio esteroide. Em exemplos particulares, a sequência de ligação do DNA do domínio de codificação pode ser selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 99. Em exemplos particulares, o polinucleotideo pode compreender uma sequência de ligação a DNA que codifica a proteína, isto é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou 100% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 99.

Em alguns exemplos, o polinucleotideo pode compreender uma sequência de codificação do motivo de interação TAD que codifica um moti- vo de interação TAD ou variante do motivo de interação TAD, por exemplo, possuindo uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs :10 a 58. As modalidades particulares incluem um poiinucleotídeo que codifica uma prote-ína de fusão ativadora transcricíonal que compreende pelo menos um motivo de interação TAD. As modalidades particulares incluem um poiinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão ativadora transcricíonal que compreende pelo menos um domínio de ligação a DNA.

Exemplos de polinucleotídeos que codificam para uma proteína de fusão ativadora sintética transcricionai de acordo com algumas modalidades da presente invenção incluem os polinucleotídeos que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um domínio de ligação a DNA e pelo menos uma sequência nucleotídica que codifica um motivo de interação TAD (ou variante), em que o poiinucleotídeo compreende, por exemplo e sem limitação, pelo menos, uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ !D NOs :79 a 93, uma sequência de nucleotídeos que é substanciaimente idêntica a uma das SEQ ID NOs :79 a 93, uma sequência de nucleotídeo possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com uma das SEQ ID NOs :79 a 93, uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85% de identidade de sequência com uma das SEQ ID NOs :79 a 93, uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade de sequência a uma das SEQ ID NOs :79 -93, uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 95% de identidade de sequência com uma das SEQ ID NOs :79 - 93, uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 97% de identidade de sequência com uma das SEQ ID NOs: 79 - 93, uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 98% de identidade de sequência com uma das SEQ ID NOs :79 - 93, uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99% de identidade de sequência com uma das SEQ ID NOs :79 - 93, o complemento de um polinucleido que é de uma maneira específica hibridada com, pelo menos, uma das SEQ ID NOs :79 -93, e o complemento inverso de um poiinucleotídeo que é de uma maneira específica hibridada com, pelo menos, uma das SEQ ÍD NOs :79 - 93.

Em algumas modalidades, um poiinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão ativadora transcricional pode ser incorporado em um vetor /y recombinante, por exemplo, com a finalidade de proporcionar a expressão da proteína em uma célula hospedeira. Deste modo, alguns exemplos incluem um vetor que compreende pelo menos um polinucleotídeo da presente invenção, e / ou a uma célula hospedeira para a qual um tal vetor foi introduzido.

Também descritos na presente invenção estão os meios para a transativação de expressão de genes de plantas. Como utilizado na presente invenção, um "meio para a transativação da expressão do gene de planta" inclui um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, uma proteína sintética que compreende pelo menos um meio para a transativação de expressão de genes de plantas podem ser utilizados para modular a expressão de um gene de interesse em uma célula vegetal.

Além disso, são descritos na presente invenção os meios com a finalidade de aumentar a expressão do gene que são derivados de ERF2. Como usado na presente invenção, um "meio com a finalidade de aumentar a expressão do gene que é derivado de ERF2" inclui um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :17 - 22 e SEQ ID NO: 121. Adicionalmente são descritos meios com a finalidade de aumentar a expressão do gene que são derivados de PTI4. Como usado na presente invenção, um "meio com a finalidade de aumentar a expressão do gene que é derivado de PTI4" inclui um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :23 - 28 e SEQ ID NO: 122. Adicionalmente são descritos meios com a finalidade de aumentar a expressão do gene que são derivados de AtERFI. Como usado na presente invenção, um "meio com a finalidade de aumentar a expressão do gene que é derivado de AtERFT' inclui um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :29 - 34 e SEQ ID NO: 123. Adicionalmente são descritos meios com a finalidade de aumentar a expressão do gene que são derivados de OR-CA2. Como usado na presente invenção, um "meio com a finalidade de au- mentar a expressão do gene que é derivado de ORCA2" inclui um polipeptí-deo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :35 - 40 e SEQ ID NO: 124. Adicionalmente são descritos meios com a finalidade de aumentar a expressão do gene que são derivados de DREB1A. Como usado na presente invenção, um "meio com a finalidade de aumentar a expressão do gene que é derivado de DREB1A" inclui um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :41 - 46 e SEQ ID NO: 125. Adicionalmente são descritos meios com a finalidade de aumentar a expressão do gene que são derivados de CBF1. Como usado na presente invenção, um "meio com a finalidade de aumentar a expressão do gene que é derivado de CBF1" inclui um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :47 - 52 e SEQ ID NO: 126. Adicionalmente são descritos meios com a finalidade de aumentar a expressão do gene que são derivados de DOF1. Como usado na presente invenção, um "meio com a finalidade de aumentar a expressão do gene que é derivado de DOF1" inclui um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :53 - 58 e SEQ ID NO: 127. São descritos também na presente invenção os métodos com a finalidade de aumentar a expressão do gene, utilizando uma proteína de fusão ativadora sintética transcricíonal. Nos exemplos, um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão ativadora sintética transcricíonal pode ser introduzido em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula de planta, célula de levedura, células de mamífero e células imortalizada) que compreende um gene de interesse de maneira operacional ligado a um local alvo de ligação do DNA para a proteína de fusão. A expressão da proteína de fusão na célula hospedeira, e a ligação subsequente da proteína de fusão para o local alvo de DNA operativamente ligado a ligação, pode resultar na iniciação da transcrição ou de transcrição aumentada do gene de interesse. Em exemplos particulares, o local alvo de DNA de ligação pode ser introduzido na célula hospedeira, de tal forma que o local de ligação de DNA alvo é operativamente ligado ao gene de interesse. Em outros exemplos, uma proteína de fusão ativadora sinté- tica transcrícional pode compreender um domínio de ligação a DNA de poli-peptídeo que foi concebido para se ligar a um local de ligação de DNA alvo que está operativamente ligado ao gene de interesse.

Em algumas modalidades, um vetor que compreende um polinu-cleotídeo que codifica uma proteína de fusão ativadora sintética transcricio-nal pode ser introduzido em uma célula hospedeira, de tal modo que o poli-nucleotídeo é subsequentemente integrado no DNA genômico da célula hospedeira (por exemplo, através de recombinação homóloga). Dessa maneira, uma proteína de fusão ativadora sintética transcrícional, e além disso, um ácido nucleico que codifica o mesmo, pode ser composto dentro de um organismo transgênico (por exemplo, uma planta transgênica). Deste modo, estes organismos transgênicos são também descritos na presente invenção. Nos exemplos, um ácido nucleico que codifica para uma proteína de fusão ativadora sintética transcrícional tanto pode ser integrado de forma aleatória, ou em um local pré - determinado, no genoma de uma célula do organismo transgênico.

Além disso são descritos na presente invenção os métodos para a expressão de um gene de interesse, utilizando uma proteína de fusão ativadora sintética transcrícional e / ou um ácido nucleico que codifica para o mesmo. Em algumas modalidades, um vetor que compreende um polinucle-otídeo que codifica uma proteína de fusão ativadora sintética transcrícional pode ser introduzido em uma célula hospedeira que compreende um gene de interesse de maneira operacional ligada a um local de ligação do DNA alvo para a proteína de fusão. Em alguns exemplos, a proteína de fusão ativadora sintética transcrícional compreende um meio para a transativação de expressão de genes de plantas. Após o vetor é introduzido na célula hospedeira, a expressão do gene de interesse pode ser iniciado, ou aumentada, produzindo assim o produto da expressão do gene de interesse na célula hospedeira, por exemplo, em uma quantidade de acordo com o controle regulador do proteína de fusão. Tais produtos de expressão pode ser isolado e / ou purificado a partir da célula hospedeira de acordo com qualquer método conhecido na técnica.

As caraterísticas anteriores e outras tornam-se mais evidentes a partir da descrição detalhada seguinte de diversas modalidades, que prossegue com referência às figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 inclui um motivo de interação identificado do domínio de transativação de VP16 (TAD), subdomínío II (SEQ ID NO: 9). Os asteriscos indicam os aminoácidos de VP16 do domínio de transativação, subdo-mínio II, que são propostos para contactar de uma maneira direta com a su-bunidade de Tfb1 TFIIH como proposto por Langlois et a!.. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130:10596 - 604. A Figura 2 incluí um alinhamento da transativação do subdomí-nio II VP16 com as plantas identificadas TADs. As plantas TADs enumeradas contem um motivo de interação. Os motivos de interação alinhados estão em destaque. Os resíduos do motivo de interaçãodo subdomínío II de VP16, que têm sido propostos para entrar em contato com os fatores de transcrição são marcados com um asterisco (*). A Figura 3 inclui um alinhamento o qual mostra ums modificações que podem ser introduzidas no motivo de interação TAD ERF2 com a finalidade de produzir um motivo de interação da variante ERF2. As sequências dos motivos de interação nativos ERF2 e VP16 são listados para comparação. Os contatos diretos são realçados. A Figura 4 inclui um alinhamento o qual mostra ums modificações que podem ser introduzidas no motivo de interação TAD PTI4 com a finalidade de produzir um motivo de interação da variante PTI4. As sequências dos motivos de interação nativos PT14 e VP16 são listados para comparação. Os contatos diretos são realçados. A Figura 5 inclui um alinhamento o qual mostra ums modificações que podem ser introduzidas no motivo de interação TAD AtERFI com a finalidade de produzir um motivo de interação da variante AtEFRI. As sequências dos motivos de interação nativos AtERFI e VP16 são listados para comparação. Os contatos diretos são realçados. A Figura 6 inclui um alinhamento o qual mostra ums modifica- ções que podem ser introduzidas no motivo de interação TAD ORCA2 com a finalidade de produzir um motivo de interação da variante ORCA2. As sequências dos nativos ORCA2 e VP16 motivos de interação são listados para comparação. Os contatos diretos são realçados.

Figura 7 inclui um alinhamento o qual mostra ums modificações que podem ser introduzidas no motivo de interação TAD DREB1A com a finalidade de produzir um motivo de interação da variante DREB1A. As sequências dos motivos de interação nativos DREB1A e VP16 são listados para comparação. Os contatos diretos são realçados, A Figura 8 inclui um alinhamento o qual mostra ums modificações que podem ser introduzidas no motivo de interação TAD CBF1 com a finalidade de produzir um motivo de interação da variante CBF1. As sequências dos motivos de interação nativos CBF1 e VP16 são listados para comparação. Os contatos diretos são realçados. A Figura 9 inclui um alinhamento o qual mostra ums modificações que podem ser introduzidas no motivo de interação TAD DOF1 com a finalidade de produzir um motivo de interação da variante DOF1. As sequências dos motivos de interação nativos DOF1 e VP16 são listados para comparação. Os contatos diretos são realçados. A Figura 10 inclui um mapa de vetor de levedura de integração, PhO - zBG - MEL1, que contém os locais de ligação HAS (local de elevada afinidade) ZFP de ligação a montante de um gene repórter MEL1. O vetor foi alvejado ao local S. cerevisiae HO, e continha um gene de resistência para a seleção KanMX em levedura e bactérias. A Figura 11 inclui uma ilustração gráfica dos níveis de expressão do gene repórter Mel1, que resultou na levedura a partir de ativação por meio das diferentes plantas dos motivos de interação de transativação. A Figura 12 inclui um mapa de plasmídeo pDAB9897: Arabidop-sis thaliana promotor de atina 2 contendo 8 locais de ligação de dedo de zinco em tandem (Z6) de 548 - 749 pares de bases a montante do local de início da transcrição a condução de um gene repórter gus usado para testar os motivos de planta de dedo de zinco de transativação de interação de pro- teínas de fusão . O vetor binário também contém um promotor da ubiquitina -10 A. thaliana dirigindo um marcador pat selecionável para produção de casos de planta repórter alvo. A Figura 13 inclui um mapa de plasmfdeo pDAB107881. A Figura 14 inclui um mapa de plasmídeo pDAB107882. A Figura 15 inclui um mapa de plasmídeo pDAB107883. A Figura 16 inclui um mapa de plasmídeo pDAB107884. A Figura 17 inclui um mapa de plasmídeo pDAB107885. A Figura 18 Inclui um mapa de plasmídeo pDAB107886. A Figura 19 inclui um mapa de plasmídeo pDAB107887. A Figura 20 inclui um mapa de plasmídeo pDAB106272. A Figura 21 inclui um mapa de plasmídeo pDAB106238. A Figura 22 inclui um mapa de plasmídeo pDAB 106273. A Figura 23 inclui um mapa de plasmídeo pDAB106274. A Figura 24 inclui um mapa de plasmídeo pDAB 106275. A Figura 25 inclui um mapa de plasmídeo pDAB106276. A Figura 26 inclui um mapa de plasmídeo pDAB 106277. A Figura 27 inclui um mapa de plasmídeo pDAB106278. A Figura 28 inclui um mapa de plasmídeo pDAB106279. A Figura 29 inclui uma representação gráfica do desvio médio e padrão (diamantes) e os quartís (linhas e caixas) do nível de transcrição de gus normalizado pelo nível endógeno da expressão do gene para os diferentes tratamentos de plantas de transativação do motivo de interação. A ativação do gene repórter gus a partir de diferentes plantas dos motivos de interação de transativação foi comparada com um controle do vetor vazio e a ativação da subunidade do domínio II da proteína VP16. A Figura 30 incluí um mapa de plasmídeo pGalgus: Seis locais de ligação em tandem Gai4 fundidos com um promotor de atina - 2 de A. thaliana que conduz um gene repórter gus os quais são usados para testar os motivos de interação da transativação de plantas fundidas com a proteína de ligação a GAL4. O vetor binário também contém um promotor da ubíquiti-na - 10 A. thaliana dirigindo um marcador pat selecionável para a produção de casos repórter da planta aivo. A Figura 31 inclui um mapa de plasmídeo pTALgus: Oito locais de ligação de consenso da caixa em tandem UPA fundidos a um promotor de atina - 2 de A. thaliana o qual conduz um gene repórter gus sos quais ão usados para testar os motivos de interação da transativação das plantas fundidas com a proteína de ligação a TAL. O vetor binário também contém um promotor da ubiquitina -10 A. thaliana dirigindo um marcador pat sele-cionável para a produção de casos repórter da planta alvo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

As sequências de ácidos nucleicos indicadas na listagem de sequências que a acompanha são apresentadas usando as abreviaturas padrão para bases de nucleotídeos, tal como definido em 37 CFR § 1.822. A-penas um filamento de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, mas a cadeia complementar é compreendida para ser incluído por meio de qualquer referência ao filamento exibido. Na listagem de sequências de acompanhamento: SEQ ID NO, 1 mostra um domínio de transativação da planta VP16contendo um motivo de interação (sublinhado): GMTHDPVSY-GALDVDDFEFEQMFTDALGIDDFGG

SEQ ID NO: 2 mostra um domínio de transativação da planta ERF2 contendo um motivo de interação (sublinhado): NDSEDMLVYGLLK-DAFHFDTSSSDLSCLFDFPA

SEQ ID NO: 3 mostra um domínio de transativação da planta PTI4 contendo um motivo de interação (sublinhado) :CLTETWGDLPLKVDDSED!VMYGLLKDALSVGWSPFSFT AG

SEQ ID NO: 4 mostra um domínio de transativação da planta AtERFI contendo um motivo de interação (sublinhado): CFTESWGDLPL-KENDSEDMLVYGILNDAFHGG

SEQ ID NO; 5 mostra um domínio de transativação da planta ORCA2 contendo um motivo de interação (sublinhado): FNENCEEIISPNYA-SEDLSDIILTDIFKPQDNYEDE SEQ ID NO: 6 mostra um domínio de transativação da planta DREB1A contendo um motivo de interação (sublinhado): GFDMEETLVE-AIYTAEQSENAFYMHDEAMFEMFSLLANMAEGM

SEQ ID NO: 7 mostra um domínio de transativação da planta CBF1 contendo um motivo de interação (sublinhado): EQSEGAFYMDE-ETMFGMPTLLDNMAEG SEQ ID NO: 8 mostra um domínio de transativação da planta DOF1 contendo um motivo de interação (sublinhado): SAGKAVLD- DEDSFVWPAASFDMGACWAGAG FAD

SEQ ID NO: 9 mostra subdomínio II de um domínio de transativação VP16, o qual é o motivo de interação dentro da SEQ ID NO:1: DDFE-FEQMFTD

SEQ ID NO: 10 mostra um motivo de interação do domínio de transativação da plantaERF2: DAFFIFDTSSSD

SEQ ID NO: 11 mostra um motivo de interação do domínio de transativação da planta PTI4: DDSEDMVIYGLLKD

SEQ ID NO: 12 mostra um motivo de interação do domínio de transativação da planta AtERFI: ENDSEDMLV

SEQ ID NO: 13 mostra um motivo de interação do domínio de transativação da planta ORCA2: EDLSDIILTD

SEQ ID NO: 14 mostra um motivo de interação do domínio de transativação da planta DREB1A: ENAFYMHDEAMFEMP

SEQ ID NO: 15 mostra um motivo de interação do domínio de transativação da planta CBF1: DEETMFGMP

SEQ ID NO: 16 mostra um motivo de interação do domínio de transativação da planta DOF1: EDSFVWPAASFD SEQ ID NOs: 17 - 22 mostra as sequências do motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante ERF2. SEQ ID NOs: 23 - 28 mostra as sequências do motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante PTI4. SEQ ID NOs: 29 - 34 mostra as sequências do motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante AtERFI. SEQ ID NOs: 35 - 40 mostra as sequências do motivo de intera- ção do domínio de transativação da planta da variante ORCA2. SEQ ID NOs: 41 - 46 mostra as sequências do motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante DREB1A. SEQ ID NOs: 47 - 52 mostra as sequências do motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante CBF1. SEQ ID NOs: 53 - 58 mostra as sequências do motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante DOF1. SEQ ID NOs: 59 - 66 mostra os iniciadores usados para o cons-tructo do plamídeo, pHO - zBG - MEL1.

SEQ ID NO: 67 mostra uma sequência de polinucleotídeo do domínio de ligação ao DNA Z6: TGTGGTGGGAGAGGAGGGTGG SEQ ID NO: 68 mostra uma sequência repetida 8x tandem de um domínio de ligação ao Z6: GGTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGGAGTGTGGTGGGAGAGG AGGGTGGCTCTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGAGATGTGGTGGGAGAGG AGGGT GGT CTT GT GGT GGGAGAGGAGGGTGGGGAT GT GGTGGGAGAGG AGGGTGGCCTTGTGGTGGGAGAGGAGGGTGGAGGTGTGGTGGGAGAG GAGGGTGGCTTAAGCCGC SEQ ID NOs: 69 - 74 mostra os iniciadores e as sondas usadas em ensaios pat e pal HP. SEQ ID NOs: 75 - 78 mostra os iniciadores usados para a análise PCR de PTUs em tobaco. SEQ ID NO: 79 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa a partir de VP16 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: GGC AT GAC C CAT GAT CCT GT GT CTTAT GGAG C CTT GGAT GTT GAT GACTTT GAGTTT G AG CAGAT GTT CACAGAT GC ACT GG G C AT CGAT G A CTTTGGTGGA SEQ ID NO: 80 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v3) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa a partir de ERF2 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: AAT GACT CT GAGGAC AT GCT GGT GTAT GGTTT GCT CAAGGAT GCCTTT CACTTT GACACCTCCAGCT CAGACCT CTCCT GCCT CTTT GACTTC CCAGCC SEQ ID NO: 81 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v3) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa a partir de PTI4 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: TGCCTGACAGAAACTTGGGGAGACTTGCCTCTCAAGGTTGAT GACT CT GAGGACAT GGT GATCTAT GGT CT GTT GAAGGAT GCACT CT CAGT GGGGTGGTCCCCATTCTCTTTCACGGCTGGT SEQ ID NO:82 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v3) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa a partir de AtERFI a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: TGCTTCACGGAATCCTGGGGAGACCTTCCTTTGAAGGAGAAT GACT CT GAGGACAT GTT GGT GTACG GAATCCT CAAT GAT GCTTTT CAT GG

TGGC SEQ ID NO: 83 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v3) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa a partir de ORCA2 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: TT CAAT GAGAATT GT G AAGAAAT CAT CT CT CC AAACTACGC AT CAGAGGACTTGTCT GACAT CAT CTT GACGGACAT CTT CAAGGACCAAGAC AACTAT GAGGATGAG SEQ ID NO: 84 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v3) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa a partir de DREB1A a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: GGCTTT GACAT GGAAGAAACATT GGT GGAGGCCAT CTACACT GCT GAACAGAGCGAG AAT GCCTTCTACATGCAT GAT GAGGCAAT GTTT GA GAT GCCAT CT CTT CT GGCCAACAT GGCT GAGGGAAT G SEQ ID NO: 85 mostra uma sequência de nucteotídeo sintética (v3) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa a partir de CBF1 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: GAACAGT CAGAAGGTGCTTTCTAC AT GGAT GAAGAGACCATG TTT GGGAT GCCAACCCTT CT GGATAACAT GGCAGAGGGA SEQ ID NO: 86 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v3) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa a partir de DOF1 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: TCAGCTGGGAAGGCAGTCTTGGATGATGAGGACAGCTTTGTT T GGCCT GCT GGAT CCTTT GACAT GGGT GCCT GCTGGGCT GGAGCT GGCT TTGCTGAC SEQ ID NO:87 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v2) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa exemplar a partir de ERF2 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: AAT GACT CT GAGG ACAT GCT GGT GTAT GGTTTGCTCAAGGAT GATTT CCACTTT GAGACAATGTTCT CAGACCTGTCCT GCCTCTTT GACTT C CCAGCC SEQ ID NO: 88 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v2) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa exemplar a partir de PT14 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: T GCCT GAC AGAAACTT GGGGAGACTTGCCT CT C AAGGTT GAT G ACTTTGAGTTT GAGAT GAT GTT CAC AGATGCACT CTCAGTGGGGT GGT C CCCATTCTCTTTCACGGCTGGT SEQ ID NO: 89 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v2) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa exemplar a partir de AtER.F1 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: TG CTT CAC G G AAT C CTG GG G A GAC CTT C CTTT G AAG G AG AAT

GACTTTGAGTTT G AAAT GTT CACAGATTACGGAATCC TCAAT GAT GCTTTT CATGGTGGC SEQ 1D NO: 90 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v2) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa exemplar a partir de ORCA2 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: TT CAAT GAGAATT GTG AAGAAAT C AT CT CTCC AAACT ACGC AT C AGAG GACTTT GAT CTT G AG AT GTT GAC G GACAT CTT C AAG G AC CAAGAC AACTAT GAGGAT GAG SEQ ID NO: 91 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v2) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa exemplar a partir de DREBIAa qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: GGCTTTGACATGGAAGAAACATT GGTGGAGGCCAT CTACACT GCT G AAC AGAGCGAGGACTTT GAGTTT GAAGCAAT GTTCAT GG ATT CT CT T CT GGCCAACAT GGCT GAGGGAAT G SEQ ID NO: 92 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v2) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa exemplar a partir de CBF1 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: GAAGAGT CAGAAGGT GCTTT CTACAT GGAT GACTTT GAGTT C GAGACAATGTT CATGGACACCCTT CT GGATAACAT GGCAGAGGGA SEQ ID NO; 93 mostra uma sequência de nucleotídeo sintética (v2) que codifica um motivo de interação do domínio de transativação da planta nativa exemplar a partir de DOF1 a qual foi fundida aum dedo de zinco Z6 da proteína de ligação: T C AGCT GGGAAGGCAGT CTT GGAT GAT GAGGACTTT GAGTTT GAAGCCAT GTT C ACGGACAT GGGT GCCTGCT GGGCTGGAGCT GGCTTT G CTGAC SEQ ID NOs: 94 - 98 mostra os inciadores e as sondas usadas em ensaios gus e BYEEF HP, SEQ ID NO: 99 rnostra uma sequência repetida tandem tomada a partir da sequência de ligação consenso de genes induzíveis AVRBS3, e nomeadas ao dompinio de ligação a DNA UPA: TATATAAACTN N C CTT SEQ ID NO: 100 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta ERF2 (sublinhado): GMTH DPVS YGALDVDAFHFDTSSSDALGIDDFGG SEQ ID NO: 101 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta PTI4 (sublinhado): GMTHDPVSYGALDVDDSEDMVIYGLLKDALGIDDFGG SEQ ID NO: 102 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta AtERFI (sublinhado): GMTHDPVSYGALDVENDSEDMLVALGIDDFGG SEQ ID NO: 103 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta ORCA2 (sublinhado): GMTHDPVSYGALDVEDLSDIILTDALGIDDFGG SEQ ID NO: 104 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta DREB1A (sublinhado): G MTHDPVSYGALDVENAFYMHDEAMFEMPALGID D FG G SEQ ID NO: 105 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta CBF1 (sublinhado): GMTHDPVSYGALDVDEETMFGMPALGI DDFGG SEQ ID NO: 106 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta DOF1 (sublinhado): GMTHDPVSYGALDVEDSFVWPAASFDALGIDDFGG SEQ ID NO: 107 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transati-vação da planta da variante ERF2 (sublinhado): GMTHDPVSYGALDVDDFHFETMFSDALGIDDFGG SEQ ID NO: 108 mostra um domínio de transativação sintético exemplar adicional que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante ERF2 (sublinhado): NDSEDMLVYGLLKDDFHFETMFSDLSCLFDFPA SEQ ID NO: 109 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um variant PTI4 motivo de interação do domínio de transativação da planta(sublinhado): GMTHDPVSYGALDVDDFEFEMMFTDALGIDDFGG SEQ ID NO: 110 mostra um domínio de transativação sintético exemplar adicional que compreende um variant PTI4 motivo de interação do domínio de transativação da planta(sublinhado): CLTETWGDLPLKVDDFEFEMMFTDALSVGWSPFSFTAG SEQ ID NO: 111 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante AtERFI (sublinhado): GMTHDPVSYGALDVENDFEFEMFTDALGIDDFGG SEQ ID NO: 112 mostra um domínio de transativação sintético exemplar adicional que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante AtERFI (sublinhado): CFTESWGDLPLKENDFEFEMFTDYGILNDAFHGG SEQ ID NO: 113 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta variante ORCA2 (sublinhado): GMTHD PVSYGALDVEDFDLEMLTDALGIDDFGG SEQ ID NO: 114 mostra um domínio de transativação sintético exemplar adicional que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante ORCA2 (sublinhado): FNENCEEIISPNYASEDFDLEMLTDIFKDQDNYEDE SEQ ID NO: 115 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transati-vação da planta da variante DREB1A (sublinhado): GMTHDPVSYGALDVEDFEFEAMFMDALGIDDFGG SEQ ID NO: 116 mostra um domínio de transativação sintético exemplar adicional que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante DREB1A (sublinhado): GFDMEETLVEAIYTAEQSEDFEFEAMFMDSLLANMAEGM SEQ ID NO: 117 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transati-vação da planta da variante CBF1 (sublinhado): GMTHDPVSYGALDVDDFEFETMFMDALGIDDFGG SEQ ID NO: 118 mostra um domínio de transativação sintético exemplar adicional que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante CBF1 (sublinhado): EQSEGAFYMDDFEFETMFMDTLLDNMAEG SEQ ID NO: 119 mostra um domínio de transativação sintético exemplar que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante DOF1 (sublinhado): G MTHDPVSYGALDVEDFEFEAMFTDALGI DD FGG SEQ ID NO: 120 mostra um domínio de transativação sintético exemplar adicional que compreende um motivo de interação do domínio de transativação da planta da variante DOF1 (sublinhado): SAGKAVLDDEDFEFEAMFTDMGACWAGAGFAD SEQ ID NOs: 121 - 127 mostra as sequências do motivo de interação do domínio de transativação da planta. MODO(S) DE REALIZAÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO /. Visão das várias modalidades São descritos na presente invenção os novos domínios de transativação de plantas (TADs), motivos de interação TAD e as variantes sintéticas dos compostos anteriores que podem ser úteis como ativadores da transcrição, e que pode ser fundido em uma proteína de fusão ativadora transcricionaí sintética com um polipeptídeo de ligação de DNA para a ativa- ção transcricional de um gene de interesse. Os novos TADs particulares de plantas e motivos de interação TAD descritos na presente invenção têm sido isolados a partir de proteínas de plantas, ERF2; PTI4; AtERF 1; ORCA2; DREB1A; CBF1, e DOF1. Sintéticos de transcrição de proteínas de fusão que compreendem ativadores TAD planta nova e / ou interação motivo TAD, como na presente invenção descrito pode ser utilizado em modalidades particulares com a finalidade de aumentar (por exemplo, iniciar) a expressão do gene em uma variedade de células (por exemplo, células de levedura e células de plantas), e por virtualmente qualquer gene.

Os domínios de transativação são funcionalmente autônomos, isto é, um único TAD pode regular a transcrição quando fundido a um dos diversos modelos de domínios de ligação ao DNA heterólogos, e quando amarrados em diferentes posições de uma região promotora. Hall e Struhl (2002), supra. TADs são acreditadas para partilhar a homologia da sequência primária e pouco adotam uma estrutura definida somente após ligação a um alvo. Sigler (1988), supra. Embora os resíduos ácidos e hidrofóbicos, dentro dos TADs pensa-se que é importante (vide, por exemplo, Cress e Tri-ezenberg (1991), supra), a contribuição dos resíduos individuais de atividade acredita-se ser reduzida. Hall e Struhl (2002), supra. É difícil prever a priori se um motivo de interação domínio da transativação sintética irá funcionar de modo a iniciar ou aumentar a expressão em uma célula de planta. Esta imprevisibílidade pode ser pelo menos em ptécnica, uma consequência do fato de que alguns são TADs transativa-dores muito fortes que podem resultar em "silenciando" (por exemplo, por meio da titulação de componentes da maquinaria de transcrição celular) como uma função tanto da sua concentração intracelular quanto a força dos seus TADs. Vide, por exemplo, Patente U.S, 6.271.341 (mutantes VP16 TADs com regulação de genes gradual).

Descrito na presente invenção é o inesperado fato de descobrir que determinados novos motivos de interação TADs e TAD de plantas compartilham a homologia com o TAD VP16 conferindo diferentes níveis de regulação sobre genes sob seu controle. Utilizando uma estratégia generalizá- vel para "troca" de TADs sintéticos com a finalidade de produzir as proteínas de fusão de transcrição ativadores, verificou-se surpreendentemente que os novos TADs e os motivos de interação TAD isolados de PTI4, DREB1A, ERF2 e CBF1 são capazes de proporcionar um maior aumento da transcrição do gene em uma planta célula que é fornecida por VP16, que é reconhecido na técnica como sendo um transativador muito bom. Constatou-se também que novos motivos de interação TADs e TAD AtERFI, ORCA2 e DOF1 proporcionam os aumentos menores na transcrição do yene É também descrito neste documento a descoberta inesperada de que variantes TADs e motivos de interação TAD que compreende poucas e pequenas alterações de aminoácidos relativamente à sequência nativa podem proporcionar um aumento de mais ou ajuste das propriedades reguladoras do gene exibidos pelo TAD nativo. Por exemplo, verificou-se surpreendentemente que a variante ERF2 CBF1 e motivos de interação TAD conduzem a transcrição significativamente maior de um gene sob o seu controle do que o motivo de interação nativo correspondente em plantas. II. Abreviaturas chs gene chalcona sintase HAS local de alta afinidade HP sonda de hidrólise HSV Vérus da Herpes Simplex MS Murashige e Skoog PNPG p - nitrofenil - alfa - D - glucopiranosídeo PTU unidade fabril transcricional SSC - ciírato de sódio de solução salina TAD Domínio de transativação TBP proteína de ligação a TATA T - DNA DNA de transferência TFIIB Transcrição do fator IIB TFilH Transcrição do fator IIH

Tj indução de tumores (plasmídeos derivados de A. tumefaciens) UAS sequência de ativação a montante VP16 Proteína Viriona de Herpes Simplex 16 Ui. Condições De forma a facilitar a análise de várias modalidades da presente invenção, as explicações que se seguem de termos específicos são fornecidas: Endógeno: Como usado na presente invenção, o termo "endó-geno" refere-se a substâncias (por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos e polipeptídeos) que se originam a partir de dentro de um determinado organismo, célula ou tecido. Por exemplo, um polipeptídeo "endógeno" expresso em uma célula de planta pode referir-se a um polipeptídeo que é norrnai-mente expressa em células do mesmo tipo a partir de plantas modificadas não geneticamente da mesma espécie. Da mesma forma, um ácido nucleico "endógeno" composto de uma célula vegetal pode referir-se a um ácido nucleico (por exemplo, DNA genômíco), que é norrnalmente encontrado nas células do mesmo tipo a partir de plantas não geneticamente manipuladas da mesma espécie.

Expressão: Conforme usado na presente invenção, "expressão" de uma sequência de codificação (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo pelo qua! a informação codificada de uma unidade de transcrição de ácido nucleico (incluindo DNA, por exemplo, DNA genômíco ou DNAc) é convertido em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula (por exemplo, uma proteína). A expressão do gene podem ser influenciados por sinais externos, como por exemplo, a exposição de uma célula, tecido ou organismo de um agente que aumenta ou diminui a expressão de um gene compreendido no seu interior. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer parte do percurso a partir do DNA para o RNA e a proteína. A regulação da expressão de genes ocorre, por exemplo, por meio de controles que atuam sobre a transcrição, a tradução, o transporte e processamento de RNA, a degradação de moléculas intermediárias, como mRNA, ou por meio de ativação, desativação, comparti-mentalização, ou a degradação das moléculas de proteínas específicas, depois de terem sido feitas, ou por meio das combinações de quaisquer dos anteriores. A expressão do gene pode ser medida ao nível do ARN, ou o nível de proteína por meio dos métodos conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT - PCR, Western Blot, e in vitro , in situ, ou ensaio (s ) da atividade da proteína in vivo.

Aumento da expressão: Como usado na presente invenção, o "aumento de expressão" refere-se a iniciação da expressão, bem como a um aumento quantitativo da quantidade de um produto de expressão produzido a partir de um modelo de constructo. Em algumas modalidades, um polipep-tídeo que compreende um TAD pode ser usado para "aumentar a expressão" a partir de um ácido nucleico. Em tais modalidades, o aumento na expressão pode ser determinada por meio da comparação com a quantidade de produto produzida na expressão de um controle (por exemplo, a partir do constructo, na ausência da proteína que compreende o domínio de transati-vação de planta).

Proteína de fusão: Como usado na presente invenção, o termo "proteína de fusão" refere-se a uma molécula que compreende pelo menos dois poiipeptídeos ligados de maneira operacional. Em determinados exemplos, os dois poiipeptídeos ligados de maneira operacional pode ser normalmente expressa como parte de produtos de genes diferentes (por exemplo, em organismos diferentes). Em outros exemplos, os pelo menos dois poiipeptídeos ligados de maneira operacional podem ser derivados de poli-peptídeos normalmente expressos como parte de produtos de genes diferentes. Os poiipeptídeos ligados de maneira operacional presentes em uma proteína de fusão na presente invenção descrita normalmente interagem com pelo menos uma proteína ou ácido nucleico alvo em uma célula em que a proteína de fusão é para ser expresso. Por exemplo, um polipeptídeo operativamente ligado pode interagir com um ou mais fator (es) de transcrição ou elemento (s) proteico (s) da maquinaria de transcrição celular, ou pode interagir com um polinucleotídeo específico ou elemento estrutural de um ácido nucleico.

Heteróíogo: Como usado na presente invenção, o termo "heteró-logo" refere-se a substâncias (por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos e polipeptídeos) que não se originam a partir de dentro de um determinado organismo, célula, ou tecido. Por exemplo, um polipeptídeo "heterólogo" expresso em uma célula de planta pode referir-se a um polipeptídeo que não é normalmente expresso em células do mesmo tipo a partir de plantas não geneticamente manipuladas da mesma espécie (por exemplo, um polipeptídeo que é expresso em células de diferentes do mesmo organismo ou de células de um organismo diferente).

Isolado: Um componente de "isolado" biológico (tal como um á-cido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido para além de, ou purificado longe de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre de maneira natural (por exemplo, outro cromossómica e DNA extra - cromossómico e RNA e proteínas), enquanto que de uma alteração química ou funcionais no componente (por e-xemplo, um ácido nucleico pode ser isolado a partir de um cromossoma por quebrar as ligações químicas de ligação do ácido nucleico ao restante do DNA nos cromossomas) . As moléculas de ácidos nucleicos e proteínas que têm sido "isoladas" pode incluir as moléculas de ácidos nucleicos e proteínas purificadas por meio dos métodos de purificação convencionais. O termo abrange ácidos nucleicos e proteínas, preparados por meio da expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como moléculas de ácidos nucleicos, proteínas e peptídeos quimicamente sintetizados.

Molécula de ácido nucleico: Como usado na presente invenção, o termo "molécula de ácido nucleico" pode referir-se a uma forma polimérica de nucleotídeos, o que pode incluir tanto os filamentos sentido e anti - sentido de RNA, DNAc, DNA genômico, formas sintéticas e polímeros mistos e do acima. Um nucleotídeo pode referir-se a um ribonucleotídeo, desoxirribo-nucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. A "molécula de ácido nucleico", tal como na presente invenção usado é sinônimo de "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". Uma molécula de ácido nucleico que é geralmente pelo menos de 10 bases de comprimento, a menos que especificado de outra forma. O termo inclui formas de filamento simples e dupo de DNA. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer um dos ambos nucleotídeos de ocorrência natural quanto os modificados ligados entre si aos quais ocorrem de maneira natural e / ou as ligações nucleotidi-cas que não ocorrem de maneira natural.

Uma molécula "exógena" é uma molécula que não é nativa do sistema especificado (por exemplo, um germoplasma, variedade, variedade de elite, e / ou planta) com respeito à sequência de nucleotídeos e / ou a localização genômica de um polinucleotídeo, e com respeito a sequência de aminoácidos e / ou a localização celular de um polipeptídeo. Em modalidades, os polinucleotídeos exógenos ou heterólogas ou polipeptídeos podem ser moléculas que tenham sido artificialmente fornecidas a um sistema biológico (por exemplo, uma célula vegetal, um gene de planta, uma espécie particular da planta ou variedade, e / ou um cromossoma da planta), e não são nativos para esse sistema particular biológicas. Deste modo, a designação de um ácido nucleico tal como "exógeno" pode indicar que o ácido nu-cleico que se originou a partir de uma fonte diferente de uma fonte que ocorre de maneira natural, ou pode indicar que o ácido nucleico que tem uma configuração não natural, localização genética, ou arranjo de elementos.

Em contraste, por exemplo, um ácido "nativo" ou "endógeno" nucleico é um ácido nucleico (por exemplo, um gene) que não contém um elemento de ácido nucleico diferentes dos normalmente presente no cromossoma ou outro material genético no qual a nucleico ácido é normalmente encontrada na natureza. Um transcrito do gene endógeno é codificado por meio de uma sequência nucleotídica no seu local natural cromossômico, e não é artificialmente fornecido à célula.

As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimi-camente ou bioquimicamente ou podem conter bases de nucleotídeos não naturais ou derivatizadas, tal como será prontamente apreciado por aqueles que são versados na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, rótulos, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem de maneira natural com um análogo, modificações internucleotídicas (por e-xemplo, ligações sem carga; por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriéste-res, fosforamidatos, carbamatos, etc; ligações carregadas ; por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc; porções pendentes: por exemplo, peptí-deos, intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc; quelantes; alqui-ladores; e ligações modificadas: por exemplo, alfa - ácidos nucleicos anomé-ricos, etc) . O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topoíógica, inclusive de cadeia simples, de cadeia dupla, as conformações parcialmente frente e verso, triplexadas, grampeadas, circulares e trancadas.

Algumas modalidades empregam uma forma particular de ácido nucleico, um oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos são relativamente curtos de moléculas de ácido nucleico, que compreende tipicamente 50 nucleoba-ses ou menos (embora alguns oligonucleotídeos podem compreender mais do que 50). Um oligonucleotídeo pode ser formado por divagem (por exemplo, a digestão de restrição) de um ácido nucleico maior, que compreende a sequência de oligonucleotídeos, ou pode ser sintetizada químicamente, de uma maneira específica da sequência, a partir de fosforamiditos de nucleó-sidos individuais.

Um oligonucleotídeo pode ser utilizado como uma sequência de sonda para detectar uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos específica. De acordo com o exposto, uma sonda de oligonucleotídeos pode ser preparada sinteticamente ou por meio da clonagem. Os vetores de clonagem adequados são conhecidos dos peritos na técnica Uma sonda de oligonucleotídeo pode ser marcado ou não marcado. Uma grande variedade de técnicas existentes para a marcação de moléculas de ácido nucleico, incluindo, por exemplo e sem limitação, marcação radioativa de tradução nick; iniciação aleatória, e cauda com terminal deoxytransfe-rase, em que os nucleotídeos marcados são empregues, por exemplo, com 32P radioativos. Outros rótulos que podem ser usados incluem, por exemplo e sem limitação: fluoróforos, enzimas, substratos de enzimas, cofatores de enzimas, inibidores de enzimas e. Em alternativa, a utilização de uma etiqueta que proporciona um sinal detetável, por si só ou em conjunto com outros agentes reativos, podem ser substituídos por ligandos de receptores aos quais se ligam, em que os receptores são marcados (por exemplo, as etique- tas acima indicado) para proporcionam sinais detetáveis, quer por si próprios, ou em conjunto com outros reagentes. Vide , por exemplo, Leary et ai. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 80:4045 - 9.

Algumas modalidades da presente invenção incluem um polinu-cleotídeo que é "de uma maneira específica hibridado" ou "de uma maneira específica complementar" a uma sequência de nucleotídeos alvo. "De uma maneira específica hibridizável" e "complementar de uma maneira específica" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade tal que a ligação estável e específica ocorre entre o polínucleotídeo e a molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos alvo em particular. Uma molécula de ácido nucleico não precisa de ser 100% complementar a sua sequência alvo para ser de uma maneira específica hibridá-vel. Uma molécula de ácido nucleico é de uma maneira específica hibridar quando existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do ácido nucleico para as sequências não - alvo em condições em que a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições rigorosas de hibridação.

As condições de hibridação resulta em graus específicos de rigor irão variar em função da natureza do método de hibridação de escolha e da composição e do comprimento das sequências de ácidos nucleicos que hi-bridam. Geralmente, a temperatura de hibridação e a força iónica (especialmente Na + e / ou Mg + + de concentração) do tampão de hibridação irá contribuir para o rigor da hibridação, mas também influenciam lavar vezes rigor. Os cálculos relativos às condições de hibridação necessário para atingir graus de rigor particulares são conhecidos dos vulgares peritos na técnica, e são discutidos, por exemplo, em Sambrook et ai.. (Ed.), Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual, 2a ed, vol.. 1 - 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11, e Hames e Higgins (eds.), Nucleic Acid Hybridization. IRL Press, Oxford, 1985. Instrução mais detalhada e orientação no que diz respeito à hibridação de ácidos nucleicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen. "Visão geral dos princípios da hibridação e da estratégia de ensaios com sondas de ácidos nuclei- cos", em Técnicas de Laboratório em Biochemistry and Molecular Biology -hibridação com Sondas de Ácido Nucleico, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993 e Ausubel et al., Eds, protocolos atuais em Biologia Molecular, capítulo 2, Greene Publishing e Wiley - interscience, NY, 1995...

Como usado na presente invenção, o termo "condições rigorosas" abrange as condições em que a hibridização irá ocorrer apenas se houver menos do que 25% incompatibilidade entre a molécula alvo e hibridização de DNA. "Condições rigorosas" inclui os níveis mais particulares de rigor. Dessa maneira, tal como usado na presente invenção, "moderadas" es-tringência condições são aquelas sob as quais as moléculas com mais de 25% mismatch sequência não irá hibridar; condições de "rigor médio" são aqueles em que as moléculas com mais de 15% mismatch não irá hibridar e condições de "severidade elevada" são aqueles em que as sequências com mais de desfasamento de 10% não irá hibridar. Condições de "severidade elevada" são aqueles em que as sequências com mais de 6% mismatch não irá hibridar.

Em modalidades particulares, as condições rigorosas são hibridação durante 1 hora a 65°C em um tampão de hibridação PerfetHyb ™ plus (Sigma - Aldrich), seguido por 40 minutos lavagens sequenciais de 65°C em 0,1 X de SDS SSC/0.1%.

De maneira operacional ligadas sequências de nucleotídeos: Uma primeira sequência de nucleotídeos está "de maneira operacional ligado" ou com a uma segunda sequência nucleotídica quando a primeira sequência de nucleotídeos está em uma relação funcional com a segunda sequência de nucleotídeos. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afeta a transcrição ou a expressão da sequência de codificação Quando produzidos de forma re-combinante, de maneira operacional ligadas sequências de nucleotídeos são geralmente contíguas e, quando necessário para unir duas regiões codifican-tes de proteínas, no mesmo enquadramento de leitura. No entanto, as sequências de nucleotídeos não precisa ser contígua a ser operativamente ligada. O termo "de maneira operacional ligado", quando utilizado em referência a uma sequência genética reguladora e uma sequência de codificação, quer dizer que a sequência reguladora se afeta a expressão da sequência de codificação iigada. "Sequências reguladoras", ou "elementos de controle," referem-se a sequências de nucleotídeos que influenciam o tempo ea nível / quantidade de transcrição, processamento de RNA ou de estabilidade, ou a tradução da sequência codífícante associada. As sequências reguladoras convencionais podem incluir as regiões 5 ' não traduzidas; promotores; sequências líder de tradução, intrões, potenciadores, haste - laço estruturas; sequências de ligação do repressor, sequências de terminação, sequências de reconhecimento de poliadenilação, etc particulares sequências reguladoras podem estar localizadas a montante e / ou a jusante de uma sequência de codificação operativamente ligada ao mesmo. Além disso, determinadas sequências reguladoras operativamente ligadas a uma sequência codificadora pode estar localizado na cadeia complementar associada de uma molécula de ácido nucleico de cadeia dupla. Os elementos que podem ser "de maneira operacional ligadas" a uma sequência de codificação não se limitam aos promotores ou outras sequências reguladoras convencionais. Por exemplo, em algumas modalidades, o domínio de ligação a DNA de uma proteína transativadora pode ltgar-se a uma sequência de nucleotídeos que é proximal a um promotor ou outra região reguladora, de modo que a proteína transativadora pode interagir com o promotor ou outra região reguladora, ou um ligado à mesma molécula (por exemplo, um fator de transcrição) para afetar a transcrição. Em tais exemplos, a sequência de nucleotídeos para a qual se liga a proteína transativadora através do seu domínio de ligação a DNA está "operativamente ligada" à sequência de codificação sob o controle do promotor ou outra sequência reguladora.

Os polipeptídeos operativamente ligados: Tal como usado na presente invenção em relação a polipeptídeos, o termo "de maneira operacional ligado" refere-se a, pelo menos, dois polipeptídeos que são ligados em uma única molécula (por exemplo, uma proteína de fusão), e de tal maneira que cada polipeptídeo pode servir o seu destina função. Tipicamente, as, pelo menos, dois polipeptídeos são ligados covalentemente através de ligações peptídicas. Uma proteína de fusão que compreende polipeptídeos operativamente ligados podem ser produzidos por técnicas de DNA recom-binante. Por exemplo, uma molécula de DNA que codifica um primeiro poli-peptídeo pode ser ligado a outra molécula de DNA que codifica um segundo polipeptídeo, e a molécula de DNA resultante híbrido pode ser expressa em uma célula hospedeira com a finalidade de produzir uma proteína de fusão que compreende os primeiro e segundo polipeptídeos. Nos exemplos particulares, as duas moléculas de DNA podem ser ligados um ao outro na direção 5 'para 3’ de orientação, de tal forma que, após a ligação, o quadro de translação dos polipeptídeos codificados não é alterada {isto é, as moléculas de DNA são ligadas uma à outra em estrutura).

Promotor: Como usado na presente invenção, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcrição, e que podem estar envolvidos no reconhecimento e ligação da RNA polimerase e outras proteínas para efetuar a transcrição. Um promotor pode ser operativamente ligado a uma sequência de codificação para a expressão em uma célula, ou a um promotor pode ser operativamente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de sinal que pode ser operativamente ligado a uma sequência de codificação para a expressão em uma célula. Um "promotor vegetal" pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em uma célula vegetal.

Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem os promotores que iniciam a transcrição preferenciaimente em determinados tecidos, por exemplo e sem limitação, folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueídos, ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como "preferida por tecido." Os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são referidos como "tecido - específicos." A "célula de tipo específico" promotor de transcrição efeitos principalmente em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo e sem limitação, em células vasculares em raízes ou folhas. Exemplificativos Os promotores específicos de tecido ou de tecido preferidos incluem, mas não estão limitados a: Um promotor root - preferido, tal como o gene da faseolina, um promotor específico de folha e induzida pela luz tal como o da cabina ou rubisco, um promotor específico das anteras, tais como a de LAT52, um promotor específico do pólen tais como a de Zm13, e um promotor de micrósporo preferido, como a que a partir de APG.

Um promotor "induzível" pode ser um promotor que pode estar sob controle ambiental. Ver Ward et aí. (1993) Plant Mol. Biol, Biol. 22:361 -366. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição de promotores induziveis incluem, por exemplo e sem limitação, condições a-naeróbicas e a presença de luz. Com um promotor indutivel, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Promotores indutíveis e xemplares incluem, mas não estão limitados a: Os promotores do sistema de ACEI que responde ao cobre; In2 gene do milho que responde a benzenos sulfonamida fitoprotetores herbicidas; Tet repressor de Tn10, e o promotor indutivel de um gene da hormona esteroide, a atividade de transcrição um dos quais pode ser induzida por uma hormona glucocorticosteroide (Schena et ai. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88:0421).

Tecido específico, preferível em tecidos, tipo de célula específico, e promotores induziveis constituem a classe de " promotores não - constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor que pode ser ativa na maioria das condições ambientais. Exemplos de promotores constitutivos incluem, mas não estão limitados a: Os promotores de vírus de plantas, tais como o promotor 35S do CaMV, os promotores dos genes de atina do arroz, os promotores de ubiquitina; pEMU; MAS, promotor de histona H3 milho, e o promotor de ALS, Xba1 / Ncol fragmento 5 'do gene de Brassica napus ALS3 estrutural (ou urna semelhança de sequência de nucleotídeos para o referido fragmento Xba1 / Ncol) (International PT Publication No. WO 96 / 30530).

Qualquer um dos promotores constitutivos precedentes e não constitutivos podem ser utilizados em algumas modalidades da presente invenção. Por exemplo, um gene a ser regulado por meio da atividade de uma proteína de fusão ativadora transcricional sintético pode ser proporcionado (por exemplo, em uma célula hospedeira), em que o gene está de maneira operacional ligado a um promotor.

Identidade de sequência: A "identidade de sequência" ou termo "identidade", tal como usado na presente invenção no contexto de dois ácidos nucleícos ou de sequências de polipeptídeos, pode referir-se que os resíduos das duas sequências que são iguais quando alinhados para correspondência máxima sobre uma comparação especificada.

Como usado na presente invenção, a "porcentagem de identidade de sequência" termo pode referir-se o valor determinado por comparação de duas sequências optimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácidos nucleícos e sequências de aminoácidos) ao longo de uma janela de comparação, em que a porção da sequência na comparação janela pode compreender adições ou deleções (isto é, intervalos) comparativamente com a sequência de referência (que não inclui adições ou deleções) para alinhamento óptimo das duas sequências. A porcentagem é calculada através da determinação do número de posições em que o resíduo de ácido nucleotí-deo idênticos ou amino ocorre em ambas as sequências, para originar o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 com a finalidade de produzir a porcentagem de identidade de sequência. Métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento encontram-se descritos em, por exemplo: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Matemática. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. Bi-ol. 48:443; Pearson e Lipman, Proc (1988). Natl. Acad. Sei. EUA 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237 - 44; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151 - 3; Corpet et ai. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 - 90; Huang et ai. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155 - 65; Pearson et ai. (1994) Mol Métodos. Biol. 24:307 - 31; Tatiana et ai. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247 -50. Uma análise detalhada dos métodos de alinhamento de sequências e os cálculos de homologia podem ser encontrados em, por exemplo, Altschul et ai. (1990) J. Mol. Biol. Biol. 215:403 - 10. O Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) Ferramenta de Busca Básica do Local de alinhamento (BLAST ™;. Altschul et ai (1990)) está disponível a partir de diversas fontes, incluindo o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como para determinar a identidade de sequência usando este programa está disponível na Internet sob a "ajuda" para BL4ST ™. Para comparações de sequências de ácidos nucleicos, o " sequências de Blast 2 " função do programa BLAST ™ (Blastn) podem ser empregues utilizando os parâmetros por defeito. As sequências de ácidos nucleicos com maior semelhança com as sequências de referência para mostrar o aumento percentual de identidade, quando avaliados por meio deste método.

Tal como usado na presente invenção no que diz respeito a sequências de nudeotídeos, o termo "substancialmente idêntico" pode referir-se a sequências que têm mais de 85% idênticos. Por exemplo, uma sequência de nudeotídeos substancialmente idêntica pode ser de pelo menos 85,5%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%; pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 99,5% idêntica à sequência de referência.

Substituição conservadora: Como usado na presente invenção, a "substituição conservadora" refere-se a uma substituição em que um resíduo de aminoácido é substituído por meio de outro amínoácido da mesma classe. A substituição não conservadora de aminoácidos é aquele em que os resíduos não caem na mesma categoria, por exemplo, a substituição de um aminoácido básico para um ácido ou neutro não polar amíno. Classes de aminoácidos que podem ser definidos com a finalidade de realizar uma substituição conservadora são conhecidos na técnica Em algumas modalidades, uma substituição conservadora inclui a substituição de um aminoácido alifático primeiro para um segundo ácido alifático, diferente de amino. Por exemplo, se um primeiro aminoácido é um dos Gly; Ala; Pro; Ile; Leu; Vai, e Met, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de entre Gly, Ala; Pro; Ile; Leu; Vai, e Met. Em exemplos particulares, se um primeiro aminoácido é um dos Gly; Ala; Pro; Ile; Leu, e Vai, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de entre Gly, Ala; Pro; Ile; Leu e Vai. Em exemplos particulares que envolvem a substituição de ácidos aminados alifáticos hidrofóbicas, se um primeiro aminoácido é um de Ala, Pro; Ile; Leu, e Vai, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de entre Ala, Pro ; Ile; Leu, e Vai.

Em algumas modalidades, uma substituição conservadora inclui a substituição de um primeiro aminoácido aromático por um segundo, diferente aminoácido aromático. Por exemplo, se um primeiro aminoácido é um de His; Phe; Trp e Tyr, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de His; Phe; Trp e Tyr. Em exemplos particulares que envolvem a substituição de aminoácidos aromáticos não carregados, se um primeiro aminoácido é um dos Phe; Trp e Tyr, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de entre Phe, Trp e Tyr.

Em algumas modalidades, uma substituição conservadora inclui a substituição de um primeiro aminoácido hidrofóbico para um segundo, diferente aminoácido hidrofóbico. Por exemplo, se um primeiro aminoácido é um de Ala, Vai, Ile; Leu; Met; Phe, Tyr e Trp, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de entre Ala, Vai, Ile; Leu; Met; Phe, Tyr e Trp. Em exemplos particulares que envolvem a substituição de não - aromáticos, aminoácidos hidrófobos, se um primeiro aminoácido é um de Ala, Vai, Ile; Leu e Met, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado a partir de Ala; Vai; Ile; Leu e Met.

Em algumas modalidades, uma substituição conservadora inclui a substituição de um primeiro aminoácido polar para um segundo, diferente amínoácido polar. Por exemplo, se um primeiro aminoácido é um de Ser, Tre; Asn; Gin; Cys, Gly; Pro; Arg; His; Lys; Asp e Glu, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de Ser, Tre; Asn; Gin; Cys; Gly; Pro; Arg; His; Lys; Asp e Glu. Em e-xemplos particulares que envolvem a substituição de não carregadas, ami-noácidos polares, se um primeiro aminoácido é um de Ser, Tre; Asn; Gin; Cys; Gly e Pro, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de Ser, Tre; Asn; Gin; Cys; Gly e Pro. Em exemplos particulares que envolvem a substituição de carregadas, aminoácidos polares, se um primeiro aminoácido é um de His; Arg; Lys; Asp e Glu, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de His; Arg; Lys; Asp e Glu. Em outros exemplos que envolvem a substituição deaminoácidos polares carregados se um primeiro aminoácido é um de Arg; Lys; Asp e Glu, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de entre Arg, Lys; Asp e Glu. Em exemplos particulares que envolvem a substituição de carregados positivamente (básicos), aminoácidos polares, se um primeiro aminoácido é um de His; Arg e Lys, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de His; Arg e Lys. Em outros exemplos que envolvem a substituição de carga positiva, aminoácidos polares, se um primeiro aminoácido é Arg ou Lys, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de outro aminoácido a de Arg e Lys. Em exemplos particulares que envolvem a substituição de carga negativa (ácidos), aminoácidos polares, se um primeiro a-minoácído é Asp ou Glu, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de outro aminoácido a de Asp e Glu. Em exemplos particulares que envolvem a substituição de aminoácidos polares carregados posítivamente do que outros aminoácidos polares, se um primeiro aminoácido é um de Ser, Tre; Asn; Gin; Cys; Gly; Pro; Asp e Glu, o primeiro amínoácido pode ser substituído por meio de um segundo, de aminoácido diferente selecionado de entre Ser, Tre; Asn; Gin; Cys; Gly; Pro; Asp e Glu. Em exemplos particulares que envolvem a substituição de aminoácidos polares não carregados negativamente outros aminoácidos polares, se um primeiro aminoácido é um de Ser; Thr; Asn; Gin; Cys; Gly; Pro; Arg, Sua, e Lys: o primeiro aminoácido podem ser substituídos por um segundo aminoácido diferente selecionado de entre Ser, Tre; Asn; Gin; Cys; Gly; Pro; Arg, Sua, e Lys.

Em algumas modalidades, uma substituição conservadora inclui a substituição de um ácido eletricamente neutra primeiro amino por um segundo, ácido eletricamente neutro diferente de amino. Por exemplo, se um primeiro aminoácido é um dos Gly; Ser, Tre; Cys; Asn; Gin e Tir, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de entre Gly, Ser, Tre; Cys; Asn; Gin, e Tyr.

Em algumas modalidades, uma substituição conservadora inclui a substituição de um primeiro aminoácido não - polar por um segundo, o ácido não - polar diferente de amino. Por exemplo, se um primeiro aminoácido é um de Ala, Vai, Leu, lie; Phe; Trp; Pro, e Met, o primeiro aminoácido pode ser substituído por meio de um segundo aminoácido diferente selecionado de entre Ala, Vai, Leu; lie; Phe; Trp; Pro, e Met.

Em muitos exemplos, a seleção de um segundo aminoácido especial para ser usado em uma substituição conservadora para substituir um primeiro aminoácido pode ser feita de modo a maximizar o número das classes precedentes em que os primeiro e segundo ácidos aminados tanto pertencem. Dessa maneira, se o primeiro aminoácido é Ser (um polar, não -aromático, e de aminoácido eletricamente neutra), o segundo aminoácido pode ser um outro aminoácido polar (por exemplo, Thr; Asn; Gin; Cys; Gly; Pro; Arg ; His; Lys; Asp, ou Glu); outro ácido não - amino aromático (ou seja, Thr; Asn; Gin; Cys; Gly; Pro; Arg; His; Lys; Asp; Glu; Ala; lie; Leu; Vai; ou Met), ou um outro ácido eletricamente neutro amino (isto é, Gly; Thr; Cys; Asn; Gin, ou Tyr). No entanto, pode ser preferível que o segundo aminoácido, neste caso, ser um dos Thr; Asn; Gin; Cys, e Gly, pois estes aminoácidos compartilham todas as classificações de acordo com a polaridade, aro-maticidade e neutralidade elétrica. Os critérios adicionais que podem, opcionalmente, ser utilizados para selecionar um segundo aminoácido especial para ser usado em uma substituição conservadora são conhecidos na técní- ca. Por exemplo, quando Thr; Asn; Gin; Cys; Gly e estão disponíveis para serem utilizados em uma substituição conservadora de Ser, Cis pode ser eliminado a partir de seleção, a fim de evitar a formação de ligações cruzadas indesejáveis e / ou ligações de dissulfureto. Da mesma forma, Gly pode ser eliminado da seleção, porque falta uma cadeia lateral de alquila. Neste caso, Thr podem ser selecionados, por exemplo, a fim de manter a funcionalidade de um grupo hidroxila da cadeia lateral. A seleção do segundo amino-ácido especial para ser usado em uma substituição conservadora é, em última análise, no entanto, dentro do critério daquele que é versado na na técnica. O termo "derivado", tal como usado na presente invenção em relação à sequência de amínoácídos significa a modificação química de uma proteína de fusão da presente invenção.

Transativação proteína; Como usado na presente invenção, a "proteína de transativação" (ou "transativador" ou "proteína ativadora trans-cricional" ou "proteína de fusão ativador transcricional") refere-se a um poli-peptídeo que se liga a um elemento de ácido nucleico e inicia ou aumenta a transcrição de um polinucleotídeo (por exemplo, um gene de interesse) que está de maneira operacional ligada ao elemento de ácido nucleico. Proteínas de transativação que são nativas para determinados organismos incluem, por exemplo e sem limitação, dedo de zinco de ligação a DNA de proteínas; domínio de ligação de DNA UPA; GALA, e TAL. As modalidades particulares da presente invenção incluem proteínas sintéticas transativadores de fusão que compreende pelo menos um domínio de ligação a DNA de uma proteína de ligação ao DNA e um motivo de interação de um domínio de transativação de planta.

Ligação específica; Tal como usado na presente invenção no que diz respeito a poiipeptídeos e os domínios de proteína, a "ligação específica" refere-se a uma interação suficientemente forte entre o domínio de polipeptídeo ou proteína e do (s) seu (s) parceiro (s) de ligação (por exemplo, polipeptídeo (s) que compreende um amino específico sequência de ácido, ou ácido (s) nucleico (s) que compreende (m) uma sequência núcleo- tídica específica) de tal forma que a ligação estável e específica ocorre com o (s) parceiro (s) de ligação (s), mas não com outras moléculas que não possuem uma sequência especifica de aminoácidos ou uma sequência de nucleotídeos específica que é reconhecido pelo o polipeptídeo de uma maneira específica vinculativo. Ligação estável e específica pode ser determinada por meio das técnicas de rotina aqueles que são versdos na técnica, tais como ensaios de "pulldown" (por exemplo, pulldowns GST), leveduras híbridas 2, ensaios de levedura híbrida - 3 , ensaios de ELISA, etc. Moléculas que têm o atributo de "ligação específica” umas com as outras pode-se dizer que "se ligam de uma maneira específica" umas as outras.

Transformação: Como usado na presente invenção, o termo "transformação" refere-se à transferência de uma ou mais moléculas de ácido (s) nucleico (s) para uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucleico transferido para dentro da célula quando a molécula de ácido nucleico se torna estáveímente replicado pela célula, ou por incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular, ou pela re-plicação episomal. Como usado na presente invenção, o termo "transformação" engloba todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico podem ser introduzidas em tal célula. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a: a transfeção com vetores viraís; transformação com vetores plasmídicos, eletroporação (Fromm et a!. (1986) Nature 319:791 - 3.); Lipo-feção (Felgner et al. (1987) Proc Natl Acad Sei EUA 84:7413 - 7); microinje-ção (Mueller et al. (1978.) Cell 15:579 - 85); mediada por Agrobaterium de transferência (Fraley et al. (1983.) Proc Natl Acad Sei EUA 80: 4803 - 7); absorção direta de DNA, e bombardeamento de microprojéteis (Klein et al. (1987.) Nature 327:70).

Transgene: Uma sequência de ácido nucleico exógena. Em alguns exemplos, um transgene pode ser uma sequência que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional. Em alguns exemplos, um transgene pode codificar uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional que compreende pelo menos um TAD planta e / ou pelo menos um Variante TAD Em alguns exemplos, um transgene pode codificar um gene de interesse (por exemplo, um gene repórter, um gene que confere resistência a herbicida, e um gene que contribui para uma caraterístíca de plantas agronomicamente importantes). Nos exemplos destes e de outros, um transgene pode incluir uma ou mais sequências reguladoras (por exemplo, um promotor) de maneira operacional ligada a uma sequência de codificação do transgene. Para os fins desta descrição, o termo "transgênico", quando usado para se referir a um organismo (por exemplo, uma planta), refere-se a um organismo que compreende a sequência de ácido nucleico exógeno. Em alguns exemplos, o organismo que compreende a sequência de ácido nucleico exógeno pode ser um organismo para o qual a sequência de ácido nucleico que foi introduzido através de técnicas de transformação molecular. Em outros exemplos, o organismo que compreende a sequência de ácido nucleico exógeno pode ser um organismo para o qual a sequência de ácido nucleico que foi introduzido através de, por exemplo introgressão, ou a polinização cruzada de uma planta.

Vetor: Como usado na presente invenção, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que possam ser introduzidos em uma célula, por exemplo, com a finalidade de produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácidos nucleicos que permita que se replicar em uma célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. E-xemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a: plasmídeos; cosmí-deos, bateriófagos e vírus; que transportam o DNA exógeno em uma célula. Um vetor pode também incluir um ou mais genes, moléculas anti - sentido, e / ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica Um vetor pode transduzir, transformar, ou infectar uma célula, fazendo assim com que a célula venha a expressar as moléculas de ácido nucleico e / ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor, opcionalmente, inclui materiais para auxiliar na obtenção de entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossoma, proteína de revestimento, etc.) A menos que de seja indicado de uma maneira específica ou implícita, os termos "a", "um", e "a” significa "pelo menos um", como na presente invenção é usado. A menos que de seja explicado de uma maneira específica ou implícita, todos os termos técnicos e científicos usados na presente inven-çãos têm o mesmo significado como normalmente entendido por aqueles que são versdos na técnica à qual pertence esta presente invenção. As definições dos termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo, Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0 - 19 - 854287 - 9); Kendrew et al.. (Eds.), The Encyclopedia of Molecular Bio-logy, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0 - 632 - 02182 - 9); Meyers e RA (Ed.) Biologia Molecular e Biotecnologia: A referência de mesa Abrangente, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 - 56081 - 569 - 8). IV. Motivos de interação de domínios transativação das plantas A presente invenção fornece novos TADs cultivares e motivos de interação proteína - proteína a partir dos mesmos, assim como os ácidos nucleicos que codificam para o mesmo. TADs que foram identificados e isolados a partir de proteínas de plantas, ERF2 (Arabidopsis thaliana); PTI4 (Solanum tuberosum), AtERFI (A. thaliana); ORCA2 (Catharanthus roseus)\ DREB1A (A. thalianat); CBF1 {A. thaliana), e DOF1 (Zea mays), foram utilizados para identificar motivos de plantas interação TAD que podem, em algumas modalidades ser "trocados" em um TAD heterólogo, ou utilizado com a finalidade de produzir um motivo de interação da variante TAD. Os TADs de plantas recentemente identificados, motivos de interação das mesmas, e TADS variantes destes, podem ser utilizados em modalidades particulares (por exemplo, pela inclusão de uma proteína ativadora transcricional sintética) para conferir o controle de expressão e desejável novo regulador de um gene de interesse. O TAD de VP16 (V16 TAD) tem sido caraterizado, e as regiões estruturais dos novos TADs precedentes de plantas e os domínios de interação são referidos por meio da analogia às estruturas correspondentes em VP16 TAD. VP16 TAD pode ser dividido em dois subdomínios, e cada sub-domínio é capaz de ativar de forma autônoma e independente de transcrição quando ligado a um domínio de ligação a DNA. Os subdomínios VP16 são, por vezes referido como o subdomínio do amino (ou "VP16 transativação do subdomínio I" ou "VP16412 - 456") e o grupo de subdomínio carboxila (ou "VP16 transativação do subdomínio II" ou "VP16456 - 490"). VP16 interage através de interação com os seus domínios de proteínas alvo várias envolvidas na transcrição, incluindo a sub - unidade de fator de transcrição p62 / Tfb1 IIB (TFIIB). A atividade de VP16 não depende apenas dos resíduos ácidos, mas também em aminoácidos hidrófobos e aromáticos dentro do DAT. Vide, por exemplo, Cress e Triezenberg (1991) Science 251 (4989) :87 - 90. No entanto, o TAD VP16 ácido pode ser mais tolerante a mutagénese do que muitas outras sequências polipeptídicas, devido à falta de uma estrutura secundária regular em TADs ácidas. Sigler (1988) Nature 333:210 - 2. A natureza não estruturada dos subdomínios VP16 TAD pode ajudar a mediar as múltiplas interações TAD proteína/proteína com diferentes parceiros de ligação (Dyson e Wright (2002) Curr. Opin. Strut. Biol. 12 (1) :54 - 60), e o TAD subdomínios pode adoptar uma estrutura mais ordenada (por exemplo, um curto α - hélice (Langlois et ai. (2008), supra), quando eles estão ligados a proteínas alvo do que quando livres em solução. Vide, por exemplo, Garza et ai. (2009) Life Sei. 84 (7 - 8) : 189 - 93,.. Jonker et ai (2005) Biochemistry 44 (3) :827 - 39,. Langlois et ai (2008), supra.

Algumas modalidades incluem uma proteína sintética ativadora transcricional que compreende um motivo de interação da planta TAD, em que o motivo de interação da planta TAD é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :10-16. Alguns exemplos de síntese de proteínas atívadoras de transcrição compreendem um TAD que compreende um motivo de interação da planta TAD, e estas proteínas podem ter uma sequência, incluindo, por exemplo e sem limitação, SEQ ID NO :2 - 8 e SEQ ID NO :100 - 106. Adicionais TADs exemplares compreendem um motivo de interação da planta TAD incluem aqueles engenharia substituindo uma sequência nativa TAD motivo de interação incluídos em um nativo transativador TAD com uma das SEQ ID NOs :10 - 16.

Algumas modalidades da presente invenção tomam vantagem da descoberta surpreendente de que motivos de interação da variante TAD, que compreende as substituições de aminoácidos conservadoras e / ou substituições de aminoácidos que se encontram em posição análoga em um motivo de interação homóloga (por exemplo, a partir de um ortólogo da proteína nativa que compreende a referência motivo de interação TAD), pode produzir propriedades de genes novos e nomeadamente de regulação. Estas propriedades particulares pode ser desejável para a expressão de um poli-nucleotídeo, em que um certo nível de expressão é desejada. Por exemplo, um motivo de interação da variante TAD pode fornecer a expressão aumentada ao longo de um motivo nativo de referência TAD que aumenta a expressão em si, e, portanto, pode ser desejável na síntese de proteínas e purificação, em que a expressão é maximizada frequentemente uma meta. Em outros exemplos, um motivo de interação da variante TAD pode fornecer menos expressão do que um motivo nativo referência TAD onde menos do que a expressão é desejada maximizada.

Dessa maneira, algumas modalidades incluem uma proteína sintética ativadora transcricional que compreende um motivo de interação da variante TAD. Em alguns exemplos, o motivo de interação da variante TAD pode ser uma variante de uma das SEQ ID NOs : 10 - 16. Motivo de interação da variante TAD incluem polipeptídeos possuindo a sequência de aminoácidos de uma sequência nativa de TAD interação, mas em que um ou mais aminoácidos na sequência de ter sido alterado para o aminoácido que se encontra na posição correspondente em um diferente, TAD homóloga. Motivo de interação da variante TAD também incluem polipeptídeos possuindo a sequência de aminoácidos de uma sequência nativa de TAD interação, mas em que uma substituição conservadora foi feita por um ou mais aminoácidos da sequência. Um motivo de interação da variante TAD pode ser, por exemplo e sem limitação, pelo menos 95% idêntica a uma sequência de referência motivo TAD interação (por exemplo, uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs : 10 - 16), pelo menos 90% idêntica à da referência sequência de, pelo menos 85% idêntica à sequência de referência, pelo menos 80% idêntica à sequência de referência, pelo menos 75% idêntica à sequência de referência, pelo menos 70% idêntica à sequência de referência, pelo menos 65% idêntica à da referência sequência de, pelo menos 60% idêntica à sequência de referência, pelo menos 55% idêntica à sequência de referência, pelo menos 50% idêntica à sequência de referência, ou menos de 50% idêntica à sequência de referência.

Motivo de interação da variante TAD incluem, por exemplo e sem limitação, SEQ ID NOs :17 - 22 (variante exemplares ERF2 motivos interação TAD); SEQ fD NOs :23 - 28 (variante exemplares PTI4 motivos interação TAD); ID SEQ NOs: 29 - 34 (variantes exemplificativas AtERFI motivos interação TAD); SEQ ID NOs :35 - 40 (variante exemplares ORCA2 motivos interação TAD); SEQ ID NOS .41 - 46 (variante exemplares DREB1A motivos interação TAD); SEQ ID NOs :47 - 52 ( variante exemplificativa CBF1 motivos interação TAD), e SEQ ID NOs :53 - 58 (variante exemplares DOF1 motivos interação TAD). TADs exemplares compreendem um motivo de interação da variante TAD incluem aqueles concebidos por substituição de uma sequência de TAD motivo de interação compreendido em um TAD transativador nativo com um Variante TAD selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :17 - 58. Por exemplo, TADs exemplares compreendem um motivo de interação da variante TAD inclunas SEQ ID NOs: 107 -120.

Os ácidos nucleicos que codificam para qualquer e todos os po-lipeptídeos acima mencionados são facilmente identificáveis a partir da sequência de aminoácidos do polipeptídeo. Por exemplo, um motivo TAD ou interação TAD pode ser codificado pelo polinucleotídeo nativo que é transcrito para gerar um mRNA, que é subsequentemente traduzido para os amino-ácidos do TAD ou motivo de interação TAD. No entanto, um versado na técnica irá apreciar que, devido à degenerescência do código genético, muitas outras polinucleotídeos equivalentes existem que irão codificar um polipeptídeo idêntico. Motivos variantes TAD de interação (por exemplo, SEQ ID NOs : 17 - 58) podem ser codificados por polinucleotídeos que são prontamente determináveís por referência a uma tabela de códon de RNA a partir da se- quência de aminoácidos da variante particular desejada. Em determinadas modalidades, pode ser desejável que a sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica um motivo de interação TAD (ou variante), a ser montada de acordo com a utilização de códons da célula hospedeira, por exemplo, de modo a maximizar ou optimizar a expressão de um proteína (por exemplo, uma proteína de fusão), que compreende o motivo de interação TAD. V. Ativadores de transcrição das proteínas de fusão Esta presente invenção também fornece proteínas de fusão de transcrição sintética ativadora que compreende umo motivo de interação da planta TAD e / ou um motivo de interação da variante TAD. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional compreende ainda pelo menos um domínio de ligação a DNA. Os ácidos nuclei-cos (por exemplo, DNA) que codificam tais proteínas de fusão sintéticos de transcrição ativadores são também fornecidos.

Em algumas modalidades, uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional compreende pelo menos um primeiro polipeptídeo que se liga ao DNA de uma maneira específica da sequência (isto é, um "domínio de ligação ao DNA"). O domínio de ligação a DNA primeiro polipeptídeo da proteína de fusão ativadora transcricional sintética pode ser operativamente ligado a pelo menos um segundo polipeptídeo de uma planta que compreende o motivo de interação TAD ou motivo variante interação TAD. Em alguns exemplos, uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional podem compreender polipeptídeos adicionais, tais como uma sequência espaçadora posicionado entre os primeiro e segundo polipeptídeos de a proteína de fusão; um peptídeo líder, um peptídeo que tem como alvo a proteína de fusão para uma organela (por exemplo, a núcleo); polipeptídeos que são clivadas por uma enzima celular, marcas peptídicas, e outras sequências de ácidos aminados que não interferem com a função dos polipeptídeos ligados de maneira operacional primeira e segunda.

Em algumas modalidades, os primeiro e segundo polipeptídeos de um proteína de fusão ativadora transcricional de síntese pode ser ligado de maneira operacional pela sua expressão a partir de um único polinucleo-tídeo codificando os primeiro e segundo polipeptídeos ligados uns aos outros em grelha, de modo a criar um gene quimérico que codifica uma proteína de fusão. Exemplos de polinucleotideos que codificam para uma proteína de fusão que compreende um ativador transcricional do domínio de ligação a DNA e um motivo de interação TAD incluem, sem limitação, SEQ ID NOs: 79 - 93. Em modalidades alternativas, os primeiro e segundo polipeptídeos de um proteína de fusão ativadora transcricional sintética pode ser ligada operativamente, por outros meios, tais como por ligação cruzada de forma independente expressos primeiro e segundo polipeptídeos.

Motivos de interação de plantas TAD e motivos de interação da variante TAD que podem ser compreendidos dentro de uma proteína de fusão ativadora transcricional sintéticos incluem os motivos TAD de interação e as suas variantes descritas na Seção IV, supra. Por exemplo, uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional pode compreender um polipep-tídeo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 10 - 58.

Domínios de ligação do DNA que pode ser composto de uma proteína de fusão ativadora transcricional sintética do dedo de zinco incluem os domínios de ligação a DNA de proteínas dedo de zinco (por exemplo, um Z6 domínio de ligação ao DNA). Dedo de zinco individuais DNA domínios de ligação podem ser concebidas para atingir e se ligar a uma grande variedade de locais de DNA. Vide, por exemplo, Wu et aL. (2007) Cetl. Mol. Life Sei. 64:2933 - 44. Canonical Cys2His2, bem como não canônicas Cys3His proteínas dedo de zinco, liga ao DNA através da inserção de uma hélice - α no sulco maior da dupla hélice. Reconhecimento de DNA por domínios de dedo de zinco é modular, cada dedo contatos basicamente três pares de bases consecutivos no alvo, e alguns resíduos chave para o reconhecimento de proteínas mediata. Com a inclusão de múltiplos domínios de ligação ao DNA de dedo de zinco de uma proteína de fusão ativadora transcricional sintético, a especificidade de ligação ao DNA da proteína de fusão pode ser aumentada (e, portanto, a especificidade de todos os efeitos reguladores de genes, dessa maneira, confere também pode ser aumentada). Vide, por exemplo, Urnov et ai. (2005) Nature 435:646 - 51. Dessa maneira, um ou mais dedos de zinco DNA domínios de ligação podem ser construídos e utilizados de tal forma que uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional introduzido em uma célula hospedeira interage com uma sequência de DNA que é único dentro do genoma da célula hospedeira.

Em alguns exemplos, uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional compreende um domínio de ligação a DNA de GAL4, um tran-sativador modular em Saccharomyces cerevisiae, mas que também opera como um transativador em muitos outros organismos. Vide, por exemplo, Sadowski et ai. (1988) Nature 335:563 - 4. Neste sistema de regulação, a expressão de genes que codificam enzimas da via metabólica galatose em S. cerevisiae é rigorosamente regulada pela fonte de carbono disponível. Johnston (1987) Microbiol. Rev. 51:458 - 76. Controle transcricional destes enzimas metabólicas é mediada pela interação entre a proteína reguladora positiva, GAL4, e um 17 pb da sequência de DNA de GAL4 simétrico ao qual se liga de uma maneira específica a (UAS). GAL4 nativo consiste em 881 resíduos de aminoácidos, com um peso molecular de 99 kDa. GAL4 compreende os domínios funcionalmente autônomos, as atividades combinadas que contam para a atividade de GAL4 in vivo . Ma & Ptashne (1987) Cell 48:847 - 53); Brent e Ptashne (1985) Cell 43 (3 Pt 2) :729 - 36. Os N - terminal de 65 aminoácidos de GAL4 compreendem o GAL4 de domínio de ligação a DNA. Keegan et ai. (1986) Science 231:699 - 704; Johnston (1987) Nature 328:353 - 5. - Sequência de ligação específico é necessária a presença de um catião divalente coordenado por seis resíduos Cys presentes no domínio de ligação ao DNA. O domínio de cátions contendo coordenada interage com e reconhece um tripleto CCG conservadas em cada extremidade dos 17 pb UAS via contato direto com o sulco maior da dupla hélice do DNA. Marmorstein et ai. (1992) Nature 356:408 - 14. A função de ligação de DNA das posições C - terminal da proteína dos domínios de transcrição ativantes na proximidade do promotor, de tal forma que os domínios de ativação da transcrição podem dirigir.

Os domínios de ligação ao DNA adicionais que podem ser com- preendidos em uma proteína de fusão ativadora transcricional sintética incluem, por exemplo e sem limitação, uma sequência de ligação a partir de um gene induzível AVRBS3; uma sequência de consenso de ligação a partir de um gene induzível AVRBS3 ou sequência de ligação sintética daí engenharia (por exemplo, UPA domínio de ligação de DNA, SEQ ID NO: 89),.. TAL; LexA (vide, por exemplo, Brent e Ptashne (1985), supra): LACR (vide, por exemplo, Labow et al. (1990) Mol Cell .. Biol 10:3343 - 56, Baim et ai (1991) Proc Natl Acad Sei EUA 88 (12) :5072 - 6), um receptor da hormona esteroide (Elliiston et ai (1990.) J. Biol . Chem 265:11517 - 121);. repressor Tet (Patente U.S. 6.271.341) e um mutante Tet repressor que se liga a uma sequência de operador tet na presença, mas não na ausência, de tetracíclina (Tc), e os componentes do regulador sistema descrito em Wang et ai. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91 (17) :8180 - 4, que utiliza uma fusão de GAL4, um receptor da hormona, e VP16.

Em alguns exemplos, uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional compreende mais de um motivo de interação TAD. Por exemplo e sem limitação, uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional pode compreender 2, 3, 4, ou mais domínios de interação TAD. Em alguns exemplos, uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional compreende mais do que um domínio de ligação a DNA. Por exemplo e sem limitação, uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional pode compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais domínios de ligação a DNA. VL Moléculas de ácido nucleico que compreendem um poiinu-cleotídeo que codifica uma proteína de fusão ativadora transcricional Em algumas modalidades, a presente invenção providencia uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência polinucleotidica que codifica um motivo de interação da planta TAD, motivo de interação da variante TAD, Planta TAD ou Variante TAD. Tais moléculas de ácido nucleico pode ainda compreender pelo menos uma sequência polinucleotidica que codifica um domínio de ligação a DNA. Por exemplo, um ácido nucleico em algumas modalidades compreende uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica para um motivo de interação da planta TAD, motivo de interação da variante TAD, Planta TAD ou Variante TAD, fundido em estrutura a uma segunda sequência de polinucleotídeos que codifica um domínio de ligação a D NA, tais de que as duas sequências de poli-nucleotídeo são transcritas como parte de uma única proteína de fusão.

Em moléculas de ácidos nucleicos fornecidas em algumas modalidades da presente invenção, o último códon de uma primeira sequência polinucleotidica que codifica um motivo de interação da planta TAD, motivo de interação da variante TAD, Planta TAD ou Variante TAD, e o primeiro códon de uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um de ligação ao DNA do domínio podem ser separados por qualquer número de tri-pletos de nucleotídeos, por exemplo, sem que codifica para um intrão ou um "STOP" Da mesma forma, o último códon de uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação a DNA, e o primeiro códon de uma sequência polinucleotidica que codifica uma segunda planta motivo de interação TAD, motivo de interação da variante TAD, Planta TAD ou Variante TAD, podem ser separados por qualquer número de tripletos de nucleotídeos. Em modalidades destes e, ainda, o códon final do último (ou seja, mais 3 ' da sequência de ácido nucleico) da sequência polinucleotidica que codifica uma primeira planta motivo de interação TAD, motivo de interação da variante TAD, Planta TAD ou TAD, variante e a sequência de polinucleotídeo que codifica um segundo domínio de ligação de DNA, pode ser fundida em fase de registo, com o primeiro códon de uma sequência polinucleotidica que codifica mais de uma maneira direta contígua à mesma, ou separado do mesmo por não mais do que uma sequência peptídica curta, como a que está codificado por um sintético linker de nucleotídeos (por exemplo, um agente de ligação de nucleotídeos que podem ter sido usados para alcançar a fusão). Exemplos de tais outras sequências polinucleotídicas incluem, por exemplo e sem limitação, as etiquetas, a segmentação peptídeos, e os locais de divagem enzimática. Da mesma forma, o primeiro códon do mais a 5 '(na sequência de ácido nucleico) das primeira e segunda sequências polinucleotídicas pode ser fundido em fase com o códon de registrar o último de uma sequência polínucleotidica que codifica mais de uma maneira direta contígua à mesma, ou separado do mesmo por nenhuma mais do que uma sequência peptidica curta.

Uma sequência de separação de uma sequência polinucleotídica que codifica um motivo de interação da planta TAD, variante motivo de interação Planta TAD ou variante TAD, e uma sequência de polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação a DNA pode, por exemplo, consistir em qualquer sequência, de tal modo que o aminoácido sequência codificada não é susceptível de alterar significativamente a tradução da proteína de fusão. Devido à natureza autônoma dos domínios de interação TAD (e suas variantes) na presente invenção descritos e conhecidos de domínios de ligação ao DNA, as sequências não intervenientes, nos exemplos, interferem com as funções respectivas destas estruturas.

Algumas modalidades da presente invenção incluem também uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica para um motivo de interação da planta TAD, motivo de interação da variante, Planta TAD ou Variante TAD, em que a molécula de ácido nucleico que não compreende uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma DNA - binding domínio. Tais moléculas de ácido nucleico podem ser úteis, por exemplo, para facilitar a manipulação da sequência de codificação de Motivo de interação TAD em técnicas de biologia molecular. Por exemplo, em algumas modalidades, uma sequência de codificação do motivo de interação TAD, podem ser introduzidos em um vetor adequado para a sub - clonagem da sequência em um vetor de expressão, ou uma sequência de codificação Motivo de interação TAD pode ser introduzida uma molécula de ácido nucleico que facilita a produção de uma molécula de ácido nucleico que compreende ainda a sequência de codificação do Motivo de interação TAD ligada operativamente a uma sequência de nucleotídeos de interesse.

Todas as sequências de nucleotídeos que codificam para, por exemplo, uma proteína de fusão que compreende pelo menos um motivo de interação da planta TAD, motivo de interação da variante TAD, Planta TAD ou Variante TAD, e que compreende ainda pelo menos um domínio de ligação a DNA especifica, será imediatamente reconhecíveis por aqueles que são versados na técnica. A degenerescência do código genético fornece um número finito de sequências que codificam para uma sequência de aminoá-cidos particular. A seleção de uma sequência em particular para codificar uma proteína de fusão de acordo com modalidades da presente invenção está dentro do critério do praticante. Diferentes sequências de codificação pode ser desejável em aplicações diferentes.

Em algumas modalidades, pode ser desejável modificar os nu-cleotídeos de uma sequência polinucleotídica que codifica um motivo de interação da planta TAD, motivo de interação da variante TAD, Planta TAD ou Variante TAD (e / ou de nucleotídeos de uma sequência de ligação ao DNA de codificação de domínio), por exemplo, com a finalidade de aumentar a expressão da sequência de polinucleotídeo em um hospedeiro particular. O código genético é redundante com 64 códons possíveis, mas a maioria organismo preferencialmente utilizar um subconjunto destes códons. Os códons que são utilizados na maioria das vezes de uma espécie são chamados de códons ideais, e os que não utilizaram muitas vezes são classificados como códons raros ou pouca utilização. Zhang et ai. (1991) Gene 105:61 -72. Códons podem ser substituídos de modo a refletir a utilização de códons preferidos de um hospedeiro particular, em um processo por vezes referido como "optimização de códon." Optimizado sequências de codificação que contêm códons preferidos por um determinado procariótica ou eucariótica hospedeira pode ser preparado através de, por exemplo, com a finalidade de aumentar o taxa de tradução ou com a finalidade de produzir transcritos de RNA recombinante tendo as propriedades desejáveis (por exemplo, uma meia - vida maior, quando comparado com transcritos produzidos a partir de uma sequência não - optimizada). VII. A expressão de uma proteína de fusão ativadora transcricio-nal Em algumas modalidades, pelo menos uma proteína de fusão que codifica molécula de ácido (s) nucleico (s) que compreende pelo menos uma sequência polinucleotidica que codifica um motivo de interação da planta TAD (ou motivo de interação da variante TAD, Planta TAD ou Variante TAD), e pelo menos uma sequência polinucleotidica que codifica um domínio de ligação de DNA, pode ser introduzido em uma célula, tecido ou organismo para expressão da proteína de fusão no seu interior.

Em algumas modalidades, uma tal molécula de ácido nucleico pode, por exemplo, ser um sistema de vetor, incluindo, por exemplo e sem limitação, um plasmídeo linear, e um plasmídeo circular fechado. Em exemplos particulares, o vetor pode ser um vetor de expressão. As sequências de ácidos nucleicos de acordo com modalidades particulares podem, por exemplo, ser inserido em um vetor, tal que a sequência de ácido nucleico está operativamente ligado a uma ou mais sequências reguladoras. Estão disponíveis muitos vetores para este fim, e a seleção do vetor particular pode depender, por exemplo, do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor, a célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor, e / ou a quantidade da proteína de fusão que é desejada a ser expressa. Um vetor contém vários componentes, tipicamente, a identidade do qual dependem uma função do vetor (por exemplo, a amplificação de DNA e expressão de DNA) e da célula hospedeira particular (es) com a qual o vetor é compatível.

Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de plantas que compreende uma sequência de nucleotídeos que compreende pelo menos uma sequência reguladora ligada operativamente a uma ou mais sequências de nucleotídeos (s) que codifica uma proteína de fusão que compreende pelo menos um motivo de interação planta TAD, motivo de interação da variante TAD, TAD planta , ou Variante TAD, de maneira operacional ligada a pelo menos um domínio de ligação a DNA. A sequência de um ou mais nucleotídeo (s) pode ser expressa, sob o controle da (s) sequência (s) reguladora (s), em uma célula de planta, tecido ou organismo com a finalidade de produzir a proteína de fusão.

Em algumas modalidades, uma sequência reguladora ligada o-perativamente a uma ou mais sequências de nucleotídeos (s) que codifica uma proteína de fusão que compreende pelo menos um motivo de interação planta TAD, motivo de interação da variante TAD, Planta TAD ou Variante TAD, de maneira operacional ligado a pelo menos um DNA domínio de ligação, pode ser uma sequência de promotor que funciona na célula hospedeira, tal como uma célula bateriana, em que a molécula de ácido nucleico está a ser amplificada, ou uma célula de planta, em que a molécula de ácido nucleico que é para ser expressa.

Os promotores adequados para utilização em moléculas de ácido nucleico de acordo com algumas modalidades incluem as que são indutí-veis, virais, sintéticos, ou constitutiva, todos os quais são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de promotores que podem ser úteis em modalidades da presente invenção são fornecidos por: Patente U.S. N ° s 6.437.217 (promotor de milho RS81); 5.641.876 (promotor de atina de arroz); 6.426.446 (promotor de milho RS324); 6.429.362 (promotor de milho PR -1); 6.232.526 (promotor de milho A3); 6.177.611 (promotores constitutivos de milho); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196 (promotor 35S); 6.433.252 (promotor de milho oleosin L3); 6.429.357 (arroz atina 2, promotor da atina do arroz e duas intron ); 6.294.714 (promotores leves induzíveis); 6.140.078 (promotores induzíveis por sal); 6.252.138 (agente patogênico por promotores induzíveis); 6.175.060 (deficiência de fósforo por promotores induzíveis); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor gama - coixin); e Pedido de Patente EUA N ° de Série 09 / 757, 089 (promotor al-dolase de milho cloroplasto).

Promotores adicionais exemplíficativos incluem a nopalina sinta-se (NOS) promotor (Ebert et al. (1987) Proc Natl Acad Sei EUA 84 (16) :5745 - 9), A sintase de otopina (OCS) promotor (que é transportado no indutores de tumor plasmídeos de Agrobaterium tumefaciens), os promotores caulimo-virus tais como o vírus do mosaico da couve - flor (CaMV) 19S promotor (Lawton et al. (1987.) Plant Mol Biol 9:315 - 24) o promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810 - 2;. vírus mosaico promotor figwort 35S - (Wal- ker et al. (1987) Proc Natl Acad Sei EUA 84 (19) :6624 - 8....), o promotor da sacarose sintase (Yang e Russell, Proc (1990) Natl Acad Sei EUA 87:4144 — 8), o promotor do gene R complexo (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175 - 83.), promotor do gene clorofila a / b da proteína de ligação; CaMV35S (Patentes dos EUA Nos 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196); FMV35S (Patentes dos EUA Nos 6.051.753 e 5.378.619), um promotor PC1SV (Patente U.S. No. 5.850.019), o promotor SCP1 (Patente U.S. No. 6677503), e promotores AGRTU.nos (número de acesso GenBank V0Q087; Depicker et ai (1982.) J. Mol. Appl Genet 1:561 -73; Bevan et ai (1983) Na-ture 304:184-7).

Em modalidades particulares, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem compreender um promotor específico do tecido. Um promotor específico de tecidos é uma sequência nucleotidica que dirige um nível mais elevado de transcrição de uma sequência de nucleotídeos de maneira operacional ligada no tecido para o qual o promotor é específica, relativamente a outros tecidos do organismo. Exemplos de promotores específicos de tecido incluem, sem limitação; tapetum promotores específicos de antera, promotores específicos de pólen, promotores específicos (Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 7,141.424, e Internacional PT Publication No, WO 99 / 042587); ovule - promotores específicos, (Vide, por exemplo, Patente U.S. No. Pedido 2001 / 047525 A1), frutas promotores específicos (Vide, por exemplo, Patente U.S. N ° s 4.943.674, e 5.753.475), e promotores específicos da semente (Vide, por exemplo, Patente U.S. N's 5.420,034, e 5.608.152). Em algumas modalidades, um promotor específico do estágio de desenvolvimento (por exemplo, um promotor ativo em uma fase posterior do desenvolvimento) pode ser utilizado em uma composição ou método da presente invenção.

As sequências reguladoras adicionais que podem, em algumas modalidades ser de maneira operacional ligadas a uma molécula de ácido nucleico que inclui 5 'UTRs localizadas entre uma sequência promotora e uma sequência codificadora que funcione como uma sequência líder de tradução. A sequência líder de tradução está presente no mRNA totaimente processado, e isto pode afetar o processamento do transcrito primário, e / ou a estabilidade do ARN. Exemplos de sequências líder tradução incluem milho e petúnia calor líderes choque proteína (EUA patente 5.362.865), plan- ta vírus líderes da proteína capsidial, líderes de plantas rubisco, e outros. Vide, por exemplo, Turner e Foster (1995) Biotech Molecular. 3 (3) :225 - 36. Exemplos não - limitativos de 5 'UTRs são fornecidos por: GmHsp (Patente U.S. No. 5.659.122); PhDnaK (Patente U.S. No. 5.362.865); AtAntl; TEV (. Carrington e Freed (1990) J. Virol 64:1590 - 7) e AGRtunos (número de a-cesso GenBank V00087,. e Bevan et al. (1983), supra).

As sequências reguladoras adicionais que podem, em algumas modalidades ser de maneira operacional ligadas a uma molécula de ácido nucleico que também incluem "sequências não traduzidas, regiões 3 '3 de terminação da transcrição, ou as regiões de poliadenilação. Estes são elementos genéticos localizados a jusante de uma sequência de nucleotídeos, e incluem polinucleotídeos que fornecem o sinal de poliadenilação, e / ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição ou processamento de mRNA. As funções de poliadenilação de sinal em plantas para causar a adição de nucleotídeos polyadenylate à extremidade 3 'do precursor de mRNA. A sequência de poliadenilação podem ser obtidas a partir de uma variedade de genes de plantas, ou a partir dos genes T - DNA. Um exemplo não limitativo de uma região 3 ' de terminação da transcrição é a sintase da região 3' nopalina (NOS 3 \ Fraley et al. (1983) Proc Natl Acad Sei EUA 80:4803 - 7). Um exemplo da utilização de três diferentes "regiões não traduzidas são fornecidas em Ingelbrecht et ai. (1989) Plant Cell 1:671 - 80. Exemplos não limitantes de sinais de poliadenilação incluem uma a partir de um gene RbcS2 Pisum sativum (Ps.RbcS2 E9 - ; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671 - 9) e AGRTU.nos (número de acesso GenBank E01312).

Informação adicional a respeito das sequências reguladoras que podem ser úteis em modalidades particulares está descrita, por exemplo, em Goeddel (1990) " Gene Expression Techonolgy", Methods Enzymol. 185, Academic Press, San Diego, CA.

Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou um vetor da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável na célula transformada, tal como uma célula vegetal. Os marcadores selecionáveis podem também ser utilizados para sele- cionar para as plantas ou células de plantas que compreendem uma molécula de ácido nucleico da presente invenção. O marcador pode codificar resistência a bíocidas, a resistência aos antibióticos (por exemplo, canamícina, geneticina (G418), bleomicina, e higromicina), ou resistência a herbicidas (por exemplo, o glifosato). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a: um gene neo, que confere resistência a canami-cina e pode ser selecionado para utilização, por exemplo, canamícina e G418, um gene bar que confere resistência a bialafos, um mutante do gene da sintase EPSP, que confere resistência ao glifosato; um gene de nitrilase que confere resistência ao bromoxinil; um gene de sintase acetolatato mutante (ALS) que confere resistência a imidazolinona ou sulfonilureia, e um gene DHFR resistente ao metotrexato. Múltiplos marcadores selecionáveis estão disponíveis, que conferem resistência aos agentes químicos, incluindo, por exemplo e sem limitação, a ampicilína; bleomicina; cloranfenicol; genta-micina; higromicina; canamícina; lincomicina; metotrexato; fosfinotricina; pu-romicina; espetinomicina; rifampicina; estreptomicina e tetraciclina. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados em, por exemplo, as Patentes US 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

Uma molécula de ácido nucleico ou vetor da presente invenção podem também, ou De uma maneira alternativa, incluir um marcador detec-táveis. Os marcadores detectáveis podem ser utilizados para monitorar a expressão. Exemplos de marcadores detectáveis incluir um gene β - glucu-ronidase ou uidA (gus) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol Rep. 5:387 - 405 Biol), Um R - local do gene, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocianinas (cor vermelha) em tecidos de plantas (Dellaporta et al.. (1988) "Molecular cloning do alelo R - nj milho por transposon marcação com Ac." Em 18 Stadler Genetics Symposium, P. e R. Appels Gustafson, eds, Plenum, Nova Iorque (pp. 263 - 82), um gene β -latamase (Sutcliffe et al. (1978) Proc Nati Acad Sei EUA 75:3737 - 41), um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica), um gene da luciferase (Ow et al. (1986.) Science 234:856 - 9), um gene que codifica xylE uma dioxigenase de catecol que converte cromogênico catecóis (Zukowski et al. (1983) Gene 46 (2 - 3) :247 - 55.); um gene de amilase (Ika-tu et al. (1990) Bio / Technol 8:241 - 2..); um gene da tirosinase, que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e aquinona, que por sua vez se condensa em melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbio! 129:2703 - 14), e uma α - galatosidase.

Os métodos adequados para a transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, por exemplo e sem limitação: por meio da transformação de pro-toplastos (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.508.184), por meio da desidratação / inibição mediada por incorporação de DNA (vide, por exemplo, Po-trykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet 199:183 - 8), por meio da eletroporação (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.384.253), por agitação com fibras de car-boneto de silício (Vide, por exemplo, as Patentes US 5.302.523 e 5464765), por meio da transformação mediada por Agrobaterium (vide, por exemplo, Patentes dos EUA 5.563.055, 5.591.616, 5.693.512, 5.824.877, 5.981.840, e 6.384.301), e por meio da aceleração de partículas revestidas com DNA (vide, por exemplo, Patentes dos EUA 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861, e 6.403.865). Através da aplicação de técnicas, tais como estas, as células virtualmente de todas as espécies podem ser esta-velmente transformadas. Em algumas modalidades, o DNA transformador é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso das espécies multicelu-lares, as células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma dessas técnicas pode ser utilizada com a finalidade de produzir uma planta transgênica, por exemplo, que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos da presente invenção no genoma da planta transgênica. O método mais amplamente utilizado para a introdução de um vetor de expressão em plantas baseia-se no sistema de transformação natural de Agrobaterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias patogênicas de plantas do solo que transformam geneticamente células de plantas.

Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respetivamente, transportam genes responsáveis para a transformação genética de plantas. Os Ti (indutores de tumor) - plasmídeos contêm um grande segmento, conhecido como T - DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região vir, é responsável pela transferência de T - DNA. A região de T - DNA é delimitada pelas fronteiras da mão esquerda e da mão direita que são compostos, cada um terminal de repetidas sequências de nucleotídeos. Em alguns vetores binários modificados, os genes indutores de tumores foram suprimidos e as funções da região vir são utilizadas para transferir DNA estranho delimitada pelas sequências de fronteira de T - DNA. A região de T - podem também conter, por exemplo, um marcador de seleção para a recuperação eficiente de plantas transgênicas e células, e um local de clonagem múltipla para inserção de sequências de transferência tal como um ácido nucleico que codifica para uma proteína de fusão da presente invenção.

Dessa maneira, em algumas modalidades, um vetor de transformação de plantas é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (vide, por exemplo, Patente U.S. N ° s 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, e 5.501.967, e Pedido de Patente Européia EP 0 122 791) ou de um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Vetores de transformação de plantas adicionais incluem, por exemplo e sem limitação, os descritos por aí Herrera - Estrella et al. (1983) Nature 303:209 - 13; Bevan et ai. (1983), supra; Klee et al.. (1985) Bio / Technol. 3:637 - 42, e na patente europeia EP 0 120 516, e os que derivam de qualquer um dos anteriores. Outras bactérias, tais como Si-norhizobium, Rhizobium, Mesorhizobium, e que, de maneira natural, interagem com as plantas podem ser modificadas para mediar a transferência de genes para um certo número de plantas diferentes. Estas bactérias simbióti-cas planta - associados podem ser tornadas competentes para a transferência de genes através da na presente invençãosição de ambos Ti um plasmídeo desarmado e um vetor binário adequado.

Após o fornecimento do DNA exógeno para as células receptoras, as células transformadas podem ser identificadas para posterior cultura e regeneração de plantas. A fim de melhorar a capacidade para identificar as células transformadas, pode-se desejar utilizar um gene marcador de seleção ou detectáveis, como previamente definido, com o vetor usado para gerar o transformante. No caso de um marcador selecionável é utilizado, as células transformadas são identificadas dentro da população de células potencialmente transformadas expondo as células a um agente seletivo, ou agentes. No caso em que um marcador detectáveis é usado, as células podem ser rastreados para a caraterística desejada gene marcador.

As células que sobrevivem a exposição ao agente seletivo, ou células que foram marcados positivos em um ensaio de rastreio, podem ser cultivadas em meios que suportem a regeneração das plantas. Em algumas modalidades, quaisquer meios adequados para cultura de tecidos de plantas (por exemplo, MS e N6 media) pode ser modificado por inclusão de outras substâncias, tais como reguladores de crescimento. Tecido pode ser mantido em um suporte de base com os reguladores de crescimento de tecido suficiente até que esteja disponível para iniciar a regeneração de plantas esforços, ou seguintes ciclos repetidos de seleção manual, até que a morfo-logia do tecido seja adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos, 2 semanas), a seguir transferidas para mídia propícias para atirar formação. As culturas são transferidas periodicamente até a formação de brotos suficientes ocorreu. Uma vez que brotos são formadas, elas são transferidas para meios conducentes à formação de raízes. Uma vez que as raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para um maior crescimento e maturidade.

Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, uma sequência de nucleotideos que codifica um poiipeptídeo que compreende pelo menos uma proteína de fusão da presente invenção) de uma planta de regeneração, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo: moleculares ensaios biológicos, tais como Southern e Northern blottíng, PCR e sequenciamento de ácidos nucleicos; ensaios bioquímicos, tais como a deteção da presença de um produto de proteína, por exemplo, por meios imunoiógicos (ELISA e / ou Western blots } ou por função enzimãtica; ensaios de plantas, tais como a parte da folha ou raiz, e ensaios de análise do fenótipo da planta inteira regenerada.

Os casos de integração podem ser analisados, por exemplo, a-través de amplificação por PCR, utilizando, por exemplo, iniciadores de oli-gonucleotídeos que são específicas para uma sequência de nucleotídeos de interesse. PCR genotipagem é entendido como incluindo, mas não se limitam a, em cadeia da polimerase - reação de amplificação (PCR) de DNA genômico isolado a partir de tecido derivadas da planta hospedeira prevista para conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integradas no ge-moma, seguida de clonagem standard e sequência A análise dos produtos de amplificação por PCR. Os métodos de genotipagem por PCR foram bem descritos (vide, por exemplo, Rios, G. et ai. (2002) Plant J. 32:243 - 53), e pode ser aplicado a DNA genômico derivado de qualquer espécie de planta ou de um tipo de tecido, incluindo culturas de células.

Uma planta transgênica formada utilizando os métodos de transformação Agrobaterium contém tipicamente dependentes de uma única sequência de DNA recombinante inserido em um cromossoma. A sequência de DNA única recombinante é referido como um "acontecimento transgênico" ou "caso de integração." Tais plantas transgênicas são heterozigóticos para a sequência de DNA inserida. Em algumas modalidades, um de plantas transgênicas homozigóticas em relação a um transgene podem ser obtidos por acasalamento sexualmente (selfing) uma planta transgênica segregante independente que contenha uma sequência do gene exógeno único para si mesmo, por exemplo, uma planta de FO, com a finalidade de produzir sementes Fl. Um quarto da semente Fl produzido será homozigótica no que respeita ao transgene. Germinação de sementes Fl resultados em plantas que podem ser testadas para a heterozigosidade, tipicamente utilizando um ensaio de SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre os heterozigotos e homozigotos (ou seja, um ensaio de zigosida-de).

Em modalidades particulares, as cópias de pelo menos uma pro- teína de fusão ativadora transcricional sintético que compreende pelo menos um motivo de interação da planta TAD (e / ou o motivo de interação da variante TAD) e pelo menos um domínio de ligação de DNA são produzidos de uma célula, em que tenha sido introduzido pelo menos uma molécula de ácido (s) nucleico (s) que compreende uma sequência de nucieotídeos que codifica o pelo menos uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional. Cada proteína de fusão ativadora sintética transcricional pode ser expressa a partir de várias sequências de ácido nucleico introduzidas em casos de transformação diferentes, ou a partir de uma sequência de ácido nucleico única introduzida em um caso de transformação única. Em algumas modalidades, uma pluralidade de tais proteínas de fusão pode ser expressa sob o controle de um promotor único, em outras modalidades, uma pluralidade de tais proteínas de fusão pode ser expressa sob o controle de promotores múltiplos.

Além da transformação direta de uma planta ou célula vegetal com uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, as plantas transgênicas podem ser preparadas, em algumas modalidades, atravessando a primeira planta que possui pelo menos um acontecimento transgênico com uma segunda planta sem tal caso. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucieotídeos que codifica uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional que compreende pelo menos um motivo de interação planta TAD (e / ou o motivo de interação da variante TAD) e pelo menos um domínio de ligação de DNA pode ser introduzido em uma primeira planta linha que é passível de transformação, com a finalidade de produzir uma planta transgênica, o qual planta transgênica pode ser cruzada com uma linha de planta segundo a introgress a sequência de nucieotídeos que codifica a proteína de fusão ativadora sintética transcricional na linha segunda planta. VIII. Materiais de planta que compreendem uma fusão de proteína ativadora transcricional Em algumas modalidades, uma planta é fornecida, em que a planta compreende uma célula de planta que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional que compreende pelo menos um motivo de interação planta TAD (e / ou o motivo de interação da variante TAD) e pelo menos uma DNA - domínio de ligação. Em modalidades particulares, uma tal instalação pode ser produzido pela transformação de um tecido vegetal ou célula vegetal, e a regeneração de uma planta completa, em outras modalidades, uma tal instalação pode ser obtido através de íntrogressão de um ácido nucleíco que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional em uma germoplasma. Materiais de planta que compreende uma tal célula vegetal são também fornecidos. Um tal material de planta pode ser obtido a partir de uma planta que compreende a célula vegetal.

Um material de planta ou planta transgênica que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional que compreende pelo menos um motivo de interação planta TAD (e/ou o motivo de interação da variante TAD) e peío menos um domínio de ligação a DNA pode, em algumas modalidades apresentam uma ou mais das seguintes caraterísticas: a expressão da proteína de fusão de uma célula da planta; localização da; expressão da proteína de fusão em um plasto de uma célula da planta; expressão da proteína de fusão no núcleo de uma célula da planta proteína de fusão em uma célula da planta, da integração da sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula da planta; presença da sequência nucleotidica em extra - cromossomal de DNA de uma célula da planta, e / ou a presença de um transcrito de ARN correspondente à sequência de nucleotídeos em uma célula da planta. Tal planta pode, adicionalmente, ter um ou mais traços desejáveis outros do que a expressão da proteína de fusão codificada. Tais caraterísticas podem incluir os que resultam da expressão de uma sequência de nucleotídeos endógena, ou transgênicos, a expressão do qual é regulada pela proteína de fusão de uma célula da planta, por exemplo e sem limitação: a resistência a insetos, e outras pragas, doenças - agentes causadores; tolerâncias a herbicidas; maior estabilidade, rendimento, ou vida de prateleira; tolerâncias ambientais; pro- dução farmacêutica, a produção de produtos industriais, e melhorias nutricionais.

Uma planta transgênica de acordo com a presente invenção pode ser qualquer planta capaz de ser transformada com uma molécula de á~ cido nucleico da presente invenção. Consequentemente, a planta pode ser uma dicotiledónea ou monocoíiledónea. Exemplos não - limitativos de plantas dicotiledóneas utilizáveis nos métodos da presente invenção incluem al-fafa, Arabidopsis, feijão, brócolos, couve, colza, cenouras, couve - flor, aipo, couve chinesa, algodão, pepino, beringela, alface, melão, ervilha, pimentão, amendoim, batata, abóbora, rabanete, canola, espinafre, soja, abóbora, beterraba, girassol, tabaco, tomate e melancia. Exemplos não - limitativos de plantas monocotiledóneas utilizáveis nos métodos da presente invenção incluem milho, cebola, arroz, sorgo, trigo, centeio, milho miúdo, cana de açúcar, aveia, triticale, switchgrass e relva. As plantas transgênícas de acordo com a presente invenção pode ser usada ou cultivada em qualquer forma.

Algumas modalidades também proporcionam os produtos de base que contêm uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional que compreende pelo menos um motivo de interação planta TAD (e / ou o motivo de interação da variante TAD) e pelo menos um domínio de ligação de DNA, por exemplo, uma mercadoria de produto produzido a partir de uma planta ou semente recombinante que contenha um ou mais de tais sequências de nucleotídeos. Produtos de base que contêm uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional que compreende pelo menos um motivo de interação planta TAD (e/ou o motivo de interação da variante TAD) e pelo menos um domínio de ligação de DNA incluem, por exemplo e sem limitação: os produtos alimentares , refeições, óleos, ou grãos esmagados ou inteiro ou de sementes de uma planta que compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína de fusão tal sintético ativador transcricional. A detecção de uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional da presente invenção em um ou mais produ- tos de base ou a um produto é uma evidência, de fato, que o produto de base ou de base foi, pelo menos em ptécnica, produzido a partir de uma planta que compreende um ou mais nucleotídeos sequências que codificam uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional da presente invenção. Em modalidades particulares, um produto de base da presente invenção compreendem uma quantidade detetável de uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional que compreende pelo menos um motivo de interação planta TAD (e/ou o motivo de interação da variante TAD) e pelo menos um DNA - binding domínio. Em algumas modalidades, os produtos de tais matérias - primas podem ser produzidos, por exemplo, mediante a obtenção de plantas transgênicas e preparar o alimento ou alimento para animais a partir deles.

Em algumas modalidades, uma planta transgênica ou semente que compreende um transgene que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional da presente invenção também podem compreender pelo menos um outro acontecimento transgênico no seu genoma, incluindo, sem limitação: uma modificação genética a partir da qual é transcrita uma molécula de RNAi, um gene que codifica uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringíensis), um gene de tolerância a herbicidas (por e-xemplo, um gene de fornecimento de tolerância ao glifosato) e um gene que contribui para um fenótipo desejável na planta transgênica (por exemplo, rendimento aumentado, o metabolismo dos ácidos gordos alterada, ou a restauração da esterilidade masculina cítoplasmática).

Em algumas modalidades, uma planta transgênica ou semente que compreende um transgene que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional da presente invenção pode compreender um ou endógena do gene alvo no genoma nativo da planta transgênica, incluindo, sem limitação: um gene alvo endógeno para uma caraterística do metabolismo de ácidos gordos alterada, um gene alvo endógeno de uma caraterística de tolerância à seca, um gene alvo endógeno de uma caraterística eficiência azoto uso, ou qualquer outro gene alvo endógeno contribuindo para um fenótipo desejável na planta transgênica (por exemplo, o aumento de rendimento, ou restauração da esterilidade masculina citoplasmática). O gene alvo endógeno ou nativo pode ser operativamente ligado a uma sequência de nucleotídeos para a qual a proteína de fusão ativadora sintética transcricional se liga de uma maneira específica, o que afeta a transcrição do gene alvo. IX. A regulação da expressão de uma proteína de fusão ativadora transcricional Em algumas modalidades, uma proteína de fusão ativadora sintética transcricional que compreende pelo menos um motivo de interação planta TAD (e / ou o motivo de interação da variante TAD) e pelo menos um domínio de ligação de DNA pode ser utilizada com a finalidade de aumentar (por exemplo, iniciar) a expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, um gene de interesse) em uma célula. A sequência de nucleotídeos de interesse pode, em algumas modalidades ser endógeno ao genoma da célula, em outras modalidades, pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógeno (s) que compreende a sequência de nucleotídeos de interesse, foi introduzida na célula. Geralmente, uma segunda sequência de nucleotídeos ligada operativamente à sequência de nucleotídeos de interesse será reconhecido pelo domínio de ligação ao DNA da proteína de fusão, de tal modo que a ligação estável e específica entre a segunda sequência de nucleotídeos e a proteína de fusão pode ocorrer. Em alguns exemplos, a pelo menos uma molécula de ácido (s) nucleico (s) que compreende a sequência de nucleotídeos de interesse compreender ainda tal sequência de um segundo nucleotídeo. Em alguns exemplos, a pelo menos uma molécula de ácido (s) nucleico (s) que compreende a sequência de nucleotídeos de interesse são introduzidas na célula hospedeira, de tal forma que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligado operativamente a uma segunda sequência de nucleotídeos que é endógeno para a célula hospedeira. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de interesse pode facilitar a recombinação homóloga, que insere a sequência de nucleotídeos de interesse no genoma da célula hospedeira, de tal forma que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligado operativamente a uma sequência endógena que é reconhecido por um DNA domínio de ligação. Em alguns exemplos, a pelo menos uma molécula de ácido (s) nucleico (s) que compreende a sequência de nucleotí-deos de interesse é endógena ou nativo dentro da célula hospedeira, de tal forma que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligado operativamente a uma segunda sequência de nucleotídeos que é endógeno ao hospedeiro célula. A(s) sequência (s) nucleotídica (s) múltipla (s) de interesse, que são introduzidos em casos de transformação diferentes podem ser expressos sob o controle regulador de uma única proteína de fusão, em alguns e-xemplos. Em outros exemplos, uma única sequência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, um caso de integração único) é regulado e expressa. Em algumas modalidades, uma pluralidade de sequências de nucleotídeos de interesse pode ser regulada por meio da ligação de uma proteína de fusão da presente invenção a um único local de ligação de ácido nucleico, por exemplo, a pluralidade de sequências de nucleotídeos de interesse pode ser todo ligado operativamente à mesma sequência nucleotídica segundo a qual o domínio de ligação a DNA da proteína de fusão se liga de uma maneira específica. As sequências de nucleotídeos de interesse que compreende uma pluralidade tal não são necessariamente os mesmos, em determinados exemplos. Dessa maneira, vários produtos de genes diferentes, podem ser expressas sob o controle regulador de uma única proteína de fusão.

Em modalidades específicas, o produto da expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse, que está sob o controle regulador de uma proteína de fusão da presente invenção pode ser um produto do gene marcador, por exemplo e sem limitação, uma molécula fluorescente. Observações quantitativas e qualitativas sobre a expressão de tal expressão produto pode fornecer um sistema para avaliar as propriedades particulares de regulamentação de um motivo especial TAD interação ou variante TAD motivo de interação.

Qualquer produto de expressão (por exemplo, proteína, proteína precursora, e molécula de RNA inibitório) pode ser expresso sob o controle regulador de uma proteína de fusão ativadora transcricional sintético que compreende pelo menos um motivo de interação da planta TAD (e / ou o motivo de interação da variante TAD) e, pelo menos, um domínio de ligação ao D NA. Em exemplos particulares, um produto de expressão sob o controle regulador de uma proteína de fusão ativadora transcricional sintético pode ser, sem limitação, um polipeptídeo endógeno, ou nativa, que é normalmente expresso na célula hospedeira na qual um ácido nucleico codificando a proteína de fusão é introduzido. Em outros exemplos, um produto de expressão sob o controle regulador de uma proteína de fusão ativadora transcricional sintético pode ser um polipeptídeo heterólogo, que não é normalmente expresso na célula hospedeira. Por exemplo e sem limitação, um produto de expressão sob o controle regulador de uma proteína de fusão ativadora transcricional sintético pode ser um polipeptídeo envolvidos na resistência a herbicidas, resistência a vírus, resistência a agente patogênico, resistência a insetos, resistência a nemátodes, ou de resistência fúngíca. Vide, por exemplo, as Patentes US 5.569.823; 5.304.730; 5.495.071; 6.329.504 e 6.337.431. Um produto de expressão sob o controle regulador de uma proteína de fusão ativadora transcricional sintético pode ser De uma maneira alternativa, por exemplo, e sem limitação, um polipeptídeo envolvidos em vigor da planta ou o rendimento (incluindo os polipeptídeos envolvidos na tolerância a temperaturas extremas, condições do solo, os níveis de luz, os níveis de água , químicas e meio ambiente), ou um polipeptídeo que pode ser utilizado como um marcador para identificar uma planta que compreende um traço de interesse (por exemplo, um produto do gene marcador selecionável, e um polipeptídeo envolvidos na cor da semente).

Os exemplos não limitativos de polipeptídeos que podem estar sob o controle regulador de uma proteína de fusão ativadora transcricional sintético que compreende pelo menos um motivo de interação da planta TAD (e / ou o motivo de interação da variante TAD) e pelo menos um domínio de ligação de DNA em algumas modalidades da presente invenção, incluem: sintase acetolatase (ALS), esclerose lateral amiotrófica mutados, e precurso- res de ALS (vide, por exemplo, Patente U.S, 5.013.659); EPSPS (vide, por exemplo, as Patentes US 4.971.908 e 6.225.114), tal como um CP4 EPSPS ou uma classe III EPSPS; As enzimas que modificam um processo fisiológico que ocorre em um plasto, incluindo, por exemplo e sem limitação, a síntese da fotossíntese, e de ácidos gordos, aminoácidos, óleos, arotenoids, ter-penoides, e amido. Outros exemplos não limitativos de polipeptídeos que podem estar sob o controle regulador de uma proteína de fusão ativadora transcricional sintética em modalidades específicas incluem: zeaxantina e-poxidase, colina monooxigenase, ferroquelatase, omega - 3 dessaturase de ácido gordo, a glutamina - sintetase, amido de enzimas modificadoras, polipeptídeos envolvidos na síntese de aminoácidos essenciais, provitamina A, as hormonas, toxina Bt, e proteínas.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Identificação de Motivos de interação da transativa-ção da planta Sete proteínas foram identificadas como sendo homólogas ao domínio de transativação de VP16 (SEQ iD NO: 1): PTI4 (número de acesso GenBank ACF57857.1), ERF2 (número de acesso GenBank NP 199533.1), AtERFI (número de acesso GenBank NP 567530.4 ), ORCA2 (número de acesso GenBank CAB93940.1), DREB1A (número de acesso GenBank NP_567720.1), CBF1 (número de acesso GenBank NP_567721.1), e DOF1 (número de acesso GenBank NP_001105709.1). A sequência de aminoácidos do domínio de transativação de VP16 (SEQ ID NO: 1) similaridade de sequência partilhada com as regiões de estes ativadores de transcrição pu-tativos de plantas, e a sequência de VP16 foi usado para localizar um domínio de transativação, dentro de cada ativador. Os domínios de transativação identificadas para estas proteínas ativadoras de plantas são: SEQ ID NO: 2 (ΡΤΊ4), SEQ ID NO: 3 (ERF2), SEQ ID NO: 4 (AtERFI), SEQ ID NO: 5 (OR-CA2), SEQ ID NO : 6 (DREB1A), SEQ ID NO: 7 (CBF1), e SEQ ID NO: 8 (DOF1). Em seguida, o motivo de interação do VP16 da transativação do subdomínio II (Figura 1, SEQ ID NO: 9) foi utilizado para localizar um motivo de interação dos domínios de transativação de plantas. Figura 2 mostra um alinhamento de VP16 eom os domínios de transativação de plantas, em que os novos motivos de interação são realçados.

Exemplo 2: A modificação dos motivos de interação Identificados de domínios da transativação das plantas Os motivos de interação dos domínios identificados da transativação da planta foram modificados. Novas variantes de motivos de interação que continha os resíduos de aminoácidos de contato do motivo do subdomí-nio II interação do domínio de transativação de VP16 foram produzidos. Langlois et ai. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130:10596. Seis resíduos de ami-noácidos de contato do domínio de transativação VP16 são propostos para interagir de uma maneira direta com Tfb1, uma subunidade do fator de transcrição TFIIH. Figura 1. Os aminoácidos foram introduzidas dentro dos motivos dos domínios de interação de transativação recentemente identificadas de plantas para a produção de sequências variantes.

Foi colocada em questão a hipótese de que a modificação dos motivos de interação para conter os seis resíduos de aminoácidos identificados de contato a partir do motivo de interação VP16 do subdomínio II produziría motivos de interação modificadas dos ativadores de plantas capazes de interagir com uma maior variedade de fatores de transcrição, resultando assim em maiores níveis de a expressão da proteína.

Modificações ERF2. A região de Asn53 a Ala85 na ERF2 alinhada com o subdomínio II de VP16 domínio de transativação (Figura 2), e foi identificado como sendo a sequência do domínio de transativação de ERF2 planta. Modificações foram introduzidas na região que se verificou corresponder ao motivo de interação do subdomínio II do domínio de transativação de VP16, a partir de Asp66 Asp76. Os resíduos de aminoácido que eram diferentes dos seis resíduos de contato da interação motivo de subdomínio II do domínio de transativação de VP16 foram modificadas. Estas alterações resultaram em um motivo de interação exemplar modificado de ERF2 (isto é, uma variante da sequência motivo de interação) que é semelhante ao do subdomínio II do domínio de transativação de VP16. Figura 3.

Modificações aos Motivos de interação PTI4. AtERFI, ORCA2, DREB1A, CBF1, e DOF1 As modificações foram introduzidas na PTI4, AtERFI, ORCA2, DREB1A, CBF1 e DOF1 motivos de interação que são semelhantes àqueles introduzidos ERF2. Os resíduos de aminoácidos das sequências nativas que eram diferentes dos seis resíduos de contato direto do motivo do subdomínio II interação do domínio de transativação de VP16 foram modificadas, produzindo assim os motivos de interação exemplares variantes. Estas modificações foram introduzidas para tornar os motivos de interação das plantas semelhante as variantes (por exemplo, funcionalmente semelhante) ao do sub-domrnio II do domínio de transativação de VP16. Exemplos de sequências destes variantes ou motivos de interação modificadas, em comparação com a sequência nativa de interação motivo de subdomínio II do domínio de transativação de VP16, estão listados nas FIGs. 4-9, Exemplo 3: Testando os Motivos de Interação dos Domínios da planta de ativação em uma cepa de Repórter Saccharomyces cerevisiae Cepa repórter Saccharomyces cerevisiae. A cepa repórter Saccharomyces cerevisiae foi produzida com a finalidade de testar os domínios de ativação de planta que compreende ou motivos de interação nativa ou variante. Um procedimento de três etapas de clonagem resultou no constructo do vetor de integração de levedura, PhO -zBG - MEL1 (Figura 10).

Em primeiro lugar, dois fragmentos separados do vetor repórter de levedura SSA, pNorMEL.1 (Doyon et ai.. (2008) Nat. Biotechnol. 26 (6) :702 - 8), foram amplificadas via PCR. O primeiro fragmento continha uma cassete de expressão de levedura KanMX, e foi amplificado a partir pNor-MEL1 utilizando os inicíadores, KanMX - For (SEQ ÍD NO: 59) e KanMX -Rev (SEQ ID NO: 60), que adicionam 5 'Spel, BamHI, Nhel , Pacl, Bglíi, Kpnl, e 3 'locais de restrição EcoRI, respetivamente. O segundo fragmento continha virados para o exterior os braços de homologta com a levedura HO local (Voth et ai. (2001) Nucleic Acids Res. 29 (12):.. E59 - 9) separado por uma origem de replicação bateriana, e foi amplificado utilizando iniciadores, HO - For (SEQ ID NO: 61) e HO - Rev (SEQ ID NO: 62). Os dois fragmentos foram digeridos com EcoRI / Spel e ligados para gerar um vetor KanMX HO - alvo selecionável.

Em seguida, o cassete de expressão a partir de MEL1 pMEL1a2 (. Melcher et ai (2000) Gene 247 (1 - 2) :53 - 61) foi amplificado com MEL1 -For (SEQ ID NO: 63) e MEL1 - Rev (SEQ ID NO: 64) iniciadores, e clonado no local Kpnl do vetor KanMX HO - alvo selecionável.

Finalmente, uma proteína de dedo de zinco (ZFP) do local de ligação (designado por "TEM" local de elevada afinidade por) foi sintetizada de novo por meio de um fornecedor externo (DNA2.0, Menlo Park, CA). Este local contém locais de ligação para zinco - dedo Proteínas (ZFP), tendo o gene CCR5 humano (Perez et a/,. (2008) Nat. Biotechnol. 26:808 - 16). O fragmento de HAS foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores, TEM -For - F1 (SEQ ID NO: 65) e tem - For - R1 (SEQ ID NO: 66), e clonado nos locais BamHI - pacl da HO KanMX MEL1 vetor, localizado a montante do gene repórter MEL1. Este vetor final foi designado, PhO - zBG - MEL1 (Figura 10). PHO - zBG - MEL1 foi linearizado com Notl para expor os braços de homologia que flanqueiam para o direcionamento para a levedura HO local e transformado em cepa S. cerevisiae, BY4741 MATa (Invitrogen, Car-Isbad, CA), utilizando-se o protocolo sugerido pelo fabricante. Resumidamente, 3 ml_ de uma cultura em fase log BY4741 foi sedimentado, e lavadas em tampão TEL (10 mM de Tris HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM de acetato de lítio). A levedura de sedimento de células foi ressuspenso em 360μΙ de levedura solução de transformação (33,3% de PEG - 3350 (Sigma - Aldri-ch, St. Louis, MO), acetato de lítio 0,1 M (Sigma - Aldrich), e 0,2 mg / mL de DNA de esperma de salmão (Stratagene , La Jolla, CA) em 1X TE) contendo 3 mg de linearizado Pho - zBG - MEL1 e calor chocado durante 40 minutos a 42 ° C. As células de levedura foram sedimentadas, lavadas e cultivadas em meio rico durante 2 horas antes da seleção em placas de YPD contendo 1 mg / L ® Geneticin (Life Technologies, Carlsbad, CA). Os clones resisten- tes foram re - semeados em placas YPD + Geneticina ®, e utilizado para as transformações subsequentes.

Constructo cassete de expressão do Ativados Transcrictonal da Levedura ZFP DNA contendo um constructo em uma estrutura CCR5 da proteína do dedo de zinco de ligação (CCR5 - ZFP) - motivo de interação da transativação da planta foram construídos. As plantas nativas e a variante dos motivos de transativação de interação descrita nas SEG ID NOs :80 - 93 foram mobilizadas como um fragmento de enzima BamHI / Hindlll de restrição e clonado de uma maneira direta a jusante das sequências que codificam os domínios de CCR5 - ZFP {Perez et aí.. (2008), supra) . O resultante ZFP transcrição da cassete de expressão ativador utilizado um GAL1, 10 promotor (West et ai. (1987) Genes Dev. 1:1118 - 31.) E terminador CYC1 (Osborne et aí.. (1988) Genes Dev. 2:766 - 72. ), e foi baseado no vetor de levedura pRS315 série. Os vetores resultantes continham plantas nativas e variante motivos transativação de interação, como no quadro - fusões com o GCR5 - ZFP.

Além disso, os vários controles foram incluídos. Um controle do vetor vazio e de dois diferentes VP - 16 de transcrição ativadores, as cassetes de expressão SGMO VP16 - CCR5 (SEQ ID NO: 79) e de CCR5 CCR5 VP16v2, foram utilizados no estudo. Ambos os VP - 16 de transcrição cassetes de expressão ativador foram impulsionados pelo GAL1, 10, promotor e denunciado pelo terminador CYC1. O controle do vetor vazio continha apenas os domínios CCR5 - ZFP, e que não continha um motivo de interação transativação.

Ensaio da Atividade de levedura.

Culturas durante a noite da cepa repórter de linha BY4741 foram crescidas em YPD + Geneticina ®e 1 ug do vetor contendo a ZFP de transcrição da cassete de expressão ativador foi entregue usando um protocolo de transformação padrão de levedura em um formato de 96 poços. Todas as transformações foram duplicadas. As células de levedura transformadas foram recuperadas em meio sintético sem leucina Dextrose (SD - Leu) para ielecionar para o vetor que contém a transcrição ZFP - cassete de expres-ião ativador. Após 72 horas, as células de levedura foram enriquecidas por ima diluição de 1:10 dos transformantes em SD - Leu e cultivadas mais 24 loras. Em seguida, as células de levedura foram diluídas 1:10 em meio sin-ético sem leucina rafinose (SR - Leu) para de - reprimem a GAL1, 10 pro-notor. 24 horas depois, as células de levedura foram sedimentadas e res-uspensas em meio de galatose sintético sem leucina (SG - Leu). Em pon-ds de tempo de 0, 3, e 6 horas pós - indução de galatose, 110μΙ de células le levedura foram colhidas para ensaio de MEL1.

No ensaio MEL1, 100μΙ de 110pl de células de leveduras foram liluídas em 100 mL de água e a densidade óptica a 600 nm (OD600) foi de-arminada utilizando um espetrofotómetro. O restantes 10μΙ de células de evedura foram incubadas em 90μΙ de tampão MEL1 (77 mM Na2HP04, 61 nM de ácido cítrico, 2 mg / mL PNPG (Sigma - Aldrich)) durante 1 hora a !0 ° C. A reação foi parada pela adição de 100μΙ de Na2C03 1M. a atividade /IEL1 foi avaliada em DO405, e mU foram calculados utilizando uma fórmula ;om base na relação das medições DO405 e DO600 (Doyon et ai. (2008) Jat. BiotechnoL 26 (6) :702 - 8). O nível de expressão do gene repórter Mel1 que resultou da ativação dos diferentes motivos de plantas de transativação de interação é nostrado na Figura 11. A expressão da proteína MEL1 que resultou destas ilantas em diferentes motivos de interação de transativação foi comparada :om um controle do vetor vazio e a ativação de Mel1 do subdomínio II do lomínio de transativação de VP16 (SEQ ID NO: 1) (VP16 (v2) - CCR5) e >GMO VP16 (VP16 - SGMO CCR5). A modificação ERF2 (v2) motivo de interação de transativação Ia planta produziram níveis inesperadamente elevados de expressão, em :omparação com o controle de VP16. Além disso, a expressão de Mel1 com ísta variante motivo de interação planta transativação resultou em um au-nento em relação à versão do motivo de interação de transativação da plan-a ERF2 nativo (v3). A modificação ΡΤΙ4 (v2) motivo de interação de transativação da planta expressa a proteína MEL1 em níveis semelhantes ao controle de domínio de transativação VP16. No entanto, as modificações introduzidas no motivo de interação PTI4 resultou em níveis significativamente elevados de expressão Mel1, em comparação com o motivo de interação de transativação da planta PTI4 nativo (v3). O AtERFI (v3), AtERFI (v2), ORCA2 (v3), ORCA2 (v2), DOF1 (v3), DOF1 (v2), DREB1A (v3), DREB1A (v2), CBF1 (v3) e CBF1 (v2) motivos de plantas interação de transativação não resultou em altos níveis de expressão de Mel1, no ensaio de levedura, em comparação com os controles de VP16. No entanto, os AtERFI, DREB1A e CBF1 planta motivos interação transativação fez expressão unidade de Mel1 em levedura. Apenas o ORCA2 (v3) e DOF1 (v2) de motivos de interação de transativação das plantas não resultou em qualquer expressão de Mef1 no ensaio de levedura.

Os níveis de MEL1 produzidos pelo domínio de transativação de plantas para os motivos de plantas interação de transativação da variante modificada (v2) foram geralmente mais elevados, em comparação com os motivos de planta de transativação de interação nativos (v3) no ensaio de levedura Mel1. A única planta modificada motivo de interação transativação que não conduzir a expressão de MeUin o ensaio levedura foi o motivo DOF1 interação (v2). Este motivo de interação de transativação da planta não produziu qualquer expressão MEL1 no ensaio fermento.

Exemplo 4; Função de Motivos de Interação dos Domínios da planta de ativação em Tobacco Contendo um constructo Repórter que compreende um domínio de ligação ao DNA do dedo de zinco Constructo RepórterpDAB9897.

Oito repetições em tandem da sequência de poiinucleotídeo de Z6 domínio de ligação ao DNA (SEQ ID NO:67; Yokoi et al. (2007) Mol Ther 15 (11) :1917 23) foram sintetizados de novo (IDT, Coralsville, IA), com Saci I locais adicionado â extremidade 5 'e 3' para facilitar a clonagem de extremidades. O domínio 8X - Z6 de ligação completo (SEQ ID NO: 68) foi subsequentemente clonada em um pré - existentes de gateway de entrada ® vetor contendo elementos de expressão desejados da planta. Os locais de ligação 8X - Z6 foram mobilizados em um fragmento de Saci! e clonado imediatamente a montante do promotor de atina de Arabidopsis thaliana - 2 (v2 AtAt2 promotor,. An et al. (1996) Plant J. 10:107 - 21), utilizando um único Sacll local encontrado no vetor de espinha dorsal. Subsequentemente, o gene gus (gus; Jefferson (1989) Nature 342:837 - 8), foi clonado neste vetor sob o controle direto da A. thaliana de atina - 2 usando promotor de locais únicos Ncol / Saci, com o códon ATG do Ncol local da iniciação da formação do códon. Uma Atu ORF23 3'UTR (Agrobaterium tumefaciens moldura de leitura aberta - 23, região 3'untransiated; Pedido de Patente Européia No. EP 222,493 A1) foi usada para terminar a transcrição. O vetor de transformação final, pDAB9897 (Figura 12), foi o resultado de uma ligadura Gateway ® com um vetor contendo um promotor de destino A. thaliana da ubiquitina - 10 (Na Ubi10 Promotor v2 (Callis et al.. (1990) J. Biol. Chem. 265:12486 - 93)):: gene fosfinotricína acetil transferase (PAT v3 (Wohlleben et al.. (1988) Gene 70:25 - 37)) :: A. tumefaciens aberto quadro de leitura - 1, a região 3‘untranslated (AtuORFI 3'UTR v3 (Fluang et al.. (1990) J. Bateriol. 172:1814 - 22) cassete marcador selecionável para a seleção de plantas. O vetor de transformação final foi confirmado através de sequenciação, e transformados em cepa A. tumefaciens LBA4404 (Invitro-gen , Carlsbad, CA).

Transformação mediada por Agrobaterium de tabaco com pDAB9897.

Para fazer com que os casos repórter planta transgênica, os discos de folha (1 cm2) cortadas a partir de plantas de tabaco Petit Havana foram incubadas durante a noite em uma cultura de A. tumefaciens cepa LBA4404 abrigando pDAB9897 plasmídeo, crescidas a OD600 - 1,2 nm, secos com papel absorvente de papel de filtro estéril, e em seguida, colocado no meio MS (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS) e 30 g de sacarose / L, com a adição de 1 mg de ácido / L indolacético e 1 mg / L benzyamino purtna em 60 x 20 pratos mm (5 discos por placa) selado com Nescofilm ® (Karlan Research Produts Corporation, Cottonwood, AZ). Na sequência de 48 horas de co - cuitura, os discos foliares foram transferidos para o mesmo meio, com 250 mg / L cephotaxime e 5 mg / L BASTA ®.

Após 3-4 semanas, as plântulas foram transferidas para o meio MS com 250 mg / L cephotaxime e 10 mg / L em PhytaTrays BASTA ® durante um período adicional de 2 - 3 semanas antes da colheita e análise molecular folha. Número de cópias e Análise de Casos PTU Repórter.

Isolamento de DNA por PCR. Tecido de planta transgênica de tabaco foi colhido a partir de plântulas recém - crescidas e liofilizadas (Lab-conco, Kansas City, MO) durante pelo menos 2 dias em placas de 96 cavidades de recolha (Qiagen, Valencia, CA). O DNA foi em seguida isolado u-sando um kit de extração Dneasy ™ de 96 cavidades (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Um modelo 2 - 96A Kleco ™ tecido pulverizador (Garcia Manufaturing, Visalia, CA) foi utilizado para rompimento do tecido.

Isolamento do DNA do sul. Tecido de planta transgênica de tabaco foi colhido a partir de recém - crescidos plântulas e liofilizadas (Lab-conco, Kansas City, MO) durante pelo menos 2 dias, em tubos de 2 ml (Ep-pendorf). O DNA foi em seguida isolado usando um Mini Kit de extração de Planta Dneasy ™ (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Um modelo de tecido pulverizador 2 - 96A Kleco ™ (Garcia Manufaturing) foi utilizado para rompimento do tecido. A quantificação de DNA. DNA genômieo resultante foi quantificado utilizando um kit de ensaio Quant - iT ™ PicoGreen ® DNA (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). Cinco padrões de DNA pré - quantificados variando de 20 ng / mL a 1,25 ng / mL (diluídos em série) foram utilizados para a geração da curva padrão. As amostras foram primeiro diluídas com diluições 1:10 ou 1:20 para estar dentro do intervalo linear do ensaio, as concentrações de DNA genômieo foram determinadas de acordo com o protocolo do fabricante. A fluorescência foi então gravada utilizando um leitor de placas de Synergy2 ™ (Biotek, Winooski, VT). Concentração de DNA genô-mico foi estimada a partir de uma curva padrão, calculado a partir de correções de fluorescência de fundo. Usando TE ou água, O DNA foi então diluído para uma concentração comum de 10 ng / mL para a RCP, utilizando um manipulador de líquidos Biorobot3000 ™ automatizado (Qiagen). DNA para análise de Southern foi deixado sem diluição.

Estimativa de Número de Cópia. Putativas casos transgênicos foram analisadas para a complexidade da integração de DNA usando um ensaio multiplexado sonda de hidrólise análogo ao ensaio ® TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). O número de cópias do inserto do transgene foi estimado usando-se os iniciadores específicos de sequência e sondas, tanto para o transgene pat e um gene de referência endógeno tabaco, pal (fenilalanina liase de amónío; GenBank N° AB008199 Adesão). Os ensaios para os dois genes foram desenhados utilizando o LightCycler ® Design Probe Software 2.0 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). PCR em tempo real para os dois genes foi avaliado utilizando o LightCycler ® 480 system (Roche Applied Science).

Para a amplificação, LightCycler ® 480 Probes Mestre mix (Roche Applied Science) foi preparado a uma concentração final de 1X em uma reação multiplex 10pl de volume, contendo 0,4 uM de cada iniciador e 0,2 uM de cada sonda. Tabela 1. A reação de amplificação em dois passos foi realizada com uma extensão a 58 ° C durante 38 segundos, com a na presente invençãosição de fluorescência. Todas as amostras foram corridas em triplicado e os valores médios de T foram usados para a análise de cada amostra. Análise dos dados de PCR em tempo real foi realizado utilizando software LightCycler ® (Roche Applied Science) através do módulo relativo quant, e baseia-se no método ΔΔΤ. Uma amostra de gDNA de um calibrador de cópia única foi incluída para normalizar os resultados. O caso calibrador única cópia foi previamente identificado por análise de Southern, e foi confirmada a presença da inserção de um única gene pat.

Tabela 1. Sequências dos iniciadores e sondas utilizadas tanto nos ensaios das sondas de hidrólise pat e pal (HP). O epitopo de fluorescência de cada sonda foi diferente, o que permitiu que os ensaios viessem a ser executados simultaneamente como uma reação multiplexada._ PTU PCR. Casos de pouca cópia foram subsequentemente pesquisados por PCR para as unidades de transcrição das plantas íntatas (PTU). Usando o Blu636 (SEQ ID NO: 75) e Blu637 (SEQ ID NO: 76) inicia-dores, a amplificação correta resultou em um produto de 3,7 kb constituído pelo PTU Z6 - At2 / gus / AtORF23 (3771 pb). Phusion® GC Mix Master (New Engiand Biolabs, Beverley, MA) foi utilizado com as seguintes condições de reação; 98°C durante 30 segundos, seguido por 30 ciclos de 98°C durante 10 segundos, 67CC durante 30 segundos, 72°C durante 2 minutos e uma extensão final de 72°C durante 10 minutos. Além da reação de PCR PTU detalhado acima, a amplificação de um gene endógeno, chs (chalcona sintase; Genbank No. de acesso FJ969391.1), foi também incluído para confirmar a qualidade dos modelos de DNA genômico. 3'CHS Avançado (SEQ ID NO: 77) e reversa 3'CHS (SEQ ID NO: 78) iniciadores foram incluídos na reação, que produziu um produto de amplificação de 350 pb. 20 reaçõespl foram utilizados, com uma concentração final de 0,5 uM para os iniciadores de transgenes e 0,2 uM para o gene de referência endógeno.

Análise Southern. Para cada amostra, 5 ug de DNA genômico foi completamente digerido com a enzima de restrição, Asei (New Engiand Biolabs), por incubação a 37“C durante a noite. O DNA digerido foi concentrado por precipitação com rápida Precip Solução ™ (Edge Biosystems, Gaithers-burg, MD), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA genômico foi então ressuspenso em 25pl de água a 65°C durante 1 hora. As amostras ressuspensas foram carregados em um gel de agarose a 0,8%, preparado em tampão TAE 1X, e submetidas a eletroforese durante a noite a 1,1 V / cm em 1X TAE. O gel foi imerso em tampão de desnaturação (0,2 M NaOH / 0.6 M NaCI) durante 30 minutos, seguindo-se a imersão em tampão de neutralização (0,5 M Tris - HCI (pH 7,5) / NaCI 1,5 M) durante 30 minu- tos.

Transferência de fragmentos de DNA para membranas de náilon foi realizada por passivamente wicking 20X tampão SSC durante a noite a-través do gel sobre Immobilan ™ tratado - NY + transferência de membrana (Millipore, Billerica, MA), utilizando uma mecha de papel de cromatografia e toalhas de papel. Transferência seguinte, a membrana foi brevemente lavado com 2X SSC, de ligação cruzada com o Stratalinker ® 1800 (Stratagene, LaJolla, CA), e cozida a vácuo a 80°C durante 3 horas.

As membranas foram incubadas com solução de pré - hibridação (PerfetHyb ™ plus, Sigma - Aldrich) durante 1 hora a 65°C em garrafas de vidro, utilizando um rolo Robbins Scientific Modelo 400 hibridação incubadora (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). As sondas foram preparadas a partir de um fragmento de PCR contendo a sequência de codificação inteira. O fragmento amplificado por PCR foi purificado utilizando Qiaex II ® gel extração kit (Qiagen), e marcadas com [a32P] dTP através do Aleatório Prime RT - iT rotulagem ® Kit (Stratagene, La Jolla, CA). As manchas foram hibridiza-das durante a noite a 65°C com uma sonda desnaturada adicionado de uma maneira direta à solução de hibridação pré - de cerca de 2 milhões de contagens blot - 1 mL - 1. Hibridação a seguir, blots foram sequencialmente lavados a 65°C com 0,1 X de SDS SSC / 0,1% durante 40 minutos. Finalmente, as transferências foram expostos a telas de armazenamento de fósforo de imagem, e fotografada usando um Dinâmica Molecular ™ Storm ™ sistema de imagem 860. Verdadeiros casos de integração de cópia única foi confirmada pela identificação de uma única banda de hibridação.

Geração de homoziqotos Plantas Repórter T2, Um total de 51 plantas Basta ® resistentes foram gerados, dos quais 24 foram consideradas de baixa complexidade (1-2 cópias de pat) com base na análise de hidrólise da sonda de número de cópia. Estes casos de baixa complexidade, 18 mostraram PTU intactos, conforme determinado por análise de PCR. Após a análise de Southern blot, dois única cópia, casos intatas PTU foram selecionados e cresceu para a maturidade na estufa, onde eles foram autorizados a auto - polinização. Sementes T1 foi então re- colhido, a superfície esterilizada (por 3 min em lixívia a 20%, seguida por duas lavagens de água estéril, destilada), e germinadas em meio MS (Phyto-technology Labs, Shawnee Mission, KS) e 30 g de sacarose / L em Phyta-Trays ™ (Sigma, St. Louis, MO). Triagem zigosidade seguinte via pat análise do número de cópias, homozigotas T1 foram selecionados, cresceu para a maturidade na estufa, e permitiu a auto - polinização. Semente T2 foi então recolhido, a superfície esterilizada e germinadas tal como descrito anteriormente, e utilizadas para gerar plantas repórter para testes de transativação planta.

Plantas ZFP - Constructo de expressão de ativador trancicional de planta.

Constructos de plantas ZFP transcrição - ativador contendo um motivo de interação transativação da planta variante ou nativo foram construídos. Motivos de interação de transativação das plantas (variantes nativos e modificados) flanqueados pelos locais de enzimas de restrição BamHI / Saci para a clonagem foram sintetizados de novo (DNA2.0, Menlo Park, CA). Os motivos de interação de transativação das plantas foram mobilizados com um fragmento BamHI / Saci, clonado e imediatamente a jusante do domínio de DNA Z6 zinco dedo de ligação (Yokoi et ai. (2007), supra) utilizando um único BamHI / Saci sites encontrados em um Gateway existente ® Entry vetor backbone. Após a conclusão desta fase, os constructos ativadores de transcrição ZFP (contendo um domínio de zinco Z6 DNA proteína de dedo de ligação fundido com o motivo de interação planta transativação), foram colocados sob o controle do promotor de mandioca Vein constitutiva do vírus mosaico (promotor CsVMV v2; Verdaguer et Plant Mol. Biol al. (1996). Biol. 31:1129 - 39), e terminado com a 3'UTR ORF23 de A. tumefaciens. Vetores de transformação finais (Tabela 2), resultou de um Gateway ® mediado por ligação (Invitrogen, Carlsbad, CA) com um vetor contendo um destino A. tha-liana promotor da ubiquitina - 3 (No Ubi3 promotor v2; Callís et al. (1995) Genetics. , 139 (2) :921 - 39)) / higromicina fosfotransferase II (HPTII v1, Gritz et al. (1983) Gene 25 (2 - 3) :179 - 88) / A. tumefaciens abrir de 24 quadros de leitura, região 3 ’ não traduzida (3’UTR Atu ORF24 v2) cassete utilizado para a seleção das plantas.

Tabela 2. Planta ZFP - constructos ativadores de transcrição testados no tabaco. O identificador de sequência proporciona a sequência de DNA do motivo de interação da transativação de planta que foi fundida com a proteína de dedo de zinco de liaacão Z6 e expressa no vetor binário. O vetor binário final foi confirmado através de sequenciação de DNA e transformado em A. tumefaciens cepa LBA4404 (Invitrogen). Além disso, um controle de vetor pDAB106238 (Figura 21), que contém o domínio de ligação de zinco localizador e não inclui um composto ativador do motivo de interação transativação, foi incluído. Neste constructo, o domínio de dedo de zinco de ligação foi colocada sob o controle do promotor constitutivo A. tumefaciens MAS (AtuMas promotor v4; Patentes dos EUA Nos 5.001.060; 5.573.932 e 5.290.924), e terminado com a 3’UTR ORF23 de A. tumefaciens . Além disso, o vetor contém a A. thaliana ubiquitina - 3 promotorIhigromicina - fosfotransferase USA, tumefaciens abrir de 24 quadros de leitura, 3 'cassete região não traduzida utilizado para a seleção das plantas.

Com a finalidade de produzir acontecimentos de plantas que contêm os constructos ativadores de transcrição ZFP, discos de folha (1 cm2) cortados a partir de plantas de tabaco repórter T2 foram incubadas durante a noite em uma cultura de A. tumefaciens cepa LBA4404 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que abrigam um dos 16 plasmídeos enumerados na Tabela 2, crescidas a OD600 ~ 1,2 nm, secos com papel absorvente de papel de filtro estéril e em seguida, colocados em meio MS (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS) e 30 g / L de sacarose, com a adição de 1 mg / L ácido indolacético e 1 mg / L benzyamíno purina em 60 x 20 pratos mm (5 discos por placa) selado com Nescofilm ® (Karlan Research Produts Corporation, Cottonwood, AZ). Na sequência de 48 horas de co - cultura, os discos foliares foram transferidos para o mesmo meio, com 250 mg / L e 10 cepho-taxime higromicina mg / L. Após 3-4 semanas, as plântulas foram transferidas para o meio MS com 250 mg / L e 10 cephotaxime higromicina mg / L em PhytaTrays ™ para um adicional de 2 - 3 semanas, seguido de colheita das folhas e análise de expressão gus. Um total de 20 - 30 acontecimentos de plantas foram gerados para cada uma dos 16 constructos ativadores de trascrição de planta.

Análise de expressão gus Isolamento de mRNA. Tecido de planta transgênica tabaco foi colhido a partir de plântulas recém-crescentes e rapidamente congelados em gelo seco, em placas de 96 cavidades de recolha (Qiagen). O RNA foi então isolado utilizando o RNeasy ® extração de 96 poços kit (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Um modelo 2 - 96A Kleco ™ tecido pulverizador (Garcia Manufaturíng) foi utilizado para rompimento do tecido.

Quantificação do RNA. MRNA resultante foi quantificado utilizando um espetrofotómetro NanoDrop ™ 8000 (Thermo Scientific, Wilming-ton, DE). Cada poço foi inibida com 4 água sem RNasepl antes do carregamento e quantificar 4pi de amostras não diluídas. A concentração de ARNm foi estimada a partir NanoDrop ™ 8000 software, utilizando o padrão de RNA método de medição do ácido nucleico. mRNA foi mão - diluído com RNase água livre para ~ 83 ng / mL.

Preparação do cDNA. cDNA foi preparada a partir de ARNm utilizando o Quantitet diluída ® RT kit (Qiagen, Carlsbad, CA), seguindo as instruções do fabricante. 1 pg de mRNA total foi utilizado em cada reação. Após a conclusão, o cDNA foi armazenado a - 20 ° C até a análise foi completada. RT - PCR. Acontecimentos selecionados em higromicina foram analisadas para os níveis de transcrição do gene gus utilizando dois ensaios de hidrólise de DNA sonda, ambas as quais são análogas aos ensaios Taq-Man ®. Níveis estáveis de gus mRNA para cada caso foram estimadas utilizando sequência de inciadors específicos e sondas. O mRNA foi normalizada utilizando o nível de estado estacionário de mRNA de um gene endógeno de tabaco de referência, BYEEF (Genbank No. de acesso Gl. 927382). Ensaios para ambos os genes foram projetados usando LightCycler ® Design Sonda Software 2.0 (Roche Applied Science). PCR em tempo real para os dois genes foi avaliada utilizando o LightCycler ® 480 sistema. Para a amplificação gus, LightCycler Master Mix ® 480 Probes foi preparada a uma concentração final de 1X em uma reação multiplex 10μΙ de volume, contendo 0,4 uM de cada iniciador e 0,2 uM de sonda. Tabela 3. A reação de amplificação em duas etapas foi realizada com uma extensão a 56°C durante 40 segundos, com a na presente invençãosição de fluorescência. Todas as amostras não diluídas foram executadas em triplicado, e os valores médios de T foram usados para a análise de cada amostra. Para a amplificação BYEEF, LightCycler Master Mix ® 480 Probes foi preparada a uma concentração final de 1X em uma reação multiplex 10μΙ de volume contendo 0,25 uM de cada iniciador (Tabela 3) e 0,1 uM de sonda UPL 119 (Roche Applied Science). A reação de amplificação em dois passos foi realizada com uma extensão a 58°C durante 25 segundos, com a na presente invençãosição de fluorescência. Todas as amostras foram diluídas 1:10 executado em triplicado, e os valores médios de T foram usados para a análise de cada amostra. Análise dos dados de PCR em tempo real foi realizado utilizando software LightCycler ® utilizando o módulo relativo quant, e baseia-se no método AACt. Níveis de expressão relativa entre os diferentes tra- tarnentos de transcrição ativadores de plantas foram então comparados. Figura 29.

Tabela 3. Sequências dos iniciadores e sondas utilizados nos pn<5£>inc: Hp «snnHn Ha hirlrAli«A íHPl n nus fi RYFFF

Resultados. A Figura 29 mostra uma relação resultante dos níveis de transcrição gus para as diferentes plantas motivos de transativação de interação, como por normalizaram os níveis de expressão de genes endógenos BYE-EF. A ativação do gene gus a partir de plantas dos diferentes motivos de interação de transativação foi comparada com um controle de vetor vazio, e o motivo do subdomínio II interação do domínio de transativação de VP16 Várias das plantas motivos interação transativação mostraram níveis inesperadamente elevados de expressão em comparação com subdomínio II do transativador VP16. Por exemplo, os PTI4, DREB1A, ERF2 e CBF1 planta motivos interação transativação expressa mais do que mRNA gus subdomínio II do domínio de ativação de VP16 de transcrição.

Os níveis de ARNm produzidos pelo motivo de interação planta de transativação para a variante modificada (v2), em comparação com a versão nativa (v3) variou entre os motivos de interação de transativação das plantas. A versão modificada do ERF2 motivo de interação planta transativação produziram significativamente mais do que o mRNA gus motivo de interação de sequência nativa ERF2, Da mesma forma, a modificação CBF1 motivo de interação de transativação da planta produziu mais de ARNm do que a interação motivo de sequência nativa CBF1. Por outro lado, as modificações introduzidas na PTI4 e motivo de interação DREB1A transativação resultou na produção de níveis mais baixos de ARNm de gus, em compara- ção com as versões nativas de plantas e PI 14 DREB1A motivos de interação de transativação.

Exemplo 5: Função do Motivo de Interação em Tabaco Contendo um constructo Repórter GAL4 Unha de tabaco contendo um constructo repórter Composto de um domínio de ligação GAL4.

Um constructo repórter, pGalGUS, é construído usando a estratégia descrita abaixo. Seis repetições em tandem da sequência de ligação a GAL4 de levedura e 23 das regiões espaçadoras pb (tal como descrito no Baleja et a/.. (1997) J. Biomol. NMR 10:397 - 401) são sintetizados de novo (IDT) com os locais Sacll acrescentado para faciíitar a clonagem . Os locais de ligação de Gal4 6X são mobilizadas em um fragmento Sacíl, e são usados para substituir os locais de ligação Z6 de um vetor de entrada pré - existente que é também digerido com Sacll. Este passo de clonagem coloca os locais de ligação GAL4 imediatamente a montante do promotor de atina de Arabidopsis 2, que dirige a expressão do gene gus. O vetor de transformação final, pGalGUS (Figura 30), os resultados de uma reação de transformação Gateway ® com um vetor contendo um destino Arabidopsis UbiquitinlQ promotor - pat cassete de expressão do gene, o qual é usado para a seleção de plantas. O vetor de transformação final é confirmado através de sequência ção, e transformado na cepa A. tumefaciens LBA4404 (Invitrogen). Transformação mediada por Aqrobaterium de tabaco com oGALat/s.

As plantas transgênicas repórter são feitas utilizando o protocolo descrito acima. Ver "transformação mediada por Agrobaterium de tabaco com pDAB9897". Número de cópias e Análise PTU de Casos Repórter.

As plantas transgênicas resistentes a BASTA ® com número de cópias de baixa complexidade, são geradas e identificadas com base na a-nálise do número de TaqMan ® cópia, Dos casos de baixa complexidade, um subconjunto exibe um PTU intacto, conforme determinado por análise de PGR. Estes casos são analisados através de análise de mancha de Southern. Após a análise de transferência de Southern, pelo menos, uma cópia única, caso PTU intato é selecionado e cultivadas até à maturidade em uma estufa, e é permitida a auto - polinização. As sementes T1 são coletadas, esterilizadas superfíçialmente e germinadas. Após triagem zigosídade através da análise do número de cópias pat, homozigotos plantas T1 são selecionados, cresceu para a maturidade na estufa, e permitiu a auto - polinização. Semente T2 é então recolhida, a superfície esterilizada e germinada (como descrito anteriormente), e é usada para gerar plantas de ensaio repórter ativador.

Plantas GAL4 - Constructos de expressão Ativadores transcricionais.

Os constructos de expressão ativadores transcricionais da Planta GAL4 contendo uma variante ou uma planta nativa motivo de interação transativação são construídos. Os constructos de expressão de ativadores de transcrição ZFP de planta descritos no Exemplo 4 (''Constructos de expressão de ativadores transcricionais de planta ZFP de planta") são modificados pela inserção de uma sequência polinucleotídica de oAL4 proteína de ligação no lugar do zinco sequência polinucleotídica Dedo Binding Protein. A planta hemícot otimizado GAL4 DNA sequência polinucleotídica domínio de ligação (Keegan et a!,. (1986) Science 231 (4739) :699 - 704) é inserido no lugar do zinco sequência polinucleotídica Dedo Binding Protein como um fragmento Ncol/BamHI. Após a conclusão desta fase, o constructo ativador de transcrição GALA é colocado sob o controle do promotor constitutivo da veia da mandioca Mosaic Virus, e terminou com o 3'UTR ORF23 de A. tume-faciens. Vetores de transformação binários finais são completadas, resultante de uma passagem de transformação ® com um vetor contendo uma cassete de destino UbiquitinS - Hptll Arabidopsis para a seleção de plantas. O vetor de transformação final é confirmado através de sequenciação, e transformados em A, tumefaciens cepa LBA4404 (Invitrogen).

Com a finalidade de produzir acontecimentos de plantas que contêm uma unidade de constructo ativador transcrição GAL4, o protocolo de transformação transiente descrito no Exemplo 4 é utilizado. Um total de 20 - 30 acontecimentos de plantas são gerados para cada um dos 16 cons-trutos ativadores de transcrição GAL4.

Análise de expressão gus. I / Acontecimentos selecionados em higromicina são analisados para os níveis de transcrição do gene gus utilizando dois ensaios com sondas de DNA de hidrólise. Os níveis de estado estacionário do mRNA gus para cada caso individual são estimados utilizando inciadors de sequências específicas e uma sonda. O mRNA para cada caso é normalizado usando o nível de estado estacionário de mRNA de um gene endógeno de tabaco de referência, por exemplo, BYEEF. Os ensaios para os dois genes foram concebidos utilizando o protocolo descrito no Exemplo 4. Análise de PCR em tempo real de dados é executada utilizando software LightCycler ® utilizando o módulo relativo quant, e baseia-se no método AACt. Níveis de expressão relativa para as diferentes constructos de ativadores são comparados. Os resultados indicam que os motivos de plantas transativação de interação e as variantes de engenharia destos motivos de interação de transativação das plantas pode ser utilizado como ativadores de transcrição, e pode ser fundida com uma proteína de ligação a GAL4 para a ativação da transcrição de um gene.

Exemplo 6: Função do Motivo de interação em Tabaco Contendo um constructo Repórter TAL

Linha de tabaco contendo umconstructo repórter Composto de um domínio de ligação a TAL.

Um constructo repórter, pTalGUS, é construído usando a estratégia descrita abaixo. Oito repetições em tandem (TATATAAACTNNCCTT sequências (SEQ ID NO: 99)), tomada a partir da sequência de consenso de ligação de AVRBS3 induzíveis por genes, e denominado o domínio de ligação a DNA UPA (Kay et al. (2009) Plant J. 59 (6):. 859 - 71), são sintetizados de novo (IDT) com os locais Saci! acrescentado para facilitar a clonagem. Os locais de ligação são 8X UPA mobilizada em um fragmento Sacll, e são usados para substituir os locais de ligação de Z6 um vetor de entrada pré -existente, que é também digerido com Sacll. Este passo de clonagem coloca os locais de ligação da UPA imediatamente a montante do promotor de atina de Arabidopsis 2, que dirige a expressão do gene gus. O vetor de transfor- mação final, pTalGUS (Figura 31), os resultados de uma reação de transformação Gateway ® com um vetor contendo um destino A, thaliana Ubiqui-tin10 promotor / gene pat cassete de expressão, que é utilizado para a seleção de plantas. O vetor de transformação final é confirmado através de se-quenciação e transformado em A. tumefaciens cepa LBA4404 (Invitrogen). Transformação mediada por Agrobaterium de tabaco com pTALgus.

Plantas transgênicas repórter são feitas utilizando o protocolo descrito acima. Vide "transformação mediada por Agrobaterium de tabaco com pDAB9897".

Numero de cópias e Análise de Casos PTU Repórter.

As plantas transgênicas resistentes a BASTA ® com número de cópias de baixa complexidade são geradas e identificadas utilizando uma análise de número de cópia TaqMan ®. Dos casos de baixa complexidade, um subconjunto exibe um PTU intato, conforme determinado por análise de PCR. Estes casos são analisados através de análise de mancha de Southern. Após a análise de Southern blot, pelo menos um exemplar único, caso PTU intata é selecionado e cresceu para a maturidade em uma estufa, e é permitida a autopolinização. Semente T1 são coietadas, esterilizadas superficialmente e germinadas. Após triagem zigosidade via pat análise do número de cópias, homozigotos plantas T1 são selecionados, cresceu para a maturidade na estufa, e permitiu a auto - polinização. Semente T2 é então recolhida, a superfície esterilizada e germinada (como descrito anteriormente), e é usada para gerar plantas de ensaio repórter ativador.

Plantas TAL - Constructos de expressão Ativadores transcricionais Constructos de expressão ativadores transcricionais contendo um motivo de interação de transativação da planta variante ou nativa são construídos. A planta de transcrição ZFP de constructos de expressão de ativadores transcricionais descritas no Exemplo 4 são modificados através da inserção de uma sequência de polinucleotídeo TAL proteína de ligação no lugar do zinco sequência polinucleotídica Dedo Binding Protein. Os 17,5 repete TAL que são necessários para a ligação de DNA são sintetizados de novo, e fundido a um Zea mays opaco - 2 sequência de localização nuclear (Van Eenennaam et al. (2004) Engenharia Metabólíca 6:101 - 8). A sequên-cia de cada domínio utiliza diferentes aminoácidos nos resíduos variáveis (12 e 13 de posição) para ditar de ligação ao DNA, tal como previsto para a sequência de consenso UPA - box. Boch et al.. (2009) Ciência 326 (5959) : 1509 - 12. A planta hemicot otimizado TAL DNA sequência polinucleotídica domínio de ligação é inserido no lugar do zinco sequência polinucleotídica Dedo Binding Protein como um fragmento Ncol / BamHI. Após a conclusão desta fase, a transcrição TAL - constructo ativador é colocado sob o controle do promotor constitutivo da veia da mandioca Mosaic Virus, e terminou com o 3'UTR ORF23 de A. tumefaciens. Vetores de transformação finais são concluídos a partir de um gateway transformação com um vetor de destino contendo uma Arabidopsis cassete 3 - Hptll Ubiquitina para seleção de plantas. O vetor de transformação final é confirmado através de sequenciação e transformadona cepa A. tumefaciens LBA4404 (Invitrogen).

Com a finalidade de produzir acontecimentos de plantas que contêm uma unidade de constructos de expressão de ativadores transcricio-nais da planta TAL, o protocolo de transformação transiente descrito no E-xemplo 4 é utilizado. Um total de 20 - 30 acontecimentos de plantas são gerados para cada um dos 16 constructos de ativadores de transcrição TAL. Análise de expressão gus.

Acontecimentos selecionados em higromicina são analisados para os níveis de transcrição do gene gus utilizando dois ensaios com sondas de DNA de hidrólise. Os níveis de estado estacionário do mRNA gus para cada caso individual são estimados utilizando inciadores de sequências específicas e uma sonda. O mRNA é normalizado utilizando o nível de estado estacionário de mRNA de um gene endógeno de tabaco de referência, por exemplo, BYEEF. Os ensaios para os dois genes foram concebidos utilizando o protocolo descrito no Exemplo 4. Análise de PCR em tempo real de dados é executada utilizando software LightCycler ® utilizando o módulo relativo, e baseia-se no método AACt. Os níveis de expressão relativos para as diferentes constructos de ativadores são comparados.

Claims

1. Proteína de fusão do ativador transcricional sintético que compreende: um polipeptídeo de iígação ao DNA, e um polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transati-vação selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NOs :10 a 58.

2. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo de ligação ao DNA é selecionado de entre o grupo que consiste em um dedo de zinco do domínio de ligação ao DNA, uma sequência de consenso de ligação a partir de um gene induzível AVRBS3 ou a sequência de ligação sintética de engenharia dos mesmos; GAL4; TAL; LexA, um repressor tet; LACR, e um receptor de hormona esteroide.

3. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de fusão compreende pelo menos um polipeptídeo de ligação ao DNA adicional.

4. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína de fusão transcricional de ativador compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO :2 a 8 e SEQ ID NO :100 a 120.

5. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transativação é selecionado de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs :10-16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 58.

6. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transativação é selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 53.

7. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transativação é selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48 e SEQ ID NO: 54.

8. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transativação é selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 55.

9. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transativação é selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50 e SEQ ID NO: 56.

10. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de a-cordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transativação é selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 57.

11. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de a-cordo com a reivindicação 1, em que a proteína de fusão compreende pelo menos um polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transativação.

12. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional que aumenta a expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse quando a sequência de nucleotídeos de interesse está ligada operativamente a uma segunda sequência de nucleotídeos, a proteína de fusão que compreende: Um polipeptídeo de ligação ao DNA que se liga especificamente à segunda sequência de nucleotídeos; e um polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transativação selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :10 a 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 58.

13. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional que compreende: um polipeptídeo de ligação ao DNA, e um polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transati-vação possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :10 a 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 58.

14. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de a-cordo com a reivindicação 13, em que polipeptídeo de interação do domínio de transativação tem pelo menos 85% da identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :10 a 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 58.

15. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de a-cordo com a reivindicação 13, em que o polipeptídeo de interação do domínio de transativação tem pelo menos 90% da identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :10-16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 58.

16. Proteína de fusão do ativador sintético transcricional de a-cordo com a reivindicação 13, em que o polipeptídeo de interação do domínio de transativação de polipeptídeo tem pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :10 a 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 58.

17. Ácido nucleico que codifica para uma Proteína de fusão do ativador sintético transcricional, o ácido nucleico que compreende: uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ligação ao DNA, e uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um po- lipeptídeo de interação do domínio de transativação selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :10 a 58, em que as primeira e segunda sequências polinucleotídicas são expressas a partir do ácido nucieico na estrutura e, em um único transcrito.

18. Ácido nucieico de acordo com a reivindicação 17, em que o ácido nucieico compreende pelo menos uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo adicional de ligação ao DNA.

19. Ácido nucieico de acordo com a reivindicação 17, em que o ácido nucieico compreende pelo menos uma sequência polinucleotídica que codifica uma interação adicional de domínio de transativação polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :10 a 58.

20. Ácido nucieico de acordo com a reivindicação 17, em que as primeira e segunda sequências polinucleotídicas são operativamente ligadas a um elemento de gene regulador.

21. Ácido nucieico de acordo com a reivindicação 17, em que as primeira e segunda sequências polinucleotídicas são separadas por meio de uma terceira sequência polinucleotídica.

22. Ácido nucieico de acordo com a reivindicação 17, em que o ácido nucieico está integrado no genoma de uma célula hospedeira.

23. Ácido nucieico de acordo com a reivindicação 22, em que a célula hospedeira é uma célula de planta.

24. Ácido nucieico de acordo com a reivindicação 17, em que o polipeptídeo de ligação ao DNA é selecionado de entre o grupo que consiste em um dedo de zinco do domínio de ligação ao DNA, uma sequência de consenso de ligação a partir de um gene induzível AVRBS3 ou sequência de ligação sintética de engenharia dos mesmos; GAL4; TAL; LexA, um repres-sor tet; LACR, e um receptor de hormona esteroide.

25. Ácido nucieico de acordo com a reivindicação 24, em que o polipeptídeo de ligação ao DNA se liga especificamente a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 67, SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO; 99.

26. Vetor que compreende o ácido nucieico como definido na reivindicação 17.

27. Vetor de acordo com a reivindicação 26, em que o vetor compreende um marcador de seleção ou um marcador de tela.

28. Vetor de acordo com a reivindicação 26, em que o vetor é um vetor de expressão da planta.

29. Ácido nucleico que codifica para uma Proteína de fusão do ativador sintético transcricional, o ácido nucleico que compreende: uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um poli-peptídeo de ligação ao DNA, e uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um po-lipeptídeo de interação do domínio de transativação possuindo de pelo menos 80% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO .2 a 8, SEQ ID NOS: 10 a 16, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NOs: 100, 120, em que as primeira e segunda sequências polinucleotídicas são expressas a partir do ácido nucleico de estrutura e, em um único transcrito.

30. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 29, em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 80 a 93.

31. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 29, em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 80 a 93.

32. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 29, em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 80 a 93.

33. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 29, em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 95% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 80 a 93.

34. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 29, em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 97% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 80 a 93.

35. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 29, em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 98% de identidade com uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 80 a 93.

36. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 29, em que o ácido nucleico compreende uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 80 a 93.

37. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 29, em que o polipeptídeo de ligação ao DNA é selecionado de entre o grupo que consiste em um dedo de zinco do domínio de ligação ao DNA, uma sequência de consenso de ligação a partir de um gene induzível AVRBS3 ou a sequência de ligação sintética de engenharia dos mesmos; GAL4; TAL; LexA, um re-pressor tet; LACR, e um receptor de hormona esteroide.

38. Ácido nucleico que codifica para uma Proteína de fusão do ativador sintético transcricional, o ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs :80 a 93; uma sequência de nucleotídeos que é substancialmente idêntica a uma das SEQ ID NOs :80 a 93; o complemento de um polinucleotídeo que é especificamente hi-bridado com, pelo menos, uma das SEQ ID NOs :80 a 93; e o complemento reverso de um polinucleotídeo que é especificamente hibridado com, pelo menos, uma das SEQ ID NOs :80 a 93.

39. Célula que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 17.

40. Céluia de acordo com a reivindicação 39, em que a célula é uma célula de planta ou uma célula de levedura.

41. Célula que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 29.

42. Célula de acordo com a reivindicação 41, em que a célula é uma célula de planta ou uma célula de levedura.

43. Tecido da planta, parte da planta, produto de base da planta, ou planta inteira que compreende a célula como definida na reivindicação 39.

44. Tecido da planta, parte da planta, produto de base da planta, ou planta inteira que compreende a célula como definida na reivindicação 41.

45. Método para aumentar a expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula hospedeira, que compreende o método: introdução do ácido nucleico como definido na reivindicação 17, em uma célula hospedeira que compreende a sequência de nucleotídeos de interesse, em que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligaa operativamente a uma segunda sequência de nucleotídeos que se liga especificamente ao polipeptídeo de ligação ao DNA, aumentando, dessa maneira, a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse na célula hospedeira.

46 Método de acordo com a reivindicação 45, em que a introdução do ácido nucleico na célula hospedeira compreende a introdução de um vetor que compreende o ácido nucleico na célula hospedeira.

47. Método de acordo com a reivindicação 45, em que o ácido nucleico está integrado de forma estável no genoma da célula hospedeira.

48. Método de acordo com a reivindicação 45, em que a sequência de nucleotídeos de interesse é uma sequência nucleotídica exóge-na.

49. Método de acordo com a reivindicação 45, em que a sequência de nucleotídeos de interesse é uma sequência de nucleotídeos en- dógena.

50. Método de acordo com a reivindicação 45, em que a introdução do ácido nucteico na célula hospedeira compreende o cruzamento de uma planta que compreende o ácido nucleico com uma planta que compreende a célula hospedeira.

51. Método para aumentar a expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula hospedeira, que compreende o método de: introdução em uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 17, a sequência de nucleotídeos de interesse, em que a sequência de nucleotídeos de interesse está ligada operativamente a uma segunda sequência de nucleotídeos que se liga especificamente ao polipeptídeo de ligação ao DNA, aumentando, dessa maneira, a expressão da sequência de nucleotídeos de interesse na célula hospedeira.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, em que a introdução da sequência de nucleotídeos de interesse na célula hospedeira compreende a introdução de um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos de interesse na célula hospedeira.

53. Método de acordo com a reivindicação 51, em que o ácido nucleico está integrado de forma estável no genoma da célula hospedeira.

54. Método de acordo com a reivindicação 51, em que a sequência de nucleotídeos de interesse operativamente ligada a segunda sequência nucleotídica é estavelmente integrada no genoma da célula hospedeira.

55. Método de acordo com a reivindicação 51, em que a introdução da sequência de nucleotídeos de interesse na célula hospedeira compreende o cruzamento de uma planta que compreende a sequência de nucleotídeos de interesse, com uma planta que compreende a célula hospedeira.

56. Método para aumentar a expressão de uma sequência de nucleotídeos de interesse em uma célula hospedeira, que compreende o método de: introdução do ácido nucleico como definido na reivindicação 17, em uma célula hospedeira que compreende a sequência de nucleotideos de interesse, em que a sequência de nucleotideos de interesse está ligada operativamente a uma segunda sequência de nucleotideos que se liga especificamente ao polípeptídeo de ligação ao DNA, aumentando, dessa maneira, a expressão da sequência de nu-cleotídeos de interesse na célula hospedeira.

57. Ácido nucleico que codifica para uma Proteína de fusão do ativador sintético transcricional. o ácido nucleico que compreende: uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um poli-peptídeo de ligação ao DNA, e um segunda sequência de polinucleotídeo que codifica os meios para a transativação de expressão de genes de plantas, em que as primeira e segunda sequências polinucleotídicas são expressas a partir do ácido nucleico de estrutura e, em um único transcrito.

58. Método para aumentar a expressão de uma sequência de nucleotideos de interesse em uma célula hospedeira, que compreende o método de: introdução do ácido nucleico da reivindicação 57 em uma célula hospedeira que compreende a sequência de nucleotideos de interesse, em que a sequência de nucleotideos de interesse está ligada operativamente a uma segunda sequência de nucleotideos que se liga específicamente ao polípeptídeo de ligação ao DNA, aumentando, dessa maneira, a expressão da sequência de nucleotideos de interesse na célula hospedeira.

59. Método para aumentar a expressão de uma sequência de nucleotideos de interesse em uma célula hospedeira, que compreende o método de: introdução em uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico da reivindicação 57, a sequência de nucleotideos de interesse, em que a sequência de nucleotideos de interesse está ligado operativamente a uma segunda sequência de nucieotídeos que se liga especificamente ao polipeptídeo de ligação ao DNA, aumentando, dessa maneira, a expressão da sequência de nu-cleotídeos de interesse na célula hospedeira.

60. Ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotí-deos que codifica um polipeptídeo de interação do domínio de transativação selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 121 a 127.

61. Complemento de um ácido nucleico que é especificamente hibridado com o ácido nucleico como definido na reivindicação 60.

62. Complemento reverso de um ácido nucleico que é especificamente hibridar com o ácido nucleico como definido na reivindicação 60.

63. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 60, em que o polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transativação é selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO; 52 e SEQ ID NO: 58.

64. Polipeptídeo que compreende um polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transativação selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 121 a 127.

65. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 64, em que o polipeptídeo do motivo de interação do domínio de transativação é selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO. 58