MX2014012629A

MX2014012629A - Peptidos sinteticos de transito al cloroplastos derivados de brassica.

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Publication number: MX2014012629A
Application number: MX2014012629A
Authority: MX
Inventors: Andrew E Robinson; Carla Yerkes; Justin M Lira; Robert M Cicchillo
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2015-05-12
Also published as: EP2846623B1; CA2870538A1; RU2014145864A; ZA201408351B; RU2636035C2; AU2016206393B2; JP6652383B2; AU2013205557A1; MX346574B; AU2013205557B2; MX355199B; IL235201B; PH12014502316A1; AP2014008051A0; IL235201A0; CL2014002774A1; EP2846623A1; AU2016206393A1; JP2015514426A; NZ701694A

Abstract

Esta descripción trata de composiciones y métodos para direccionar péptidos, polipéptidos y proteínas a plástidos de células que contienen plástido. En algunas modalidades, la descripción trata de péptidos de tránsito de clorolplasto que pueden dirigir un polipéptido a un plástido y moléculas de ácido nucleico que codifican el mismo. En algunas modalidades, la descripción trata de métodos para producir un material de planta transgénica (por ejemplo, una planta transgénica) que comprende un péptido de tránsito de cloroplasto, así como también materiales de planta producidos por tales métodos y productos mercancía de planta producidos de ahí.

Description

PÉPTIDOS SINTÉTICOS DE TRÁNSITO AL CLOROPLASTOS DERIVADOS DE BRASSICA Reclama Prioridad Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense No, 61 /625,222 presentada el 17 de abril de 2012.

Declaración de Acuerdo con 37 C.F.R. S 1.821 (c) o (e) - Listado de Secuencias Presentado como Archivo de Texto ASCII Conforme a 37 C.F. R. § 1 .821 (c) o (e), se ha presentado un archivo que contiene una versión en texto ASCI I del Listado de Secuencias concomitante a esta solicitud.

Campo de la Invención Esta descripción se refiere a composiciones y metodos para la codificación y extracción de la información genética de polipéptidos que son específicos para los plastos de células que contienen plastos. En ciertas modalidades, la descripción se refiere a secuencias de aminoácidos específicas de polipéptidos que se dirigen hacia los cloroplastos (por ejemplo, de plantas superiores), y/o a las moléculas de ácido nucleico que codifican a los antes mencionados. En ciertas modalidades, la descripción se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden una secuencia de aminoácidos que controla el tránsito de los polipéptidos quiméricos hacia los plastos, y/o hacia las moléculas de ácido nucleico que codifican a los mismos.

Antecedentes de la Invención Las celulas vegetales contienen distintos orgánulos sub celulares los cuales generalmente se denominan como “plastos”, que están delimitados por sistemas de membranas que son característicos y que realizan funciones especializadas dentro de la célula. Determinados plastos son los responsables de la fotosíntesis, así como de la síntesis y del almacenamiento de ciertos compuestos químicos. Todos los plastos se derivan de protoplastos que están presentes en las regiones meristemáticas de la planta. Los protoplastos puede convertirse en , por ejemplo: cloroplastos, etioplastos, cromoplastos, gerontoplastos, leucoplastos, amiloplastos, elaioplastos y proteinoplastos. Los plastos existen de una manera semi-autónoma dentro de la célula, contienen su propio sistema genético y su propia maqumaria de síntesis de proteínas, pero dependen de una estrecha cooperación con el sistema núcleo-citoplasmático en cuanto a su desarrollo y actividades de biosíntesis.

En las células de las hojas que realizan la fotosíntesis de las plantas superiores, los plastos más conspicuos son los cloroplastos. La función más esencial de los cloroplastos es el desempeño de las reacciones de la fotosíntesis que son inducidas por la luz. Sin embargo, los cloroplastos también llevan a cabo muchos otros procesos biosintéticos que son de importancia para la célula vegetal. Por ejemplo, todos los ácidos grasos de la celula son formados por enzimas localizadas en el estroma del cloroplasto, mediante el uso del ATP, NAOPH, y de los carbohidratos que están fácilmente disponibles allí. Por otra parte, el poder reductor de los electrones que se activan por la luz conduce la reducción de nitrito (NO2 ) a amoniaco (N H3) en el cloroplasto; este amoníaco proporciona a la planta con el nitrógeno necesario para la síntesis de aminoácidos y nucleótidos.

El cloroplasto también participa en los procesos de especial importancia en la industria agroquímica. Por ejemplo, se conoce que muchos herbicidas actúan mediante el bloqueo de las funciones que se realizan dentro del cloroplasto. Estudios recientes han identificado el objetivo específico de varios herbicidas. Por ejemplo, los herbicidas derivados de la triazina inhiben la fotosíntesis mediante el desplazamiento de una molécula de plastoqumona de su sitio de unión en el polipéptido 32 kD del fotosistema II . Este polipéptido 32 kD se codifica en el genoma del cloroplasto y se sintetiza por la maquinaria del orgánulo. Se han obtenido plantas mutantes, las cuales son resistentes a herbicidas de triazina. Estas plantas contienen un polipéptido 32 kD mutante, del cual ya no se puede desplazar la plastoquinona mediante herbicidas de triazina. Las sulfonilureas inhiben la acetolactato sintasa en el cloroplasto. La acetolactato sintasa está implicada en la síntesis de la isoleucina y la valina. El glifosato inhibe la función de 5-enol-3-piruvilfosfoshikimato sintasa (EPSPS por sus siglas en ingles), que es una enzima implicada en la síntesis de aminoácidos aromáticos. Todas estas enzimas son codificadas por el genoma nuclear, pero son trasladadas en el cloroplasto, donde la síntesis real de aminoácidos se lleva a cabo.

La mayoría de las proteínas de los cloroplastos se codifican en el núcleo de la celula vegetal, sintetizadas como proteínas precursoras más grandes en el citosol, y después de su traducción son importadas hacia dentro del cloroplasto. La importación a través de las membranas envolventes exteriores e interiores hacia dentro del estroma es el principal medio para la entrada de las proteínas que están destinadas para el estroma, la membrana de los tilacoides y el lumen tilacoidal. La localización de las proteínas precursoras importadas a la membrana del tilacoide y lumen tilacoidal se lleva a cabo por cuatro mecanismos distintos, incluyendo dos que son homólogos a los sistemas de trasporte de las proteínas bacterianas. Por lo tanto, los mecanismos para la localización de proteínas dentro del cloroplasto están, en parte, derivados de la procariota endosimbionte. Cline and Henry (1996) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12: 1 -26.

Las proteínas precursoras destinadas para la extracción de cloroplastos contienen extensiones terminales N conocidas como péptidos de tránsito de cloroplasto (CTP por sus siglas en inglés). El péptido de tránsito es instrumental para el reconocimiento específico de la superficie del cloroplasto y en la mediación de la translocación post-traduccional de las proteínas a traves de la envoltura cloroplástica y, de allí, hacia los diversos sub compartimientos dentro del cloroplasto (por ejemplo, el estroma, los tilacoides, y la membrana del tilacoide). Estas secuencias de péptidos de tránsito de terminales N contienen toda la información necesaria para la importación de la proteína del cloroplasto hacia dentro de los plastos; las secuencias de péptidos de tránsito son necesarias y suficientes para la importación hacia dentro de los plastos.

Los genes de las plantas que se conocen que tienen secuencias de péptidos naturalmente codificadas en sus terminales N incluyen la subunidad pequeña de la ribulosa-1 ,5-bifosfato carboxilasa (RuBisCo) (de Castro Silva-Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-80; Schnell et al. (1991 ) J. Biol.

Chem. 266:3335-42); EPSPS (ver, por ejemplo. , Archer et al. (1990) J. Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810 y Patentes Estadounidenses 6,867,293, 7,045,684, y Re. 36,449); triptófano sintasa (Zhao et al. (1995) J . Biol. Chem. 270:6081 -7); plastocianina (Lawrence et al. (1997) J . Biol. Chem. 272:20357-63); corismato sintasa (Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:27447-57); la proteína de unión a clorofila a/b que recoge la luz (LHBP) (Lamppa et al. (1988) J . Biol. Chem. 263: 14996-14999); y proteína del cloroplasto de Arabidopsis thaliana (Lee et al. (2008) Plant Cell 20: 1603-22). La publicación de patente Estadounidense No. US 2010/0071090 proporciona ciertos pepticos de tránsito al cloroplasto provenientes de las Chlamydomonas sp.

Sin embargo, los requerimientos estructurales para la información codificada por cloroplastos que tienen como objetivo a los péptidos sigue siendo difícil de alcanzar, debido a su alto nivel de diversidad de secuencias y la falta de motivos de secuencia comunes o de consenso, aunque es posible que existan distintos subgrupos de cloroplastos péptidos con independientes motivos estructurales. Lee et al. (2008), supra. Además, no todas estas secuencias han sido útiles para la extracción heteróloga de proteínas específicas en cloroplastos en plantas superiores.

Breve Descripción de la Invención Se describen aquí las composiciones y los métodos para dirigirse a plastos específicos de polipéptidos en una planta. En algunas modalidades, una composición contiene una molécula de ácido nucleico que, a su vez, contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifican un péptido sintético de tránsito hacia el cloroplasto derivado de Brassica péptido de tránsito al cloroplasto (por ejemplo, un péptido TraP8 y un péptido TraP9) unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que sea de interés. En determinadas modalidades, dichas moléculas de ácido nucleico pueden ser útiles para la extracción y la orientación específica de un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés en una planta monocotiledónea o dicotiledónea. Además se describen vectores que comprenden una molecula de ácido nucleico que contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido sintético de tránsito hacia el cloroplasto derivado de la Brassica que está unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés.

En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un CTP sintético derivado de Brassica puede ser una secuencia de nucleótidos que se deriva de una secuencia de nucleótidos de referencia obtenida a partir de un gen Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea, y B. carinata), o de una variante funcional de la misma. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un CTP sintético derivado de Brassica puede ser una secuencia quimérica de nucleótidos que contiene un CTP parcial que codifica la secuencia de nucleótidos provenientes de un gen Brassica sp. , o de una variante funcional del mismo. En modalidades específicas, una secuencia de nucleótidos que codifica un CTP sintético de Brassica puede contener secuencias contiguas de nucleótidos obtenidas de cada uno, de un CTP de Brassica sp. de referencia, y de un CTP proveniente de un gen diferente de la Brassica sp., de una Brassica sp. diferente o de un organismo diferente (por ejemplo, una planta, una procariota, y una eucariota inferior fotosintética), o de variantes funcionales o de cualquiera de los anteriores. En determinadas modalidades, se puede obtener una secuencia de nucleótidos contiguos a partir de una secuencia de ortólogos de nucleótidos del CTP de la Brassica de referencia que se obtiene del ortólogo de un organismo diferente al gen de Brassica sp. de referencia (por ejemplo, un genoma de Brassica sp. diferente). En estas y aún en más modalidades, una secuencia de nucleótidos que codifica un derivado CTP sintetico derivado de Brassica puede ser una secuencia de nucleótidos quiméricos que contiene más de una secuencia de nucleótidos codificantes de CTP.

En algunos ejemplos, una secuencia de nucleótidos que codifican un CTP sintético derivado de Brassica puede ser una secuencia quimérica de nucleótidos que contiene una secuencia parcial de nucleótidos de CTP ya sea proveniente de B. napus y B. rap, o de variantes funcionales de estos. En ejemplos específicos, una secuencia de nucleótidos que codifica un CTP sintético derivado sintético de Brassica puede contener secuencias contiguas de nucleótidos que se obtienen de cada uno de B. napus y B. rapa, o de una variante funcional de los mismos.

En algunas modalidades, una composición contiene una molécula de ácido nucleico que, a su vez, contiene al menos un medio derivado de Brassica para dirigir de manera específica a un polipéptido hacia un cloroplasto. Además, se describen las moléculas de ácido nucleico que comprenden al menos un medio derivado de Brassica para dirigir a un polipéptido hacia un cloroplasto que se encuentra operativamente vinculado a una secuencia de nucleótidos de interés. En modalidades determinadas, dichas moleculas de ácido nucleico pueden ser útiles para la extracción y direccionamiento específico de un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés en una planta monocotiledónea o dicotiledónea. Para los fines de la presente descripción , los medios a través de los cuales un derivado de Brassica dirige de forma específica a un polipéptido hacia un cloroplasto se refieren a determinadas secuencias de nucleótidos sintéticos. En modalidades específicas, los medios por los que un derivado de Brassica dirige de manera específica a un polipéptido hacia un cloroplasto se seleccionan del grupo que consiste de secuencias de nucleótidos que codifica, los polipéptidos, denominadas en este documento como TraP8 y TraP9.

También se describen en el presente documente los materiales vegetales (por ejemplo y sin limitación , plantas vegetales, tejidos vegetales y células vegetales) que comprenden una molécula de ácido nucleico que a su vez comprenden al menos una secuencia de nucleótidos que codifican un CTP sintético derivado de Brassica vinculado operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés. En algunas modalidades, un material vegetal puede tener una molécula de ácido nucleico integrada de manera estable en su genoma. En algunas modalidades, un material vegetal puede extraer transitoriamente un producto de una molécula de ácido nucleico que contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un CTP sintetico derivado de Brassica vinculado operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés. En algunas modalidades, el material vegetal es una célula vegetal del cual una planta no puede ser regenerada.

Los métodos también se describen para extraer una secuencia de nucleótidos en una célula que contiene plastos (por ejemplo, una planta) hacia dentro de un plasto (por ejemplo, un cloroplasto) de la célula que contiene dicho plasto En determinadas modalidades, una molécula de ácido nucleico que contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un CTP sintético derivado de Brassica, que está vinculado operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés, se puede usar para transformar una célula vegetal, de tal manera que un polipéptido precursor de fusión que contiene el CTP sintético derivado de Brassica fusionado a un producto de extracción de la secuencia de nucleótidos de interés se produce en el citoplasma de la célula vegetal, y el polipéptido de fusión se transporta en vivo hacia dentro de un cloroplasto de la célula vegetal. En algunas modalidades, la célula vegetal no es capaz de regenerarse en una planta.

Además se describen métodos para la producción de una planta transgénica que contiene una molécula de ácido nucleico que a su vez contiene al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un CTP sintético derivado de Brassica- CTP vinculado operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés.

También se describen los productos vegetales provenientes de productos básicos (por ejemplo, semillas) producidos a partir de tales plantas transgénicas. En algunas modalidades, estas plantas transgénicas o productos básicos vegetales contienen células transgénicas a partir de los cuales una planta no puede ser regenerada.

Las anteriores características como también otras se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias modalidades, que proceden haciendo referencia a las figuras adjuntas.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 ilustra una molécula de ARNm que es representativa de determinados ejemplos de una secuencia de nucleótidos de CTP sintético codificante derivado de Brassica (por ejemplo, TraP8 y TraP9) que está vinculada operativamente, a su vez, a una secuencia de nucleótidos de interés. En algunas modalidades, una molécula de ARNm (como la que se muestra) puede ser transcrita a partir de una molécula de ADN que contiene un marco de lectura abierto, que a vez incluye la secuencia CTP sintética y codificadora de nucleótidos de CTP derivado de Brassica vinculado operativamente al nucleótido de interés. La secuencia de nucleótidos de interés puede ser, en algunas modalidades, una secuencia codificadora de un péptido de interés, por ejemplo y sin limitación, un producto del gen marcador o un péptido que se dirige a un plasto.

Figura 2 ilustra un mapa del plásmido de pDAB101977.

Figura 3 ilustra un mapa del plásmido de pDAB101908.

Figura 4 incluye una imagen microscópica que muestra el TraP8-YFP que se infiltra en el tejido de una hoja de tabaco que se traslada a los cloroplastos de tejido de la hoja de tabaco.

Figura 5 incluye una imagen microscópica que muestra el TraP9-YFP que se infiltra en el tejido de una hoja de tabaco que se traslada a los cloroplastos de tejido de la hoja de tabaco.

Figura 6 incluye una imagen microscópica que muestra controles de YFP no dirigidos que se infiltraron en el tejido de una hoja de tabaco y que no fueron incorporados dentro de los cloroplastos del tejido de la hoja de tabaco.

Figura 7 ilustra un mapa del plásmido de pDAB106597.

Figura 8 incluye una imagen microscópica del constructo TraP8-YFP transformado en protoplastos de maíz que muestra el traslado hacia dentro de los cloroplastos del protoplasto del maíz.

Figura 9 ilustra un mapa del plásmido de pDAB105526.

Figura 10 ilustra un mapa del plásmido de pDAB105527.

Figura 11 ilustra un mapa del plásmido de pDAB109807. Figura 12 ilustra un mapa del plásmido de pDAB107687.

Figura 13 ilustra un mapa del plásmido de pDAB1 1 1481 .

Figura 14 ilustra un mapa del plásmido de pDAB1 1 1479.

Figura 15 ilustra un mapa del plásmido de pDAB1 1 1338.

Figura 16 ilustra un mapa del plásmido de pDAB1 12710. Figura 17 incluye una alineación de los peptidos de tránsito al cloroplasto predichos para la proteína EPSPS de Brassica napus (SEC ID No.: 1 ) y Brassica rapa (SEC ID No.: 2). El asterisco indica que las secuencias fueron divididas y recombinadas para formar TraP8 y TraP9.

Figura 18 ustra un mapa de plásm do de pDAB107527. Figura 19 ustra un mapa de plásm do de pDAB105530. Figura 20 ustra un mapa de plásm do de pDAB105531. Figura 21 ustra un mapa de plásm do de pDAB105532. Figura 22 ustra un mapa de plásm do de pDAB105533. Figura 23 ustra un mapa de plásm do de pDAB105534. Figura 24 ustra un mapa de plásm do de pDAB107532. Figura 25 ustra un mapa de plásm do de pDAB107534. Figura 26 ustra un mapa de plásm do de pDAB107533. Figura 27 ustra un mapa de plásm do de pDAB4104.

Figura 28 ustra un mapa de plásm do de pDAB102715. Figura 29 ustra un mapa de plásm do de pDAB102716. Figura 30 ustra un mapa de plásm do de pDAB102717. Figura 31 ustra un mapa de plásm do de pDAB102785. Figura 32 ustra un mapa de plásm do de pDAB102719. Figura 33 ustra un mapa de plásm do de pDAB102718. Figura 34 ustra un mapa de plásm do de pDAB107663. Figura 35 ustra un mapa de plásm do de pDAB107664. Figura 36 ustra un mapa de plásm do de pDAB107665. Figura 37 ustra un mapa de plásm do de pDAB107666. Figura 38 ustra un mapa de plásm do de pDAB109812.

Figura 39 ilustra un mapa del plásmido de pDAB101556.

Figura 40 ilustra un mapa del plásmido de pDAB107698.

Figura 41 ilustra un mapa del plásmido de pDAB108384.

Figura 42 ilustra un mapa del plásmido de pDAB108385.

Figura 43 ilustra un mapa del plásmido de pDAB108386.

Figura 44 ilustra un mapa del plásmido de pDAB108387. Listado de Secuencias Las secuencias de ácidos nucleicos que figuran en la lista de secuencias adjunta se muestran usando abreviaturas estándar para bases de nucleótidos, como se define en 37 C. F.R. § 1 .822.

Sólo se muestra una hebra de cada secuencia de ácido nucleico, pero la cadena complementaria se entiende para ser incluido por cualquier referencia a la cadena complementaria. En la lista de secuencias adjunta: SEC I D No. : 1 muestra el aminoácido del peptido de tránsito al cloroplasto de una Brassica napus EPSPS.

SEC ID No. : 2 muestra el aminoácido del péptido de tránsito al cloroplasto de una Brassica rapa EPSPS.

SEC ID No. : 3 muestra el aminoácido de un péptido quimérico de tránsito al cloroplasto TraP8.

SEC ID No. : 4 muestra el aminoácido de un péptido quimérico de tránsito al cloroplasto TraP9.

SEC ID No. : 5 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido quimérico de transito al cloroplasto TraP8.

SEC I D No.: 6 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica un peptido quimérico de transito al cloroplasto TraP9.

SEC I D No. : 7 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de vinculación.

SEC ID No.: 8 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido quimérico de tránsito al cloroplasto TraP8 v2.

SEC I D No.: 9 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido quimérico de tránsito al cloroplasto TraP9 v2.

SEC I D No.: 10 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica un gen Cry2Aa.

SEC ID No.: 1 1 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica un gen Vip3Ab 1 v6.

SEC ID No.: 12 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica un gen Vip3Ab 1 v7.

SEC I D No. : 13 muestra un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos Ser-Val-Ser-Leu .

SEC ID No. : 14 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica el péptido de tránsito al cloroplasto Brassica napus EPSPS de la SEC ID No. : 1 .

SEC ID No. : 15 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica el péptido de tránsito al cloroplasto Brassica rapa EPSPS de la SEC I D No. : 2.

SEC I D No. : 16 muestra una secuencia de polinucleótido que codifica dgt-28 v5.

SEC I D No. : 17 muestra una secuencia de polinucleótido que codifica dgt-28 v6.

SEC ID No. : 17 muestra una secuencia de polinucleótido que codifica dgt-28 v6.

SEC ID No. : 18 muestra la secuencia de polinucleótido de codón optimizado dgt- 1.

SEC ID No. : 19 muestra la secuencia de polinucleótido de codón optimizado dgt-3 v2 (G173A).

SEC ID No. : 20 muestra la secuencia de polinucleótido de codón optimizado dgt-3 v3 (G173A; P178S).

SEC I D No. : 21 muestra la secuencia de polinucleótido de codón optimizado dgt-3 v4 (T 1741 ; P178S).

SEC ID No. : 22 muestra la secuencia de polinucleótido de codón optimizado dgt-7 v4 (T 1681 ; P172S).

SEC ID No. : 23 muestra la secuencia de polinucleótido de codón optimizado dgt-32 v3.

SEC ID No. : 24 muestra la secuencia de polinucleótido de codón optimizado dgt-33 v3.

SEC I D No. : 25 muestra la secuencia de polinucleótido de codón optimizado dgt-31 v3.

SEC ID No. : 26 muestra una secuencia de polinucleótido que codifica peptido de tránsito TraP4 v 2.

SEC I D No. : 27 muestra una secuencia de polinucleótido que codifica peptido de tránsito TraP5 v 2.

SEC I D No. : 28 muestra una secuencia de polinucleótido que codifica péptido de tránsito TraP8 v2.

SEC I D No.: 29 muestra una secuencia de polinucleótido que codifica péptido de tránsito TraP9 v2.

SEC ID No.: 30 muestra una secuencia de polinucleótido que codifica péptido de tránsito TraP12 v2.

SEC ID No. : 31 muestra una secuencia de polinucleótido que codifica péptido de tránsito TraP13 v2.

SEC I D No. : 32 muestra la secuencia de polinucleótido de TraP4 v2 \dgt-28 v5.

SEC I D No. : 33 muestra la secuencia de polinucleótido de TraP5 v2 :dgt-28 v5.

SEC I D No.: 34 muestra la secuencia de polinucleótido de T raP8 \¡2:dgt-28 v5.

SEC ID No. : 35 muestra la secuencia de polinucleótido de TraP9 v2 \dgt-28 v5.

SEC ID No. : 36 muestra la secuencia de polinucleótido de T raP12 M2 dgt-28 v5.

SEC I D No.: 37 muestra la secuencia de polinucleótido de TraP13 v2 \dgt-28 v5.

SEC I D No. : 38 muestra la secuencia de polinucleótido que codifica péptido de tránsito TraP14 v2.

SEC I D No. : 39 muestra la secuencia de polinucleótido que codifica péptido de tránsito TraP23 v2.

SEC ID No. : 40 muestra la secuencia de polinucleótido que codifica peptido de tránsito TraP24 v2.

SEC I D No. : 41 muestra la secuencia de polinucleótido que codifica péptido de tránsito dgt-32 v3 fusionado a TraP14 v2.

SEC ID No.: 42 muestra una secuencia de polinucleótido que codifica péptido de tránsito dgt-33 v3 fusionado a TraP24 v2.

SEC I D No. : 43 muestra una secuencia de polinucleótido que codifica péptido de tránsito dgt-31 v3 fusionado a TraP23 v 2.

SEC ID No. : 44 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador DSM2A.

SEC ID No. : 45 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador DSM2S.

SEC ID No. : 46 muestra la secuencia de oligonucleótido de la sonda DSM2 CY5.

SEC ID No. : 47 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador DGT28F.

SEC ID No. : 48 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador DGT28R.

SEC ID No. : 49 muestra la secuencia de oligonucleótido de la sonda TAFFY-HEX.

SEC I D No. : 50 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador TAFIM 5-F.

SEC ID No. : 51 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador TAFI I 15-R.

SEC I D No. : 52 muestra la secuencia de oligonucleótido de la oligo hacia adelante usado para dgt-28 gen de confirmación casete de expresión .

SEC I D No. : 53 muestra la secuencia de oligonucleótido de la oligo inverso usado para dgt-28 gen de confirmación casete de expresión.

SEC I D No. : 54 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador AT26410LP.

SEC I D No. : 55 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador AT26410RP.

SEC ID No. : 56 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador DGT28F.

SEC ID No. : 57 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador DGT28R.

SEC ID No. : 58 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador GAAD1 F.

SEC ID No. : 59 muestra la secuencia de oligonucleótido de la sonda GAAD1 P.

SEC ID No. : 60 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador GAAD1 R.

SEC I D No. : 61 muestra la secuencia de oligonucleótido de la IV-Probe.

SEC I D No. : 62 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador FIV-Taq.

SEC ID No. : 63 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador IVR-Taq.

SEC ID No. : 64 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador zmDGT28 F.

SEC I D No.: 65 muestra la secuencia de oligonucleótido de la sonda zmDGT28 FAM.

SEC I D No. : 66 muestra la secuencia de oligonucleótidos del cebador zmDGT28 R Descripción Detallada de la Invención I. Visión general de varias modalidades Un peptido de tránsito al cloroplasto (CTP por sus siglas en inglés) (o péptido de tránsito al plasto) funciona de manera co-traduccional o post-traduccional para dirigir un polipéptido que contiene el CTP a un plasto (por ejemplo, un cloroplasto). En algunas modalidades de la invención, sea como proteínas endógenas de cloroplastos o proteínas heterólogas, se les puede dirigir a un cloroplasto mediante la extracción de tal proteína como un precursor polipéptido más grande que contiene un CTP. En determinadas modalidades, se puede derivar el CTP A partir de una secuencia que se obtiene de un gen Brassica sp. , por ejemplo y sin limitación, al incorporar al menos una secuencia contigua de un gen ortólogo que se obtuvo de un organismo diferente, o de una variante funcional del mismo.

En un ejemplo de modalidad, se aislaron las secuencias de ácidos nucleicos, cada una codificando un CTP, a partir de secuencias de genes EPSPS que fueron obtenidas, a su vez, a partir de Brassica napus (No. de acceso a base de datos NCBI P17688) y Brassica rapa (No. de acceso a base de datos NCBI AAS80163). Las secuencias codificantes de ácido nucleico para CTP fueron aisladas mediante el análisis de la secuencia del gen EPSPS con el servidor de predicción ChloroP. Emanuelsson et al. (1999) Protein Science 8:978-84 (disponible en cbs.dtu.dk/services/ChloroP). Los productos proteicos que se predice obtener de las secuencia codificantes de CTP que fueron aisladas tienen peptidos de tránsito de 60-70 aminoácidos de largo. En este ejemplo, se usó el CTP de B. napus nativo como secuencia de referencia para diseñar ejemplos de CTPs sintéticos derivados de Brassica al fusionar secuencias contiguas provenientes de otros CTPs en una posición determinada en el CTP napus. Este proceso de diseño ilustra el desarrollo de un CTP sintético nuevo, de acuerdo con algunos aspectos provenientes de una secuencia de ácido nucleico de Brassica sp. Se hace referencia a estos ejemplos de CTPs derivados de Brassica a lo largo de esta descripción bajo la denominación de TraP8 y TraP9. Estos ejemplos de TraPs sintéticos fueron puestos a prueba para la función de direccionamiento de plastos y se determinó que muestran direccionamiento de plastos que fue al menos tan favorable como el que se observó de manera individual para las secuencias de Brassica nativa.

En otro ejemplo de modalidad , secuencias de ácido nucleico, cada una codificando un péptido sintético TraP de la invención, se sintetizaron de forma independiente y se vincularon operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína amarilla fluorescente (YFP por sus siglas en ingles) para producir moléculas de ácidos nucleicos sintéticos, cada una codificando un polipéptido quimérico de fusión TraP:YFP. Tales moléculas de ácidos nucleicos, cada una codificando un polipéptido quimérico de fusión TraP:YFP, fueron una a una introducidas a un vector binario, de manera que la secuencia de ácido nucleico codificante TraP:YFP fue vinculada operativamente a un promotor AtUbi 10.

En un ejemplo más de modalidad , los vectores binarios que contienen una secuencia TraP:YFP codificadora de ácido nucleico vinculada operativamente a un promotor AtUbi 10, cada una fue de forma independiente, transitoriamente transformada en tabaco ( Nicotiana benthamiana) a través de una transformación mediada por Agrobacterium. La microscopía confocal y el análisis de transferencia Western confirmaron que cada TraP se dirigió YFP de forma exitosa a los cloroplastos del tabaco.

En otro ejemplo de modalidad, las secuencias de ácido nucleico, cada una de las cuales codifica un péptido sintético TraP de la invención, se sintetizaron de forma independiente y de forma vinculada operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de genes agronómicamente importantes. Las secuencias TraP se fusionaron a rasgos tolerantes a los herbicidas (por ejemplo a dgt-28 y dgt- 14) para producir moléculas de ácidos nucleicos sintéticos, cada una de las cuales codifica al polipeptido quimérico de fusión TraP: DGT-28 o TraP: DGT-14. Tales moléculas de ácido nucleico, cada una de las cuales codifica al polipéptido quimérico de fusión TraP: DGT-28 o TraP:DGT-14, fueron una a una introducidas a un vector binario, de forma que cada secuencia de ácido nucleico codificante TraP:dgt-28 o TraP:dgt-14 fuese vinculada operativamente a un promotor y a otros elementos reguladores de genes. Se usó el binario que contiene la secuencia de ácido nucleico codificante TraP:dgt-28 o TraP:dgt-14 para transformar varias especies de plantas vegetales. Se realizaron ensayos con plantas transgénicas para poner a prueba su tolerancia a los herbicidas como resultado de la extracción y translocación de las enzimas DGT-28 o DGT-14 hacia el cloroplasto.

En otro ejemplo de forma, las secuencias de ácido nucleico, cada una codificando un péptido TraP sintético de la invención, se sintetizaron de forma independiente y se vincularon operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de genes agronómicamente importantes. Las secuencias TraP se fusionaron a genes que confieren rasgos tolerantes a insectos (por ejemplo Cry2Aa y Vip3Ab1 ) para producir moléculas sintéticas de ácidos nucleicos, cada una de las cuales codifica un polipéptido vinculante quimérico TraP:Cry2Aa o TraP:Vip3Ab1 . Tales moléculas de ácidos nucleicos, cada una de las cuales codifica un polipéptido vinculante quimérico TraP:Cry2Aa o TraP:Vip3Ab1 , fueron introducidas una a una a un vector binario, como cada secuencia de ácido nucleico TraP:Cry2Aa o TraP:Vip3Ab1 que estuvo vinculada operativamente a un promotor y a otros elementos reguladores de genes. Se usó el binario que contiene cada secuencia de ácido nucleico TraP \ Cry2Aa o TraP: Vip3Ab 1 a fin de transformar varias especies de plantas vegetales. Las plantas vegetales transgenicas se bio-ensayaron en cuanto a su resistencia a los insectos, como resultado de la extracción y la translocación de enzimas Cry2Aa o Vip3Ab1 al cloroplasto.

En vista de los ejemplos de trabajo antes mencionados, las secuencias sintéticas de CTP derivadas de Brassica de la invención, y los ácidos nucleicos que codifican las mismas, se pueden usar para dirigir a cualquier polipéptido a un plasto en una amplia gama de células que contienen plastos. Por ejemplo, por los métodos que se ponen a disposición de los expertos en la téenica por la presente descripción, un polipéptido quimérico que comprende una secuencia de CTP sintético derivado de Brassica-CTP fusionada a la terminal N de cualquier segunda secuencia péptica puede ser introducida dentro de (o expresada en) una célula anfitriona que contiene plastos para dirigirse de manera específica a la segunda secuencia péptica. Por lo tanto, en formas específicas, un péptido TraP de la invención puede proporcionar una mayor eficiencia de importación y de procesamiento de un péptido del que se desea expresar el plasto, en comparación con un CTP nativo.

II. Abreviaturas CTP peptido de tránsito al cloroplasto Bt bacillus thuringiensis EPSPS 3-enolpiruvilsiquimato-5-fosfato sintetasa YFP proteína amarilla fluorescente Inducción de tumor (plásmidos derivados de A tumefaciens) T-ADN ADN de transferencia III. Términos Para facilitar la revisión de las diversas modalidades de la descripción, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos: Péptido de tránsito de cloroplasto: Como se usa aquí, el término “péptido de tránsito de cloroplasto” (CTP por su sigla en inglés) (o “péptido de tránsito de plástido”) se puede referir a una secuencia de aminoácido que, cuando está presente en el término N de un polipéptido, dirige la importación de polipéptido en un plástido de una célula que contiene plástido (por ejemplo, una célula de planta, como en una planta completa o un cultivo de célula de planta). Un CTP es generalmente necesario y suficiente para dirigir la importación de una proteína en un plástido (por ejemplo, un plástido primario, secundario o terciario como un cloroplasto) de una célula huésped. Un péptido de tránsito de cloroplasto supuesto puede ser identificado por uno de los siguientes algoritmos disponibles (por ejemplo, PSORT y CloroP (disponible en cbs.dtu.dk/services/ChloroP)). El CloroP puede brindar una predicción de CTP particularmente buena. Emanuelsson et al. (1999) Protein Science 8:978-84. Sin embargo, la predicción de CTP funcionales no se logra al 100% de eficiencia por ningún algoritmo existente. Por tanto, es importante verificar que un supuesto CTP identificado ciertamente funciona como está previsto, por ejemplo, una metodología ¡n vi tro, o in vivo Los peptidos de tránsito de cloroplasto pueden ser localizados en el término N de un polipéptido que es importado a un plástido El CTP puede facilitar transporte co o post-traduccional de un polipéptido que se compone de CTP en un plástido. Los péptidos de tránsito de cloroplasto consisten de entre 40 y 100 aminoácidos y tales CTP han sido observados que contienen ciertas características comunes. Por ejemplo: Los CTP contienen muy pocos, si no ninguno, aminoácidos cargados negativamente (como el ácido aspártico, ácido glutámico o glutamina); las regiones terminales N de los CTP carecen de aminoácidos cargados, glicina y prolina; la región central de un CTP también tiene la probabilidad de contener una proporción muy alta de aminoácidos básicos o hidroxilados (como la serina y treonina); y la región terminal C de un CTP tiene la probabilidad de ser rico en arginina, y tiene la capacidad de contener una estructura de lámina antipática beta Las proteasas plástidas pueden atravesar el CTP del resto de un polipéptido que contiene el CTP despues de la importación de un polipéptido en un plástido.

Contacto: Como se usa aquí, el término “contacto con” o “absorción por” una célula, tejido u organismo (por ejemplo, una 5 célula de planta; tejido de planta; y planta), con respecto a una molécula de ácido nucleico, incluye la internalización de la molécula de ácido nucleico en el organismo, por ejemplo y sin limitación: poniendo en contacto el organismo con una composición que contiene la molécula de ácido nucleico y 10 empapando el organismo con una solución que contiene la molécula de ácido nucleico.

Endógeno: Como se usa aquí, el término “endógeno” se refiere a sustancias (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico y polipéptidos) que se originan desde adentro de un organismo ís particular, tejido o célula. Por ejemplo, un polipéptido “endógeno” expresado en una célula de planta puede referirse a un polipéptido que es normalmente expresado en células del mismo tipo de plantas no genéticamente diseñadas de las mismas especies. En algunos ejemplos, un gen endógeno (por ejemplo, 0 un gen EPSPS) de una Brassica sp. puede ser usado para obtener una secuencia de Brassica CTP de referencia.

Expresión: Como se usa aquí, “expresión” de una secuencia de codificación (por ejemplo, un gen o un transgén) se refiere al proceso por el cual la información codificada de una unidad 5 transcripcional de un ácido nucleico (incluyendo, por ejemplo, ADN genómico o cADN) es convertida en una parte operativa, no operativa, o estructural de una celula que con frecuencia incluye la síntesis de una proteína. La expresión genética puede ser influenciada por señales externas; por ejemplo, la exposición de una célula, tejido u organismo a un agente que aumente o disminuya la expresión genética. La expresión de un gen también puede ser regulada en cualquier lugar en la ruta del ADN a ARN a proteína. La regulación de la expresión genética ocurre, por ejemplo, mediante controles que actúan en la transcripción, traducción, transporte y procesamiento del ARN , degradación de moléculas intermediarias como la mARN, o mediante activación, inactivación, compartimentación o degradación de moléculas específicas de proteínas después de que han sido hechas o por combinaciones de los mismos. La expresión genética se puede medir al nivel del ARN o al nivel de la proteína por cualquier método conocido, por ejemplo y sin limitaciones: Transferencia de Northern; RT-PCR; Western blot; o ensayos de actividad de proteínas in vitro in situ ; e in vivo.

Material genético: Como se usa aquí, el término “material genético” incluye todos los genes y moléculas de ácido nucleico, como el ADN y el ARN .

Heterólogos: Como se usa aquí, el término “heterólogos” se refiere a sustancias (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico y polipéptidos) que no se originan desde adentro de un organismo particular, tejido o célula. Por ejemplo, un polipéptido “heterólogo” expresado en una celula de planta puede referirse a un polipéptido que no es normalmente expresado en células del mismo tipo de plantas no genéticamente diseñadas de las mismas especies (por ejemplo, un polipéptido que es expresado en células diferentes del mismo organismo o células de un organismo diferente).

Aislado: Como se usa aquí, el término “aislado” se refiere a moléculas (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico y polipéptidos) que están sustancialmente separadas o purificadas de otras moléculas del mismo tipo (por ejemplo, otras moléculas de ácido nucleico y otros polipéptidos) con las cuales la molécula está normalmente asociada en la célula del organismo en el cual la molécula existe de forma natural. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico aislada puede estar sustancialmente separada o purificada del ADN cromosómico o del ADN extracromosómicos en la célula del organismo en el cual la molécula de ácido nucleico existe de forma natural. Así, el término incluye moléculas de ácido nucleico recombinante y polipéptidos que son bioquímicamente purificados de modo que otras moléculas de ácido nucleico, polipéptidos y componentes celulares sean removidas. El término también incluye moléculas de ácido nucleico recombinante, moléculas de ácido nucleico sintetizadas químicamente y polipéptidos producidos de forma recombinante.

El término “sustancialmente purificado” como se usa aquí, se refiere a una molécula que está separada de otras moléculas normalmente asociadas con ella en su estado natural. Una molecula sustancialmente purificada puede ser la especie predominante presente en una composición . Una molécula sustancialmente purificada puede estar por ejemplo, al menos 60% libre, al menos 75% libre o al menos 90% libre de otras moléculas además de un solvente presente en una mezcla natural. El término “sustancialmente purificada” no se refiere a moléculas presentes en su estado natural.

Molécula de ácido nucleico: Como se usa aquí, el término “molécula de ácido nucleico” se refiere a una forma polimérica de nucleótidos que pueden incluir tanto cadenas sentido y antisentido de ARN , cADN , ADN genómico y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Un nucleótido se puede referir a un ribonucleótido, desoxirribonucleótido o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Una “molécula de ácido nucleico” como se usa aquí es sinónimo de “ácido nucleico” y “polinucleótido”. Una molécula de ácido nucleico generalmente es al menos 10 bases en longitud, a menos que se especifique lo contrario. El término incluye formas de cadenas individuales y dobles de ADN. Las moléculas de ácido nucleico incluyen formas diméricas (así llamadas en tándem) y los productos de transcripción de moléculas de ácido nucleico. Una molécula de ácido nucleico puede incluir cualquiera o ambos nucleótidos naturales y modificados unidos por enlaces naturales y/o no naturales.

Las moleculas de ácido nucleico pueden modificarse químicamente o bioquímicamente o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, como se apreciará fácilmente por los expertos en la téenica. Tales modificaciones incluyen , por ejemplo, etiquetas, metilación , sustitución de uno o más nucleótidos naturales con modificaciones internucleótidos análogos (por ejemplo, enlaces no cargados: por ejemplo, fosfonatos metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etcétera; enlaces cargados: por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etcétera; restos independientes: por ejemplo, péptidos, intercaladores: por ejemplo, acridina, psoraleno, etcétera; quelantes, alquilantes y enlaces modificados: por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etcétera. El término “molécula de ácido nucleico” también incluye cualquier conformación topológica, incluyendo conformaciones de cadena sencilla, de cadena doble, duplicada, triplicada, en forma de horquilla, circular y de candado.

Como se usa aquí con respecto al ADN, el término “secuencia de codificación”, “secuencia estructural de nucleótido” o “molécula estructural de ácido nucleico” se refiere a una secuencia de nucleótido que es ultimadamente traducida a un polipéptido via transcripción y mARN , cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Con respecto al ARN, el término “secuencia de codificación” se refiere a una secuencia de nucleótido” que es traducida a un péptido, polipeptido o proteína. Los límites de una secuencia de codificación están determinados por un codón de inicio de traducción en el término 5 y un codón de terminación de traducción en el término 3 . Las secuencias de codificación incluyen pero no están limitadas a: secuencias de ADN genómico, cADN; EST y nucleótidas recombinantes.

En algunas modalidades, la invención incluye secuencias de nucleótidos que pueden ser aisladas, purificadas o parcialmente purificadas, por ejemplo, usando métodos de separación como por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico; por exclusión basada en tamaño molecular o por afinidad por téenicas de fraccionamiento basadas en la solubilidad en solventes diferentes; y métodos de ingeniería genética como amplificación, clonación y subclonación.

Identidad de secuencia: El término “identidad de secuencia” o “identidad”, como se usa aquí en el contexto de secuencias de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, puede referirse a los residuos en las dos secuencias que son la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada.

Como se usa aquí, el término “porcentaje de identidad de secuencia” puede referirse al valor determinado por comparación de dos secuencias óptimamente alineadas (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos) sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (por ejemplo, espacios) comparada con la secuencia de referencia (la que no comprende adiciones ni supresiones) para alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinación del número de posiciones en las cuales los residuos identicos de nucleótidos o aminoácidos existen en ambas secuencias para producir el número de posiciones comcidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de la identidad de secuencia.

Los métodos para alinear secuencias para comparación son bien conocidos en la téenica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en, por ejemplo: Smith and Waterman (1981 ) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5: 151 -3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 -90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8: 155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31 ; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Una consideración detallada de métodos de alineación de secuencias y cálculos de homología se puede encontrar en, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

The National Center for Biotechnology Information (NCBI por sus siglas en ingles) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990)) disponible en varias fuentes, incluyendo el National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), y en internet, para ser usado con respecto a varios programas de análisis de secuencia. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia usando este programa se encuentra disponible en internet bajo la sección “help” para BLAST™. Para comparaciones de secuencias de ácido nucleico, la función “Blast 2 sequences” del programa BLAST™ (Blastn) puede usarse, usando la matriz BLOSUM62 predeterminada configurada a parámetros predeterminados. Las secuencias de ácido nucleico con incluso mayor similitud a las secuencias de referencia mostrarán identidad de porcentaje en aumento cuando se evalúen por este método.

Específicamente hibridizable/Específicamente complementaria: Como se usan aquí, los términos “Específicamente hibridizable” y “específicamente complementaria” son términos que indican un grado suficiente de complementariedad , de modo que ocurra unión estable y especifica entre la molécula de ácido nucleico y una molécula objetivo de ácido nucleico. La hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico involucra la formación de una alineación anti paralela entre las secuencias de ácido nucleico de las dos moléculas de ácido nucleico. Las dos moléculas son después capaces de formar enlaces de hidrógeno con las bases correspondientes en la cadena opuesta para formar una molecula doble que, si es suficientemente estable, es detectable usando métodos bien conocidos en el campo. Una molécula de ácido nucleico no necesita ser 100% complementaria a su secuencia objetivo para ser específicamente hibridizable. Sin embargo, la cantidad de complementariedad de secuencia que debe existir para que la hibridación sea específica, es una función de las condiciones de hibridación usadas.

Las condiciones de hibridación que resulten en grados particulares de severidad, variarán dependiendo de la naturaleza del método de hibridación elegido y de la composición y longitud de las secuencias de ácido nucleico en hibridación. Generalmente, la temperatura de hibridación y la fuerza iónica (especialmente la concentración de Na+ y/o Mg + + ) del amortiguador de hibridación determinará la severidad de la hibridación aunque los tiempos de lavado influyen en la severidad . Los cálculos relacionados con las condiciones de hibridación requeridas para lograr grados particulares de severidad son conocidos por los expertos en la téenica y son discutidos, por ejemplo, en Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , vol. 1 -3, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 1 1 ; and Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, I RL Press, Oxford, 1985. Instrucción y orientación detallada adicional con respecto a la hibridación de ácidos nucleicos se puede encontrar, por ejemplo, en Tijssen , “OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,” en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; y Ausubel et al. , Eds. , Current Protocois in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wilcy-lnterscience, NY, 1995.

Como se usa aquí, “condiciones severas” comprenden condiciones bajo las cuales la hibridación solo ocurrirá si hay menos del 20% de no comcidencia entre la molecula de hibridación y una secuencia homologa dentro de la molécula meta de ácido nucleico. Las “Condiciones severas” incluyen niveles particulares adicionales de severidad. Así, como se usa aquí, condiciones de “severidad moderada” son aquellas bajo las cuales las moléculas con más del 20% de no coincidencia de secuencia no se hibridarán; condiciones de “severidad alta” son aquellas bajo las cuales las secuencias con más del 10% de no coincidencia no se hibridarán y condiciones de “severidad muy alta” son aquellas bajo las cuales las secuencias con más del 5% de no coincidencia no se hibridarán.

Las siguientes son condiciones de hibridaciones representativas, no limitantes.

Condición de alta severidad (detecta secuencias que comparten al menos 90% de identidad de secuencia); Hibridación en amortiguador 5x SSC a 65°C durante 16 horas; lave dos veces en amortiguador 2x SSC a temperatura ambiente durante 15 minutos cada vez; y lave dos veces en amortiguador 0.5x SSC a 65°C durante 20 minutos cada vez.

Condición de moderada severidad (detecta secuencias que comparten al menos 80% de identidad de secuencia): Hibridación en amortiguador 5x-6x SSC a 65-70°C durante 16-20 horas; lave dos veces en amortiguador 2x SSC a temperatura ambiente durante 5-20 minutos cada vez; y lave dos veces en amortiguador 1 x SSC a 55-70°C durante 30 minutos cada vez.

Condición de control de no severidad (secuencias que comparten al menos 50% de identidad de secuencia se hibridarán): Hibridación en amortiguador 6x SSC a temperatura ambiente a 55°C durante 16-20 horas; lave al menos dos veces en amortiguador 2x-3x SSC a temperatura ambiente a 55°C durante 20-30 minutos cada vez.

Como se usa aquí, el termino “sustancialmente homólogo” o “homología sustancial”, con respecto a una secuencia adyacente de ácido nucleico, se refiere a secuencias adyacentes de nucleótidos que se hibridan bajo condiciones severas a la secuencia de referencia del ácido nucleico. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente homologas a una secuencia de referencia de ácido nucleico son aquellas secuencias de ácido nucleico que hibridan bajo condiciones severas (por ejemplo, las condiciones de moderada severidad establecidas, supra) a la secuencia de referencia del ácido nucleico. Secuencias sustancialmente homólogas pueden tener al menos 80% de identidad de secuencia. Por ejemplo, las secuencias sustancialmente homólogas pueden tener de aproximadamente 80% a 100% de identidad de secuencia, como aproximadamente 81 %; aproximadamente 82%; aproximadamente 83% ; aproximadamente 84%; aproximadamente 85% ; aproximadamente 86%; aproximadamente 87%; aproximadamente 88%; aproximadamente 89%; aproximadamente 90%; aproximadamente 91 %; aproximadamente 92%; aproximadamente 93%; aproximadamente 94% aproximadamente 95%; aproximadamente 96%; aproximadamente 97%; aproximadamente 98%; aproximadamente 98.5% ; aproximadamente 99%; aproximadamente 99.5%; y aproximadamente 100%. La propiedad de homología sustancial está estrechamente relacionada a hibridación específica. Por ejemplo, una molecula de ácido nucleico es específicamente hibridizable cuando hay suficiente grado de complementariedad para evitar unión no específica del ácido nucleico a secuencias no meta bajo condiciones donde se desea la unión específica, por ejemplo, bajo condiciones severas de hibridación.

Como se usa aquí, el término “ortólogo” se refiere a un gen en dos o más especies que han evolucionado de una secuencia ancestral común de nucleótido y que puede retener la misma función en las dos o más especies.

Como se usa aquí, dos moléculas de secuencia de ácido nucleico se dice que exhiben “complementariedad completa” cuando cada nucleótido de una lectura de secuencia en la dirección 5 a 3 es complementaria a cada nucleótido de la otra secuencia cuando lee en la 3 a 5 dirección. Una secuencia de nucleótido que es complementaria a una secuencia de referencia de nucleótido exhibirá una secuencia identica a la secuencia de complemento inversa de la secuencia de referencia del nucleótido. Estos términos y descripciones están bien definidos en el campo y son fácilmente comprendidos por los expertos en la téenica.

Cuando se determina el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de aminoácidos, es bien conocido por los expertos en la técnica que la identidad del aminoácido en una posición dada proporcionada por una alineación puede diferir sin afectar las propiedades deseadas de los polipéptidos que comprenden las secuencias alineadas. En estos casos, la identidad de secuencia porcentual se puede ajustar para explicar la similitud entre aminoácidos sustituidos conservadoramente. Estos ajustes son bien conocidos y comúnmente usados por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo. , Myers and Miller (1988) Computer Applications in Biosciences 4:1 1 -7.

Las modalidades de la invención incluyen variantes funcionales de secuencias ejemplares de aminoácidos de péptidos de tránsito de plástido, y secuencias de ácido nucleico que codifican el mismo. Una variante funcional de una secuencia ejemplar de peptido de tránsito puede ser, por ejemplo, un fragmento de una secuencia ejemplar de aminoácido de péptidos de tránsito (como un fragmento de terminal N o terminal C), o una secuencia modificada de una secuencia ejemplar de longitud total 5 de aminoácido de péptido de tránsito o fragmento de una secuencia ejemplar de aminoácido de péptido de tránsito. Una secuencia ejemplar de aminoácido péptido de tránsito puede ser modificada en algunas modalidades introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos conservadores. Una sustitución de 10 aminoácido “conservador” es una en la que el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral funcional similar, tamaño similar y/o similar hidrofobicidad. Las familias de aminoácidos que pueden ser usadas para reemplazar otro aminoácido de la misma familia ís para introducir una sustitución conservadora son conocidas en la téenica. Por ejemplo, estas familias de aminoácidos incluyen: Aminoácidos básicos ( por ejemplo, Usina, arginina, e histidina); aminoácidos ácidos ( por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico); aminoácidos polares sin carga (a pH fisiológico) ( por 20 ejemplo, glicina, asparaginas, glutamina, serina, treonina, tirosina, y citosina); aminoácidos no polares ( por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, y triptófano); aminoácidos beta ramificados ( por ejemplo, treonina, valina, e isoleucina); aminoácidos aromáticos 25 ( por ejemplo. , tirosina, fenilalanina, triptófano, e histidina). Ver, por ejemplo. , Sambrook Innis et al. , PCR Protocole: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, NY, USA.

Unido operablemente: Una primera secuencia de nucleótido está “unida operablemente” con una segunda secuencia de nucleótido cuando la primera secuencia está en una relación funcional con la segunda secuencia. Por ejemplo, un promotor está unido operablemente a una secuencia de codificación si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. Cuando se produce por recombinación , las secuencias de nucleótido unidas operablemente están generalmente adyacentes y, cuando es necesario unir dos regiones de codificación de proteínas, en el mismo marco de lectura. Sin embargo, las secuencias de nucleótido no necesitan estar adyacentes para estar unidas operablemente.

El termino, “unido operablemente”, cuando se usa en referencia a una secuencia reguladora y una secuencia de codificación, significa que la secuencia reguladora afecta la expresión de la secuencia de codificación unida. Las “secuencias reguladoras” o “elementos de control”, se refieren a secuencias de nucleótidos que influyen en el tiempo y nivel/cantidad de transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN, o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores; secuencias líderes de traducción; intrones; potenciadores; estructuras de tallo-lazo; secuencias de unión de represor; secuencias de finalización; secuencias de reconocimiento de poliadeniiación, etcetera. Las secuencias reguladoras particulares pueden estar localizadas corriente arriba y/o corriente debajo de una secuencia de codificación unida operablemente a ello. También, las secuencias reguladoras particulares unidas operablemente a una secuencia de codificación pueden estar localizadas en la cadena complementaria asociada de una molécula de ácido nucleico de cadena doble.

Cuando se usa en referencia a dos o más secuencias de aminoácidos, el término “unido operablemente” significa que la primera secuencia de aminoácido está en relación funcional con al menos una de las secuencias adicionales de aminoácido. Por ejemplo, un péptido de tránsito (por ejemplo, un CTP) está unido operablemente a una segunda secuencia de aminoácido dentro de un polipéptido que comprende ambas secuencias si el péptido de tránsito afecta la expresión o el tráfico del polipéptido o segunda secuencia de aminoácido.

Promotor: Como se usa aquí, el término “promotor” se refiere a una región del ADN que puede estar corriente arriba del inicio de la transcripción, y que puede estar involucrada en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un promotor puede estar operablemente unido a una secuencia de codificación para expresión en una célula, o un promotor puede estar operablemente unido a una secuencia de nucleótido codificando una secuencia de señal que puede estar operablemente unida a una secuencia de codificación para expresión en una celula. Un “promotor de planta” puede ser un promotor capaz de iniciar la transcripción en células de plantas. Ejemplos de promotores bajo control del desarrollo incluyen promotores que inician de manera preferente la transcripción en ciertos tejidos como hojas, raíces, semillas, fibras, vasos de xilema, traqueidas y esclerénquima Tales promotores son conocidos como “preferidos del tejido”. Los promotores que inician la transcripción solamente en ciertos tejidos son conocidos como “específicos del tejido”. Un promotor “específico del tipo de célula” activa primordialmente la expresión en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raíces u hojas. Un promotor “inducible” puede ser un promotor que puede estar bajo control ambiental. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden iniciar la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas y la presencia de luz. Los promotores específicos del tejido, preferidos del tejido, específicos del tipo de célula e inducibles constituyen la clase de promotores “no constitutivos”. Un promotor “constitutivo” es un promotor que puede estar activo bajo la mayoría de condiciones ambientales.

Cualquier promotor inducible puede ser usado en algunas modalidades de la invención. Ver Ward et al. (1993) Plant Mol.

Biol. 22:361 -366. Con un promotor inducible, la tasa de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor. Los promotores ejemplares inducibles, incluyen pero no están limitados a: Los promotores del sistema ACEI que responden al cobre; In2 gen del maíz que responde a protectores de herbicidas de bencensulfonamida; represor Tet de Tn 10; y el promotor inducible de un gen hormonal esteroide, la actividad de transcripción de la cual puede ser inducida por una hormona glucocorticosteroide (Schena et al. (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:0421 ).

Los promotores ejemplares constitutivos, incluyen pero no están limitados a: Promotores de virus de planta, como el promotor 35S de CaMV; promotores de genes actina de arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona H3 de maíz; y el promotor ALS, fragmento 5 de Xba1 /Ncol al gen estructural Brassica napus ALS3 (o una similitud de secuencia de nucleótido a dicho fragmento de Xba1/Ncol ) (Publicación PCT Internacional No. WO 96/30530).

Adicionalmente, cualquier promotor específico de tejido o preferido de tejido puede ser usado en algunas modalidades de la invención. Las plantas transformadas con una molecula de ácido nucleico que comprenden una secuencia de codificación unida operablemente a un promotor específico de tejido pueden producir el producto de la secuencia de codificación exclusiva o preferencialmente en un tejido específico. Los promotores ejemplares específicos de tejido o preferidos de tejidos incluyen pero no están limitados a: Un promotor preferido de raíz, como el del gen faseolina; un promotor específico de hoja y un promotor inducido por la luz como el del cab o rubisco un promotor específico de antera como el del LA T52\ un promotor específico de polen como el del Zm 13 y un promotor específico de microsporas como el del apg.

Transformación: Como se usa aquí, el termino “transformación” o “transducción” se refiere a la transferencia de una o más moléculas de ácido nucleico en una célula. Una célula es “transformada” por una molécula de ácido nucleico transducida en la célula cuando la molécula de ácido nucleico se vuelve establemente replicada por la célula, ya sea por la incorporación de la molécula de ácido nucleico en el genoma celular o por replicación episomal. Como se usa aquí, el término “transformación” incluye todas las téenicas por las cuales una molécula de ácido nucleico puede ser introducida en tal célula. Ejemplos incluyen pero no están limitados a: Transfección con vectores virales; transformación con vectores plásmidos; electroporación (Fromm et al. (1986) Nature 319:791 -3); lipofección (Felgner et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413-7); micromyección (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); transferencia mediada por Agrobacterium (Fralcy et al. (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:4803-7); absorción directa de ADN ; y bombardeo de microproyectiles (Klein et al. (1987) Nature 327:70).

Transgen: Una secuencia de ácido nucleico exógeno. En algunos ejemplos, un transgén puede ser una secuencia que codifica un polipéptido que comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica. En ejemplos particulares, un transgén puede codificar un polipéptido que comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica sintética y por lo menos una secuencia adicional de péptido (por ejemplo, una secuencia de péptido que confiere resistencia a los herbicidas), para lo cual es deseable una expresión plástido. En estos y otros ejemplos, un transgén puede contener secuencias reguladoras unidas operativamente a una secuencia de codificación del transgén (por ejemplo, un promotor). Para los propósitos de esta descripción, el término “transgénico”, cuando se usa para referirse a un organismo (por ejemplo, una planta), se refiere a un organismo que comprende la secuencia de ácido nucleico exógeno. En algunos ejemplos, el organismo que comprende la secuencia de ácido nucleico exógeno puede ser un organismo dentro del cual se introdujo la secuencia de ácido nucleico por medio de téenicas de transformación molecular. En otros ejemplos, el organismo que comprende la secuencia de ácido nucleico exógeno puede ser un organismo dentro del cual se introdujo la secuencia de ácido nucleico a través de, por ejemplo, introgresión o polinización cruzada en una planta.

Transporte: Tal y como se usa en el presente documento, los términos “transporte”, “destino” y “transferencia” se refieren a la propiedad de ciertas secuencias de aminoácidos de la invención que facilita el movimiento de un polipeptido que comprende la secuencia de aminoácido desde el núcleo de una célula huésped dentro de un plástido de la célula huésped. En modalidades particulares, una secuencia de aminoácido así (es decir, una secuencia CTP derivada de Brassica) puede ser capaz de transportar aproximadamente 100%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 60%, y/o por lo menos aproximadamente 50% de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácido dentro del plástido de una célula huésped.

Vector: Una molécula de ácido nucleico tal y como es introducida dentro de una célula, por ejemplo, para producir una célula transformada. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en la célula huésped, como un origen de replicación. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no están limitados a: un plásmido, cósmido; bacteriófago; o virus que transporta ADN exógeno dentro de una célula. Un vector también puede incluir uno o más genes, moléculas antisentido y/o genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la téenica. Un vector puede transducir, transformar o infectar a una célula, causando así que la célula exprese las moléculas de ácido nucleico y/o proteínas codificadas por el vector.

Opcionalmente, un vector incluye materiales para ayudar a que la molecula de ácido nucleico entre en la célula (por ejemplo, un liposoma, recubrimiento de proteína, etcétera).

A menos que se indique o se implique específicamente, los términos “un” “uno” y “el” significa “al menos uno”, como se acostumbra en el presente documento.

A menos que se explique específicamente de otra manera, todos los términos téenicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado, como los entienden comúnmente aquellos que son expertos en la técnica a la que pertenece esta descripción. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en, por ejemplo, Lewin B. , Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew y otros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology (La Enciclopedia de Biología Molecular) , Blackwell Science Ltd ., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Mcyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Biología Molecular y Biotecnología: Una Obra de Referencia Integral), VCH Publishers, Inc. , 1995 (ISBN 1 -56081 -569-8). Todos los porcentajes son por peso y todas las proporciones de mezcla de solventes son por volumen, a menos que se indique de otra manera. Todas las temperaturas son en grados Celsius.

IV. Moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de codificación CTP derivada de Brassica sintética En algunas modalidades, esta descripción proporciona una molecula de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de nucleótido que codifica un CTP derivado de Brassica sintético unido operativamente a una secuencia de nucleótido de interés. En modalidades particulares, la secuencia de nucleótido de interés puede ser una secuencia de nucleótido que codifica una polipéptido de interés. En ejemplos particulares, se proporciona una sola molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde una secuencia TraP8 o TraP9 se fusiona con un N-terminal de un polipéptido de interés.

Un CTP derivado de Brassica sintético se puede derivar de un gen EPSPS Brassica. En ejemplos particulares de estas modalidades, el gen EPSPS Brassica puede ser uno que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida como SEC ID No. : 14, o una secuencia de ácido nucleico homóloga de un gen EPSPS diferente, o un ortólogo del gen EPSPS Brassica que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida como SEC ID No.: 14 (por ejemplo, el gen EPSPS Brassica que comprende la secuencia de ácido nucleico establecida como SEC ID No. : 15).

En algunas modalidades, un péptido de tránsito del cloroplasto derivado de Brassica sintético, puede ser un CTP derivado de Brassica imaginario. Un CTP derivado de Brassica imaginario sintético se puede derivar de una secuencia CTP Brassica de referencia uniendo una primera secuencia contigua de aminoácido comprendida dentro de la secuencia CTP Brassica de referencia a una segunda secuencia contigua de aminoácido comprendida dentro de una secuencia CTP diferente (por ejemplo, una segunda secuencia CTP Brassica). En modalidades particulares, la secuencia CTP diferente que comprende la segunda secuencia contigua de aminoácido puede ser codificada por una secuencia de gen homólogo desde un genoma distinto al de Brassica sp. , del cual se obtuvo la secuencia de referencia (por ejemplo, un Brassica sp. Diferente, una planta distinta a un Brassica sp.; un eucariota fotosintetico inferior, por ejemplo, un Clorofito; y un procariota, por ejemplo, un Cyanobacterium o Agrobacterium). De esta manera, una secuencia de nucleótido que codifica un CTP derivado de Brassica sintético se puede derivar de una secuencia de gen que codifica un CTP Brassica de referencia, fusionando una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido contigua de la secuencia CTP Brassica de referencia con una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácido contigua desde una secuencia CTP diferente que es homologa al resto de la secuencia CTP Brassica de referencia. En estos y otros ejemplos, la secuencia contigua de aminoácido de la secuencia CTP Brassica de referencia se puede localizar en el extremo 5 o el extremo 3 del CTP derivado de Brassica sintético.

En algunas modalidades, un CTP derivado de Brassica imaginario sintético, se puede derivar de una pluralidad de secuencias CTP Brassica (incluyendo una secuencia CTP Brassica de referencia) uniendo una secuencia de aminoácido contigua que comprende dentro de una secuencia CTP Brassica a una secuencia de aminoácido contigua comprendida dentro de una secuencia CTP Brassica diferente. En modalidades particulares, la pluralidad de secuencias CTP Brassica pueden ser codificadas por secuencias de gen ortólogo en diferentes especies de Brassica. En algunos ejemplos, la pluralidad de secuencias CTP de Brassica pueden ser exactamente dos secuencias CTP Brassica. De esta manera, una secuencia de nucleótido que codifica un CTP derivado de Brassica imaginario sintetico se puede derivar de dos secuencias homologas (por ejemplo, sustancialmente homólogas) de gen que codifican CTP Brassica (por ejemplo, dos secuencias de gen ortólogas) fusionando la secuencia de nucleótido que codifica una secuencia contigua de aminoácido de una de las secuencias CTP Brassica con la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia contigua de aminoácido desde de las otras de las secuencias CTP Brassica que es homóloga al resto de la primera secuencia CTP Brassica. TraP8 y TraP9 son ejemplos ilustrativos de este CTP derivado de Brassica imaginario sintético.

Un experto en la téenica comprenderá que, después de la selección de una primera secuencia contigua de aminoácido dentro de una secuencia CTP Brassica de referencia, la identificación y selección de la secuencia contigua de aminoácido del resto de una secuencia CTP homóloga, de acuerdo con el anterior proceso de derivación es inequívoca y automática. En algunos ejemplos, la primera secuencia contigua de aminoácido puede estar entre aproximadamente 25 y aproximadamente 41 aminoácidos en longitud (por ejemplo, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , y 42 aminoácidos de longitud). En algunas modalidades, la primera secuencia contigua de aminoácido dentro de la secuencia CTP Brassica de referencia está definida por la posición en el extremo 3 de un motivo “SVSL” (SEC I D No. : 13) que está conservado dentro de algunos genes EPSPS Brassica.

Los ejemplos de secuencias CTP derivadas de Brassica imaginario sintetico, de acuerdo con el anterior proceso, están representados por SEC I D No. : 3 y SEC ID No. : 4. En vista de la degeneración del código genético, el género de secuencias de nucleótido que codifican a estos péptidos será concebido de inmediato por alguien que sea experto en la téenica. Los ejemplos de estas secuencias de polinucleótidos incluyen SEC ID Nos.: 5, 6, 8 y 9. Estos ejemplos particulares ilustran las características estructurales de CTPs derivados de Brassica imaginarios sintéticos incorporando secuencias contiguas de un CTP homólogo de uno de varios ortólogos ESPSP de un gen ESPSP B. napus.

Algunas modalidades incluyen variantes funcionales de un péptido de tránsito de cloroplasto derivado de Brassica sintético, y/o ácidos nucleicos que codifican al mismo. Estas variantes funcionales incluyen, por ejemplo y sin limitación: una secuencia que codifica CTP derivado de Brassica sintetico que se deriva de un homólogo y/u ortólogo de una o ambas las secuencias de codificación CTP Brassica establecidas como SEC ID Nos. : 14 y/o SEC ID No. : 15, y/o un CTP codificado de este modo; un ácido nucleico que codifica un CTP derivado de Brassica sintético que comprende una secuencia contigua de aminoácido dentro de SEC ID No. : 1 y/o SEC I D No. : 2; y/o un CTP codificado de este modo; una secuencia de codificación de CTP derivado de Brassica sintético truncado que comprende una secuencia de ácido nucleico contigua dentro de uno de SEC I D Nos. : 5, 6, 8 y 9; una secuencia de codificación CTP derivada de Brassica sintético truncado que comprende una secuencia contigua de ácido nucleico que es esencialmente homologa a una de las SEC I D Nos. : 5, 6, 8 y 9; un CTP derivado de Brassica sintético truncado que comprende una secuencia contigua de aminoácido dentro de uno de los SEC ID Nos. : 3 y 4; un ácido nucleico que codifica un CTP derivado de Brassica sintético que comprende una secuencia contigua de aminoácido dentro de uno de los SEC ID Nos. : 5, 6, 8 y 9, y/o un CTP codificado de tal modo; un ácido nucleico que codifica un CTP derivado de Brassica sintético que comprende una secuencia contigua de aminoácido dentro de uno de los SEC ID Nos. : 3 y 4 que tiene uno o más sustituciones conservadoras de aminoácido y/o un CTP codificado de este modo; y un ácido nucleico que codifique un CTP derivado de Brassica sintético que comprende una secuencia contigua de aminoácido dentro de uno de SEC I D Nos. : 3 y 4 que tiene una o más sustituciones de aminoácido no conservadoras que se demuestra que dirigen un peptido unido operativamente a un plástido en una célula que contiene plástido, y/o un CTP codificado de este modo.

De este modo, algunas modalidades de la invención incluyen una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un CTP derivado de Brassica imaginario sintético que comprende una o más sustituciones de aminoácido conservadoras. Esta molécula de ácido nucleico puede ser útil, por ejemplo, para facilitar la manipulación de una secuencia de codificación CTP de la invención en téenicas de biología molecular. Por ejemplo, en algunas modalidades, una secuencia de codificación CTP de la invención se puede introducir en un vector adecuado para sub-clonar la secuencia en un vector de expresión, o una secuencia de codificación CTP de la invención se puede introducir en una molécula de ácido nucleico que facilita la producción de una molécula de ácido nucleico adicional que comprende la secuencia de codificación CTP unida operativamente a una secuencia de nucleótido de interés. En estas modalidades y en modalidades adicionales, se pueden suprimir una o más posiciones de aminoácido en la secuencia de un CTP derivado de Brassica imaginario sintético. Por ejemplo, la secuencia de un CTP derivado de Brassica imaginario sintético se puede modificar de manera tal que se supriman los aminoácidos en las posiciones 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 en la secuencia CTP. Una alineación de secuencias CTP homologas se puede usar para proporcionar orientación en cuanto a cuáles aminoácidos se pueden suprimir sin afectar la función del CTP sintetico.

En ejemplos particulares, un péptido de tránsito de cloroplasto derivado de Brassica sintético es menos que 80 aminoácidos en longitud. Por ejemplo, un CTP derivado de Brassica sintético puede ser 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71 , 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61 , 60, o menos aminoácidos en longitud . En ciertos ejemplos, un CTP derivado de Brassica sintético puede tener aproximadamente 65, aproximadamente 68, aproximadamente 72 o aproximadamente 74 aminoácidos de longitud . En estos y en ejemplos adicionales, un CTP derivado de Brassica sintético puede comprender una secuencia de aminoácido establecida en una de SEC I D Nos. : 3 y 4, o una variante funcional de cualquiera de las anteriores. De esta manera, un CTP derivado de Brassica sintético puede comprender una secuencia de aminoácido que comprende uno de SEC ID Nos. : 3 y 4, o una variante funcional de los mismos, en donde la longitud del CTP derivado de Brassica sintético tiene menos de 80 aminoácidos en longitud. En ciertos ejemplos, un CTP derivado de Brassica sintético puede comprender una secuencia de aminoácido que es, por ejemplo, por lo menos 80% , por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 92%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o 100% identica a una de SEC ID Nos. : 3 y 4.

Todas las secuencias de nucleótidos que codifican un CTP derivado de Brassica sintético particular, por ejemplo, el péptido TraP8 de SEC ID No. : 3 y el péptido TraP9 de SEC ID No. : 4, o variantes funcionales de cualquiera de los anteriores, incluyendo cualesquiera supresiones específicas y/o sustituciones conservadoras de aminoácidos, serán reconocibles por aquellos que sean expertos en la téenica en vista de la actual descripción. La degeneración del código genético proporciona un número finito de secuencias de codificación para una secuencia de aminoácido particular. La selección de una secuencia particular para codificar un CTP derivado de Brassica sintético está dentro de la discreción del profesional. Diferentes secuencias de codificación pueden ser deseables en diferentes aplicaciones. Por ejemplo, para aumentar la expresión del CTP derivado de Brassica sintético en un huésped particular, se puede seleccionar una secuencia de codificación que refleje la predisposición de uso de codón del huésped . A modo de ejemplo, un CTP derivado de Brassica sintético puede ser codificado por una secuencia de nucleótido establecida como una de SEC I D Nos. : 5, 6, 8 y 9.

En moléculas de ácido nucleico que se proporcionan en algunas modalidades de la invención, el último codón de una secuencia de nucleótido que codifica un CTP derivado de Brassica sintético y el primer codón de una secuencia de nucleótido de interes pueden estar separados por cualquier número de tripletes de nucleótidos, por ejemplo, sin codificar para un intrón o un “STOP”. En algunos ejemplos, una secuencia que codifica los primeros aminoácidos de una proteína madura normalmente asociados con un péptido de tránsito de cloroplasto en un polipéptido precursor natural, puede estar presente entre el último codón de una secuencia de nucleótidos que codifica un CTP derivado de Brassica sintético y el primer codón de una secuencia de nucleótido de interés. Una secuencia que separa una secuencia de nucleótido que codifica un CTP derivado de Brassica sintético y el primer codón de una secuencia de nucleótido de interés puede, por ejemplo, consistir de cualquier secuencia, de tal forma que la secuencia de aminoácido codificada probablemente no altere de forma significativa la traslación del polipéptido imaginario y su translocación a un plástido. En estas y otras modalidades, el último codón de una secuencia de nucleótidos que codifica a un péptido de tránsito de cloroplasto derivado de Brassica sintético, se puede fusionar en fase-registro con el primer codón de la secuencia de nucleótidos de interés directamente contigua al mismo, o separada del mismo por no más de una secuencia de péptido corta, como aquella codificada por un enlazador de nucleótido sintético (por ejemplo, un enlazador de nucleótido que puede haberse usado para lograr la fusión).

En algunas modalidades, puede ser aconsejable modificar los nucleótidos de una secuencia de nucleótido de interes y/o una secuencia de codificación de CTP derivado de Brassica sintético fusionada en la misma en una sola secuencia de codificación, por ejemplo, para incrementar la expresión de la secuencia de codificación en un huésped particular. El código genético es redundante con 64 codones posibles, la mayoría de los organismos usan preferentemente un subconjunto de estos codones. Los codones que son usados en la mayoría de los casos en una especie son llamados codones óptimos, y aquellos no usados muy frecuentemente se clasifican como codones raros o de poco uso. Zhang y otros (1991 ) Gen 105:61 -72. Los codones se pueden sustituir para reflejar el uso preferido del codón de un huésped particular en un proceso algunas veces llamado “optimización de codón”. Las secuencias de codificación optimizadas que contienen codones preferidos por un huésped procariótico o eucariótico particular pueden ser preparadas, por ejemplo, para aumentar el índice de traslación o para producir transcripciones de ARN recombinante que tengan propiedades deseables (por ejemplo, una vida media más larga, comparado con transcripciones producidas de una secuencia no optimizada).

Cualquier polipéptido puede ser dirigido a un plástido de una célula que contiene plástido mediante incorporación de una secuencia CTP derivada de Brassica sintético. Por ejemplo, un polipéptido puede estar enlazado a una secuencia CTP derivada de Brassica sintético en algunas modalidades, a fin de dirigir el polipeptido a un plástido en una célula en donde se expresa la molécula CTP-polipéptido enlazados. En modalidades particulares, un polipéptido dirigido a un plástido por incorporación de una secuencia CTP derivado de Brassica sintético puede ser, por ejemplo, un polipéptido que normalmente se expresa en un plástido de una célula en donde el polipéptido se expresa de forma originaria. Por ejemplo y sin limitación, un polipéptido dirigido a un plástido por incorporación de una secuencia CTP derivada de Brassica sintético puede ser un polipéptido involucrado en resistencia a herbicidas, resistencia a virus, resistencia a patógenos bacterianos, resistencia a insectos, resistencia a nematodos o resistencia micótica. Ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses 5,569,823; 5,304,730; 5,495,071 ; 6,329,504; y 6,337,431. Un polipéptido dirigido a un plástido por incorporación de una secuencia CTP derivada de Brassica sintético puede ser alternativamente, por ejemplo y sin limitación, un polipéptido involucrado en el vigor o producción de una planta (incluyendo polipéptidos involucrados en tolerancia para temperaturas extremas, condiciones de suelo, niveles de luz, niveles de agua y ambiente químico), o un polipéptido que puede ser usado como un marcador para identificar una planta que comprende un rasgo de interés (por ejemplo, un producto de gen marcador seleccionable, un polipéptido involucrado en el color de la semilla, etcétera).

Ejemplos no limitantes de polipéptidos involucrados en resistencia a herbicidas que pueden estar vinculados a una secuencia CTP derivada de Brassica sintetica en algunas modalidades de la invención incluyen: sintasa acetolactasa (ALS por sus siglas en inglés), ALS mutado y precursores de ALS (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense 5,013,659); EPSPS (ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses 4,971 ,908 y 6,225, 1 14), como un CP4 EPSPS, EPSPS clase II I , o EPSPS clase IV; enzimas que modifican un proceso fisiológico que ocurre en un plástido, incluyendo fotosíntesis, y síntesis de ácidos grasos, aminoácidos, aceites, arotenoides, terpenoides, almidón, etcétera. Otros ejemplos no limitantes de polipéptidos que pueden estar vinculados a un péptido de tránsito de cloroplasto derivado de Brassica sintética en modalidades particulares incluyen: zeaxantina epoxidasa, colina monooxigenasa, ferroquelatasa, desaturasa de ácido graso omega 3, glutamina sintetasa, enzimas modificadoras de almidón, polipéptidos involucrados en síntesis de aminoácidos esenciales, provitamina A, hormonas, proteínas de toxina Bt, etcétera. Las secuencias de nucleótidos que codifican a los péptidos arriba mencionados se conocen en la téenica, y estas secuencias de nucleótidos pueden estar unidas operativamente a una secuencia de nucleótido que codifica un CTP derivado de Brassica sintética para ser expresado en un polipéptido que comprende el polipéptido de interés enlazado al CTP derivado de Brassica sintética. Más aún, las secuencias de nucleótidos adicionales que codifican a cualquiera de los polipeptidos arriba mencionados pueden ser identificadas por aquellos que son expertos en la téenica (por ejemplo, por clonación de genes con homología elevada a otros genes que codifican al polipéptido particular). Una vez que esta secuencia de nucleótidos ha sido identificada, es un proceso directo para diseñar una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia que codifica a CTP derivado de Brassica sintética unido operativamente a la secuencia de nucleótido identificada, o una secuencia que codifica a un polipéptido equivalente.

V. Expresión de polipéptidos que comprenden un péptido de tránsito de cloroplasto derivado de Brassica sintética En algunas modalidades, por lo menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica sintética, o equivalente funcional del mismo, puede ser introducida en una célula, tejido u organismo para expresión del polipéptido en el mismo. En modalidades particulares, una molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótido de interés unida operativamente a una secuencia de nucleótido que codifica un CTP derivado de Brassica sintética. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico puede comprender una secuencia de codificación que codifica un polipéptido que comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica sintética y por lo menos una secuencia de péptido adicional codificada por una secuencia de nucleótido de interés.

En algunas modalidades, una molecula de ácido nucleico de la invención puede ser introducida en una célula, tejido u organismo huésped que contenga plástido (por ejemplo, una célula de planta, tejido de planta y planta), de tal modo que un polipéptido puede ser expresado desde la molécula de ácido nucleico en la célula, tejido u organismo huésped que contiene plástido, en donde el polipéptido expresado comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica sintética y por lo menos una secuencia de péptido adicional codificada por una secuencia de nucleótido de interés. En ciertos ejemplos, el CTP derivado de Brassica sintética de semejante polipéptido expresado puede facilitar el dirigir una porción del polipéptido que comprende por lo menos la secuencia de péptido adicional a un plástido de la célula, tejido u organismo huésped.

En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico de la invención puede ser introducida en una célula que contiene plástido por una de las metodologías conocidas por los expertos en la téenica. En modalidades particulares, una célula, tejido u organismo huésped puede ser contactado con una molécula de ácido nucleico de la invención a fin de introducir la molécula de ácido nucleico en la célula, tejido u organismo. En modalidades particulares, una célula puede ser transformada con una molécula de ácido nucleico de la invención, de tal modo que la molécula de ácido nucleico es introducida dentro de la célula, y la molécula de ácido nucleico es integrada de forma estable dentro del genoma de la celula. En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico que comprende por lo menos una secuencia de nucleótido que codifica un CTP derivado de Brassica sintética unido operativamente a una secuencia de nucleótido de interés, se puede usar para la transformación de una célula, por ejemplo, una célula que contiene plástido (por ejemplo, la célula de una planta). A fin de iniciar o incrementar la expresión, una molécula de ácido nucleico puede comprender una o más secuencias reguladoras, y estas secuencias reguladoras pueden estar unidas operativamente a la secuencia de nucleótido que codifica a un polipéptido que comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica sintética.

Una molécula de ácido nucleico puede, por ejemplo, ser un sistema de vector incluyendo, por ejemplo, un plásmido lineal o un plásmido circular cerrado. En modalidades particulares, el vector puede ser un vector de expresión. Las secuencias de ácido nucleico de la invención pueden, por ejemplo, ser insertadas dentro de un vector, de tal modo que la secuencia de ácido nucleico esté unida operativamente a una o más secuencias reguladoras. Muchos vectores están disponibles para este propósito, y la selección del vector particular puede depender, por ejemplo, del tamaño del ácido nucleico que va a ser insertado dentro del vector y la célula huésped particular que va a ser transformada con el vector. Un vector normalmente contiene varios componentes, cuya identidad depende de una función del vector (por ejemplo, amplificación del ADN y expresión de ADN), y la celula huésped particular con la que es compatible el vector.

Algunas modalidades pueden incluir un vector de transformación de la planta que comprende una secuencia de nucleótido que comprende por lo menos una de las secuencias reguladoras arriba descritas unidas operativamente a una o más secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica sintético. La secuencia o más secuencias de nucleótidos pueden ser expresadas, bajo el control de las secuencias reguladoras, en una célula, tejido u organismo de la planta para producir un polipéptido que comprende un CTP derivado de Brassica sintética que tiene como objetivo por lo menos una porción del polipéptido a un plástido de la célula, tejido u organismo de la planta.

En algunas modalidades, una secuencia reguladora unida operativamente a una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica sintético, puede ser una secuencia promotora que funciona en una célula huésped, como por ejemplo una célula bacteriana en donde la molécula de ácido nucleico va a ser amplificada, o una célula de la planta en donde la molécula de ácido nucleico va a expresarse. Los promotores adecuados para usarse en moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen aquellos que son inducibles, virales, sintéticos o constitutivos, y todos son bien conocidos en la téenica. Los ejemplos no limitantes de promotores que pueden ser útiles en modalidades de la invención son ofrecidos por Patente Estadounidenses Nos. 6,437,217 (promotor RS81 de maíz); 5,641 ,876 (promotor de actina de arroz); 6,426,446 (promotor RS324 de maíz); 6,429,362 (promotor PR-1 de maíz); 6,232,526 (promotor A3 de maíz); 6, 177,61 1 (promotores constitutivos de maíz); 5,322,938, 5,352,605, 5,359, 142, y 5,530, 196 (promotor 35S); 6,433,252 (promotor L3 de oleosina de maíz); 6,429,357 (promotor 2 de actina de arroz, e intrón 2 de actina de arroz); 6,294,714 (promotores inducibles por luz); 6, 140,078 (promotores inducibles por sal); 6,252, 138 (promotores inducibles por patógenos); 6, 175,060 (promotores inducibles por deficiencia de fósforo); 6,388,170 (promotores bidireccionales); 6,635,806 (promotor de gamma coixina); y Solicitud de Patente Estadounidense Serial No. 09/757,089 (promotor de aldolasa de cloroplasto de maíz).

Los promotores ejemplares adicionales incluyen promotor de sintasa nopalina (NOS por sus siglas en ingles) (Ebert y otros (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); el promotor de sintasa octopina (OCS por sus siglas en inglés) (que es transportado en plásmidos que inducen tumores de Agrobacterium tumefaciens) los promotores de caulimovirus como el promotor 19S virus de mosaico de coliflor (CaMV por sus siglas en inglés) (Lawton y otros (1987) Biología Molecular de Plantas 9:315-24); el promotor 35S CaMV (Odell y otros (1985) Nature 313:810-2; el promotor 35S de virus de mosaico de escrofularia (Walker y otros (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); el promotor de sintasa de sucrosa (Yang and Russell (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:4144-8); el promotor complejo de gen R (Chandler y otros (1989) Plant Cell 1 : 1 175-83); el promotor de gen de proteína para fijación de clorofila a/b; CaMV35S (Patente Estadounidense Nos. 5,322,938, 5,352,605, 5,359, 142 y 5,530,196); FMV35S (Patente Estadounidense Nos. 6,051 ,753 y 5,378,619); un promotor de PC1 SV (Patente Estadounidense 5,850,019); el promotor de SCP1 (Patente Estadounidense No. 6,677.503); y promotores AGRtu.nos (GenBank Acceso No. V00087); Depicker y otros (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 :561 -73; Bevan y otros (1983) Nature 304: 184-7).

En modalidades particulares, las moleculas de ácido nucleico de la invención pueden comprender un promotor específico de tejido. Un promotor específico de tejido es una secuencia de nucleótido que dirige un nivel más elevado de transcripción de una secuencia de nucleótido unida operativamente en el tejido para la cual el promotor es específico, en relación con los otros tejidos del organismo. Los ejemplos de promotores específicos de tejido incluyen, sin limitación: promotores específicos de tapete; promotores específicos de antera; promotores específicos de polen (Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 7, 141 ,424, y Publicación PCT Internacional No. WO 99/042587); promotores específicos de óvulo; (Ver, por ejemplo, Solicitud de Patente Estadounidense No. 2001 /047525 A1 ); promotores específicos de fruta (Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense Nos. 4,943,674 y 5,753,475); y promotores específicos de semilla (Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense Nos. 5,420,034 y 5,608, 152). En algunas modalidades, un promotor específico de la etapa de desarrollo (por ejemplo, un promotor activo en una etapa posterior en el desarrollo) puede usarse en una composición o metodo de la invención.

Las secuencias reguladoras adicionales que en algunas modalidades pueden estar unidas operativamente a una molécula de ácido nucleico incluyen UTR 5 situados entre una secuencia promotora y una secuencia de codificación que funcionan como una secuencia líder de traslación. La secuencia líder de traslación está presente en el mARN completamente procesado, y puede afectar el procesamiento de la transcripción primaria, y/o estabilidad del ARN. Los ejemplos de secuencias líder de traslación incluyen líderes de proteína de impacto de calor en maíz y petunia (Patente Estadounidense No. 5,362,865), líderes de proteína de recubrimiento contra virus de plantas, líderes rubisco de plantas, y otros. Ver, por ejemplo, Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Los ejemplos no limitantes de UTR 5 son proporcionados por: GmHsp (Patente Estadounidense No. 5,659, 122); PhDnaK (Patente Estadounidense No. 5,362,865); AtAntl ; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64: 1590-7); y AGRtunos (Acceso GenBank No. V00087; y Bevan y otros (1983) Nature 304: 184-7).

Las secuencias reguladoras adicionales que pueden estar unidas operativamente, en algunas modalidades, a una molecula de ácido nucleico incluyen secuencias no trasladadas 3 , regiones de terminación de transcripción 3 o regiones de poli-adenilación. Estos son elementos genéticos situados corriente abajo de la secuencia de nucleótido e incluyen polinucleótidos que proporcionan señal de poliadenllación y/u otras señales reguladoras capaces de afectar la transcripción o procesamiento de mARN. La señal de poliadenilación funciona en plantas para producir la adición de nucleótidos de poliadenilatos al extremo 3 del precursor mARN . La secuencia de poliadenilación se puede derivar de una variedad de genes de plantas, o de genes T-ADN. Un ejemplo no limitante de una región de terminación de transcripción de 3 es la región 3 de sintasa nopalina (nos 3 ; Fralcy y otros (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:4803-7). Un ejemplo del uso de diferentes regiones no trasladadas 3 se proporciona en Ingelbrecht y otros (1989) Plant Cell 1 :671 -80. Ejemplos no limitantes de señales de poliadenilación incluyen uno de un gen RbcS2 Pisum sativum (Ps. RbcS2-E9; Coruzzi y otros (1984) EMBO J . 3: 1671 -9) y AGRtu.nos (Acceso GenBank No. E01312).

Una molécula de ácido nucleico recombinante o vector de la presente invención puede comprender un marcador seleccionable que confiere un fenotipo seleccionable en una célula transformada, como por ejemplo, una celula de planta. Los marcadores seleccionables también pueden usarse para seleccionar para plantas o células de plantas que comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante de la invención. El marcador puede codificar resistencia a biocidas, resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanamicina, Geneticina (G418), bleomicina, higromicina, etcétera) o resistencia a herbicidas (por ejemplo, glifosato, etcétera). Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no están limitados a: un neo gen que codifica para resistencia a kanamicina y puede ser seleccionado para usar kanamicina, G418, etcétera, un gen pat o bar que codifica para resistencia a bialafos; un gen de sintasa EPSP muíante que codifica resistencia a glifosato; un gen de nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinilo; un gen de sintasa acetolactato mutante (ALS) que confiere resistencia a imidazolinona o sulfonilurea; y un gen DHFR resistente a metotrexato. Múltiples marcadores seleccionables están disponibles que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina y tetracielina, y similares. Ejemplos de estos marcadores seleccionables se ilustran en, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos., 5,550,318; 5,633,435; 5,780,708 y 6, 1 18,047.

Una molécula de ácido nucleico recombinante o vector de la presente invención tambien puede o alternativamente puede incluir un marcador detectable. Los marcadores detectables pueden usarse para monitorear la expresión. Los marcadores detectables ejemplares incluyen un gen b-glucuronidasa o uidA(GUS) que codifica una enzima para la que se conocen varios sustratos cromogénicos (Jefferson y otros (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); un gen de locus R, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos de plantas (Dellaporta y otros (1988) “Clonación molecular del alelo R-nj del maíz por identificación de transposón con Ac.” En el 18vo Simposio de Genética Stadler, P. Gustafson y R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); un gen de b-lactamasa (Sutcliffe y otros (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:3737-41 ); un gen que codifica una enzima para la que se conocen varios sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica); un gen de luciferasa (Ow y otros (1986) Science 234:856-9); un gen xylE que codifica una dioxigenasa catecol que puede convertir catecoles cromogénicos (Zukowski y otros (1983) Gen 46(2-3):247-55); un gen de amilasa (Ikatu y otros (1990) Bio/Techol. 8:241 -2); un gen de tirosinasa que codifica una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaqumona que, a su vez, condensa a melanina (Katz y otros (1983) J. Gen. Micriobiol. 129:2703-14); y una a-galactosidasa.

Los métodos adecuados para transformación de células huésped incluyen cualquier método por el cual el ADN se puede introducir en una celula, por ejemplo y sin limitación : por transformación de protoplasto (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense 5,508, 184); por aceptación de ADN mediada por desecación/inhibición (ver, por ejemplo, Potrykus y otros (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 183-8); por electroporación (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense 5,384,253) ; por agitación con fibras de carburo de silicona (ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses 5,302,523 y 5,464,765); por transformación mediada con Agrobacterium (ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses 5,563,055, 5,591 ,616, 5,693,512, 5,824,877, 5,981 ,840, y 6,384,301 ); y por aceleración de partículas recubiertas de ADN (ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses 5,015,580, 5,550,318, 5,538,880, 6, 160,208, 6,399,861 y 6,403,865); etcétera. A través de la aplicación de téenicas como éstas, las células de prácticamente cualquier especie se pueden transformar de manera estable. En algunas modalidades, el ADN transformador está integrado dentro del genoma de la célula huésped. En el caso de especies multicelulares, las células transgénicas se pueden regenerar en un organismo transgénico. Alternativamente, las células transgénicas pueden no ser capaces de regeneración de una planta. Cualquiera de estas técnicas se puede usar para producir una planta transgénica, por ejemplo, que comprende una o más secuencias de ácido nucleico de la invención en el genoma de la planta transgénica.

El método más ampliamente usado para introducir un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural del Agrobacterium . A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias de tierra patogenicas de plantas que genéticamente transforman las células de las plantas. Los plásmidos T¡ and R¡ de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, transportan genes responsables de la transformación genética de la planta. Los plásmidos T¡ (que inducen tumores) contienen un segmento grande, conocido como T-ADN, que es transferido a las plantas transformadas. Otro segmento del plásmido T¡ la región vir, es responsable de la transferencia de T-ADN. La región T-ADN está delimitada por repeticiones terminales. En algunos vectores binarios modificados, los genes que inducen tumores han sido suprimidos, y las funciones de la región vir se usan para transferir ADN extraño delimitado por las secuencias de límite de T-ADN. La región T también puede contener, por ejemplo, un marcador seleccionable para recuperación eficiente de células y plantas transgénicas, y un sitio de clonación múltiple para insertar secuencias para transferencia, como por ejemplo, un ácido nucleico que codifica CTP derivado de Brassica sintética.

De esta manera, en algunas modalidades, un vector de transformación de planta se puede derivar de un plásmido T¡ de A. tumefaciens ( Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense Nos. 4,536,475, 4,693,977, 4,886,937, y 5,501 ,967; y Patente Europea EP 0 122 791 ) o un plásmido Ri de A. rhizogenes. Los vectores adicionales de transformación de plantas incluyen , por ejemplo y sin limitación , los descritos por Herrera-Estrella y otros (1983) Nature 303:209-13; Bevan y otros (1983) Nature 304: 184-7; Klee y otros (1985) Bio/Technol. 3:637-42; y en la Patente Europea EP 0 120 516, y los derivados de cualquiera de los anteriores. Otras bacterias como Sinorhizobium, Rhizobium y Mesorhizobium que interactúan con las plantas de forma natural se pueden modificar para mediar la transferencia de genes a una cantidad de plantas diversas. Estas bacterias simbióticas asociadas con plantas pueden hacerse competentes para transferencia de genes por adquisición de plásmidos T¡ desarmados y un vector binario adecuado.

Despues de proporcionar ADN exógeno a células receptoras, las células transformadas por lo general se identifican para cultivo adicional y regeneración de plantas. A fin de mejorar la capacidad para identificar células transformadas, uno puede desear usar un gen marcador seleccionable o detectable, como se estableció previamente, con el vector usado para generar el transformante. En el caso donde un marcador seleccionable se usa, las células transformadas se identifican dentro de la población de células potencialmente transformadas exponiendo las células a un agente o agentes selectivos. En ei caso donde se usa un marcador detectable, las células se pueden detectar para el rasgo de gen marcador deseado.

Las células que sobreviven a la exposición al agente selectivo, o células que han sido cuantificadas como positivas en un ensayo de detección, se pueden cultivar en medios que apoyan la regeneración de plantas. En algunas modalidades, cualquier medio de cultivo de tejido de planta adecuado (por ejemplo, medios MS y N6) se puede modificar incluyendo sustancias adicionales, como reguladores de crecimiento. El tejido se puede mantener en un medio básico con reguladores de crecimiento hasta que una cantidad de tejido suficiente está disponible para comenzar los esfuerzos de regeneración de la planta, o despues de rondas repetidas de selección manual, hasta que la morfología del tejido es adecuada para la regeneración (por ejemplo, por lo menos 2 semanas), después se transfiere a un medio conducente para la formación del brote. Los cultivos se transfieren periódicamente hasta que ha ocurrido una formación de brote suficiente. Una vez que se forman los brotes, estos se transfieren a medios conducentes para la formación de raíz. Una vez que se forman raíces suficientes, las plantas se pueden transferir a la tierra para crecimiento y madurez adicional.

Para confirmar la presencia de una molécula de ácido nucleico de interés (por ejemplo, una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica sintética) en una planta que se regenera, se pueden efectuar una variedad de ensayos. Estos ensayos incluyen, por ejemplo: ensayos biológicos moleculares, como detección Southern blot y Transferencia de Northern, PCR y secuenciamiento de ácido nucleico; ensayos bioquímicos, como por ejemplo, detectar la presencia de un producto de proteína, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA y/o Western blots) o por función enzimática; ensayos parciales de plantas, como ensayos de hojas o raíces; y análisis del fenotipo de toda la planta regenerada.

A modo de ejemplo, los eventos de integración se pueden analizar por amplificación PCR usando, por ejemplo, cebadores oligonucleótidos específicos para una secuencia de nucleótido de interes. Se entiende que el genotipo PCR incluye, pero no está limitado a amplificación por reacción de cadena de polimerasa (PCR) del ADN genómico derivado del tejido de planta huésped aislado que se predice que contiene una molécula de ácido nucleico integrada dentro del genoma, seguido por clonación estándar y análisis de secuencia de productos de amplificación PCR. Los métodos de genotipo PCR han sido bien descritos (ver, por ejemplo, RÍOS , G. y otros (2002) Plant J. 32:243-53), y se pueden aplicar a ADN genómico de cualquier especie de planta (por ejemplo, Z mays o G max) o tipo de tejido, incluyendo cultivos de célula.

Una planta transgénica formada usando métodos de transformación dependientes de Agrobacterium normalmente contiene una secuencia de ADN recombinante simple insertada dentro de un cromosoma. La secuencia de ADN recombinante simple es denominada un “evento transgénico” o “evento de integración”. Estas plantas transgénicas son heterocigotos para la secuencia de ADN insertada. En algunas modalidades, una planta transgenica homocigota con respecto a un transgén puede obtenerse apareando sexualmente (por autofecundación) una planta transgénica segregante independiente que contiene una secuencia de gen exógeno simple a sí misma, por ejemplo, una planta F0, para producir una semilla F . Una cuarta parte de la semilla F producida será homocigota con respecto al transgén. La semilla F que germina da como resultado plantas a las que se puede hacer pruebas para ver si son heterocigotas, normalmente usando un ensayo SNP o un ensayo de amplificación térmica que permite la distinción entre heterocigoto y homocigoto (por ejemplo, un ensayo de cigosidad).

En modalidades particulares, las copias de por lo menos un polipéptido que comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica sintética, se producen en una célula que contiene plástido, dentro de la cual se han introducido al menos una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica al menos un polipéptido que comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica sintético. Cada polipéptido que comprende por lo menos un CTP derivado de Brassica sintética se puede expresar desde múltiples secuencias de ácido nucleico introducidas en diferentes eventos de transformación, o de un una sola secuencia de ácido nucleico introducida en un solo evento de transformación . En algunas modalidades, una pluralidad de estos polipéptidos se expresa bajo el control de un solo promotor. En otras modalidades, una pluralidad de estos polipeptidos se expresa bajo el control de promotores múltiples. Se pueden expresar polipéptidos simples que comprenden múltiples secuencias de péptidos, y cada una de estas secuencias de péptidos se debe dirigir a un plástido.

Además de la transformación directa de una planta con una molécula de ácido nucleico recombinante, las plantas transgénicas se pueden preparar cruzando una primera planta que tenga al menos un evento transgénico con una segunda planta que carezca de tal evento. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que comprende al menos un CTP derivado de Brassica sintética, se puede introducir dentro de una primera línea de plantas que sea sensible a la transformación, para producir una planta transgénica, y esta planta transgénica se puede cruzar con una segunda línea de plantas para ingresar la secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido dentro de la segunda línea de plantas.

VI. Materiales vegetales que comprenden una Brassica sintética derivada del péptido de tránsito al cloroplasto dirigida al polipéptido En algunas modalidades, una célula vegetal se proporciona, en el que la célula de la planta comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende al menos un CTP sintético derivado de Brassica. En modalidades particulares, tal celula de planta puede ser producida por transformación de una célula vegetal que no es capaz de regeneración para producir una planta. En algunas modalidades, se suministra una planta, en donde la planta contiene células vegetales que consisten de una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende al menos una Brassica sintética derivada del CTP. En modalidades especiales, tal planta puede producirse por transformación de un tejido vegetal o célula vegetal, y la regeneración de toda una planta. En modalidades adicionales, tal planta puede obtenerse de una fuente comercial, o a través de la introgresión de un ácido nucleico que consta de una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende al menos una Brassica sintética derivada del CTP en un germoplasma. En modalidades particulares, dicha planta comprende células vegetales que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende al menos un CTP sintético derivado de Brassica que no son capaces de regeneración para producir una planta. También se suministran materiales vegetales que contienen células vegetales que consisten de una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende al menos una Brassica sintética derivada del CTP. Tal material vegetal puede obtenerse de una planta que contiene células vegetales.

Una planta transgénica, una célula vegetal no-regenerable, o material vegetal que contiene células vegetales que consisten de una secuencia de nucleótidos que codifican un polipeptido que comprende al menos una Brassica sintética derivada del CTP también pueden en algunas modalidades presentar una o más de las características siguientes: expresión del polipéptido de una célula de la planta; expresión de una parte del polipéptido en un plástido de una célula de la planta; importación del polipéptido del citosol de una célula de la planta respecto a un plástido de la célula; expresión específica del plástido del polipéptido en una célula de la planta; y/o localización del polipéptido en una célula de la planta. Adicionalmente, tal planta podría tener uno o más rasgos deseables aparte de la expresión del polipéptido codificado. Tales rasgos pueden Incluir, por ejemplo: resistencia a los insectos, otras plagas, y agentes causantes de enfermedades; tolerancias a herbicidas; estabilidad mejorada, cosecha, o vida útil; tolerancias ambientales; producción farmacéutica; producción de productos industriales; y mejoras nutritivas.

Una planta transgénica de acuerdo con la invención puede ser cualquier planta capaz de transformarse con una molécula del ácido nucleico de la invención. Por lo tanto, la planta podría ser dicotiledónea o monocotiledónea. Ejemplos sin restricción de plantas dicotiledóneas usados en los métodos actuales incluyen los siguientes: arabidopsis, alfalfa, frijoles, brócoli, col, zanahoria, coliflor, apio col china, algodón, pepino, berenjena, lechuga, melón, arveja, pimienta, maní, papa, calabaza, rábano, semillas de colza, espinaca, haba de soja, chayóte, remolacha, girasol, tabaco, tomate, y sandía. Ejemplos sin restricción de plantas monocotiledóneas usadas en los metodos actuales incluyen los siguientes: maíz, Brassica, cebolla, arroz, sorgo, trigo, centeno, mijo, caña de azúcar, avena, triticale, mijo, y césped . Las plantas transgénicas de acuerdo con la invención pueden usarse o cultivarse de cualquier manera.

Algunas modalidades también proporcionan productos primarios que contienen una o más secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende al menos una Brassica sintética derivada del CTP, por ejemplo, un producto primario producido de una planta combinada o semillas que contienen una o más tales secuencias de nucleótidos. Productos primarios que contienen una o más secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende al menos una Brassica sintética derivada del CTP incluyen, por ejemplo y sin limitación lo siguiente: productos alimentarios, alimentos, aceites, o cereales triturados o enteros o semillas de una planta que contienen una o más secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende al menos una Brassica sintética derivada del CTP. La detección de una o más secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende al menos una Brassica sintética derivada del CTP en uno o más artículos de consumo o productos primarios es una prueba de hecho que el artículo de consumo o el producto primario fue al menos producido en parte de una planta que contiene una o más secuencias de nucleótidos que codifican un polipeptido que comprende al menos una Brassica sintética derivada del CTP. En modalidades especiales, un producto primario de la invención comprende una cantidad detectable de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende al menos una Brassica sintética derivada del CTP. En algunas modalidades, tales productos primarios pueden producirse, por ejemplo, al obtener plantas transgénicas y preparar alimentos o alimentarse de ellas.

En algunas modalidades, una planta transgénica, una célula vegetal no-regenerable o una semilla que contiene un transgén que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende al menos una Brassica sintética derivada del CTP también puede constar de al menos otro evento transgénico en su genoma, que incluye sin limitación lo siguiente: un evento transgénico del cual se transcribe una molécula de ARNi; una gen que codifica una proteína insecticida (por ejemplo, la proteína insecticida Bacillus thuringiensis ); un gen de tolerancia a herbicidas (por ejemplo, un gene que proporciona tolerancia al glifosato); y un gen que colabora con un fenotipo deseable en la planta transgénica (por ejemplo, aumento de producción, metabolismo del ácido graso alterado, o restauración de la esterilidad masculina citoplasmática).

Vil. Brassica sintética derivada del péptido de tránsito al cloroplasto - localización mediada de los productos de genes al plástido Algunas modalidades de la invención actual suministran un metodo para expresión y/o localización de un producto de gen a un plástido (por ejemplo, un cloroplasto). En las modalidades especiales, el producto de gen podría ser un producto de gene marcador, por ejemplo, una molécula fluorescente. La expresión del producto de gen como parte de un polipéptido que también comprende una Brassica sintética derivada del CTP puede proporcionar un sistema para evaluar las capacidades de localización de una plástido de una secuencia especial de una Brassica sintética derivada del CTP. En algunas modalidades, la expresión de un producto de gen marcador como parte de un polipéptido que contiene una Brassica sintética derivada del CTP se usa para dirigir la expresión del producto de gen marcador a un plástido de una célula en el que se expresa el polipéptido. En ciertas modalidades, tal producto de gen marcador se localiza en el plástido de la célula huésped. Por ejemplo, el producto de gen marcador puede expresarse a niveles más altos en el plástido que en el citosol u otros orgánulos de la célula huésped ; el producto de gen marcador puede expresarse a niveles mucho más altos en el plástido; el producto de gen marcador puede expresarse esencial y únicamente en el plástido; o el producto de gen indicador puede expresarse completamente en el plástido, de forma que la expresión en el citosol o los orgánulos que no son del plástido no puedan detectarse.

En algunas modalidades, un polipeptido que comprende una variante funcional de una Brassica sintética derivada del CTP en el que el polipéptido está unido operativamente a un producto de gen marcador se usa para evaluar las características del péptido variante funcional. Por ejemplo, la secuencia de una Brassica sintética derivada del CTP podría ser variada, por ejemplo, al introducir al menos una mutación conservadora en la Brassica sintética derivada del CTP, y el péptido variante resultante puede estar unido a un producto de gen marcador. Después de que la expresión esté en una célula huésped apropiada (por ejemplo, una célula en la que uno o más elementos reguladores en la construcción de la expresión son usables), puede determinarse la expresión del producto de gen marcador. Al comparar la localización subcelulares del producto de gen marcador entre la construcción de referencia del marcador de la Brassica sintética derivada del CTP y la construcción variante del marcador del péptido, puede determinarse si el péptido variante proporciona, por ejemplo, una mayor localización del plástido, o una localización del plástido sustancialmente idéntica. Tal variante puede considerarse una variante funcional. Al identificar variantes funcionales de la Brassica sintética derivada del CTP que proporcionan mayor localización del plástido, las mutaciones en tales variantes pueden incluirse en variantes adicionales de la Brassica sintética derivada del CTP. Realizar múltiples rondas de este proceso de evaluación , e integrar posteriormente las mutaciones favorables identificadas en una secuencia de la Brassica sintetica derivada del CTP, podría producir un proceso iterativo para la optimización de una secuencia de una la Brassica sintética derivada del CTP. Tales secuencias optimizadas de la Brassica sintética derivada del CTP, y las secuencias de nucleótidos que codifican lo mismo, se consideran parte de la invención actual, ya sea o no que tales secuencias optimizadas de la Brassica sintética derivada del CTP puedan optimizarse más por la mutación adicional.

Las referencias citadas aquí se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la solicitud actual. Nada aquí se interpreta como una admisión de que los inventores no tienen derecho a preceder tal descripción en virtud de la invención previa.

Los ejemplos siguientes se suministran para ilustrar ciertas características y/o aspectos especiales. Estos ejemplos no deben interpretarse como que limitan la descripción de características especiales o los aspectos descritos.

Ejemplos Ejemplol : Diseño y producción de las secuencias del péptido de tránsito al cloroplasto quimérico (TraP) Los plástidos son orgánulos citoplásmicos que se encuentran en especies de plantas mayores y están presentes en todos los tejidos vegetales. Los coioroplastos son un tipo específico de plástidos que se encuentran en los tejidos fotosinteticos verdes que son responsables de las funciones fisiológicas esenciales. Por ejemplo, una función fisiológica principal es la síntesis de aminoácidos aromáticos requerida por la planta. Las enzimas codificadas nucleares se requieren en este sendero biosintético y se transportan del citoplasma al interior del cloroplasto. Estas enzimas codificadas nucleares poseen un péptido de tránsito N-terminal que ¡nteractúa con la membrana del cloroplasto para facilitar el transporte del péptido al estroma del cloroplasto. Bruce B. (2000) Péptidos de tránsito al cloroplasto: estructura, función , y evolución. Tendencias de la biología celular. 10:440 - 447. En la importación, las peptidasas estromales abandonan el péptido de tránsito, y abandonan la proteína funcional madura importada dentro del cloroplasto. Richter S, Lamppa GK. (1999) La peptidasa de procesamiento estromal se une a los péptidos de tránsito e inicia su producción dependiente de la ATP en los cloroplastos. Diario de biología celular. 147:33 - 43. Los péptidos de tránsito al cloroplasto son secuencias variables que son muy divergentes en longitud, composición y organización. Bruce B. (2000) Péptidos de tránsito al cloroplasto: estructura, función, y evolución . Tendencias de la biología celular. 10:440 - 447. Las semejanzas de secuencia de los péptidos de tránsito al cloroplasto se bifurcan significativamente entre las proteínas homologas de diferentes especies de plantas. La cantidad de divergencia entre los péptidos de tránsito al cloroplasto es inesperada dado que las proteínas homologas obtenidas de las diferentes especies de plantas típicamente comparten altos niveles de semejanzas de secuencias cuando se comparan con la proteína funcional madura procesada.

Secuencias nuevas de peptidos de tránsito al cloroplasto quimérico fueron diseñadas, producidas y evaluadas en planta. Se demostró que los nuevos péptidos de tránsito al cloroplasto quimérico que poseían una translocación eficaz y propiedades de procesamiento para la importación de proteínas agronómicas importantes dentro del cloroplasto. Inicialmente, se analizaron las secuencias nativas de proteínas de 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS, por sus siglas en inglés) de diferentes especies de plantas mediante el programa informático ChloroP™ para identificar las secuencias putativas de péptidos de tránsito al cloroplasto (Emanuelsson O, Nielsen H , von Heijne G (1999) ChloroP, un método basado en redes neuronales para pronosticar los péptidos de tránsito al cloroplasto y sus sitios de división, Ciencias de las proteínas 8; 978-984) disponible en http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/. Después de que se identificaron péptidos en tránsito al cloroplasto nativos, se alineó una primera secuencia de péptidos de tránsito al cloroplasto con una segunda secuencia de péptidos de tránsito al cloroplasto de un segundo organismo. La Figura 18 ilustra la alineación de las secuencias de péptidos de tránsito al cloroplasto de la EPSPS de una Brassica napus (Acceso NCBI No: P17688) y una Brassica rapa (Acceso NCBI No: AAS80163). Al usar la alineación de secuencias del peptido de tránsito al cloroplasto, se diseñaron nuevos péptidos de tránsito al cloroplasto quimérico al combinar la primera mitad de la secuencia de péptidos de tránsito al cloroplasto del primer organismo con la segunda mitad de la secuencia de péptidos de tránsito al cloroplasto del segundo organismo en una proporción aproximada de 1 : 1 . Las secuencias ejemplares de los péptidos de tránsito al cloroplasto quimérico recién diseñados son TraP8 (SEC ID No.: 3) y TraP9 (SEC ID No.: 4). Estas nuevas secuencias de péptidos de tránsito al cloroplasto quimérico se obtienen de las proteínas de la EPSPS de una Brassica napus (Acceso ATCC No: P17688) y una Brassica rapa (Acceso ATCC No: AAS80163). La TraP8 (SEC ID No. : 3), una secuencia de péptidos de tránsito al cloroplasto quiméricos comprende un N-terminal que se obtiene de una Brassica napus, y la C-terminal del péptido de tránsito al cloroplasto se obtiene de una Brassica rapa. La TraP9 (SEC ID No.: 4) una secuencia de péptidos de tránsito al cloroplasto quiméricos comprende un N-terminal que se obtiene de una Brassica napas, y la C-terminal del péptido de tránsito al cloroplasto se obtiene de una Brassica napus. Los péptidos de tránsito al cloroplasto se probaron mediante múltiples ensayos que incluían a un sistema de expresión en planta transiente y transgénicamente como un evento de transformación estable que comprende un elemento de expresión del gen unido a una secuencia agronómica del transgén importante.

Ejemplo2: Prueba en planta transiente de las Secuencias de Peptidos de Tránsito al Cloroplasto Quimérico (TraP) Ensayo de transiente del tabaco: La Trap8 y la Trap9, secuencias de péptidos de tránsito al cloroplasto quimérico se probaron inicialmente mediante un ensayo en planta transiente. Se sintetizaron las secuencias de polinucleótidos que codifican la Trap8 (SEC ID No.: 5) y la TraP9 (SEC ID No. : 6), secuencias de péptidos de tránsito al cloroplasto quimérico. Se integró una secuencia de unión (SEC ID No.: 7) entre la secuencia de TraP y la secuencia de codificación de la yfp. Las construcciones resultantes contenían dos Unidades de Transcripción de Planta (PTU, por sus siglas en inglés). La primera PTU estaba compuesta de la promotora Arabidopsis thaliana Ubiquitin 10 (promotora AtUbM O; Callis, y otros, (1990) Química biológica J., 265: 12486-12493) TraP-gen de fusión a la proteína fluorescente amarilla (Trap-YFP; Solicitud de Patente Estadounidense 2007/0298412), y la región sin traducir de la Agrobacterium tumefaciens ORF 23 3 (AtuORF23 3 UTR; Solicitud de Patente Estadounidense No. 5,428, 147). La segunda PTU estaba compuesta de la promotora del Virus Mosaico de la Yuca (promotora del CsVMV; Verdaguer y otros, (1996) Biología molecular de una planta, 31 : 1 129-1 139), fosfinotricin-acetil transferasa (PAT; Wohlleben y otros, (1988) Gen, 70: 25-37), y la región sin traducir de la Agrobacterium tumefaciens ORF 1 3 (AtuORF 1 3 UTR; Huang y otros, (1990) Bacteriología J. , 172: 1814-1822). La construcción PDAB101977 contiene la TraP8 del peptido de tránsito al cloroplasto quimérico (Figura 2). La construcción PDAB101978 contiene la TraP9 del péptido de tránsito al cloroplasto quimérico (Figura 3). Un plásmido de control 101908, que no contenía una secuencia de péptidos de tránsito al cloroplasto ascendente del gen yfp se desarrolló e incluyó en los estudios (Figura 4). Las construcciones se confirmaron mediante la digestión y la secuencia de enzima de restricción . Finalmente, las construcciones se transformaron en Agrobacterium tumefaciens y se almacenaron en reservas de glicerina.

De una reserva de glicerina de la Agrobacterium , un bucle lleno del cultivo congelado se inoculó en 2 mi de YPD (100 mg/ml de espectinomicina) en un tubo estéril de 14 mi. El medio inoculado se incubó a 28°C toda la noche agitándolo a 200 rpm. Al día siguiente, aproximadamente 100 pl del cultivo se usó para inocular 25 mi de YPD (100 pg/ml de espectinomicina) en un matraz con tres deflectores estéril de 125 mi, y se incubó a 28°C toda la noche agitándolo a 200 rpm. Al día siguiente, los cultivos se diluyeron en OD60o de 0.5 en ddH20 estéril (pH 8.0). La cepa de Agrobacterium diluida se mezcló con una segunda cepa de Agrobacterium que contiene la proteína ayudante P19 en una proporción 1 : 1 . El cultivo se usó para la infiltración de una hoja de tabaco mediante el método de Vomnet O, Rivas S, Mestre P, y Baulcombe D. , (2003). Un sistema de expresión transiente mejorado en plantas basadas en la supresión del silenciamiento genico por la proteína p19 del virus del enanismo arbustivo del tomate, El Diario de Plantas, 33:949-956. Las plantas de tabaco infiltradas se colocaron en un grupo de Conviron™ por 16 horas de luz a 24°C durante al menos tres días hasta que fueran analizadas.

Resultados microscópicos: Agrobacterium - las hojas de tabaco infiltradas se cortaron de la planta, y se colocaron en un petri-plato con agua para evitar la deshidratación. Las hojas de tabaco infiltradas se observaron bajo excitación por luz azul de ligera azul con filtros de vidrio de paso largo sujetados en su lugar mediante una Dark Reader Hand Lamp™ (Clare Chemical Research Co. ; Dolores, CO) para identificar áreas intactas de la hoja que expresaron con éxito las proteínas indicadoras YFP. Las áreas de la hoja específicamente identificadas se disecaron de la hoja y se montaron en agua para obtención de imágenes por un microscopio confocal (Leica TCS-SP5 AOBS™; Buffalo Grove, I L). La proteína indicadora YFP se estimuló por una línea láser de 514 nm, mediante un rayo láser de argón-ión multi-línea. El ancho de las grietas de detección se ajustó mediante una muestra de la hoja de control de (oscura) sin expresión para excluir la autofluorescencia de la hoja del fondo. La autofluorescencia de la clorofila se recogió simultáneamente en un segundo canal para la comparación directa con la señal de la proteína indicadora fluorescente para determinar la localización cloroplástica.

Los resultados de la obtención de imágenes del microscopio indicaron que la proteína fluorescente YFP consisten de un peptido de tránsito al cloroplasto de Trap8 o TraP9 acumulado dentro de los cloroplastos localizados en el citoplasma de las células del tabaco en comparación con las proteínas fluorescentes YFP que no se translocan en los cloroplastos del citoplasma de las células del tabaco (Figura 5 y Figura 6). Estos resultados de obtención de imágenes del microscopio indican que la translocación de la proteína YFP en el cloroplasto fue un resultado del péptido de tránsito al cloroplasto de Trap8 o TraP9. Como muestran en la Figura 5 y la Figura 6, la señal de fluorescencia de la YFP está localizada en los cloroplastos que también tienen fluorescencia roja debido a la autofluorescencia bajos las condiciones de obtención de imágenes del microscopio. Comparativamente, la Figura 7 suministra que una imagen microscópica del tejido de una hoja de tabaco infiltrada con la construcción de control pDAB101908 que no contiene un péptido de tránsito al cloroplasto. Los cloroplastos en esta imagen solo tienen fluorescencia roja debido a la auto-fluorescencia bajo las condiciones de obtención de imágenes del microscopio, y carecen de cualquier señal de fluorescencia de la YFP que se presenta en las células de tabaco infiltradas de TraP. Más bien, la señal de fluorescencia de la YFP en las células vegetales del tabaco de control se expresa de manera difusa en todo el citoplasma de las celulas de la planta de tabaco.

Resultados de Western Blot: Las muestras de las plantas de tabaco infiltradas se analizaron por Western Blotting. Golpes de hojas se recogieron y se sometieron a talón de molienda. Cerca de 100-200 mg de material de las plantas se mezcló con 2 BBs (esferas de acero) (Daisy; Rogers, AR) y 500 mi de PBST durante 3 minutos en un molino de perlas Kleco™. Las muestras se centrifugaron entonces en una centrífuga a 14,000 x g a 4°C. El sobrenadante fue retirado y analizado directamente por la téenica de Western blot o por inmunoprecipitado. Las inmunoprecipitaciones fueron llevadas a cabo usando el Pierce Direct I P kit™ [kitMR Pierce de Inmuno Precipitación Directa] (Thermo Scientific; Rockford, IL) siguiendo el protocolo del fabricante. Aproximadamente 50 mg de anti-YFP [Proteína Fluorescente Amarilla] estaban pegados a la resina. Se incubaron las muestras con la resina durante la noche a 4°C. A la mañana siguiente se lavaron y eluyeron las muestras y se prepararon para análisis, combinando volúmenes iguales de amortiguador de muestras de urea 2X 8M y después se hirvieron las muestras durante 5 minutos. Las muestras hervidas fueron realizadas en 4-12% gel SDS-Bis Tris en amortiguador MOPS durante 40 minutos. Se manchó entonces el gel usando el Invitrogen ¡Blot™ (Life Technologies; Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. La membrana manchada fue bloqueada durante 10 minutos usando 5% de leche en polvo descremada en solución PBS-Tween. Se examinó la membrana con el anticuerpo primario (anti-GFP [Proteína Fluorescente Verde] monoclonal en conejo) usado a un 1 : 1000 de dilución en el 5% de leche en polvo descremada en solución PBS-Tween durante 1 hora. Despues se secó la membrana tres veces durante cinco minutos con PBS-Tween para retirar todo el anticuerpo primario desligado. La membrana fue examinada con un monoclonal secundario anti conejo en anticuerpo de cabra (Life Technologies) usado a un 1 : 1000 dilución, durante 60 minutos. La membrana fue lavada como se describió previamente y desarrollada agregándole sustrato Themo BCIP/NBT. Se dejó que el sustrato colorimétrico se desarrollara durante 5- 10 minutos y después las manchas fueron enjuagadas con agua antes de ser secadas.

Los resultados de la téenica de Western blot indicaron que la proteína YFP se manifestaba en las células de tabaco infiltradas. Los tejidos de las hojas de ambas plantas de tabaco infiltradas, la pDAB101977 y pDAB101978, mostraron la proteína YFP indicada por la presencia de una banda de proteína que reaccionó a los anticuerpos YFP y era equivalente en tamaño a la banda de proteína obtenida del tejido de las hojas de las plantas de tabaco infiltradas con el constructo YFP de control. Más aun, estos resultados indicaron que los péptidos de tránsito cloroplasto recombinante TraP8 fueron procesados y cortados de la proteína YFP. Los constructos TraP8-YFP y TraP9-YFP expresan una banda de proteína pre-procesada que es mayor en peso molecular que la proteína YFP de control. La presencia de bandas en la teenica de Western blot que son equivalentes en tamaño a la YFP de control indican que las secuencias de péptido de tránsito cloroplasto recombinante TraP8 y TraP9 se procesaron, reduciendo así el tamaño de la YFP a un peso molecular que es equivalente a la YFP de control.

Ensayo Transitorio de Protoplasto de Maíz: La secuencia del polinucleótido que codifica el péptido de tránsito cloroplasto recombinante TraP8 (SEC ID No.: 5) y la secuencia del polinucleótido que codifica el enlace (SEC ID No.: 7) fueron clonadas aguas arriba del gen de la proteína fluorescente amarilla e incorporados al constructo pDAB106597 (Figura 8) para la prueba por medio del ensayo transitorio in planta del protoplasto de maíz. Los constructos resultantes contenían una única unidad de transcripción de planta (PTU por sus siglas en inglés). La PTU se componía del promotor Zea mays Ubiquitin 1 (ZmUbil promotor; Christensen, A. , Sharrock R., y Quail P. , (1992) genes de maíz poliubiquitina: estructura, perturbación termal de expresión y empalme de transcripción, y actividad de promotor siguiendo la transferencia a protoplastos por electroporación, Biología Molecular de la Planta, 18:675-689), fusión de gen TraP- proteína fluorescente amarilla (TraP8-YFP; EEUU Patente App. 2007/0298412), y Zea mays Peroxidasa 5 3 región no traducida (ZmPer5 3 UTR; Patente Estadounidense No. 6384207). Los constructos fueron confirmados mediante restricción de digestión de enzima y secuenciación.

Semillas de Zea mays var. B104 fueron esterilizadas en su superficie sacudiendolas vigorosamente en 50% Clorox (3% 5 hipoclorito de sodio), conteniendo 2-3 gotas de Tween 20, durante aproximadamente 20 minutos. Las semillas fueron enjuagadas concienzudamente con agua destilada estéril. Las semillas esterilizadas fueron plantadas en ½ MS en Phytatrays o tipos de cajas similares, y se las dejó crecer en la oscuridad (28°C) ío durante 12 a 20 días. Se usó un ensayo transitorio de protoplasto de maíz para obtener y transfectar protoplastos de maíz de hojas de maíz B104-. Este ensayo de protoplasto de maíz es una modificación del sistema descrito por Yoo, S.-D. , Cho, Y.-H. , y Sheen, J. , (2007), Arabidopsis Mesophyll Protoplasts: Un Sistema ís de Células Versátiles para el Análisis de la Expresión Transitoria del Gen, Protocolos de la Naturaleza, 2: 1565-1572. Las soluciones se prepararon como las describe Yoo et. al., (2007), con la excepción de que la concentración de manitol usada para los siguientes experimentos fue cambiada a 0.6M. 20 La transfección de 100 a 500 mI de protoplastos (1 -5x105) se completó añadiendo a los protoplastos hasta 2ml de un tubo microfuga conteniendo aproximadamente 40 mg de ADN plásmido (pDAB1 06597), a temperatura ambiente. El volumen de ADN fue mantenido preferentemente a aproximadamente 10% del volumen 25 del protoplasto. Los protoplastos y el ADN fueron ocasionalmente mezclados durante un período de incubación de 5 minutos Un volumen igual de solución PEG se agregó lentamente a los protoplastos y el ADN, 2 gotas por vez mezclando en medio el agregado de las gotas de solución PEG . Se dejaron incubar los tubos durante aproximadamente 10 minutos, mezclando ocasionalmente de manera suave. Despues se agregó y se mezcló 1 mi de solución W5+ invirtiendo los tubos varias veces. Los tubos fueron centrifugados durante 5 minutos a 75 x g a una temperatura de 4°C. Finalmente, el sobrenadante fue retirado y el precipitado fue resuspendido en 1 mi de solución Wl y los protoplastos fueron colocados en una pequeña placa Petri (35 x 10 mm) o en placas multipocillo de 6 e incubados toda la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. La fluorescencia del YFP pudo ser vista en el microscopio después de 12 horas de incubación. Las condiciones del microscopio previamente descritas fueron usadas para las imágenes.

Los resultados de las imágenes del microscopio indicaron que la proteína YFP fluorescente que comprende un péptido de tránsito cloroplasto recombinante TraP8 se acumuló dentro de los cloroplastos localizados en el citoplasma de las células de maíz, en comparación con las proteínas fluorescentes YFP de control que no se translocan en los cloroplastos del citoplasma de las células de maíz (Figura 9). Estos resultados de las imágenes del microscopio sugieren que la translocación de la proteína YFP en el cloroplasto fue como resultado del péptido de tránsito cloroplasto recombinante TraP8.

Ejemplo 3: Secuencias del Peptido de Tránsito Cloroplasto Recombinante (TraP) para la Expresión de Transgénicos Agronómicamente Importantes en Arabidopsis La mutación de un único aminoácido (G96A) en la enzima Escherichia coli 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintasa (EPSP sintasa) puede resultar en falta de sensibilidad al glifosato (Padgette et al., (1991 ); Eschenburg et al., (2002); Priestman et al., (2005); Haghani et al., (2008)). Mientras esta mutación le confiere tolerancia al glifosato, también se conoce que afecta adversamente el enlace de EPSP sintasa con su sustrato natural, el fosfoenolpiruvato (PEP por sus siglas en inglés). El cambio resultante en la eficiencia del enlace del sustrato puede dar una enzima mutada no adecuada para proporcionar tolerancia al glifosato in planta.

La base de datos del NCBI Genbank fue examinada in silico para las secuencias de la proteína sintasa EPSP y polinucleótidos que contienen una alanina de forma natural en una posición análoga dentro de la enzima sintasa EPSP como la de la mutación G96A que fue introducida en la versión E. coli de la enzima (Padgette et al., (1991 ); Eschenburg et al., (2002); Priestman et al., (2005); Haghani et al., (2008)).

Una enzima que se identificó que contenía una alanina natural en esta posición fue la DGT-28 (GENBANK ACC NO: ZP_0691 7240.1 ) del Streptomyces sviceus ATCC29083. Datos posteriores in silico de minería describieron otras tres enzimas Streptomyces únicas con mayor homología que las DGT-28; DGT-31 (GENBANK ACC NO: YP_004922608.1 ); DGT-32 (GENBANK ACC NO: ZP_0469661 3); y DGT-33 (GENBANK ACC NO: NC_010572). Cada una de estas enzimas contiene una alanina natural en una posición análoga dentro de la enzima sintasa EPSP como la de la mutación G96A que fue introducida en la versión E. col¡ de la enzima. Figura 1 .

Dado que las proteínas de EPSP sintasa de diferentes organismos tienen diferentes largos, la numeración de la mutación para la versión de E. coli de la enzima ESPS sintasa no corresponde necesariamente con la numeración de la mutación para las enzimas de la EPSP sintasa de los otros organismos. Estas enzimas de la EPSP sintasa identificadas no se caracterizaron previamente de acuerdo con la tolerancia al glifosato o su afinidad con el sustrato PEP. Además, estas enzimas de la EPSP sintasa representan una nueva clase de enzimas de la EPSP sintasa y no contienen motivos secuenciales que hayan sido usados para caracterizar las enzimas de la EPSP sintasa de Clase I (secuencias derivadas de plantas descritas con mayor detalle en Patente Estadounidense No. RE39247), II (secuencias derivadas de bacterias descritas con mayor detalle en Patente Estadounidense No. RE39247), y II I (secuencias derivadas de bacterias descritas con mayor detalle en Solicitud de Patente Internacional WO 2006/1 10586) previamente descritas.

Las enzimas nuevas DGT-14, DGT-28, DGT-31 , DGT-32, y DGT-33 se caracterizan por la tolerancia al glifosato y afinidad por ei sustrato PEP en comparación a enzimas EPSP sintasa Clase I . Las siguientes enzimas Clase I : DGT-1 de Glycine max, DGT-3 de Brassica napus (GenBank Cuenta No. : P17688), y 7-DGT de Triticum aestivum (GenBank Cuenta No. : EU977181 ) fueron para comparación. Las enzimas EPSP sintasa Clase I mutantes, y variantes de los mismos, fueron sintetizados y evaluados. Una mutación introducida en enzimas vegetales EPSP sintasa consistía en la mutación de glicina a alanina hecha dentro de la enzima EPSP sintasa en una ubicación similar a la de la mutación G96A de la versión de E. coli de la enzima. Además, las mutaciones de treonina a isoleucina y prolina a serina se introdujeron a estas enzimas EPSP sintasa Clase I en posiciones análogas al del aminoácido 97 (T a I) y del aminoácido 101 (P a S) en la EPSP sintasa de E. coli, como se describe en Funke et al. , (2009).

DGT14: Se produjeron plantas Ti Arabidopsis con peptidos de tránsito al cloroplasto quiméricos TraP8 y TraP9 fusionados con el transgén dgt-14 usando el método de inmersión floral de Clough y Bent (1998), Plant J. 16:735-743. Se obtuvieron plantas de Arabidopsis transgénicas y se confirmó que contenían el transgén mediante confirmación molecular. Las plantas transgénicas se atomizaron con diferentes tasas de glifosato. Se aplicó en este estudio una distribución de distintas concentraciones de tasas de glifosato, incluyendo tasas elevadas, para determinar los niveles relativos de resistencia (105, 420, 1 ,680 o 3,360 g ae/ha). La tasa de uso de glifosato de 1 X campo es 1 , 120 g ae/ha. Las plantas Ti de Arabidopsis que se usaron en este estudio tenían variaciones en el número de copias para el transgen dgt- 14. Las plantas T Arabidopsis con números bajos copias del dgt-14 se identificaron usando ensayos de confirmación molecular, y se autopolinizaron y se usaron para producir plantas T2- La Tabla 1 muestra la resistencia de las plantas con el transgén dgt- 14, en comparación con las plantas de control que contenían un gen de resistencia al herbicida glifosato, dgt-1 (según se describe en la Presentación para Patente Estadounidense No. 12558351 ), y controles silvestres.

Los transformantes Ti Arabidopsis se seleccionaron primero de un fondo de semilla no transformada usando un esquema de selección de glufosinato. Se analizaron tres pisos, o 30,000 semillas, para cada constructo T^ Se caracterizaron molecularmente las plantas Ti y éstas fueron subsecuentemente trasplantadas a macetas individuales y rociadas con diversas tasas de glifosato comercial como se describió anteriormente. La respuesta a la dosis de estas plantas se presentó en términos de % de lesión visual 2 dos semanas después del tratamiento. Los datos se presentan en las tablas a continuación que muestran plantas individuales que exhiben poco o ninguna (<20% ), una lesión moderada (20-40%) o una lesión grave (>40%). Se presenta el promedio aritmetico y la desviación estándar para cada constructo usado para la transformación Arabidopsis. En la última columna, también se indica el intervalo de respuesta individual para cada tasa y transformación. Tipo silvestre, Arabidopsis (c.v. Columbia) no transformada, sirvió como un control sensible al glifosato.

El nivel de respuesta de las plantas varió en las plantas Arabidopsis T1 . Esta varianza puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformación independiente y por lo tanto el número de copia del gen de interés varía de planta en planta. En la Tabla 1 se presenta un promedio de lesión de populación global por tasa para demostrar la tolerancia provista por cada uno de los constructos dgt- 14 unido con el péptido de tránsito a cloroplasto TraP8 v2 o TraP9 v2 versus el dgt-1 y controles no transformados de tipo salvaje para diversas tasas de glifosato. Los elementos contenidos en el dgt-14 unido con TraP8 v2 (SEC ID No. : 8) que está contenido en el constructo pDAB105526 (Figura 10) y con TraP9 v2 (SEC ID No. : 9) que está contenido en el constructo pDAB105527 (Figura 1 1 ). Datos de la selección de glifosato de plantas T demostraron que cuando dgt-14 estaba unido con estos péptidos de tránsito a cloroplastos, se proporcionaba una tolerancia robusta a altos niveles de glifosato. En comparación, los controles no transformados (o tipo salvaje) no proporcionaron tolerancia al tratamiento a concentraciones altas de glifosato al ser tratadas con tasas similares de glifosato. Además, hubo ocasiones cuando eventos que se mostraron que contenían tres o más copias de dgt-14 fueron más susceptibles a tasas elevadas de glifosato. Estas instancias se muestran dentro del intervalo porcentual de lesión visual que se muestra en la Tabla 1 . Es probable que la presencia de números de copia altos de los transgenes dentro de las plantas Arabidopsis resulte en silenciamiento transgénico u otros efectos epigenéticos que resultaran en sensibilidad al glifosato, a pesar de la presencia del transgén dgt-14.

Tabla 1. dgt-14 transformado T Arabidopsis respuesta a un intervalo de tasas de glifosato aplicadas post-emergencia, comparado con una población de segregación de dgt-1 (T2), y un control no transformado. Lesión visual % 2 después de la aplicación.

Las plantas de Arabidopsis Ti seleccionadas que se identificó contenían bajos números de copias de insertos transgenicos (1 -3 copias) se auto-fertilizaron para producir una segunda generación para la evaluación adicional de la tolerancia al glifosato. Las plantas de Arabidopsis de segunda generación (T2) que contenían 1 -3 copias del transgén dgt- 14 se fusionaron con los péptidos de tránsito al cloroplasto quiméricos TraP8 y TraP9 y se las clasificó además según su tolerancia al glifosato y al glufosinato (una resistencia al glufosinato indicaba que el casete de expresión PAT estaba intacto y que no sufrió una reorganización durante la autopolinización de las plantas Ti). En la segunda generación T2 hubo plantas hemicigóticas y homocigóticas disponibles para pruebas para cada evento y por lo tanto se incluyeron para cada tasa de glifosato evaluada. Las plantas hemicigóticas contienen dos alelos diferentes en cada locus en comparación con las homocigóticas, que contienen dos alelos iguales en un locus. El número de copias y los niveles de ploidía de las plantas T2 se confirmaron usando protocolos de análisis molecular. Asimismo, se aplicó glifosato usando los metodos y tasas descritos anteriormente. La respuesta a las dosis de las plantas se presenta en términos de % visual de lesiones 2 semanas después del tratamiento (SDT). Los datos se presentan como un histograma de individuos que exhiben pocas lesiones o ninguna (<20%), lesiones moderadas (20-40%), o lesiones severas (>40%). Se presenta una desviación media y estándar para cada constructo usado para la transformación de las Arabidopsis. El intervalo de respuesta individual también se indica en la última columna para cada tasa y transformación. El control sensible al glifosato fueron plantas de Arabidopsis (cv. Columbia) silvestres sin transformar. Además, se incluyeron las plantas que contenían un gen resistente al herbicida glifosato, dgt-1 (según se describe en la Presentación de la Patente Estadounidense No. 12558351 , incorporado aquí como referencia en su totalidad) como control positivo.

En la generación T2, tanto la copia única como la copia baja (la copia dos o tres) de los eventos de dgt-14 se han caracterizado por la tolerancia al glifosato. Un daño general en la población promedio por porcentaje se presenta en la Tabla 2 para demostrar la tolerancia proporcionada por cada uno de los constructos dgt- 14 relacionados con un peptido de tránsito al cloroplasto frente a los controles de tipo de cígM y “tipo silvestre” no transformado para diferentes tasas de glifosato. Los eventos de generación T2 contiene dgt- 14 relacionado con TraP8 v2 (pDAB105526) y TraP9 v2 (pDAB105527). Ambos de estos eventos son altamente resistentes a glifosato. Los resultados indicaron que el intervalo de daño para las plantas T2 Arabidopsis fue menor al 20% para todas las concentraciones de glifosato que se probaron . Comparativamente, los controles no transformados (o de “tipo silvestre”) no proporcionan tolerancia al tratamiento con altas concentraciones de glifosato cuando se tratan con tasas similares de glifosato. En general, los resultados mostraron que las plantas que contienen y extraen DGT-14 se fusionan a las proteínas pépticas de tránsito quimérico TraP8 y TraP9 otorgando un nivel de resistencia comercial al glifosato en niveles de hasta 3 veces la tasa de campo (1 120 g ea/ha).

Tabla 2. dgf-14 transformó la respuesta T2 Arabidopsis a un intervalo de tasas de glifosato aplicadas postemergencia, en comparación a una población segregante dgt-1 (T2), y a un control no transformado. % de lesión visual 2 semanas después de la aplicación. Los datos representan una línea selecta de copia única de cada constructo que se segregó como una posición única en la pantalla de herencia.

Plantas T2 Arabidopsis seleccionadas aleatoriamente identificadas como conteniendo números bajos de copias de introducción de transgenes (1 -3 copias) fueron auto fertilizadas para producir una tercera generación para evaluación adicional de tolerancia al glifosato. Semillas Arabidopsis de la tercera generación (T3) fueron plantadas y evaluadas por su tolerancia al glifosato por medio de los mismos protocolos previamente descritos. Los eventos analizados en la generación T3 contenían réplicas de cada línea que eran homocigóticos (determinado por medio de una pantalla de resistencia al glufosinato para identificar si alguna de las plantas avanzadas mostraba segregación de los transgénes). Estos eventos fueron analizados por medio de LC-EM-EM para confirmar que las plantas expresaban la proteína DGT-14. Los resultados de la generación T3 para promedio de lesiones de la población general por tasa de glifosato se presenta en la Tabla 3 que muestra la tolerancia al glifosato proporcionada por cada uno de los constructos dgt- 14 para diversas tasas de glifosato. Eventos T3 ejemplares de resistencia comprendían dgt- 14 vinculado con TraP8 v2 (pDAB1 05526) y con TraP9 v2 (pDAB105527). Ambos eventos son altamente resistentes al glifosato. Los resultados indicaron que el intervalo de lesiones para las plantas T3 Arabidopsis fue menor al 20% en todas las concentraciones de glifosato que fueron probadas. En comparación, los controles no transformados (o de tipo silvestre) no proporcionaron tolerancia al tratamiento de altas concentraciones de glifosato al ser tratados con tasas similares de glifosato. En general, los resultados demostraron que las plantas que contenían y que expresaban DGT-14 producían resistencia comercial al glifosato a niveles de hasta 3 veces la tasa en el campo (1 120 g ae/ha).

Tabla 3. dgt-14 transformó la respuesta T3 Arabidopsis a un intervalo de tasas de glifosato aplicadas postemergencia, en comparación a una población segregante dgt-1 (T2), y a un control no transformado. % de lesión visual 2 semanas despues de la aplicación. Los datos representan una población selecta de copia única de cada constructo que se segregó como una posición única en la pantalla de herencia T2.

Los datos muestran que la expresión de una enzima resistente a glifosato (por ejemplo, la DGT-28), cuando dirigida al cloroplasto de una célula vegetal mediante un péptido de tránsito TraP en una proteína de fusión, es capaz de conferir resistencia al glifosato a una célula de planta y a las plantas compuestas de estas células.

DGT-28. PGT-31. DGT-32. v DGT-33: La secuencia de polinucleótidos dgt-28 v5 optimizada de plantas dicotiledóneas, recientemente diseñada, aparece listada en SEC I D No. : 16. La secuencia de polinucleótidos dgt-28 v6 optimizada de plantas monocotiledóneas, recientemente diseñada, aparece listada en SEC ID No.: 17; esta secuencia fue ligeramente modificada al incluir una alanina en la segunda posición de amino ácido para introducir un sitio de enzima de restricción . Las secuencias de ADN resultantes tienen un mayor grado de diversidad de codones, una composición base deseable, contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción estrategicamente situados, y no tienen secuencias que pudieran interferir con transcripción del gen , o traslación de producto mARN.

Síntesis de fragmentos de ADN que componen SEC ID No.: 16 y SEC ID No. : 17 que contienen secuencias adicionales, como 6 terminaciones de marco (codones de terminación ubicados en todos los seis marcos de lectura que se añaden al extremo 3 de la secuencia de codificación), y un sitio de restricción 5 para clonar fueron realizadas por proveedores comerciales (ADN2.0, Menlo Park, CA). La molécula sintética de ácido nucleico fue entonces clonada en vectores de expresión y transformada en plantas o en bacterias como se describe en los ejemplos a continuación.

Se usaron estrategias similares de optimización de codones para diseñar dgt-1, dgt-3 v2 (G 173A), dgt-3 v3 (G 173A; P178S), dgt-3 v4 (T174I ; P178S), dgt-7 v4 (T168I ; P172S), dgt-32 v3, dgt-33 v3, y dgt-31 v3. La versión de codones optimizados de estos genes están listados como SEC I D No. : 18, SEC I D No. : 19, SEC ID No.: 20, SEC ID No.: 21 , SEC I D No. : 22, SEC I D No. : 23, SEC ID No.: 24, y SEC I D No. : 25, respectivamente.

Construcción vectorial binaria de plantas. Se usaron metodos estándar de clonado en la construcción de vectores de entrada que contienen una secuencia de polinucleótido de péptido de tránsito al cloroplasto unidos a dgt-28 como fusión en marco. Los vectores de entrada que contienen un péptido de tránsito (TraP) fusionado a dgt-28 fueron ensamblados por medio de la teenología In-Fusion™ Advantage Technology (Clontech, Mountain View, CA). Como resultado de la fusión, el primer amino ácido, metionina, fue eliminado de dgt-28. Los péptidos de tránsito TraP4 v2 (SEC I D No. : 26), TraP5 v2 (SEC ID No. : 27), T raP8 v2 (SEC I D No. : 28), TraP9 v2 (SEC I D No.: 29), TraP12 v2 fueron cada uno sintetizado por ADN2.0 (Menlo Park, CA) y fusionados al fragmento extremo 5 de dgt-28, hasta e incluido un sitio único de reconocimiento de endonucleasa de restricción Accl.

Plásmidos binarios que contenían los distintos casetes de expresión TraP y dgt-28 fueron accionados por el promotor Arabidopsis thaliana Ubiquitin 10 (AtUbM O v2; Callis, et al., (1990) J. Biol. Chem. , 265: 12486-12493) y flanqueados por el marco de lectura abierto Agrobacterium tumefaciens región no traducida 3 veintitrés (AtuORF23 3 UTR v1 ; Patente Estadounidense No. 5,428, 147).

Los casetes de expresión ensamblados TraP y dgt-28 fueron diseñados usando Gateway® Technology (Invitrogen, Carlsbad, CA) y transformados en plantas mediante transformación mediada por plantas Agrobacterium. Se obtuvieron endonucleasa de restricción de New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) y Ligasa T4 ADN (Invitrogen) fue usada para ligamiento ADN . Se realizaron reacciones Gateway usando una mezcla de enzimas Gateway® LR Clonase® (Invitrogen) para ensamblar un vector de entrada en un vector de destino único que contenía el casete marcador seleccionable Virus promotor mosaico de la yuca vena (CsVMV v2; Verdaguer et al. , (1996) Plant Mol. Biol., 31 : 1 129-1 139) - DSM-2 (Solicitud de Patente Estadounidense No. 2007/086813) -marco de lectura abierto Agrobacterium tumefaciens región no traducida 3 uno (AtuORFI 3 UTR v6; Huang et al., (1990) J. Bacterio!. 172: 1814-1822). Preparaciones plásmidos fueron realizadas usando plásmido NucleoSpin® (Machercy-Nagel Inc. , Bethlehem, PA) o el kit plásmido Midi (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones de los proveedores. Se aislaron fragmentos de ADN mediante un kit de extracción de gel QIAquick™ (Qiagen) despues de electroforesis en gel de agarosa - tri acetato.

Colonias de todos los plásmidos ensamblados fueron inicialmente seleccionadas por digestión restrictiva de mini preparación de ADN. ADN plásmido de clones fue secuenciado por un proveedor comercial de secuencias (Eurofins™ MWG Operon, Huntsville, AL). Los datos de secuencias fueron ensamblados y analizados usando software Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, M I).

Los siguientes constructos binarios expresan las distintas secuencias de fusión de genes TraP:dgf-28: pDAB107527 (Figura 19) contiene TraP4 v2 \dgt-28 v5 (SEC I D No. : 32); pDAB105530 (Figura 20) contiene TraP5 v2: dgt-28 v5 (SEC I D No. : 33); pDAB105531 (Figura 21 ) contiene TraP8 v2: dgt-28 v5 (SEC I D No. : 34); pDAB105532 (Figura 22) contiene TraP9 v2: dgt-28 v5 (SEC ID No. : 35); pDAB105533 (Figura 23) contiene TraP12 v2: dgt-28 v5 (SEC I D No. : 36); y pDAB105534 (Figura 24) contiene La secuencia dgt-28 v5 de pDAB105534 fue modificada en la que el primer codón (GCA) fue cambiado a (GCT).

Construcción vectorial binaria adicional de plantas. Se usaron estrategias de clonado similares a las descritas anteriormente para construir plásmidos binarios que contengan dgt-31, dgt-32, dgt- 33, dgt-? , dgt-3, y dgt-7.

Los genes derivados de microbios; dgt-31, dgt-32, y dgt-33, fueron fusionados con distintos peptidos de tránsito al cloroplasto que los previamente descritos. Se usaron los siguientes péptidos de tránsito al cloroplasto; TraP14 v2 (SEC I D No. : 38), TraP23 v2 (SEC I D No. : 39), TraP24 v2 (SEC ID No. : 40). pDAB107532 (Figura 25) contiene dgt-32 v3 fusionado a TraP14 v2 (SEC ID No.: 41 ), pDAB107534 (Figura 26) contiene dgt-33 v3 fusionado a TraP24 v2 (SEC I D No. : 42), y pDAB107533 (Figura 27) contiene dgt-31 v3 fusionado a TraP23 v2 (SEC I D No. : 43). Los casetes de expresión dgt fueron accionados por el promotor Arabidopsis thaliana Ubiquitin 10 (AtUbM O promotor v2) y flanqueados por el marco de lectura abierto Agrobacterium tumefaciens región no traducida 3' veintitres (AtuORF23 3 ' UTR v1 ). Un casete marcador seleccionable DSM-2 que contenía el promotor del virus mosaico de la yuca vena (CsVMV v2) - DSM-2 - Agrobacterium tumefaciens región no traducida 3' uno (AtuORFI 3 UTR v6) también estaba presente en el vector binario.

Binarios adicionales se construyen en donde dgt-31 v3, dgt-32 v3, y dgt-33 v3 se fusionan a las secuencias de péptido de tránsito al cloroplasto previamente descritas. Por ejemplo, la secuencia TraP8 v2 se fusiona a dgt-31 v3, dgt-32 v3, y dgt-33 v3, y se clona en vectores binarios como se describe anteriormente.

Se construyeron vectores binarios conteniendo los genes clase I ( dgt-1 , dgt-3, ydgt-7). Los siguientes vectores binarios se construyeron y se transformaron en plantas: pDAB4104 (Figura 28), que contiene la secuencia dgt-1 v4 según se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente Estadounidense, No. 201 1 /0124503, flanqueada por las secuencias Nicotiana tabacum Osmotin según se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente Estadounidense, No. 2009/0064376; pDAB102715 (Figura 29); pDAB102716 (Figura 30); pDAB102717 (Figura 31 ); y pDAB102785 (Figura 32). Los distintos péptidos de tránsito al cloroplasto TraP que fueron fusionados a dgt-28, dgt-31, dgt-32, y dgt-33 no se añadieron a los genes clase I , ya que estas secuencias derivadas de plantas poseen péptidos de tránsito al cloroplasto de las plantas nativas. Estos vectores se describen en más detalle en la Tabla 4.

Tabla 4. Descripción de los vectores binarios que contienen un gen EPSP sintasa clase I (es decir, dgt-1, dgt-3, o dgt-7).

Transformación Arabidopsis thaliana. Arabidopsis fue transformada usando el metodo de inmersión de flores de Clough y Bent (1998). Una selecta colonia de Agrobacterium conteniendo uno de los plásmidos binarios descritos anteriormente fue usada para inocular una o más precultivos de 100 mi de caldo YEP conteniendo espectinomicina (100 mg/l) y kanamicina (50 mg/l). El cultivo fue incubado toda la noche a 28°C con agitación consistente a 225 rpm. Las celulas fueron sedimentadas a aproximadamente 5000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente, y el sobrenadante resultante fue desechado. El sedimento celular fue suavemente resuspendido en 400 mi de medio de remojo conteniendo: 5% (p/v) sucrosa, 10 mg/l 6-bencilaminopurina, y 0.04% Silwet™ L-77. Las plantas de aproximadamente 1 mes de edad fueron sumergidas en el medio durante 5 a 10 minutos con agitación suave. Las plantas fueron recostadas y cubiertas con bolsas de plástico transparente u opaco de 2 a 3 horas, y después fueron colocadas verticales. Las plantas fueron cultivadas a 22°C, con fotoperiodos de 16 horas de luz y 8 horas de obscuridad. Aproximadamente 4 semanas después de que las plantas fueron sumergidas, se cosecharon las semillas.

Selección de plantas transformadas. Las semillas ? recién cosechadas [conteniendo los casetes de expresión dgt y DSM-2 ] fueron puestas a secar durante 7 días a temperatura ambiente. Las semillas T fueron sembradas en bandejas de germinación de 26.5 x 51 -cm, cada una recibiendo una alícuota de 200 mg de semilla P estratificada (~10,000 semillas) que habían previamente sido suspendidas en 40 mi de una solución de agarosa al 0.1 % y almacenadas a 4°C durante 2 días para completar los requisitos de vida latente y asegurar la germinación síncrona de las semillas.

Sunshine Mix LP5 fue cubierta con fina vermiculita y sub irrigada con solución de Hoagland hasta quedar húmeda, despues se le dejó drenar por gravedad. Cada alícuota de 40 mi de semillas estratificadas fue sembrada de manera uniforme en la vermiculita con una pipeta y fue cubierta con domos de control de humedad de 4 a 5 días. Los domos fueron retirados 1 día antes de la selección inicial de transformable usando un rocío de glufosinato postemergencia (seleccionando para el gen DSM-2 co transformado).

Siete días después de plantar (DAP) y una vez más 1 1 días después de plantar (DAP), las plantas T (cotiledóneas y etapa If 2-4, respectivamente) fueron rociadas con una solución de herbicida Liberty al 0.2% (200 g ai/l de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) a un volumen de rocío de 10 ml/bandeja (703 L/ha) usando una punta de rocío con aire comprimido DeVilbiss para rociar a una tasa efectiva de 280 g ai/ha de glufosinato por aplicación. Las supervivientes (plantas desarrollándose activamente) fueron identificadas de 4 a 7 días después del rocío final y fueron trasplantadas individualmente a macetas de 3 pulgadas preparadas con medio para macetas (Metro Mix 360). Las plantas trasplantadas fueron cubiertas con domos de control de humedad de 3 a 4 días y fueron colocadas en una cámara de cultivo a 22°C como antes o fueron movidas directamente al invernadero. Los domos fueron posteriormente retirados y las plantas se cultivaron en el invernadero (22±5°C, 50±30% HR, 14 horas luz: 10 obscuridad, como mínimo 500 pE/m2s1 luz natural + suplementaria). El análisis de confirmación molecular fue completado en las plantas Ti supervivientes para confirmar que el gen de tolerancia a la glifosato se hubiera integrado establemente en el genoma de las plantas.

Confirmación molecular. Se confirmó la presencia de transgenes dgt-28 y DSM-2 dentro del genoma de plantas Arabidopsis que fueron transformadas con pDAB1 07527, pDAB1 05530, pDAB105531 , pDAB105532, pDAB105533, o pDAB105534. La presencia de estas secuencias de polinucleótidos fue confirmada mediante ensayos de sonda de hidrólisis, casetes de expresión de genes PCR (también descritos como unidad de transcripción de plantas PCR -- PTU PCR), análisis de transferencias Southern, y análisis PCR de transcripción cuantitativa inversa.

Las plantas T-i Arabidopsis fueron inicialmente seleccionadas mediante un ensayo de sonda de hidrólisis, análogo a TAQMAN™, para confirmar la presencia de los transgénes DSM-2 y dgt-28. Los eventos fueron seleccionados mediante casetes de expresión de genes PCR para determinar si el casete de expresión dgt se integró por completo a los genomas de la planta sin reordenamiento. Los datos generados de estos estudios fueron usados para determinar el número de copias de transgenes e identificar selectos eventos Arabidopsis para el auto fertilización y avance a la generación T2. Las avanzadas plantas T2 Arabidopsis también fueron seleccionadas mediante ensayos de sonda de hidrólisis para confirmar la presencia y para estimar el número de copias de los genes DSM-2 y dgt dentro del cromosoma de la planta. Finalmente se usó un ensayo de transferencias Southern para confirmar el número de copias estimado en un subconjunto de las plantas T-! Arabidopsis.

Se usaron ensayos similares para confirmar la presencia del transgén dgt-1 de plantas transformadas con pDAB4101 , la presencia del transgén dgt-32 de plantas transformadas con pDAB107532, la presencia del transgén dgt-33 de plantas transformadas con pDAB107534, la presencia del transgén dgt-3 de plantas transformadas con pDAB102715, la presencia del transgén dgt-3 de plantas transformadas con pDAB102716, la presencia del transgén dgt-3 de plantas transformadas con pDAB102717, y la presencia del transgén dgt-7 de plantas transformadas con pDAB102785.

Ensayo de sonda de hidrólisis. Se determinó el número de copias en las plantas T^ y T2 Arabidopsis usando el ensayo de sonda de hidrólisis descrito a continuación. Las plantas con diversos números de transgénes fueron identificadas y avanzadas a estudios posteriores de tolerancia al glifosato.

Se obtuvieron muestras de tejido en 96-pocillos y fueron liofilizadas durante 2 días. La maceración del tejido fue realizada con un pulverizador de tejido KLECO™ y con cuentas de tungsteno (Environ Metal INC. , Sweet Home, Oregon). Despues de la maceración del tejido, el ADN genómico fue aislado en formato de alto rendimiento por medio del kit Biosprint™ 96 Plant (Qiagen™, Germantown , M D) de acuerdo al protocolo sugerido por el fabricante. Se cuantificó el ADN genómico por kit de ensayo de ADN Quant-IT™ Pico Green (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADN genómico cuantificado fue ajustado a aproximadamente 2 ng/pL para el ensayo de sonda de hidrólisis usando un gestor de líquidos automatizado BIOROBOT3000™ (Qiagen, Germantown , M D). La determinación del número de copias de transgénes por ensayo de sonda de hidrólisis fue realizado con PCR en tiempo real usando el sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Los ensayos fueron diseñados para DSM-2, dgt-28 y el gen de referencia interno, TAFII15 (Genbank ID: NC 003075; Duarte et al. , (201 ) BMC Evol. BioL, 10:61 ). \ Para amplificación se preparó una mezcla LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) a una concentración final de 1 X en una reacción multiplex de 10 mL de volumen conteniendo 0.1 pM de cada cebador para DSM-2 y dgt-28, 0.4 pM de cada cebador para TAFII15 y 0.2 pM de cada sonda.

Tabla 5. Se realizó una reacción de amplificación de dos etapas con una extensión a 60°C durante 40 segundos con adquisición de fluorescencia. Se corrieron todas las muestras y se usaron los valores de umbral de ciclo (Ct) para el análisis de cada muestra. Se realizó el análisis de los datos de PCR a tiempo real con software LightCycler™ versión 1 .5, usando el módulo 5 Quant relativo y se basa en el metodo DDO?. Para esto se incluyeron en cada corrida una muestra de ADN genómico de un calibrador de copia única y una prueba de copia 2 conocida. Los resultados de número de copia de la pantalla de sonda de hidrólisis se determinaron para las plantas T y T2 transgénicas ío Arabidopsis.

Tabla 5. Información de cebador y sonda para ensayo de sonda de hidrólisis de DSM-2, dgt-28 y gen de referencia interno ( TAFII15 ). 25 Confirmación de i ración 28 mediante análisis de Transferencia Southern. Se usó el análisis de Transferencia Southern para establecer el patrón de integración del fragmento de la cadena T del ADN e identificar eventos que contenían dgt-28. Se generaron datos para demostrar la integración y la integridad de los insertos transgenes dentro del genoma Arabidopsis. Los datos del análisis de Transferencia Southern se usaron para identificar la integración simple de una copia intacta de la cadena T del ADN . Se realizó un análisis detallado Transferencia Southern con una sonda PCR específica al casete de expresión de genes dgt-28. La hibridización de la sonda con ADN genómico que había sido digerido con enzimas de restricción específicas identificó fragmentos de ADN genómico de pesos moleculares específicos, los patrones de los cuales se usaron para identificar eventos transgénicos de longitud completa e inserción simple para el avance a la siguiente generación.

Se recolectaron muestras de tejido en tubos cónicos de 2 mi (Eppendorf™) y se liofilizaron durante 2 días. La maceración del tejido se realizó con un pulverizador de tejido KLECKO™ y con cuentas de tungsteno. Después de la maceración del tejido, el ADN genómico fue aislado con un procedimiento de aislamiento CTAB. El ADN genómico fue purificado más con el kit Qiagen™ Genomic Tips. Se cuantificó el ADN genómico por kit de ensayo de ADN Quant-IT™ Pico Green (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADN genómico cuantificado fue ajustado a 4 pg para tener una concentración consistente.

Para cada muestra se digirieron por completo 4 mg de ADN genómico con la enzimas de restricción Swal (New England Biolabs, Beverlcy, MA) y fueron incubadas a 25°C toda la noche, despues se agregó Nsil a la reacción y se incubó a 37°C durante 6 horas. El ADN digerido fue concentrado por precipitación con Quick Precipitation Solution™ (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) de acuerdo al protocolo sugerido por el fabricante. El ADN genómico fue entonces resuspendido en 25 pl_ de agua a 65°C durante 1 hora. Las muestras resuspendidas fueron cargadas a un gel de agarosa al 0.8% preparado en 1 X TAE y electroforesis toda la noche a 1 .1 V/cm en un amortiguador 1 X TAE. El gel fue secuencialmente sujeto a desnaturalización (0.2M NaOH / 0.6M NaCI) durante 30 minutos, y a neutralización (0.5M Tris-HCI (pH 7.5) / 1 .5M NaCI) durante 30 minutos.

Se realizó la transferencia de fragmentos de ADN a membranas de nylon con efecto pasivo que absorbe una solución 20 X SSC toda la noche a través del gel a una membrana de transferencia IMMOBILON™ NY+ (Millipore, Billerica, MA) usando una mecha de papel para cromatografía y toallas de papel. Después de la transferencia, la membrana fue lavada brevemente con 2X SSC, reticulada con STRATALI NKER™ 1800 (Stratagene, LaJolla, CA), y horneada al vacío a 80°C durante 3 horas.

Las transferencias fueron incubadas con una solución de pre-hibridización (Perfect Hyb plus, Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora a 65°C en botellas de vidrio tipo rodillo usando una incubadora de hibridización modelo 400 (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). Las sondas fueron preparadas de un fragmento PCR conteniendo la secuencia completa de codificación . El amplicón PCR fue purificado usando un kit de extracción de gel QIAEX™ I I y etiquetado con a32P-dCTP mediante el kit de etiquetado Random RT Prime IT™ (Stratagene, La Jolla, CA). Las transferencias se hibridaron toda la noche a 65°C con sonda desnaturalizada agregada directamente al amortiguador de hibridización a aproximadamente 2 millones de cuentas por transferencia por mi. Despues de la hibridización, las transferencias fueron lavadas secuencialmente a 65°C con 0.1 X SSC / 0.1 % SDS durante 40 minutos. Finalmente, las transferencias fueron expuestas a pantallas de fósforo de almacenamiento y toma de imágenes usando un sistema de toma de imágenes Molecular Dynamics Storm 860™.

Los análisis de transferencias Southern completados en este estudio fueron usados para determinar el número de copia y confirmar que eventos selectos contenían el transgén dgt-28 dentro del genoma de Arabidopsis.

Confirmación del Casete de Expresión del Gen dat-28 mediante análisis PCR. La presencia del casete de expresión de gen dgt-28 contenido en los eventos de plantas Ti fue detectado por una reacción de punto terminal PCR. Iniciadores (Tabla 6) específicos a las regiones AtUbM O promotor v2 y AtuORF23 3 'UTR v1 del casete de expresión del gen dgt-28 fueron usados para detección.

Tabla 6. Cebadores de oligonucleótido usados para la confirmación de los casetes de expresión de genes dgt-28.

Las reacciones PCR requerían un protocolo de cielado PCR de tres etapas estándar para amplificar el casete de expresión de genes. Todas las reacciones PCR fueron completadas usando las siguientes condiciones PCR: 94°C durante tres minutos siguientes de 35 ciclos a 94°C durante treinta segundos, 60°C durante treinta segundos, y 72°C durante tres minutos. Las reacciones fueron completadas con el kit EX-TAQ™ PCR (TaKaRa Biotechnology Inc. Otsu, Shiga, Japan) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Despues del ciclo final, la reacción fue incubada a 72°C durante 10 minutos. Se usó electroforesis de gel de agarosa TAE para determinar la magnitud del amplicón PCR. Los amplicones PCR de una magnitud esperada indicaron la presencia de un casete de expresión de gen de longitud completa en el genoma de los eventos Arabidopsis transgenicos.

Confirmación de Transcripción Relativa dat-28 mediante análisis de transcripción inversa cuantitativa PCR. Se recolectaron muestras de tejido de plantas transgénicas dgt-28 en 96 pocilios y se congelaron a 80°C. La maceración del tejido fue realizada con un pulverizador de tejido KLECO™ y con cuentas de tungsteno (Environ Metal I NC., Sweet Home, Oregon). Después de la maceración del tejido, el ARN total fue aislado en formato de alto rendimiento por medio del kit Qiagen™ Rneasy 96 (Qiagen™, Germantown, MD) de acuerdo al protocolo sugerido por el fabricante que incluía el tratamiento Dnasel opcional en la columna. Esta etapa fue posteriormente seguida por un tratamiento adicional Dnasel (Ambion™, Austin, TX) del ARN total extraído. Se realizó síntesis cADN con el ARN total como plantilla con el kit de alta capacidad de transcripción inversa High Capacity cADN Reverse Transcription™ (Applied Biosystems, Austin, TX) de acuerdo al procedimiento sugerido por el fabricante con la adición del oligonucleótido, TVN . La cuantificación de la expresión fue completada por ensayo de sonda de hidrólisis y fue realizada por PCR en tiempo real con el sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Se diseñaron ensayos para dgt-28 y para el gen de referencia interno “proteína desconocida” (Número de Genbank Acceso: AT4G24610) usando el software LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para amplificación , LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) fue preparado a 1 X la concentración final en una reacción singleplex con 10 mL de volumen conteniendo 0.4 mM de cada cebador y 0.2 pM de cada sonda. Tabla 7.

Tabla 7. Cebadores PCR usados para análisis de transcripción inversa cuantitativa PCR de dgt-28.

Se realizó una reacción de amplificación de dos etapas con una extensión a 60°C durante 40 segundos con adquisición de fluorescencia. Todas las muestras se corrieron por triplicado y los valores de umbral de ciclo (Ct) promediados fueron usados para el análisis de cada muestra. Se corrió una reacción de transcripción inversa menos por cada muestra para asegurar que no hubiera nada de contaminación gADN presente. Se realizó el análisis de los datos PCR en tiempo real de acuerdo al metodo AACt. Este ensayo fue usado para determinar la expresión relativa de dgt-28 en eventos transgénicos Arabidopsis que se determinó ser hemicigóticos y homocigóticos. Los niveles relativos de transcripción del dgt-28 mARN variaron de 2.5 veces a 207.5 veces más latos que el control interno. Estos datos indican que las plantas transgénicas dgt-28 contenían un casete de expresión de gen dgt-28 funcional, y que las plantas eran capaces de transcribir el transgén dgt-28.

Análisis de transferencias Western. Se detectó DGT-28 en muestras de hojas obtenidas de plantas Arabidopsis thaliana transgénicas. Los extractos de plantas de plantas transgénicas dgt-28 y proteínas estándares de proteínas DGT-28 fueron incubados con amortiguador muestra NU PAGE® LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) conteniendo DTT a 90°C durante 10 minutos y separados electroforéticamente en un gel de acrilamida prefabricado. Las proteínas fueron entonces electro transferidas a una membrana de nitrocelulosa de acuerdo al protocolo del fabricante. Después de bloquear con la mezcla bloqueante WESTERN BREEZE® (Invitrogen) la proteína DGT-28 fue detectada por el antisuero-DGT-28 seguido por fosfatasa de cabra anticonejo. La proteína detectada fue visualizada por sustrato de quimioluminiscencia BCIP/NBT Western Analysis Reagent (KPL, Gaithersburg, MD). Producción de una proteína DGT-28 intacta mediante transferencia Western indicó que las plantas transgenicas dgt-28 que fueron ensayadas expresaron la proteína DGT-28.

Plantas transgénicas T Arabidopsis conteniendo el transgén 5 dgt-28 fueron rociadas con diversas tasas de glifosato. Se aplicaron tasas elevadas en este estudio para determinar los niveles relativos de resistencia (105, 420, 1 ,680 or 3,360 g ae/ha). Una tasa de uso típica de 1 X de glifosato que controlará a la Arabidopsis sin transformar es de 420 g ae/ha. Las ío formulaciones de glifosato con el agregado de sulfato de amonio se aplicaron a las plantas T? con un pulverizador de surcos calibrado a 187 L/ha. Las plantas ? Arabidopsis que fueron usadas en este estudio eran un número de copia variable del transgén dgt-28. Las plantas de baja copia dgt-28 ? Arabidopsis ís se autopolinizaron y usadas para producir plantas T2. La Tabla 8 muestra la comparación de plantas transgénicas dgt-28, a un gen resistente a herbicida de glifosato, dgt-1 , y controles tipo silvestre. La Tabla 9 muestra la comparación de dgt-32, y dgt-33 a un gen resistente a herbicida de glifosato, dgt-1 , y controles 0 tipo silvestre. La Tabla 10 muestra la comparación de las enzimas bacterianas sintasa EPSP a las enzimas sintasa clase I EPSP y los controles a una tasa de glifosato de 1 ,680 g ae/ha.

Resultados de la selección de glifosato de plantas dat-28 5 Arabidopsis transformadas. Los transformantes Arabidopsis fueron primero seleccionados de los antecedentes de semillas no transformadas usando un esquema de selección de glufosinato. Tres planos o 30,000 semillas fueron analizados para cada constructo TT . Las plantas T seleccionadas arriba fueron caracterizadas molecularmente y las plantas representativas con números de copia variables fueron posteriormente trasplantadas a macetas individuales y rociadas con diversas tasas de glifosato comercial, como se describió previamente. La respuesta de estas plantas se presenta en terminos de % de lesiones visuales 2 semanas después del tratamiento (WAT). Los datos se presentan en una tabla que muestra las plantas individuales exhibiendo pocas o nada de lesiones (<20%), lesiones moderadas (20-40%), o lesiones graves (>40%). Una media aritmética y la desviación estándar se presentan para cada constructo usado para transformación Arabidopsis. El intervalo en respuesta individual también se indica en la última columna para cada tasa y transformación. Arabidopsis (c.v. Columbia) tipo silvestre, no transformada, sirvió como control sensible un glifosato.

El nivel de respuesta de las plantas varió. Esta variancia puede ser atribuida al hecho de que cada planta representa un evento de transformación independiente y por ello el número de copia del gen de interés varía de planta a planta. Se notó que algunas plantas que contenían el transgén no eran tolerantes al glifosato; un análisis completo para determinar si estas plantas expresaron el transgén no se completó. Es posible que la presencia de números de copia altos del transgen dentro de las plantas T-i Arabidopsis haya resultado en silenciamiento del transgén u otros efectos epigenéticos que dieron como resultado sensibilidad al glifosato, a pesar de la presencia del transgén dgt-28.

En la Tabla 10 se presenta el promedio de lesiones general en la población por tasas de glifosato a 1 ,680 g ae/ha para demonstrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con dgt-3, dgt-7, dgt-28, dgt-32, y dgt-33 versus dgt-1 y los controles tipo silvestre.

La tolerancia proporcionada por las enzimas bacterianas sintasa EPSP varió de acuerdo a la enzima específica. DGT-28, DGT-32, y DGT-33 inesperadamente proporcionaron tolerancia significativa al glifosato. Los genes dgt impartieron resistencia a herbicidas a plantas Arabidopsis individuales a través de todos los péptidos de tránsito probados. Como tal, el uso de péptidos de tránsito al cloroplasto adicionales (es decir, TraP8 - dgt-32 o TraP8 - dgt-33) proporcionarían protección a glifosato con niveles similares de lesiones como los reportados dentro de un tratamiento dado.

Tabla 8. dgt-28 transformó la respuesta T Arabidopsis a un intervalo de tasas de glifosato aplicadas postemergencia, en comparación a una población resistente a homocigóticos dgt-1 (T4), y a un control no transformado. % de lesión visual 14 semanas después de la aplicación .

Tabla 9. dgt-32 y dgt-33 transformaron la respuesta Arabidopsis a un intervalo de tasas de glifosato aplicadas postemergencia, en comparación a una población resistente a homocigóticos dgt-1 (T4), y a un control no transformado. % de lesión visual 14 semanas despues de la aplicación.

Tabla 10. dgt-28, dgt-32, dgt-33, dgt-3, y dgt-7 Arabidopsis a glifosato aplicado ha, en comparación a una población asistente a homocigóticos dgt-1 (T4), y a un control no transformado. % de lesión visual 14 semanas después de la aplicación. dat-28 como un Marcador Seleccionable. El uso de dgt-28 un marcador seleccionable para el agente de selección de glifosato es probado con las plantas transformadas de Arabidopsis descritas anteriormente. Aproximadamente 50 semillas de generación T4 de Arabidopsis (homocigotos para dgt- 28) son fortificados en aproximadamente 5,000 semillas de tipo 5 silvestre (sensibles al glifosato). Las semillas son germinadas y las plántulas son rociadas con una dosis seleccionada de glifosato. Se comparan varios tratamientos de glifosato; cada bandeja de plantas recibe ya sea uno o dos tiempos de aplicación de glifosato en uno de los siguientes esquemas de tratamiento: 7 ío DAP (días despues de la plantación), 1 1 DAP, o 7 después de 1 1 DAP. Ya que todas las plantas también contienen el gen de resistencia glufosinato en el mismo vector de transformación, las plantas que contienen dgt-28 seleccionadas con glifosato pueden ser comparadas directamente con 15 DSM-2 o a plantas que contienen pat seleccionadas con glufosinato.

Se aplican tratamientos de Glifosato con una boquilla rociadora DeVilbiss™ como se describió anteriormente. Las plantas transgénicas que contienen dgt-28 son identificadas como 20 “resistentes” o “sensibles” 17 DAP. Los tratamientos de glifosato 26.25-1680 g ae/ha aplicados 7 y 1 1 días después de la plantación (DAP), muestran selección efectiva para las plantas Arabidopsis transgénicas que contienen dgt-28. Las plantas sensibles y resistentes son contadas y el número de plantas 25 tolerantes a glifosato se encuentra que está correlacionado con el número original de semillas transgenicas que contienen el transgén dgt-28 que están plantadas. Estos resultados indican que dgt-28 puede ser usado efectivamente como un marcador seleccionable alternativo para una población de Arabidopsis transformado.

Heredabilidad. Los eventos T^ Arabidopsis de transgénicos confirmados fueron autopolinizados para producir la semilla T2. Estas semillas fueron probadas de descendencia al aplicar el herbicida Ignite™ que contiene glufosinato (200 g ae/ha) a 100 hermanos aleatorios de T2. Cada planta individual T2 fue trasplantada a macetas de 7.5 cm cuadrados previo a la aplicación del rociado (rastrear el rociador a tasa de aplicación 187 L/ha) Las familias Ti (plantas T2) segregadas en el anticipado resistente 3: 1 modelo sensible para un único locus heredado dominantemente con herencia Mendeliana como es determinado por el análisis de Chi cuadrado (P > 0.05). El porcentaje de familias T que segregaron con la herencia Mendeliana esperada están ilustradas en la Tabla 1 1 , y demuestran que la característica dgt-28 se transmite vía herencia Mendeliana a la generación T2 Las semillas fueron recolectadas de 5 a 15 individuos T2 (Semilla T3). Veinticinco hermanos T3 de cada 3-4 familias T2 seleccionados aleatoriamente fueron probados de descendencia como se describió anteriormente. Los datos no mostraron ninguna segregación y así demostraron que dgt-28 y dgt-3 están integrados establemente dentro del cromosoma y heredados de forma Mendeliana al menos tres generaciones.

Tabla 11. Porcentaje de familias T-i (plantas T2 ) segregando como herencia Mendeliana única para una prueba de descendencia de 100 plantas.

Datos de Arabidopsis T . Las plantas de segunda generación (T2) de eventos seleccionados de Arabidopsis T- que contenían un número bajo de copia del transgén dgt-28 fueron caracterizadas por tolerancia a glifosato. El Glifosato fue aplicado como se describió anteriormente. La respuesta de las plantas está presentada en términos de % de lesión visual 2 semanas después del tratamiento (WAT por sus siglas en inglés).

Los datos son presentados como un histograma de individuos exhibiendo poca o ninguna lesión (<20%), lesión moderada (20-40%), o lesión severa (>40%). Son presentadas una media aritmetica y desviación estándar para cada constructo usado para la transformación de Arabidopsis. El intervalo en respuesta individual también está indicado en la última columna para cada tasa y transformación. Arabidopsis de tipo silvestre, no transformado (cv. Columbia) servido como un control sensible de glifosato. En la generación T2 las plantas hemicigotos y homocigotos estuvieron disponibles para pruebas para cada evento y por tanto fueron incluidas para cada proporción de glifosato probada. Las plantas hemicigotos contienen dos alelos diferentes en un locus a diferencia de las plantas homocigotos que contienen los dos mismos alelos en un locus. Se espera variabilidad de respuesta al glifosato en la generación T2 como un resultado de la diferencia en dosis del gen para las plantas hemicigotos a diferencia de las homocigotos. La variabilidad en respuesta a glifosato está reflejada en la desviación estándar e intervalo de respuesta.

En la generación T2 tanto los eventos de dgt-28 de copia única como los de copia múltiple fueron caracterizados por tolerancia a glifosato. Dentro de un evento, las plantas de copia única mostraron niveles similares de tolerancia al glifosato. Los datos característicos para un evento T2 de copia única son presentados en la Tabla 12. Los eventos que contienen dgt-28 vinculado con TraP5 v2 no proporcionaron tolerancia sólida al glifosato en comparación con los constructos de dgt-28 que contenían otros peptidos de tránsito TraP. Sin embargo, los constructos dgt-28 TraP5 sí proporcionaron un bajo nivel de tolerancia de glifosato en comparación al control Columbia no transformado. Se dieron casos cuando los eventos que mostraron contener dos o más copias de dgt-28 fueron más susceptibles a tasas elevadas de glifosato (los datos no se muestran). Este incremento en la sensibilidad al glifosato es similar a los datos previamente descritos para las plantas que también contenían números de copia altos del transgén dgt-28. Es probable que la presencia de números altos de copia del transgén dentro de las plantas Arabidopsis resulte en el silenciado el transgén u otros efectos epigenéticos que resultaron en sensibilidad al glifosato, a pesar de la presencia del transgén dgt-28.

Estos eventos contenían dgt-28 vinculado con TraP5 v2 (pDAB1 05530) , TraP12 v2 (pDAB105533) y Trap13 v2 (pDAB1 05534) .

Además de dgt-28, los eventos de Arabidopsis T2 transformados con dgt-3 son presentados en la Tabla 13. Como se describió para los eventos dgt-28 en la Tabla 12, la tabla de datos contiene un evento representativo que es característico de la respuesta al glifosato para cada constructo. Para la caracterización dgt-3, los constructos que contienen una PTU (Unidad de transformación de planta) única con el gen dgt-3 activado por el promotor AtUbi l O (pDAB102716, Figura 30 y pDAB102715, Figura 29) fueron comparados con constructos con el mismo gen que contiene 2 PTU del gen (pDAB102719, Figura 33; pDAB102718, Figura 34). Los constructos que contenían 2 PTU usaron el promotor AtUbil O para activar una copia del gen y el promotor CsVMV para activar la otra copia. El uso del PTU doble fue incorporado para comparar las plantas transgenicas dgt-3 con las plantas transgénicas dgt-28 que contenían dos copias del transgén. Los datos demostraron que los eventos dgt-3 T2 de copia única con un solo PTU fueron más susceptibles al glifosato que los eventos probados de dgt-28 de copia única, pero fueron más tolerantes que el control no transformado. Las familias que contienen 2 PTU del gen dgt3 proporcionaron un nivel más alto de tolerancia visual al glifosato en comparación a los constructos de 1 PTU . En ambos casos las familias TT fueron comparadas con el dgt-1 y controles de tipo silvestre. Los datos de T2 demuestran que dgt-28 proporciona tolerancia sólida como eventos de copia única.

Tabla 12. Respuesta de eventos de Arabidopsis T2 individuales seleccionados que contienen dgt-28 para post emergencia aplicada de glifosato a tasas variables, en comparación con una población resistente a homocigotos dgt-1 (T4) y a un control no transformado. Lesión % visual 14 días después de la aplicación .

Tabla 13. Respuesta de eventos de Arabidopsis T2 seleccionados transformados con dgt-3 para post-emergencia aplicada de glifosato a tasas variables. Lesión % visual 14 días despues de la aplicación .

Datos de Arabidopsis T,. Las plantas de tercera generación (T3) de eventos seleccionados de Arabidopsis T2 que contenían un número bajo de copia del transgen dgt-28 fueron caracterizadas por tolerancia a glifosato. Se seleccionaron veinticinco plantas por línea con glufosinato según se describe anteriormente y las líneas de cada constructo testeado no segregaron para el gen del marcador seleccionable. El Glifosato fue aplicado como se describió anteriormente. La respuesta de las plantas está presentada en términos de % de lesión visual 2 semanas después del tratamiento (WAT). Los datos son presentados como un histograma de individuos que exhiben poca o ninguna lesión (<20%), lesión moderada (20-40%), o lesión severa (>40%). Se presentan una media aritmética y desviación estándar para cada constructo usado para la transformación de Arabidopsis. El intervalo en respuesta individual tambien está indicado en la última columna para cada tasa y transformación. Arabidopsis de tipo silvestre, no transformado (cv. Columbia) sirvió como un control sensible al glifosato. .

Tabla 14. Respuesta de eventos de Arabidopsis T3 individuales seleccionados que contienen dgt-28 para post emergencia aplicada de glifosato a tasas variables, en comparación a una población resistente a homocigotos dgt-1 (T4) y a un control no transformado. Lesión % visual 14 días después de la aplicación.

Selección de plantas transformadas. Las semillas T recién cosechadas [gen dgt-31, dgt-32, y dgt-33 v1] fueron secadas a temperatura ambiente y enviadas a Indianápolis para pruebas. La semilla Ti fue sembrada en bandejas de germinación de 26.5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc. , Clearwater, M N), recibiendo cada una alícuota de 200 mg de semillas Ti estratificadas (~10,000 semillas) que habían sido previamente suspendidas en 40 mi de solución de agarosa 0.1 % y almacenadas a 4°C durante 2 días para completar los requerimientos de latencia y asegurar la germinación sincrónica de semillas.

Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc. , Bellevue, WA) fue cubierto con vermiculita fina y sub irrigado con solución de Hoaglands hasta que estuviera húmedo, despues se le permitió que drenara por medio de la gravedad. Cada alícuota de 40 mi de semillas estratificadas fue sembrada uniformemente en la vermiculita con una pipeta y cubiertas con domos de humedad (KORD ™ Products, Bramalea, Ontario, Cañada) durante 4-5 días. Los domos fueron removidos una vez que las plantas habían germinado previas a la selección transformante inicial usando aerosol de post-emergencia de glufosinato (seleccionando para el gen dsm-2 co-transformado).

Seis días después de plantar (DAP) y de nuevo 10 DAP, las plantas T (cotiledón y etapa 2-4- If, respectivamente) fueron rociadas con una solución al 0.1 % de herbicida Ignite™ (280 g ai/L glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) a un volumen de rociado de 10 ml/bandeja (703 L/ha) usando una boquilla rodadora de aire comprimido DeVilbiss™ para proporcionar una tasa efectiva de 200 g ae/ha de glufosinato por aplicación . Las sobrevivientes (plantas creciendo activamente) fueron identificadas 4-7 días después del rociado final. Las plantas sobrevivientes fueron trasplantadas individualmente en macetas de 3 pulgadas preparadas con medios para macetas (Metro Mix 360™) Las plantas fueron criadas en el vivero al menos 1 día previo al muestreo de tejido para análisis de número de copias.

Las plantas T1 fueron muestreadas y se completó el análisis de número de copias para el gen dgt-31, dgt-32 y dgt-33 v1. Las plantas T1 fueron despues asignadas a varias tasas de glifosato para que un intervalo de copias estuviera entre cada tasa. Para Arabidopsis, 26.25 g ae/ha de glifosato es una dosis efectiva para 5 distinguir plantas sensibles de las que tienen niveles significativos de resistencia. Tasas elevadas fueron aplicadas para determinar niveles relativos de resistencia (105, 420, 1680, o 3360 g ae/ha). La Tabla 15 muestra las comparaciones recogidas para dgt- 1. ío Todas las aplicaciones de herbicida de glifosato fueron realizadas por rociador de pista en un volumen de pulverización de 187 L/ha. El glifosato usado fue de la fórmula de sal comercial de dimetilamina DURANGO (480 g ae/L, Dow AgroSciences, LLC). Las plantas Ti de copias bajas que mostraron tolerancia al 15 glufosinato o al glifosato fueron accedidas además en la generación T2.

Las primeras transformaciones de Arabidopsis fueron realizadas usando dgt-31, dgt-32, y dgt-33 v1. Los transformantes Ti fueron seleccionados en primer lugar a partir de 0 los antecedentes de las semillas no transformadas usando un esquema de selección de glufosinato. Tres pisos o 30,000 semillas fueron analizados para cada constructo T^ Se calculó la frecuencia de transformación y los resultados de los constructos T1 dgt-31, dgt-32, y dgt-33 están enumerados en la 5 Tabla 15.

Tabla 15. Frecuencia de transformación de los constructos Arabidopsis T1 dgt-31, dgt-32, y dgt-33 seleccionados con glufosinato para la selección del gen marcador seleccionable DSM-2.

Las plantas T seleccionadas fueron trasplantadas posteriormente a macetas individuales y rociadas con varias tasas de glifosato comercial. La Tabla 16 compara la respuesta de dgt-31, dgt-32, y dgt-33 v1 y genes de control para impartir resistencia al glifosato a los transformantes de Arabidopsis T·, . La respuesta se presenta en terminos % de lesión visual 2 WAT. Los datos se presentan como un histograma de individuos que exhiben poca o ninguna lesión (<20%), lesión moderada (20-40%), o lesión severa (>40%). Se presentan una media aritmética y una desviación estándar para cada tratamiento. El intervalo en respuesta individual también está indicado en la última columna para cada tasa y transformación. Arabidopsis de tipo silvestre, no transformado (cv. Columbia) sirvió como un control sensible al glifosato. El gen DGT-31 (vD con peptido de tránsito TraP23 impartió ligera tolerancia al herbicida a plantas individuales de Arabidopsis Ti comparadas con el control negativo, pero el gen exhibido mejoró la tolerancia con el péptido de tránsito TraP8. Tanto DGT-32 como DGT-33 demostraron tolerancia sólida al glifosato a las tasas probadas con TraP8 y con su respectivo péptido de tránsito de cloroplasto diferente (TraP14 y TraP24 respectivamente). Dentro de un tratamiento dado, el nivel de respuesta de planta varió grandemente, lo que puede ser atribuido al hecho que cada planta representa un evento de transformación independiente y por tanto el número de copia del gen de interés varía de planta a planta. Es importante notar que, en cada tasa de glifosato probada, hubo individuos que fueron más tolerantes que otros. Un promedio de lesión por tasa de la población en general se presenta en la Tabla 16 para demostrar la diferencia significativa entre las plantas transformadas con dgt-31, dgt-32, y dgt-33 v1 y los controles dgt-1 v1 o los de tipo salvaje.

Tabla 16. Reacción de los Arabidopsis ^ transformados con dgt-31, dgt-32, y dgt-33 v1 a un intervalo de tasas de glifosato aplicadas post-aparición , en comparación con una población resistente (T4) homocigótica transformada con dgt- 1 , o con un control no transformado. Porcentaje de daño visible 2 semanas después del tratamiento.

Transformación del maíz. Metodos de clonación estándar, según lo descrito anteriormente, se usaron en la construcción de vectores binarios para su uso en la transformación del maíz mediada por Agrobacterium tumefaciens. La Tabla 17 enumera los vectores que se construyeron para la transformación de maíz. Se usaron los siguientes elementos de gen en los vectores que contenían dgt-28 ; el promotor de ubiquitina 1 del Zea mays (ZmUbM ; Patente Estadounidense No. 5,510,474) fue usado para conducir la secuencia de codificación dgt-28 que está flanqueada por una región sin traducir de lipasa 3 del Zea mays (Zmlip 3 UTR; Patente Estadounidense No. 7179902), el casete del marcador seleccionable está compuesto del promotor de ubiquitina 1 del Zea mays que fue usado para conducir la secuencia de codificación aad-1 (Patente Estadounidense No. 7,838,733), que está flanqueado por una región de lipasa 3 sin traducir del Zea mays. La secuencia de codificación aad-1 confiere tolerancia hacia los herbicidas auxina fenoxi, por ejemplo, el ácido 2, 4-diclorofenoxiacetico (2,4-D) y los herbicidas tipo ariloxifenoxipropionato (AOPP).

Las construcciones dgt-28 se fabricaron como vectores binarios estándar y como vectores del sistema superbinario mediado por Agrobacterium (Japan Tobacco, Tokio, JP). Entre los vectores binarios estándar se encuentran el pDAB1 07663, el pDAB107664, el pDAB107665 y el pDAB107665. Los vectores del sistema superbinario mediado por Agrobacterium incluyen el pDAB108384, el pDAB108385, el pDAB108386 y el pDAB 108387.

Se completaron construcciones adicionales que contienen un gen indicador para una proteína fluorescente amarilla ( yfp\ Solicitud de Patente Estadounidense No. 2007/0298412). El pDAB109812 contiene un casete de gen indicador yfp que es conducido por el promotor de ubiquitina 1 del Zea mays y está flanqueado por la región por 5 3 ' sin traducir del Zea mays (región sin traducir Zm per5 3 ; Patente Estadounidense No. 7179902); el casete del marcador seleccionable está compuesto del promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar (SCBV; Patente Estadounidense No. 5,994, 123) que se usa para conducir la expresión de aacf-1 y está flanqueado por la región de lipasa 3' sin traducir del Zea mays. El pDAB101556 contiene un casete de yfp que es conducido por el promotor de ubiquitina 1 del Zea mays y está flanqueado por la región sin traducir 5 3' del Zea mays ; el casete del marcador seleccionable está compuesto del promotor de ubiquitina 1 del Zea mays, que se usa para conducir la expresión de aad-1 y está flanqueado por la región de lipasa 3' sin traducir del Zea mays. El pDAB107698 contiene un casete de dgt- 28 que es conducido por el promotor de ubiquitina 1 del Zea mays y está flanqueado por una región de lipasa 3 sin traducir del Zea mays, un casete de yfp que es conducido por el promotor de ubiquitina 1 del Zea mays y está flanqueado por la región sin traducir per 5 3' del Zea mays, el casete del marcador seleccionable consta del promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar, el cual se usa para conducir la expresión de aad-1 y está flanqueado por la región del lipasa 3' sin traducir del Zea mays. Las tres construcciones son vectores binarios estándar.

Tabla 17. Vectores de transformación del maíz Esterilización del elote v aislamiento del embrión. Para obtener embriones inmaduros del maíz, se cultivaron plantas de la línea endogámica B104 de Zea mays en invernadero y fueron auto-polinizadas o polinizadas por plantas emparentadas para producir los elotes. Los elotes se cosecharon aproximadamente 9-12 días post-polinización. El día del experimento se esterilizó la superficie de los elotes por inmersión en una solución al 20% de hipoclorito de sodio (5%) y fueron sacudidos durante 20-30 minutos, seguido de tres enjuagues con agua esteril. Después de la esterilización, se disecaron asépticamente embriones cigóticos inmaduros (1 .5-2.4 mm) de cada elote y fueron distribuidos al azar en tubos de microcentrífuga que contenían medios líquidos de infección (medio basal bajo en suero, 4.43 gm/l; solución de vitaminas N6 [1000X], 1 .00 ml/l; L-prolina, 700.0 mg/l; sacarosa, 68.5 gm/l; glucosa D( + ), 36.0 gm/l; 10 mg/ml de 2,4-D, 150 mI/I). Para una serie dada de experimentos, los embriones combinados de tres elotes fueron usados para cada transformación.

Inicio del cultivo de Aarobacterium Se untaron unas reservas de glicerol de Agrobacterium que contenían los vectores de transformación binaria descritos arriba sobre placas de medio mínimo AB que contenían antibióticos adecuados y se cultivaron a 20°C durante 3-4 días. Una sola colonia fue seleccionada y untada sobre placas YEP que contenían los mismos antibióticos y se incubó a 28°C durante 1 -2 días.

Cultivo v co-cultivo de Aarobacterium . Se tomaron colonias de Agrobacterium de la placa YEP, fueron suspendidas en 10 mi de medio de infección en un tubo desechable de 50 mi, y la densidad celular se ajustó a OD60o nm de 0.2-0.4 usando un espectrofotómetro. Los cultivos de Agrobacterium se colocaron en un agitador rotatorio a 125 rpm, a temperatura ambiente, mientras que se realizaba la disección del embrión. Embriones cigóticos inmaduros de entre 1 .5 a 2.4 mm de tamaño fueron aislados de los granos de maíz esterilizados y colocados en 1 mi de medio de infección y lavados una vez en el mismo medio. La suspensión de Agrobacterium (2 mi) se agregó a cada tubo y los tubos se colocaron en una plataforma agitadora durante 10-15 minutos. Los embriones fueron transferidos a medios de co- cultivo (Sales EM, 4.33 gm/l; L-prolina, 700.0 mg/l; miomositol, 100.0 mg/l; hidrolizado enzimático de caseína 100.0 mg/l; 30 mM Dicamba-KOH, 3.3 mg/l; Sacarosa, 30.0 gm/l; Gelzan ™, 3.00 gm/l; vitamina EM modificada [1000X], 1 .00 ml/l; 8.5 mg/ml AgNo3, 15.0 mg/l; DMSO, 100 mM), orientados con el escutelo hacia arriba y se incubaron a 25°C, bajo luz de 24 horas a una intensidad de la luz de 50 pmoles/m2/s durante 3 días.

Selección de callos v regeneración de los supuestos acontecimientos. Tras el período de co-cultivo, los embriones fueron transferidos a medios de reposo (Sales EM, 4.33 gm/l; L-Prolina, 700.0 mg/l; 1 ,2,3,5/4,6-hexahidroxiciclohexano, 100 mg/l; MES [ácido (2-(n-morfolino)-etanosulfónico, ácido libre], 0.500 gm/l; hidrolizado enzimático de caseína, 100.0 mg/l; 30 mM Dicamba-KOH , 3.3 mg/l; sacarosa, 30.0 gm/l; Gelzan, 2.30 gm/l; EM-vitamina modificada [1000X], 1 .00 ml/l; 8.5 mg/ml de AgNo3, 15.0 mg/l; Carbenicilina, 250.0 mg/l) sin agente selectivo e incubados bajo luz de 24 horas a una intensidad de la luz de 50 pmole/m2/s y a 25°C durante 3 días.

Unos experimentos sobre la inhibición del crecimiento como reacción a cambios de dosis sugirieron que las concentraciones de glifosato de 0.25 mM y superiores eran suficientes para inhibir el crecimiento celular en el linaje de maíz B104 no transformado. Se transfirieron embriones a medios de selección 1 que contenían 0.5 mM de glifosato (Sales EM, 4.33 gm/l; L-prolina, 700.0 mg/l; miomositol, 110000..00 mmgg//ll;; áácciiddoo MES [(2-(n-morfolino)-etanosulfónico), ácido libre] 0.500 gm/l; Hidrolizado enzimático de caseína, 100.0 mg/l; 30 mM Dicamba-KOH , 3.3 mg/l; sacarosa, 30.0 gm/l; Gelzan™, 2.30 gm/l; EM-vitamina modificada [1000X], 1 .00 ml/l; 8.5 mg/ml de AgNo3, 15.0 mg/l; Carbenicilina, 250.0 mg/l) y se incubaron en la oscuridad o bajo luz de 24 horas a una intensidad de luz de 50 pmoles/m2/s durante 7-14 días a 28°C.

Los callos embriogenicos que proliferaban fueron transferidos a medios de selección 2 que contenían 1 .0 mM de glifosato (Sales EM, 4.33 gm/l; 1 , 2, 3, 5/4,6-hexahidroxiciclohexano, 100 mg/l; L-prolina, 700.0 mg/l; ácido MES [(2-(n-morfolino)-etanosulfónico), ácido libre], 0.500 gm/l; hidrolizado enzimático de caseína, 100.0 mg/l; 30 mM Dicamba-KOH, 3.3 mg/l; sacarosa, 30.0 gm/l; Gelzan™, 2.30 gm/l; EM-vitamina modificada [1000X], 1 .00 ml/l; 8.5 mg/ml de AgNo3, 15.0 mg/l; Carbenicilina, 250.0 mg/l; ácido R-haloxifop 0.1810 mg/l) y se incubaron en la oscuridad o bajo luz de 24 horas a una intensidad de la luz de 50 pmoles/m2/s durante 14 días a 28°C. Esta etapa de selección permitió al callo transgénico proliferar y diferenciarse más. El período de selección de callos duró de tres a cuatro semanas.

Se transfirieron callos embriogénicos proliferantes a medios PreReg que contenían 0.5 mM de glifosato (Sales EM, 4.33 gm/l; 1 ,2,3,5/4,6-hexahidroxiciclohexano, 100 mg/l; L-prolina, 350.0 mg/l; ácido MES [(2-(n-morfolino)-etanosulfónico), ácido libre], 0.250 gm/l; hidrolizado enzimático de caseína, 50.0 mg/l; NAA-NaOH, 0.500 mg/l; ABA-EtOH , 2.50 mg/l; BA 1 .00 mg/l; sacarosa, 45.0 gm/l; Gelzan™, 2.50 gm/l; EM-vitamina modificada [1000X], 1 .00 ml/l; 8.5 mg/ml de AgNo3, 1 .00 mg/l; Carbenicilina, 250.0 mg/l) y fueron cultivados bajo luz de 24 horas a una intensidad de luz de 50 pmoles/m2/s durante 7 días a 28°C.

Se transfirieron callos embriogénicos con brotes semejantes a retoños a medios de regeneración que contenían 0.5 mM de glifosato (Sales EM, 4.33 gm/l; 1 , 2, 3, 5/4,6-hexahidroxiciclohexano, 100.0 mg/l; sacarosa, 60.0 gm/l; Goma Gellan G434™, 3.00 gm/l; EM-vitamina modificada [1000X], 1 .00 ml/l; Carbenicilina, 125.0 mg/l) y fueron cultivados bajo luz de 24 horas a una intensidad de luz de 50 pmoles/m2/s durante 7 días.

Se transfirieron pequeños brotes con raíces primarias a medios de enraizamiento (Sales EM, 4.33 gm/l; EM-vitamina modificada [1000X], 1 .00 ml/l; 1 ,2,3,5/4,6-hexahidroxiciclohexano, 100 mg/l; sacarosa, 60.0 gm/l; goma Gellan G434™, 3.00 gm/l; Carbenicilina, 250.0 mg/l) en fitobandejas y se incubaron bajo 16/8 horas luz/oscuridad a una intensidad de luz de 140-190 pmole/m2/s durante 7 días a 27°C. Se analizaron plántulas transgénicas putativas para determinar el número de copias transgénicas usando los protocolos descritos anteriormente y fueron transferidas a tierra.

Confirmación molecular de la ncia de los antas de maíz. La presencia de las secuencias de polinucleótido dgt- 28 y aacf-1 fue confirmada vía sonda de análisis de hidrólisis. Plantas de maíz aisladas T0 fueron revisadas inicialmente via una sonda de análisis de hidrólisis, análogo a TAQMAN™, para confirmar la presencia de transgenes aad-1 y dgt- 28. Los datos generados por estos estudios fueron usados para determinar el número de copias transgénicas y para seleccionar eventos de maíz transgénico para retrocruzamiento y avance a la generación T i .

Se colectaron muestras de tejido en placas de 96 pocilios, se realizó maceración del tejido con un pulverizador de tejido KLECO™ y granos de acero inoxidable (Hoover Precisión Products, Cumming, GA) en el amortiguador Qiagen™ RLT. Tras la maceración del tejido, se aisló el ADN genómico en formato de alto rendimiento usando el equipo de plantas Biosprint 96™ (Qiagen, Germantown, MD) según el protocolo sugerido del fabricante. El ADN genómico se cuantificó mediante el equipo de análisis de ADN Quant-IT™ Pico Green (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad , CA). El ADN genómico cuantificado se ajustó a aproximadamente 2ng/pl para la sonda de análisis de hidrólisis usando un controlador de líquido automatizado BIOROBOT3000™ (Qiagen, Germantown, MD). La determinación del número de copias transgénicas mediante el ensayo de la sonda de la hidrólisis, análogo a TAQMAN® de ensayo, se realizó mediante PCR en tiempo real usando el LIGHTCYCLER® sistema 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Los análisis fueron diseñados para aad-1 , dgt- 28 y un gen de referencia interna invertasa (Núm. de acceso de Genbank: U 16123.1 ) usando el programa de diseño de sonda LIGHTCYCLER® 2.0. Para la amplificación, se preparó la mezcla LIGHTCYCLER®480 Probe Master (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) en 1 X concentración final en una reacción multiplex en un volumen de 10 mL que contenía 0.4 mM de cada cebador para aad- 1 y dgt- 28 y 0.2 mM de cada sonda (Tabla 18).

Una reacción de amplificación de dos etapas se realizó con una extensión a 60°C durante 40 segundos con la adquisición de fluorescencia. Se procesaron todas las muestras y el promedio de los valores del umbral de ciclo (Ct) se usaron para el análisis de cada muestra. Se realizó el análisis de datos PCR en tiempo real mediante el programa LightCycler® versión 1 .5 usando el módulo de quant relativa a base del metodo AACt. Los controles incluyeron una muestra de ADN genómico de un calibrador de copia única y verificación de dos copias conocidas que se incluyeron en cada ejecución. La Tabla 19 muestra los resultados de las sondas de análisis de hidrólisis.

Tabla 18. Secuencias de cebador y sonda usadas para sondas de análisis de hidrólisis de aad-1 , dgt- 28 y una referencia interna (Invertasa).

Tabla 19. Resultados de número de copias T0 para eventos dgt- 28. Los eventos con bajo número de copias consisten de 1 -2 copias transgenicas, los números de copias únicas aparecen en paréntesis. Los eventos con alto número de copias contenían 3 o más copias transgénicas.

Tolerancia hacia el herbicida en maíz transformado dat- 28. Se le permitió a los eventos de transformación de Zea mays con dgt-28 (T0) aclimatarse en el invernadero y crecieron hasta que las plantas habían pasado de cultivo de tejidos a condiciones de crecimiento en invernadero, (es decir, 2-4 hojas nuevas de aspecto normal habían surgido del verticilo). Las plantas crecieron a 27°C en condiciones de 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad en el invernadero. Las plantas fueron tratadas después con formulaciones comerciales de DURANGO DMA™ (que contenían el herbicida glifosato) con la adición de 2% w/v sulfato de amonio. Las aplicaciones de herbicida se hicieron con un rociador de pista a un volumen de rociado de 187 L/ha, y una altura del rociado de 50 cm. Las plantas T0 fueron rociadas con un intervalo de glifosato que varió desde 280 - 4480 g ea/ha glifosato, la cual es capaz de causar daño significativo a los linajes de maíz no transformados. Una dosis letal se define como la tasa que causa > 95% de daño a las B104 cruzada entre sí.

Los resultados de las plantas de maíz T0 dgt- 28 han demostrado que tolerancia al glifosato se logró hasta a la tasa de 4480 g ea/ha. Se usó un tipo de medio específico en la generación T0. La incidencia mínima de retraso en el crecimiento y el crecimiento en general de las plantas transformadas en comparación con los controles no transformados demostraron que el dgt -28 proporciona tolerancia fuerte al glifosato cuando se vincula a los peptidos de tránsito de cloroplasto TraP5, TraP8 y T raP23.

Algunas plantas seleccionadas T0 son auto fecundado o retrocruzadas para mayor caracterización en la próxima generación. Cien linajes seleccionados dgt- 28 líneas que contienen las plantas ? son rociadas con 140-1 120 g ea/ha de glufosinato o g 105-1680 ae/ha de glifosato. Tanto el marcador seleccionable como el gen resistente al glifosato se construyen en el mismo plásmido. Por lo tanto, si un gen de tolerancia a herbicidas es seleccionado rociando con un herbicida, se cree que ambos genes están presentes. En DAT 14, las plantas resistentes y susceptibles se cuentan para determinar el porcentaje de linajes que se segregado como un solo rasgo mendeliano dominante de lugar único (3R: 1 S) según lo determinado por análisis de Chi cuadrado. Estos datos demuestran que el dgt- 28 es heredable como gen de resistencia robusta al glifosato en una especie de monocotiledóneas. Se aplican tasas mayores de glifosato a los sobrevivientes de Ti o para caracterizar más la tolerancia y la protección que proporciona el gen dgt- 28.

La tolerancia hacia el herbicida en maíz Tn post aparición transformado con dat-28. Se generaron eventos en T0 de dgt-28 vinculados con TraP4, TraP5, TraP8 y TraP23 mediante transformación por Agrobacterium y se permitió que se aclimataran bajo condiciones controladas de cámara de crecimiento hasta que 2-4 hojas nuevas con apariencia normal surgieron del verticilo. Se le asignaron a las plantas números de identificación individual y a una muestra de ellas se le hizo un análisis de número de copias tanto de dgt-28 como de aad-1. A base de los análisis de número de copias, se seleccionaron plantas para hacer análisis de expresión proteínica. Plantas fueron trasplantadas a tiestos más grandes con nuevo sustrato de crecimiento y cultivadas a 27°C en condiciones de 16 horas luz: 8 horas oscuridad en el invernadero. Las plantas restantes que no fueron muestreadas para la expresión de proteínas, a continuación, fueron tratadas con formulaciones comerciales de DURANGO DMA™ (glifosato) con la adición de 2% w/v sulfato de amonio. Los tratamientos se distribuyeron para que cada grupo 5 de plantas contuvieran eventos T0 con variedad en el número de copias. Las aplicaciones de herbicida se hicieron con un rociador de pista a un volumen de rociado de 187 L/ha, y una altura del rociado de 50 cm. Las plantas T0 fueron rociadas con un intervalo de glifosato que varió desde 280 hasta 4480 g ío ea/ha glifosato, la cual es capaz de causar daño significativo a los linajes de maíz no transformados. Una dosis letal se define como la tasa que causa > 95% de daño a las B104 endogámicas. B104 fue el antecedente genetico de los transformados. 15 Los resultados de las plantas de maíz T0 dgt- 28 han demostrado que la tolerancia al glifosato se logró hasta la tasa de 4480 g ea/ha. Tabla 20. La incidencia mínima de retraso en el crecimiento y el crecimiento en general de las plantas transformadas en comparación con los controles no 0 transformados demostraron que el dgt -28 proporciona tolerancia fuerte al glifosato cuando se vincula a TraP5, TraP8 y TraP23.

Tabla 20. Respuesta a eventos T0 dgt-28 de diversos números de copias a tasas de glifosato en un intervalo de 280 a 5 4480 g ae/ha + 2.0% p/v de sulfato de amonio, 14 días después tratamiento.

Análisis de expresión de proteína ELISA estándar demostraron un intervalo promedio de proteína DGT-28 de 12.6 a 22.5 ng/cm2 en los constructos analizados.

Confirmación de tolerancia a qlifosato en la generación F baio condiciones de invernadero. Plantas T0 de copia única que no fueron rociadas fueron retrocruzadas a la referencia B104 no transformada para mejorar la caracterización en la siguiente generación. En la generación T , se evaluó la tolerancia al glifosato para confirmar la herencia del gen dgt-28. En el caso de plantas T se aplicó el herbicida Assure II™ (35 g ae/ha de quizalofop-metil) en la etapa de crecimiento V1 para seleccionar la proteína AAD-1 . En el mismo plásmido se construyeron tanto el gen marcador seleccionadle como el gen resistente al glifosato. Por lo tanto, si se selecciona un gen, se considera que ambos genes están presentes. Despues de 7 días después del tratamiento (DAT) se contaron las plantas resistentes y las plantas sensitivas, y las plantas nulas fueron retiradas de la población. Estos datos demuestran que dgt-28 (v1 ) es hereditario como gen robusto de resistencia al glifosato en una especie monocotiledónea. Se muestrearon las plantas por la caracterización de la proteína DGT-28 por medio de análisis estándar ELISA y de niveles de transcripción ARN. Las plantas resistentes fueron rociadas con 560-4480 g ae/ha de glifosato, como se describió previamente. Los datos demostraron una robusta tolerancia de dgt-28 ligado con los peptidos de tránsito cloroplástica TraP4, TraP5, TraP8 y TraP23 hasta 4480 g ae/ha de glifosato. Tabla 21 .

Tabla 21. Respuesta de eventos dgt-28 de copia única F a tasas de glifosato en el intervalo de 560 a 4480 g ae/ha + 2.0% p/v de sulfato de amonio, 14 días después del tratamiento.

Los datos de expresión de proteína demuestran un intervalo de proteína DGT-28 media de 42.2 a 88.2 ng/cm2 a traves de eventos T, y constructos analizados, estableciendo expresión de proteína en la generación T Caracterización del maíz dat-28 baio condiciones de campo. Se enviaron eventos Ti de copia única a una ubicación en el campo para crear semillas tanto homocigotas híbridas como homocigotas endogámicas, con el fin de realizar una caracterización adicional. Las semillas híbridas fueron creadas cruzando eventos Ti en la línea de transformación del maíz B104 a la línea endogámíca 4XP81 1 , generando poblaciones híbridas segregando 1 : 1 (hemicigotas: nulo) para el evento. Las semillas resultantes fueron enviadas a 2 ubicaciones distintas. Se plantaron un total de cinco eventos de copia única por constructo en cada una de las ubicaciones, con un diseño aleatorio de bloque completo por triplicado. Los campos fueron diseñados para efectuar aplicaciones de glifosato en la etapa de crecimiento V4 y efectuar la aplicación a otro grupo distinto de plantas en la etapa de crecimiento V8. El híbrido convencional 4XP81 1 /B104 fue usado como control negativo.

Hileras experimentales fueron tratadas con 184 g ae/ha de Assure I I™ (106 g ai/l de quizalofop-metil) para eliminar segregantes nulos. Todas las entradas experimentales se segregaron 1 : 1 (sensitivo:resistente) (p=0.05) con respecto a la aplicación de Assure I I™. Se muestrearon plantas resistentes seleccionadas de cada evento con el fin de cuantificar la proteína DGT-28 por medio del análisis ELISA estándar.

Las plantas resistentes al Quizalofop-metil fueron tratadas con el herbicida comercial DURANGO DMA™ (480 g ae/l de glifosato) con la adición de 2.5% p/v de sulfato de amonio, ya fuera en la etapa de crecimiento V4 o en la V8. Las aplicaciones de herbicida fueron hechas con un atomizador con arco de pulverización calibrado para aplicar un volumen de 187 l/ha a una altura de atomización de 50 cm. Las plantas fueron rociadas con glifosato en un intervalo de 1 120 a 4480 g ae/ha de glifosato, capaz de lesionar en forma significativa las líneas de maíz no transformado. Dosis letal se define como la tasa que causa > 95% de lesiones al 4XP81 1 endogámico. Se tomaron evaluaciones visuales de lesiones del porcentaje de clorosis visual, del porcentaje de necrosis, del porcentaje de inhibición de crecimiento y de las lesiones totales visuales a 7, 14 y 21 días despues del tratamiento (DAT). Las evaluaciones fueron comparadas con las revisiones sin tratar cada línea y los controles negativos.

Los datos visuales de lesiones de todas las fechas de evaluación demostraron una robusta tolerancia de hasta 4480 g ae/ha de DURANGO DMA™ en ambas localidades y en los momentos de aplicación . Se presentan los eventos representativos de la aplicación V4 de una ubicación y son consistentes con otros eventos, momentos de aplicación y ubicaciones. Tabla 22. Un evento del constructo que contenía dgt-28 vinculado con TraP23 (pDAB107665) fue tolerante a la selección de Assure I I™ para la proteína AAD-1 , pero fue sensible a todas las tasas aplicadas de glifosato.

Tabla 22. Respuesta de eventos dgt-28 aplicados con un intervalo de glifosato de 1 120 a 4480 g ae/ha + 2.5% p/v de sulfato de amonio en la etapa de crecimiento V4.

Se realizaron evaluaciones adicionales durante la etapa reproductiva de crecimiento a la tasa de 4480 g ae/ha de glifosato. Evaluaciones visuales del pelo de elote, del tiempo de polinización y de cuán llenos estaban los elotes fueron similares a los controles sin tratar de cada línea de todos los constructos, los momentos de aplicación y las ubicaciones. Los resultados de cuantificación para la proteína DGT-28 demostraron un intervalo de expresión media de proteína de 186.4 a 303.0 ng/cm2. Los datos demuestran una robusta tolerancia del maíz transformado dgt-28 bajo condiciones de campo a traves de la etapa reproductiva de crecimientos hasta 4480 g ae/ha de glifosato. Los datos también demostraron detección y función de proteína DGT-28 basadas en los resultados de tolerancia a la atomización.

Confirmación de heredabilidad v tolerancia de maíz of dat-28 en el estado homociaoto. Se plantaron semillas de T1S2 en condiciones de invernadero como se describió anteriormente. Las mismas cinco líneas de copia única que se caracterizaron en condiciones de campo se caracterizaron en el estado homogéneo. Las plantas se hicieron crecer hasta el estado de crecimiento V3 y se separaron en tres tasas de glifosato que oscilaban desde 1 120 hasta 4480 gramos de equivalente ácido por hectárea (g ea/ha) de glifosato (DURANGO DMA™) y cuatro réplicas por tratamiento. Las aplicaciones se realizaron en un rociador de pista como se describió previamente y se formularon en sulfato de amonio al 2.0% en peso por volumen (p/v). Se usó una aplicación de sulfato de amonio como verificación del caso sin tratamiento para cada línea. Se realizaron evaluaciones visuales a los 7 y a los 14 días despues del tratamiento como se describió anteriormente. Los datos demuestran una tolerancia robusta hasta 4480 g ae/ha de glifosato para todos los eventos probados. Tabla 23.

Tabla 23. Respuesta de eventos dgt-28 homocigotos en un intervalo de glifosato desde 1 120 hasta 4480 g ae/ha + sulfato de amonio al 2.0% en p/v.

La línea de pDAB107665 que no fue tolerante en condiciones de campo demostró no tener ninguna tolerancia al glifosato y por lo tanto fue coherente con las observaciones de campo (no se muestran los datos). Excepto por la línea previamente mencionada, todas las replicas de las líneas que fueron tratadas con glifosato no fueron sensibles al gllfosato. Por lo tanto, los datos demuestran heredabilidad a una población homogenea de maíz dgt-28 de una manera mendeliana. La expresión de la proteína DGT-28 mediante el método ELISA estándar demostró un intervalo de expresión de proteína promedio de 27.5 a 65.8 ng/cm2 a través de eventos de copia simple que fueron tolerantes al glifosato. Los datos demuestran una proteína funcional y una estabilidad de ia proteína DGT-28 a través de las generaciones.

Uso de glifosato como un marcador seleccionable de tolerancia al herbicida con posterioridad al surgimiento. Como se describió anteriormente, se trasladaron plantas transformadas T0 de un cultivo de tejidos y se aclimataron en el invernadero. Los eventos probados contenían dgt-28 vinculado a los péptidos de tránsito a cloroplastos TraP5, TraP8 y TraP23. Se demostró que estas plantas T0 presentaron una tolerancia robusta hasta 4480 g ea/ha de glifosato, y se controlaron las plantas no transformadas con glifosato a una concentración tan baja como 280 g ea/ha. Estos datos demuestran que se puede usar dgt-28 como un marcador seleccionable usando una concentración de glifosato que oscile desde 280 hasta 4480 g ea/ha.

Se añadió un número de semillas de líneas fijas que contienen el transgén dgt-28 a un número de semillas de maíz no transformado. Se plantaron las semillas y se las dejó crecer hasta el estado de desarrollo V1 -V3, momento en el cual se rociaron las plantitas con dosis seleccionadas de glifosato en el intervalo de 280 a 4480 g ea/ha. Despues de 7 a 10 días, se contaron las plantas sensibles y las resistentes, y la cantidad de plantas resistentes al glifosato se correlacionó con el número original de semillas transgénica que contienen el transgén dgt-28 que se plantaron.

Apilamiento de maíz dat-28. Se usa la proteína AAD-1 como el marcador seleccionable en maíz transformado dgt-28 para fines de investigación. El gen aad-1 también puede usarse como una característica de tolerancia al herbicida para proporcionar una tolerancia robusta a 2,4-D hasta una aplicación V8 en un cultivo. Se caracterizaron cuatro eventos de los constructos pDAB107663 (TraP4 -. -.dgt-28), pDAB107664 (TraP8: .dgt-28) y pDAB107666 (TraP5: :dgí-28) conforme a la tolerancia a una mezcla en tanque de glifosato y 2,4-D. El estudio de caracterización se completó con semilla F1 en condiciones de invernadero. Las aplicaciones se hicieron con un rociador de pista como se describió anteriormente a las siguientes tasas: 1 120-2240 g ea/ha de glifosato (selectivo para el gen dgt-28), 1 120-2240 g ea/ha de 2,4-D (selectivo para el gen aad-D, o una mezcla de tanque de los dos herbicidas a las tasas descritas. Las plantas se clasificaron a los 7 y a los 14 días después del tratamiento. En la Tabla 24 se muestran los resultados del rociado para las aplicaciones de los herbicidas.

Tabla 24. Respuesta del maíz Fi aad-1 y dgt-28 rociados con 2240 g ea/ha de 2,4-D, glifosato y una mezcla en tanque combinación de los dos herbicidas 14 días despues del tratamiento.

Los resultados confirman que dgt-28 puede apilarse con éxito con aad-1 , incrementando así el espectro de herbicidas que pueden aplicarse al cultivo de interés (glifosato + ácidos fenoxiacéticos para dgt-28 y aad-1 , respectivamente). En producción de cultivos donde es difícil controlar malezas de hoja ancha o existen biotipos de malezas resistentes se puede usar el apilamiento de herbicidas como un medio de controlar malezas y proteger el cultivo de interés. También se pueden apilar características adicionales de insumo y producción con el gen dgt-28 en maíz y otras plantas.

Transformación de la soja. Se generó soja transgénica ( Glycine max) que contenía un transgen dgt- 28 establemente integrado a través de una transformación mediada por Agrobacterium de explantes de nodos cotiledones de soja. Para iniciar la transformación, se usó una cepa desarmada de Agrobacterium que portaba un vector que contenía un dgt- 28 funcional.

La transformación mediada por Agrobacterium se llevó a cabo usando un procedimiento modificado de nodo de mitad de cotiledón de Zeng et al. (Zeng P. , Vadnais D.A. , Zhang Z. , Polacco J.C. , (2004), Plant Cell Rep. , 22(7): 478-482).

Brevemente, se germinaron semillas de soja (cv. Maverick) en medio basal y se aislaron nodos cotiledones y se infectaron con Agrobacterium. La iniciación de brotes, el alargamiento de estos y el medio para enraizar se suplementan con cefotaxima, timentina y vancomicina para extraer la Agrobacterium . Se usó una selección vía un herbicida para inhibir el crecimiento de brotes no transformados. Los brotes seleccionados se transfieren a un medio para enraizar para el desarrollo de las raíces y después se transfieren a una mezcla de suelo para la aclimatación de las plantitas.

Las hojuelas terminales de las plantitas se trataron tópicamente (mediante la téenica de pintado de hojas) con un herbicida para cribar transformantes putativos. Las plantitas cribadas se transfirieron al invernadero, se les permitió aclimatarse y se pintaron las hojas con un herbicida para confirmar la tolerancia. Estas plantas transformadas T0 putativas se muestrearon y se usaron análisis moleculares para confirmar la presencia del marcador seleccionable herbicida, y del transgen dgt- 28. Se permitió que las plantas T0 se auto fertilicen en el invernadero para producir semilla T Se puede usar un segundo método de transformación de la soja para producir plantas de soja transgénica adicionales. Se usa una cepa desarmada de Agrobacterium que porta un vector binario que contiene dgt- 28 para iniciar la transformación La transformación mediada por Agrobacterium se llevó a cabo usando un procedimiento modificado de media semilla de Paz et al., (Paz M. , Martínez J ., Kalvig A. , Fonger T. , y Wang K. , (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213). En breve, se esterilizaron durante toda la noche semillas maduras de soja con gas cloro y se las embebió con H2O esterilizada veinte horas antes de la transformación de las plantas mediada por Agrobacterium. Las semillas se cortaron por la mitad mediante un corte longitudinal a lo largo del hilo para separar la semilla y extraer el recubrimiento de la semilla. Se cortó el eje embriónico y se extrajo todo brote o germen axial del nodo cotiledonar. Los explantes de la media semilla resultante se infectaron con Agrobacterium. La iniciación de brotes, el alargamiento de estos y el medio para enraizar se suplementaron con cefotaxima, timentina y vancomicina para extraer la Agrobacterium. Se empleó una selección herbicida para inhibir el crecimiento de brotes no transformados. Los brotes seleccionados se transfirieron a un medio para enraizar para el desarrollo de las raíces y despues se transfirieron a una mezcla de suelo para la aclimatación de las plantitas.

Las plantas transformadas T0 putativas se muestrearon y se usaron análisis moleculares para confirmar la presencia del marcador seleccionable y del transgén dgt-28. Se identificaron diversos eventos por contener los transgénes. Se hizo proceder a estas plantas T0 a análisis adicionales y se les permitió que se auto fertilicen en el invernadero para producir semilla T Confirmación de la heredabilidad de dat-28 a la generación T-¡_. Se evaluó la heredabilidad de la proteína DGT-28 en la generación T en una de dos maneras. El primer método incluyó plantar semilla T en un medio Metro-mix y aplicar 41 1 g ea/ha de Ignite™ 280 SL en plantas germinadas en el estado de crecimiento del primer trifoliato. El segundo método consistió en homogeneizar semilla para un total de 8 réplicas usando un cojinete de bolas y un gen moledor. Pruebas de tira ELISA para detectar la proteína PAT se usaron entonces para detectar eventos heredables ya que el marcador seleccionable estaba sobre el mismo plásmido que dgt-28. Por cualquier método, si una planta única era tolerante al glufosinato o se detectaba con la prueba de tira PAT ELISA, el evento demostraba heredabilidad a la generación T 1.

Se cribó un total de cinco constructos para determinar heredabilidad como se describió anteriormente. Los plásmidos contenían dgt-28 unido a TraP4, TraP8 y TraP23. Los eventos en todos los constructos demostraron un 68% de heredabilidad de la proteína PAT: :DGT-28 a la generación TY Tolerancia al herbicida posterior al surgimiento en soja T transformada por dat-28. Semillas de eventos Ti que se determinaron ser heredables por los metodos de cribado previamente descritos se plantaron en medio Metro-mix en condiciones de invernadero. Se hicieron crecer las plantas hasta que el primer foliato estuvo completamente expandido y se trataron con 41 1 g ea/ha de Ignite™ 280 SL para la selección del gen pat como se describió anteriormente. A las plantas resistentes de cada evento se les dieron identificadores únicos y se muestrearon para análisis de cigosidad del gen dgt-28. Los datos de cigosidad se usaron para asignar 2 réplicas hemicigotas y 2 homocigotas para cada tasa de glifosato aplicada lo que permitía un total of 4 réplicas por tratamiento cuando existían suficientes plantas. Estas plantas se compararon con tabaco Petite havana salvaje. Todas las plantas se rociaron con un rociador de pista fijado a 187 L/ha. Las plantas se rociaron de un intervalo de 560 a 4480 g ea/ha de sal de dimetilamina (DMA) DURANGO™. Todas las aplicaciones se formularon en agua con la adición de sulfato de amonio (AMS) al 2% en p/v. Las plantas se evaluaron a los 7 y a los 14 días después del tratamiento. A las plantas se les asignó una calificación por lesión con respecto a atrofia, clorosis y necrosis visuales globales. La generación Ti es segregante y, por lo tanto, se espera alguna respuesta variable debido a la diferencia en cigosidad.

Tabla 25. Los resultados del rociado demuestran a los 14 días despues del tratamiento una tolerancia robusta hasta 4480 g ea/ha de glifosato de al menos un evento dgt-28 por constructo caracterizado. Todos los eventos de copia única representativos proveyeron tolerancia hasta 4480 g ea/ha comparados con el control negativo Maverick.

Protección de dat-28 contra tasas elevadas de qlifosato en la generación T . Se llevó a cabo una prueba de progenie de 45 plantas en dos a cinco líneas T2 de dgt-28 por constructo. Las líneas homocigotas se eligieron sobre la base de análisis de cigosidad completados en la previa generación. Las semillas se plantaron como se describió anteriormente. Las plantas se rociaron despues con 41 1 g ea/ha de Ignite 280 SL para la selección del marcador seleccionable pat como se describió previamente. Las plantas resistentes y las sensibles se contaron 3 días después del tratamiento.

Para constructos que contenían TraP4 unido con dgt-28 (pDAB107543 y pDAB107548), nueve de doce líneas probadas no se segregaron, confirmando así líneas homogéneas en la generación T2. Las líneas que contenían TraP8 unido con dgt-28 (pDAB107545) mostraron dos de las cuatro líneas sin segregantes y demostraron una herencia mendeliana por al menos dos generaciones de dgt-28 en la soja. Se tomaron muestras de tejidos de las plantas resistentes y se cuantificó la proteína DGT-28 mediante métodos ELISA estándar. Los datos demostraron un intervalo de la proteína DGT-28 promedio de 32.8 a 107.5 ng/cm2 para las líneas T2 no segregantes probadas. Las líneas del constructo pDAB107553 (TraP23 r.dgt-28) no fueron previamente seleccionadas con glufosinato, y se usó la respuesta a la dosis de glifosato tanto para probar homogeneidad como tolerancia a tasas elevadas de glifosato. Réplicas de las líneas del constructo pDAB107553 fueron tolerantes a tasas que oscilaron desde 560 hasta 4480 g ea/ha de glifosato, y por lo tanto se confirmó que eran una población homogenea y heredable al menos dos generaciones.

Se aplicaron tasas de DMA DURANGO que oscilaban desde 560 a 4480 g ea/ha de glifosato a soja en las etapas de trifoliato 2-3 como se describió anteriormente. Datos visuales de lesión a los 14 días después del tratamiento confirmaron los resultados de tolerancia que se demostraron en la generación Tabla 26. Los datos demuestran una tolerancia robusta del tabaco dgt-28 hasta 3360 g ea/ha de glifosato a través de dos generaciones, comparado con el control no transformado.

Transformación de arroz con dat-28. Se genera arroz transgenico ( Oryza sativa) que contiene un transgén dgt-28 establemente integrado por medio de una transformación de semilla de arroz estéril mediada por Agrobacterium . Para iniciar 5 la transformación, se usa una cepa desarmada de Agrobacterium que porta un vector binario que contiene un dgt-28 funcional.

El medio de cultivo se ajusta a un pH 5.8 con KOH 1 M y se solidifica con Phytagel de 2.5 g/l (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Los callos embriogénicos se cultivan en discos de Petri de 100 x ío 20 mm que contienen 30 mi de medio semisólido. Se hacen crecer las plantitas de arroz en 50 mi de medio en cajas MAGENTA. Las suspensiones celulares se mantienen en matraces cónicos de 125 mi que contienen 35 mi de medio líquido y se rota a 125 rpm. La inducción y el mantenimiento de los cultivos embriogénicos tienen ís lugar en la oscuridad a 25-26°C, y la regeneración de las plantas y el cultivo de la planta entera tienen lugar en una habitación iluminada con un fotoperíodo de 16 horas (Zhang et al. 1996).

La inducción y el mantenimiento del callo embriogénico se realizan en un medio basal N B modificado como se describió 20 previamente (Li et ai. 1993), donde el medio se adapta para contener 500 mg/l de glutamina. Los cultivos en suspensión se inician y se mantienen en un medio líquido SZ (Zhang et al. 1998) con la inclusión de 30 g/l de sacarosa en lugar de maltosa. Un medio osmótico (NBO) que consiste de un medio NB con la 5 adición de 0.256M de cada uno, manitol y sorbitol. Se selecciona un callo resistente al herbicida en un medio NB suplementado con el agente herbicida selectivo apropiado por 3-4 semanas. La preregeneración se realiza en un medio (PRH50) que consiste de un medio NB con ácido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), ácido a-naftalenacético (NAA) de 1 mg/l, ácido abscísico (ABA) de 5 mg/l y un herbicida selectivo por 1 semana. La regeneración de las plantitas sigue al cultivo en un medio de regeneración (RNH50) que comprende un medio NB que contiene 2,4-D, NAA de 0.5 mg/l y un herbicida selectivo hasta que se regeneran los brotes putativamente transgénicos. Los brotes se transfieren a un medio para enraizar con sales básales de Murashige y Skoog a la mitad de la fuerza iónica y vitaminas B5 de Gamborg suplementado con sacarosa al 1 % y un herbicida selectivo.

Se esterilizaron semillas desecadas maduras de Oryza sativa L. japónica cv. Taipéi 309 como se describe en Zhang et al. 1996. Se indujeron tejidos embriogénicos mediante el cultivo de semillas de arroz maduras estériles en un medio NB en la oscuridad. El callo primario, de aproximadamente 1 mm de diámetro, se separa del escutelo y se usa para iniciar una suspensión celular en un medio líquido SZ. Las suspensiones se mantienen entonces como se describe en Zhang 1996. Los tejidos embriogénicos derivados de suspensiones se separan del cultivo líquido 3 a 5 días después del subcultivo previo y se colocan en un medio osmótico NBO para formar un círculo de aproximadamente 2,5 cm de extensión en un disco de Petri y se cultiva por 4 horas antes del bombardeo. 16 a 20 horas despues del bombardeo, los tejidos se transfieren del medio NBO a un medio de selección NBH50, asegurando que la superficie bombardeada esté cara arriba, y se incuba en la oscuridad durante 14-17 días. Se separa entonces el callo recientemente formado de los explantes bombardeados originales y se lo coloca en las cercanías en el mismo medio. Después de 8-12 días adicionales se identifica visualmente un callo opaco, relativamente compacto, que es transferido a un medio de preregeneración PHR50 por 7 días en la oscuridad . El callo en crecimiento, que se vuelve más compacto y opaco, se subcultivo entonces en un medio de regeneración RNH50 por un período de 14 a 21 días con un fotoperíodo de 16 horas. Los brotes regenerantes se transfieren a cajas MAGENTA que contienen medio de MSH50. Las múltiples plantas regeneradas de un único explante se consideran hermanas y se tratan como una línea de plantas independiente. A una planta se la califica como positiva para el gen dgt-28 si produce raíces blancas y gruesas y crece vigorosamente en medio MSH50. Una vez que las plantitas alcanzan el tope de las cajas MAGENTA, se transfieren a tierra en una maceta de 6 cm en condiciones de humedad del 100% por una semana, y después se llevan a una cámara de crecimiento con un período de luz de 14 horas a 30°C y en la oscuridad a 21 °C por 2 a 3 semanas antes de trasplantarlas a macetas de 13 cm en el invernadero. Las semillas se juntan y secan a 37°C por una semana antes de almacenarlas a 4°C.

Análisis Tn de arroz con dqt-28. Los transformantes de arroz transplantados obtenidos mediante un metodo de transformación de A grobacterium se trasplantaron en un medio y se aclimataron a las condiciones del invernadero. Todas las plantas se sometieron a la detección PCR del dgt-28 y los resultados demuestran veintidós eventos PCR positivos para pDAB1 10827 (TraP8: .dgt-28) y un mínimo de dieciséis eventos PCR positivos para pDAB1 10828 (TraP23: dgt-28). El análisis Southern para dgt-28 de los eventos PCR positivos demostró eventos simples (1 -2 copia) para ambas construcciones. La expresión de la proteína en eventos T0 seleccionados demostró intervalos de expresión de la proteína DGT-28 desde por debajo de los niveles detectables hasta 130 ng/cm2. Los eventos T0 seleccionados del constructo pDAB1 10828 se trataron con DU RANGO DMA™ a razón de 2240 g ae/ha según lo descrito anteriormente, y se evaluaron 7 y 14 días después del tratamiento. Los datos demostraron una resistencia robusta a la tasa de glifosato aplicada. Se permitió a todas las plantas positivas para PCR producir semillas Ti para una mayor caracterización.

Heredabilidad del Dqt-28 en arroz. Se llevó a cabo una prueba de progenia con 100 plantas en cuatro líneas Ti de dgt-28 del constructo pDAB1 10827 que contenían el péptido de tránsito al cloroplasto TraP8. Las semillas se plantaron en macetas llenas de sustrato. Se procedió despues a atomizar todas las plantas con 560 g ae/ha de DURANGO DMA™ para la selección del gen dgt-28 según se describe anteriormente. Siete DDT, se contaron las plantas resistentes y las sensibles. Dos de las cuatro líneas analizadas para cada constructo segregaron como locus único, la característica Mendeliana dominante (3R: 1 S) según se determinó mediante análisis Chi cuadrado. El Dgt-28 es un gen de resistencia al glifosato heredable en varias especies.

Tolerancia al herbicida de postemeraencia en arroz T con transformación del dat-28. Las plantas con resistencia T^ de cada evento usadas en las pruebas de progenie recibieron identificadores únicos y se les realizó un análisis de cigosidad del gen dgt-28. Se usaron datos de cigosidad para asignar 2 réplicas hemicigóticas y 2 homocigóticas a cada tasa de glifosato aplicado por un total de 4 réplicas por tratamiento. Estas plantas se compararon con el arroz kitaake de tipo silvestre. Se atomizó a todas las plantas con un pulverizador configurado a 187 L/ha. Se roció las plantas con un intervalo de entre 560-2240 g ae/ha de DURANGO DMA™. Todas las aplicaciones se formularon en agua con el agregado de 2% p/v de sulfato de amonio (AMS, por sus siglas en inglés). Se evaluaron las plantas 7 y 14 días después del tratamiento. Se les asignó una calificación visual de lesiones según su falta de crecimiento, clorosis y necrosis globales. La generación Ti es segregadora, por lo cual se espera una respuesta variable debido a la diferencia de cigosidad.

Los resultados de la pulverización demuestran que a 7 DDT (días despues del tratamiento) se detectaron mínimas lesiones vegetales con elevadas tasas de glifosatos (no se muestran datos).

Tabla 27. Los datos de lesiones visuales 14 DDT demuestran menos del 15% de lesiones visuales medias hasta 2240 g ae/ha de glifosato.

Se evaluó la detección de proteína del DGT-28 en las replicas de todas las líneas T1 analizadas de pDAB1 10827. Los datos demuestran que la proteína media del DGT-28 comprende desde 20-82 ng/cm2 hasta 21 -209 ng/cm2 para réplicas hemicigóticas y homocigóticas respectivamente. Estos resultados demostraron una expresión estable de la proteína a la generación J- y tolerancia del arroz con dgt-28 de hasta 2240 g ae/ha de glifosato después de una aplicacióm de 560 g ae/ha de glifosato usada para la selección.

Transformación del tabaco con dat-28. Se transformaron trozos de las hojas de tabaco (cv. Petit Havana) usando Agrobacterium tumefaciens que contenía el transgén dgt-28. Se inocularon colonias únicas que contienen el plásmido con el transgén dgt-28 en 4 mi de medio YEP con espectinomicina (50 mg/ml) y estreptomicina (125 pg/ml) y se incubaron durante la noche a 28°C en un agitador a 190 rpm. El cultivo de semillas de 4 mi después se usó para inocular un cultivo de 25 mi del mismo medio en una matraz Erlenmcyer de 125 mi con deflectores. Este cultivo se incubó a 28°C agitando a 190 rpm hasta que alcanzó una O D6OO de ~1 ,2. Después se colocaron diez mi de suspensión de Agrobacterium en placas Petri™ esterilizadas de 60 x 20 mm.

Trozos de hojas recién cortados (0.5 cm2) de plantas cultivadas asépticamente en medio EM (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS,) con 30 g/l de sucrosa en bandejas PhytaTrays™ (Sigma, St. Louis, MO) en 10 mi de cultivo hecho durante la noche de Agrobacterium por unos minutos, se secan con papel de filtro esteril y después se colocaron en el mismo medio con el agregado de 1 mg/l de ácido indolacético y 1 mg/l de 6-bencil amino purina. Tres días más tarde, los trozos de hojas co-cultivados con Agrobacterium que hospeda el transgén dgt-28 se transfirieron al mismo medio con 5 mg/l de Basta™ y 250 mg/l de cefotaxima.

Después de 3 semanas, las plántulas T0 individuales se transfirieron al medio EM con 10 mg/l de Basta™ y 250 mg/l de cefotaxima tres semanas adicionales antes de trasplantarlas a tierra y transferirlas al invernadero. Se permitió que las plantas T0 seleccionadas (según se identificaron usando protocolos de análisis molecular descritos anteriormente) se auto-polinicen y se recolectaron las semillas de las cápsulas cuando se secaron por completo. Se analizó la cigosidad y la expresión del gen indicador (según se describe a continuación) y se identificaron las plantas seleccionadas que contenían el transgén dgt-28.

Las plantas se transfirieron al invernadero después de lavar el agar de las raíces, trasplantándolas en tierra en macetas cuadradas de 13.75 cm, colocando las macetas en bolsas Ziploc® (SC Johnson & Son , Inc.), colocando agua del grifo en el fondo de las bolsas y colocándolas bajo luz indirecta en un invernadero a 30°C durante una semana. Después de 3-7 días, se abrieron las bolsas; se fertilizaron las plantas y se les permitió crecer en la bolsa abierta hasta que las plantas se aclimataron al invernadero, momento en el cual se retiraron las bolsas. Las plantas se cultivaron bajo condiciones de invernadero cálido normales (27°C durante el día, 24°C durante la noche, día de 16 horas, luz natural + suplementaria mínima = 1200 pE/m2s1).

Antes de la propagación, se tomaron muestras de las plantas T0 para realizar un análisis de ADN para determinar el número de copia del inserto dgt-28 mediante PCR en tiempo real. Se colocó el tejido fresco en tubos y se liofilizó a 4°C durante 2 días. Una vez que el tejido se secó por completo, se colocó una perla de tungsteno (Valenite) en el tubo y las muestras se sometieron a 1 minuto de molienda en seco usando un molino de perlas Kelco. Despues se siguió el procedimiento estándar de aislamiento de ADN DNeasy™ (Qiagen, DNeasy 69109). Una alícuota del ADN extraído se tiñió con Pico Green (Molecular Probes P7589) y se cuantificó en el fluorímetro (BioTek™) con estándares conocidos para obtener la concentración en ng/mI. Se usó un total de 100 ng de ADN total como molde. Se llevó a cabo la reacción PCR en el termocielador Geneamp™ 9700 (Applied Biosystems), al someter las muestras a 94°C por 3 minutos y 35 ciclos de 94eC por 30 segundos, 64°C por 30 segundos, y 72°C por 1 minuto y 45 segundos seguido de 72°C por 10 minutos. Los productos CPR se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 % teñido con EtBr y confirmado con transferencia Southern.

Se regeneraron de cinco a nueve eventos PCR positivos con 1 -3 copias del gen dgt-28 de 3 constructos que contenían una secuencia de peptidos de tránsito al cloroplasto diferente (TraP4, TraP8 y TraP23) y se trasladaron al invernadero.

Se obtuvieron muestras de todas las plantas con PCR positivo para cuantificación de la proteína DGT-28 mediante método ELISA estándard. Se detectó proteína DGT-28 en todas las plantas PCR positivas y se notó una tendencia al aumento de la concentración de proteína según aumentaba el número de copias del dgt-28.

Heredabilidad aad-12 (vD en tabaco. Se llevó a cabo una prueba de progenie con 100 plantas en cinco líneas Ti de dgt-28 por constructo. Los constructos contenían una de las siguientes secuencias de péptidos de tránsito al cloroplasto: TraP4, TraP8 o TraP23. Se estratificaron, plantaron y trasplantaron las semillas de manera muy parecida a como se realizó el procedimiento con Arabidopsis detallado anteriormente, con la excepción de que las plantas nulas no fueron retiradas mediante una selección inicial antes del trasplante. Todas las plantas fueron atomizadas con 280 g ae/ha de Ignite 280 SL para la selección del marcador seleccionable pat según se describe anteriormente. Tres DDT, se contaron las plantas resistentes y las sensibles.

Cuatro de las cinco líneas analizadas para cada constructo segregaron como locus único, la característica Mendeliana dominante (3R: 1 S) según se determinó mediante análisis Chi cuadrado. El Dgt-28 es un gen de resistencia al glifosato heredable en varias especies.

Tolerancia al herbicida de postemerqencia en tabaco T con transformación del dat-28. Las plantas con resistencia Ti de cada evento usadas en las pruebas de progenie recibieron identificadores únicos y se les realizó un análisis de cigosidad del gen dgt-28. Se usaron datos de cigosidad para asignar 2 replicas hemicigóticas y 2 homocigóticas a cada tasa de glifosato aplicado por un total de 4 réplicas por tratamiento. Estas plantas se compararon con el tabaco Petite havana de tipo silvestre. Se atomizó a todas las plantas con un pulverizador configurado a 187 L/ha. Se roció las plantas con un intervalo de entre 560-4480 g ae/ha de DURANGO DMA™. Todas las aplicaciones se formularon en agua con el agregado de 2% p/v de sulfato de amonio (AMS, por sus siglas en inglés). Se evaluaron las plantas 7 y 14 días después del tratamiento. Se les asignó una calificación de lesiones según su falta de crecimiento, clorosis y necrosis globales visual. La generación T1 es segregadora, por lo cual se espera una respuesta variable debido a la diferencia de cigosidad.

Los resultados de la pulverización demuestran que a 7 DDT (días después del tratamiento) se detectaron mínimas lesiones vegetales con elevadas tasas de glifosatos (no se muestran datos). Después de 14 DDT, los datos visuales de lesiones demuestran lesiones aumentadas con eventos de copia única del constructo que contenía TraP4 en comparación con eventos de copia única de los constructos TraP8 y TraP23. Tabla 28.

Tabla 28. A una tasa de 2240 g ae/ha de glifosato, se demostró una lesión promedio de 37.5% con el evento que contenía TraP4, mientras que los eventos que contenían TraP8 y TraP23 demostraron una lesión promedio de 9.3% y 9.5% respectivamente.

Estos resultados demostraron una tolerancia del dgt-28 de hasta 4480 g ae/ha de glifosato, así como diferencias en la tolerancia proporcionada por las secuencias de peptidos de tránsito al cloroplasto vinculadas al gen dgt-28.

Protección del 28 contra altas tasas de en la generación T . Se llevó a cabo una prueba de progenie con 25 plantas en dos a tres líneas T2 de dgt-28 por constructo. Se seleccionaron las líneas homocigóticas en base a los análisis de cigosidad llevados a cabo en la generación previa. Se estratificaron, plantaron y trasplantaron las semillas según se describe anteriormente. Todas las plantas fueron atomizadas con 280 g ae/ha de Ignite 280 SL para la selección del marcador seleccionable pat según se describe anteriormente. Tres DDT, se contaron las plantas resistentes y las sensibles. Ninguna de las líneas analizadas para cada constructo segregó, lo que confirma las líneas homogeneas en la generación T2 y demuestra la herencia mendeliana a través de al menos dos generaciones de dgt-28 en tabaco.

Se aplicaron tasas de DURANGO DMA™ que comprenden de 420-3360 g ae/ha de glifosato a tabaco con 2-3 hojas, según se describe anteriormente. Datos de lesiones visuales 14 DDT confirmaron los resultados de tolerancia que se demostraron en la generación T1. Resultados foliares de líneas con dos copias del constructo que contenía TraP4 demostraron una tolerancia similar a la de las líneas con copia única con TraP8 y TraP23 (no se muestran los datos).

Tabla 29. Las líneas con copia única del constructo que contenía TraP4 con dgt-28 demostraron mayores lesiones en comparación con las líneas de constructos que contenían TraP8 y TraP23 con dgt-28.

Los datos demuestran una tolerancia robusta del tabaco con dgt-28 hasta 3360 g ae/ha de glifosato a traves de dos generaciones en comparación con el control sin transformar.

Se obtuvieron muestras de las plantas seleccionadas de cada evento antes de realizar la aplicación de glifosato para análisis de la proteína DGT-28 mediante método ELISA estándar para DGT-28. Los datos demostraron una expresión media de proteína DGT-28 de las líneas simples (1 -2 copias) a través de los constructos desde 72.8-1 14.5 ng/cm2. Los datos demuestran que el dgt-28 está expresando proteína en la generación T2 del tabaco transformado y los datos de tolerancia confirman que la proteína DGT-28 es funcional.

Apilamiento de dat-28 para aumentar el espectro del herbicida en tabaco (cv, Petit Havana). Se cruzaron de manera recíproca las plantas con dgt-28 homocigótico (pDAB107543 y pDAB 107545) y aad-12 v1 (pDAB3278) ( ver PCT/US2006/042133 para las últimas, lo que se incorpora aquí en esta referencia en su totalidad) y se recolectaron semillas Las semillas F de dos cruzas recíprocas se estratificaron y se trataron; 6 repeticiones de cada cruza se trataron con 1 120 g ae/ha de glifosato (selectivo para el gen dgt-28), 1 120 g ae/ha 2,4-D (selectivo para el gen aad-12), o una mezcla en tanque de ambos herbicidas a las tasas descritas. Las plantas se clasificaron 14 DDT. Los resultados de las atomizaciones se muestran en la Tabla 30.

Tabla 30. Respuesta Los resultados confirman que el gen dgt-28 puede apilarse con exito con el aad-12 (vD, de esta manera aumentando el espectro de herbicidas que pueden aplicarse al cultivo de interés (glifosato + ácido fenoxiacético para dgt-28 y aad-12, respectivamente). En la producción de cultivos en donde existan malas hierbas de hojas anchas difíciles de controlar o biotipos de malas hierbas resistentes, el apilamiento puede usarse como medio de control de malas hierbas y de protección del cultivo de interes. Los caracteres adicionales de entrada o salida también podrían apilarse con el gen dgt-28.

Resistencia al Glifosato en Trigo. Producción de vectores binarios que codifican DGT-28. Se diseñaron vectores binarios que contenían la expresión DGT-28 y casetes de selección PAT y se ensamblaron usando habilidades y téenicas comúnmente conocidas en la industria. Cada casete de expresión DGT-28 contenía el promotor, 5 de región sin traducir e intrón del gen Ubiquitina (Ubi) de Zea mays (Toki et al Plant Physiology 1992, 100 1503-07), seguido de una secuencia de codificación consistente en uno de los cuatro péptidos de tránsito (TraP4, TraP8, TraP23 o TraP5) fusionado con el extremo 5 de una versión sintética del gen 5-enolpiruvilshikimate-3-fosfato sintasa (DGT-28), que había sido optimizado mediante codón para su expresión en plantas. El casete con la expresión del DGT-28 terminaba con una región sin traducir (UTR) de 3 que comprende el terminador transcripcional y el sitio de poliadenilación de un gen de lipasa (Vpl) de Z. mays (Paek et al Mol Cells 1998 30;8(3) 336-42). El casete de selección PAT consistía del promotor, una región 5 sin traducir e intrón del gen Actina (Act 1 ) de Oryza sativa (McEIroy et al The Plant Cell 1990 2(2) 163-17D, seguido de una versión sintética del gen de la fosfinotricina acetil transferasa (PAT) aislado de Streptomyces viridochromogenes, que había sido optimizado por codón para su expresión en plantas. El gen PAT codifica una proteína que confiere resistencia a los inhibidores de la glutamina sintetasa que 5 comprende fosfinotricina, glufosinato y bialafos (Wohlleben et al Gene 1988, 70(1 ), 25-37). El casete de selección se terminó con la UTR 3 que comprende el terminador transcripcional y sitios de poliadenilación del gen 35s del virus mosaico del coliflor (CaMV) (Chenault et al Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-ío 1396).

El casete de selección de sintetizó con un proveedor de síntesis de genes comercial (GeneArt, Life Technologies) y se clonó en un vector binario del tipo Gateway. Los casetes de expresión del DGT-28 se subclonaron en pDONR221 . El clon de 15 ENTRADA resultante se usó en una reacción de LR Clonase II (Invitrogen, Life Technologies) con el vector binario Gateway que codificaba el casete de expresión de la fosfinotricina acetil transferasa (PAT). Inicialmente se clasificaron las colonias de todos los plásmidos reunidos mediante digestión restrictiva de 0 ADN purificado usando endonucleasas de restricción obtenidas de los laboratorios New England BioLabs (N EB; Ipswich, MA) y Promega (Promega Corporation, Wl). Se realizaron preparaciones de ADN con plásmidos usando el kit Q IAprep Spin Miniprep (Qiagen, Hilden) o el Pure Yield Plasmid Maxiprep System 25 (Promega Corporation, Wl), siguiendo las instrucciones de los proveedores. Se secuenció el ADN plasmídico de los clones seleccionados usando el protocolo de secuenciamiento en ciclos ABI Sanger Sequencing and Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies). Los datos de las secuencias se reunieron y analizaron usando el software Sequencher™ (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, M I).

Se transformó a los cuatro clones de expresión binarios resultantes: pDAS000122 (T raP4-DGT28), pDAS000123 (T raP8-DGT28), pDAS000124 (TraP23-DGT28) y pDAS000125 (TraP5-DGT28) en la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens.

Producción de constructo con eventos de trigo transaenicos con expresión de dat.28. Se generaron plantas de trigo transgénicas que expresaban uno de los cuatro constructos de DGT-28 mediante transformación mediada por Agrobacterium usando la línea donante de trigo Bobwhite MPB26RH , siguiendo un protocolo similar al de Wu et al. Transgenic Research 2008, 17:425-436. Se seleccionaron eventos transgénicos putativos T0 para tolerancia a la fosfinotricina (PPT), el fenotipo otorgado por el marcador seleccionable PAT, y se transfirieron a la tierra. Se cultivaron las plantas T0 bajo condiciones de contención en invernadero y se produjeron semillas T1 . En total se generaron aproximadamente 45 eventos T0 por cada constructo de expresión DGT-28.

Resistencia al glifosato en eventos de trigo Tn con dat - 28. Se permitió a los eventos T0 aclimatarse en el invernadero y se cultivaron hasta que emergieron del verticilo de 2-4 hojas nuevas aparentemente normales (es decir, las plantas habían pasado del cultivo de tejidos a condiciones de crecimiento en el invernadero). Se cultivaron las plantas a 25°C bajo 12 horas de luz suplementaria en el invernadero hasta su maduración . Se completó un análisis de resistencia al glifosato y análisis Taqman iniciales en las plantas T1 cultivadas bajo las mismas condiciones descritas previamente. Los datos permitieron determinar que la heredabilidad de los eventos Ti fuera caracterizada aún más. Seis eventos Ti con copias bajas (1 -2 copias) y dos con múltiples copias se replantaron en condiciones de invernadero y se cultivaron hasta alcanzar la fase de 3 hojas. Se atomizaron las plantas Ti con una formulación comercial de glifosato (DURANGO DMA™) en un intervalo de 420 - 3360 g ae/ha, los que puede causar lesiones significativas a las líneas de trigo sin transformar. Se incluyó en la aplicación el agregado de 2% p/v de sulfato de amonio. Una dosis letal se define como la tasa que causa >75% de lesiones al control Bob White MPB26RH sin transformar. Se aplicó el herbicida.

En este ejemplo, las aplicaciones de glifosato se usaron tanto para determinar la segregación del gen dgt-28 en la generación Ti como para demostrar su tolerancia a niveles aumentados de glifosato. La respuesta de las plantas se presenta en términos de una escala visual de lesiones 21 días después del tratamiento (DDT). Se presentan los datos en forma de histograma de individuos que exhiben menos del 25% de lesiones visuales (4), 25% -50% de lesiones visuales (3), 50%-75% de lesiones visuales (2) y más del 75% de lesiones (1 ). Se presenta una desviación media y estándar aritmética para cada constructo usado para la transformación del trigo. El intervalo de clasificación de cada respuesta individual también se indica en la última columna para cada tasa y transformación. El trigo silvestre sin transformar (c.v. Bob White MPB26RH) funcionó como control sensible al glifosato. En la generación Ti hubo plantas hemicigotas y homocigotas disponibles para realizar pruebas para cada evento y por lo tanto se incluyeron para cada tasa de glifosato evaluada. Las plantas hemicigotas contienen la mitad de la dosis del gen que las plantas homocigotas, por lo que se puede esperar una variabilidad de las respuestas al glifosato en la generación T i .

Los resultados de las plantas de trigo Ti con dgt-28 demostraron que se alcanzó una tolerancia al glifosato a tasas de hasta 3360 g ae/ha con los péptidos de tránsito al cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 y TraP23. Tabla 31 . Los datos pertenecen a un evento Ti de copias bajas pero representan a la población de cada constructo.

Tabla 31. Respuesta de los eventos de copias bajas de trigo Ti dgt-28 al glifosato 21 días después del tratamiento.

A los 21 DDT, se cuentan las plantas resistentes y sensibles al tratamiento para determinar el porcentaje de líneas que segregaron como locus simple, una tendencia mendeliana dominante (3R: 1 S) según se determinó mediante análisis Chi cuadrado. Tabla 32. Estos datos demuestran que el dgt- 28 es heredable como un gen robusto de resistencia al glifosato en especies monocotiledóneas.

Tabla 32. Porcentaje de eventos Ti dgt-28 por constructo que demostraron heredabilidad mendeliana basado en una selección con glifosato en tasas que van de 420-3360 g ae/ha.

Ejemplo 4: Secuencias de Peptido de Tránsito al Cloroplasto Quimerico(TraP)para la Expresión de Transaénes en Maíz de Importancia en Agronomía Crv2Aa: La proteína CRY2Aa del Bacillus thuringiensis ha demostrado actividad contra Helicoverpa zea (CEW) y Ostrinia nubilalis (ECB). Se analizó en maíz una versión única del gen cry2Aa (SEC ID No. : 10), con sesgo de codones para maíz. En este experimento, se evaluó el Cry2Aa solo y en conjunto con el péptido de tránsito al cloroplasto quimérico TraP8 en maíz para determinar la actividad de tolerancia a insectos y para evaluar el efecto que tendría la secuencia del péptido de tránsito al cloroplasto quimérico TraP8 v2 en la expresión de la proteína Cry2Aa en maíz.

Se clonaron el constructo pDAB109807 que contiene la secuencia del péptido de tránsito al cloroplasto quimérico (SEC ID No.: 8) y un vinculador de codones GCA antes del gen cry2Aa y se incorporaron al constructo pDAB109807 (Figura 12) para la evaluación de la tolerancia a insectos en plantas de maíz. Los constructos resultantes contenían dos unidades de transcripción de plantas (PTU). La primera PTU comprende el promotor Ubiquitin 1 Zea mays (promotor ZmUbM ; Christensen, A. , Sharrock R. , y Quail P. , (1992) Genes poliubiquitina en maíz: estructura, perturbación térmica de la expresión y corte y empalme de la transcripción, y actividad del promotor después de la transferencia a protoplastos mediante electroporación, Biología Molecular de Plantas, 18:675-689), gen de fusión TraP8-cry2Aa (TraP8 Cry2Aa), y región sin traducir de Lipasa 3 de Zea mays (Zmlip 3 UTR;US Patente Estadounidense No 7, 179,902). Se confirmaron los constructos mediante restricción de la digestión 5 de enzimas y secuenciamiento. La segunda PTU comprende el promotor del Virus Baciliforme de la Caña de Azúcar (promotor SCBV, Patente Estadounidense No. 6,489,462), gen tolerante al herbicida aad-1 que contenía un líder MSV y el intrón 6 del gen del alcohol deshidrogenasa 1 (AAD-1 ; Patente Estadounidense ío No. 7,838,733, y secuencia Líder MSV; Genbank Cta. No.

FJ882146.1 , y el intrón del alcohol deshidrogenasa; Genbank Cta. No. EF539368.1 ), y región sin traducir de Lipasa 3 de Zea mays (Zmlip 3 UTR). Se construyó un plásmido de control, pDAB107687, que no contenía una secuencia de peptidos de ís tránsito al cloroplasto aguas arriba del gen cry2Aa, y se lo incluyó en los estudios (Figura 13). Se introdujeron los plásmidos en Agrobacterium tumefaciens para la transformación de las plantas.

Se recolectaron mazorcas del cultivo B104 de Zea mays de 10 a 12 días después de la polinización. Se les quitó la chala a 0 las mazorcas cosechadas y se esterilizaron en su superficie mediante inmersión en una solución al 20% de lavandina comercial (Lavandina germicida Ultra Clorox®, 6.15% de hipoclorito de sodio) y dos gotas de Tween, por 20 minutos, seguido de tres enjuagues en agua esterilizada desionizada 5 dentro de una campana de flujo laminar. Se retiraron los embriones cigóticos inmaduros (1 .8 a 2.2 mm de largo) de manera aseptica de cada mazorca y se distribuyeron en uno o más tubos de microcentrífuga que contenían 2.0 mi de suspensión de Agrobacterium a la que se la había agregado 2 mI de surfactante Break-Thru® S233 al 10%.

Una vez completada la actividad de aislamiento de los embriones, el tubo con embriones se cerró y se colocó en una plataforma agitadora por 5 minutos. El contenido del tubo se vertió en una bandeja con medio de cultivo y la suspensión líquida de Agrobacterium se retiró con una pipeta de transferencia estéril desechable. Se colocó la bandeja de co-cultivo que contenía los embriones en la parte trasera de la campana de flujo laminar con la tapa semi-abierta durante 30 minutos; pasado ese tiempo, se orientaron los embriones con el escudete hacia arriba usando un microscopio. Después se devolvió la bandeja de cocultivo a la parte trasera de la campana de flujo laminar con la tapa semi-abierta por 15 minutos más. Después se cerró la bandeja, se selló con cinta de microporo 3M , y se colocó en una incubadora a 25°C con 24 horas/día de luz a aproximadamente 60 pmol m-2 s-1 de intensidad de luz.

Después del período de co-cultivo, se transfirieron los embriones a un medio de Descanso. No se colocaron más de 36 embriones en cada bandeja. Las bandejas se envolvieron con cinta de microporo 3M y se incubaron a 27°C con 24 horas de luz al día a una intensidad de luz de aproximadamente 50 pmol m-2 s-1 por 7-10 días. Los embriones con callos se transfirieron posteriormente al medio de Selección I. No se transfirieron más de 18 embriones por bandeja con medio de Selección I. Las bandejas se envolvieron con cinta de microporo 3M y se incubaron a 27°C con 24 horas de luz al día a una intensidad de luz de aproximadamente 50 pmol m-2 s-1 por 7 días Los embriones con callos se transfirieron posteriormente al medio de Selección I I . No se colocaron más de 12 embriones con callos en cada bandeja con medio de Selección I I . Las bandejas se envolvieron con cinta de microporo 3M y se incubaron a 27°C con 24 horas de luz al día a una intensidad de luz de aproximadamente 50 pmol m-2 s-1 por 14 días.

En esta fase los callos resistentes se transfirieron a un medio de pre-regeneración. No se colocaron más de 9 embriones con callos en cada bandeja con medio de pre-regeneración . Las bandejas se envolvieron con cinta de microporo 3M y se incubaron a 27°C con 24 horas de luz al día a una intensidad de luz de aproximadamente 50 pmol m-2 s-1 por 7 días. Los callos regenerados se transfirieron al medio de regeneración en bandejas Phytatrays™ y se incubaron a 28°C con 16 horas de luz/8 horas de luz por día a aproximadamente 150 pmol m-2 s-1 de intensidad de luz por 7-14 días o hasta que se desarrollaron brotes. No se colocaron más de 5 callos en cada bandeja Phytatray™. Despues se aislaron los brotes pequeños con raíces primarias y se transfirieron a un medio Brote/Raíz. Las plántulas enraizadas de aproximadamente 6 cm o más se trasplantaron a la tierra y se colocaron en una cámara de crecimiento para su endurecimiento.

Se asignaron identificadores únicos a las plantas transgenicas y se las transfirió al invernadero de manera regular. Se trasplantaron las plantas de las bandejas Phytatrays™ a pequeñas macetas (T. O. Plastics, SVD 3.5 pulgadas (8.89 centímetros), 700022C) llenas de medio de crecimiento (Premier Tech Horticulture, ProMix BX, 0581 P) y se las cubrió con domos de humedad para ayudar a aclimatar las plantas. Se colocaron las plantas en una cámara de crecimiento Conviron™ (28°C/24°C, fotoperíodo de 16-horas, 50-70% HR, 200 pmol de intensidad de luz) hasta que alcanzaron la fase V3-V4. Esto ayudó a aclimatar las plantas a la tierra y a temperaturas más rigurosas. Después se llevaron las plantas al invernadero (Tipo de Exposición a la Luz: Foto o Asimilación; Límite Alto de Luz: 1200 PAR; largo de 16-horas por día; 27°C Día/24°C Noche) y se trasplantaron de las macetas pequeñas a macetas de 5,5 pulgadas. Aproximadamente 1 -2 semanas después del trasplante a las macetas más grandes se procedió a realizar la toma de muestras de las plantas para el bioensayo. Se analizó una planta por evento.

Se identificó a los eventos seleccionados para su avance a la próxima generación según el número de copias de los genes, la detección de proteína con Western blot y la actividad contra los insectos del bioensayo. Los eventos que contenían el gen de resistencia a la espectinomicina se tuvieron en cuenta, pero no necesariamente se los retiró para el avance. Los eventos seleccionados para el avance se trasplantaron a macetas de 5 galones. Se registraron observaciones periódicamente para monitorizar cualquier fenotipo anormal. Se colocaron bolsas para brotes sobre los brotes antes de la aparición de las barbas para evitar la contaminación cruzada con polen extraño. Todos los brotes que produjeron barbas antes de que fueran cubiertos se identificaron y se retiraron. Despues se cubrió el segundo brote y se usó para las polinizaciones. Se registraron en la base de datos las plantas que produjeron brotes anormales o que no produjeron brotes. Se cortaron las barbas el día anterior a las polinizaciones para proporcionar un roce parejo para aceptar el polen y se auto-polinizaron las plantas.

Las plantas para selección T1 se atomizaron 7 días después de sembradas. Se las cultivó en macetas de 4 pulgadas (10.16 centímetros) con sustrato Metro 360 con 15 macetas por bandeja. La fase de crecimiento de las plántulas era de V1 -V1 .5. Se marcaron las macetas con germinación pobre o que contenían plantas muy pequeñas se (verticilo todavía cerrado) para no incluirlas en la evaluación de selección. Las bandejas enteras con plantas se colocaron después en bandejas secundarias para la aplicación de atomizador para su monitorización. Las bandejas se colocaron de a dos en vez en el atomizador Mendel, configurado para proporcionar un volumen de 187 L/ha al área meta usando una boquilla plana 8002E (Tee Jet). Se formuló una solución con 35 g ae/ha de Assure I I (quizalofop) + 1 % COC (concentrado de aceite de cultivo) para la aplicación. Se usó un volumen de 15 mils/atomización para calcular el total de solución para atomizar necesaria. Cálculos; (35 g ae/ha) x (1 ha/1871) x (1 I/ 97.7 g ae de Assure II) = solución 0.192% o 28.74 mI/15 mi H20 + 1 % v/v Despues de la aplicación, las plantas se dejaron secar por una hora en el laboratorio de atomización antes de devolverlas al invernadero. Aproximadamente 1 -2 semanas después del trasplante a las macetas más grandes se procedió a realizar la toma de muestras de las plantas para los bioensayos. Se analizó una planta por evento.

Todos los eventos T0 que pasaron el filtro del análisis molecular se analizaron para detectar los niveles de expresión de la proteína Cry2Aa. Los eventos del constructo de control, pDAB107687, que contenía Cry2Aa sin un TraP tuvieron un nivel de expresión de Cry2Aa significativamente más alta (15.0 ng/cm2) en comparación con los eventos de pDAB109807 (5.0 ng/ cm2) que contenían TraP8. A pesar de los niveles de expresión reducidos de los eventos pDAB109807, éstos aún expresaban la proteína Cry2Aa.

También se analizaron los eventos T1 para determinar los niveles de expresión de la proteína Cry2Aa. Los eventos del constructo de control, pDAB107687, que contenía Cry2Aa sin un TraP tuvieron un nivel de expresión de Cry2Aa significativamente más alta (55 y 60 ng/cm2) en comparación con los eventos de pDAB109807 (aproximadamente 20 a 40 ng/ cm2) que contenían TraP8. A pesar de los niveles de expresión reducidos de los eventos pDAB109807, estos aún expresaban la proteína Cry2Aa.

Se realizaron pruebas en las plantas transgénicas que contenían genes Bt para determinar su actividad insecticida en bioensayos llevados a cabo con larvas de lepidópteros recién nacidas en hojas de las plantas transgénicas. Las especies de lepidópteros analizadas aquí fueron el Taladrador Europeo del maíz, Ostrinia nubialis (Hübner) (ECB) y el Gusano del Maíz, Helicoverpa zea (CEW).

Se llenaron parcialmente bandejas con 32 pozos (C-D International, Pitman, NJ) con 2% de solución de agar y se dejó que el agar solidifique. Se tomaron secciones de hojas de aproximadamente 1 pulgada2 de cada planta y se colocaron en los pozos de las bandejas de 32 pozos, de una por pozo. Se colocó un trozo de hoja en cada pozo, y se analizaron dos trozos de hojas por planta y por insecto. Se produjo una infestación masiva con los insectos usando un pincel, colocando 10 larvas recién nacidas en cada pozo. Se sellaron las bandejas con tapas adhesivas perforadas que permitieron la ventilación durante la prueba. Se colocaron las bandejas a 28°C, 40% hr, 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad por tres días. Después de la duración de la prueba, se tomó un simple porcentaje de daños para cada trozo de hoja. Se promedió la clasificación de daños para cada prueba, lo cual se usó junto con el análisis de expresión de proteínas para llevar a cabo análisis de correlación.

Los resultados del bioensayo T0 y Ti indicaron que la secuencia quimerica de péptidos de tránsito de cloroplasto TraP8 ha sido funcional y que los Eventos pDAB109807 brindaron protección contra los insectos probados. En los Eventos T1 , las plantas que expresaron la proteína Cry2Aa sin el TraP, (pDAB1 07687) , presentaron un nivel promedio de daño a la hoja que no fue estadísticamente diferente a la planta que expresó la proteína Cry2Aa con TraP8 (pDAB109807) en todas las especies probadas. Estos resultados no fueron sorprendentes, dado que las plantas que expresaron la proteína Cry2Aa sin TraP, (pDAB107687) expresaron niveles más altos de proteína, comparado con las plantas que expresaron la proteína Cry2Aa sin T raP8, (pDAB109807).

VIP3Ab1 : La proteína Vip3Ab1 de Bacillus thuringiensis ha demostrado actividad contra Helicoverpa zea (CEW), cogollero del maíz (FAW) y cogollero del maíz resistente (rFAW). Los genes Vip3Ab 1 v6 (SEC ID No.: 1 1 ) y Vip3Ab 1 v7 (SEC ID No. : 12) fueron expresados y probados para tolerancia a insectos en maíz. En este experimento, Vip3Ab 1 v6 y Vip3Ab 1 v7 fueron evaluados separadamente y conjuntamente con el péptido de tránsito de cloroplasto quimérico TraP8 en maíz para determinar la actividad de tolerancia a insectos y para evaluar el efecto de la secuencia quimerica de péptidos de tránsito de cloroplasto TraP8 v2 en la expresión de las proteínas Vip3Ab 1 v6 y Vip3Ab 1 v7 en maíz.

El constructo pDAB1 1 1481 (Figura 14) que contiene la secuencia de polinucleótido que codifica los péptidos de tránsito de cloroplasto quimérico TraP8 v2 (SEC ID No.: 8) y un enlace de codón GCA fueron clonados río arriba del gen Vip3Ab1 v6 y probados para la tolerancia a insectos en plantas de maíz. La construcción resultante contenía dos unidades de transcripción planta (PTU). La primera PTU comprende el promotor Zea mays Ubiquitin 1 (ZrnUbM promoter; Christensen, A., Sharrock R. , y Quail P. , (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation , Plant Molecular Biology, 18:675-689), gen de la fusión TraP8-V¡p3Ab 1 v6 (TraP8 - Vip3Ab1 v6) y Zea mays Peroxidase5 3 región no traducida (ZmPer 5 3 UTR). El constructo ha sido confirmado por digestión de ADN con enzimas de restricción y secuenciación. La segunda PTU comprende el promotor del Sugar Cañe Baciliforme Virus (SCBV promoter; U .S. Patent No. 6,489,462), aad-1 gen de tolerancia a los herbicidas conteniendo secuencia líder de MSV y alcohol deshidrogenasa 1 intrón 6 (AAD-1 ; Patente Estadounidense No. 7,838,733, and MSV Leader sequence; Genbank Acc. No. FJ882146.1 , and the alcohol dehydrogenase intron; Genbank Acc. No. EF539368.1 ), y Zea mays Lipasa 3 región no traducida (Zmlip 3 UTR). Un plásmido de control, pDAB1 1 1479, que no contenía secuencia de peptidos de tránsito de cloroplasto río arriba del gen Vip3Ab1 v6 ha sido construido e incluido en los estudios. (Figura 15). Los plásmidos fueron introducidos en Agrobacterium tumefaciens para la transformación de la planta.

El constructo pDAB1 1 1338 (Figura 16) que contiene la secuencia quimérica de péptidos de tránsito de cloroplasto Trap8 v2 (SEC ID No. : 8) y un enlace de codón GCA fueron clonado río arriba del gen Vip3Ab 1 v7 y probado para detección de tolerancia a insectos en plantas de maíz. El constructo resultante contenía dos unidades de transcripción de plantas (PTU). La primera PTU consistía en el promotor Zea mays Ubiquitin 1 (ZmUbM promoter; Christensen, A. , Sharrock R. , and Quail P. , (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689), el gen de la fusión TraP8- Vip3Ab1 v7 (TraP8 - Vip3Ab1 v7) y región no traducida de Zea mays Peroxidase5 3 (ZmPer 5 3 UTR). El constructo ha sido confirmado por digestión de ADN con enzimas de restricción y secuenciación. La segunda PTU consistía en el promotor del Sugar Cañe Baciliforme Virus (SCBV promoter; Patente Estadounidense No. 6,489,462), aad-1 gen de tolerancia a los herbicidas conteniendo una secuencia líder de MSV y alcohol deshidrogenase 1 intrón 6 (AAD-1 ; Patente Estadounidense No. 7,838,733, y MSV Leader sequence; Genbank Acc. No. FJ882146.1 , and the alcohol dehydrogenase intron; Genbank Acc. No. EF539368.1 ), y región no traducida de Zea mays región no traducida de Lipasa 3 (Zmlip 3 UTR). Un plásmido de control, pDAB1 12710, que no contenía secuencia de peptidos de tránsito de cloroplasto río arriba del gen Vip3Ab 1 v7 ha sido construido e incluido en los estudios. (Figura 17). Los plásmidos fueron clonados en Agrobacterium tumefaciens para la transformación de la planta.

La transformación del maíz, la expresión de proteínas y los bioensayos de insectos han sido llevados a cabo según los protocolos antes descritos, y los resultados figuran en la Tabla 33. Los resultados de los bioensayos de insectos indicaron que la secuencia quimérica de péptidos de tránsito de cloroplasto TraP8 ha sido funcional y que los Eventos pDAB1 1 1338 y pDAB1 1 1481 brindaron protección contra los insectos probados en el bioensayo. En los Eventos probados, las plantas que expresaron la proteína Vip3Ab1 sin TraP, (pDAB1 12710 ypDAB1 1 1479), presentaron un nivel promedio de daño a la hoja que no fue estadísticamente diferente a la planta que expresó la proteína Vip3Ab1 con TraP8 (pDAB1 1 1338 y pDAB1 1 1481 ). Para concluir, los borrones de Western y los bioensayos indicaron que todos los eventos probados expresaron la proteína Vip3 Ab1 .

Tabla 33. Resultados del ensayo bioquímico y resultados del bioensayo para secuencias de codificación Vip3Ab 1 v6 y Vip3Ab 1 v7 que han sido fusionadas a TraP8, en comparación con las secuencias de codificación Vip3Ab 1 v6 y Vip3Ab 1 v7 , las cuales no poseían secuencia de peptidos de tránsito de cloroplasto.

Ejemplo 5: Escisión de Secuencias Quiméricas de Péptidos de Tránsito de Cloroplasto en Planta El sitio de escisión del péptido de tránsito de cloroplasto TraP8 y TraP9 ha sido determinado por la espectrometría MALDI y la degradación de Edman N-terminal. El material de la planta ha sido obtenida de plantas transgénicas que contenían los genes de fusión TraP8 -dgt14, TraP8 -dgt28, TraP9 -dgt14, y TraP9-c/gf28 y ensayado para determinar el sitio de escisión del péptido de tránsito de cloroplasto que ocurrió durante la translocación dentro del cloroplasto.

Resultados MALDI: Las proteínas semi-purificadas de una muestra de planta han sido separadas por SDS-PAGE. Las bandas de proteína de tamaño equivalente al peso molecular de YFP han sido extraídas del gel, desteñidas y secadas. Despues, las bandas de proteína secadas fueron digeridas en gel con Tripsina (Promega; Madison, Wl) en 25 mM de bicarbonato de amonio durante la noche a 37°C. Los péptidos han sido purificados por un C18 ZipTip™ (Millipore, Bedford, MA) y eluídos con 50% acetonitrilo /0.1 % TFA. Las muestras fueron mezcladas con ácido matriz a-ciano-4-hidroxicinámico en una proporción de 1 : 1 y la mezcla resultante ha sido soportada en una placa de muestras MALDI y secada al aire.

El espectro de masa péptida fue generado por medio de un espectrómetro de masas Voyager DE-PRO MALDI-TOF Mass Spectrometer™ (Applied Biosystems; Framingham, MA). La calibración externa fue realizada con una mezcla de calibración Calibration Mixture 2™ (Applied Biosystems). La calibración interna fue realizada usando los picos de la autolisis de la tripsina a 842.508, 1045.564 y 221 1 .108 m/z. Todos los espectros de masas fueron recolectados en el modelo de reflector de iones positivos. El análisis de huella peptídica (PMF por sus siglas en inglés) se realizó por medio del programa gratuito PAWS™ (hoja de trabajo de análisis de proteínas) de Proteometrics LLC, equiparando la huella peptídica de la muestra con la huella peptídica teórica de la proteína meta para verificar si la muestra era en realidad la proteína meta. La identificación de proteínas fue realizada por medio de búsqueda en bases de datos por medio de MASCOT (MatrixScience, Londres, Reino Unido) contra la base de datos de proteínas NCBI NR.

Secuenciación N-terminal por medio de la degradación de Edman: La secuenciación N-terminal fue realizada en un secuenciador de proteínas Procise (modelo 494) de Applied Biosystems (Foster City, CA). Las muestras de proteína primero fueron separadas por SDS-PAGE, despues fueron absorbidas en una membrana de PVDF. Las bandas de proteína fueron extraídas de la membrana y cargadas al secuenciador Procise. Se efectuaron ocho ciclos de la degradación de Edman en cada una de las muestras para obtener cinco residuos AA en N-terminal. Se corrió una mezcla estándar de 20 aminoácidos PTH (Applied Biosystems) con cada muestra. Los residuos de amino ácidos de cada degradación de Edman fueron determinados de acuerdo a sus tiempos de retención en la columna C-18 contra los estándares.

Los resultados de la secuenciación MALDI indicaron que las proteínas DGT-28 y DGT14 fueron expresadas, y que las secuencias de péptido de tránsito al cloroplasto recombinante TraP fueron procesadas. La Tabla 34 lista las secuencias procesadas que fueron obtenidas al usar la degradación de Edman N-terminal y la secuenciación MALDI .

Tabla 34. Sitios de corte de TraP8 y de TraP9 fusionados con las secuencias de codificación dgt- 14 or dgt-28. La casilla gris indica el sitio de empalme.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molecula aislada de ácido nucleico que comprende: una secuencia sintética de nucleótidos derivada de Brassica que codifica un péptido que comprende una secuencia contigua de aminoácidos de un primer péptido de tránsito del cloroplasto de Brassica, en donde el péptido además comprende una secuencia contigua de aminoácidos de un segundo péptido de tránsito del cloroplasto.

2. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 , que además comprende una secuencia de nucleótidos de interés funcionalmente unida a la secuencia sintética de nucleótidos derivada de Brassica.

3. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 , en donde el primer péptido de tránsito del cloroplasto de Brassica es de Brassica napus o Brassica rapa.

4. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 3, en donde el segundo péptido de tránsito del cloroplasto es de una Brassica sp. diferente del primer péptido de tránsito del cloroplasto de Brassica.

5. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 , en donde el primer péptido de tránsito del cloroplasto de Brassica proviene de un gen de 3-enolpiruvilshikimato-5-fosfato sintetasa.

6. La molecula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 , en donde el segundo péptido de tránsito del cloroplasto proviene de un gen de 3-enolpiruvilshikimato-5-fosfato sintetasa.

7. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 , en donde el péptido es al menos 80% idéntico a un péptido de tránsito del cloroplasto seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID Nos. : 3 y 4.

8. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 7, en donde el péptido es al menos 85% idéntico a un péptido de tránsito del cloroplasto seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID Nos. : 3 y 4.

9. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 8, en donde el péptido es al menos 90% idéntico a un péptido de tránsito del cloroplasto seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID Nos. : 3 y 4.

10. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 9, en donde el péptido es al menos 95% idéntico a un péptido de tránsito del cloroplasto seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID Nos. : 3 y 4.

1 1 . La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 10, en donde el péptido es al menos 98% idéntico a un péptido de tránsito del cloroplasto seleccionado del grupo que consiste de la SEC I D Nos. : 3 y 4.

12. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 1 , en donde ei peptido es seleccionado del grupo que consiste de la SEC ID Nos. : 3 y 4.

13. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 , en donde la secuencia codificadora de 5 nucleótidos de interés no codifica el péptido de la SEC I D No. : 1 o SEC I D No. : 2.

14. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1 , en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido es específicamente hibridizable a una ío secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las SEC ID Nos. : 5, 6, 8 y 9.

15. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 2, que además comprende al menos una secuencia adicional de nucleótidos, cada una que codifica un péptido de 15 tránsito del cloroplasto, en donde las secuencias adicionales de nucleótidos están funcionalmente unidas a la secuencia de nucleótidos de interés.

16. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 15, en donde al menos una secuencia adicional de 0 nucleótidos es de un organismo seleccionado del grupo que consiste de procariotas, eucariotas fotosintéticas inferiores, y clorofitos.

17. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 2, en donde la secuencia sintética de nucleótidos 5 derivada de Brassica y la secuencia de nucleótidos de interés están funcionalmente unidas a una o más secuencias reguladoras.

18. La molecula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 2, en donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido quimérico que comprende un péptido codificado por s la secuencia de nucleótidos de interés y un péptido codificado por la secuencia sintética de nucleótidos derivada de Brassica.

19. Un polipéptido quimérico codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 18.

20. El polipéptido quimérico de la reivindicación 19, en ío donde el péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés está dirigido a un plástido en una célula que contiene piástido.

21 . El polipéptido quimérico de la reivindicación 20, en donde el polipéptido comprende un péptido de tránsito del ís cloroplasto que es retirado cuando el péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés está dirigido a un plástido.

22. El polipéptido quimérico de la reivindicación 19, en donde el péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés es un péptido biológicamente activo. 0

23. El polipéptido quimérico de la reivindicación 19, en donde el péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés es un péptido fluorescente.

24. El polipéptido quimérico de la reivindicación 22, en donde el péptido biológicamente activo es una enzima. 5

25. El polipéptido quimérico de la reivindicación 22, en donde el peptido biológicamente activo es normalmente expresado en un plástido de una célula en donde el péptido se expresa en forma nativa.

26. El polipéptido quimérico de la reivindicación 22, en 5 donde el péptido biológicamente activo está involucrado en un proceso seleccionado del grupo que consiste de resistencia a herbicidas, resistencia a virus, resistencia a patógenos bacterianos, resistencia a insectos, resistencia a nematodos, resistencia a hongos, vigor de la planta, rendimiento de la planta, ío tolerancia a la temperatura, tolerancia a las condiciones del suelo, tolerancia a bajos niveles de luz, tolerancia a bajos niveles de agua, tolerancia a elevados niveles de agua, tolerancia al ambiente químico, color de la semilla, modificación del almidón, síntesis de aminoácidos, fotosíntesis, síntesis de ácidos grasos, 15 síntesis de aceites, síntesis de arotenoides, síntesis de terpenoides, síntesis de almidón, y resistencia a herbicidas.

27. El polipéptido quimérico de la reivindicación 22, en donde el péptido biológicamente activo es seleccionado del grupo que consiste de zeaxantina epoxidasa, colina monooxigenasa, 0 ferroquelatasa, ácido graso omega-3 desaturasa, glutamina sintetasa, provitamina A, hormonas, proteínas de toxinas Bt, y marcadores útiles en la identificación de plantas que comprenden un rasgo de interés.

28. El polipéptido quimérico de la reivindicación 26, en 5 donde el péptido biológicamente activo está involucrado en resistencia a herbicidas.

29. El polipeptido quimérico de la reivindicación 24, en donde el péptido biológicamente activo es seleccionado del grupo que consiste de: acetolactato sintasa (ALS), ALS mutada, precursores de ALS, 3-enolpiruvilshikimato-5-fosfato sintetasa (EPSPS), CP4 EPSPS, una EPSPS de clase I I I y una EPSPS de clase IV.

30. Un vector de expresión vegetal que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2.

31 . Un material vegetal que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2.

32. El material vegetal de la reivindicación 31 , en donde el material vegetal es seleccionado del grupo que consiste de una célula vegetal, un tejido vegetal, un cultivo de tejido vegetal, un cultivo de callo, una parte de planta, y una planta entera.

33. El material vegetal de la reivindicación 31 , que además comprende un polipéptido que comprende al péptido.

34. El material vegetal de la reivindicación 33, en donde la secuencia de nucleótidos de interés codifica una porción del polipéptido que está dirigido a un plástido en una célula del material vegetal.

35. El material vegetal de la reivindicación 31 , en donde la molécula de ácido nucleico está integrada de forma estable dentro del genoma de una célula del material vegetal.

36. El material vegetal de la reivindicación 31 , en donde el material vegetal es una planta entera.

37. El material vegetal de la reivindicación 31 , en donde el material vegetal es una célula vegetal que no es capaz de regenerarse para producir una planta.

38. El material vegetal de la reivindicación 31 , en donde el material vegetal es de una planta seleccionada del grupo que consiste de Arabidopsis, alfalfa, Brassica, porotos, brócoli, repollo, zanahoria, coliflor, apio, repollo chino, algodón, pepino, berenjena, lechuga, melón, guisante, pimienta, maní, papa, calabaza, rabanito, semilla de colza, espinaca, soja, calabacín , remolacha, girasol, tabaco, tomate, sandía, maíz, cebolla, arroz, sorgo, trigo, centeno, mijo, caña de azúcar, avena, triticale, pasto varilla, y césped.

39. Un método para producir un material vegetal transgénico, en donde el método comprende: obtener la molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 2; y transformar un material vegetal con la molécula de ácido nucleico.

40. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el material vegetal es seleccionado del grupo que consiste de una célula vegetal, un tejido vegetal, un cultivo de tejido vegetal, un cultivo de callo, una parte de planta, y una planta entera.

41 . El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el material vegetal no es una planta entera.

42. Un material vegetal transgenico producido mediante el método de acuerdo con la reivindicación 39.

43. El material vegetal transgénico de la reivindicación 42 5 en donde el material vegetal es una célula vegetal que no es capaz de regenerarse para producir una planta.

44. Una planta transgénica regenerada a partir del material vegetal transgénico de la reivindicación 42.

45. Un producto básico de vegetal transgénico producido a ío partir del material vegetal de la reivindicación 42.

46. El material vegetal transgénico de la reivindicación 42, en donde la secuencia de nucleótidos de interés codifica un péptido biológicamente activo.

47. El material vegetal transgénico de la reivindicación 46, 15 en donde el péptido biológicamente activo está involucrado en un proceso seleccionado de un grupo que consiste de resistencia a herbicidas, resistencia a virus, resistencia a patógenos bacterianos, resistencia a insectos, resistencia a nematodos, resistencia a hongos, vigor de la planta, rendimiento de la planta, 0 tolerancia a la temperatura, tolerancia a las condiciones del suelo, tolerancia a bajos niveles de luz, tolerancia a bajos niveles de agua, tolerancia a elevados niveles de agua, tolerancia al ambiente químico, color de la semilla, modificación del almidón, síntesis de aminoácidos, fotosíntesis, síntesis de ácidos grasos, 5 síntesis de aceites, síntesis de arotenoides, síntesis de terpenoides, síntesis de almidón, y resistencia a herbicidas.

48. El material vegetal transgenico de la reivindicación 46, en donde el péptido biológicamente activo es seleccionado del grupo que consiste de zeaxantina epoxidasa, colina monooxigenasa, ferroquelatasa, ácido graso omega-3 desaturasa, glutamina sintetasa, provitamina A, hormonas, proteínas de toxinas Bt, y marcadores útiles en la identificación de plantas que comprenden un rasgo de interés.

49. El material vegetal transgénico de la reivindicación 47, en donde el péptido biológicamente activo está involucrado en resistencia a herbicida.

50. El material vegetal transgénico de la reivindicación 46, en donde el péptido biológicamente activo es seleccionado del grupo que consiste de: acetolactato sintasa (ALS), ALS mutada, precursores de ALS, 3-enolpiruvilshikimato-5-fosfato sintetasa (EPSPS), CP4 EPSPS, y una EPSPS de clase I I I.

51 . El material vegetal transgénico de la reivindicación 49, en donde el material vegetal exhibe una mayor resistencia a herbicidas o tolerancia a herbicidas en comparación con un material vegetal de tipo salvaje de la misma especie.

52. Una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un medio derivado de Brassica para dirigir un polipéptido a un cloroplasto.

53. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 52, que además comprende una secuencia de nucleótidos de interés funcionalmente unida al medio derivado de Brassica para dirigir un polipéptido a un cloroplasto.

54. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 53, en donde la molécula de ácido nucleico codifica 5 un polipéptido quimérico que comprende un péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés.

55. Un polipéptido quimérico codificado por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 54.

56. El polipéptido quimérico de la reivindicación 55, en ío donde el péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés está dirigido a un plástido en una célula que contiene plástido.

57. El polipéptido quimérico de la reivindicación 56, en donde el polipéptido comprende un péptido de tránsito de 15 cloroplasto que es retirado cuando el péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés está dirigido al plástido.

58. El polipéptido quimérico de la reivindicación 55, en donde el péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de interés es un péptido biológicamente activo. 0

59. El polipéptido de la reivindicación 58, en donde el péptido biológicamente activo está involucrado en un proceso seleccionado del grupo que consiste de: resistencia a herbicidas, resistencia a virus, resistencia a patógenos bacterianos, resistencia a insectos, resistencia a nematodos, resistencia a 5 hongos, vigor de la planta, rendimiento de la planta, tolerancia a la temperatura, tolerancia a las condiciones del suelo, tolerancia a bajos niveles de luz, tolerancia a bajos niveles de agua, tolerancia a elevados niveles de agua, tolerancia al ambiente químico, color de la semilla, modificación del almidón, síntesis de aminoácidos, fotosíntesis, síntesis de ácidos grasos, síntesis de aceites, síntesis de arotenoides, síntesis de terpenoides, síntesis de almidón, y resistencia a herbicidas.

60. El polipeptido de la reivindicación 58, en donde el péptido biológicamente activo es seleccionado del grupo que consiste de zeaxantina epoxidasa, colina monooxigenasa, ferroquelatasa, ácido graso omega-3 desaturasa, glutamina sintetasa, provitamina A, hormonas, proteínas de toxinas Bt, y marcadores útiles en la identificación de plantas que comprenden un rasgo de interés.

61 . El polipéptido de la reivindicación 58, en donde el péptido biológicamente activo es seleccionado del grupo que consiste de: acetolactato sintasa (ALS), ALS mutada, precursores de ALS, 3-enolpiruvilshikimato-5-fosfato sintetasa (EPSPS), CP4 EPSPS, y una EPSPS de clase I I I .

62. Un vector de expresión vegetal que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 53.

63. Un material vegetal que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 53.

64. El material vegetal de la reivindicación 63, en donde la molécula de ácido nucleico está integrada de forma estable dentro del genoma de una celula del material vegetal.

65. El material vegetal de la reivindicación 63, en donde el material vegetal es una planta entera.

66. El material vegetal de la reivindicación 63, en donde el 5 material vegetal es una célula vegetal que no es capaz de regenerarse para producir una planta.

67. El material vegetal de la reivindicación 63, en donde el material vegetal es de una planta seleccionada del grupo que consiste de Arabidopsis, alfalfa, Brassica, porotos, brócoli, ío repollo, zanahoria, coliflor, apio, repollo chino, algodón, pepino, berenjena, lechuga, melón, guisante, pimienta, maní, papa, calabaza, rabanito, semilla de colza, espinaca, soja, calabacín, remolacha, girasol, tabaco, tomate, sandía, maíz, cebolla, arroz, sorgo, trigo, centeno, mijo, caña de azúcar, avena, triticale, pasto 15 varilla, y césped.

68. Un método para producir un material vegetal transgénico, en donde el método comprende: obtener la molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 53; y 0 transformar un material vegetal con la molécula de ácido nucleico.

69. El método de acuerdo con la reivindicación 68, en donde el material vegetal es seleccionado del grupo que consiste de una célula vegetal, un tejido vegetal, un cultivo de tejido 25 vegetal, un cultivo de callo, una parte de planta, y una planta entera.

70. El metodo de acuerdo con la reivindicación 68, en donde el material vegetal no es una planta entera.

71 . Un material vegetal transgénico producido mediante el 5 método de acuerdo con la reivindicación 68.

72. Una planta transgénica regenerada a partir del material vegetal transgénico de la reivindicación 68.

73. El material vegetal de la reivindicación 71 , en donde el material vegetal transgénico es una planta entera. ío

74. El material vegetal de la reivindicación 71 , en donde el material vegetal transgénico es una célula vegetal que no es capaz de regenerarse para producir una planta.

75. Un producto básico vegetal transgénico producido a partir del material vegetal transgénico de la reivindicación 71 . 15

76. El material vegetal transgénico de la reivindicación 71 , en donde la secuencia de nucleótidos de interés codifica un péptido biológicamente activo. 0