BR112014025946B1 - Molécula de ácido nucleico e proteína quimérica compreendendo um peptídeo de trânsito de cloroplasto - Google Patents

Molécula de ácido nucleico e proteína quimérica compreendendo um peptídeo de trânsito de cloroplasto Download PDF

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Abstract

POLIPEPTÍDEOS QUIMÉRICOS COMPREENDENDO UM PEPTÍDEO DE TRÂNSITO DE CLAOROPLASTO, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO CODIFICANDO OS MESMOS, VETORES DE EXPRESSÃO EM PLANTA, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA E UM MATERIAL DA MESMA, SEUS USOS, BEM COMO PRODUTOS DE CONSUMO DE PLANTA TRANSGÊNICA. A presente invenção refere-se a composições e métodos para direcionamento de peptídeos, polipeptídeos e proteínas a plastídeos de células contendo plastídeo. Em algumas modalidades, a invenção refere-se a peptídeos de trânsito de cloroplasto que podem direcionar um polipeptídeo a um plastídeo, e moléculas de ácido nucleico codificando os mesmos. Em algumas modalidades, a invenção refere-se a métodos para produção de um material de planta transgênica (por exemplo, uma planta transgênica) compreendendo um peptídeo de trânsito de cloroplasto, bem como materiais de planta produzidos através de tais métodos, e produtos de consumo de planta produzidos a partir dos mesmos.

Description

Reivindicação de Prioridade
[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Pa tente Provisório U.S. N°. de Série 61/625.222 depositado em 17 de abril de 2012.
DECLARAÇÃO DE ACORDO COM 37 C.F.R. § 1.821(c) ou (e) - LIS-TAGEM DE SEQUÊNCIA APRESENTADA COMO ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[0002] De acordo com 37 C.F.R. § 1.821(c) ou (e), um arquivo contendo uma versão de texto ASCII da Listagem de Sequência foi apresentado concomitantemente com o presente pedido.
Campo Técnico
[0003] A presente invenção refere-se a composições e métodos para codificar e expressar geneticamente polipeptídeos que são dire-cionados a plastídeos de células contendo plastídeo. Em certas moda-lidades, a invenção refere-se a sequências de aminoácido que direcionam polipeptídeos a cloroplastos (por exemplo, de plantas superiores) e/ou moléculas de ácido nucleico responsáveis por sua codificação. Em certas modalidades, a invenção refere-se a polipeptídeos quiméricos compreendendo uma sequência de aminoácido que controla o trânsito dos polipeptídeos quiméricos para plastídeos e/ou moléculas de ácido nucleico responsáveis por sua codificação.
Antecedentes
[0004] Células de planta contêm organelas subcelulares distintas, referidas geralmente como "plastídeos", que são delimitadas por sistemas de membrana característicos e realizam funções especializadas dentro da célula. Plastídeos particulares são responsáveis por fotos- síntese, bem como a síntese e armazenamento de certos compostos químicos. Todos os plastídeos são derivados de proplastídeos que estão presentes nas regiões meristemáticas da planta. Proplastídeos podem se desenvolver em, por exemplo: cloroplastos, etioplastos, cro- moplastos, gerontoplastos, leucoplastos, amiloplastos, elaioplastos e proteinoplastos. Plastídeos existem de uma maneira semiautônoma dentro da célula, contendo seu próprio sistema genético e maquinário de síntese de proteína, mas se apoiando em uma cooperação íntima com o sistema núcleo-citoplásmico em seu desenvolvimento e atividades biossintéticas.
[0005] Em células de folha fotossintética de plantas superiores, os plastídeos que mais chamam atenção são os cloroplastos. A função mais essencial dos cloroplastos é o desempenho das reações direcionadas pela luz de fotossíntese. Mas os cloroplastos também realizam muitos outros processos biossintéticos de importância para a célula de planta. Por exemplo, todos os ácidos graxos da planta são feitos por enzimas localizadas no estroma do cloroplasto, usando o ATP, NAOPH e carboidratos prontamente disponíveis. Além disso, o poder de redução de elétrons ativados pela luz direciona a redução de nitrito (NO2-) em amônia (NH3) no cloroplasto; esta amônia provê a planta com nitrogênio requerido para a síntese de aminoácidos e nucleotídeos.
[0006] O cloroplasto também toma parte no processo de importân cia particular na indústria agroquímica. Por exemplo, é conhecido que muitos herbicidas agem através do bloqueio de funções que são realizadas dentro do cloroplasto. Estudos recentes identificaram o alvo específico de vários herbicidas. Por exemplo, herbicidas derivados de triazina inibem fotossíntese através do deslocamento de uma molécula de plastoquinona de seu sítio de ligação no polipeptídeo de 32 kD do fotossistema II. Este polipeptídeo de 32 kD é codificado no genoma do cloroplasto e sintetizado pelo maquinário da organela. Plantas mutan- tes foram obtidas, as quais são resistentes a herbicidas de triazina. Essas plantas contêm um polipeptídeo de 32 kD mutante a partir do qual a plastoquinona não pode mais ser deslocada por herbicidas de triazina. Sulfonilureias inibem sintase de acetolactato no cloroplasto. A sintase de acetolactato está envolvida em síntese de isoleucina e valina. Glifosato inibe a função de 5-enol piruvil-3-fosfochiquimato sintase (EPSPS), que é uma enzima envolvida na síntese de aminoácidos aromáticos. Todas essas enzimas são codificadas pelo genoma nuclear, mas elas são transportadas para o cloroplasto onde a síntese de aminoácido real acontece.
[0007] A maior parte das proteínas do cloroplasto são codificadas no núcleo da célula de planta, sintetizadas como proteínas precursoras maiores no citosol e pós-traducionalmente importadas para o cloro- plasto. Importação através das membranas envelope externa e interna para o estroma é o principal meio para a entrada de proteínas destinadas para o estroma, a membrana do tilacoide e o lúmen do tilacoide. Localização de proteínas precursoras importadas para a membrana do tilacoide e o lúmen do tilacoide é realizada por quatro mecanismos distintos, incluindo dois que são homólogos a sistemas de transporte de proteína bacteriana. Desta maneira, mecanismos para localização de proteína no cloroplasto são, em parte, derivados do endossibionte pro- cariótico. Cline e Henry (1996) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:1-26.
[0008] Proteínas precursoras destinadas para expressão cloro- plástica contêm extensões N-terminais conhecidas como peptídeos de trânsito de cloroplasto (CTPs) (Chloroplast Transit Peptides). O peptí- deo de trânsito é instrumental para reconhecimento específico da superfície do cloroplasto e na mediação do transporte pós-traducional de pré-proteína através do envelope cloroplástico e, então, para os vários subcompartimentos dentro do cloroplasto (por exemplo, estroma, tila- coide e membrana do tilacoide). Essas sequências de peptídeo de trânsito N-terminais contêm toda a informação necessária para a im- portação da proteína do cloroplasto para plastídeos; as sequências de peptídeo de trânsito são necessárias e suficientes para importação de plastídeo.
[0009] Genes de planta relatados ter sequências de peptídeo de trânsito naturalmente codificadas em seu terminal N incluem a subuni- dade pequena de cloroplasto de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (RuBisCo) (de Castro Silva-Filho e outros (1996), Plant. Mol. Biol. 30:769-80; Schnell e outros (1991), J. Biol. Chem. 266:3335-42); EPSPS (vide, por exemplo, Archer e outros (1990) J. Bioenerg. And Biomed. 22:789-810 e Patentes dos Estados Unidos 6.867.293, 7.045.684 e Re. 36.449); triptofano sintase (Zhao e outros (1995), J. Biol. Chem. 270:6081-7); plastocianina (Lawrence e outros (1997), J. Biol. Chem. 272:20357-63); corismato sintase (Schmidt e outros (1993), J. Biol. Chem. 268:27447-57); a proteína de ligação a/b de clorofila de coleta de luz (LHBP) (Light Harvesting Chlorophyll a/b Binding Protein) (Lamppa e outros (1988), J. Biol. Chem. 263:14996-14999); e proteína do cloroplasto de Arabidopsis thaliana (Lee e outros (2008), Plant Cell 20:1603-22). A Publicação de Patente dos Estados Unidos No. US 2010/0071090 provê certos peptídeos de direcionamento a clo- roplasto de Chlamydomonas sp.
[00010] No entanto, as necessidades estruturais para a informação codificada pelos peptídeos de direcionamento a cloroplasto permanecem elusivas, devido ao seu nível alto de diversidade de sequência e falta de motivos de sequência comuns ou consenso, embora seja possível que haja subgrupos distintos de peptídeos de direcionamento a cloroplasto com motivos estruturais independentes. Lee e outros (2008), supra. Ainda, nem todas dessas sequências foram úteis na expressão heteróloga de proteínas direcionadas a cloroplasto em plantas superiores.
Divulgação
[00011] Composições e métodos são descritos aqui para direcionamento a plastídeo de polipeptídeos em uma planta. Em algumas modalidades, uma composição compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto derivado de Brassica sintético (por exemplo, um peptídeo TraP8 e um peptídeo TraP9) operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo de interesse. Em modalidades particulares, tais moléculas de ácido nucleico podem ser úteis para expressão e direcionamento de um polipeptídeo codificado pela sequência de nucleotídeo de interesse em uma planta mo- nocotiledônea ou dicotiledônea. São ainda descritos vetores compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto derivado de Brassica sintético operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo de interesse.
[00012] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético pode ser uma sequência de nucleotídeo que é derivada de uma sequência de nucleotí- deo de referência obtida de um gene de Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea e B. carinata) ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético pode ser uma sequência de nucleotídeo quimérico compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando CTP parcial de um gene de Brassica sp. ou uma variante funcional da mesma. Em modalidades específicas, uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético pode conter sequências de nucleotídeo contíguas obtidas de cada um de um de um CTP de Brassica sp. de referência e um CTP de um gene diferente da Brassica sp., uma Brassica sp. diferente ou um organismo diferente (por exemplo, uma planta, procarionte e euca- rionte fotossintético inferior) ou variantes funcionais de qualquer um dos acima. Em modalidades particulares, uma sequência de nucleotí- deo contígua pode ser obtida a partir de uma sequência de nucleotí- deo ortóloga do CTP de Brassica de referência que é obtida de um or- tólogo de organismo diferente do gene de Brassica sp. de referência (por exemplo, um genoma de Brassica sp. diferente). Nessas e em modalidades adicionais, uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético pode ser uma sequência de nucle- otídeo quimérico compreendendo mais de uma sequência de nucleotí- deo codificando CTP.
[00013] Em alguns exemplos, uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético pode ser uma sequência de nucleotídeo quimérico compreendendo uma sequência de nucleotí- deo de CTP parcial ou de B. napus ou B. rapa ou suas variantes funcionais. Em exemplos específicos, uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético pode conter sequências de nucleotídeo contíguas obtidas de cada uma de B. napus e B. rapa ou suas variantes funcionais.
[00014] Em algumas modalidades, uma composição compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos um meio derivado de Brassica para direcionamento de um polipeptídeo a um cloroplasto. São ainda descritas moléculas de ácido nucleico compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos um meio derivado de Brassica para direcionamento de um polipeptí- deo a um cloroplasto operavelmente ligado a uma sequência de nu- cleotídeo de interesse. Em modalidades particulares, tais moléculas de ácido nucleico podem ser úteis para expressão e direcionamento de um polipeptídeo codificado pela sequência de nucleotídeo de interesse em uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea. Para os propósitos da presente invenção, um meio derivado de Brassica para direciona- mento de um polipeptídeo a um cloroplasto refere-se a sequências de nucleotídeo sintético particulares. Em modalidades particulares, um meio derivado de Brassica para direcionamento de um polipeptídeo a um cloroplasto é selecionado do grupo consistindo nas sequências de nucleotídeo codificando os polipeptídeos referidos aqui como TraP8 e TraP9.
[00015] São também descritos aqui materiais de planta (por exemplo e sem limitação, plantas, tecidos de planta e células de planta) compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético operavelmente ligado a uma sequência de nucle- otídeo de interesse. Em algumas modalidades, um material de planta pode ter tal molécula de ácido nucleico estavelmente integrada em seu genoma. Em algumas modalidades, um material de planta pode expressar transientemente um produto de uma molécula de ácido nuclei- co compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo de interesse. Em algumas modalidades, o material de planta é uma célula de planta da qual uma planta não pode ser regenerada.
[00016] São também descritos métodos para expressão de uma sequência de nucleotídeo em uma célula contendo plastídeo (por exemplo, uma planta) em um plastídeo (por exemplo, um cloroplasto) da célula contendo plastídeo. Em modalidades particulares, uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo de interesse pode ser usada para transformar uma célula de planta, de maneira que um polipeptídeo de fusão precursor compreendendo o CTP derivado de Brassica sintético fundido a um produto de expressão da sequência de nucleotídeo de interesse é produzido no citoplasma da célula de planta, e o polipeptídeo de fusão é então transportado in vivo para um cloroplasto da célula de planta. Em algumas modalidades, a célula de planta não é capaz de regeneração para uma planta.
[00017] São ainda descritos métodos para a produção de uma planta transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico com-preendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo de interesse. São também descritos produtos de consumo de planta (por exemplo, sementes) produzidos a partir de tais plantas transgênicas. Em algumas modalidades, essas plantas transgênicas ou produtos de consumo de planta contêm células trans- gênicas a partir das quais uma planta não pode ser regenerada.
[00018] As características acima e outras se tornarão mais aparentes a partir da descrição detalhada que segue de várias modalidades, que prossegue com referência às Figuras acompanhantes.
Breve Descrição das Figuras
[00019] A Figura 1 ilustra uma molécula de mRNA que é representativa de exemplos particulares de sequências de nucleotídeo codificando CTP derivado de Brassica sintético (por exemplo, para TraP8 e TraP9) operavelmente ligada a uma sequência de nucleotídeo de interesse. Em algumas modalidades, uma molécula de mRNA (tal como a mostrada) pode ser transcrita a partir de uma molécula de DNA compreendendo uma estrutura de leitura aberta incluindo a sequência codificando CTP derivado de Brassica sintético operavelmente ligada à sequência de nu- cleotídeo de interesse. A sequência de nucleotídeo de interesse pode ser, em algumas modalidades, uma sequência codificando um peptídeo de interesse, por exemplo e sem limitação, um produto de gene marcador ou peptídeo a ser direcionado a um plastídeo.
[00020] A Figura 2 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB101977.
[00021] A Figura 3 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB101908.
[00022] A Figura 4 inclui uma imagem de microscópio mostrando que TraP8-YFP infiltrado no tecido de folha de tabaco foi transportado para os cloroplastos do tecido da folha de tabaco.
[00023] A Figura 5 inclui uma imagem de microscópio mostrando que TraP9-YFP infiltrado no tecido de folha de tabaco foi transportado para os cloroplastos do tecido da folha de tabaco.
[00024] A Figura 6 inclui uma imagem de microscópio mostrando que controles de YFP não direcionados que foram infiltrados em tecido de folha de tabaco não foram incorporados aos cloroplastos do tecido de folha de tabaco.
[00025] A Figura 7 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB106597.
[00026] A Figura 8 inclui uma imagem de microscópio do construto de TraP8-YFP transformado em protoplastos de milho mostrando o transporte para os cloroplastos do protoplasto de milho.
[00027] A Figura 9 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB105526.
[00028] A Figura 10 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB105527.
[00029] A Figura 11 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB109807.
[00030] A Figura 12 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB107687.
[00031] A Figura 13 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB111481.
[00032] A Figura 14 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB111479.
[00033] A Figura 15 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB111338.
[00034] A Figura 16 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB112710.
[00035] A Figura 17 inclui um alinhamento dos peptídeos de trânsito de cloroplasto previstos para a proteína EPSPS de Brassica napus (SEQ ID NO:1) e Brassica rapa (SEQ ID NO:2). Os asteriscos indicam onde as sequências foram separadas e recombinadas para formar TraP8 e TraP9.
[00036] A Figura 18 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB107527.A Figura 19 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB105530.
[00037] A Figura 20 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB105531.
[00038] A Figura 21 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB105532.
[00039] A Figura 22 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB105533.
[00040] A Figura 23 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB105534.
[00041] A Figura 24 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB107532.
[00042] A Figura 25 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB107534.
[00043] A Figura 26 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB107533.
[00044] A Figura 27 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB4104.
[00045] A Figura 28 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB102715.
[00046] A Figura 29 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB102716.
[00047] A Figura 30 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB102717.
[00048] A Figura 31 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB102785.
[00049] A Figura 32 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB102719.
[00050] A Figura 33 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB102718.
[00051] A Figura 34 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB107663.
[00052] A Figura 35 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB107664.
[00053] A Figura 36 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB107665.
[00054] A Figura 37 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB107666.
[00055] A Figura 38 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB109812.
[00056] A Figura 39 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB101556.
[00057] A Figura 40 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB107698.
[00058] A Figura 41 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB108384.
[00059] A Figura 42 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB108385.
[00060] A Figura 43 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB108386.
[00061] A Figura 44 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB108387.
Listagem de Sequência
[00062] As sequências de ácido nucleico listadas na listagem de sequência acompanhante são mostradas usando abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeo, conforme definido no 37 C.F.R. § 1.822. Apenas um filamento de cada sequência de ácido nucleico é mostrado, mas o filamento complementar é compreendido ser incluído por qualquer referência ao filamento exibido. Na listagem de sequência acompanhante:
[00063] A SEQ ID NO:1 mostra o aminoácido de um peptídeo de trânsito de cloroplasto de EPSPS de Brassica napus.
[00064] A SEQ ID NO:2 mostra o aminoácido de um peptídeo de trânsito de cloroplasto de EPSPS de Brassica rapa.
[00065] A SEQ ID NO:3 mostra o aminoácido de um peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8.
[00066] A SEQ ID NO:4 mostra o aminoácido de um peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP9.
[00067] A SEQ ID NO:5 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8.
[00068] A SEQ ID NO:6 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP9.
[00069] A SEQ ID NO:7 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando uma sequência ligante.
[00070] A SEQ ID NO:8 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 v2.
[00071] A SEQ ID NO:9 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP9 v2.
[00072] A SEQ ID NO:10 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando um gene cry2Aa.
[00073] A SEQ ID NO:11 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando um gene vip3ab1v6.
[00074] A SEQ ID NO:12 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando um gene vip3ab1v7.
[00075] A SEQ ID NO:13 mostra um peptídeo tendo a sequência de aminoácido Ser-Val-Ser-Leu.
[00076] A SEQ ID NO:14 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto EPSPS de Brassica napus de SEQ ID NO:1.
[00077] A SEQ ID NO:15 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito de cloroplasto EPSPS de Brassica rapa.
[00078] A SEQ ID NO:16 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando dgt-28 v5.
[00079] A SEQ ID NO:17 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando dgt-28 v6.
[00080] A SEQ ID NO:18 mostra a sequência de polinucleotídeo de códon otimizado dgt-1.
[00081] A SEQ ID NO:19 mostra a sequência de polinucleotídeo de códon otimizado dgt-3 v2 (G173A).
[00082] A SEQ ID NO:20 mostra a sequência de polinucleotídeo de códon otimizado dgt-3 v3 (G173A; P178S).
[00083] A SEQ ID NO:21 mostra a sequência de polinucleotídeo de códon otimizado dgt-3 v4 (T174I; P178S).
[00084] A SEQ ID NO:22 mostra a sequência de polinucleotídeo de códon optimized dgt-7 v4 (T168I; P172S).
[00085] A SEQ ID NO:23 mostra a sequência de polinucleotídeo de códon optimized dgt-32 v3.
[00086] A SEQ ID NO:24 mostra a sequência de polinucleotídeo de códon otimizado dgt-33 v3.
[00087] A SEQ ID NO:25 mostra a sequência de polinucleotídeo de códon otimizado dgt-31 v3.
[00088] A SEQ ID NO:26 mostra uma sequência de polinucleotídeo
[00089] codificando o peptídeo de trânsito TraP4 v2.
[00090] A SEQ ID NO:27 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito TraP5 v2.
[00091] A SEQ ID NO:28 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito TraP8 v2.
[00092] A SEQ ID NO:29 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito TraP9 v2.
[00093] A SEQ ID NO:30 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito TraP12 v2.
[00094] A SEQ ID NO:31 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito TraP13 v2.
[00095] A SEQ ID NO:32 mostra a sequência de polinucleotídeo de TraP4 v2:dgt-28 v5.
[00096] A SEQ ID NO:33 mostra a sequência de polinucleotídeo de TraP5 v2: dgt-28 v5.
[00097] A SEQ ID NO:34 mostra a sequência de polinucleotídeo de TraP8 v2: dgt-28 v5.
[00098] A SEQ ID NO:35 mostra a sequência de polinucleotídeo de TraP9 v2: dgt-28 v5.
[00099] A SEQ ID NO:36 mostra a sequência de polinucleotídeo de TraP12 v2: dgt-28 v5.
[000100] A SEQ ID NO:37 mostra a sequência de polinucleotídeo de TraP13 v2:dgt-28 v5.
[000101] A SEQ ID NO:38 mostra a sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito TraP14 v2.
[000102] A SEQ ID NO:39 mostra a sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito TraP23 v2.
[000103] A SEQ ID NO:40 mostra a sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito TraP24 v2.
[000104] A SEQ ID NO:41 mostra a sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito dgt-32 v3 fundido a TraP14 v2.
[000105] A SEQ ID NO:42 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito dgt-33 v3 fundido a TraP24 v2.
[000106] A SEQ ID NO:43 mostra uma sequência de polinucleotídeo codificando o peptídeo de trânsito dgt-31 v3 fundido a TraP23 v2.
[000107] A SEQ ID NO:44 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador DSM2A.
[000108] A SEQ ID NO:45 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador DSM2S.
[000109] A SEQ ID NO:46 mostra a sequência de oligonucleotídeo da sonda DSM2 Cy5.
[000110] A SEQ ID NO:47 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador DGT28F.
[000111] A SEQ ID NO:48 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador DGT28R.
[000112] A SEQ ID NO:49 mostra a sequência de oligonucleotídeo da sonda TAFFY-HEX.
[000113] A SEQ ID NO:50 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador TAFII15-F.
[000114] A SEQ ID NO:51 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador TAFII15-R.
[000115] A SEQ ID NO:52 mostra a sequência de oligonucleotídeo do oligo avançado usado para confirmação de cassete de expressão de gene dgt-28.
[000116] A SEQ ID NO:53 mostra a sequência de oligonucleotídeo do oligo reverso usado para confirmação de cassete de expressão de gene dgt-28.
[000117] A SEQ ID NO:54 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador AT26410LP.
[000118] A SEQ ID NO:55 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador AT26410RP.
[000119] A SEQ ID NO:56 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador DGT28F.
[000120] A SEQ ID NO:57 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador DGT28R.
[000121] A SEQ ID NO:58 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador GAAD1F.
[000122] A SEQ ID NO:59 mostra a sequência de oligonucleotídeo da sonda GAAD1P.
[000123] A SEQ ID NO:60 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador GAAD1R.
[000124] A SEQ ID NO:61 mostra a sequência de oligonucleotídeo da sonda IV.
[000125] A SEQ ID NO:62 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador IVF-Taq.
[000126] A SEQ ID NO:63 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador IVR-Taq.
[000127] A SEQ ID NO:64 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador zmDGT28 F.
[000128] A SEQ ID NO:65 mostra a sequência de oligonucleotídeo da sonda zmDGT28 FAM.
[000129] A SEQ ID NO:66 mostra a sequência de oligonucleotídeo do iniciador zmDGT28 R.
Descrição Detalhada Visão geral de várias modalidades
[000130] Um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP) (ou peptídeo de trânsito de plastídeo) funciona cotraducionalmente ou pós- traducionalmente para direcionar um polipeptídeo compreendendo o CTP a um plastídeo (por exemplo, um cloroplasto). Em algumas modalidades da invenção, ou proteínas de cloroplasto endógenas ou proteínas heterólogas podem ser direcionadas a um cloroplasto através de expressão de tal proteína como um polipeptídeo precursor maior compreendendo um CTP. Em modalidades particulares, um CTP pode ser derivado de uma sequência de nucleotídeo obtida de um gene de Brassica sp., por exemplo e sem limitação, através da incorporação de pelo menos uma sequência contínua de um gene ortólogo obtido de um organismo diferente ou uma variante funcional da mesma.
[000131] Em uma modalidade exemplar, sequências de ácido nuclei- co, cada uma codificando um CTP, foram isoladas de sequências de gene de EPSPS obtidas de Brassica napus (No. de Acesso Banco de dados NCBI P17688) e Brassica rapa (No. de Acesso Banco de dados NCBI AAS80163). As sequências de ácido nucleico codificando CTP foram isoladas através de análise da sequência de gene de EPSPS com o servidor de previsão ChloroP. Emanuelsson e outros (1999), Protein Science 8:978-84. Os produtos de proteína previstos das sequências de codificação de CTP isoladas são peptídeos de trânsito de comprimento de aproximadamente 60-70 aminoácidos. Neste exemplo, o CTP de B. napus nativo foi usado como uma sequência de referência para projetar CTPs derivados de Brassica sintéticos exemplares através de fusão de sequências contíguas de outros CTPs em uma posição particular no CTP de B. napus. Este processo de projeto ilustra o desenvolvimento de um novo CTP sintético, de acordo com alguns aspectos, a partir de uma sequência de ácido nucleico de Brassica sp. Esses CTPs derivados de Brassica sintéticos exemplares são referidos na invenção como TraP8 e TraP9. Esses TraPs sintéticos exemplares foram testados quanto à função de direcionamento a plas- tídeo e foram verificados exibir direcionamento a plastídeo que era pelo menos tão favorável quanto aquele observado para as sequências de Brassica nativas individualmente.
[000132] Em uma modalidade exemplar adicional, sequências de ácido nucleico, cada uma codificando um peptídeo TraP sintético da invenção, foram sintetizadas independentemente e operavelmente ligadas a uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína amarelo fluorescente (YFP) (Yellow Fluorescent Protein) para produzir moléculas de ácido nucleico sintéticas, cada uma codificando um poli- peptídeo de fusão TraP:YFP quimérico. Tais moléculas de ácido nu- cleico, cada uma codificando um polipeptídeo TraP:YFP quimérico, foram, cada uma, introduzidas em um vetor binário, de maneira que cada sequência de ácido nucleico codificando TraP:YFP era opera- velmente ligada a um promotor AtUbi 10.
[000133] Em ainda uma modalidade exemplar, vetores binários com-preendendo uma sequência de ácido nucleico codificando TraP:YFP operavelmente ligada a um promotor AtUbi 10 foram, cada um, inde-pendentemente, transientemente transformados em tabaco (Nicotiana benthamiana) através de transformação mediada por Agrobacterium. Microscopia confocal e análise Western blot confirmaram que cada TraP direcionou com sucesso YFP a cloroplastos de tabaco.
[000134] Em uma modalidade exemplar adicional, sequências de ácido nucleico, cada uma codificando um peptídeo TraP sintético da invenção, foram sintetizadas independentemente e operavelmente ligadas a uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de gene agronomicamente importante. As sequências TraP foram fundidas a características tolerantes a herbicida (por exemplo, dgt-28 e dgt-14) para produzir moléculas de ácido nucleico sintéticas, cada uma codificando um polipeptídeo de fusão TraP:DGT-28 ou TraP:DGT-14. Tais moléculas de ácido nucleico, cada uma codificando um polipeptí- deo TraP:DGT-28 ou TraP:DGT-14 quimérico, foram, cada uma, introduzidas em um vetor binário, de maneira que cada sequência de ácido nucleico codificando TraP:DGT-28 ou TraP:DGT-14 foi operavelmente ligada a um promotor e outros elementos reguladores de gene. O binário contendo a sequência de ácido nucleico codificando TraP:DGT-28 ou TraP:DGT-14 foi usado para transformar espécies de planta varo- pis. As plantas transgênicas foram ensaiadas quanto à tolerância a herbicida como um resultado da expressão e translocação das enzi- mas DGT-28 ou DGT-14 para o cloroplasto.
[000135] Em uma modalidade exemplar adicional, sequências de ácido nucleico, cada uma codificando um peptídeo TraP sintético da invenção, foram sintetizadas independentemente e operavelmente ligadas a uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência de gene agronomicamente importante. As sequências de TraP foram fundidas a genes conferindo características de tolerância a inseto (por exemplo, cry2Aa e vip3ab1) para produzir moléculas de ácido nucleico sintéticas, cada uma codificando um polipeptídeo de fusão TraP:Cry2Aa ou TraP:Vip3ab1 quimérico. Tais moléculas de ácido nu- cleico, cada uma codificando um polipeptídeo TraP:Cry2Aa ou TraP:Vip3ab1, foram, cada uma, introduzidas em um vetor binário, de maneira que cada sequência de ácido nucleico codificando TraP:Cry2Aa ou TraP:Vip3ab1 foi operavelmente ligada a um promotor e os outros elementos reguladores de gene. O binário contendo a sequência de ácido nucleico codificando TraP:Cry2Aa ou TraP:Vip3ab1 foi usado para transformar várias espécies de planta. As plantas trans- gênicas foram bioensaiadas quanto à resistência a inseto como um resultado da expressão e translocamento das enzimas Cry2Aa ou Vip3ab1 para o cloroplasto.
[000136] Em vista dos exemplos de trabalho detalhados mencionados acima, sequências de CTP derivado de Brassica da invenção, e ácidos nucleicos codificando as mesmas, podem ser usados para direcionar qualquer polipeptídeo a um plastídeo em uma faixa ampla de células contendo plastídeo. Por exemplo, através dos métodos disponibilizados àquelas versados na técnica pela presente invenção, um polipeptídeo quimérico compreendendo uma sequência CTP derivado de Brassica sintético fundida ao terminal N de qualquer segunda sequência de peptídeo pode ser introduzido em (ou expresso em) uma célula hospedeira contendo plastídeo para direcionamento a plastídeo da segunda sequência de peptídeo. Desta maneira, em modalidades particulares, um peptídeo TraP da invenção pode prover eficiência aumentada de importação e processamento de um peptídeo para o qual expressão de plastídeo é desejada, quando comparado com um CTP nativo.
Abreviações
[000137] CTP peptídeo de trânsito de cloroplasto
[000138] Bt bacillus thuringiensis
[000139] EPSPS 3-enolpiruvilchiquimato-5-fosfato sintetase
[000140] YFP proteína amarelo fluorescente
[000141] Ti indução de tumor (plasmídeos derivados de A tumefaciens)
[000142] T-DNA DNA de transferência
III. Termos
[000143] A fim de facilitar revisão das várias modalidades da invenção, as explicações que seguem de termos específicos são providas:
[000144] Peptídeo de trânsito de cloroplasto: Conforme aqui usado, o termo "peptídeo de trânsito de cloroplasto" (CTP) (ou "peptídeo de trânsito de plastídeo") pode se referir a uma sequência de aminoácido que, quando presente no terminal N de um polipeptídeo, direciona a importação do polipeptídeo para um plastídeo de uma célula contendo plastídeo (por exemplo, uma célula de planta, tal como em uma planta inteira ou cultura de célula de planta). Um CTP é geralmente necessário e suficiente para direcionar a importação de uma proteína para um plastídeo (por exemplo, um plastídeo primário, secundário ou terciário, tal como um cloroplasto) de uma célula hospedeira. Um peptídeo de trânsito de cloroplasto putativo pode ser identificado por um de vários algoritmos disponíveis (por exemplo, PSORT e ChloroP. ChloroP pode prover previsão particularmente boa de CTPs. Emanuelsson e outros (1999), Protein Science 8:978-84. No entanto, previsão de CTPs funci- onais não é obtida em 100% de eficiência por um algoritmo existente. Desta maneira, é importante verificar que um CTP putativo identificado não funciona na verdade como pretendido em, por exemplo, uma metodologia in vitro ou in vivo.
[000145] Peptídeos de trânsito de cloroplasto podem estar localizados no terminal N de um polipeptídeo que é importado para um plastí- deo. O CTP pode facilitar transporte co- ou pós-traducional de um po- lipeptídeo compreendendo o CTP para o plastídeo. Peptídeos de trânsito de cloroplasto tipicamente compreendem entre cerca de 40 e cerca de 100 aminoácidos, e tais CTPs foram observados conter certas características comuns. Por exemplo: CTPs contêm pouquíssimos, se algum, aminoácidos negativamente carregados (tal como ácido aspár- tico, ácido glutâmico, asparaginas ou glutamina); as regiões N- terminais de CTPs não têm aminoácidos, glicina e prolina carregados; a região central de um CTP também é provável conter uma proporção muito alta de aminoácidos básicos ou hidroxilados (tais como serina e treonina); e a região C-terminal de um CTP é provável ser rica em ar- ginina, e tem a habilidade em compreender uma estrutura de folha- beta anfifática. Proteases de plastídeo podem clivar o CTP do restante de um polipeptídeo compreendendo o CTP após importação do poli- peptídeo para o plastídeo.
[000146] Contato: Conforme aqui usado, o termo "contato com" ou "absorção por" uma célula, tecido ou organismo (por exemplo, uma célula de planta; tecido de planta; e planta), com relação a uma molécula de ácido nucleico, inclui internalização da molécula de ácido nu- cleico no organismo, por exemplo e sem limitação: contato do organismo com uma composição compreendendo a molécula de ácido nu- cleico; e enxágue dos organismos com uma solução compreendendo a molécula de ácido nucleico.
[000147] Endógeno: Conforme aqui usado, o termo "endógeno" refe- re-se a substâncias (por exemplo, moléculas de ácido nucleico e poli- peptídeos) que se originam de dentro de um organismo, tecido ou célula particular. Por exemplo, um polipeptídeo "endógeno" expresso em uma célula de planta pode se referir a um polipeptídeo que é normalmente expresso em células do mesmo tipo de plantas não geneticamente engenheiradas da mesma espécie. Em alguns exemplos, um gene endógeno (por exemplo, um gene EPSPS) de uma Brassica sp. pode ser usado para obter uma sequência de CTP de Brassica de referência.
[000148] Expressão: Conforme aqui usado, "expressão" de uma sequência de codificação (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo através do qual a informação codificada de uma unidade transcriptional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA ou cDNA genômico) é convertida em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, frequentemente incluindo a síntese de uma proteína. Expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui expressão de gene. Expressão de um gene pode também ser regulada em qualquer ponto no curso de DNA para RNA para proteína. Regulagem de expressão de gene ocorre, por exemplo, através de controles agindo sobre transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias tal como mRNA, ou através de ativação, ina- tivação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteína específicas após elas terem sido feitas, ou através de combinações das mesmas. Expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína através de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, e sem limitação: Northern blot; RT-PCR; Western blot; ou ensaio(s) de atividade de proteína in vitro; in situ; e in vivo.
[000149] Material genético: Conforme aqui usado, o termo "material genético" inclui todos os genes, e moléculas de ácido nucleico, tais como DNA e RNA.
[000150] Heterólogo: Conforme aqui usado, o termo "heterólogo" se refere a substâncias (por exemplo, moléculas de ácido nucleico e poli- peptídeos) que não se originam de dentro de um organismo, tecido ou célula particular. Por exemplo, um polipeptídeo "heterólogo" expresso em uma célula de planta pode se referir a um polipeptídeo que não é normalmente expresso em células do mesmo tipo de plantas não geneticamente engenheiradas da mesma espécie (por exemplo, um poli- peptídeo que é expresso em células diferentes do mesmo organismo ou células de um organismo diferente).
[000151] Isolado: Conforme aqui usado, o termo "isolado" refere-se a moléculas (por exemplo, moléculas de ácido nucleico e polipeptídeos) que são substancialmente separadas ou purificadas de outras moléculas do mesmo tipo (por exemplo, outras moléculas de ácido nucleico e outros polipeptídeos) com as quais a molécula está normalmente associada na célula do organismo onde a molécula ocorre naturalmente. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico isolada pode ser substancialmente separada ou purificada do DNA cromossômico ou DNA extracromossômica na célula do organismo onde a molécula de ácido nucleico ocorre naturalmente. Desta maneira, o termo inclui moléculas de ácido nucleico e polipeptídeos recombinantes que são bioquimica- mente purificados de maneira que outras moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos e componentes celulares são removidos. O termo também inclui moléculas de ácido nucleico recombinantes, moléculas de ácido nucleico quimicamente sintetizadas e polipeptídeos recombinan- temente produzidos.
[000152] O termo "substancialmente purificado", conforme aqui usado, se refere a uma molécula que é separada de outras moléculas normalmente associadas com ela em seu estado nativo. Uma molécu- la substancialmente purificada pode ser a espécie predominante presente em uma composição. Uma molécula substancialmente purificada pode ser, por exemplo, pelo menos 60% livre, pelo menos 75% livre ou pelo menos 90% livre de outras moléculas além de um solvente presente em uma mistura natural. O termo "substancialmente purificado" não se refere a moléculas presentes em seu estado nativo.
[000153] Molécula de ácido nucleico: Conforme aqui usado, o termo "molécula de ácido nucleico" se refere a uma forma polimérica de nu- cleotídeos, que pode incluir ambos os filamentos de senso e antissen- so de RNA, cDNA, DNA genômico e formas sintéticas e polímeros mistos dos acima. Um nucleotídeo pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico" conforme aqui usado é sinônimo de "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". Uma molécula de ácido nucleico é geralmente pelo menos de 10 bases de comprimento, a menos que de outra maneira especificado. O termo inclui formas de DNA de filamento simples e duplo. Moléculas de ácido nucleico incluem formas diméricas (chamadas em tandem) e os produtos de transcrição de moléculas de ácido nucleico. Uma molécula de ácido nuclei- co pode incluir ou um ou ambos os nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados por ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural.
[000154] Moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivatizadas, como será prontamente compreendido por aqueles de habilidade na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nu- cleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações inter- nucleotídeo (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, fos- fonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc; li- gações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos; etc; porções pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc; quelantes; alquiladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de filamento simples, filamento duplo, parcialmente duplexadas, triplexadas, grampo-de-cabelo, circulares e cadeado.
[000155] Conforme aqui usado com relação a DNA, o termo "sequência de codificação", "sequência de nucleotídeo estrutural" ou "molécula de ácido nucleico estrutural" refere-se a uma sequência de nu- cleotídeo que é por fim traduzida em um polipeptídeo, através de transcrição e mRNA, quando posta sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Com relação a RNA, o termo "sequência de codificação" se refere a uma sequência de nucleotídeo que é traduzida em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de uma sequência de codificação são determinados por um códon de início de tradução no terminal 5' e um códon de parada de tradução no terminal 3'. Sequências de codificação incluem, mas não estão limitadas a: DNA ge- nômico; cDNA; ESTs; e sequências de nucleotídeo recombinantes.
[000156] Em algumas modalidades, a invenção inclui sequências de nucleotídeo que podem ser isoladas, purificadas ou parcialmente puri-ficadas, por exemplo, usando métodos de separação tais como, por exemplo, cromatografia de troca de íon; através de exclusão com base em tamanho molecular ou através de afinidade; através de técnicas de fracionamento com base em solubilidade em solventes diferentes; e métodos de engenharia genética tais como amplificação, clonagem e subclonagem.
[000157] Identidade de sequência: O termo "identidade de sequência" ou "identidade", conforme aqui usado no contexto de duas se- quências de ácido nucleico ou polipeptídeo, pode se referir aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação especificada.
[000158] Conforme aqui usado, o termo "porcentagem de identidade de sequência" pode se referir ao valor determinado através de comparação de duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico e sequências de aminoácido) em uma janela de comparação, onde a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) comparado com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada através da determinação do número de posições nas quais o resíduo de nucleotídeo ou ácido nucleico idêntico ocorre em ambas as sequências para dar o número de posições compatíveis, dividindo o número de posições compatíveis pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a porcentagem de identidade de sequência.
[000159] Métodos para alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith e Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988); Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988), Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989); CABIOS 5:151-3; Corpet e outros (1988), Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang e outros (1992), Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson e outros (1994), Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana e outros (1999), FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração de-talhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homo- logia pode ser encontrada em, por exemplo, Altschul e outros (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10.
[000160] O National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST®; Altschul e outros (1990)) está disponível de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD) e na internet, para uso junto com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar identidade de sequência usando este programa está disponível na internet sob a seção "help" para BLAST®. Para comparações de sequências de ácido nucleico, a função "Blast2 sequences" do programa BLAST® (Blastn) pode ser empregada usando o ajuste de matriz BLOSUM62 default para parâmetros default. Sequências de ácido nucleico com similaridade ainda maior com as sequências de referência vão mostrar identidade de porcentagem alta quando avaliadas através deste método.
[000161] Especificamente hibridizável/Especificamente complementar: Conforme aqui usado, os termos "especificamente hibridizável" e "especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade, de maneira que ligação estável e específica ocorre entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico alvo. Hibridização entre duas moléculas de ácido nu- cleico envolve a formação de um alinhamento antiparalelo entre as sequências de ácido nucleico das duas moléculas de ácido nucleico. As duas moléculas são então capazes de formar ligações hidrogênio com bases correspondentes no filamento oposto para formar uma molécula duplex que, se ela for suficientemente estável, é detectável usando métodos bem conhecidos na técnica. Uma molécula de ácido nucleico não precisa ser 100% complementar à sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. No entanto, a quantidade de complementaridade de sequência que deve existir para hibridização ser específica é uma função das condições de hibridização usadas.
[000162] Condições de hibridização resultando em graus particulares de adstringência vão variar dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e comprimento das sequências de ácido nucleico de hibridização. Em geral, a temperatura de hi- bridização e a resistência iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridização vão determinar a adstringência de hibridização, embora tempos de lavagem também influenciem a adstringência. Cálculos com relação a condições de hibridização requeridas para atingir graus particulares de adstringência são conhecidos daqueles de habilidade comum na técnica e são discutidos, por exemplo, em Sambrook e outros (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11; e Hames e Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instruções e orientações detalhadas com relação à hibridização de ácidos nucleicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, "Overview of princi-ples of hybridization and the strategy of nucleico acid probe assays", em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel e outros, Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.
[000163] Conforme aqui usado, "condições adstringentes" compreende condições sob as quais hibridização vai apenas ocorrer se houver menos do que 20% de incompatibilidade entre a molécula de hibri- dização e uma sequência homóloga dentro da molécula de ácido nu- cleico alvo. "Condições adstringentes" incluem níveis partículas de adstringência adicionais. Desta maneira, conforme aqui usado, condições de "adstringência moderada" são aquelas sob as quais moléculas com mais de 20% de incompatibilidade de sequência não vão hibridi- zar; condições de "alta adstringência" são aquelas sob as quais se- quências com mais de 10% de incompatibilidade não vão hibridizar; e condições de "adstringência muito alta" são aquelas sob as quais se-quências com mais de 5% de incompatibilidade não vão hibridizar.
[000164] O que segue são condições de hibridização não limitantes, representativas.
[000165] Condição de alta adstringência (detecta sequências que compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência): Hibridiza- ção em tampão SSC 5x a 65°C por 16 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x em temperatura ambiente por 15 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 0,5x a 65°C por 20 minutos cada.
[000166] Condição de Adstringência Moderada (detecta sequências que compartilham pelo menos 80% de identidade de sequência): Hi- bridização em tampão SSC 5x-6x a 65-70°C por 16-20 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x em temperatura ambiente por 5-20 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 1x a 55-70°C por 30 minutos cada.
[000167] Condição de controle não adstringente (sequências que compartilham pelo menos 50% de identidade de sequência vão hibridi- zar): Hibridização em tampão SSC 6x em temperatura ambiente para 55°C por 16-20 horas; lavar pelo menos duas vezes em tampão SSC 2x-3x em temperatura ambiente para 55°C por 20-30 minutos cada.
[000168] Conforme aqui usado, o termo "substancialmente homólogo" ou "homologia substancial", com relação a uma sequência de ácido nucleico contígua, refere-se a sequências de nucleotídeo contíguas que hibridizam sob condições adstringentes para a sequência de ácido nucleico de referência. Por exemplo, sequências de ácido nucleico que são substancialmente homólogas a uma sequência de ácido nucleico de referência são aquelas sequências de ácido nucleico que hibridi- zam sob condições adstringentes (por exemplo, as condições de Adstringência Moderada mostradas, supra) para a sequência de ácido nu- cleico de referência. Sequências substancialmente homólogas podem ter pelo menos 80% de identidade de sequência. Por exemplo, sequências substancialmente homólogas podem ter de a partir de cerca de 80% a 100% de identidade de sequência, tal como cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%: cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94%; cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; e cerca de 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada com hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando há um grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não específica do ácido nucleico a sequências não alvo sob condições onde ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridização adstringentes.
[000169] Conforme aqui usado, o termo "ortólogo" (ou "ortólogos") refere-se a um gene em duas ou mais espécies que se desenvolveram a partir de uma sequência de nucleotídeo ancestral comum e pode reter a mesma função nas duas ou mais espécies.
[000170] Conforme aqui usado, duas moléculas de sequência de ácido nucleico são ditas exibir "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma sequência lida na direção 5' para 3' é complementar a cada nucleotídeo da outra sequência quando lida na direção 3' para 5'. Uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de nucleotídeo de referência vai exibir uma sequência idêntica à sequência de complemento reverso da sequência de nucleo- tídeo de referência. Esses termos e descrições são bem definidos na técnica e são facilmente compreendidos por aqueles de habilidade comum na técnica.
[000171] Quando determinando a porcentagem de identidade de se- quência entre sequências de aminoácido, é bem conhecido daqueles de habilidade na técnica que a identidade do aminoácido em uma dada posição provida por um alinhamento pode diferir sem afetar propriedades desejadas dos polipeptídeos compreendendo as sequências alinhadas. Nesses casos, a identidade de sequência percentual pode ser ajustada para permitir similaridade entre aminoácidos conservati- vamente substituídos. Esses ajustes são bem conhecidos e geralmente usados por aqueles de habilidade na técnica. Vide, por exemplo, Myers e Miller (1988), Computer Applications in Biosciences 4:11-7.
[000172] As modalidades da invenção incluem variantes funcionais de sequências de aminoácido de peptídeo de trânsito de plastídeo exemplares e sequências de ácido nucleico realizando sua codificação. Uma variante funcional de uma sequência de peptídeo de trânsito exemplar pode ser, por exemplo, um fragmento de uma sequência de aminoácido de peptídeo de trânsito exemplar (tal como um fragmento N-terminal ou C-terminal) ou uma sequência modificada de uma sequência de aminoácido de peptídeo de trânsito exemplar de comprimento integral ou fragmento de uma sequência de aminoácido de pep- tídeo de trânsito exemplar. Uma sequência de aminoácido de peptídeo de trânsito exemplar pode ser modificada em algumas modalidades através da introdução de uma ou mais substituições de aminoácido conservativas. Uma substituição de aminoácido "conservativa" é uma onde o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de amino- ácido tendo uma cadeia lateral funcional similar, tamanho similar e/ou hidrofobicidade similar. Famílias de aminoácidos que podem ser usadas para substituir outro aminoácido da mesma família a fim de introduzir uma substituição conservativa são conhecidas na técnica. Por exemplo, essas famílias de aminoácido incluem: aminoácidos básicos (por exemplo, lisina, arginina e histidina); aminoácidos ácidos (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico); aminoácidos polares não carregados (por exemplo, glicina, asparaginas, glutamina, serina, treo- nina, tirosina e citosina); aminoácidos não polares (por exemplo, alani- na, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e tripto- fano); aminoácidos beta-ramificados (por exemplo, treonina, valina e isoleucina); e aminoácidos aromáticos (por exemplo, tirosina, fenilala- nina, triptofano e histidina). Vide, por exemplo, Sambrook e outros (Eds.), supra; e Innis e outros, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, NY, USA.
[000173] Operavelmente ligado: Uma primeira sequência de nucleo- tídeo é "operavelmente ligada" com uma segunda sequência de nucle- otídeo quando a primeira sequência de nucleotídeo está em uma relação funcional com a segunda sequência de nucleotídeo. Por exemplo, um promotor está operavelmente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afetar a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Quando recombinantemente produzidas, sequências de nucleotídeo operavelmente ligadas são geralmente contíguas e, onde necessário unir duas regiões de codificação de proteína, na mesma estrutura de leitura. No entanto, sequências de nucleotídeo não precisam ser contíguas para serem operavelmente ligadas.
[000174] O termo "operavelmente ligado", quando usado em referência a uma sequência reguladora e uma sequência de codificação, significa que a sequência reguladora afeta a expressão da sequência de codificação ligada. "Sequências reguladoras" ou "elementos de controle" se referem a sequências de nucleotídeo que influenciam o momento e nível/quantidade de transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores; sequências líderes de tradução; íntrons; realçadores; estruturas haste-alça; sequências de ligação repressoras; sequências de terminação; sequências de reconhecimento de poliadenilação; etc. Sequências reguladoras particulares podem estar localizadas a montante e/ou a jusante de uma sequência de codificação operavelmente ligada a elas. Também, sequências reguladoras particulares operavelmente ligadas a uma sequência de codificação podem estar localizadas no filamento complementar associado de uma molécula de ácido nucleico de filamento duplo.
[000175] Quando usado em referência a duas ou mais sequências de aminoácido, o termo "operavelmente ligado" significa que a primeira sequência de aminoácido está em uma relação funcional com pelo menos uma das sequências de aminoácido adicionais. Por exemplo, um peptídeo de trânsito (por exemplo, um CTP) está operavelmente ligado a uma segunda sequência de aminoácido dentro de um polipep- tídeo compreendendo ambas as sequências se o peptídeo de trânsito afetar a expressão ou tráfego do polipeptídeo ou segunda sequência de aminoácido.
[000176] Promotor: Conforme aqui usado, o termo "promotor" se refere a uma região de DNA que pode estar a montante do início de transcrição e que pode estar envolvida em reconhecimento e ligação de polimerase de RNA e outras proteínas para iniciar transcrição. Um promotor pode estar operavelmente ligado a uma sequência de codificação para expressão em uma célula ou um promotor pode estar ope- ravelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de sinal que pode estar operavelmente ligada a uma sequência de codificação para expressão em uma célula. Um "promotor de planta" pode ser um promotor capaz de iniciar transcrição em células de planta. Exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que iniciam preferivelmente transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xi- lema, traqueídos ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como "preferidos de tecido". Promotores que iniciam transcrição apenas em certos tecidos são referidos como "específicos de tecido". Um promotor "específico de tipo de célula" dirige expressão principalmente em certos tipos em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível" pode ser um promotor que pode estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas e a presença de luz. Promotores específicos de tecido, preferidos de tecido, específicos de tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor que pode ser ativo sob a maioria das condições ambientais.
[000177] Qualquer promotor induzível pode ser usado em algumas modalidades da invenção. Vide Ward e outros (1993), Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução. Promotores induzíveis exemplares incluem, mas não estão limitados a: Promotores do sistema ACEI que responde a cobre; gene In2 de milho que responde a protetores de herbicida de benzenossulfonamida; repressor Tet de Tn10; e o promotor induzível de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcripcional pode ser induzida por um hormônio glicocorticosteroide (Schena e outros (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421).
[000178] Promotores constitutivos exemplares incluem, mas não estão limitados a: Promotores de vírus de planta, tal como o promotor 35S de CaMV; promotores do gene da actina do arroz; promotores da ubiquitina; pEMU; MAS; promotor da histona H3 do milho; e o promotor de ALS, fragmento Xba1/NcoI 5' para o gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou uma similaridade de sequência de nucleotídeo com o dito fragmento Xba1/NcoI) (Publicação PCT Internacional N°. WO 96/30530).
[000179] Ainda, qualquer promotor específico de tecido ou preferido de tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico compre-endendo uma sequência de codificação operavelmente ligada a um promotor específico de tecido podem produzir o produto da sequência de codificação exclusivamente, ou preferivelmente, em um tecido específico. Promotores específicos de tecido ou preferidos de tecido exemplares incluem, mas não estão limitados a: um promotor preferido de raiz, tal como aquele do gene da faseolina; um promotor específico de folha e induzido por luz tal como aquele de cab ou rubisco; um promotor específico de antera tal como aquele de LAT52; um promotor específico de pólen tal como aquele de Zm13; e um promotor preferido de microesporo tal como aquele de apg.
[000180] Transformação: Conforme aqui usado, o termo "transformação" ou "transdução" refere-se a uma transferência de uma ou mais moléculas de ácido nucleico para uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucleico transduzida na célula quando a molécula de ácido nucleico se torna estavelmente replicada pela célula, ou através de incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular ou através de replicação epissomal. Conforme aqui usado, o termo "transformação" compreende todas as técnicas através das quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmídeo; eletroporação (Fromm e outros (1986), Nature 319:791-3); lipofecção (Felgner e outros (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); microinjeção (Mueller e outros (1978), Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley e outros (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); absorção de DNA direta; e bombardeamento por micropro- jéctil (Klein e outros (1987), Nature 327:70).
[000181] Transgene: Uma sequência de ácido nucleico exógena. Em alguns exemplos, um transgene pode ser uma sequência que codifica um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. Em exemplos particulares, um transgene pode ser codificado por um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético e pelo menos uma sequência de peptí- deo adicional (por exemplo, uma sequência de peptídeo que confere resistência a herbicida), para a qual expressão de plastídeo é desejável. Nesses e outros exemplos, um transgene pode conter sequências reguladoras operavelmente ligadas a uma sequência de codificação do transgene (por exemplo, um promotor). Para os propósitos da presente invenção, o termo "transgênico" quando usado para se referir a um organismo (por exemplo, uma planta) refere-se a um organismo que compreende a sequência de ácido nucleico exógena. Em alguns exemplos, o organismo compreendendo a sequência de ácido nucleico exógena pode ser um organismo no qual a sequência de ácido nuclei- co foi introduzida através de técnicas de transformação molecular. Em outros exemplos, o organismo compreendendo a sequência de ácido nucleico exógena pode ser um organismo no qual a sequência de ácido nucleico foi introduzida através de, por exemplo, introgressão ou polinização cruzada em uma planta.
[000182] Transporte: Conforme aqui usado, os termos "transpor- te(s)", "alvo(s)" e "transferência(s)" se referem à propriedade de certas sequências de aminoácido da invenção que facilita o movimento de um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido do núcleo de uma célula hospedeira para um plastídeo da célula hospedeira. Em modalidades particulares, tal sequência de aminoácido (isto é, uma sequência de CTP derivada de Brassica sintética) pode ser capaz de transportar cerca de 100%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 60% e/ou pelo menos cerca de 50% de um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido para plastídeos de uma célula hospedeira.
[000183] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico é introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucleico que permitem que ele replique na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a: um plasmí- deo; cosmídeo; bacteriófago; ou vírus que carrega DNA exógeno para uma célula. Um vetor pode também incluir um ou mais genes, moléculas de antissenso e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, desta maneira fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor inclui opcionalmente materiais para auxiliar na obtenção da entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossoma, revestimento de proteína, etc).
[000184] A menos que especificamente indicado ou implicado, os termos "um", "uma", "o" e "a" significam "pelo menos um", conforme aqui usado.
[000185] A menos que de outra maneira especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que geralmente compreendido por aqueles de habilidade comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo, Lewin, B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 019-854287-9); Kendrew e outros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science, Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as porcentagens estão em peso e todas as proporções de mistura de solvente são em volume a menos que de outra maneira menci- onado. Todas as temperaturas estão em graus Celsius.
IV. Moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de codificação de CTP derivado de Brassica sintético
[000186] Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo de interesse. Em modalidades particulares, a sequência de nucleotídeo de interesse pode ser uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse. Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nu- cleico única é provida, a qual codifica um polipeptídeo onde uma sequência de TraP8 ou TraP9 é fundida ao terminal N de um polipeptí- deo de interesse.
[000187] Um CTP derivado de Brassica sintético pode ser derivado de um gene EPSPS de Brassica. Em exemplos particulares de tais modalidades, o gene EPSPS de Brassica pode ser um que compreende a sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO:14 ou uma sequência de ácido nucleico homóloga de um gene EPSPS diferente ou pode ser um ortólogo do gene EPSPS de Brassica compreendendo a sequência de ácido nucleico mostrada como SEQ ID NO:14 (por exemplo, o gene EPSPS de Brassica compreendendo a sequência de ácido nucleico mostrada como SEQ ID NO:15).
[000188] Em algumas modalidades, um peptídeo de trânsito de clo- roplasto derivado de Brassica sintético pode ser um CTP derivado de Brassica quimérico. Um CTP derivado de Brassica quimérico sintético pode ser derivado de uma sequência de CTP de Brassica de referência através da união de uma primeira sequência de aminoácido contígua compreendida dentro da sequência de CTP de Brassica de referência a uma segunda sequência de aminoácido contígua compreendida dentro de uma sequência de CTP diferente (por exemplo, uma segunda sequência de CTP de Brassica). Em modalidades particulares, a sequência de CTP diferente compreendendo a segunda sequência de aminoácido contígua pode ser codificada por uma sequência de gene homóloga de um genoma outro que não aquele de Brassica sp. da qual a sequência de referência foi obtida (por exemplo, uma Brassica sp. diferente, uma planta que não uma Brassica sp.; um eu- carionte fotossintético inferior, por exemplo, um Clorofito; e um proca- rionte, por exemplo, uma Cyanobacterium ou Agrobacterium). Desta maneira, uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético pode ser derivada de uma sequência de gene de codificação de CTP de Brassica de referência através da fusão de uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido contígua da sequência de CTP de Brassica de referência com uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido contígua de uma sequência de CTP diferente que é homóloga ao restante da sequência de CTP de Brassica de referência. Nesses e em outros exemplos, a sequência de aminoácido contígua da sequência de CTP de Brassica de referência pode estar localizada na extremidade 5' ou na extremidade 3' do CTP derivado de Brassica sintético.
[000189] Em algumas modalidades, um CTP derivado de Brassica quimérico sintético pode ser derivado de uma pluralidade de sequências de CTP de Brassica (incluindo uma sequência de CTP de Brassica de referência) através da união de uma sequência de aminoácido contígua compreendida dentro da sequência de CTP de Brassica a uma sequência de aminoácido contígua compreendida dentro de uma sequência de CTP de Brassica diferente. Em modalidades particulares, a pluralidade de sequências de CTP de Brassica pode ser codificada por sequências de gene hortólogas em diferentes espécies de Brassica. Em alguns exemplos, a pluralidade de sequências de CTP de Brassica pode ser exatamente duas sequências de CTP de Brassi ca. Desta maneira, uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica quimérico sintético pode ser derivada de duas sequências de gene de codificação de CTP de Brassica homólogas (por exemplo, substancialmente homólogas) (por exemplo, sequências de gene ortólogas) através de fusão da sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácido contígua de uma das sequências de CTP de Brassica com a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido contígua das outras sequências de CTP de Brassica que é homóloga ao restante da primeira sequência de CTP de Brassica. TraP8 e TraP9 são exemplos ilustrativos de tal CTP derivado de Brassica quimérico sintético.
[000190] Um versado comum na técnica vai compreender que, seguindo a seleção de uma primeira sequência de aminoácido contígua dentro de uma sequência de CTP de Brassica, identificação e seleção da sequência de aminoácido contígua do restante de uma sequência de CTP homóloga de acordo com o processo de derivação acima são sem ambiguidade e automáticas. Em alguns exemplos, a primeira sequência de aminoácido contígua pode ser entre cerca de 25 e cerca de 41 ami- noácidos de comprimento (por exemplo, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 e 42 aminoácidos de comprimento). Em algumas modalidades, a primeira sequência de aminoácido contígua dentro da sequência de CTP de Brassica de referência é definida pela posição na extremidade 3' de um motivo "SVSL" (SEQ ID NO:13) que é conservado dentro de alguns genes de EPSPS de Brassica.
[000191] Exemplos de sequências de CTP derivado de Brassica quimérico sintético de acordo com o processo acima são representados pela SEQ ID NO:3 e pela SEQ ID NO:4. Em vista da degeneração do código genético, o gênero de sequências de nucleotídeo codificando esses peptídeos será imediatamente previsto por um versado comum na técnica. Exemplos de tais sequências de polinucleotídeo in- cluem SEQ ID NOs:5, 6, 8 e 9. Esses exemplos particulares ilustram as características estruturais de CTPs derivados de Brassica quiméricos sintéticos através da incorporação de sequências contíguas de um CTP homólogo de um de vários ortólogos de ESPSP de um gene ES- PSP de B. napus.
[000192] Algumas modalidades incluem variantes funcionais de um peptídeo de trânsito de cloroplasto derivado de Brassica sintético e/ou ácidos nucleicos codificando o mesmo. Tais variantes funcionais incluem, por exemplo e sem limitação: uma sequência de codificação de CTP derivado de Brassica sintético que é derivada de um homólogo e/ou ortólogo de uma ou ambas as sequências de codificação de CTP de Brassica mostradas nas SEQ ID NOs:14 e/ou SEQ ID NO:15 e/ou um CTP então codificado; um ácido nucleico que codifica um CTP derivado de Brassica sintético que compreende uma sequência de ami- noácido contígua dentro de SEQ ID NO:1 e/ou SEQ ID NO:2 e/ou um CTP então codificado; uma sequência de codificação de CTP derivado de Brassica sintético truncado que compreende uma sequência de ácido nucleico contígua dentro de uma das SEQ ID NOs: 5, 6, 8 e 9; uma sequência de codificação de CTP derivado de Brassica sintético truncado que compreende uma sequência de ácido nucleico contígua que é substancialmente homóloga a uma de SEQ ID NOs: 5, 6, 8 e 9; um CTP derivado de Brassica sintético truncado que compreende uma sequência de aminoácido contígua dentro de uma das SEQ ID NOs: 3 e 4; um ácido nucleico que codifica um CTP derivado de Brassica sintético compreendendo uma sequência de aminoácido contígua dentro de uma de SEQ ID NOs: 5, 6, 8 e 9 e/ou um CTP então codificado; um ácido nucleico que codifica um CTP derivado de Brassica sintético compreendendo uma sequência de aminoácido contígua dentro de uma de SEQ ID NOs: 3 e 4 que tem uma ou mais substituições de aminoácido conservativas e/ou um CTP então codificado; e um ácido nucleico que codifica um CTP derivado de Brassica sintético compre-endendo uma sequência de aminoácido contígua dentro de um de SEQ ID NOs: 3 e 4 que tem uma ou mais substituições de aminoácido não conservativas que são demonstradas direcionar um peptídeo ope- ravelmente ligado a um plastídeo em uma célula contendo plastídeo e/ou um CTP então codificado.
[000193] Desta maneira, algumas modalidades da invenção incluem uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica quimérico sintético compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido con- servativas. Tais moléculas de ácido nucleico podem ser úteis, por exemplo, na facilitação da manipulação de uma sequência de codificação de CTP da invenção em técnicas de biologia molecular. Por exemplo, em algumas modalidades, uma sequência de codificação de CTP da invenção pode ser introduzida em um vetor adequado para subclonagem da sequência em um vetor de expressão ou uma sequência de codificação de CTP da invenção pode ser introduzida em uma molécula de ácido nucleico que facilita a produção de uma molécula de ácido nucleico adicional compreendendo a sequência codificando CTP operavelmente ligada a uma sequência de nucleotídeo de interesse. Nessas e em modalidades adicionais, uma ou mais posições de aminoácido na sequência de um CTP derivado de Brassica quimérico sintético podem ser deletadas. Por exemplo, a sequência de um CTP derivado de Brassica quimérico sintético pode ser modificada de maneira que o(s) aminoácido(s) na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 na sequência é/sejam dele- tados. Um alinhamento de sequências de CTP homólogas pode ser usado para prover orientação de quais aminoácidos podem ser deleta- dos sem afetar a função do CTP sintético.
[000194] Em exemplos particulares, um peptídeo de trânsito de clo- roplasto derivado de Brassica sintético é de menos do que 80 aminoá- cidos de comprimento. Por exemplo, um CTP derivado de Brassica sintético pode ser de 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60 ou menos aminoácidos de comprimento. Em certos exemplos um CTP derivado de Brassica sintético pode ser de cerca de 65, cerca de 68, cerca de 72 ou cerca de 74 aminoácidos de comprimento. Nesses e em exemplos particulares, um CTP derivado de Brassica sintético pode compreender uma sequência de aminoáci- do mostrada em uma de SEQ ID NOs: 3 e 4 ou uma variante funcional de qualquer uma das acima. Desta maneira, um CTP derivado de Brassica sintético pode compreender uma sequência de aminoácido compreendendo uma de SEQ ID NOs: 3 e 4 ou uma variante funcional da mesma, onde o comprimento do CTP derivado de Brassica sintético é menos do que 80 aminoácidos de comprimento. Em certos exemplos, um CTP derivado de Brassica sintético pode compreender uma sequência de aminoácido que é, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma de SEQ ID NOs: 3 e 4.
[000195] Todas das sequências de nucleotídeo que codificam um CTP derivado de Brassica sintético particular, por exemplo, o peptídeo TraP8 de SEQ ID NO:3 e o peptídeo TraP9 de SEQ ID NO:4, ou variantes funcionais de qualquer uma das acima incluindo quaisquer dele- ções e/ou substituições de aminoácido conservativas, serão reconhecíveis por aqueles versados na técnica em vista da presente invenção. A degeneração do código genético provê um número finito de sequências de codificação para uma sequência de aminoácido particular. A seleção de uma sequência particular para codificar um CTP derivado de Brassica sintético é da competência do praticante. Sequências de codificação diferentes podem ser desejáveis em diferentes aplicações. Por exemplo, para aumentar a expressão do CTP derivado de Brassica sintético em um hospedeiro particular, uma sequência de codificação pode ser selecionada, a qual reflete a tendência de uso do códon do hospedeiro. A título de exemplo, um CTP derivado de Brassica sintético pode ser codificado por uma sequência de nucleotídeo descrita como uma de SEQ ID NOs: 5, 6, 8 e 9.
[000196] Em moléculas de ácido nucleico providas em algumas mo-dalidades da invenção, o último códon de uma sequência de nucleotí- deo codificando um CTP derivado de Brassica sintético e o primeiro códon de uma sequência de nucleotídeo de interesse podem ser separados por qualquer número de tripletos de nucleotídeo, por exemplo, sem codificação para um íntron ou um "STOP". Em alguns exemplos, uma sequência codificando os primeiros aminoácidos de uma proteína madura normalmente associada com um peptídeo de trânsito de clo- roplasto em um polipeptídeo precursor natural pode estar presente entre o último códon de uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético e o primeiro códon de uma sequência de nucleotídeo de interesse. Uma sequência separando uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético e o primeiro códon de uma sequência de nucleotídeo de interesse pode, por exemplo, consistir em qualquer sequência, de maneira que a sequência de aminoácido codificada não seja provável alterar significantemente a tradução do polipeptídeo quimérico e sua translo- cação para um plastídeo. Nessas e em modalidades adicionais, o último códon de uma sequência de nucleotídeo codificando um peptídeo de trânsito de cloroplasto derivado de Brassica sintético pode ser fundido em fase-registro com o primeiro códon da sequência de nucleotí- deo de interesse diretamente contíguo a ele, ou separado dele por não mais do que uma sequência de peptídeo curta, tal como aquela codificada por um ligante de nucleotídeo sintético (por exemplo, um ligante de nucleotídeo que pode ter sido usado para obter a fusão).
[000197] Em algumas modalidades, pode ser desejável modificar os nucleotídeos de uma sequência de nucleotídeo de interesse e/ou uma sequência de codificação de CTP derivado de Brassica sintético fundida a ela em uma sequência de codificação única, por exemplo, para aumentar a expressão da sequência de codificação em um hospedeiro particular. O código genético é redundante com 64 códons possíveis, mas a maioria dos organismos usa preferivelmente um subconjunto desses códons. Os códons que são utilizados com mais frequência em uma espécie são chamados códons ótimos, e aqueles não utilizados com muita frequência são classificados como códons raros ou de pouco uso. Zhang e outros (1991), Gene 105:61-72. Códons podem ser substituídos para refletir o uso de códon preferido de um hospedeiro particular em um processo algumas vezes referido como "otimização de códon". Sequências de codificação otimizadas contendo códons preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico particular podem ser preparadas, por exemplo, para aumentar a taxa de tradução ou produzir transcritos de RNA recombinantes tendo propriedades desejadas (por exemplo, uma meia-vida mais longa, comparado com transcritos produzidos a partir de uma sequência não otimizada).
[000198] Qualquer polipeptídeo pode ser direcionado a um plastídeo de uma célula contendo plastídeo através da incorporação de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético. Por exemplo, um poli- peptídeo pode ser ligado a uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético em algumas modalidades, de maneira a direcionar o po- lipeptídeo para um plastídeo em uma célula onde a molécula de CTP de polipeptídeo ligada é expressa. Em modalidades particulares, um polipeptídeo direcionado a um plastídeo através de incorporação de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético pode ser, por exemplo, um polipeptídeo que é normalmente expresso em um plastí- deo de uma célula onde o polipeptídeo é nativamente expresso. Por exemplo e sem limitação, um polipeptídeo direcionado a um plastídeo através da incorporação de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético pode ser um polipeptídeo envolvido em resistência a herbicida, resistência a vírus, resistência a patógeno bacteriano, resistência a inseto, resistência a nematoide ou resistência fúngica. Vide, por exemplo, Patentes U.S. N°s. 5.569.823; 5.304.730; 5.495.071; 6.329.504; e 6.337.431. Um polipeptídeo direcionado a um plastídeo através da incorporação de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético pode ser alternativamente, por exemplo e sem limitação, um polipeptídeo envolvido em vigor ou rendimento de planta (incluindo polipeptídeos envolvidos em tolerância a temperaturas extremas, condições do solo, níveis de luz, níveis de água e ambiente químico) ou um polipeptídeo que pode ser usado como um marcador para identificar uma planta compreendendo uma característica de interesse (por exemplo, um produto de gene marcador selecionável, um polipeptídeo envolvido em cor de semente, etc).
[000199] Exemplos não limitantes de polipeptídeos envolvidos em resistência a herbicida que podem ser ligados a uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético em algumas modalidades da invenção incluem: acetolactase sintase (ALS), ALS mutada e precursores de ALS (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.013.659); EPSPS (vide, por exemplo, Patentes U.S. 4.971.908 e 6.225.114)) tais como EPSPS CP4, EPSPS classe III ou uma EPSPS classe IV; enzimas que modificam um processo fisiológico que ocorre em um plastídeo, incluindo fotossíntese, e síntese de ácidos graxos, aminoácidos, óleos, arote- noides, terpenoides, amido, etc. Outros exemplos não limitantes de polipeptídeos que podem ser ligados a um peptídeo de trânsito de clo- roplasto derivado de Brassica sintético em modalidades particulares incluem: zeaxantina epoxidase, colina mono-oxigenase, ferroquela- tase, dessaturase de ácido graxo ômega-3, glutamina sintetase, enzimas de modificação de amido, polipeptídeos envolvidos em síntese de aminoácidos essenciais, provitamina A, hormônios, proteínas da toxina de Bt, etc. Sequências de nucleotídeo codificando os peptídeos mencionados acima são conhecidas na técnica e tais sequências de nu- cleotídeo podem ser operavelmente ligadas a uma sequência de nu- cleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético a ser expresso em um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo de interesse ligado ao CTP derivado de Brassica sintético. Ainda, sequências de nucleotídeo adicionais codificando qualquer um dos polipeptídeos mencionados acima podem ser identificadas por aqueles de habilidade na técnica (por exemplo, através de clonagem de genes com alta ho- mologia com outros genes codificando o polipeptídeo particular). Uma vez tal sequência de nucleotídeo tendo sido identificada, é um processo direto projetar uma sequência de nucleotídeo compreendendo uma sequência codificando CTP derivado de Brassica sintético operavel- mente ligada à sequência de nucleotídeo identificada, ou uma sequência codificando um polipeptídeo equivalente.
V. Expressão de polipeptídeos compreendendo um peptídeo de trânsito de cloroplasto derivado de Brassica sintético
[000200] Em algumas modalidades, pelo menos uma molécula(s) de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético, ou equivalente funcional do mesmo, pode ser introduzida em uma célula, tecido ou organismo para expressão do polipeptídeo no mesmo. Em modalidades particulares, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeo de interesse operavelmente ligada a uma sequência de nucleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de codi- ficação codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético e pelo menos uma sequência de peptídeo adicional codificada por uma sequência de nucleotídeo de interesse. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser introduzida em uma célula hospedeira contendo plastídeo, tecido ou organismo (por exemplo, uma célula de planta, tecido de planta e planta), de maneira que um polipeptídeo pode ser expresso a partir da molécula de ácido nucleico na célula hospedeira contendo plastídeo, tecido ou organismo, onde o polipeptídeo expresso compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético e pelo menos uma sequência de peptídeo adicional codificada por uma sequência de nucleotídeo de interesse. Em certos exemplos, o CTP derivado de Brassica sintético de tal polipeptídeo expresso pode facilitar direcionamento de uma porção do polipeptídeo compreendendo pelo menos a sequência de peptídeo adicional para um plastídeo da célula hospedeira, tecido ou organismo.
[000201] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser introduzida em uma célula contendo plastídeo através de qualquer uma das metodologias conhecidas daqueles de habilidade na técnica. Em modalidades particulares, uma célula hospedeira, tecido ou organismo pode ser contatado com uma molécula de ácido nucleico da invenção a fim de introduzir a molécula de ácido nucleico na célula, tecido ou organismo. Em modalidades particulares, uma célula pode ser transformada com uma molécula de ácido nuclei- co da invenção de maneira que a molécula de ácido nucleico é introduzida na célula, e a molécula de ácido nucleico é estavelmente integrada no genoma da célula. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de nu- cleotídeo codificando um CTP derivado de Brassica sintético opera- velmente ligado a uma sequência de nucleotídeo de interesse pode ser usada para transformação de uma célula, por exemplo, uma célula contendo plastídeo (por exemplo, uma célula de planta). A fim de iniciar ou realçar a expressão, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma ou mais sequências reguladoras, sequências reguladoras que podem ser operavelmente ligadas à sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético.
[000202] Uma molécula de ácido nucleico pode, por exemplo, ser um sistema de vetor incluindo, por exemplo, um plasmídeo linear ou um circular fechado. Em modalidades particulares, o vetor pode ser um vetor de expressão. Sequências de ácido nucleico da invenção podem, por exemplo, ser inseridas em um vetor, de maneira que a sequência de ácido nucleico é operavelmente ligada a uma ou mais sequências reguladoras. Muitos vetores estão disponíveis para este propósito, e seleção do vetor particular pode depender, por exemplo, do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Um vetor contém tipicamente vários componentes, cuja identidade depende de uma função do vetor (por exemplo, amplificação de DNA e expressão de DNA) e da(s) célu- la(s) hospedeira particular(es) com as quais o vetor é compatível.
[000203] Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de planta que compreende uma sequência de nucleotídeo compreendendo pelo menos uma das sequências reguladoras descritas acima operavelmente ligada a uma ou mais sequência(s) de nucle- otídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. A uma ou mais sequências de nu- cleotídeo podem ser expressas, sob o controle da(s) sequência(s) re- guladora(s), em uma célula de planta, tecido ou organismo para produzir um polipeptídeo compreendendo um CTP derivado de Brassica sintético que direciona pelo menos uma porção do polipeptídeo a um plastídeo da célula de planta, tecido ou organismo.
[000204] Em algumas modalidades, uma sequência reguladora ope- ravelmente ligada a uma sequência de nucleotídeo codificando um po- lipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético pode ser uma sequência promotora que funciona em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana onde a molécula de ácido nucleico deve ser amplificada, ou uma célula de planta onde a molécula de ácido nucleico deve ser expressa. Promotores adequados para uso em moléculas de ácido nucleico da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, todos eles são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de promotores que podem ser úteis em modalidades da invenção são providos por: Patentes U.S. N°s. 6.437.217 (promotor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor da actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores do milho constitutivos); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S); 6.433.252 (promotor da oleosina do milho L3); 6.429.357 (promotor da actina 2 do arroz e íntron da actina do arroz 2); 6.294.714 (promotores induzíveis por luz); 6.140.078 (promotores induzíveis por sal); 6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno); 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor gama-coixina); e Pedido de Patente U.S. N°. de Série 09/757.089 (promotor da aldolase do cloroplasto do milho).
[000205] Promotores exemplares adicionais incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert e outros (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745:9); promotor da octopina sintase (OCS) (que é carregado em plasmídeos de indução de tumor de Agrobacterium tumefa- ciens); os promotores de caulimovirus tais como o promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 19S (Lawton e outros (1987), Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor 35S (Odell e outros (1985), Nature 313:810-2; o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Walker e outros (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19);6624-8); o promotor da sacarose sintase (Yang e Russell (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); o promotor do complexo do gene R (Chandler e outros (1989), Plant Cell 1:1175-83); o promotor do gene da proteína de ligação a/b da clorofila; CaMV35S (Patentes U.S. N°s. 5.322.938; 5.352.605; 5.359.142 e 5.530.196); FMV35S (Patentes U.S. N°s. 6.051.753 e 5.378.619); um promotor PC1SV (Patente U.S. N°. 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente U.S. N°. 6.677.503); e promotores AGRtu.nos (No. Acesso GenBank V00087; Depicker e outros (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan e outros (1983), Nature 304:184-7).
[000206] Em modalidades particulares, as moléculas de ácido nu- cleico da invenção podem compreender um promotor específico de tecido. Um promotor específico de tecido é uma sequência de nucleo- tídeo que direciona um nível de transcrição maior de uma sequência de nucleotídeo operavelmente ligada no tecido para o qual o promotor é específico, com relação a outros tecidos do organismo. Exemplos de promotores específicos de tecido incluem, sem limitação: promotores específicos da camada de células; promotores específicos da antera; promotores específicos do pólen (vide, por exemplo, Patente U.S. N°. 7.141.424 e Publicação PCT Internacional N°. WO 99/042587); promotores específicos de óvulo (vide, por exemplo, Pedido de Patente U.S. N°. 2001/047525 A1); promotores específicos de fruta (vide, por exemplo, Patentes U.S. N°s. 4.943.674 e 5.753.475); e promotores específicos de semente (vide, por exemplo, Patentes U.S. N°s. 5.420.034 e 5.608.152). Em algumas modalidades, um promotor específico do estágio do desenvolvimento (por exemplo, um promotor ativo em um estágio posterior em desenvolvimento) pode ser usado em uma compo- sição ou método da invenção.
[000207] Sequências reguladoras adicionais que podem em algumas modalidades ser operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nu- cleico incluem 5' UTRs localizadas entre uma sequência promotora e uma sequência de codificação que funciona como uma sequência líder de tradução. A sequência líder de tradução está presente no mRNA in-tegralmente processado, e pode afetar processamento do transcrito primário e/ou estabilidade do RNA. Exemplos de sequências líderes de tradução incluem líderes de proteína de choque térmico do milho e pe- túnia (Patente U.S. N°. 5.362.865), líderes de proteína de revestimento do vírus de planta, líderes de rubisco de planta e outros. Vide, por exemplo, Turner e Foster (1995), Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitantes de 5' UTRs são providos por: GmHsp (Patente U.S. N°. 5.659.122); PhDnak (Patente U.S. N°. 5.362.865); AtAntl; TEV (Carrington e Freed (1990), J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (N°. Acesso GenBank V00087); e Bevan e outros (1983), Nature 304:184-7).
[000208] Sequências reguladoras adicionais que podem em algumas modalidades estar operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico também incluem sequências não traduzidas 3', regiões de terminação de transcrição 3' ou regiões de poliadenilação. Esses são elementos genéticos localizados a jusante de uma sequência de nu- cleotídeo e incluem polinucleotídeos que proveem sinal de poliadenila- ção e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar transcrição ou processamento de RNA. O sinal de poliadenilação funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos de poliadenilação à extremidade 3' do precursor de mRNA. A sequência de poliadenilação pode ser derivada de uma variedade de genes de planta ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitante de uma região de terminação de transcrição 3' é a região 3' da nopalina sintase (nos 3'; Fraley e outros (1983), Proc. Natl Acad. Sci. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de regiões não traduzidas 3' diferentes é provido em Ingelbrecht e outros (1989), Plant Cell 1:671-80. Exemplos não limitantes de sinais de poliadenila- ção incluem um de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi e outros (1984), EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (No. Acesso GenBank E01312).
[000209] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável em uma célula transformada, tal como uma célula de planta. Marcadores selecionáveis podem também ser usados para selecionar plantas ou células de planta que compreendem molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar resistência a biocida, resistência a antibiótico (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, higromicina, etc) ou resistência a herbicida (por exemplo, glifosato, etc). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a: um gene neo que codifica resistência à canamicina e pode ser selecionado para uso de canamicina, G418, etc; um gene pat ou bar que codifica resistência a bialafos; um gene de EPSP sintase mutante que codifica resistência a glifosato; um gene da nitrilase que confere resistência à bromoxinila; um gene da acetolactato sintase mutante (ALS) que confere resistência à imidazolinona ou sulfonilureia; e um gene DHFR resistente a metotrexato. Marcadores selecionáveis múltiplos estão disponíveis, os quais conferem resistência à ampicilina, bleomicina, clo- ranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotre- xato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estrep- tomicina e tetraciclina e similar. Exemplos de marcadores selecionáveis são ilustrados nas, por exemplo, Patentes U.S. N°s. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.
[000210] Uma molécula ou vetor de ácido nucleico recombinante da presente invenção pode também ou alternativamente incluir um mar- cador selecionável. Marcadores selecionáveis podem ser usados para monitorar expressão. Marcadores selecionáveis exemplares incluem um gene da β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson e outros (1987), Plant Mol. Biol. Rep. 5.387.405); um gene de locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocia- nina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta e outros (1988), "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging wit Ac" In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson e R. Appels, eds. (Nova York: Plenum), pp. 263-82); um gene da β-lactamase (Sutcliffe e outros (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogêni- ca); um gene da luciferase (Ow e outros (1986), Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski e outros (1983), Gene 46(2- 3):247-55); um gene da amilase (Ikatu e outros (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene da tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa em melanina (Katz e outros (1983), J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma α-galactosidase.
[000211] Métodos adequados para transformação de células hospedeiras incluem qualquer método através do qual DNA pode ser introduzido em uma célula, por exemplo e sem limitação: através da transformação de protoplastos (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.508.184); através de absorção de DNA mediada por dissecação/inibição (vide, por exemplo, Potrykus e outros (1985), Mol. Gen. Genet. 199:183-8); através de eletroporação (vide, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.384.253); através de agitação com fibras de carbida de silício (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.302.523 e 5.464.765); através de transformação medi- ada por Agrobacterium (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.563.055, 5.591.616, 5.693.512, 5.842.877, 5.981.840 e 6.384.301); e através de aceleração de partículas revestidas com DNA (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861 e 6.403.865), etc. Através da aplicação de técnicas tais como essas, as células de virtualmente qualquer espécie podem ser estavelmente transformadas. Em algumas modalidades, DNA transformante é integrado ao genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelu- lares, células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Alternativamente, as células transgênicas podem não ser capazes de regeneração para uma planta. Qualquer uma dessas técnicas pode ser usada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico da invenção no genoma da planta transgênica.
[000212] O método mais amplamente utilizado para introdução de um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas de planta que transformam geneticamente células de planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis por transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (tumor-inducing (indução de tumor)) contêm um segmento grande, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de T-DNA é contornada por repetições terminais. Em alguns vetores binários modificados, os genes de indução de tumor foram deletados, e as funções da região vir são utilizadas para transferir DNA estranho contornado pelas sequências de borda de T-DNA. A região T pode também conter, por exemplo, um marcador selecionável para recuperação eficiente de plantas e células transgênicas, e um sítio de clonagem múltiplo para inserção de sequências para transferência tal como ácido nucleico de codificação de CTP derivado de Brassica sintético.
[000213] Desta maneira, em algumas modalidades, um vetor de transformação de planta pode ser derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (vide, por exemplo, Patentes U.S. N°s. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e 5.501.967; e Patente Europeia EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Vetores de transformação de planta adicionais incluem, por exemplo e sem limitação, aqueles descritos por Herrera-Estrella e outros (1983), Nature 303:209-13; Bevan e outros (1983), Nature 304:184-7; Klee e outros (1985), Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Europeia EP 0 120 516, e aqueles derivados de qualquer um dos acima. Outra bactéria, tais como Sinorhizobium, Rhizobium e Mesorhizobium, que interage com plantas naturalmente pode ser modificada para mediar transferência de gene para várias de plantas diversas. Essas bactérias simbióticas associadas à planta podem ser tornadas competentes para transferência de gene através de aquisição de ambos um plasmídeo Ti desarmado e um vetor binário adequado.
[000214] Depois de provisão de DNA exógeno às células recipientes, células transformadas são geralmente identificadas para cultura adicional e regeneração de planta. A fim de aprimorar a habilidade em identificar células transformadas, uma pessoa pode desejar empregar um gene marcador selecionável ou que pode ser avaliado, conforme anteriormente mostrado, com o vetor usado para gerar o transforman- te. No caso onde um marcador selecionável é usado, células transformadas são identificadas dentro da população de célula potencialmente transformada através de exposição das células a um agente ou agentes seletivos. No caso onde um marcador que pode ser avaliado é usado, as células podem ser avaliadas quanto à característica de gene marcador desejada.
[000215] As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que foram classificadas positivas em um ensaio de avaliação, podem ser cultivadas em meio que apoie regeneração de plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido de planta adequado (por exemplo, meios MS e N6) pode ser modificado através da inclusão de substâncias adicionais, tais como reguladores de crescimento. Tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para começar esforços de regeneração de planta, ou seguindo rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido esteja adequada para regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), então transferido para meio condutor para formação de broto. Culturas são transferidas periodicamente até que formação de broto suficiente tenha ocorrido. Uma vez os brotos sendo formados, eles são transferidos para meio condutor para formação de raiz. Uma vez raízes suficientes tendo sido formadas, as plantas podem ser transferidas para solo para crescimento adicional e maturidade.
[000216] Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nuclei- co de interesse (por exemplo, uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético) em uma planta em regeneração, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e Northern blotting, PCR e sequenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos, tal como detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, através de meios imunológicos (ELISA e/ou Western blots) ou através de função enzimática; ensaios de parte de planta, tais como ensaios de folha ou raiz; e análise do fenótipo da planta regenerada inteira.
[000217] A título de exemplo, eventos de integração podem ser analisados através de amplificação por PCR, por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeo específicos para uma sequência de nucleotídeo de interesse. Genotipificação de PCR é compreendida incluir, mas não está limitada a amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) de DNA genômico derivado de tecido de planta hospedeiro isolado previsto conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguido por análise de clonagem e sequência padrão de produtos de amplificação por PCR. Métodos de genotipifica- ção por PCR foram bem descritos (vide, por exemplo, Rios, G. e outros (2002), Plant. J. 32:243-53) e podem ser aplicados a DNA genô- mico derivado de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo culturas de célula.
[000218] Uma planta transgênica formada usando métodos de trans-formação dependentes de Agrobacterium tipicamente contém uma se-quência de DNA recombinante única inserida no cromossomo. A sequência de DNA recombinante única é referida como um "evento transgênico" ou "evento de integração". Tais plantas transgênicas são heterozigotas para a sequência de DNA inserida. Em algumas modalidades, um homozigoto de planta transgênica com relação a um transgene pode ser obtido através de emparceiramento sexual (autopolini- zação) de uma planta transgênica segregante independente que contém uma sequência de gene exógeno única com si mesma, por exemplo, uma planta F0, para produzir semente F1. Um quarto da semente F1 produzida será homozigoto com relação ao transgene. Semente F1 de germinação resulta em plantas que podem ser testadas quanto à heterozigosidade, tipicamente usando um ensaio SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade).
[000219] Em modalidades particulares, cópias de pelo menos um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético são produzidas em uma célula contendo plastídeo, na qual foi introduzida pelo menos uma molécula(s) de ácido nucleico compre-endendo uma sequência de nucleotídeo codificando o pelo menos um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. Cada polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético pode ser expresso a partir de sequências de ácido nucleico múltiplas introduzidas em eventos de transformação diferentes ou de uma sequência de ácido nucleico única introduzida em um evento de transformação único. Em algumas modalidades, uma pluralidade de tais polipeptídeos é expressa sob o controle de um promotor único. Em outras modalidades, uma pluralidade de tais polipeptídeos é expressa sob o controle de promotores múltiplos. Polipeptídeos únicos podem ser expressos, os quais compreendem sequências de peptídeo múltiplas, cada uma das sequências de peptí- deo deve ser direcionada a um plastídeo.
[000220] Em adição à transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma primeira planta tendo pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta sem tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético pode ser introduzida em uma primeira linhagem de planta que é condescendente à transformação, para produzir uma planta transgênica, planta transgênica que pode ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para introgredir a sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo na segunda linhagem de planta.
IV. Materiais de planta compreendendo um polipeptídeo direcionado a peptídeo de trânsito de cloroplasto derivado de Brassica sintético
[000221] Em algumas modalidades, uma célula de planta é provida, onde a célula de planta compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. Em modalidades particulares, tal célula de planta pode ser produzida através da transformação de uma célula de planta que não é capaz de regeneração para produzir uma planta. Em algumas modalidades, uma planta é provida, onde a planta compreende uma célula de planta compreendendo uma sequência de nucleotí- deo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. Em modalidades particulares, tal planta pode ser produzida através de transformação de um tecido de planta ou célula de planta e regeneração de uma planta inteira. Em modalidades adicionais, tal planta pode ser obtida de uma fonte comercial ou através de introgressão de um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético em um germo- plasma. Em modalidades particulares, tal planta compreende células de planta compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético que não são capazes de regeneração para produzir uma planta. Materiais de planta compreendendo uma célula de planta compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando um poli- peptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético são também providos. Tal material de planta pode ser obtido de uma planta compreendendo uma célula de planta.
[000222] Uma planta transgênica, célula de planta não regenerável ou material de planta compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético pode em algumas modalidades exibir uma ou mais das características que seguem: expressão do polipeptídeo em uma célula da planta; expressão de uma porção do polipeptídeo em um plastídeo de uma célula da planta; importação do polipeptídeo a partir do citosol de uma célula da planta para o plastídeo da célula; expressão específica de plastídeo do polipeptídeo em uma célula da planta; e/ou localização do polipeptídeo em uma célula da planta. Tal planta pode ter ainda uma ou mais características desejáveis que não expressão do polipeptídeo codificado. Tais características podem incluir, por exemplo: resistência a insetos, outras pestes e agentes causadores de doença; tolerâncias a herbicidas; estabilidade, rendimento ou vida de prateleira aumentada; tolerâncias ambientais; produção de farmacêuticos; produção de produto industrial; e aprimoramentos nutricionais.
[000223] Uma planta transgênica de acordo com a invenção pode ser qualquer planta capaz de ser transformada com uma molécula de ácido nucleico da invenção. Desta maneira, a planta pode ser uma di- cotiledônea ou monocotiledônea. Exemplos não limitantes de plantas dicotiledôneas úteis nos presentes métodos incluem Arabidopsis, alfafa, feijões, brócolis, repolho, cenoura, couve-flor, aipo, repolho Chinês, algodão, pepino, berinjela, alface, melão, ervilha, pimenta, amendoim, batata, abóbora, rabanete, semente de colza, espinafre, soja, abóbora, beterraba, girassol, tabaco, tomate e melancia. Exemplos não limitan- tes de plantas monocotiledôneas úteis nos presentes métodos incluem milho, Brassica, cebola, arroz, sorgo, trigo, cevada, milheto, cana-de- açúcar, aveia, triticale, gramas switchgrass e turfgrass. Plantas trans- gênicas de acordo com a invenção podem ser usadas ou cultivadas de qualquer maneira.
[000224] Algumas modalidades também proveem produtos de consumo contendo uma ou mais sequências de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético, por exemplo, um produto de consumo produzido a partir de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais de tais se- quências de nucleotídeo. Produtos de consumo contendo uma ou mais sequências de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético incluem, por exemplo e sem limitação: produtos alimentícios, farinhas, óleos ou grãos triturados ou inteiros ou sementes de uma planta compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. A detecção de uma ou mais sequências de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compre-endendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético em um ou mais produtos brutos ou produtos de consumo é evidência de facto que o produto bruto ou produto de consumo foi pelo menos em parte produzido a partir de uma planta compreendendo uma ou mais sequências de nu- cleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. Em modalidades particulares, um produto de consumo da invenção compreende uma quantidade detectá- vel de uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. Em algumas modalidades, tais produtos de consumo podem ser produzidos, por exemplo, através da obtenção de plantas transgênicas e preparação de comida ou ração a partir delas.
[000225] Em algumas modalidades, uma planta transgênica, uma célula de planta não regenerável ou semente compreendendo um transgene compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético pode também compreender pelo menos outro evento transgênico em seu genoma, incluindo, sem limitação: um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA; um gene codificando uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida Bacillus thuringiensis); um gene de tolerância a herbicida (por exemplo, um gene provendo tolerância a glifosato); e um gene contribuindo para um fenótipo desejável na planta transgênica (por exemplo, rendimento aumentado, metabolismo de ácido graxo alterado ou restauração de esterilidade masculina citoplásmica). VII. Localização de produtos de gene para plastídeos mediada por peptídeo de trânsito de cloroplasto derivado de Brassica sintético
[000226] Algumas modalidades da presente invenção proveem um método para expressão e/ou localização de um produto de gene para um plastídeo (por exemplo, um cloroplasto). Em modalidades particulares, o produto de gene pode ser um produto de gene marcador, por exemplo, uma molécula fluorescente. Expressão do produto de gene como parte de um polipeptídeo também compreendendo um CTP derivado de Brassica sintético pode prover um sistema para avaliar as capacidades de localização de plastídeo de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético particular. Em algumas modalidades, expressão de um produto de gene marcador como parte de um polipep- tídeo contendo CTP derivado de Brassica sintético é utilizada para direcionar expressão do produto de gene marcador a um plastídeo de uma célula onde o polipeptídeo é expresso. Em certas modalidades, tal produto de gene marcador está localizado em plastídeo(s) da célula hospedeira. Por exemplo, o produto de gene marcador pode ser expresso em níveis maiores no(s) plastídeo(s) do que no citosol ou outras organelas da célula hospedeira; o produto de gene marcador pode ser expresso em níveis muito mais altos no plastídeo(s); o produto de gene marcador pode ser expresso essencialmente apenas no(s) plas- tídeo(s); ou o produto de gene marcador pode ser expresso totalmente no(s) plastídeo(s), de maneira que expressão no citosol ou organelas não plastídeo não pode ser detectada.
[000227] Em algumas modalidades, um polipeptídeo compreendendo uma variante funcional de um CTP derivado de Brassica sintético, onde o polipeptídeo que é operavelmente ligado a um produto de ge ne marcador é usado para avaliar as características do peptídeo variante funcional. Por exemplo, a sequência de um CTP derivado de Brassica sintético pode ser variada, por exemplo, através da introdução de pelo menos uma(s) mutação(ões) conservativa(s) no CTP derivado de Brassica sintético, e o peptídeo variante resultante pode ser ligado a um produto de gene marcador. Após expressão em uma célula hospedeira adequada (por exemplo, uma célula onde um ou mais elementos reguladores no construto de expressão são operáveis), expressão do produto de gene marcador pode ser determinada. Ao comparar a localização subcelular do produto de gene marcador entre o construto CTP derivado de Brassica sintético-marcador de referência e o construto peptídeo-marcador variante, pode ser determinado se o peptídeo variante provê, por exemplo, maior localização de plastídeo, ou localização de plastídeo substancialmente idêntica. Tal variante pode ser considerada uma variante funcional. Ao identificar variantes funcionais de CTP derivado de Brassica sintético que proveem localização de plastídeo maior, as mutações em tais variantes podem ser incorporadas em variantes adicionais de CTPs derivados de Brassica sintéticos. Realização de rodadas múltiplas deste processo de avaliação, e subsequentemente incorporação de mutações favoráveis identificadas em uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético, podem render um processo iterativo para otimização de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético. Tais sequências de CTP derivado de Brassica sintético otimizadas, e sequências de nucleotídeo codificando as mesmas, são consideradas parte da presente invenção, podendo ou não tais sequências de CTP derivado de Brassica sintético otimizadas serem otimizadas mais através de mutação adicional.
[000228] Todas as referências discutidas aqui são providas apenas quanto à sua descrição antes da data do depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser considerado como uma admissão que os inventores não têm o direito de antedatar tal descrição em virtude de invenção anterior.
[000229] Os Exemplos que seguem são providos para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Esses exemplos não devem ser considerados limitar a descrição às características ou aspectos particulares descritos.
EXEMPLOS Exemplo 1: Projeto e Produção de Sequências de Peptídeo de Trânsito (TraP) de Cloroplasto Quimérico
[000230] Plastídeos são organelas citoplásmicas encontradas em espécies de planta superiores e estão presentes em todos os tecidos de planta. Cloroplastos são um tipo específico de plastídeo encontrado em tecidos fotossintéticos verdes que são responsáveis por funções fisiológicas essenciais. Por exemplo, uma tal função fisiológica primária é a síntese de aminoácidos aromáticos requeridos pela planta. Enzimas codificadas nucleares são requeridas neste curso biossintético e são transportadas do citoplasma para o interior do cloroplasto. Essas enzimas codificadas nucleares geralmente possuem um peptídeo de trânsito N-terminal que interage com a membrana do cloroplasto para facilitar transporte do peptídeo para o estroma do cloroplasto. Bruce B (2000) "Chloroplast transit peptides: structure, function and evolution". Trends Cell Biol. 10:440-447. Quando da importação, peptidases es- tromais clivam o peptídeo de trânsito, deixando a proteína funcional madura importada dentro do cloroplasto. Richter S, Lamppa GK. (1999) "Stromal processing peptidase binds transit peptides and initiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts". Journ. Cell. Bio. 147:33-43. Os peptídeos de trânsito de cloroplasto são sequências variáveis que são altamente divergentes em comprimento, composição e organização. Bruce B. (2000) "Chloroplast transit peptides: structures, function and evolution". Trends Cell Biol. 10:440-447. As similaridades de sequência de peptídeos de trânsito de cloroplasto divergem signifi- cantemente dentre proteínas homólogas de espécies de planta diferentes. A quantidade de divergência entre peptídeos de trânsito de clo- roplasto é inesperada dado que as proteínas homólogas obtidas de espécies de planta diferentes tipicamente compartilham níveis relativamente altos de similaridade de sequência quando comparando a proteína funcional madura processada.
[000231] Novas sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico foram projetadas, produzidas e testadas in planta. Os novos peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos foram mostrados possuir propriedades de translocamento e processamento eficazes para a importação de proteínas importantes agronômicas dentro do cloroplas- to. Inicialmente, sequências de proteína 5-enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS) nativa de espécies de planta diferentes foram analisadas através do programa de computador Chloro® para identificar sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto putativas (Ema- nuelsson, O, Nielsen, H, von Heijne G, (1999) "ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites", Protein Science 8; 978-984). Depois dos peptí- deos de trânsito de cloroplasto nativos terem sido identificados, uma primeira sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto foi alinhada com uma segunda sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto de um segundo organismo. A Figura 18 ilustra o alinhamento das sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto de EPSPS de Brassica napus (N°. Acesso NCBI: P17688) e Brassica rapa (N°. Acesso NCBI: AAS80163). Utilizando o alinhamento de sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto, novos peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos foram projetados combinando a primeira metade da sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto do primeiro organismo com a segunda metade da sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto do segundo organismo em uma razão aproximada de 1:1. Sequências exemplares dos peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos re- cém-projetados são TraP8 (SEQ ID NO:3) e TraP9 (SEQ ID NO:4). Essas novas sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico são derivadas das proteínas EPSPS de Brassica napus [No. Acesso ATCC: P17688] e Brassica rapa [No. Acesso ATCC: AAS80163]. A sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 (SEQ ID NO:3) compreende um terminal N que é derivado de Brassica napus e o terminal C do peptídeo de trânsito de cloroplas- to é derivado de Brassica rapa. A sequência do peptídeo de trânsito de cloroplasto TraP9 (SEQ ID NO:4) compreende um terminal N que é derivado de Brassica rapa e o terminal C do peptídeo de trânsito de cloroplasto é derivado de Brassica napus. Os peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos foram testados através de ensaios múltiplos que incluíam um sistema de expressão in planta transiente e transge- nicamente como um evento de transformação estável compreendendo um elemento de expressão de gene fundido a uma sequência de transgene agronômica importante.
Exemplo 2: Teste In Planta Transiente de Sequências de Peptídeo de Trânsito (TraP) de Cloroplasto Quimérico Ensaio Transiente em Tabaco:
[000232] As sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 e Trap9 foram inicialmente testadas através de um ensaio in planta transiente. Sequências de polinucleotídeo que codificam as sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto TraP8 (SEQ ID NO:5) e TraP9 (SEQ ID NO:6) foram sintetizadas. Uma sequência ligante (SEQ ID NO:7) foi incorporada entre a sequência de TraP e a sequência de codificação de yfp. Os construtos resultantes continham duas unidades de transcrição de planta (PTU). A primeira PTU compreendida do pro motor 10 da Ubiquitina de Arabidopsis thaliana (promotor AtUbi10; Callis e outros (1990) J. Biol. Chem., 265:12486-12493), gene de fusão de TraP-proteína amarelo fluorescente (TraP-YFP; Pedido de Patente U.S. 2007/0298412) e região não traduzida 3' ORF 23 de Agrobacterium tu- mefaciens (AtuORF23 3'UTR; Patente U.S. N°. 5.428.147). A segunda PTU era compreendida do promotor do Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca (promotor CsVMV; Verdaguer e outros (1996) Plant Molecular Biology; 31:1129-1139), fosfinotricin acetil transferase (PAT; Wohlleben e outros (1988) Gene, 70:25-37) e região não traduzida 3' ORF 1 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3'UTR; Huang e outros (1990), J. Bacteriol., 172:1814-1822). O construto pDAB101977 contém o peptí- deo de trânsito de cloroplasto quimérico Trap8 (Figura 2). O construto pDAB101978 contém o peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP9. Um plasmídeo controle, 101908, que não continha uma sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto a montante do gene yfp foi construído e incluído nos estudos (Figura 3). Os construtos foram confirmados através de digestão e sequenciamento de enzima de restrição. Finalmente, os construtos foram transformados em Agrobacterium tu- mefaciens e armazenados como estoques de glicerol.
[000233] A partir de um estoque de glicerol de Agrobacterium, uma alça cheia de cultura congelada foi inoculada em 2 ml de YPD (100 μg/ml de espectinomicina) em um tubo estéril de 14 ml. O meio inoculado foi incubado a 28°C da noite para o dia com agitação a 220 rpm. No dia seguinte, cerca de 100 μl da cultura foram usados para inocular 25 ml de YPD (100 μg/ml de espectinomicina) em um frasco com três reentrâncias no fundo estéril de 125 ml e incubados da noite para o dia a 28°C com agitação a 200 rpm. No dia seguinte, as culturas foram diluídas para um OD600 de 0,5 em ddH2O estéril (pH 8,0). A linhagem de Agrobacterium diluída foi misturada com uma segunda linhagem de Agrobacterium contendo a proteína auxiliar P19 em uma razão de 1:1. A cultura foi usada para infiltração em folha de tabaco através do método de Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P. e Baulcombe, D. (2003). "An enhanced transient expression system in plants based on supression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus", The Plant Journal, 33:949-956. Plantas de tabaco infiltradas foram postas em um conjunto Conviron® a 16 h de luz a 24oC por pelo menos três dias até serem ensaiadas.
Resultados de Microscopia:
[000234] Folhas de tabaco infiltradas com Agrobacterium foram retiradas da planta e postas em uma placa de Petri com água para prevenir desidratação. As folhas de tabaco infiltradas foram observadas sob excitação com luz azul com vidros de filtro de passagem longa mantidos no lugar usando uma Dark Reader Hand Lamp® (Clare Chemical Research Co.; Dolores, CO) para identificar áreas não danificadas da folha que estavam expressando com sucesso as proteínas repórteres YFP. Áreas de folha especificamente identificadas foram dissecadas da folha e montadas em água para imagem através de microscopia confocal (Leica TCS-SP5 AOBS®; Buffalo Grove, IL). A proteína repórter YFP foi excitada por uma linha de laser de 514 nm, usando um laser de íon de argônio multilinha. A largura das fendas de detecção foi ajustada usando uma amostra de folha de controle de não expressão (escura) para excluir autofluorescência de folha de base. Autofluores- cência de clorofila foi simultaneamente coletada em um segundo canal para comparação direta com o sinal de proteína repórter fluorescente para determinação de localização cloroplástica.
[000235] Os resultados de imagem de microscopia indicaram que a proteína fluorescente YFP compreendendo um peptídeo de trânsito de cloroplasto TraP8 ou Trap9 acumulou dentro dos cloroplastos localizados no citoplasma das células de tabaco comparado com as proteínas fluorescentes YFP controle que não translocaram para os cloroplastos do citoplasma das células de tabaco (Figura 4 e Figura 5). Esses resultados de imagem de microscopia sugerem que a translocação da proteína YFP no cloroplasto era um resultado do peptídeo de trânsito de cloroplasto TraP8 ou TraP9. Conforme mostrado na Figura 5 e na Figura 6, o sinal de fluorescência de YFP está localizado nos cloroplas- tos que também fluorescem vermelho devido à autofluorescência sob as condições de imagem de microscopia. Comparativamente, a Figura 7 provê uma imagem de microscopia de tecidos de folha de tabaco infiltrados com o construto controle pDAB101908 que não contém um peptídeo de trânsito de cloroplasto. Os cloroplastos nesta imagem apenas fluoresceram vermelho devido à autofluorescência sob as condições de imagem de microscopia, e são destituídos de qualquer sinal de fluorescência de YFP que é exibido nas células de tabaco infiltradas com TraP. Ao invés disso, o sinal de fluorescência de YFP nas células de planta de tabaco controle é expresso difusamente no citoplasma das células de planta de tabaco.
Resultados Western Blot:
[000236] Amostras das plantas de tabaco infiltradas foram ensaiadas através de Western blotting. Punções de folha foram coletadas e submetidas à trituração em leito. Cerca de 100-200 mg de material de folha foram misturados com 2 BBs (bolas de aço) (Daisy; Rogers, AR) e 500 ml de PBST por 3 minutos em um moedor de bola Kleco®. As amostras foram então giradas em uma centrífuga a 14.000 x g a 4°C. O sobrenadante foi removido e ou analisado diretamente através de Western blot ou imunoprecipitado. As imunoprecipitações foram realizadas usando o Pierce Direct IP kit® (Thermo Scientific; Rockford, IL) seguindo o protocolo do fabricante. Aproximadamente 50 μg de anti-YFP foram ligados à resina. As amostras foram incubadas com a resina da noite para o dia a 4°C. Em seguida, as amostras foram lavadas e eluídas na manhã seguinte e preparadas para análise através de combinação de volumes iguais de tampão de amostra de Ureia 2X 8M e então fervura das amostras por 5 minutos. As amostras fervidas foram ativadas em um Tris gel SDS-Bis 412% em tampão MOPS por 40 minutos. O gel então sofreu blotting usando o Invitrogen iBlot® (Life Technologies; Carlsbac, CA) seguindo o protocolo do fabricante. A membrana que sofreu blotting foi bloqueada por 10 minutos usando leite em pó desnatado 5% em solução de PBS-Tween. A membrana foi sondada com o anticorpo primário (anti-GFP monoclonal em coelho) usado em uma diluição 1:1000 no leite em pó desnatado 5% em solução de PBS-Tween por uma hora. Em seguida, a membrana foi enxaguada três vezes por cinco minutos com PBS-Tween para remover todo o anticorpo primário não ligado. A membrana foi sondada com um anticoelho monoclonal secundário em anticorpo de cabra (Life Technologies) usado em uma diluição 1:1000, por 60 minutos. A membrana foi lavada conforme anteriormente descrito e desenvolvida através da adição de substrato Themo BCIP/NBT. O substrato colorimétrico foi deixado desenvolver por 5-10 minutos e então os blots foram enxaguados com água antes de serem secos.
[000237] Os resultados de Western blot indicaram que a proteína YFP foi expressa nas células de tabaco infiltradas. Ambos os tecidos de folha de planta de tabaco infiltrados com pDAB101977 e pDAB101978 expressaram a proteína YFP conforme indicado pela presença de uma faixa de proteína que reagiu para os anticorpos para YFP e era equivalente em tamanho à faixa de proteína YFP obtida de tecido de folha de planta de tabaco infiltrado com o construto de controle YFP. Além disso, esses resultados indicaram que os peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos TraP foram processados e clivados da proteína YFP. Os construtos TraP8-YFP e TraP9-YFP expressam uma faixa de proteína pré-processada que é maior em peso mo lecular do que a proteína YFP controle. A presença de faixas no Western blot que eram equivalentes em tamanho à YFP controle indica que as sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto TraP8 e TraP9 foram processadas, desta maneira reduzindo o tamanho da YFP para um tamanho de peso molecular que é equivalente ao controle de YFP.
Ensaio Transiente de Protoplasto de Milho:
[000238] A sequência de polinucleotídeo codificando peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 (SEQ ID NO:5) e a sequência de polinucleotídeo de codificação de ligante (SEQ ID NO:7) foram clo- nadas a montante do gene da proteína amarelo fluorescente e incorporadas ao construto pDAB106597 (Figura 7) para teste através de ensaio in planta transiente de protoplasto do milho. Os construtos resultantes continham uma unidade de transcrição de planta única (PTU). A PTU era compreendida de promotor da Ubiquitina 1 de Zea Mays (promotor ZmUbi1; Christensen, A., Sharrock, R. e Quail, P., (1992) "Maize polybiquitin genes: structure, thermal pertubation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplast by electroporation", Plant Molecular Biology, 18:675-689), gene de fusão TraP-proteína amarelo fluorescente (TraP8-YFP; Pedido de Patente U.S. 2007/0298412) e região não traduzida 3' de Peroxidase 5 de Zea Mays (ZmPer5 3' UTR; Patente U.S. N°. 6384207). Os constru- tos foram confirmados através de digestão e sequenciamento de enzima de restrição.
[000239] Semente de Zea mays var. B104 foram esterilizadas na superfície agitando vigorosamente em Clorox 50% (hipoclorito de sódio 3%), contendo 2-3 gotas de Tween 20, por cerca de 20 minutos. As sementes foram enxaguadas completamente com água destilada estéril. A semente estéril foi plaqueada em meios MS ^ em Phytatrays ou caixas de tipo similar e deixada crescer no escuro (28°C) por 12 a 20 dias. Um ensaio transiente de protoplasto de milho foi usado para ob- ter e transfectar protoplastos de milho de folhas de B104-milho. Este ensaio de protoplasto de milho é uma modificação do sistema descrito por Yoo, S.D., Cho, Y.H. e Sheen, J., (2007), Arabidopsis Mesophyll Protoplasts: A Versitile Cell System for Transient Gene Expression Analysis", Nature Protocols, 2:1565-1572. As soluções foram preparadas conforme descrito por Yoo e outros (2007), com a exceção que concentração de manitol usada para os experimentos que seguem foi mudada para 0,6 M.
[000240] Transfecção de 100 a 500 μl de protoplastos (1-5x105) foi completada através da adição dos protoplastos a um tubo microfuge de 2 ml contendo cerca de 40 μg de DNA de plasmídeo (pDAB106597), em temperatura ambiente. O volume de DNA foi preferivelmente mantido para cerca de 10% do volume de protoplasto. Os protoplastos e DNA foram ocasionalmente misturados durante um período de incubação de 5 minutos. Um volume igual de solução de PEG foi lentamente adicionado aos protoplastos e DNA, duas gotas por vez com mistura entre a adição das gotas de solução de PEG. Os tubos foram deixados incubar por cerca de 10 minutos com mistura suave ocasional. Em seguida, 1 ml de solução W5+ foi adicionado e misturado através da inversão do tubo várias vezes. O(s) tubo(s) foi(ram) cen- trifugado(s) por 5 minutos a 75 x g em uma temperatura de 4°C. Finalmente, o sobrenadante foi removido e o pélete foi ressuspenso em 1 ml de solução WI e os protoplastos foram postos em uma placa de Petri pequena (35 x 10 mm) ou em placas de multicavidades de 6 cavidades e incubados da noite para o dia no escuro em temperatura ambiente. Fluorescência de YFP foi vista através de microscopia após 12 horas de incubação. As condições de microscopia anteriormente descritas foram usadas para a imagem.
[000241] Os resultados de imagem de microscopia indicaram que a proteína fluorescente YFP compreendendo um peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 acumulou dentro dos cloroplastos localizados no citoplasma das células de milho comparado com as proteínas fluorescentes YFP controle que não translocaram para os cloro- plastos do citoplasma das células de milho (Figura 8). Esses resultados de imagem de microscopia sugerem que a translocação da proteína YFP para o cloroplasto foi um resultado do peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8.
Exemplo 3: Sequências de Peptídeo de Trânsito de Cloroplasto (TraP) Quimérico para Expressão de Transgenes Agronomica- mente Importantes em Arabidopsis
[000242] Uma mutação de aminoácido única (G96A) na enzima 5- enolpiruvilchiquimato 3-fosfato sintase (EPSP sintase) de Escherichia coli pode resultar em insensibilidade a glifosato (Padgette e outros (1991); Eschenburg e outros (2002); Priestman e outros (2005); Hagha- ni e outros (2008)). Embora esta mutação confira tolerância a glifosato, ela é também conhecida afetar adversamente ligação de EPSP sintase com seu substrato natural, fosfoenolpiruvato (PEP). A mudança resultante em eficiência de ligação de substrato pode tornar uma enzima mu- tada inadequada para provisão in planta de tolerância a glifosato.
[000243] O banco de dados Genbank NCBI foi avaliado in silico quanto à proteína EPSP sintase e sequências de polinucleotídeo que contêm naturalmente uma alanina em uma posição análoga dentro da enzima EPSP sintase que aquela da mutação G96A que foi introduzida na versão de E. coli da enzima (Padgette e outros (1991); Eschenburg e outros (2002); Priestman e outros, (2005); Haghani e outros (2008)).
[000244] Uma enzima que foi identificada conter uma alanina natural nesta posição foi DGT-28 (NO. AC. GENBANK: ZP_06917240.1) de Streptomyces sviceus ATCC29083. Exploração de dados in silico adicionais revelou três outras enzimas de Streptomyces únicas com maior homologia para DGT-28; DGT-31 (NO. AC. GENBANK: YP_004922608.1); DGT-32 (NO. AC. GENBANK: ZP_04696613); e DGT-33 (NO. AC. GENBANK: NC_010572). Cada uma dessas enzimas contém uma alanina natural em uma posição análoga dentro da enzima EPSP sintase que aquela da mutação G96A que foi introduzida na versão de E. coli da enzima. Figura 1.
[000245] Devido ao fato de proteínas EPSP sintase de organismos diferentes serem de comprimentos diferentes, a numeração da mutação para a versão de E. coli da enzima EPSP sintase não corresponde necessariamente com a numeração da mutação para as enzimas EPSP sintase dos outros organismos. Essas enzimas EPSP sintase identificadas não foram anteriormente caracterizadas com relação à tolerância a glifosato ou afinidade de substrato PEP. Ainda, essas enzimas EPSP sintase representam uma nova classe de enzimas EPSP sintase e não contêm quaisquer motivos de sequência que tenham sido usados para caracterizar enzimas EPSP sintase de Classe I (sequências derivadas de planta descritas na Patente U.S. N°. RE39247), II (sequências bacterialmente derivadas descritas adicionalmente na Patente U.S. N°. RE39247) e III (sequências bacterialmente derivadas descritas adicionalmente no Pedido de Patente Internacional WO 2006/110586) previamente descritas.
[000246] As enzimas DGT-14, DGT-28, DGT-31, DGT-32 e DGT-33 novas foram caracterizadas quanto à tolerância a glifosato e afinidade com o substrato PEP através de comparação com enzimas EPSP sin- tase de Classe I. As enzimas Classe I que seguem; DGT-1 de Glycine max; DGT-3 de Brassica napus (NO. AC. GENBANK: P17688) e DGT- 7 de Triticum aestivum (NO. AC. GENBANK: EU977181) foram para comparação. As enzimas EPSP sintase Classe I e suas variantes mu- tantes foram sintetizadas e avaliadas. Uma mutação introduzida nas enzimas EPSP sintase de planta consistia na mutação Glicina em Ala- nina feita dentro da enzima EPSP sintase em um local similar àquele da mutação G96A da versão de E. coli da enzima. Ainda, mutações Treonina para Isoleucina e Prolina para Serina foram introduzidas nessas enzimas EPSP sintase Classe I em posições análogas àquelas do aminoácido 97 (T a I) e aminoácido 101 (P a S) na EPSP sintase de E. coli conforme descrito em Funke e outros (2009).
DGT14:
[000247] Plantas de Arabidopsis transgênicas T1 contendo os peptí- deos de trânsito de cloroplasto quiméricos TraP8 e TraP9 fundidos ao transgene dgt-14 foram produzidas usando o método de mergulho floral de Clough e Bent (1998), Plant J. 16:735-743. Plantas de Arabi- dopsis transgênicas foram obtidas e confirmadas conter o transgene através de confirmação molecular. As plantas transgênicas foram pulverizadas com taxas diferentes de glifosato. Uma distribuição de concentrações variáveis de taxas de glifosato, incluindo taxas elevadas, foi aplicada neste estudo para determinar os níveis relativos de resistência (105, 420, 1.680 ou 3.360 g ae/ha). A taxa de uso de campo 1X típica de glifosato é 1.120 g ae/ha. As plantas de Arabidopsis T1 que foram usadas neste estudo eram variáveis em número de cópia para o transgene dgt-14. As plantas de Arabidopsis T1 dgt-14 de pouca cópia foram identificadas usando ensaios de confirmação molecular e auto- polinizadas e usadas para produzir plantas T2. A Tabela 1 mostra a resistência para plantas transgênicas dgt-14, comparado com plantas controle compreendendo um gene de resistência a herbicida glifosato, dgt-1 (conforme descrito no Depósito de Patente U.S. N°. 12558351.
[000248] Os transformantes T1 de Arabidopsis foram primeiro selecionados da base de semente não transformada usando um esquema de seleção de glufosinato. Três bandejas, ou 30.000 sementes, foram analisadas para cada construto T1. As plantas T1 selecionadas foram molecularmente caracterizadas e as plantas foram subsequentemente transplantadas para potes individuais e pulverizadas com várias taxas de gli- fosato comercial conforme anteriormente descrito. A dose resposta dessas plantas é apresentada em termos de % de lesão visual 2 semanas após tratamento (WAT) (Weeks After Treatment). Os dados são apresentados nas tabelas abaixo que mostram plantas individuais exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada construto usado para transformação de Arabidopsis. A faixa em resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada, do tipo selvagem, (c.v. Columbia) serviu como um controle sensível a glifosato.
[000249] O nível de resposta de planta variou nas plantas de Arabi- dopsis T1. Esta variância pode ser atribuída ao fato que cada planta representa um evento de transformação independente e então o número de cópia do gene de interesse varia de planta para planta. Uma média de lesão de população geral por taxa é apresentada na Tabela 1 para demonstrar a tolerância provida por cada um dos construtos dgt-14 ligados ou com peptídeo de trânsito de cloroplasto TraP8 v2 ou TraP9 v2 versus o dgt-1 e controles do tipo selvagem não transformados para taxas variáveis de glifosato. Os eventos continham dgt-14 ligado com TraP8 v2 (SEQ ID NO:8) que está contido no construto pDAB105526 (Figura 9) e TraP9 v2 (SEQ ID NO:9) que está contido no construto pDAB105527 (Figura 10). Dados da seleção de glifosato de plantas T1 demonstraram que quando dgt-14 foi ligado com esses peptídeos de trânsito de cloroplasto, tolerância robusta a níveis altos de glifosato foi provida. Comparativamente, os controles não transformados (ou tipo selvagem) não proveram tolerância ao tratamento de concentrações altas de glifosato quando tratados com taxas similares de glifosato. Ainda, houve casos quando eventos que eram mostrados conter três ou mais cópias de dgt-14 foram mais suscetíveis a taxas elevadas de glifosato. Esses casos são demonstrados dentro da faixa de lesão visual mostrada na Tabela 1. É provável que a presença de números de cópia altos dos transgenes dentro das plantas de Arabi- dopsis resulte em silenciamento de transgene ou outros efeitos epige- néticos que resultaram em sensibilidade a glifosato, apesar da presença do transgene dgt-14. Tabela 1. Resposta de Arabidopsis Ti transformada com dgt-14 a uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós-emergência, comparado com uma população de segregação de dgt-1 (T2) e um controle não transformado. % de lesão visual 2 semanas após aplicação.
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[000250] Plantas de Arabidopsis T1 selecionadas que foram identifi- cadas conter números de cópia baixos de inserções de transgene (1-3 cópias) foram autofertilizadas para produzir uma segunda geração para avaliação adicional de tolerância a glifosato. As plantas de Arabi- dopsis de segunda geração (T2) que continham 1-3 cópias do transgene dgt-14 fundidas aos peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos TraP8 e TraP9 foram caracterizadas adicionalmente quanto à tolerância a glifosato e tolerância a glufosinato (resistência à glufosinato indicou que o cassete de expressão PAT estava intacto e não sofreu rear- ranjos durante a autopolinização das plantas T1). Na geração T2 plantas hemizigotas e homozigotas estavam disponíveis para teste para cada evento e então foram incluídas para cada taxa de glifosato testada. Plantas hemizigotas continham dois alelos diferentes em um locus comparado conforme comparado com plantas homozigotas que continham os mesmos dois alelos em um locus. O número de cópia e níveis ploides das plantas T2 foram confirmados usando protocolos de análise molecular. Da mesma maneira, glifosato foi aplicado usando os métodos e taxas conforme anteriormente descrito. A dose resposta das plantas é apresentada em termos de % de lesão visual duas semanas após tratamento (WAT). Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada construto usado para transformação de Arabidopsis. A faixa em resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa de transformação. Ara- bidopsis não transformada, do tipo selvagem, (cv. Columbia) serviu como um controle sensível a glifosato. Ainda, plantas compreendendo um gene de resistência a herbicida glifosato, dgt-1 (conforme descrito no Depósito de Patente U.S. N°. 12558351) foram incluídas como um controle positivo.
[000251] Na geração T2, ambos os eventos dgt-14 de cópia única e pouca cópia (duas ou três cópias) foram caracterizados quanto à tolerância a glifosato. Uma média de lesão de população geral por taxa é apresentada na Tabela 2 para demonstrar a tolerância provida por cada um dos construtos dgt-14 ligados com um peptídeo de trânsito de cloroplasto versus dgt-1 e controles do tipo selvagem não transformados para taxas variáveis de glifosato. Os eventos da geração T2 continham dgt-14 ligado com TraP8 v2 (pDAB105526) e TraP9 v2 (pDAB105527). Ambos os eventos são altamente resistentes a glifosa- to. Os resultados indicaram que a faixa de lesão para as plantas de Arabidopsis T2 foi menos do que 20% para todas as concentrações de glifosato que foram testadas. Comparativamente, os controles não transformados (ou tipo selvagem) não proveram tolerância ao tratamento de concentrações altas de glifosato quando tratados com taxas similares de glifosato. No geral, os resultados mostraram que plantas contendo e expressando DGT-14 fundido às proteínas de peptídeo de trânsito quimérico TraP8 e TraP9 forneceram resistência em nível comercial a glifosato em níveis de até 3 vezes a taxa de campo (1120 g ae/ha). Tabela 2. Resposta de Arabidopsis T2 transformada com dgt-14 para uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós-emergência, comparado com uma população de segregação de dgt-1 (T2) e um controle não transformado. % de lesão visual duas semanas depois da aplicação. Os dados representam uma linhagem de cópia única selecionada de cada construto que segregou como um locus único na avaliação de capacidade de herança.
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Plantas de Arabidopsis T2 aleatoriamente selecionadas que foram iden-tificadas conter números de cópia baixos de inserções transgênicas (1-3 cópias) foram autofertilizadas para produzir uma terceira geração para avaliação adicional de tolerância a glifosato. Sementes de Arabidopsis da terceira geração (T3) foram plantadas e avaliadas quanto à tolerância a glifosato usando os mesmos protocolos anteriormente descritos. Os eventos testados na geração T3 continham réplicas de cada linha que eram homozigotas (conforme determinado através do uso de uma avaliação de resistência a glufosinato para identificar se qualquer uma das plantas avançadas mostrou segregação dos transgenes). Esses Eventos foram ensaiados através de LC-MS-MS para confirmar que as plantas expressavam a proteína DGT-14. Os resultados da geração T3 para média de lesão de população geral pela taxa de glifosato são apresen- tados na Tabela 3 que mostra a tolerância a glifosato provida por cada um dos construtos dgt-14 para taxas variáveis de glifosato. Eventos T3 resistentes exemplares compreendiam dgt-14 ligado com TraP8 v2 (pDAB105526) e TraP9 v2 (pDAB105527). Ambos esses eventos eram altamente resistentes a glifosato. Os resultados indicaram que a faixa de lesão para as plantas de Arabidopsis T3 era menos do que 20% para todas as concentrações de glifosato que foram testadas. Comparativamente, os controles não transformados (ou tipo selvagem) não proveram tolerância ao tratamento de concentrações altas de glifosato quando tratados com taxas similares de glifosato. No geral, os resultados mostraram que plantas contendo e expressando DGT-14 forneceram resistência de nível comercial a glifosato em níveis de até 3 vezes a taxa de campo (1120 g ae/ha). Tabela 3. Resposta de Arabidopsis T3 transformada com dgt-14 a uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós-emergência, comparado com uma popu-lação de segregação (T2) de dgt-1 e um controle não transformado. % de Lesão visual duas semanas depois da aplicação. Os dados representam uma população de cópia única selecionada de cada construto que segregou como um locus único na avaliação de capacidade de herança de T2.
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[000252] Os dados mostram que expressão de uma enzima resisten- te a glifosato (por exemplo, DGT-28), quando direcionada ao cloroplas- to de uma célula de planta por um peptídeo de trânsito TraP em uma proteína de fusão, é capaz de conferir resistência a glifosato à célula de planta e plantas compreendidas dessas células.
DGT-28, DGT-31, DGT-32 e DGT-33:
[000253] A sequência de polinucleotídeo dgt-28 v5 otimizada de planta dicotiledônea, recém-projetada, é listada na SEQ ID NO:16. A sequência de polinucleotídeo dgt-28 v6 otimizada de planta monocoti- ledônea é listada na SEQ ID NO:17; esta sequência era ligeiramente modificada através da inclusão de uma alanina na segunda posição de aminoácido para introduzir um sítio de enzima de restrição. As sequências de DNA resultantes têm um grau maior de diversidade de códon, uma composição de base desejável, contêm sítios de reconhecimento de enzima de restrição estrategicamente postos e não têm sequências que possam interferir com transcrição do gene, ou tradução do mRNA produto.
[000254] Síntese de fragmentos de DNA compreendendo SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17 contendo sequências adicionais, tais como paradas de 6 estruturas (códons de parada localizados em todas as seis estruturas de leitura que são adicionados à extremidade 3' da sequência de codificação) e um sítio de restrição 5' para clonagem foi realizada por fornecedores comerciais (DNA2.0, Menlo Park, CA). A molécula de ácido nucleico sintética foi então clonada em vetores de expressão e transformada em plantas ou bactérias conforme descrito nos Exemplos abaixo.
[000255] Estratégias de otimização de códon similares foram usadas para projetar dgt-1, dgt-3 v2 (G173A), dgt-3 v3 (G173A; P178S), dgt-3 v4 (T174I; P178S), dgt-7 v4 (T168I; P172S), dgt-32 v3, dgt-33 v3 e dgt-31 v3. A versão otimizada nos códons desses genes é listada como SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 e SEQ ID NO:25, respectivamente.
[000256] Construção de Vetor Binário de Planta. Métodos de clonagem padrão foram usados na construção de vetores de entrada contendo uma sequência de polinucleotídeo de peptídeo de trânsito de cloroplasto unida a dgt-28 como uma fusão em estrutura. Os vetores de entrada contendo um peptídeo de trânsito (TraP) fundido a dgt-28 foram montados usando a IN-FUSION® Advantage Technology (Clon- tech, Mountain View, CA). Como um resultado da fusão, o primeiro aminoácido, metionina, foi removido de dgt-28. Peptídeos de trânsito TraP4 v2 (SEQ ID NO:26), TraP5 v2 (SEQ ID NO:27), TraP8 v2 (SEQ ID NO:28), TraP9 v2 (SEQ ID NO:29), TraP12 v2 (SEQ ID NO:30) e TraP13 v2 (SEQ ID NO:31) foram, cada um, sintetizados através de DNA2.0 (Menlo Park, CA) e fundidos ao fragmento de extremidade 5' de dgt-28, até e incluindo um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição AccI único.
[000257] Plasmídeos binários que continham os vários cassetes de expressão de TraP e dgt-28 foram direcionados pelo promotor de Ubi- quitina 10 de Arabidopsis thaliana (AtUbi10 v2; Callis e outros, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493) e flanqueados pela região não traduzida 3' de vinte e três estruturas de leitura aberta de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1; Pat. U.S. N°. 5.428.147).
[000258] Os cassetes de expressão de TraP e dgt-28 montados foram engenheirados usando GATEWAY® Technology (Invitrogen, Carlsbad, CA) e transformados em plantas através de transformação de planta mediada por Agrobacterium. Endonucleases de restrição foram obtidas da New England BioLab (NEB; Ipswich, MA) e T4 DNA Ligase (Invitrogen) foi usada para ligação de DNA. Reações Gateway foram realizadas usando mistura de enzima GATEWAY® LR CLONASE® (Invitrogen) para montagem de um vetor de entrada em um vetor de destino único que continha o cassete marcador selecionável promotor do Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca (CsVMV v2; Verdaguer e outros (1996) Plant Molecular Biology; 31:1129-1139), DSM-2 (Pedido Pat. U.S. N°. 2007/086813) - "Agrobacterium tumefaciens open reading frame one 3' unstranslated region" (AtuORF1 3' UTR v6; Huang e outros (1990) J. Bacteriol. 172:1814-1822). Preparações de plasmí- deo foram realizadas usando NUCLEOSPIN® Plasmid Kit (Macherey- Nagel Inc., Bethlehem, PA) ou o Plasmid Midi Kit (Qiagen) seguindo as instruções dos fornecedores. Fragmentos de DNA foram isolados usando QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen) após eletroforese em gel de agarose Tris-acetato.
[000259] Colônias de todos os plasmídeos montados foram inicialmente avaliadas através de digestão com restrição de DNA miniprep. DNA de plasmídeo de clones selecionados foi sequenciado por um vendedor de sequenciamento comercial (Eurofins® MWG Operon, Huntsville, AL). Dados de sequência foram montados e analisados usando o software SE- QUENCHER® (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).
[000260] Os construtos binários que seguem expressam as várias sequências de gene de fusão TraP:dgt-28: pDAB107527 (Figura 18) contém TraP4 v2:dgt-28 v5 (SEQ ID NO:32); pDAB105530 (Figura 19) contém TraP5 v2:dgt-28 v5 (SEQ ID NO:33); pDAB105531 (Figura 20) contém TraP8 v2:dgt-28 v5 (SEQ ID NO:34); PDAB105532 (Figura 21) contém TraP9 v2:dgt-28 v5 (SEQ ID NO:35); pDAB105533 (Figura 22) contém TraP12 v2:dgt-28 v5 (SEQ ID NO:36) e pDAB105534 (Figura 23) contém TraP13 v3:dgt-28 v5 (SEQ ID NO:37). A sequência dgt-28 v5 de pDAB105534 foi modificada, onde o primeiro códon (GCA) foi mudado para (GCT).
[000261] Construção de Vetor Binário de Planta Adicional. Estratégias de clonagem similares àquelas descritas acima foram usadas para construir plasmídeos binários que contêm dgt-31, dgt-32, dgt-33, dgt-1, dgt-3 e dgt-7.
[000262] Os genes microbialmente derivados: dgt-31, dgt-32 e dgt-33 foram fundidos com peptídeos de trânsito de cloroplasto diferentes daqueles previamente descritos. Os peptídeos de trânsito de cloroplasto que seguem foram usados; TraP14 v2 (SEQ ID NO:38), TraP23 v2 (SEQ ID NO:39), TraP24 v2 (SEQ ID NO:40). pDAB107532 (Figura 24) contém dgt-32 v3 fundido a TraP14 v2 (SEQ ID NO:41), pDAB107534 (Figura 25) contém dgt-33 v3 fundido a TraP24 v2 (SEQ ID NO:42) e pDAB107533 (Figura 26) contém dgt-31 v3 fundido a TraP23 v2 (SEQ ID NO:43). Os cassetes de expressão de dgt foram direcionados pelo promotor da Ubi- quitina 10 de Arabidopsis thaliana (promotor AtUbi10 v2) e flanqueados pela região não traduzida 3' de vinte e três estruturas de leitura aberta de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1). Um cassete marcador selecionável DSM-2 contendo promotor do Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca (CsVMV v2) - DSM-2 - região não traduzida 3' de uma estrutura de leitura aberta de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3' UTR v6) estava também presente no vetor binário.
[000263] Binários adicionais são construídos, onde dgt-31 v3, dgt-32 v3 e dgt-33 v3 são fundidos às sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto anteriormente descritas. Por exemplo, a sequência TraP8 v2 é fundida a dgt-31 v3, dgt-32 v3 e dgt-33 v3 e clonada a vetores binários conforme acima descrito.
[000264] Vetores binários contendo os genes Classe I (dgt-1, dgt-3 e dgt-7) foram construídos. Os vetores binários que seguem foram construídos e transformados em plantas: pDAB4104 (Figura 27), que contém a sequência dgt-1 v4 conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. 2011/0124503, que é flanqueado pelas sequências Osmotina de Nicotiana tabacum conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. 2009/0064376; pDAB102715 (Figura 28); pDAB102716 (Figura 29); pDAB102717 (Figura 30); e pDAB102785 (Figura 31). Os vários peptídeos de trânsito de cloroplasto TraP que foram fundidos a dgt-28, dgt-31, dgt-32 e dgt-33 não foram adicionados aos genes Classe I, uma vez que essas sequências derivadas de planta possuem peptí- deos de trânsito de cloroplasto de planta nativos. Esses vetores são descritos em mais detalhes na Tabela 4. Tabela 4. Descrição dos vetores binários que contêm um gene EPSP sintase Classe I (isto é, dgt-1, dgt-3 ou dgt-7).
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[000265] Transformação de Arabidopsis thaliana. Arabidopsis foi transformada usando o método de mergulho floral de Clough e Bent (1998). Uma colônia de Agrobacterium selecionada contendo um dos plasmídeos binários descritos acima foi usada para inocular uma ou mais pré-culturas de 100 mL de caldo de YEP contendo espectinomi- cina (100 mg/L) e canamicina (50 mg/L). A cultura foi incubada da noite para o dia 28°C com agitação constante a 225 rpm. As células foram plaqueadas em aproximadamente 5000 xg por 10 minutos em temperatura ambiente e o sobrenadante resultante descartado. O péle- te de célula foi gentilmente suspenso em 400 mL de meio de submersão contendo: sacarose 5% (p/v), 10 μg/L de 6-benzilaminopurina e Silwet® L-77 0,04%. Plantas de aproximadamente 1 mês de vida foram mergulhadas no meio por 5-10 minutos com agitação suave. As plantas foram posicionadas de lado e cobertas com bolsas de plástico transparentes ou opacas por 2-3 horas, e então postas viradas para cima. As plantas foram cultivadas a 22°C, com um fotoperíodo de 16 horas de luz / 8 horas escuro. Aproximadamente 4 semanas depois do banho, as sementes foram coletadas.
[000266] Seleção de Plantas Transformadas. Semente Ti recém- coletada [contendo os cassetes de expressão dgt e DSM-2] foi deixada secar por 7 dias em temperatura ambiente. Semente Ti foi semeada em bandejas de germinação de 26,5 x 5i cm, cada uma recebendo uma alíquota de 200 mg de semente Ti estratificada (~i0.000 sementes) que tinha sido anteriormente suspensa em 40 mL de solução de agarose a 0,i% e armazenada a 4°C por 2 dias para completar necessidades de dormência e assegurar germinação de semente síncrona.
[000267] Sunshine Mix LP5 foi coberta com vermiculita fina e subirri- gada com solução de Hoagland até ficar úmida, então deixada drenar pela gravidade. Cada alíquota de 40 mL de semente estratificada foi semeada uniformemente na vermiculita com uma pipeta e coberta com cúpulas de umidade por 4-5 dias. As cúpulas foram removidas i dia antes da seleção de transformante inicial usando spray de pós- emergência de glufosinato (seleção quando ao gene DMS-2 cotrans- formado).
[000268] Sete dias depois do plantio (DAP) (Days After Planting) e novamente 11 DAP, plantas T1 (cotiledônia e estágio de 2-4 folhas, res-pectivamente) foram pulverizadas com uma solução a 0,2% de herbicida Liberty (200 g ai/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) em um volume de pulverização de 10 mL/bandeja (703 L/ha) usando uma ponteira de pulverização de ar comprimido DeVilbiss para aplicar uma taxa eficaz de 280 g ai/ha de glufosinato por aplicação. Sobreviventes (plantas crescendo ativamente) foram identificadas 4-7 dias após a pulverização final e transplantadas individualmente em potes de 7,62 cm (3 polegadas) preparados com meio de plantio em pote (Metro Mix 360). Plantas transplantadas foram cobertas com cúpulas de umidade por 3-4 dias e postas em uma câmara de crescimento a 22°C como antes ou mudadas diretamente para a estufa. As cúpulas foram subsequentemente removidas e as plantas cultivadas na estufa (22±5°C, 50±30% RH, 14 h luz:10 h escuro, mínimo 500 μE/m2s1 luz natural + suplementar). Análise de confirmação molecular foi completada nas plantas T1 sobreviventes para confirmar que o gene de tolerância a glifosato tinha estavelmente integrado ao genoma das plantas.
[000269] Confirmação Molecular. A presença dos transgenes dgt-28 e DMS-2 dentro do genoma de plantas de Arabidopsis que foram transformadas com pDAB107527, pDAB105530, pDAB105531, pDAB105532, pDAB105533 ou pDAB105534 foi confirmada. A presença dessas sequências de nucleotídeo foi confirmada através de ensaios de sonda de hidrólise, PCR de cassete de expressão de gene (também descrita como PCR de unidade de transcrição de planta -- PCR PTU), análise Southern blot e análises de PCR de Transcrição Reversa Quantitativa.
[000270] As plantas de Arabidopsis T1 foram inicialmente avaliadas através de um ensaio de sonda de hidrólise, análoga à TAQMAN®, para confirmar a presença dos transgenes DSM-2 e dgt-28. Eventos foram avaliados através de PCR de cassete de expressão de gene para determinar se o cassete de expressão de dgt integrou completamente nos genomas de planta sem rearranjo. Os dados gerados a partir desses estudos foram usados para determinar o número de cópia de transgene e identificar e selecionar eventos de Arabidopsis para a au- tofertilização e avanço para a geração T2. As plantas de Arabidopsis T2 avançadas foram também avaliadas através de ensaios de sonda de hidrólise para confirmar a presença e estimar o número de cópia dos genes DSM-2 e dgt dentro do cromossomo da planta. Finalmente, um ensaio Southern blot foi usado para confirmar o número de cópia estimado em um subconjunto das plantas de Arabidopsis T1.
[000271] Ensaios similares foram usados para confirmar a presença do transigente dgt-1 de plantas transformadas com pDAB4101, a presença do transgene dgt-32 de plantas transformadas com pDAB107532, a presença do transgene dgt-33 de plantas transformadas com pDAB107534, a presença do transgene dgt-3 de plantas transformadas com pDAB102715, a presença do transgene dgt-3 de plantas transformadas com pDAB102716, a presença do transgene dgt-3 de plantas transformadas com pDAB102717 e a presença do transgene dgt-7 de plantas transformadas com pDAB102785.
[000272] Ensaio de Sonda de Hidrólise. Número de cópia foi determinado nas plantas de Arabidopsis T1 e T2 usando o ensaio de sonda da hidrólise descrito abaixo. Plantas com números variáveis de transgene foram identificadas e avançadas para estudos de tolerância de glifosato subsequentes.
[000273] Amostras de tecido foram coletadas em placas de 96 cavidades e liofilizadas por 2 dias. Maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO® e contas de tungstênio (Environ Metal INC., Sweet Home, Oregon). Seguindo maceração de tecido, o DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento usando o Biosprint® 96 Plant kit (Qiagen®, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. DNA genômico foi quantificado através do QUANT-IT® PICO GREEN DNA ASSAY KIT (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). DNA genômico quantificado foi ajustado para cerca de 2 ng/mL para o ensaio de sonda de hidrólise usando um manejador de líquido automático BIOROBOTT3000® (Qiagen, Germantown, MD). Determinação de número de cópia de transgene através de ensaio de sonda de hidrólise foi realizada através de PCR de tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER® 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Ensaios foram projetados para DSM-2, dgt-28 e o gene de referência interno, TAFII15 (ID Genbank: NC 003075; Duarte e outros (2001) BMC Evol. Biol., 10:61).
[000274] Para amplificação, mistura LIGHTCYCLER® 480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianapólis, IN) foi preparada em uma concentração final 1x em uma reação multiplex de volume de 10 μL contendo 0,1 μM de cada iniciador para DSM-2 e dgt-28, 0,4 μM para cada iniciador para TAFII15 e 0,2 μM de cada sonda.
[000275] Tabela 5. Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada com uma extensão a 60°C por 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram ativadas e os valores de limiar de Ciclo (Ct) (Cycle treshold) médios foram usados para análise de cada amostra. Análise de dados de PCR de tempo real foi realizada usando software LightCycler® 1.5 usando o módulo quant relativo e é baseada no método ΔΔCt. Para isso, uma amostra de DNA genômico de um calibrador de cópia única e checagem de duas cópias conhecidas foram incluídas em cada rodada. Os resultados de número de cópia da avaliação de sonda de hidrólise foram determinados para as plantas de Arabidopsis transgênicas T1 e T2. Tabela 5. Informação de iniciador e sonda para ensaio de sonda de hidrólise de DSM-2, dgt-28 e gene de referência interno (TAFII15)
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[000276] Confirmação de In tegração de dgt-28 através de Análise Southern Blot. Análise Southern blot foi usada para estabelecer o padrão de integração do fragmento de DNA de filamento inserido e identificar eventos que continham dgt-28. Os dados foram gerados para demonstrar a integração e integridade dos insertos de transgene dentro do genoma de Arabidopsis. Dados Southern blot foram usados para identificar integração simples de uma cópia intacta do DNA de filamento T. Análise Southern blot detalhada foi conduzida usando uma sonda amplificada por PCR específica para expressão do cassete do gene dgt-28. A hibridização da sonda com DNA genômico que tinha sido digerido com enzimas de restrição específicas identificou fragmentos de DNA genô- micos de pesos moleculares específicos, cujos padrões foram usados para identificar eventos transgênicos T1 de inserção simples, comprimento integral, para avanço para a próxima geração.
[000277] Amostras de tecido foram coletadas em tubos cônicos de 2 mL (Eppendorf®) e liofilizadas por 2 dias. Maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECKO® e contas de tungstê- nio. Seguindo maceração do tecido, o DNA genômico foi isolado usando um procedimento de isolamento CTAB. O DNA genômico foi purificado mais usando o estojo Qiagen® Genomic Tips. DNA genômico foi quantificado através do estojo de ensaio Quant-IT® Pico Green (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). DNA genômico quantificado foi ajustado para 4 μg para uma concentração consistente.
[000278] Para cada amostra, 4 μg de DNA genômico foram totalmente digeridos com a enzima de restrição SwaI (New England Biolabs, Beverley, MA) e incubados a 25°C da noite para o dia, então NsiI foi adicionado à reação e incubado a 37°C por 6 horas. O DNA digerido foi concentrado através de precipitação com Quick Precipitation Solution® (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA genômico foi então ressuspenso em 25 μL de água a 65°C por uma hora. Amostras ressuspensas foram carregadas em um gel de agarose a 0,8% preparado em TAE 1X e eletroforadas da noite para o dia a 1,1 V/cm em tampão TAE 1X. O gel foi sequencialmente submetido à desnaturação (NaOH a 0,2 M/NaCl a 0,6M) por 30 minutos e neutralização (Tris-HCl a 0,5 M (pH 7,5) / NaCl a 1,5 M) por 30 minutos.
[000279] Transferência de fragmentos de DNA para membranas de náilon foi realizada drenando passivamente solução 20 X SSC da noite para o dia através do gel em membrana de transferência IMMOBILON® NY+ tratada (Millipore, Billerica, MA) usando um pavio de papel de cro- matografia e toalhas de papel. Seguindo transferência, a membrana foi rapidamente lavada com 2X SSC, reticulada com o STRATALINKER® 1800 (Stratagene, LaJolla, CA) e cozida a vácuo a 80°C por 3 horas.
[000280] Blots foram incubados com solução de pré-hibridização (Perfect Hyb plus, Sigma, St. Louis, MO) por uma hora a 65°C em gar- rafas cilíndricas de vidro usando uma incubadora de hibridização modelo 400 (Robbins Scientific, Synnyvale, CA). As sondas foram preparadas a partir de um fragmento de PCR contendo a sequência de codificação inteira. O amplicon de PCR foi purificado usando estojo de extração em gel QIAEX® II e marcado com α32P-dCTP através do estojo de marcação Random RT Prime IT® (Stratagene, La Jolla, CA). Blots foram hibridizados da noite para o dia a 65°C com sonda desnaturada adicionada diretamente ao tampão de hibridização para aproximadamente 2 milhões de contagem por blot por mL. Seguindo hibridização, os blots foram sequencialmente lavados a 65°C com SSC 0,1X / SDS 0,1% por 40 minutos. Finalmente, os blots foram expressos para armazenar avaliações de imagem de fósforo e realizada imagem usando um sistema de imagem Molecular Dynamics Storm 860®.
[000281] As análises Southern blot completadas neste estudo foram usadas para determinar o número de cópia e confirmar que eventos selecionados continham o transgene dgt-28 dentro do genoma de Ara- bidopsis.
[000282] Confirmação do Cassete de Expressão de Gene dgt-28 através de Análise de PCR. A presença do cassete de expressão de gene dgt-28 contido nos eventos de planta T1 foi detectada através de uma reação de PCR de ponto final. Iniciadores (Tabela 6) específicos para o promotor AtUbi10 v2 e regiões AtuORF23 3'UTR v1 do cassete de expressão de gene dgt-28 foram usados para detecção. Tabela 6. Iniciadores de oligonucleotídeo usados para confirmação do cassete de expressão do gene dgt-28
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[000283] As reações de PCR requereram um protocolo de ciclização de PCR de três etapas padrão para amplificar o cassete de expressão de gene. Todas as reações de PCR foram completadas usando as condições de PCR que seguem: 94°C por três minutos seguido por 35 ciclos de 94°C por trinta segundos, 60°C por trinta segundos e 72°C por três minutos. As reações foram completadas usando o EX-TAQ® PCR kit (TaKaRa Biotechnology Inc., Otsu, Shiga, Japão) conforme as instruções do fabricante. Seguindo o ciclo final, a reação foi incubada a 72°C por 10 minutos. Eletroforese em gel de agarose TAE foi usada para determinar o tamanho do amplicon de PCR. Amplicons de PCR de um tamanho esperado indicaram a presença de um cassete de expressão de gene no genoma dos eventos de Arabidopsis transgênicos.
Confirmação de Transcrição Relativa de dgt-28 através de Análise de PCR de Transcrição Reversa Quantitativa
[000284] Amostras de tecido de plantas transgênicas de dgt-28 foram coletadas em placas de 96 cavidades e congeladas a 80° C. Maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO® e contas de tungstênio (Environ Metal INC., Sweet Home, Oregon). Seguindo maceração do tecido, o RNA total foi isolado em formato de alto rendimento usando o Qiagen® Rneasy 96 kit (Qiagen®, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante que incluía o tratamento DnaseI opcional na coluna. Esta etapa foi subsequentemente seguida por um tratamento com DnaseI adicional (Ambi- on®, Austin, TX) do RNA total eluído. Síntese de cDNA foi realizada usando o RNA total como molde com o High Capacity cDNA Reverse Transcription® kit (Applied Biosystems, Austin, TX) seguindo o procedimento sugerido pelo fabricante com a adição do oligonucleotídeo, TVN. Quantificação de expressão foi completada através de ensaio de sonda de hidrólise e foi realizada através de PCR de tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER® 480 (Roche Applied Science, Indianapo- lis, IN). Os ensaios foram projetados para dgt-28 e o gene de referência interno "proteína desconhecida" (Número de Acesso Genbank: AT4G24610) usando o LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para amplificação, LIGHTCYCLER® 480 Probes Master mix (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foi preparada em uma concentração final 1 X em um volume de 10 μL de reação singleplex contendo 0,4 μM para cada iniciador e 0,2 μM de cada sonda. Tabela 7 Tabela 7. Iniciadores de PCR usados para análise de PCR de transcrição reversa quantitativa de dgt-28
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[000285] Uma reação d e amplificação de duas etapas foi realizada com uma extensão a 60°C por 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram realizadas em triplicata e os valores de Limiar de ciclo (Ct) médios foram usados para análise de cada amostra. Uma reação de transcrição reversa negativa foi realizada para cada amostra para assegurar que nenhuma contaminação de gDNA estivesse presente. Análise de dados de PCR de tempo real foi realizada com base no método ΔΔCt. Este ensaio foi usado para determinar a expressão relativa de dgt-28 em eventos de Arabidopsis trans- gênicos que foram determinados ser hemizigotos e homozigotos. Os níveis de transcrição relativos do mRNA de dgt-28 variaram de 2,5 vezes a 207,5 vezes mais do que o controle interno. Esses dados indi- cam que plantas transgênicas de dgt-28 continham um cassete de ex-pressão de gene dgt-28 e as plantas eram capazes de transcrição do transgene dgt-28.
[000286] Análise Western Blotting. DGT-28 foi detectado em amostras de folha obtidas de plantas de Arabidopsis thaliana transgênicas. Extratos de planta de plantas transgênicas dgt-28 e padrões de proteína DGT-28 foram incubados com tampão de amostra NUPAGE® LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo DTT a 90°C por 10 minutos e ele- troforeticamente separado em um gel de pré-fundição de acrilamida. As proteínas foram então eletrotransferidas para membrana de nitroce- lulose usando o protocolo do fabricante. Após bloqueio com a WESTERNBREEZE® Blocking Mix (Invitrogen) a proteína DGT-28 foi detectada através de antissoro anti-DGT-28 seguido por fosfatase anticoelho de cabra. A proteína detectada foi visualizada através de substrato quimioluminescente BCIP/NBT Western Analysis Reagent (KPL, Gaithersburg, MD). Produção de uma proteína DGT-28 intacta através de Western blot indicou que as plantas transgênicas de dgt-28 que foram ensaiadas expressavam a proteína DGT-28.
[000287] Plantas de Arabidopsis T1 transgênicas contendo o transgene dgt-28 foram pulverizadas com taxas diferentes de glifosato. Taxas elevadas foram aplicadas neste estudo para determinar os níveis relativos de resistência (105, 420, 1.680 ou 3.360 g ae/ha). Uma taxa de uso 1X típica de glifosato que vai controlar Arabidopsis não transformada é 1120 g ae/ha. Formulações de glifosato com a adição de sulfato de amônio foram aplicadas às plantas T1 com um pulverizador em faixa calibrado a 187 L/ha. As plantas de Arabidopsis T1 que foram usadas neste estudo eram de número de cópia variável para o transgene dgt-28. As plantas de Arabidopsis T1 de dgt-28 de pouca cópia foram autopolinizadas e usadas para produzir plantas T2. A Tabela 8 mostra a comparação de plantas transgênicas dgt-28, descrita para um gene de resistência a herbicida glifosato, dgt-1, e controles do tipo selvagem. A Tabela 9 mostra a com-paração de dgt-32, e dgt-33 descrito para um gene de resistência a herbicida glifosato, dgt-1, e controles do tipo selvagem. A Tabela 10 mostra a comparação das novas enzimas de EPSP sintase bacterianas com as enzimas de EPSP sintase Classe I e os controles em uma taxa de glifo- sato de 1.680 g ae/ha.
[000288] Resultados de Seleção de Glifosato de Plantas de Arabi- dopsis dgt-28 Transformadas. Os transformantes TI de Arabidopsis foram primeiro selecionados da base de semente não transformada usando um esquema de seleção de glufosinato. Três bandejas ou 30.000 sementes foram analisadas para cada construto T1. As plantas T1 selecionadas acima foram molecularmente caracterizadas e plantas representativas com número de cópia variável foram subsequentemente transplantadas para potes individuais e pulverizadas com várias taxas de glifosato comercial conforme anteriormente descrito. A resposta dessas plantas é apresentada em termos de % de lesão visual duas semanas após tratamento (WAT). Os dados são apresentados em uma tabela que mostra plantas individuais exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada constru- to usado para transformação de Arabipodsis. A faixa de resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transfor-mação. Arabidopsis não transformada, do tipo selvagem, (c.v. Columbia) serviu como um controle sensível a glifosato.
[000289] O nível de resposta de planta variou. Esta variância pode ser atribuída ao fato que cada planta representa um evento de transformação independente e então o número de cópia do gene de interesse varia de planta para planta. Foi notado que algumas plantas que continham o transgene não foram tolerantes a glifosato; uma análise completa para determinar se essas plantas expressavam o transgene não foi completa- da. É provável que a presença de números de cópia altos do transgene dentro das plantas de Arabidopsis T1 resultou em silenciamento de transgene ou outros efeitos epigenéticos que resultaram em sensibilidade a glifosato, apesar da presença do transgene dgt-28.
[000290] Uma média de lesão de população geral por taxa é apresentada na Tabela 10 para taxas de glifosato a 1.680 g ae/ha para demonstrar a diferença significante entre as plantas transformadas com dgt-3, dgt-7, dgt-28, dgt-32 e dgt-33 versus o dgt-1 e controles do tipo selvagem.
[000291] A tolerância provida pelas novas EPSP sintases bacteria- nas variou dependendo da enzima específica. DGT-28, DGT-32 e DGT-33 inesperadamente proveram tolerância significante a glifosato. Os genes dgt forneceram resistência a herbicida a plantas de Arabi- dopsis T1 individuais através de todos os peptídeos de trânsito testados. Desta maneira, o uso de peptídeos de trânsito de cloroplasto adicionais (isto é, TraP8 - dgt-32 ou TraP8 - dgt-33) proveria proteção contra glifosato com níveis de lesão similares conforme relatado dentro de um dado tratamento. Tabela 8. Resposta de Arabidopsis Ti transformada com dgt-28 a uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós-emergência, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4) e um controle não transformado. % de % de lesão visual 14 dias após aplicação.
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Tabela 9. Resposta de Arabidopsis Ti transformada com dgt-32 e dgt- 33 a uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós-emergência, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4) e um controle não transformado. % de % de lesão visual 14 dias depois da aplicação.
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Tabela 10. Resposta de Arabidopsis Ti transformada com dgt-28, dgt- 32, dgt-33 e dgt-7 a glifosato aplicado pós-emergência a 1.680 g ae/ha comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4) e um controle não transformado. % de % de lesão visual 14 dias depois da aplicação.
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[000292] Dgt-28 como um Marcador Selecionável. O uso de dgt-28 como um marcador selecionável para agente de seleção de glifosato é testado com as plantas transformadas com Arabidopsis descritas acima. Aproximadamente 50 sementes de Arabidopsis de geração T4 (homozigotas para dgt-28) são salpicadas em aproximadamente 5.000 sementes do tipo selvagem (sensíveis a glifosato). As sementes são germinadas e as mudas são pulverizadas com uma dose de seleção de glifosato. Vários tratamentos de glifosato são comparados; cada bandeja de sementes recebe um ou dois momentos de aplicação de glifosato em um dos esquemas de tratamento que seguem: 7 DAP (dias depois do plantio), 11 DAP ou 7 seguido por 11 DAP. Uma vez que todas as plantas também contêm um gene de resistência a glufosinato no mesmo vetor de transformação, plantas contendo dgt-28 seleciona-das com glifosato podem ser diretamente comparadas com plantas contendo DSM-28 ou pat selecionadas com glufosinato.
[000293] Tratamentos com glifosato são aplicados com uma ponteira de pulverização DeVilbiss® conforme anteriormente descrito. Plantas transgê- nicas contendo dgt-28 são identificadas como "resistentes" ou "sensíveis" 17 DAP. Tratamentos de 26,25-1680 g ae/ha de glifosato aplicado 7 e 11 dias depois do plantio (DAP) mostram seleção eficaz de plantas de Arabi- dopsis transgênicas que contêm dgt-28. Plantas sensíveis e resistentes são contadas e o número de plantas tolerantes a glifosato é verificado se relacionar com o número original de sementes transgênicas contendo o transgene dgt-28 que são plantadas. Esses resultados indicam que dgt-28 pode ser eficazmente usado como um marcador selecionável alternativo para uma população de Arabidopsis transformada.
[000294] Capacidade de Herança. Eventos de Arabidopsis T1 trans- gênica confirmados foram autopolinados para produzir semente T2. Essas sementes tiveram a progênie testada através da aplicação de herbicida Ignite® contendo glufosinato (200 g ae/ha) para 100 mudas aleatórias T2. Cada planta individual T2 foi transplantada para potes de 7,5 cm antes da aplicação de pulverização (pulverizador de faixa em uma taxa de aplicação de 187 L/ha). As famílias T1 (plantas T2) segre-garam no modelo Resistente 3 : Sensível 1 antecipado para um locus único dominantemente herdado com herança Mendeliana conforme determinado através de análise do Chi quadrado (P>0,05). A porcen-tagem de famílias T1 que segregaram com a herança Mendeliana es-perada é ilustrada na Tabela 11 e demonstra que que a característica dgt-28 é passada através de herança Mendeliana para a geração T2. Sementes foram coletadas de 5 a 15 indivíduos T2 (semente T3). Vinte e cinco mudas de T3 de cada uma de 3-4 famílias T2 aleatoriamente selecionadas tiveram a progênie testada conforme anteriormente des-crito. Os dados não mostraram nenhuma segregação e então demons-traram que dgt-28 e dgt-3 são estavelmente integrados dentro do cro-mossomo e herdados de uma maneira Mendeliana para pelo menos três gerações. Tabela 11. Porcentagem de famílias TI (plantas T2) segregando como herança Mendeliana para um teste de progênie de 100 plantas
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[000295] Dados de Arabidopsis T2. As plantas da segunda geração (T2) de eventos de Arabidopsis T1 selecionados que continham números de cópia baixos do transgene dgt-28 foram caracterizadas adicionalmente quanto à tolerância a glifosato. Glifosato foi aplicado conforme anteriormente descrito. A resposta das plantas é apresentada em termos de % de lesão visual duas semanas após tratamento (WAT) (Weeks After Treatment). Os dados são apresentados como histogra-mas de indivíduos exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e Desvio-padrão são apresentados para cada construto usado para transformação de Arabidopsis. A faixa em resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabi- dopsis não transformada, do tipo selvagem, (cv. Columbia) serviu como um controle sensível a glifosato. Na geração T2 plantas hemizigo- tas e homozigotas estavam disponíveis para teste para cada evento e então foram incluídas para cada taxa de glifosato testado. Plantas he- mizigotas contêm dois alelos diferentes em um locus conforme compa-rado com plantas homozigotas que contêm os mesmos dois alelos em um locus. Variabilidade de resposta a glifosato é esperada na geração T2 como resultado da diferença em dosagem de gene para hemizigota comparado com plantas homozigotas. A variabilidade em resposta a glifosato é refletida no Desvio-padrão e faixa de resposta.
[000296] Na geração T2, ambos os eventos dgt-28 de cópia única e multicópia foram caracterizados quanto à tolerância a glifosato. Dentro de um evento, plantas de cópia única mostraram níveis similares de tolerância a glifosato. Dados característicos para um evento T2 de cópia única são apresentados na Tabela 12. Eventos contendo dgt-28 ligado através de TraP5 v2 não proveram tolerância robusta a glifosato comparado com os construtos de dgt-28 que continham outros peptídeos de trânsito TraP. No entanto, os construtos TraP5 dgt-28 não proveram um nível baixo de tolerância a glifosato comparado com o controle Columbia não transformado. Houve casos quando eventos que foram mostrados conter duas ou mais cópias de dgt-28 foram mais suscetíveis a taxas elevadas de glifosato (dados não mostrados). Este aumento em sensibilidade a glifo- sato é similar aos dados anteriormente descritos para as plantas T1 que também continham números de cópia altos do transgene dgt-28. É provável que a presença de números de cópias altos do transgene dentro da planta de Arabidopsis resulte em silenciamento de transgene ou outros efeitos epigenéticos que resultaram em sensibilidade a glifosato, apesar da presença do transgene dgt-28.
[000297] Esses eventos continham dgt-28 ligado com TraP5 v2 (pDAB105530), TraP12 v2 (pDAB105533) e TraP13 v2 (pDAB105534).
[000298] Em adição a dgt-28, eventos de Arabidopsis T2 transformados com dgt-3 são apresentados na Tabela 13. Conforme descrito para os eventos de dgt-28 na Tabela 12, a tabela de dados contém um evento representativo que é característico da resposta a glifosato para cada construto. Para a caracterização de dgt-3, construtos contendo uma PTU única (unidade de transformação de planta) com o gene dgt- 3 sendo direcionado pelo promotor AtUbi10 (pDAB102716, Figura 29 e pDAB102715, Figura 28) foram comparados com construtos com o mesmo gene contendo 2 PTUs do gene (pDAB102719, Figura 32; pDAB102718, Figura 33). Os construtos que continham 2 PTU usaram o promotor AtUbi10 para direcionar uma cópia do gene e o promotor CsVMV para direcionar a outra cópia. O uso da PTU dupla foi incorpo-rado para comparar as plantas transgênicas dgt-3 com plantas trans- gênicas dgt-28 que continham duas cópias do transgene. Dados de-monstraram que eventos de dgt-3 T2 de cópia única com apenas uma PTU única eram mais suscetíveis a glifosato do que eventos de dgt-28 de cópia única testados, mas eram mais tolerantes do que o controle não transformado. Famílias T1 contendo 2 PTUs do gene dgt-3 prove-ram um nível maior de tolerância visual a glifosato comparado com os construtos de 1 PTU. Em ambos os casos, as famílias T1 foram com-paradas com dgt-1 e controle do tipo selvagem. Dados de T2 demons-tram que dgt-28 provê tolerância robusta como eventos de cópia única. Tabela 12. Resposta de eventos de Arabidopsis T2 individuais selecio-nados contendo dgt-28 a glifosato aplicado pós-emergência em taxas variáveis, comparado com população resistente homozigota de dgt-1 (T4) e um controle não transformado. % de lesão visual 14 dias depois da aplicação.
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Tabela 13. Resposta de eventos de Arabidopsis T2 selecionados trans-formados com dgt-3 a glifosato aplicado pós-emergência em taxas va-riáveis. % de lesão visual 14 dias após aplicação
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[000299] Dados de Arabidopsis T3. As plantas da terceira geração (T3) de eventos de Arabidopsis T2 selecionados que continham números de cópia baixos do transgene dgt-28 foram caracterizadas adicionalmente quanto à tolerância a glifosato. Vinte e cinco plantas por linhagem foram selecionadas com glufosinato conforme anteriormente descrito e as linhagens de cada construto testadas não segregaram para o gene marcador selecionável. Glifosato foi aplicado conforme anteriormente descrito. A resposta das plantas é apresentada em termos de % de lesão visual duas semanas após tratamento (WAT). Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e Desvio-padrão são apresentados para cada construto usado para transformação de Arabidopsis. A faixa de resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada, do tipo selvagem, (cv. Columbia) serviu como um controle sensível a glifosato. Tabela 14. Resposta de eventos de Arabidopsis T3 individuais selecio-nados contendo dgt-28 a glifosato aplicado pós-emergência em taxas variáveis, comparado com uma população resistente homozigota de dgt-1 (T4) e um controle não transformado. % de lesão visual 14 dias após aplicação dgt-28 (pDAB107602) % de Faixa de Lesão (N°. de Réplicas) % de Análise de Lesão Taxa de Aplicação <20% 20-40% >40% Média Desvio-padrão Faixa (%) 0 g ae/ha glifosato 4 0 0 0,0 0,0 0 420 g ae/ha glifosato 0 0 4 73,8 2,5 70-75
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[000300] Seleção de plantas transformadas. Sementes T2 recém- colhidas [genes dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1] foram deixadas secar em temperatura ambiente e enviadas para Indianápolis para teste. Semente T1 foi semeada em bandejas de germinação de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), cada uma recebendo alíquotas de 200 mg de semente T1 estratificada (~10.000 sementes) que tinham sido anteriormente suspensas em 40 mL de solução de agarose a 0,1% e armazenadas a 4°C por 2 dias para completar as necessidades de dormência e assegurar germinação de semente síncrona.
[000301] Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) foi coberta com vermiculita fina e subirrigada com solução de Hoagland até ficar úmida, então deixada drenar pela gravidade. Cada alíquota de 40 mL de semente estratificada foi semeada uniformemente sobre a vermiculita com uma pipeta e coberta com cúpulas de umidade (KORD® Products, Bramalea, Ontario, Canadá) por 4-5 dias. As cúpulas foram removidas uma vez as plantas tendo germinado antes da seleção de transformante inicial usando spray de pós-emergência de glufosinato (seleção quanto ao gene dsm-2 co-transformado).
[000302] Seis dias após o plantio (DAP) e novamente 10 DAPT, plantas T1 (cotiledônea e estágio 2-4 folhas, respectivamente) foram pulverizadas com uma solução 0,1% de herbicida IGNITE® (280 g ai/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) em um volume de pulverização de 10 ml/bandeja (703 L/ha) usando uma ponteira de pulverização a ar comprimido DeVilbiss® para aplicar uma taxa eficaz de 200 g ae/ha de glufosinato por aplicação. Sobreviventes (plantas crescendo ativamente) foram identificadas 4-7 dias após a pulverização final. Plantas sobreviventes foram transplantadas individualmente em potes de 7,62 cm (3 polegadas) preparados com meio de plantio em pote (Metro Mix 360®). As plantas foram cultivadas na estufa pelo menos 1 dia antes da amostragem de tecido para análises de número de cópia.
[000303] Plantas T1 foram amostradas e análise de número de cópia quanto a genes dgt-31, dgt-32 e dgt-3 v1 foi completada. Plantas T1 foram então designadas a várias taxas de glifosato de maneira que uma faixa de cópias estava dentre cada taxa. Para Arabidopsis, 26,25 g ae/ha de glifosato é uma dose eficaz para distinguir plantas sensíveis daquelas com níveis significantes de resistência. Taxas elevadas foram aplicadas para determinar os níveis relativos de resistência (105, 420, 1680 ou 3360 g ae/ha). A Tabela 15 mostra as comparações descritas para dgt-1.
[000304] Todas as aplicações de herbicida glifosato foram feitas através de pulverizador de faixa em um volume de pulverização de 187 L/ha. O glifosato usado era da formulação de sal de dimetilamina Durango comercial (480 g ae/L, Dow AgroSciences, LLC). Plantas T1 de pouca cópia que exibiram tolerância ou a glufosinato ou glifosato foram avaliadas adicionalmente na geração T2.
[000305] As primeiras transformações de Arabidopsis foram conduzidas usando dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1. Transformantes T1 foram primeiro selecionados a partir da base de sementes não transformadas usando um esquema de seleção de glufosinato. Três bandejas ou 30.000 sementes foram analisadas para cada construto de T1. Frequência de transformação foi calculada e resultados de construtos T1 de dgt-31, dgt-32 e dgt-33 são listados na Tabela 15. Tabela 15. Frequência de transformação de construtos de Arabidopsis Ti dgt-31, dgt-32 e dgt-33 selecionados com glufosinato para seleção do gene marcador selecionável DSM-2
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[000306] Plantas T1 selecionadas acima foram subsequentemente transplantadas para potes individuais e pulverizadas com taxas variadas de glifosato comercial. A Tabela i6 compara a resposta de dgt-31, dgt- 32 e dgt-33 e genes controle em fornecer resistência a glifosato a trans- formantes de Arabidopsis Ti. A resposta é apresentada em termos de % de lesão visual 2 WAT. Os dados são apresentados como um histo-grama de indivíduos exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e desvio-padrão são apresentados para cada tratamento. A faixa de res-posta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada do tipo selvagem (cv. Co-lumbia) serviu como um controle sensível a glifosato. O gene DGT-31 (vi) com peptídeo de trânsito TraP23 forneceu tolerância a herbicida leve a plantas de Arabidopsis Ti individuais comparado com o controle negativo, mas o gene exibiu tolerância aperfeiçoada com peptídeo de trânsito TraP8. Ambos o DGT-32 e o DGT-33 demonstraram tolerância robusta a glifosato nas taxas testadas com TraP8 e com seu respectivo peptídeo de trânsito de cloroplasto diferente (TraPi4 e TraP24, respec-tivamente). Dentro de um dado tratamento, o nível de resposta de planta variou muito, o que pode ser atribuído ao fato que cada planta repre-senta um evento de transformação independente e então o número de cópia do gene de interesse varia de planta para planta. De nota impor-tante, em cada taxa de glifosato testada, houve indivíduos que eram mais tolerantes do que outros. Uma média de lesão de população geral por taxa é apresentada na Tabela 16 para demonstrar a diferença signi- ficante entre as plantas transformadas com dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1 versus dgt-1 v1 ou controles do tipo selvagem. Tabela 16. dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1 transformaram resposta de Ara- bidopsis Ti para uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós- emergência, comparado com uma população resistente homozigota de dgt-1 (T4) ou um controle não transformado. % de lesão visual duas semanas após tratamento
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[000307] Transformação de Milho. Métodos de clonagem padrão, conforme acima descrito, foram usados na construção de vetores biná-rios para uso em transformação de milho mediada por Agrobacterium tumefaciens. A Tabela 17 lista os vetores que foram construídos para transformação de milho. Os elementos de gene que seguem foram usados nos vetores que continham dgt-28; o promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (ZmUbil; Patente U.S. N°. 5.510.474) foi usado para di-recionar a sequência de codificação de dgt-28 que é flanqueada por uma região não traduzida 3' de Lipase de Zea mays (ZmLip 3'UTR; Patente U.S. N°. 7179902), o cassete de marcador selecionável con-siste no promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays que foi usado para di-recionar a sequência de codificação aad-1 (Patente U.S. N°. 7.838.733) que é flanqueada pela região não traduzida 3' de Lipase de Zea mays. A sequência de codificação aad-1 confere tolerância aos herbicidas de fenóxi auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e a herbicidas de ariloxifenoxipropionato (AOPP).
[000308] Os construtos de dgt-28 foram construídos como vetores binários padrão e vetores de sistema superbinário de Agrobacterium (Japan Tobacco, Tóquio, JP). Os vetores binários padrão incluem: pDAB107663, pDAB107664, pDAB107665 e pDAB107665. Os vetores do sistema superbinário de Agrobacterium incluem pDAB108384, pDAB108385, pDAB108386 e pDAB108387.
[000309] Construtos adicionais foram completados, os quais contêm um gene repórter da proteína amarelo fluorescente (yfp; Pedido de Pa-tente U.S. 2007/0298412). pDAB109812 contém um cassete de gene repórter de yfp que é direcionado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e flanqueado pela região não traduzida 3' per 5 de Zea mays (Zm per5 3'UTR; Patente U.S. N°. 7179902), o cassete de marcador selecio- nável consiste no promotor do vírus baciliforme da cana-de-açúcar (SCBV; Patente U.S. N°. 5.994.123) que é usado para direcionar a ex-pressão de aad-1 e é flanqueado pela região não traduzida 3' de Lipase de Zea Mays. pDAB101556 contém um cassete de yfp que é direciona-do pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e flanqueado pela região não traduzida 3' per 5 de Zea mays, o marcador selecionável consiste no promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays que é usado para direcionar a expressão de aad-1 e é flanqueado pela região não traduzida 3' de Li-pase de Zea mays. pDAB107698 contém um cassete de dgt-28 que é direcionado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e é flanqueado por uma região não traduzida 3' de Lipase de Zea mays, um cassete de yfp que é direcionado pelo promotor da Ubiqutina 1 de Zea mays e flan-queado pela região não traduzida 3' per 5 de Zea mays, o cassete de marcador selecionável consiste no promotor do vírus baciliforme da ca-na-de-açúcar que é usado para direcionar a expressão de aad-1 e é flanqueado pela região não traduzida 3' de Lipase de Zea mays. Todos os três desses construtos são vetores binários padrão. Tabela 17. Vetores de Transformação de Milho
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[000310] Esterilização de espiga e isolamento de embrião. Para obter embriões imaturos de milho, plantas da linhagem de cruzamento de Zea mays b104 foram cultivadas na estufa e foram autopolinizadas ou subpolinizadas para produzir espigas. As espigas foram colhidas apro-ximadamente 9-12 dias pós-polinização. No dia do experimento, as espigas foram esterilizadas na superfície através de imersão em uma solução 20% de hipoclorito de sódio (5%) e agitadas por 20-30 minutos, seguido por três enxágues em água estéril. Após esterilização, embriões zigóticos imaturos (1,5-2,4 mm) foram assepticamente dis-secados de cada espiga e aleatoriamente distribuídos em tubos de mi- crocentrífuga contendo meios de infecção líquidos (LS Basal Medium, 4,43 gm/L; N6 Vitamin Solution [1000X]; 1,00 mL/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Sacarose, 68,5 gm/L; (D)+ Glicose, 36,0 gm/L; 10 mg/ml de 2,4- D, 150 μL/L). Para um dado conjunto de experimentos, embriões agru-pados de três espigas foram usados para cada transformação. Início da Cultura de Agrobacterium:
[000311] Estoques de glicerol de Agrobacterium contendo os vetores de transformação binários descritos acima foram riscados em placas de meio mínimo AB contendo antibióticos apropriados e foram cultivados a 20° C por 3-4 dias. Uma colônia única foi pega e riscada em placas YEP contendo os mesmos antibióticos e foi incubada a 28°C por 1-2 dias.
[000312] Cultura e Cocultivo de Agrobacterium. Colônias de Agrobacterium_foram pegas da placa YEP, suspensas em 10 mL de meio de infecção em um tubo descartável de 50 mL e a densidade ce-lular foi ajustada para OD600 nm de 0,2-0,4 usando um espectrofotôme- tro. As culturas de Agrobacterium foram postas em um agitador giratório a 125 rpm, temperatura ambiente, enquanto dissecação de embrião foi realizada. Embriões zigóticos imaturos entre 1,5-2,4 mm de tamanho foram isolados dos grãos de milho esterilizados e postos em 1 mL de meio de infecção) e lavados uma vez no mesmo meio. A suspensão de Agrobacterium (2 mL) foi adicionada a cada tubo e os tubos foram postos em uma plataforma de agitação por 10-15 minutos. Os embriões foram transferidos para meio de cocultivo (MS Salts, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Myo-inositol, 100,0 mg/L; Hidrolisato de caseína enzimático 100,0 mg/L; Dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan®, 3,00 gm/L; MS-Vitamina Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5 mg/ml AgNo3, 15,0 mg/L; DMSO, 100 μM), ori-entados com o escutelo faceando para cima e incubados a 25°C, sob luz 24 horas e 50 μmols m-2 s-1 de intensidade de luz por 3 dias.
[000313] Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Putativos. Se-guindo o período de cocultivo, os embriões foram transferidos para meio de descanso (MS Salts, 433, gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; 1,2,3,5/4,6-Hexaidrociclo-hexano, 100 mg/L; MES [(ácido 2-(n- morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisato enzi- mático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; Saca- rose, 30,0 gm/L; Gelzan 2,30 gm/L; Vitamina MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5 mg/ml AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) sem agente seletivo e incubados sob 24 horas de luz a 50 μmols m-2 s- 1 de intensidade de luz e a 25°C por 3 dias.
[000314] Experimentos de resposta de dosagem de inibição de cres-cimento sugeriram que concentrações de glifosato de 0,25 mM e supe-riores eram suficientes para inibir crescimento celular na linhagem de milho B104 não transformada. Os embriões foram transferidos para meio Selection 1 contendo Glifosato 0,5 mM (MS Salts, 4,33 gm/L; L- prolina, 700,0 mg/L; Mio-inositol, 100,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n- morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisato enzi- mático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; Saca-rose, 30,0 gm/L; Gelzan® 2,30 gm/L; Vitamina MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5 mg/ml de AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) e incubados ou no escuro e/ou sob luz 24 horas a 50 μmols m-2 s-1 de intensidade de luz por 7-14 dias a 28°C.
[000315] Calos embriônicos em proliferação foram transferidos para meio Selection 2 contendo 1,0 mM de glifosato (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-Hexaidrociclo-hexano, 100 mg/L; L-prolina, 700,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisato enzimático de caseína 100,0 gm/L; Dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 mg/L; Gelzan® 2,30 gm/L; Vitamina MS Modi-ficada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5 mg/mL AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L; ácido R-Haloxifope 0,1810 mg/L) e foram incubados ou no escuro e/ou sob luz por 24 horas a 50 μmols m-2 s-1 de intensidade de luz por 14 dias a 28°C. Esta etapa de seleção permitiu que calo trans- gênico proliferasse mais e diferenciasse. O período de seleção de calo durou três a quatro semanas.
[000316] Calos embriogênicos, em proliferação, foram transferidos para meio PreReg contendo glifosato 0,5 mM (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-Hexa-hidrociclo-hexano, 100 mg/L; L-prolina, 350,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,25 gm/L; Hidrolisato enzimático de caseína 50,0 mg/L; NAA-NaOH 0,500 mg/L; ABA-EtOH 2,50 mg/L; BA 1,00 mg/L; Sacarose, 45,0 gm/L; Gelzan® 2,50 gm/L; Vitamina MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5 mg/ml Ag- No3, 1,00 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) e cultivados sob luz por 24 horas a 50 μmols m-2 s-1 de intensidade de luz por 7 dias a 28°C.
[000317] Calos embriogênicos com brotos tipo ramo foram transferidos para Meio de regeneração contendo glifosato 0,5 mM (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-Hexaidrociclo-hexano, 100,0 mg/L; Sacarose, 60,0 gm/L; Gellan Gum G434® 3,00 gm/L; MS-Vitamin Modificada [1000X], 1,00 ml/L; Carbenicilina, 125,0 mg/L) e cultivados sob luz por 24 horas a 50 μmols m-2 s-1 de intensidade de luz por 7 dias.
[000318] Pequenos ramos com raízes primárias foram transferidos para meio de enraizamento (MS Salts, 4,33 gm/L; MS-Vitamin Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 1,2,3,5/4,6-Hexaidrociclo-hexano, 100 mg/mL; Sacarose, 60,0 gm/L; Gellan Gum G434® 3,00 gm/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) em fitoban- dejas e foram incubados sob 16/8 h luz/escuro a 140-190 μmole em m-2 s-1 de intensidade de luz por 7 dias a 27°C. Mudas transgênicas putativas foram analisadas quanto a número de cópia de transgene usando os protocolos descritos acima e transferidas para o solo.
[000319] Confirmação molecular da Presença dos transgenes dgt-28 e aad-1 dentro de Plantas de Milho. A presença das sequências de po- linucleotídeo dgt-28 e aad-1 foi confirmada através de ensaios de sonda de hidrólise. Plantas de milho T0 isoladas foram inicialmente avaliadas através de um ensaio de sonda de hidrólise, análoga à TAQMAN®, para confirmar a presença de transgenes aad-1 e dgt-28. Os dados gerados a partir desses estudos foram usados para determinar o número de có-pia de transgene e usados para selecionar eventos de milho transgêni- cos para retrocruzamento e avanço para a geração T1.
[000320] Amostras de tecido foram coletadas em placas de 96 cavi-dades, maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO® e contas de aço inoxidável (Hoover Precision Products, Cumming, GA) em tampão Qiagen® RLT. Seguindo maceração de tecido, o DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento usando o Biosprint 96® Plant kit (Qiagen, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante). DNA genômico foi quantificado através do estojo de ensaio Quant-IT® Pico Green DNA (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). DNA genômico quanti-ficado foi ajustado por volta de 2 ng/μL para o ensaio de sonda de hidrólise usando um manuseador de líquido automático BIORO- BOTT3000® (Qiagen, Germantown, MD). Determinação do número de cópia de transgene através do ensaio de sonda de hidrólise, análogo ao ensaio TAQMAN®, foi realizada através de PCR de tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER® 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Os ensaios foram projetados para aad-1, dgt-28 e um gene de referência interno invertase (N°. Acesso Genbank: U16123.1) usando o LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para amplificação, LIGHTCYCLER® 480 Probes Master mix (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) foi preparada em uma concentração final 1X em uma reação multiplex de 10 μL de volume contendo 0,4 μM de cada iniciador para aad-1 e dgt-28 e 0,2 μM de cada sonda (Tabela 18).
[000321] Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada com uma extensão a 60°C por 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram ativadas e os valores de Limiar de ciclo (Ct) médios foram usados para análise de cada amostra. Análise de dados de PCR de tempo real foi realizada usando LightCycler® software release 1.5 usando o módulo quant relativo e é baseada no método ΔΔCt. Controles incluíam uma amostra de DNA genômico de um calibrador de cópia única e checagem de duas cópias conhecidas que foram incluídas em cada rodada. A Tabela 19 lista os resultados dos ensaios de sonda de hidrólise. Tabela 18. Iniciador e sequências de sonda usados para ensaio de sonda de hidrólise de aad-1, dgt-28 e referência interna (Invertase)
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Tabela 19. Resultados de quantidade de cópia To para eventos dgt-28. Eventos de número de cópia baixo consistiam em 1-2 cópias de trans-gene, números de cópia única são listados em parênteses. Eventos com número de cópia alto continham 3 ou mais cópias transgênicas
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[000322] Tolerância a Herbicida em Milho Transformado com dgt-28. Eventos de transformação de dgt-28 de Zea mays (T0) foram deixados aclimatar na estufa e foram cultivados até que as plantas tivessem passado pela transição de cultura de tecido para condições de cresci-mento em estufa (isto é, 2-4 folhas de aparência normal, novas, que tinham emergido da flor). As plantas foram cultivadas a 27°C sob con-dições de 16 horas de luz:8 horas de escuro na estufa. As plantas fo- ram então tratadas com formulações comerciais de DURANGO DMA® (contendo o herbicida glifosato) com a adição de sulfato de amônio 2% p/v. Aplicações de herbicida foram feitas com o pulverizador de faixa em um volume de pulverização de 187 L/ha, altura de pulverização 50 cm. Plantas T0 foram pulverizadas com uma faixa de glifosato de 2804480 g ae/ha de glifosato, que é capaz de lesão significante a linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa 95% de lesão ao cruzamento B104.
[000323] Os resultados das plantas de milho dgt-28 T0 demonstraram que tolerância a glifosato foi obtida em taxas de até 4480 g ae/ha. Um tipo de meio específico foi usado na geração T0. Atrofia mínima e cres-cimento de planta geral de plantas transformadas comparado com os controles não transformados demonstraram que dgt-28 provê tolerância robusta a glifosato quando ligado aos peptídeos de trânsito de clo- roplasto TraP5, TraP8 e TraP23.
[000324] Plantas T0 selecionadas são autocruzadas ou retrocruzadas para caracterização adicional na próxima geração. 100 linhagens de dgt-28 escolhidas contendo as plantas T1 são pulverizadas com 140-1120 g ae/ha de glufosinato ou 105-1680 gha de glifosato. Ambos os genes marcador selecionável e resistente a glifosato são construídos no mesmo plasmídeo. Desta maneira, se um gene tolerante a herbicida for selecionado através de pulverização com um herbicida, ambos os genes são acreditados estar presentes. Em 14 DAT, plantas resistentes e sensíveis são contadas para determinar a porcentagem de linhagens que segregaram como um local único, característica Mende- liana dominante (3R:1S) conforme determinado através de análise de quadrado Chi. Esses dados demonstram que dgt-28 é herdável como um gene de resistência a glifosato robusto em uma espécie monocoti- ledônea. Taxas altas de glifosato são aplicadas aos sobreviventes T1 ou F1 para caracterizar adicionalmente a tolerância e proteção que são providas pelo gene dgt-28.
[000325] Tolerância a herbicida pós-emergência em Milho To trans-formado com dgt-28. Eventos TO de dgt-28 ligado com TraP4, TraP5, TraP9 e TraP23 foram gerados através de transformação com Agrobacterium e foram deixados aclimatar sob condições de câmara de crescimento controlado até que 2-4 folhas de aparência normal, novas, tivessem emergido da flor. As plantas receberam números de identificação individuais e foram amostradas para análises de número cópia de ambos o dgt-28 e o aad-1. Com base em análises de número de cópia, as plantas foram selecionadas para análises de expressão de proteína. As plantas foram transplantadas para potes maiores com meio de crescimento novo e cultivadas a 27°C sob condições de 16 horas de luz:8 horas de escuro na estufa. As plantas restantes que não foram amostradas quanto à expressão de proteína foram então tratadas com formulações comerciais de DURANGO DMA® (glifosato) com a adição de 2% de sulfato de amônio p/v. Os tratamentos foram distribuídos de maneira que cada agrupamento de plantas continha eventos T0 de número de cópia variável. Aplicações de herbicida foram feitas com um pulverizador de faixa em um volume de pulverização de 187 L/ha, altura de pulverização 50 cm. Plantas T0 foram pulverizadas com uma faixa de glifosato de a partir de 280-4480 g ae/ha de glifosato capaz de lesão significante a linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >95% de lesão ao cruzamento B104. B104 era a base genética dos transformantes.
[000326] Os resultados de plantas de milho dgt-28 T0 demonstram que tolerância a glifosato foi obtida até 4480 g ae/ha. Atrofiamento mínimo e crescimento de planta geral de plantas transformadas comparado com os controles não transformados demonstraram que dgt-28 provê proteção robusta a glifosato quando ligado a TraP5, TraP8 e TraP23. Tabela 20. Resposta de eventos de dgt-28 To de números de cópia va-riáveis a taxas de glifosato variando de 280-4480 g ae/ha + 2,0% p/v de sulfato de amônio 14 dias depois do tratamento
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[000327] Análises de expressão de proteína através de ELISA padrão demonstraram uma faixa média de proteína DGT-28 de 12,6-22,5 ng/cm2 nos construtos testados.
[000328] Confirmação de tolerância a glifosato na geração Fi sob condições de estufa. Plantas T0 de cópia única que não foram pulveri-zadas foram retrocruzadas com a base não transformada Bi04 para caracterização adicional na geração seguinte. Na geração Ti, tolerância a glifosato foi avaliada para confirmar a herança do gene dgt-28. Para plantas Ti, o herbicida ASSURE II® (35 g ae/ha de quizalofope- metila) foi aplicado no estágio de crescimento VI para selecionar a proteína AAD-i. Ambos o marcador selecionável e gene resistente a gli- fosato são construídos no mesmo plasmídeo. Desta maneira, se um gene for selecionado, ambos os genes são acreditados estar presentes. Após 7 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas e plantas nulas fora removidas da população. Esses dados demonstram que dgt-28 (vi) é herdável como um gene de resistência a glifosato robusto em uma espécie monocotiledônea. As plantas foram amostradas para caracterização de proteína DGT-28 através de ELISA padrão e nível de transcrito de RNA. Plantas resistentes foram pulverizadas com 560-4480 g ae/ha de glifosato conforme anteriormente descrito. Os dados demonstram tolerância robusta de dgt-28 ligado a peptídeos de trânsito de cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 e Trap23 até 4480 g ae/ha de glifosato. Tabela 2i. Tabela 21. Resposta de eventos dgt-28 de cópia única F1 a taxas de glifosato variando de 560-4480 g ae/ha + 2,0% de sulfato de amônio p/v 14 dias após tratamento
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[000329] Dados de expressão de proteína demonstram uma faixa de proteína DGT-28 média de a partir de 42,2 - 88,2 ng/cm2 nos eventos T1 e construtos testados, estabelecendo expressão de proteína na geração T1.
[000330] Caracterização de milho de dgt-28 sob condições de cam- po. Eventos Ti de cópia única foram enviados para um local de campo para criar ambas as sementes hemizigotas híbridas e homozigotas de cruzamento entre a mesma espécie para caracterização adicional. Sementes híbridas foram criadas através de cruzamento de eventos Ti na linhagem de transformação de milho Bi04 com a linhagem de cru-zamento entre a mesma espécie 4XP8ii gerando populações híbridas segregando i:i (hemizigotas:nulas) para o evento. As sementes resul-tantes foram transportadas para 2 locais separados. Um total de cinco eventos de cópia única por construto foi plantado em cada local em um projeto de bloco completo aleatorizado em triplicata. Os campos foram projetados para aplicações de glifosato acontecerem no estágio de crescimento V4 e um agrupamento de plantas separado a ser aplicado no estágio de crescimento V8. O híbrido convencional 4XP8ii/Bi04 foi usado como um controle negativo.
[000331] Fileiras experimentais foram tratadas com i84 g ae/ha de ASSURE II® (i06 g ai/L de quizalofope-metila) para eliminar segregan- tes nulos. Todos os integrantes experimentais segregaram i:i (sensí- vel:resistente) (p=0,05) com relação à aplicação de ASSURE II®. Plan-tas resistentes selecionadas foram amostradas de cada evento para quantificação da proteína DGT-28 através de ELISA padrão.
[000332] Plantas resistentes a Quizalofope-metila foram tratadas com o herbicida comercial DURANGO DMA® (480 g ae/L de glifosato) com a adição de 2,5% p/v de sulfato de amônio em estágio V4 ou V8 de crescimento. Aplicações de herbicida foram feitas com um pulverizador de barra calibrado para aplicar um volume de i87 L/ha, altura de pulverização de 50 cm. As plantas foram pulverizadas com uma faixa de glifosato de a partir de ii20-4480 g ae/ha de glifosato, capaz de lesão significante a linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >95% de lesão à espécie de cruzamento entre a mesma espécie 4XP8ii. Avaliações de lesão vi- sual foram feitas para a porcentagem de clorose visual, porcentagem de necrose, porcentagem de inibição de crescimento e lesão visual total em 7, 15 e 21 DAT (dias após tratamento). As avaliações foram comparadas a checagens não tratadas para cada linhagem e os con-troles negativos.
[000333] Dados de lesão visual para todos os momentos de avaliação demonstraram tolerância robusta até 4480 g ae/ha de DURANGO DMA® em ambos os locais e momentos de aplicação. Eventos repre-sentativos para a aplicação V4 são apresentados de um local e estão de acordo com outros eventos, momentos de aplicação e locais. Tabela 22. Um evento do construto contendo dgt-28 ligado com TraP23 (pDAB107665) foi tolerante para a seleção de ASSURE II® para a pro-teína AAD-1, mas foi sensível a todas as taxas de glifosato aplicadas. Tabela 22. Resposta de eventos de dgt-28 aplicados com uma faixa de glifosato de 1120-4480 g ae/ha + 2,5% de sulfato de amônio p/v no estágio de crescimento V4
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[000334] Avaliações adicionais foram feitas durante o estágio de crescimento reprodutivo para a taxa de glifosato de 4480 g ae/ha. Ava-liações visuais de franjas, momento de polinização e enchimento da espiga foram similares às checagens não tratadas de cada linhagem para todos os construtos, momentos de aplicação e localizações. Re-sultados de quantificação para a proteína DGT-28 demonstraram uma faixa de expressão de proteína média de a partir de 186,4-303,0 ng/cm2. Dados demonstram tolerância robusta de milho transformado com dgt-28 sob condições de campo nos estágios de crescimento reprodutor de até 4480 g ae/ha de glifosato. Os dados também demonstraram detecção e função de proteína DGT-28 com base em resultados de tolerância à pulverização.
[000335] Confirmação de capacidade de herança e tolerância de milho com dgt-28 no estado homozigoto. Semente da TIS 2 foram plantadas sob condições de estufa conforme anteriormente descrito. As mesmas cinco linhagens de cópia única que foram caracterizadas sob condições de campo foram caracterizadas no estado homogêneo. As plantas foram cultivadas até o estágio de crescimento V3 e separadas em três taxas de glifosato variando de 1120-4480 g ae/ha de glifosato (DURANGO DMA®) e quatro réplicas por tratamento. As aplicações foram feitas em um pulverizador de faixa conforme anteriormente des-crito e foram formuladas em 2,0% p/v de sulfato de amônio. Uma apli-cação de sulfato de amônio serviu como uma checagem não tratada para cada linhagem. Avaliações visuais foram feitas 7 e 14 dias após tratamento conforme anteriormente descrito. Os dados demonstram tolerância robusta de até 4480 g ae/ha de glifosato para todos os eventos testados. Tabela 23. Tabela 23. Resposta de eventos de dgt-28 homozigotos aplicado com uma faixa de glifosato de a partir de 1120-4480 g ae/ha + 2,0% p/v de sulfato de amônio
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[000336] A linhagem de pDAB107665 que não foi tolerante sob con-dições de campo não demonstrou nenhuma tolerância a glifosato e então de acordo com as observações de campo (dados não mostrados). Com a exceção da linhagem mencionada acima, todas as réplicas que foram tratadas com glifosato das linhagens não eram sensíveis a glifosato. Desta maneira, os dados demonstram capacidade de herança para uma população homogênea de milho de dgt-28 de uma maneira Mendeliana. Expressão da proteína DGT-28 através de ELISA padrão demonstrou uma faixa de expressão de proteína média de a partir de 27,5-65,8 ng/cm2 em eventos de cópia únicos que eram tolerantes a glifosato. Dados demonstram proteína funcional e estabilidade da proteína DGT-28 através das gerações.
Uso de tolerância a herbicida pós-emergência de glifosato como um marcador selecionável.
[000337] Conforme anteriormente descrito, plantas transformadas T0 foram levadas de cultura de tecido e aclimatadas na estufa. Os eventos testados continham dgt-28 ligado a peptídeos de trânsito de cloro- plasto TraP5, TraP8 e TraP23. Foi demonstrado que essas plantas T0 proveram tolerância robusta até 4480 g ae/ha de glifosato, e plantas não transformadas foram controladas com glifosato em concentrações tão baixas quanto 280 g ae/ha. Esses dados demonstram que dgt-28 pode ser utilizado como um marcador selecionável usando uma concentração de glifosato variando de 280-4480 g ae/ha.
[000338] Várias sementes de linhagens fixas de milho que continham o transgene dgt-28 são salpicadas em várias sementes de milho não transformadas. As sementes são plantadas e deixadas crescer para o estágio desenvolvimental V1-V3, momento quando as mudas são pul-verizadas com uma dose de seleção de glifosato na faixa de 280-4480 g ae/ha. Seguindo 7-10 dias, plantas sensíveis e resistentes são con-tadas, e a quantidade de plantas tolerantes a glifosato se relaciona com o número original de sementes transgênicas contendo o transgene dgt-28 que são plantadas.
[000339] Empilhamento de milho dgt-28. A proteína AAD-1 é usada como o marcador selecionável em milho transformado com dgt-28 para propósitos de pesquisa. O gene aad-1 pode ser também utilizado como uma característica tolerante a herbicida em milho para prover tolerância a 2,4-D robusta até uma aplicação V8 em uma cultura. Quatro eventos dos construtos pDAB107663 (TraP4::dgt-28), pDAB107664 (TraP8::dgt-28) e pDAB107666 (TraP5::dgt-28) foram caracterizados quanto à tolerância de uma aplicação de mistura de tanque de glifosa- to e 2,4-D. O estudo de caracterização foi completado com semente F1 sob condições de estufa. As aplicações foram feitas em um pulverizador de faixa conforme anteriormente descrito nas taxas que seguem: 1120-2240 g ae/ha de glifosato (seletivo para o gene dgt-28), 11202240 g ae/ha 2,4-D (seletivo para o gene aad-1) ou uma mistura de tanque dos dois herbicidas nas taxas descritas. As plantas foram classificadas em 7 e 14 DAT. Resultados de pulverização para aplicações dos herbicidas a 2240 g ae/ha são mostrados na Tabela 24. Tabela 24. Resposta de milho aad-1 e dgt-28 Fi pulverizado com 2240 g ae/ha de 2,4-D, glifosato e uma combinação de mistura de tanque dos dois herbicidas 14 dias após tratamento
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[000340] Os resultados confirmam que dgt-28 pode ser empilhado com sucesso com aad-1, então aumentando os herbicidas de espectro que podem ser aplicados à cultura de interesse (glifosato + ácidos fe- noxiacéticos para dgt-28 e aad-1, respectivamente). Em produto de milho onde há dificuldade em controlar ervas-daninhas de folha larga ou biotipos de erva-danina resistentes, a pilha pode ser usada como um meio de controle de erva-daninha e proteção da cultura de interesse. Caraterísticas de entrada ou saída adicionais podem ser também empilhadas com o gene dgt-28 em milho e outras plantas.
[000341] Transformação de Soja. Soja transgênica (Glycine max) contendo um transgene dgt-28 estavelmente integrado foi gerada atra-vés de transformação mediada por Agrobacterium de explantes de no- do cotiledonário de soja. Uma linhagem de Agrobacterium desarmada carregando um vetor binário contendo um dgt-28 funcional foi usada para iniciar transformação.
[000342] Transformação mediada por Agrobacterium foi realizada usando um procedimento de nodo cotiledonário pela metade modificado de Zeng e outros (Zeng, P., Vadnais, D.A., Zhang, Z., Polacco, J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7):478-482). Em suma, sementes de soja (cv. Maverick) foram germinadas em meio basal e nodos cotiledoná- rios são isolados e infectados com Agrobacterium. Meios de início de ramo, alongamento de ramo e enraizamento são suplementados com cefotaxima, timentina e vancomicina para remoção de Agrobacterium. Seleção através de um herbicida foi empregada para inibir o cresci-mento de ramos não transformados. Ramos selecionados são transfe-ridos para meio de enraizamento para desenvolvimento de raiz e então transferidos para mistura de solo para aclimatação de mudas.
[000343] Folhinhas terminais de mudas selecionadas foram tratadas topicamente (técnica de pintura de folha) com um herbicida para avaliar transformantes putativos. As mudas avaliadas foram transferidas para a estufa, deixadas aclimatar e então a folha pintada com um herbicida para reconfirmar tolerância. Essas plantas T0 transformadas putativas foram amostradas e análise molecular foi usada para confirmar a presença de marcador selecionável herbicida e o transgene dgt-28. Plantas T0 foram deixadas autofertilizar na estufa para produzirem semente T1.
[000344] Um segundo método de transformação de soja pode ser usado para produzir plantas de soja transgênicas adicionais. Uma linhagem de Agrobacterium desarmada carregando um vetor binário contendo um dgt-28 funcional é usada para iniciar a transformação.
[000345] Transformação mediada por Agrobacterium foi realizada usando um procedimento de semente pela medade modificado de Paz e outros (Paz, M., Martinez, J., Kalvig, A., Fonger, T. e Wang, K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213). Em suma, sementes de soja maduras foram esterilizadas da noite para o dia com gás de cloro e embebidas com H2O estéril vinte horas antes de transformação de planta mediada por Agrobacterium. As sementes foram cortadas na metade com um corte longitudinal ao longo da entrada para separar a semente e remover o revestimento da semente. O eixo embriônico foi excisado e quaisquer ramos/brotos axiais foram removidos do nodo cotiledoná- rio. Os explantes de metade de semente resultantes foram infectados com Agrobacterium. Meios de início de ramo, alongamento de ramo e enraizamento foram suplementados com cefotaxime, timentina e van- comicina para remoção de Agrobacterium. Seleção de herbicida foi empregada para inibir o crescimento de brotos não transformados. Os brotos selecionados foram transferidos para meio de enraizamento para desenvolvimento de raiz e então transferidos para mistura de solo para aclimatação de mudas.
[000346] Plantas T0 transformadas putativas foram amostradas e análise molecular foi usada para confirmar a presença do marcador selecionável e do transgene dgt-28. Vários eventos foram identificados como contendo os transgenes. Essas plantas T0 foram avançadas para análise adicional e deixadas autofertilizar na estufa para dar origem à semente T1.
[000347] Confirmação da capacidade de herança de dgt-28 para a geração T1. A capacidade de herança da proteína DGT-28 para a ge-ração T1 foi avaliada em uma de duas maneiras. O primeiro método incluía plantio da semente T1 em meio Metro-mix e aplicação de 411 g ae/ha de IGNITE® 280 SL em plantas germinadas no 1° estágio de crescimento de três folhas. O segundo método consistia em homoge-neização de semente para um total de 8 réplicas usando um rolamento e um genogrinder. Testes de fita ELISA para detectar a proteína PAT foram então usados para detectar eventos de herança uma vez que o marcador selecionável estava no mesmo plastídeo que dgt-28. Para qualquer método se uma planta única foi tolerante a glufosinato ou foi detectada com um teste de tira ELISA PAT, o evento demonstrou ca-pacidade de herança para a geração T1.
[000348] Um total de cinco construtos foi avaliado quanto à capacidade de herança conforme anteriormente descrito. Os plasmídeos continham dgt-28 ligado com TraP4, TraP8 e TraP23. Os eventos nos construtos demonstraram 68% de capacidade de herança da proteína PAT::DGT-28 para a geração T1.
[000349] Tolerância a herbicida pós-emergência em soja Ti trans-formada com dgt-28. Sementes de eventos Ti que foram determinadas ser herdáveis através dos métodos de avaliação anteriormente descritos foram plantadas em meio Metro-mix sob condições de estufa. As plantas foram cultivadas até que o 1° trifoliato fosse totalmente expan-dido e tratado com 4ii g ae/ha de IGNITE® 280 SL para seleção do gene pat conforme anteriormente descrito. Plantas resistentes de cada evento receberam identificadores únicos e amostradas para análises de zigosidade do gene dgt-28. Dados de zigosidade foram usados para designar 2 réplicas hemizigotas e 2 homozigotas a cada taxa de gli- fosato aplicado permitindo um total de 4 réplicas por tratamento quando plantas suficientes existiam. Essas plantas foram comparadas com tabaco Petite havana do tipo selvagem. Todas as plantas foram pulve-rizadas com um pulverizador de faixa a i87 L/ha. As plantas foram pulverizadas de uma faixa de 560-4480 g ae/ha de sal de dimetiamina (DMA) DURANGO®. Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de sulfato de amônio 2% p/v (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e i4 dias depois do tratamento. As plantas receberam uma classificação de lesão com relação à atrofia visual geral, clorose e necrose. A geração Ti é segregante, então alguma reposta variável é esperada devido à diferença em zigosidade. Tabela 25. Resultados de pulverização demonstram que em 14 DAT (dias após tratamento) tolerância robusta de até 4480 g ae/ha de glifosato de pelo menos um evento de dgt-28 por construto caracterizou. Eventos de cópia única representativos dos construtos proveram, todos, tolerância de até 4480 g ae/ha comparado com o controle negativo Maverick
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[000350] Proteção de dgt-28 contra taxas de glifosato elevadas em geração T2. Um teste de progênie de 45 plantas foi conduzido em duas a cinco linhagens T2 de dgt-28 por construto. Linhagens homozigotas foram escolhidas com base em análises de zigosidade completadas na geração anterior. As sementes foram plantadas conforme anteriormente descrito. As plantas foram então pulverizadas com 411 g ae/ha de IGNITE 280 SL para a seleção dos marcadores selecionáveis pat con-forme anteriormente descrito. Depois de 3 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas. Para construtos contendo TraP4 ligado com dgt-28 (pDAB107543 e pDAB107548), nove de doze linhagens testadas não segregaram, desta maneira confirmando linhagens homogêneas na geração T2. Linhagens contendo TraP8 ligado com dgt-28 (pDAB107545) demonstraram duas das quatro linhagens sem quaisquer segregantes e demonstrando herança Mendeliana em pelo menos duas gerações de dgt-28 em soja. Amostras de tecido foram obtidas de plantas resistentes e a proteína DGT-28 foi quantificada através de métodos ELISA padrão. Dados demonstraram uma faixa de proteína DGT-28 média de 32,8-107,5 ng/cm2 para linhagens T2 não segregantes testadas. Linhagens do construto pDAB107553 (TraP23::dgt-28) não foram previamente selecionadas com glufosinato, e a resposta de dose de glifosato foi utilizada como ambos para testar homogenosidade e tolerância em taxas elevadas de glifosato. Réplicas das linhagens do construto pDAB107553 eram tolerantes a taxas variando de 560-4480 g ae/ha de glifosato, e foram então confirmadas ser uma população homogênea e herdável para pelo menos duas gerações.
[000351] Taxas de DURANGO MDA variando de 560-4480 g ae/ha de glifosato foram aplicadas a 2-3 sojas trifólias conforme anteriormente descrito. Dados de lesão visual 14 DAT confirmaram os resultados de tolerância que foram demonstrados na geração T1. Tabela 26. Os dados demonstram tolerância robusta do tabaco dgt-28 até 3360 g ae/ha de glifosato em duas gerações, comparado com o controle não transformado
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[000352] Transformação de Arroz com dgt-28. Arroz transgênico (Oryza sativa) contendo um transgene dgt-28 estavelmente integrado é gerado através de transformação mediada por Agrobacterium de sementes de arroz esterilizadas. Uma linhagem de Agrobacterium desarmada carregando um vetor binário contendo um dgt-28 funcional é usada para iniciar transformação.
[000353] Meios de cultura são ajustados para pH 5,8 com KOH 1 M e solidificados com 2,5 g/l de Phytagel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Calos embriogênicos são cultivados em placas de Petri de 100 x 20 mm contendo 30 ml de meio semissólido. Mudas de arroz são cultivadas em 50 ml de meio em caixas MAGENTA. Suspensões celulares são mantidas em frascos cônicos de 125 ml contendo 35 mL de meio líquido e giradas a 125 rpm. Indução e manutenção de culturas em- briogênicas ocorrem no escuro a 25-26° C e regeneração de planta e cultura de planta integral ocorrem em sala iluminada com um fotoperí- odo de 16 h (Zhang e outros, 1996).
[000354] Indução e manutenção de calo embriogênico são realizadas em um meio basal NB modificado conforme anteriormente descrito (Li e outros, 1993), onde o meio é adaptado para conter 500 mg/L de glu- tamina. Culturas em suspensão são iniciadas e mantidas em meio lí-quido SZ (Zhang e outros, 1998) com a inclusão de 30 g/L de sacarose no lugar de maltose. Meio osmótico (NBO) consistindo em meio NB com a adição de 0,256 M de cada um de manitol e sorbitol. Calo resistente a herbicida é selecionado em meio NB suplementado com o agente seletivo herbicida adequado por 3-4 semanas. Pré-regeração é realizada em meio (PRH50) consistindo em meio NB com ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D), 1 mg/ml de ácido a-naftalenoacético (NAA), 5 mg/l de ácido abscísico (ABA) e herbicida seletivo por 1 se-mana. Regeneração de mudas seguindo cultura em meio de regene-ração (RNH50) compreendendo meio NB contendo 2,4-D, 0,5 mg/l de NAA e herbicida seletivo até que brotos putativamente transgênicos sejam regenerados. Os brotos são transferidos para meio de enraiza-mento com sais basais Murashige e Skoog de metade de resistência e vitaminas B5 de Gamborg, suplementado com sacarose 1% e herbicida seletivo.
[000355] Sementes dissecadas maduras de Oryza sativa L. japonica cv Taipei 309 são esterilizadas conforme descrito em Zhang e outros, 1996. Tecidos embriogênicos são induzidos através da cultura de se-mentes de arroz maduras estéreis em meio NB no escuro. O calo pri-mário de aproximadamente 1 mm de diâmetro é removido do escutelo e usado para iniciar suspensão celular em meio líquido SZ. As sus-pensões foram então mantidas conforme descrito em Zhang, 1996. Tecidos embriogênicos derivados de suspensão são removidos de cul-tura líquida 3-5 dias após a subcultura anterior e postas em meio os- mótico NBO para formar um círculo de cerca de 2,5 cm de lado a lado em uma placa de Petri e cultivados por 4 h antes do bombardeamento. Dezesseis a vinte horas depois do bombardeamento, os tecidos são transferidos de meio NBO para meio de seleção NBH50, assegurando que a superfície de bombardeamento esteja faceando para cima e in-cubados no escuro por 14-17 dias. Calo recém-formado é então sepa-rado dos explantes bombardeados originais e posto próximo do mesmo meio. Seguindo mais 8-12 dias, calo opaco, relativamente compacto, é visualmente identificado e transferido para meio de pré- regeneração PRH50 por 7 dias no escuro. Calo em crescimento, que se torna mais compacto e opaco, é então subcultivado em meio de regeneração RNH50 por um período de 14-21 dias sob um fotoperíodo de 16 h. Brotos de regeneração são transferidos para caixas MAGENTA contendo meio MSG50 1A Plantas múltiplas regeneradas a partir de um explante único são consideradas irmãs e são tratadas como uma linhagem de planta independente. Uma planta é classificada como positiva para o gene dgt-28 se ela produzir raízes brancas, espessas, e cresce vigorosamente em meio MSH50 1A Uma vez as mudas tendo atingido o topo das caixas MAGENTA, elas são transferidas para solo em um pote de 6 cm sob umidade 100% por uma semana, e então são levadas para uma câmara de crescimento com um período de luz de 14 h a 30°C e no escuro a 21°C por 2-3 semanas antes do transplante para potes de 13 cm na estufa. As sementes são coletadas e secas a 37°C por uma semana antes do armazenamento a 4°C.
[000356] Análise To de arroz dgt-28. Transformantes de arroz trans-plantados obtidos através de um método de transformação de Agrobacterium foram transplantados em meio e aclimatados a condi-ções de estufa. Todas as plantas foram amostradas para detecção por PCR de dgt-28 e os resultados demonstram vinte e dois eventos posi-tivos de PCR para pDAB110827 (TraP8::dgt-28) e um mínimo de de-zesseis eventos positivos de PCR para pDAB110828 (TraP23::dgt-28). Análise Southern para dgt-28 dos eventos positivos para PCR de-monstra eventos simples (1-2 cópias) para ambos os construtos. Ex-pressão de proteína de eventos T0 selecionados demonstrou faixas de expressão de proteína DGT-28 a partir de abaixo dos níveis de detec-ção até 130 ng/cm2. Eventos T0 selecionados do construto pDAB110828 foram tratados com 2240 g ae/ha de DURANGO DMA® conforme anteriormente descrito e avaliado 7 e 14 dias depois do tratamento. Os dados demonstraram tolerância robusta para a taxa de glifosato aplicada. Todas as plantas positivas para PCR foram deixadas produzir semente T1 para caracterização adicional.
[000357] Capacidade de herança de Dgt-28 em arroz. Um teste de progênie de 100 plantas foi conduzido em quatro linhagens T1 de dgt- 28 de construto pDAB110827 contendo o peptídeo de trânsito de clo- roplasto TraP8. As sementes foram plantadas em potes cheios com meio. Todas as plantas foram então pulverizadas com 560 g ae/ha de DURANGO DMA® para a seleção do gene dgt-28 conforme anterior-mente descrito. Depois de 7 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas. Duas das quatro linhagens testadas para cada constru- to segregaram como uma característica Mendeliana dominante, de locus único (3R:1S) conforme determinado através de análise de Quadrado Chi. Dgt-28 é um gene de resistência a glifosato herdável em espécies múltiplas.
[000358] Tolerância a herbicida pós-emergência em arroz Ti trans-formado com dgt-28. Plantas resistentes Ti de cada evento usadas no teste de progênie receberam identificadores únicos e foram amostradas para análises de zigosidade do gene dgt-28. Dados de zigosidade foram usados para designar 2 réplicas hemizigotas e 2 homozigotas para cada taxa de glifosato aplicada permitindo um total de 4 réplicas por tratamento. Essas plantas foram comparadas contra arroz kitaake do tipo selvagem. Todas as plantas foram pulverizadas com um pulve-rizador de faixa ajustado a i87 L/ha. As plantas foram pulverizadas a partir de uma faixa de 560-2240 g ae/ha de DURANGO DMA®. Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de 2% p/v de sulfato de amônio (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e i4 dias depois do tratamento. As plantas receberam uma classificação de lesão com relação a atrofiamento visual, clorose e necrose gerais. A geração Ti é segregante, então alguma resposta variável é esperada devido à diferença em zigosidade.
[000359] Os resultados de pulverização demonstram em 7 DAT (dias depois do tratamento) lesão vegetativa mínima para taxas elevadas de glifosato que foram detectadas (dados não mostrados). Tabela 27. Dados de lesão visual em 14 DAT demonstram menos do que 15% de lesão visual média até 2240 g ae/ha de glifosato
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[000360] Detecção de proteína DGT-28 foi avaliada para réplicas de todas as quatro linhagens T1 testadas de pDAB110827. Os dados de-monstraram faixas de proteína médias DGT-28 de a partir de 20-82 ng/cm2 e 21-209 ng/cm2 para réplicas hemizigotas e homozigotas, res-pectivamente. Esses resultados demonstraram expressão de proteína estável para a geração T1 e tolerância de arroz dgt-28 até 2240 g ae/ha de glifosato seguindo uma aplicação de 560 g ae/ha de glifosato usado para seleção.
[000361] Transformação de tabaco com dgt-28. Pedaços de folha de tabaco (cv. Petit havana) foram transformados usando Agrobacterium tumefaciens contendo o transgene dgt-28. Colônias simples contendo o plasmídeo que contém o transgene dgt-28 foram inoculadas em 4 mL de meio YEP contendo espectinomicina (50 μg/mL) e estreptomici- na (125 μg/mL) e incubadas da noite para o dia a 28°C em um agitador a 190 rpm. A cultura de semente 4 mL foi subsequentemente usada para inocular uma cultura de 25 mL do mesmo meio em um frasco balão Erlenmeyer de 125 mL. Esta cultura foi incubada a 28°C agitando a 190 rpm até atingir um OD600 de 1,2. Dez ml de suspensão de Agrobacterium foram então postos em placas de Petri de 60 x 20 mm estéreis.
[000362] Pedaços de folha recém-cortados (0,5 cm2) de plantas as- septicamente cultivadas em meio MS (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, K.S.) com 30 g/L de sacarose em PhytaTrays® (Sigma, St. Louis, MO) foram embebidos em 10 mL de cultura da noite para o dia de Agrobacterium por alguns minutos, secas com blot em papel filtro estéril e então postos no mesmo meio com a adição de 1 mg/L de ácido indolacético e 1 mg/L de 6-benzilamino purina. Três dias depois, pedaços de folha co-cultivados com Agrobacterium carregando o transgene dgt-28 foram transferidos para o mesmo meio com 5 mg/L de Basta® e 250 mg/L de cefotaxima.
[000363] Depois de 3 semanas, mudas T0 individuais foram transferidas para meio MS com 10 mg/L de Basta® e 250 mg/L de cefotaxima por mais 3 semanas antes do transplante para solo e transferência para a estufa. Plantas T0 selecionadas (conforme identificado usando protocolos de análise molecular descritos acima) foram deixadas auto- polinar e semente foi coletada de cápsulas quando elas estavam com-pletamente secas. Mudas T1 foram avaliadas quanto à zigosidade e expressão de gene repórter (conforme descrito abaixo) e plantas sele-cionadas contendo o transgene dgt-28 foram identificadas.
[000364] As plantas foram levadas para a estufa através de lavagem com ágar das raízes, transplante para o solo em potes quadrados de 13,75 cm, colocação do pote em uma bolsa Ziploc® (SC Johnson % Son, Inc.), colocação de água da torneira no fundo da bolsa e colocação de luz indireta em uma estufa a 30°C por uma semana. Depois de 3-7 dias, a bolsa foi aberta; as plantas foram fertilizadas e deixadas crescer na bolsa aberta até que as plantas fossem aclimatadas na estufa, momento quando a bolsa foi removida. As plantas foram cultivadas sob condições de estufa aquecida comuns (27°C dia, 24°C noite, 16 horas dia, luz natural mínima + suplementar = 1200 μE/m2s1).
[000365] Antes da propagação, plantas T0 foram amostradas para análise de DNA para determinar o número de cópia de dgt-28 inserido através de PCR de tempo real. Tecido fresco foi posto em tubos e liofi- lizado a 4°C por 2 dias. Depois do tecido ter secado totalmente, uma conta de tungstênio (Valenite) foi posta no tubo e as amostras foram submetidas a 1 minuto de trituração a seco usando um moedor de conta Kelco. O procedimento de isolamento de DNA DNeasy® padrão foi então seguido (Qiagen, Dneasy 69109). Uma alíquota do DNA extraído foi então tingida com Pico Green (Molecular Probes P7589) e lida no fluorômetro (BioTek®) com padrões conhecidos para obter a concentração em ng/μl. Um total de 100 ng de DNA total foi usado como molde. A reação de PCR foi realizada no termociclizador 9700 Ge-neamp® (Applied Biosystems), através de submissão das amostras a 94°C por 3 minutos e 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 64°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto e 45 segundos seguido por 72°C por 10 minutos. Produtos de PCR foram analisados através de eletroforese em um gel de agarose 1% tingido com EtBr e confirmados através de Southern blots.
[000366] Cinco a nove eventos positivos para PCR com 1-3 cópias de gene dgt-28 de 3 construtos contendo uma sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto diferente (TraP4, TraP8 e TraP23) foram gerados e levados para a estufa.
[000367] Todas as plantas positivas para PCR foram amostradas para quantificação da proteína DGT-28 através de ELISA padrão. Proteína DGT-28 foi detectada em todas as plantas positivas para PCR e uma inclinação para um aumento em concentração de proteína foi notada com número de cópia alto de dgt-28.
[000368] Capacidade de herança de aad-12 (V1) em tabaco. Um teste de progênie de 100 plantas foi conduzido em cinco linhagens T1 de dgt- 28 por construto. Os construtos continham uma das seguintes sequên-cias de peptídeo de trânsito de cloroplasto: TraP4, Trap8 ou TraP23. As sementes foram estratificadas, semeadas e transplantadas com relação muito similar àquela do procedimento de Arabidopsis exemplificado acima, com a exceção que plantas nulas não foram removidas por uma seleção inicial antes do transplante. Todas as plantas foram então pul-verizadas com 280 g ae/ha de IGNITE 280 SL para a seleção do mar-cador selecionável pat conforme anteriormente descrito. Depois de 3 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas.
[000369] Quatro das cinco linhagens testadas para cada construto segregaram como uma característica Mendeliana dominante, de locus único (3R:1S), conforme determinado através de análise do quadrado Chi. Dgt-28 é um gene de resistência a glifosato herdável em espécies múltiplas.
[000370] Tolerância a herbicida pós-emergência em tabaco Ti trans-formado com dgt-28. Plantas resistentes Ti de cada evento usadas no teste de progênie receberam identificadores únicos e amostradas para análises de zigosidade do gene dgt-28. Dados de zigosidade foram usados para designar duas réplicas hemizigotas e 2 homozigotas a cada taxa de glifosato aplicada permitindo um total de 4 réplicas por tratamento. Essas plantas foram comparadas contra tabaco Petite ha-vana do tipo selvagem. Todas as plantas foram pulverizadas com um pulverizador de faixa ajustado a i87 L/ha. As plantas foram pulverizadas a partir de uma faixa de 560-4480 g ae/ha de DURANGO DMA®. Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de sulfato de amônio 2 p/v (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e i4 dias depois do tratamento. As plantas receberam uma classificação de lesão com relação a atrofiamento, clorose e necrose visuais gerais. A geração Ti é segregante, então alguma resposta variável é esperada devido à diferença em zigosidade.
[000371] Resultados de pulverização demonstraram em 7 DAT (dias depois do tratamento) lesão vegetativa mínima para taxas elevadas de glifosato que foram detectadas (dados não mostrados). Seguindo 14 DAT, dados de lesão visual demonstram lesão aumentada com eventos de cópia única do construto contendo TraP4 comparado com eventos de cópia única dos construtos TraP8 e TraP23. Tabela 28. Tabela 28. Em uma taxa de 2240 g ae/ha, uma lesão média de 37,5% foi demonstrada com o evento contendo TraP4, onde eventos contendo TraP8 e TraP23 demonstraram uma lesão média de 9,3% e 9,5%, respectivamente.
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[000372] Esses resultados demonstraram tolerância de dgt-28 a 4480 g ae/ha de glifosato, bem como diferenças em tolerância provida por sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto ligadas ao gene dgt-28.
[000373] Proteção de Dgt-28 contra taxas de glifosato elevadas na geração T2. Um teste de progênie de 25 plantas foi conduzido em duas a três linhagens T2 de dgt-28 por construto. Linhagens homozigotas foram escolhidas com base em análises de zigosidade completadas na geração anterior. As sementas foram estratificadas, semeadas e transplantadas conforme anteriormente descrito. Todas as plantas foram então pulverizadas com 280 g ae/ha de Ignite 280 SL para a seleção de marcador selecionável pat conforme anteriormente descrito. Depois de 3 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas. Todas as linhagens testadas para cada construto não segregaram, então confirmando linhagens homogêneas na geração T2 e demonstrando herança Mendeliana em pelo menos duas gerações de dgt-28 em ta-baco.
[000374] Taxas de DURANGO DMA® variando de 420-3360 g ae/ha de glifosato foram aplicadas a tabaco de 2-3 folhas conforme anterior- mente descrito. Dados de lesão visual 14 DAT confirmaram os resulta-dos de tolerância que foram mostradas na geração T1. Resultados fo-liares de linhagens de duas cópias do construto contendo TraP4 de-monstraram tolerância similar àquela de linhagens de TraP8 e TraP23 de cópia única (dados não mostrados). Tabela 29. Linhagens de cópia única do construto contendo TraP4 com dgt-28 demonstraram lesão aumentada comparado com linhagens de construtos contendo TraP8 e TraP23 com dgt-28
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[000375] Os dados demonstraram tolerância robusta de tabaco com dgt-28 até 3360 g ae/ha de glifosato em duas gerações comparado com o controle não transformado.
[000376] Plantas selecionadas de cada evento foram amostradas antes das aplicações de glifosato para análises da proteína DGT-28 através de ELISA DGT-28 padrão. Dados demonstraram expressão de proteína média DGT-28 das linhagens simples (1-2 cópia) nos constru- tos variando de 72,8-114,5 ng/cm2. Dados demonstram que dgt-28 é proteína de expressão na geração T2 de tabaco transformado e dados de tolerância confirmam proteína DGT-28 funcional.
[000377] Empilhamento de dgt-28 para aumentar espectro de herbicida em tabaco (cv. Petit havana). Plantas dgt-28 (pDAB107543 e pDAB107545) e aad-12 v1 (pDAB3278) homozigotas (vide PCT/US2006/042133 para a última, que é incorporada aqui a título de referência em sua totalidade) foram ambas reciprocamente cruzadas e semente F1 foi coletada. A semente F1 de dois cruzamentos recíprocos de cada gene foi estratificada e tratada 6 reps de cada cruzamento com 1120 g ae/ha de glifosato (seletivo para o gene dgt-28), 1120 g ae/ha 2,4-D (seletivo para gene aad-12) ou uma mistura de tanque dos dois herbicidas nas taxas descritas. As plantas foram graduadas em 14 DAT. Os resultados de pulverização são mostrados na Tabela 30. Tabela 30. Resposta de aad-12 e dgt-28 FI
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[000378] Os resultados confirmam que dgt-28 pode ser empilhado com sucesso com aad-12 (v1), então aumentando os herbicidas de espectro que podem ser aplicados à cultura de interesse (glifosato + ácido fenoxiacético para dgt-28 e add-12, respectivamente). Em produção de cultura onde é difícil controlar ervas-daninhas de folha larga ou biotipos de erva-daninha resistentes existem, a pilha pode ser usada como um meio de controle de erva-daninha e proteção da cultura de interesse. Características de entrada ou saída adicionais poderiam ser também empilhadas com o gene dgt-28.
[000379] Resistência a Glifosato em Trigo. Produção de vetores binários codificando DGT-28. Vetores binários contendo expressão de DGT-28 e cassetes de seleção de PAT foram projetados e montados usando habilidades e técnicas geralmente conhecidas no campo. Cada cassete de expressão de DGT-28 continha o promotor, região não traduzida 5' e íntron do gene da Ubiquitina (Ubi) de Zea mays (Toki e outros, Plant Physiol. 1992, 100 1503-07), seguido por uma sequência de codificação consistindo em um de quatro peptídeos de trânsito (TraP4, TraP8, TraP23 ou TraP5) fundido à extremidade 5' de uma versão sintética do gene da 5-enolpiruvatochiquimato-3-fosfato sintase (DGT-28), que tinha sido otimizado no códon para expressão em plan-tas. O cassete de expressão de DGT-28 terminou com uma região não traduzida 3' (UTR) compreendendo o terminador de transcripcional e sítio de poliadenilação de um gene de lipase (Vp1) de Z. mays (Paek e outros, Mol. Cells 1998 30;8(3) 336-42). O cassete de seleção de PAT compreendido do promotor, região não traduzida 5' e íntron do gene da Actina (Act1) de Oryza sativa (McElroy e outros, The Plant Cell 1990 2(2) 163-171), seguido por uma versão sintética do gene da fos- finotricino acetil transferase (PAT) isolado de Streptomyces viri- dochromogenes, que tinha sido otimizado no códon para expressão em plantas. O gene de PAT codifica uma proteína que confere resistência a inibidores de glutamina sintetase compreendendo fosfinotrici- na, glufosinato e bialafos (Wohlleben e outros, Gene 1998, 70(1), 2537). O cassete de seleção foi terminado com a UTR 3' compreendendo o terminador transcripcional e sítios de poliadenilação do gene 35s de vírus do mosaico da couve flor (CaMV) (Chenault e outros, Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-1396).
[000380] O cassete de seleção foi sintetizado por um vendedor de síntese de gene comercial (GeneArt, Life Technologies) e clonado em um vetor binário da Gateway. Os cassetes de expressão de DGT-28 foram subclonados em pDONR221. O clone ENTRY resultante foi usado em uma reação LR Clonase II (Invitron, Life Technologies) com o vetor binário da Gateway codificando o cassete de expressão de fos- finotricino acetil transferase (PAT). Colônias de todos os plasmídeos montados foram inicialmente avaliadas através de digestão por restrição de DNA purificado usando endonucleases de restrição obtidas da New England BioLabas (NEB; Ipswich, MA) e Promega (Promega Corporation, WI). Preparações de DNA de plasmídeo foram realizadas usando o QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) ou o Pure Yield Plasmid Maxiprep System (Promega Corporation, WI), seguindo as instruções dos fornecedores. DNA de plasmídeo de clones seleciona-dos foi sequenciado usando o protocolo de sequenciamento de ciclo ABI Sanger Sequencing e Bid Dye Terminator v3.1 (Applied Biosys-tems, Life Technologies). Dados de sequência foram montados e ana-lisados usando o software SEQUENCHER® (Gene Codes Corporation, Ann. Arbor, MI).
[000381] Os quatro clones de expressão binários resultantes: pDAS000122 (TraP4-DGT28), pDAS000123 (TraP8-DGT28), pDAS000124 (TraP23-DGT28) e pDAS000125 (TraP5-DGT28) foram cada um transformados em linhagem de Agrobacterium tumefaciens EHA105.
[000382] Produção de eventos de trigo transgênicos com construto de expressão de dgt-28. Plantas de trigo transgênicas expressando um dos quatro construtos de expressão de DGT-28 foram geradas através de transformação de Agrobacterium usando a linhagem de trigo doadora Bobwhite MPB26RH, seguindo um protocolo similar a Wu e outros, Transgenic Research 2008, 17:425-436. Eventos transgêni- cos T0 putativos foram selecionados quanto à tolerância à fosfinotricina (PTT), o fenótipo conferido pelo marcador selecionável PAT e transferidos para o solo. As plantas T0 foram cultivadas sob condições de estufa e semente T1 foi produzida. No geral, cerca de 45 eventos de T0 independentes foram gerados para cada construto de expressão de DGT-28.
[000383] Resistência a glifosato em eventos de trigo dgt-28 de trigo T0. Eventos T0 foram deixados aclimatar na estufa e foram cultivados até 2-4 folhas de aparência normal, novas, terem emergido da flor (isto é, plantas que transicionaram de cultura de tecido para condições de cultivo em estufa). As plantas foram cultivadas a 25°C sob 12 horas de luz suplementar na estufa até a maturidade. Uma avaliação inicial de tolerância a glifosato e análise Taqman foi completada em plantas T1 cultivadas sob as mesmas condições que anteriormente descrito. Os dados permitiram que a determinação de eventos T1 herdáveis fosse caracterizada adicionalmente. Seis eventos T1 de pouca cópia (1-2 có-pias) e dois de cópia múltipla foram replantados sob condições de es-tufa e cultivados até o estágio de 3 folhas. Plantas T1 foram pulveriza-das com uma formulação comercial de glifosato (Durango DMA®) do estágio de 420-3360 g ae/ha, que são capazes de lesionar significan- temente linhagens de trigo não transformadas. A adição de sulfato de amônio 2% p/v foi incluída na aplicação. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >75% de lesão ao controle não transformado Bob White MPB26RH. Herbicida foi aplicado.
[000384] Neste exemplo, as aplicações de glifosato foram utilizadas para ambos a determinação de segregação do gene dgt-28 na geração T1 bem como demonstração de tolerância a níveis altos de glifosa- to. A resposta das plantas é apresentada em termos de uma escala de lesão visual 21 dias após tratamento (DAT). Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos exibindo menos do que 25% de lesão visual (4), 25%-50% de lesão visual (3), 50%-75% de lesão visual (2) e mais do que 75% de lesão (1). Uma média aritmética e Desvio-padrão são apresentados para cada construto usado para transformação de trigo. A faixa de classificação de resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Trigo não transformado, do tipo selvagem (c.v. Bob White MPB26RH), serviu como um controle sensível a glifosato. Na geração T1 plantas hemizigotas e homozigotas estavam disponíveis para teste para cada evento e então foram incluídas para cada taxa de glifosato testado. Plantas hemizigotas vão conter metade da dose do gene como plantas homozigotas, desta maneira variabilidade de resposta a glifosato pode ser esperada na geração T1.
[000385] Os resultados das plantas de trigo dgt-28 T1 demonstrou que tolerância a glifosato foi obtida em taxas de até 3360 g ae/ha com os peptídeos de trânsito de cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 e TraP23. Tabela 31. Os dados são de um evento T1 de pouca cópia, mas são representativos da população para cada construto. Tabela 31. Resposta de eventos de trigo dgt-27 Ti de pouca cópia a glifosato 21 dias após tratamento
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[000386] Em 21 DAT, plantas resistentes e sensíveis são contadas para determinar a porcentagem de linhagens que segregaram como uma característica Mendeliana dominante, de locus único (3R:1S), conforme determinado através de análise de quadrado Chi. Tabela 32. Esses dados demonstram que dgt-28 é herdável como gene de resistência a glifosato robusto em uma espécie monocotiledônea. Tabela 32. Porcentagem de eventos dgt-28 Ti por construto que de-monstraram capacidade de herança de uma maneira Mendeliana com base em uma seleção de glifosato em taxas variando de 420-3360 g ae/ha
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Exemplo 4: Sequências de Peptídeo de Trânsito de Cloroplasto (TraP) Quimérico para Expressão de Transgenes Agronomicamente Impor- tantes em Milho Cry2Aa:
[000387] A proteína Cry2Aa de Bacillus thuringiensis demonstrou ativi-dade contra Helicoverpa zea (CEW) e Ostrinia nubilalis (ECB). Uma versão única do gene cry2Aa (SEQ ID NO:10), códon induzido para milho, foi testada em milho. Neste experimento, Cry2Aa foi avaliada sozinha e em conjunto com o peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 para determinar a atividade de tolerância a inseto e avaliar o efeito que a sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 v2 teria sobre a expressão da proteína Cry2Aa em milho.
[000388] O construto pDAB109807 que contém a sequência de peptí- deo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 v2 (SEQ ID NO:8) e um ligante de códon GCA foram clonados a montante do gene cry2Aa e in-corporados ao construto pDAB109807 (Figura 12) para teste de tolerân-cia a inseto em plantas de milho. Os construtos resultantes continham duas unidades de transcrição de planta (PTU). A primeira PTU continha o promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (promotor ZmUbi1; Christensen, A., Sharrock, R. e Quail, P. (1992) "Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcripts splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation", Plant Molecular Biology, 18:675-689), gene de fusão TraP8-cry2Aa (TraP8 Cry2Aa) e região não traduzida 3' de Lipase de Zea mays (ZmLip 3' UTR; Patente U.S. N°. 7.179.902). Os construtos foram confirmados através de digestão de enzima de restrição e sequenciamento. A segunda PTU compreendia o promotor do Vírus Baciliforme da Cana-de-açúcar (promotor SCBV; Patente U.S. N°. 6.489.462), gene de tolerância a herbicida aad-1 contendo um líder MSV e íntron 6 de álcool desidrogenase 1 (AAD-1; Patente U.S. N°. 7.838.733; e Sequência Líder MSV; No. Ac. Genbank FJ882146.1 e o íntron da álcool desidrogenase; No. Ac. Genbank EF539368.1) e região não traduzida 3' de Lipase de Zea mays (ZmLip 3'UTR). Um plasmídeo controle, pDAB107687, que não continha uma sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto a montante do gene cry2Aa, foi construído e incluído nos estudos (Figura 13). Os plasmídeos foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens para transformação de planta.
[000389] Espigas de Zea mays cultivar B104 foram coletadas 10-12 dias pós-polinização. As espigas colhidas foram descascadas e esterilizadas na superfície através de imersão em uma solução 20% de alvejante comercial (Ultra Clorox® Germicidal Bleach, 6,15% de hipoclo- rito de sódio) e duas gotas de Tween 20, por 20 minutos, seguido por três enxágues em água estéril, deionizada, dentro de uma tampa de fluxo laminar. Embriões zigóticos imaturos (1,8-2,2 mm de comprimento) foram assepticamente excisados de cada espiga e distribuídos em um ou mais tubos de microcentrífuga contendo 2,0 ml de suspensão de Agrobacterium à qual 2 μl de tensoativo Break-Thru® 10% S23 tinham sido adicionados.
[000390] Quando do término da atividade de isolamento de embrião, o tubo de embriões foi fechado e posto em uma plataforma de agitação por 5 minutos. Os teores do tubo foram então despejados em uma placa de meio de cocultivo e a suspensão de Agrobacterium líquida foi removida com uma pipeta de transferência, descartável, estéril. A placa de cocultivo contendo embriões foi posta na parte de trás da tampa de fluxo laminar com a tampa entreaberta por 30 minutos; momento depois do qual os embriões foram orientados com o escutelo faceando para cima usando um microscópio. A placa de cocultivo com embriões foi então retornada para a parte de trás da tampa de fluxo laminar com a tampa entreaberta por mais 15 minutos. A placa foi então fechada, vedada com fita Micropore 3M e posta em uma incubadora a 25°C com 24 horas/luz do dia em aproximadamente 60 μl m-2 s-1 de intensidade de luz.
[000391] Seguindo o período de cocultivo, os embriões foram trans-feridos para Meio de descanso. Não mais do que 36 embriões foram levados para cada placa. As placas foram enroladas com fita micropore 3M e incubadas a 27°C com 24 horas/luz do dia em aproximadamente 50 μmol m-2 s-1 de intensidade de luz por 7-10 dias. Embriões com calo foram então transferidos para meio Selection I. Não mais do que 8 embriões com calo foram levados para cada placa de Selection I. As placas foram enroladas com fita micropore 3M e incubadas a 27°C com 24 horas/luz do dia em aproximadamente 50 μmol m-2 s-1 de intensidade de luz por 7 dias. Os embriões com calo foram então transferidos para meio Selection II. Não mais do que 12 embriões com calo foram levados para cada placa de Selection II. As placas foram enroladas com fita micropore 3M e incubadas a 27°C com 24 horas/luz do dia em aproximadamente 50 μmol m-2 s-1 de intensidade de luz por 14 dias.
[000392] Neste estágio calos resistentes foram levados para meio de Pre-Regeneration. Não mais do que 9 calos foram levados para cada placa de Pre-Regeneration. As placas foram enroladas com fita de mi- croporo 3M e incubadas a 27°C com 24 horas/luz do dia em aproxima-damente 50 μmol m-2 s-1 de intensidade de luz por 7 dias. Calos de re-generação foram então transferidos para meio Regeneration em Phytatrays® e incubados a 28°C com 16 horas de luz/8 horas de escuro por dia em aproximadamente 150 μmol m-2 s-1 de intensidade de luz por 7-14 dias ou até que os brotos se desenvolvessem. Não mais do que 5 calos foram postos em cada Phytatray®. Brotos pequenos com raízes primárias foram então isolados e transferidos para meio de Bro- to/Raiz. Mudas enraizadas de cerca de 6 cm ou mais altas foram transplantadas no solo e levadas para uma câmara de crescimento para endurecimento.
[000393] Plantas transgênicas receberam identificadores únicos e transferidas em uma base regular para a estufa. As plantas foram transplantadas de Phytatrays® para potes pequenos (T.O. Plastics, SVD (3,5 polegadas), 700022C) cheios com meio de crescimento (Premier Tech Horticulture, ProMix BX, 0581 P) e cobertas com humi- domes para ajudar a aclimatar as plantas. As plantas foram postas em uma câmara de crescimento Conviron® (28°C/24°C, fotoperíodo de 16 horas, RH 50-70%, 200 μmol de intensidade de luz) até atingirem estágio V3-V4. Isto auxiliou na aclimatação das plantas ao solo e temperaturas hostis. As plantas foram então levadas para a estufa (Tipo de Exposição de Luz: Foto ou Assimilação; Limite de Luz Alto: 1200 PAR; duração do dia 16 horas; 27°C Dia/24°C Noite) e transplantadas dos potes pequenos para potes de 13,97 cm (5,5 polegadas). Aproximadamente 1-2 semanas depois do transplante para potes maiores, as plantas foram amostradas para bioensaio. Uma planta por evento foi bioensaiada.
[000394] Eventos de seleção foram identificados quanto a avanço para a próxima geração com base em número de cópia dos genes, detecção de proteína através de Western blot e atividade contra os insetos do bioensaio. Eventos que continham o gene de resistência à Espectinomicina foram notados, mas não necessariamente omitidos de avanço. Eventos selecionados quanto a avanço foram transplantados em potes de 18,93 L (5 galões). Foram feitas observações periodi-camente para acompanhar quaisquer fenótipos anormais. Bolsas de broto foram postas sobre os brotos antes da emergência da seda para prevenir contaminação cruzada por pólen de bandeja. Quaisquer brotos produzindo sedas antes da cobertura foram notados e o broto foi removido. O segundo broto foi então coberto e usado para polinações. Plantas que produziram brotos anormais ou quaisquer brotos foram registradas em um banco de dados. As sedas foram cortadas no dia anterior às polinações para prover pelos uniformes para aceitar pólen e as plantas foram autopolinadas.
[000395] Plantas para seleção T1 foram pulverizadas em 7 dias pós- semeadura. Elas foram cultivadas em potes de 10,16 cm (4 polegadas) de solo de cultivo em pote Metro 360 com 15 potes por bandeja. O es-tágio de crescimento de muda era V1-V1.5. Potes com germinação po-bre ou que contêm plantas muito pequenas (flor ainda fechada) foram marcados de maneira que eles não foram incluídos na avaliação de se-leção. Bandejas inteiras de plantas foram então postas em bandejas carreadoras secundárias para aplicação de pulverizador por faixa. As bandejas foram postas duas de cada vez no pulverizador por faixa Mandel, calibrado para aplicar um volume de 187 L/ha à área alvo usando um bocal plano (flat fan nozzle) 8002E (Tee Jet). Uma solução de 35 g ae/ha Assure II (quizalofope) + COC 1% (concentrado de óleo de cultura) foi formulada para a aplicação. Um volume de 15 ml/pulverização foi usado para calcular a solução de pulverização total necessária: Cálculos: (35 g ae/ha) x (1 ha/187L) x (1 L/97,7 g ae Assure II) = solução 0,192% ou 28,74 μl/15 ml de H2O + 1% v/v). Depois da aplicação, as plantas foram então deixadas secar por uma hora em lab de pulverização antes de retornarem para a estufa. Aproximadamente 1-2 semanas depois do transplante para potes maiores, as plantas foram amostradas para bioensaio. Uma planta por evento foi bioensaiada.
[000396] Todos dos eventos T0 que passaram pela tela de análise molecular foram analisados quanto a níveis de expressão de proteína Cry2Aa. Os eventos do construto controle, pDAB107687, que compre-endiam Cry2Aa sem um TraP tinham nível de expressão médio maior de Cry2Aa (15,0 ng/cm2) comparado com eventos de pDAB109807 (5,0 ng/cm2) que continham TraP8. Apesar dos níveis de expressão reduzidos dos eventos de pDAB109807, esses eventos ainda expres-saram a proteína Cry2Aa.
[000397] Os eventos T1 foram também analisados quanto a níveis de expressão de proteína Cry2Aa. Os eventos do construto controle, pDAB107687, que compreendiam Cry2Aa sem um TraP, tinham nível de expressão médio significantemente maior de Cry2Aa (55 e 60 ng/cm2) comparado com eventos de pDAB109807 (cerca de 20 a 40 ng/cm2) que continham TraP8. Apesar dos níveis de expressão reduzi-dos dos eventos pDAB109807, esses eventos ainda expressavam a proteína Cry2Aa.
[000398] Plantas transgênicas contendo os genes de Bt únicos foram testadas quanto à atividade inseticida em bioensaios conduzidos com larvas lepidópteras neonatais em folhas das plantas transgênicas. As espécies lepidópteras ensaiadas foram Broca do Milho Europeu, Ostri- nia nubilalis (Hübner) (ECB) e a Traça do milho, Helicoverpa zea (CEW).
[000399] Bandejas de 32 cavidades (C-D International, Pitman, NJ) foram parcialmente cheias com uma solução de ágar a 2% e ágar foi deixado solidificar. Seções de folha de aproximadamente 2,54 cm (1 polegada) foram obtidas de cada planta e postas sozinhas em cavida-des das bandejas de 32 cavidades. Um pedaço de folha foi posto em cada cavidade, e dois pedaços de folha foram testados por planta e por inseto. Os insetos foram infestados na massa usando um pincel, pondo 10 larvas neonatais em cada cavidade. As bandejas foram vedadas com tampas com adesivo perfuradas que permitiam ventilação durante o teste. As bandejas foram postas a 28°C, 40% RH, 16 horas luz:8 horas escuro por três dias. Depois do teste, um score de dano percentual simples foi obtido para cada pedaço de folha. Scores de dano para cada teste tiveram média tirada e usados ao lado de análise de expressão de proteína para conduzir análises de correlação.
[000400] Os resultados do bioensaio de T0 e T1 indicaram que a se-quência de peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 era funcional e que os eventos de pDAB109807 proveram proteção contra os insetos testados. Nos eventos T1, as plantas expressando a proteína Cry2Aa sem um TraP (pDAB107687) tiveram um dano de folha médio que não foi significantemente diferente daquele da planta expressando a proteína Cry2Aa com TraP8 (pDAB109807) em todas as espécies de inseto testadas. Esses resultados foram surpreendentes, dado que as plantas expressando a proteína Cry2Aa sem um TraP (pDAB107687) expressaram níveis mais altos de proteína comparado com as plantas expressando a proteína Cry2Aa com TraP8 (pDAB109807).
Vip3ab1:
[000401] A proteína Vip3ab1 de Bacillus thuringiensis demonstrou atividade contra Helicoverpa zea (CEW) e Lagarta do Cartucho do Ou-tono (FAWE) e lagarta do cartucho resistente (rFAW). Os genes vip3ab1 v6 (SEQ ID NO:11) e vip3ab1 v7 (SEQ ID NO:12) foram expressos e testados quanto à tolerância a inseto em milho. Neste experimento, vip3ab1 v6 e vip3ab1 v7 foram avaliados sozinhos e em conjunto com o peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 em milho para determinar a atividade de tolerância a inseto e avaliar o efeito que a sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 v2 teria sobre a expressão das proteínas Vip3ab1 v6 e Vip3ab1 v7 em milho.
[000402] O construto pDAB111481 (Figura 14) que contém a sequência (SEQ ID NO:8) de polinucleotídeo de codificação de peptí- deo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP8 v2 e ligante de códon GCA foram clonados a montante do gene vip3ab1 v6 e testados quanto à tolerância a inseto em plantas de milho. O construto resultante continha duas unidades de transcrição de planta (PTU). A primeira PTU compreendia o promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (promotor ZmUbi1; Christensen, A., Sharrock, R. e Quail, P. (1992) "Maize polyubiquitin genes: estructure, termal perturbation of ex pression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation", Plant Molecular Biology, 18:675-689), gene de fusão TraP8-vip3ab1 v6 (TraP8-Vip3ab1 v6) e região não traduzida 3' de Peroxidase de Zea mays (ZmPer 5 3'UTR). O construto foi confirmado através de digestão e sequenci- amento de enzima de restrição. A segunda PTU compreendia o promotor do Vírus Baciliforme da Cana-de-açúcar (promotor SCBV; Patente U.S. N°. 6.489.462), gene de tolerância a herbicida aad-1 contendo um líder MSV e íntron 6 de álcool diidrogenase (AAD-1; Patente U.S. N°. 7.838.733 e sequência líder MSV; No. Ac. Genbank FJ882146.1 e o íntron da álcool desidrogenase; No. Ac. Genbank EF539368.1) e região não traduzida 3' de Lipase de Zea mays (ZmLip 3'UTR). Um plasmídeo controle, pDAB111479, que não continha uma sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto a montante do gene vip3ab1 v6, foi construído e incluído nos estudos (Figura 15). Os plasmídeos foram introduzidos em Agrobacterium tu- mefaciens para transformação de planta.
[000403] O construto pDAB111338 (Figura 15) que contém a sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico Trap8 v2 (SEQ ID NO:8) e um ligante de códon GCA foram clonados a montante do gene vip3abI v7 e testados quando à tolerância a inseto testando em plantas de milho. O construto resultante continha duas unidades de transcrição de planta (PTU). A Primeira PTU era compreendida de promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (promotor ZmUbi1; Christensen, A., Sharrock, R. e Quail, P. (1992) "Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promotor activity following transfer to protoplasts by electroporation", Plant Molecular Biology, 18:675-689), gene de fusão TraP8 Vip3ab1v7 (Trap8-vip3ab1 v7) e região não traduzida 3' de Peroxidase de Zea mays (ZmPer 5 3'UTR). O construto foi confirmado através de digestão e sequenciamento de enzima de restrição. A segunda PTU era com-preendida de promotor do Vírus Baciliforme da Cana-de-açúcar (pro-motor SCBV; Patente U.S. N°. 6.489.462), gene de tolerância a herbi-cida aad-1 contendo um líder MSV e íntron 6 de álcool desidrogenase 1 (AAD-1; Patente U.S. N°. 7.838.733, Sequência líder de MSV; No. Ac. Genbank FJ882146.1 e o íntron de álcool desidrogenase; No. Ac. Genbank EF539368.1) e região não traduzida 3' de Lipase de Zea mays (ZmLip 3'UTR). Um plasmídeo controle, pDAB112710, que não continha uma sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto a montante do gene Vip3ab1v7 foi construído e incluído nos estudos (Figura 16). Os plasmídeos foram clonados em Agrobacterium tumefaciens para transformação de planta.
[000404] Transformação de milho, expressão de proteína e bioensai- os de inseto foram completados seguindo os protocolos anteriormente descritos, e os resultados são mostrados na Tabela 33. Os resultados de bioensaios de inseto indicaram que a sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico Trap8 era funcional e que eventos pDAB111338 e pDAB111481 proveram proteção contra os insetos tes-tados em bioensaio. Nos eventos testados, as plantas expressando a proteína Vip3ab1 sem um TraP, (pDAB112710 e pDAB111479), tiveram um dano de folha médio que não foi significantemente diferente daquele de planta expressando a proteína Vip3ab1 com TraP8 (pDAB111338 e pDAB111481). Concluindo, os Western blots e bioen- saios indicaram que todos dos eventos testados expressaram a proteína Vip3 Ab1. Tabela 33. Resultados dos bioquímicos e resultados de bioensaio para as sequências de codificação Vip3ab1 v6 e Vip3ab1 v7 que foram fun-didas a TraP8 comparado com as sequências de codificação Vip3ab1 v6 e Vip3ab1 v7 que não possuíam uma sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto Plasmídeo Descrição Resultados Ensaio Bio-químico Resultados BioEnsaio
Figure img0066
Exemplo 5: Clivagem In Planta de Sequências de Peptídeo de Trânsito de Cloroplasto Quimérico (TraP)
[000405] O sítio de clivagem dos peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos TraP8 e Trap9 foi determinado através de espectrometria MALDI e sequenciamento de degradação Edman N-terminal. Material de planta foi obtido de plantas transgênicas que continham os genes de fusão TraP8-dgt14, TraP8-dgt28, TraP9-dgt14 e TraP9-dgt28 e en-saiado para determinar a localização de clivagem do peptídeo de trân-sito de cloroplasto quimérico ocorrida durante translocamento dentro do cloroplasto.
Resultados de MALDI:
[000406] As proteínas semipurificadas de uma amostra de planta foram separadas através de SDS-PAGE. As faixas de proteína de um tamanho equivalente ao peso molecular de YFP foram excisadas do gel, tingimento retirado e secas. Em seguida, as faixas de proteína secas foram digeridas em gel com Tripsina (Promega; Madison, WI) em bicarbonato de amônio 25 mM da noite para o dia a 37°C. Os peptí- deos foram purificados através de um ZipTip® C18 (Millipore, Bedford, MA) e eluídos com acetonitrila 50%/TFA 0,1%. As amostras foram mis-turadas com matriz ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico em uma razão 1:1 e a mistura foi sported em uma placa de amostra MALDI e seca ao ar.
[000407] O espectro de massa do peptídeo foi gerado usando um Voyager DE-PRO MALDI-TOF Mass Spectrometer® (Applied Biosys-tems; Framingham, MA). Calibragem externa foi realizada usando uma Calibration Mixture 2® (Applied Biosystems). Calibragem interna foi realizada usando os picos de autólise de tripsina em m/z 842,508, 1045,564 e 2211,108. Todos os espectros de massa foram coletados no modelo de refletor de íon positivo. A análise de impressão digital de massa de peptídeo (PMF) (Peptide Massa Fingerprint) foi conduzida usando programa gratuito PAWS® (Protein Analysis WorkSheet) da Proteometrics LLC comparando a PMF da amostra com PMF teórica da proteína alvo para verificar se a amostra era a proteína alvo. A identificação da proteína foi realizada através de pesquisa em banco de dados usando MASCOT (MatrixScience, Londres, UK) contra banco de dados de proteína NCBI NR.
Sequenciamento N-Terminal Através de Degradação Química Edman:
[000408] Sequenciamento N-terminal foi realizado em um Procise Protein Sequencer (modelo 494) da Applied Biosystems (Foster City, CA). As amostras de proteína foram separadas primeiro através de SDS-PAGE, então sofrem blotting em membrana de PVDF. As faixas de proteína foram excisadas da membrana e carregadas no Procise Sequencer. Oito ciclos de degradação de química Edman foram reali-zados para cada amostra para dar cinco resíduos AA no terminal N. Uma mistura padrão de 20 aminoácidos PTH (Applied Biosystems) foi realizada com cada amostra. Os resíduos de aminoácido de cada de-gradação Edman foram determinados com base em seus tempos de retenção da coluna C-18 contra os padrões.
[000409] Os resultados do sequenciamento MALDI indicaram que as proteínas DGT-28 e DGT-14 foram expressas e que as sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto quimérico TraP foram processadas. A Tabela 34 lista as sequências processadas que foram obtidas usando a degradação Edman N-terminal e sequenciamento MALDI. Tabela 34. Sítios de clivagem de TraP8 e Trap9 fundidos com as sequências de codificação dgt-14 ou dgt-28. A caixa cinza indica o sítio unido
Figure img0067

Claims (10)

1. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que consiste em um polinucleotídeo que codifica uma proteína quimérica que consiste em um peptídeo de trânsito de cloroplasto sintético (CTP) e um polipeptídeo ligado, em que a sequência de nucleotídeos do CTP sintético é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, 9 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou 4.
2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindica-ção 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo ligado é um poli- peptídeo EPSPS.
3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindica-ção 2, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo EPSPS é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 16 e 17 (DGT-28), SEQ ID NO: 25 (DGT-31), SEQ ID NO: 23 (DGT-32) ou SEQ ID NO: 24 (DGT-33).
4. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindica-ção 3, caracterizada pelo fato de que a proteína quimérica consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 34 ou SEQ ID NO: 35.
5. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindica-ção 2, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo está operacio-nalmente ligado a um promotor operacional em uma célula vegetal.
6. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindica-ção 5, caracterizada pelo fato de que a molécula é um vetor de ex-pressão de planta.
7. Proteína quimérica, caracterizada pelo fato de que é co-dificada pelo polinucleotídeo da molécula de ácido nucleico como defi-nido na reivindicação 1.
8. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 7, ca-racterizada pelo fato de que o polipeptídeo é um peptídeo fluorescente.
9. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 7, ca-racterizada pelo fato de que o polipeptídeo é selecionada do grupo que consiste em zeaxantina epoxidase, colina monooxigenase, ferrocela- tase, dessaturase de ácidos graxos ômega-3, glutamina sintetase, provitamina A, hormônios, proteínas da toxina de Bacillus thuringien- sis, polipeptídeos que conferem resistência a herbicidas a uma planta.
10. Proteína quimérica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste em enzimas acetolactase sintase (ALS), ALS mutada, precursores de ALS e enzimas 3-enolpiruvilshikimate-5-fosfato sinte- tase (EPSPS).
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