JP2000515728A

JP2000515728A - 植物における制御された遺伝子発現

Info

Publication number: JP2000515728A
Application number: JP10500958A
Authority: JP
Inventors: パルメ、クラウス; ゲルバイラー、レオ; グロスコプフ―クロイラー、デボラ; ムーア、イアン; シェル、ヨーゼフ
Original assignee: マツクス―プランク―ゲゼルシャフトツールフエルデルングデルヴイツセンシャフテンエーフアウ
Priority date: 1996-08-06
Filing date: 1997-08-05
Publication date: 2000-11-28
Also published as: EP0823480A1; CA2261574A1; WO1998005789A3; WO1998005789A2; AU734149B2; AU4551597A

Abstract

(57)【要約】本発明は、転写アクチベーターキメラタンパク質システムまたはサプレッサーｔＲＮＡに基づくシステムの何れかを用いて、植物における遺伝子発現を制御することに関する。さらに、本発明は、トランスアクチベータータンパク質をコードするＤＮＡ分子またはLacリプレッサー応答配列と結合した標的遺伝子を含むＤＮＡ分子を有するトランスジェニック植物、Lacリプレッサー/トランスアクチベーター感受性プロモーター配列の制御下で標的遺伝子を有するトランスジェニック植物とLacリプレッサー/トランスアクチベータータンパク質をコードするトランスジェニック植物との交配、並びに標的遺伝子の発現のトランス活性化に関する。

Description

【発明の詳細な説明】植物における制御された遺伝子発現本発明は、転写アクチベーターキメラタンパク質システムまたはサプレッサーｔＲＮＡに基づくシステムを用いて、植物の遺伝子発現を制御することに関する。本発明のトランス活性化キメラタンパク質は種々の利点を提供し、例えば、トランスアクチベーター応答配列を含むように操作された遺伝子発現の活性化を特異的に制御することにより、例外的に高レベルの遺伝子発現が達成される。特に、本発明のトランスアクチベータータンパク質は、真核細胞において転写を直接的または間接的に活性化するポリペプチドに機能的に連結された、原核生物のLa cリプレッサーのＤＮＡ結合領域を含む。さらに、当該トランス活性化システムは、第二の標的ＤＮＡ分子において、所定の標的遺伝子内に一以上のトランスアクチベーター応答プロモーター配列を含有するＤＮＡ分子を含む。その代わりに、トランス活性化による遺伝子発現の制御は、サブレッサーｔＲＮＡ遺伝子および未熟（premature）ストップコドンを含む標的遺伝子を植物細胞において同時に発現させることより達成することができる。さらに、本発明は、トランスアクチベータータンパク質をコードするＤＮＡ分子またはLacリプレッサー応答配列と結合した標的遺伝子を含むＤＮＡ分子を有するトランスジェニック植物、Lac リプレッサー／トランスアクチベーター応答プロモーター配列の制御下にある標的遺伝子を有するトランスジェニック植物と、Lacリプレッサー／トランスアクチベータータンパク質をコードするトランスジェニック植物との交配、並びに標的遺伝子の発現のトランス活性化に関する。同様に、本発明は、サプレッサーｔＲＮＡをコードするＤＮＡ分子または未熟ストップコドン、好ましくはアンバーストップコドンを含有する標的遺伝子を含むＤＮＡ分子を有するトランスジェニック植物、未熟ストップコドンを含有する標的遺伝子を有するトランスジェニック植物と、対応するサプレッサーｔＲＮＡをコードするトランスジェニック植物との交配、並びに標的遺伝子のトランス活性化に関する。逆遺伝学の主要な目的の一つは、単離された遺伝子材料の生物体における生物学的機能を研究し解明することである。また、植物の成長および機能の様々な局面を制御する遺伝子を同定する技術が、今日植物科学の中心である。基礎的研究も応用研究も、トランスジェニック植物において生物学的プロセスを操作するため、特定の遺伝子を改変することにますます依存している。従って、アンチセンスＲＮＡ、ドミナントネガティブ突然変異体、異所性発現、および過剰発現技術により、広範な生化学的経路を調査するための効果的なツールが提供された。しかし、これら分子遺伝学的アプローチは、植物の成長および発達の基本的プロセスを制御する遺伝子に必ずしも容易に適用することができるわけではない。これは、主に、このような重要な遺伝子を操作することが植物の成長および生存にとって不利益であるからであり、このため解析および産業的応用にとって有用なトランスジェニック植物の生殖および繁殖を妨害し得るからである。植物遺伝子の場合、機能的研究は、レセプター植物におけるこれら遺伝子の導入および発現によって実現される。導入された遺伝的材料は、レセプターゲノムに安定に取り込まれ、その過剰発現または異所性発現により改変（modification ）を引き起こし得る。このようなトランスジェニック植物における表現型特性および改変は、各々の遺伝子およびその遺伝子産物の機能に関して重要な情報を提供してくれる。このようなトランスジェニック植物の解析に関して、野生型の植物と比較して観察される表現型の異常を、導入された外来遺伝子材料の異所性発現まで明確に追跡できることは非常に望ましい。安定なトランスジェニック植物の生産は、幾つかの種々の技術により行うことができる。原則として、外来ＤＮＡは植物細胞に導入され、植物ゲノムに組み込まれ、最終的に単一の形質転換された植物細胞からインタクトで完全な植物体が発生する。非常にしばしば、最後の工程は、形質転換材料として使用された全能性を有する未分化な植物細胞から完全な植物体を再生することを含む。トランスジェニック植物の解析および観察される表現型の解釈は、植物細胞の形質転換およびそれ以降のトランスジェニック植物体の再生の全工程に亘って生じる困難により劇的に妨げられ得ることが知られている。不運なことに、大変しばしば、表現型の特徴を、導入された外来遺伝子の発現にのみ関係づけることは不可能である。再生の間に現れる、ソマクローナル変異と呼ばれる遺伝的変異および後成的（epigenetic）変異は、導入された外来遺伝子の発現に、明確にではないが関連した異常な表現型につながり得る。例えば、外来ＤＮＡの植物ゲノムへの取り込みは欠失という結果に至り、これ自体表現型の変異につながる。さらに、外来ＤＮＡの植物のゲノム領域への取り込みは、例えば導入されたＤＮＡ情報と関係をもたない遺伝子をランダムにノックアウトしたり改変したりすることにより、全く独立した変化を引き起こし得る。タンパク質をコードする外来遺伝子の発現から別の困難が生じることがあるが、これは、そのタンパク質自体−またはこれらタンパク質により触媒される反応の産物−が、形質転換された植物細胞に対して特異的な影響を及ぼすからである。従って、外来遺伝子の発現がトランスジェニック植物全体の再生および生産に対して不利益でさらに有毒な効果を有する場合、標的遺伝子を全く発現しないか、非常に低いレベルで発現する植物のみが再生の間に選択されると強く思われる。その結果、得られた表現型は、標的遺伝子の機能の誤った解釈につながり得る。大変しばしば、上記の理由のため、所望のレベルで外来遺伝子を発現しているトランスジェニック植物をつくり出すことができず、このことが実験計画のささいな間違いから生じるのか、または導入遺伝子の生物学的活性から起こるのか決定することは難しい。この問題の解決索の一つは、導入遺伝子の活性をある組織に限定するために「組織特異的」プロモーターを使用することである。このアプローチは、多くのこのようなプロモーターがトランスジェニック植物の再生過程の間は活性であり、さらに多くの組織において低レベルで活性があるため、決して満足なものではない。また、これは解析の範囲をわずかな細胞タイプに限定するので、必ずしも適切な組織の研究が可能ではない。別の選択肢は、多くの細胞タイプにおいて比較的高いレベルの発現を達成できる熱ショックプロモーターを利用することである。これは、以降の解析を熱ストレスにさらした植物で行うという欠点、成長条件を注意深く制御しなければならないという欠点、および熱によらない誘導を行った植物における遺伝子の発現について困難に遭遇するという欠点を有している。これら制限を克服するため、化学的に誘導可能な遺伝子発現システムを開発する幾つかの試みがなされた。これらの試みは、また、完全に満足するものではなかった。何故なら、これら試みが比較的有効でないためか、持続する遺伝子抑制に依存しているためか、または植物に対して有毒であり得る濃度での化学物質の適用に依存しているためである。充分研究されたシステムは、タバコについて開発したテトラサイクリン誘導プロモーターシステムである(Gatzら(1991)Mol.Gen.G enet.227,229-237；Gatzら（1992）Plant J．2，397-404)。この場合、カリフラワーモザイクウイルス由来の改変された35S ＲＮＡプロモーターは、高レベルの大腸菌（Escherichia coli）テトラサイクリン（Tet）-リプレッサーを発現している植物で抑制されているが、テトラサイクリンを０．１から１．０μｇ／ｍＬで適用すると完全な活性が回復する。このような化学的誘導システムは、タバコ細胞における遺伝子発現の有効な一時的な制御を提供してくれるが、全植物の種々の組織における遺伝子の発現に関して、このシステムの有効性および確実性は明確ではない。従って、環境ストレスの外的介入または負荷を必要とせずに、植物における導入遺伝子の発現を効果的かつ空間的に制御するためのシステムが必要とされている。さらに、植物において定量的に制御された遺伝子発現を可能にするシステムであって、このシステムの利用により特定の表現型と誘導された遺伝子の発現および発現レベルとの関係が明確に実証できるようなシステムが必要とされている。その上、遺伝子構築およびトランスジェニック植物再生の工程は、時間を要し且つ多大な労力を要するので、植物の各々において標的遺伝子が所望の種々の時間的、空間的または生理学的条件の下で発現するような一連のトランスジェニック植物を再生するための方法を簡略化する必要がある。転写アクチベーターシステムに基づく真核細胞における遺伝子発現を制御する他のアプローチが報告されている。例えば、ＷＯ９１/１９７８４は、感染哺乳類細胞において機能する転写アクチベーターキメラタンパク質システムを開示している。このトランス活性化タンパク質は、ＤＮＡ結合性タンパク質の機能的部位と、脊椎動物またはウイルスの転写アクチベータータンパク質部位とを具備している。ＤＮＡ結合性タンパク質は、細菌のLacリプレッサーであり得、また使用する転写アクチベータータンパク質は、単純エルペスウイルスのＶＰ１６であり得る。記載されたシステムの使用により遺伝子の発現を制御し、トランスアクチベーター機能のスイッチをオンまたはオフにする能力は、トランスジェニック動物および哺乳類細胞系統について言及されているだけである。同様に、ＥＰ０４５５４２４は、新規の哺乳類誘導的およびカスケード的遺伝子発現システムの開発に関する。とりわけ、この発明は、lacＩ/lacＯの制御の下でＨＩＶＴＡＴタンパク質およびＨＩＶＬＴＲプロモーターによる転写制御の下でクローニングされた遺伝子を共に発現している、安定な哺乳類宿主細胞系統の開発に関する。従って、この文書は、哺乳類細胞系統において発現を制御するための誘導的遺伝子発現システムを記載している。ＷＯ９４/２９４４２は、宿主細胞または動物において標的遺伝子の発現を条件により不活性化したり変化させたりする調節システムに関する。テトラサイクリンで制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）およびｔＴＡ-応答プロモーターに基づくこのシステムは、トランスジェニック動物における使用について説明がなされている。植物において機能するトランス活性化システムについて、米国特許第５，３６２，８６４号は、植物の転写活性化因子、ＴＡＦ−１の単離および特性を開示している。さらに、ＴＡＦ−１を細胞培養システムまたはトランスジェニック植物に導入して、ＴＡＦ−１が結合することが公知であるシス作用性配列の−コピーまたは数コピーを含むプロモーター配列に融合した異種（heterologous）遺伝子の発現を増大させたり、変化させたりすることが示唆されている。特許出願ＷＯ９５/２０６６８は、改変された植物を生産するための方法を記載しており、該方法は、第一系統も第二系統もその交配植物の特性を示さないが、親植物の少なくとも片方がトランスジェニックであるような第一系統と第二系統とを交配させて、ある表現型特性を備えた植物を作り出すことを含む。特に、この方法は、雄性不稔の植物を作り出すため、および回復遺伝子の発現により雄性不稔を復活させるために使用される。従って、この出願は、ハイブリッド種子の生産に有効である植物生産方法を記載している。同様に、特許出願ＥＰ０５８９８４１は、雄性不稔の植物を作り出すための方法に関し、該方法は、トランスアクチベーターポリペプチドをコードする配列に機能的に連結した葯-特異的プロモーター領域と、花粉形成を混乱させ得るアンチセンスＲＮＡまたはポリフェノールをコードする配列に機能的に連結したトランスアクチベーターポリペプチドにより活性化され得る標的配列とに基づくものである。この発明は、また、雄性不稔の植物およびハイブリッド種子を作り出すための方法に関する。欧州特許出願０４９４７２４号は、植物において発現を制御するためのプラスミドを記載しており、該プラスミドは、異種産物および植物の時間的および位置的に制御された発現を可能にするＤＮＡ配列を含む。原則として、この制御システムは、各プロモーター領域内でそのオペレーター配列にテトラサイクリンを介して結合したＴｅｔリプレッサータンパク質を不活性化することにより、標的遺伝子の発現を誘導することに依る。ＤＮＡに結合すると同時に転写を活性化する転写アクチベーターの能力は、このような転写因子の限定されたドメインに局在していることは公知である。転写アクチベーター因子は、独立して機能するモデュールから成ることが幾つかの実験により実証することができた（Ptashne（1988）Nature 355，683-689；Mitchell and Tijan（1989）Science 245，371-378）。従って、ある因子の転写活性化を担当する部位を、別の因子のＤＮＡ結合部位に結合させることが可能である。得られたハイブリッドタンパク質は、細胞内で完全に活性である。このことは、酵母細胞で初めて明らかにすることができた（ Ptashne and Gann（1990）Nature 346，329-331；Lewin（1990）Cell61，1161-1 164；Sahaら（1993）Nature 363，648-652）。その上、この観察は、ほ乳類において検出された幾つかの転写因子について確認することができた（Guarante（19 88）Cell 52，303-305；Sadowskiら（1988）Nature 335，563-564）。しかし、植物において機能的なＤＮＡ結合部位および植物において機能的な転写活性化部位を含むキメラ転写アクチベーターを、植物において、導入遺伝子の発現を制御するために利用することは新規である。細菌、酵母またはほ乳類細胞における転写アクチベーターの発現により得られた結果を、単純に植物システムに移すことができないことは注目するに値する。例えば、種々の細胞タイプで異なる標的ＤＮＡのメチル化パターンにより、転写アクチベーターの結合（従って遺伝子の活性化）が不可能になるか、少なくとも非常に効率が悪くなる。細菌において、リプレッサータンパク質は、非構成的遺伝子（例えば代謝経路に関与する構造遺伝子）の発現を制御するオペレーター配列に可逆的に結合するために使用される。特に、大腸菌（E.coli）のLacオペコンの制御は、最近数十年にわたってさかんに研究された。LexおよびLacリプレッサーの両方がほ乳類細胞において使用されている（Brownら（1987）Cell 49，603-612；Ho and Davids on（1987）Cell 48，555-566，Smithら（1988）EMBO J．7，3975-3982）。また、Lacリプレッサーは、ほ乳類細胞において、ＴＡＴＡボックスの下流、ワクシニアウイルスプロモーターから下流、またはＳＶ４０プロモーターから下流にオペレーター配列を含む真核生物のウイルスプロモーターの発現を阻害できることがさらに示された（Brownら、同上；Ho and Davidson、同上）。不運なことに、抑制は一般的に完全ではなく、また高レベルの誘導発現がこれらのベクターを用いて植物で得ることができるかどうかは不明である。 Lacリプレッサーがほ乳類細胞において機能することが観察され、このことはl acＩがほ乳類の染色体状態のＤＮＡと相互作用できることを示しているが、植物においてlacＩのＤＮＡ結合ドメインを有益に利用することは新規であり、更に、上記のことを考慮すれば予期しない結果である。野生型のlacＩとはＤＮＡ結合部位が異なる幾つかのlacＩ突然変異体が、野生型のＤＮＡ標的であるE.coliに見られるLacオペレーターおよび特異的に改変されたLacオペレーター配列に対して、各々優れた結合能力を有することが原核細胞において見出された。（Lehmingら（1987）The EMBO Journal 6，3145-3153）。特に、lacＩ突然変異体の利用、および野生型または改変されたオペレーター配列への該lacＩ突然変異体の優れた結合能力を利用することは、植物における導入遺伝子の活性化の観点からはこれまで議論されていなかった。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるガラクトースおよびメリビオース代謝経路の転写制御は、調節タンパク質ＧＡＬ４によりポジティブに仲介されている。ガラクトースＧＡＬ４の存在は、ガラクトースレギュロン遺伝子の転写をそれぞれ促進する。ＧＡＬ４による転写活性化は、遺伝子発現のレベルを1,000倍増加させるという結果に至る（Johnston（1987）Micro biol.Rev.51，458-476）。誘導物質としてのガラクトースの非存在下では、負の調節タンパク質ＧＡＬ８０は、酵母におけるＧＡＬ４の転写活性化能力を阻害する。ＧＡＬ４は１７塩基対から成る特異的な標的ＤＮＡ配列に結合し、該ＤＮＡ配列は二回対称を示しガラクトース上流活性化配列と称される。ＧＡＬ４のその標的ＤＮＡ配列への結合は、連結された遺伝子のＲＮＡポリメラーゼII依存性転写を促進するためには不十分である。むしろ、このタンパク質のＤＮＡ結合機能は、カルボキシル末端の転写活性化ドメインを、プロモーターおよび転写機構の付近に配置する目的を果たしている。転写活性化は、活性化領域Ｉ（アミノ酸残基148-196）および活性化領域II（アミノ酸残基767-881）と称される二つの主要活性化ドメインにより媒介されるが、このうち活性化領域IIがより能力が高い。（Ma and Ptashne（1987）Cell 48，847-853）。天然のＧＡＬ４転写アクチベーターは、昆虫およびほ乳類細胞においてＧＡＬ４結合部位に連結した遺伝子の転写を活性化することが実証された（Kakidani a nd Ptashne （1988）Cell 52，161-167；Websterら（1988）Cell 52，169-178）。しかし、完全長のＧＡＬ４は、おそらくその非効率的な合成またば不安定性の結果、植物のプロトプラストにおいて転写を刺激することができない（Maら（1988）Nature 334，631-633）。別の非常に有効な転写アクチベーターは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のビリオンタンパク質１６である（ＶＰ１６；Sadowskiら、同上；Triezenbergら（1988）Genes＆Dev.2，718-729）。これまで、ＶＰ１６はほ乳類細胞におけるトランス活性化の観点からのみ記載されてきた（前述の先行技術、ＷＯ９１/１９７８４参照）。最近、ショウジョウバエ（Drosophila）において、制御遺伝子に対してトランスに配置された標的遺伝子の導入遺伝子発現が報告されている（Brand and Perr imon（1993）Development 118，401-415；Crleg and Akam（1993）Nature 362， 630-632）。しかし、これら何れの報告も、このようなシステムを植物に用いることの可能性を論じていない。別のストラテジーにおいて、親の近交系では望ましくないような特性を発現するＦ１ハイブリッドを、サプレッサーｔＲＮＡトランス活性化システムにより得ることができる。特定のメッセンジャーＲＮＡの翻訳を可能し又は促進する翻訳因子の発現が、微生物により頻繁に利用されている。例えば、サプレッサートランスファーＲＮＡ、即ちストップコドンを読むことができるｔＲＮＡの利用は、未熟終結コドンを含むｍＲＮＡの翻訳を可能にする。細菌で広く研究されたこの現象は、Eggert son and Soll（1988）Microbiol.Rev.52，354-374；Atkisnon and Martin（1994 ）Nucleic Acid Research 22,1327-1334により概説されている。この考えは、また、幾つかの植物ウイルスにおいても充分に理解されている。例えば、タバコモザイクウイルスおよびタバコラットルウイルスは、植物細胞に存在する天然の弱いサプレッサーｔＲＮＡを利用して、ｍＲＮＡにおける漏出（leaky）ストップコドンを解読している（Baierら（1984）EMBO J．3,351-356;Zerfass and Baier （1992）Plant J.2，583-588;Carneiroら(1993)Plant Mol.Biol.22,681-690，Ul masov and Folk（1995）Plant Cell 7，1723-1734）。しかし、これまで生命工学的な適用が提案されてこなかった。従って、ｔＲＮＡは、翻訳におけるその中心的役割に起因して、生命工学の目的にとって有用であることが本発明によって初めて説明される。一般的に、多面的な影響、遺伝子抑制、サイレンシングもしくは細胞傷害性を引き起こすことなく効率的かつ制御された方法で、遺伝子発現のスイッチを入れたり切ったりできる必要性、または遺伝子発現のレベルを制御する必要性がある。しかし、これまでのところ、植物における遺伝子発現の制御に関して高度に効率的なトランス−活性化システムは開発されていない。従って、新規のキメラ転写アクチベーターおよび応答プロモーターに基づく優れた制御システムが必要とされている。その上、植物の生命工学的ツールの範囲を広げるため、当業者が形質転換すべき植物、標的遺伝子、および／または所望の植物の育種に影響をもち得る他の因子に応じて、最も有効なトランス活性化ストラテジーを選択することができるように、完全に新規なトランス活性化システムに対する必要性がある。従って、本発明の目的の一つは、植物における標的遺伝子発現のトランス活性化を確実にする転写アクチベータータンパク質を提供することである。強いＤＮＡ結合能力並びに植物における強い活性化能力を備えたキメラ転写アクチベーターは、植物において標的遺伝子の発現を調節するために有益なツールを提供する。その上、この転写アクチベーターキメラタンパク質は、そのＤＮＡ標的に非常に特異的な方法で結合すべきであり、従って発現の活性化は、特異的な転写アクチベーター応答配列を一つ以上含む標的遺伝子に限定されるべきである。本発明の別の目的は、サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子および未熟ストップコドンを含む標的遺伝子に基づく新規な発現制御システムを提供することである。このようなシステムは、形質転換する植物での取扱いが比較的簡単であるべきであり、また、標的遺伝子のトランス活性化において高効率であるべき（即ち、発現のバックグランドはできるだけ低レベルであるべき）である。転写アクチベーターシステムを用いれば、（i）トランスアクチベーター発現のレベルを改変することにより、また（ii）標的遺伝子内でトランスアクチベーター−応答配列の数を調節することにより、導入遺伝子の発現の量を操作することも可能である。サプレッサーｔＲＮＡシステムについても同様であり、このシステムの使用によって、ｔＲＮＡ遺伝子の発現レベルおよび／または標的遺伝子の発現レベルで標的遺伝子の発現を調節することができる。本発明の別の目的は、一定の遺伝子、即ち、その遺伝子産物またはその遺伝子産物により触媒される反応から生じる化学的化合物が細胞傷害性であるか、または他の有害なもしくは致命的な効果をもつような遺伝子の発現を可能にすることである。さらに、本発明の目的は、その遺伝子産物が例えばポンプチャンネルもしくは孔である遺伝子であり、例えば一以上の化学的化合物、要素またはイオンをある場所から別の場所へ移動させた結果として、有益または有害であり得るような遺伝子の発現を可能にすることである。本発明の別の目的は、標的遺伝子とキメラ転写アクチベーターをコードする遺伝的情報とを同じ植物細胞において共に発現したときにのみ、所望の表現型特性を発現する植物を提供することである。しかし、所望の表現型特性の発現が、例えば以降の植物世代において調節導入遺伝子と表現型導入遺伝子を分離することにより逆行することも、場合によっては望ましい。本発明のさらなる目的は、未熟ストップコドンを含む標的遺伝子およびサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子が同じ植物細胞において共に発現したときにのみ、所望の表現型特性を発現する植物を提供することである。さらに、ここで、表現型特性が、例えば以降の植物世代において調節導入遺伝子と表現型導入遺伝子の分離により逆行することも場合によっては望ましい。さらなる目的は、安全策を取るべきとき、即ち、例えば表現型特性の環境への解放を防止すべきときに使用され得る制御システムを提供することである。本発明の別の目的は、例えばトランスジェニック分野の試験における大規模生産において、標的遺伝子の産物を生産し単離することである。本発明の別の目的は、従来のシス作用性システムで経験される共抑制（cosupp ression）の問題を防止することである。これらの目的および他の目的は、添付の独立請求項で定義された主題により達成される。好ましい態様は、従属請求項および以下での本発明の説明により特記される。本発明は、ＤＮＡ結合性タンパク質の機能的部位および転写アクチベータータンパク質の機能的部位を含む、植物において活性なキメラ転写アクチベーターを提供する。特に、本発明は、大腸菌（Escherichia coli）のlacＩリプレッサータンパク質の機能的部位を含むトランスアクチベーターキメラタンパク質を提供する。好ましい態様において、本発明のトランスアクチベーターキメラタンパク質は、ＤＮＡ結合部位として、少なくとも−アミノ酸の置換を有する突然変異体lacＩタンパク質の部位を含んでいる。特に、E．coliのlacＩタンパク質のＤＮＡ認識ヘリックスの位置１においてチロシン（アミノ酸１７）からヒスチジンへ置換された lacＩタンパク質突然変異体は、Hl−突然変異体と称される。以下でさらに説明するように、H1−Lacリプレッザー突然変異体は、本発明の転写アクチベーターキメラタンパク質の特定の応答配列への優れた結合能力を提供してくれる。本発明で使用される好ましいトランス活性化タンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＧＡＬ４である。特に、本発明はE.coliのlacＩリプレッサータンパク質における機能的部位およびS.セレビシエ（S.Cerevisiae）の転写アクチベータータンパク質ＧＡＬ４の機能的部位を含むトランスアクチベーターキメラタンパク質を提供する。本発明で使用される別の好ましい転写アクチベータータンパク質は、ＨＳＶのＶＰ１６である。特に、本発明は、E.coli由来のlacＩリプレッサータンパク質における機能的部位および単純ヘルペスウイルスの転写アクチベータータンパク質ＶＰ１６の機能的部位を含むトランスアクチベーターキメラタンパク質を提供する。さらに、本発明は、本発明の種々の転写アクチベーターキメラタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子を提供する。本発明は、その植物細胞において、Lacオペレーター配列と結合した標的遺伝子が植物ゲノムに組み込まれているトランスジェニック植物を含む。本発明の好ましい態様において、lacＩ、または特にＤＮＡ認識ヘリックスに一以上のアミノ酸の置換を有するlacＩ突然変異体は、トランスアクチベーターキメラタンパク質の骨格として使用される細菌のＤＮＡ結合性タンパク質である。また、トランスアクチベーター応答配列は、野生型のLacオペレーター配列であるか、または野生型のLacオペレーター配列［ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ］もしくは野生型Lacオペレーターのコンセンサス配列［ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＳＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴ（ＳはＧまたはＣである。Lehming（199 0）“Regeln fur Protein DNA-Erkennung”、Dissertation、Universitat zu Ko ln参照）］と比べて、一以上の異なる塩基対を有するように、および／または少なくとも−塩基対の欠失を有するように改変されたLacオペレーター配列である。標的遺伝子内でトランスアクチベーター応答配列としてLacオペレーター配列を利用することは、トランスアクチベータータンパク質が結合可能な標的配列を植物に導入した配列にほとんど限定することになるため、特に好都合である。従って、植物におけるトランス−制御システムに影響を及ぼすような、相同配列への望ましくない結合はないであろう。本発明は、サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子または未熟ストップコドン、好ましくはアンバーストップコドンを含む標的遺伝子の何れかを含有する組み換えＤＮＡ分子をさらに提供する。好ましい態様において、一つのＤＮＡ分子は、弱いプロモーター（例えばノパリンシンターゼ（nos）プロモーターまたはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来の1'/2'プロモーター（それぞれDepickterら（1982）J.Mol.Appl.Genet.1，561-573、およびVelt enら（1984）EMBO J．12，2723-2730））の制御下に、改変されたｔＲＮＡ^SerまたはｔＲＮＡ^Leu遺伝子の何れかを含み、強力なアンバー抑制ｔＲＮＡの発現は許容するが、異所で発現したサプレッサーｔＲＮＡによる有毒効果または突然変異効果は回避する。もう一つのＤＮＡ分子内に含有された標的遺伝子は、何れの遺伝子であってもよい。好ましくは、該標的遺伝子は、未熟アンバーストップコドンを含み、対応するサプレッサーｔＲＮＡが同じ植物細胞において共に発現していなければ、タンパク質の翻訳が妨害され、非機能的なタンパク質の生産に至る。サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子は、サプレッサーｔＲＮＡの毒性効果を回避するために、かなり弱いプロモーターの制御下で発現しなければならないが、標的遺伝子は、植物細胞において機能的な如何なるプロモーターの制御下でも発現することができる。好ましくは、未熟ストップコドンを有する標的遺伝子は、例えばカリフラワーモザイクウイルスの35ＳＲＮＡプロモーターのような強力なプロモーターの下で発現する。この組み合わせは、このバイナリートランス活性化システムにおけるｔＲＮＡサプレッサー成分または標的遺伝子成分の何れかを有する両トランスジェニック植物の交配後に得られたハイブリッドＦ１植物において、標的遺伝子の非常に高い発現レベルの活性化を提供するだろう。さらに、本発明は、これら導入遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供する。本発明の組み換え核酸分子をつかって形質転換され得る植物は、何れの植物でもあってもよい。所望の表現型特性に応じて、裸子植物、双子葉類または単子葉類であり得る。本発明は、本発明の植物体の生殖産物、例えば種子、果実、挿し木、塊茎、根茎、およびプロトプラスト、植物細胞、カルスまたは根のような植物の一部をさらに含む。本発明は、標的遺伝子の発現を制御するための方法であって、本発明のトランスアクチベーターキメラタンパク質を利用して、一以上のトランスアクチベーター応答配列を含む標的遺伝子の発現を特異的に制御することを具備した方法を提供する。本発明は、更に、標的遺伝子の発現を制御するための方法であって、本発明のサプレッサーｔＲＮＡを利用して、少なくとも一つの未熟ストップコドンを含む標的遺伝子の発現レベルを特異的に制御することを具備した方法を提供する。標的遺伝子または転写アクチベータータンパク質もしくはサプレッサーｔＲＮＡを発現する遺伝子の何れかを含む各親植物の交配後に、Ｆ１ハイブリッド植物において合体された導入遺伝子の調節特性および表現型特性は、各々、以降の世代において別々に分離するので、本発明のトランス−制御システムは、それが所望の表現型特性の発現を逆行させることが望ましいときにも有利に利用され得る。加えて、細菌およびほ乳類におけるlacＩのオペレーター配列への結合は、ガラクトシドおよびガラクトシド類似体（例えばイソプロピル−β-Ｄ-チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）、メチル-β-Ｄ-チオガラクトシド（ＭＴＧ））の利用により軽減することができるので、所望ならば、このような化合物の植物体、植物細胞またはプロトプラストへの適用は、lacＩのその標的配列への結合を抑制してトランス活性化を抑制するために使用され得る。さらに、本発明は、所望の表現型特性を備えた植物を生産する方法を含んでおり、この方法は、第一の植物をキメラlacＩ（もしくはlacＩ突然変異体）-ＧＡＬ４-またはlacＩ(もしくはlacＩ突然変異体）-ＶＰ１６-転写アクチベータータンパク質をコードする組み換え核酸分子で形質転換すること、第二の植物を標的遺伝子並びに少なくとも一つのlacＩ（またはlacＩ突然変異体）-応答配列を含む組み換え核酸分子で形質転換すること、第一の植物と第二の植物とを交配すること、および同じ植物細胞において両方の導入遺伝子が共に発現しているときにトランス−活性化を達成させることを含んでいる。Lac−アクチベーター結合の非存在下で標的植物細胞において不活性である何れの最小プロモーターまたは他のプロモーターシステムも、トランス活性化により標的遺伝子を発現させるために使用され得ることは自明である。その上、本発明は、所望の表現型特性を備えた植物を生産する方法を含んでおり、この方法は、第一の植物をサプレッサーｔＲＮＡをコードする組み換え核酸分子で形質転換すること、第二の植物を少なくとも一つの未熟ストップコドン、好ましくはアンバーストップコドンを有する標的遺伝子を含む組み換え核酸分子で形質転換すること、第一の植物と第二の植物とを交配すること、および同じ植物細胞において両方の導入遺伝子が共に発現しているときにトランス−活性化を達成させることを含んでいる。当然、標的遺伝子のトランス活性化は、交配によるというよりむしろ、トランスアクチベーターまたはサプレッサーｔＲＮＡをコードする核酸分子および標的遺伝子をコードする核酸分子を同じ植物に直接導入することによっても達成され得る。従って、幾つかの状況において、または幾つかの適用に対して、他の手段（例えばウイルスベクターによる一連の形質転換または感染）により同じ細胞に二つの構築物を導入することが好都合であり得る。同じ植物体または植物細胞内に二つの独立した核酸分子が存在することは、異なる選択マーカー遺伝子を用いて、または分子生物学で使用される標準技術により容易にモニターすることができる。さらに、本発明は、細胞傷害性産物を生産する植物を作り出すための方法を提供する。さらに、本発明は、特定の遺伝子産物を多量に生産する植物を作り出すために使用され得る。本発明は、安全策を取るべきときに有効な制御システムをさらに提供する。例えば、表現型特性の環境への解放は、例えば導入遺伝子の一つが雄性不稔を担当するとき劇的に低下させることができる（トランスジェニック花粉の放出がなく、トランスジェニック種子を販売する種子会社の利益になり、共抑制の低下または完全な回避である）。しかし、一般的に如何なる特定の標的遺伝子も、本発明のアプローチにおいて使用することができる。本発明のトランスアクチベーターシステムは、所望の表現型を生じるために同じ細胞で全て発現しなければならない幾つかの遺伝子、例えば生合成経路の幾つかの酵素を発現させるために同じプロモーターを使用することが望ましいときに有利に使用することができる。Lac−トランスアクチベーターシステムは、ほんの短い配列（lacオペレーター配列）をゲノムに繰り返し挿入することを含み、共抑制の危険は低下する。異なるプロモーター、即ち、Lacオペレーターの各側に、Lac−アクチベーターにより同等に（co-ordinately）制御される二つの異なる最小プロモーターを使用することが望ましい。これは、二つの標的遺伝子を同時に発現したいとき、またはある遺伝子が容易にモニターされ（例えばＧＵＳ遺伝子のようなレポーター遺伝子）もう一つが標的遺伝子であるときに有効であり得る。種々の異なるプロモーターからアクチベーターを発現する一連のトランスジェニック植物を作成することが、本発明のトランスアクチベーターシステムの使用により可能である。従って、一連のアクチベーター植物を、lac応答配列の制御下で標的遺伝子を含むトランスジェニック植物と単に交配させることにより、多くの種々のパターンで標的遺伝子を発現することが可能となるはずである。このことは、標的遺伝子が、各プロモーターの後ろに再度クローニングされ、各場合において別々に植物が再度形質転換されるのではなく、たった一つの発現プラスミドに挿入され、一度だけわずかな形質転換体を作成するために使用されなければならないことを意味している。このことは相当な時間、労働および金銭の節約を表している。一般的に、本発明のトランス活性化システムは、安定して受け継がれるという利点、植物のライフサイクルの間安定しているという利点、非常に高い発現レベル（例えば、植物においてＣａＭＶ由来の強力なウイルス35ＳＲＮＡプロモーターの利用により得られた発現レベルと同じまたは同等の高い発現レベル）を提供するという利点を示している。本発明の新規植物を生産するために、幾つかの異なった方法を本発明に従って適用することができる。一方では、植物または植物細胞を遺伝子工学で公知の一般の形質転換方法により、新規ＤＮＡ配列が植物ゲノムに組み込まれる程度、即ち安定な形質転換がつくられる程度まで改変することができる。他方では、さらに一時的な遺伝子発現を研究し使用することができる。本発明は、本発明の組み換え核酸分子、該核酸分子の植物細胞への導入および該核酸分子の植物における発現に基づいて、これら新規植物を生産する方法を含む。所望ならば、転写アクチベーターキメラタンパク質は、例えばこの導入遺伝子を組織特異的プロモーター、誘導的プロモーター、または発生段階で制御されたプロモーター領域の制御下で発現させることにより、同様に制御することができる。本発明のトランスアクチベーターシステムの利用は、標的遺伝子を種々の異なった細胞タイプにおいて特異的に発現させたいとき、特に時間節約的および労働節約的である。さらに、トランスアクチベーター発現のレベルは、トランスアクチベーターコードＤＮＡ配列に対して半接合体またはホモ接合体である植物で分析することができる。標的遺伝子の発現レベルが標的遺伝子の半接合体状態またはホモ接合体状態に応じてそれぞれ変化し得ることは自明でめる。一以上の新規核酸分子についてホモ接合体であるトランスジェニック系統は、通常の技術、例えば以降の子孫の分離パターンによって容易に同定することができる。さらに、別々の形質転換体の間で見られる発現の基本的変異（「位置効果」として公知）は、アクチベーターおよびレポーターＴ−ＤＮＡの両方に対するその効果によって、標的遺伝子の発現レベルを変えるために使用することもできる。ＤＮＡを植物の宿主細胞に導入するために、幾つかの技術が利用でき、当業者は容易に適切な形質転換方法を選択することができる。これらの技術は、形質転換手段としてのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefa ciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、単離したＤＮＡのプロトプラストへの直接的遺伝子導入、ＤＮＡのマイクロインジェクションまたは電気穿孔法、バイオリスティックな方法（biolistic method）を介したＤＮＡの導入および他の方法を含む。ＤＮＡをマイクロインジェクションまたは電気穿孔法により導入するときは、何れの形態のＤＮＡも使用することができる。同じことが直接的遺伝子導入にもあてはまる。ここでは、単純なプラスミド、例えばｐＵＣ誘導体を使用することができる。しかし、植物全体を形質転換された植物細胞から再生したいなら、形質転換された植物の選択を可能にするマーカー遺伝子が必要である。適切な選択マーカーは、当業者に公知である。使用される形質転換方法に応じて、別のＤＮＡ配列が必要とされ得る。例えば、Ti-またはRi-プラスミドを使用すると、導入すべき遺伝子は、Ti-およびRi-プラスミドに含有されるＴ−ＤＮＡの少なくとも右端で結合しなければならない。しばしば、導入すべき遺伝子は、フランキング領域としてＴ−ＤＮＡの右端および左端の両方で結合しなければならない。アグロバクテリアを形質転換のために使用する場合、導入すべきＤＮＡは、特定のプラスミド、即ちインターメディアリィベクターまたはバイナリーベクターにクローニングしなければならない。インターメディアリィベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列に対して相同的な配列を含んでおり、この配列が、相同的組み換えによりアグロバクテリアのTi-またはRi-プラスミドに組み込まれることを可能にする。さらに、このプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの導入のために必要なvir-領域を運んでいる。インターメディアリィベクターは、アグロバクテリアの中で複製することができない。インターメディアリィベクターは、ヘルパープラスミド（接合）を介してアグロバクテリアに導入され得る。バイナリーベクターは、E.coliおよびアグロバクテリアの両方で複製することができる。バイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡの左端および右端領域の間の枠内に挿入された選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。これらベクターは、アグロバクテリアに直接導入することができる(Holstersら(1978)、Molecular and General Genetics 163，181 -187)。アグロバクテリア宿主細胞は、植物細胞にＴ−ＤＮＡを導入するのに必要なvir-領域を有するプラスミドを含むべきである。形質転換されたアグロバクテリウムは、植物細胞の形質転換のために使用される。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用は、充分研究され、ＥＰ１２０５１５；Hoekema in：バイナリー植物ベクターシステム、Offsetdrokker i j Kanters B.V.，Alblasserdam（1985）Chapter V；Fraleyら（1993），Crit ．Rev．Plant Sci．4，1-46およびAnら（1985）、EMBO J．4，277-287に充分に記載されている。植物細胞にＤＮＡを導入するため、植物の外植体をアグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾジゲネスとともに効果的に培養することができる。その後、感染した植物材料（例えば葉もしくは葉切片、茎の部分、根、プロトプラストまたは懸濁培養で培養した植物細胞）から、抗生物質または殺生物剤を選択薬剤として含む適切な培地で、植物全体を再生することができる。植物体の再生は、公知の栄養培地を用いて普通の再生方法により行われる。その後、得られた植物体は、標準の生化学的手法および遺伝子工学的手法を用いて導入されたはずのＤＮＡについて分析することができる。バイオリスティック(Biolistic)形質転換法を、例えばWillmitzer（1993）Transgenic Plants、in ：Biotechnology、A Multi-Volume Comprehensive Treatise（H.J.Rehm，G．Ree d，A．Puhler，P．Stadler，eds Vol．2，627-659，V.C.H．Weinheim−New York −Basel−Cambridgeに記載されたとおりに適用することができる。 Ti-プラスミド-ベクターシステムを用いたA.tumefaciensを介しての双子葉植物の形質転換は充分確立されているが、最近の研究は、単子葉植物もアグロバクテリウム由来のベクターにより形質転換することができることを示しているようである（Chanら（1993）、Plant Mol.Biol.22，491-506；Hieiら（1994）、Plant J．6 ，271-282；Dengら（1990）、Science in China 33，28-34；Wilminkら（1992）、Plant Cell Reports 11，76-80;Mayら(1995)Bio/Technology 13，486-492；Co nner and Domiss(1992)Int.J.Plant Sci.153，550-555；Ritchieら（1993）Tran sgenic Res．2，252-265）。単子葉類を形質転換するための別のシステムは、バイオリスティック（biolis tic）アプローチ（Wan and Lemaux（1994）、Plant Physiol．104，37-48；Vasi lら（1993）、Bio/Technology 11，1553-1558;Ritalaら(1994)、Plant Mol.Biol ．24，317-325；Spencerら（1990）、Theor.Appl.Genet.79，625-631）、プロトプラストの形質転換、部分的に透過性を備えた細胞の電気穿孔法、ＤＮＡのガラス繊維による導入を用いた方法である。裸子植物の形質転換のために使用することができる形質転換法は、例えば、Li uら（1993）Plant Mol.Biol．23，297-308；Primich and Minocha（1991）Plant Cell Reports 10，545-549；Morrisら（1989）Phys.Mol.Plant Pathol．34，45 1-462に記載されている。導入されたＤＮＡが植物ゲノムに一旦組み込まれると、それは安定なままであり、さらに、元の形質転換された植物細胞の子孫に安定に受け継がれる。普通、それは、殺生物剤または抗生物質、カナマイシン、Ｇ418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、メトトレキシート、グリフォゼート、ストレプトマイシン、スルフォニルウレア、ゲンタマイシン、フォスフィノトリシンなどに対して耐性を付与する選択マーカーを含む。従って、個別に選択することができる選択マーカーは、導入ＤＮＡを欠いている細胞に対して、形質転換された細胞の選択を可能にするはずである。形質転換された細胞は、普通の方法で植物内で増殖する（例えばMcCormickら（1986）Plant Cell Reports 5，81-84）。得られた植物は普通の方法で栽培することができ、自家受粉により繁殖でき、または他の植物（野生型もしくはトランスジェニック植物）と交配させることができる。レポーターまたはアクチベーター（即ち、トランスアクチベーターまたはｔＲＮＡをコードする）構築物を含むトランスジェニック植物を交配することができ、両親がヘテロ接合体であれば、アクチベーターおよびレポーターＴ−ＤＮＡの両方を含む子孫を、各Ｔ−ＤＮＡ上の異なる耐性マーカーの存在により同定することができる。これら異なる耐性マーカーは、子孫により実証された何れかの表現型を各Ｔ−ＤＮＡの存在または非存在と関連づけることを可能にする。子孫植物の表現型を標的遺伝子の発現に結びつけるさらなる証拠は、アクチベーター植物およびレポーター植物の各々と、標的遺伝子のプロモーターにおいてla cＩ応答配列を欠いているレポーター植物とを交配するか、または転写活性化ドメインを欠いている偽（mock）アクチベーターを発現している植物とを交配することにより得ることができる。組み換え核酸分子、植物、並びに本発明の方法を記載している以下の図、表および例は説明の目的でのみ記載しており、本発明を限定するものと解釈すべきでばない。表１アクチベーター構築物およびレポーター構築物で予め形質転換された植物のＦ１タバコ芽生えにおけるＧＵＳ酵素活性（図６に対応する表）表２種々のレポーター植物とアクチベーター植物との交配に由来する子孫のＧＵＳ酵素活性の分析および分離パターン表２（続き）図および表の説明図１は、LacＩ-Gal４の転写アクチベーター融合体を有するプラスミド構築物ｐＶＫＩＶＧａｌ４を示す。原則として、LacＩ-Gal４の転写アクチベーターは、細菌のLacＩ遺伝子のチロシン１７→ヒスチジン１７置換の突然変異体（lacＩ^his ）および酵母のＧＡＬ４タンパク質の転写活性化ドメインのインフレーム融合により得た。 LacＩのＤＮＡ結合突然変異体（LacＩ^his）のコード配列は、Cologne大学の遺伝学研究所から入手した。この突然変異体は、Lehmingら（1987）Embo J．6，31 45-3153に詳細に記載されている。我々は、ｐＷＢ100シリーズ由来のベクター（ｐＷＢ100ＨＩＳ１）においてこのLacＩ突然変異体を得た。このプラスミドマップおよび一部の配列データはLehmingら、同上に記載されている。この半合成Lac Ｉ^his遺伝子において、LacＩ翻訳開始コドンはＡＴＧに変換され、一つの例外を除いて野生型のタンパク質配列を変化させることなく、他の制限部位の導入に加えてＮｄｅＩ部位に組み込まれた：一つの例外とは、LacＩ^his遺伝子が、オペレーター認識ヘリックスに位置するアミノ酸位置１７でアミノ酸の置換を有しており、ここでチロシンはヒスチジンに置換されている。さらにクローニングを容易にするため、SpeＩ制限部位（残基329および330をコードする５’-ＡＣＴＡＧＴ -３’）をLacＩ^his遺伝子のＣ−末端に導入して、残基330をロイシンからセリンに変換する。このアミノ酸の変化は、タンパク質の所望の機能に影響を及ぼさず、プラスミド構築の便宜のためだけに施した。ＧＡＬ４Ｉ＋IIタンパク質の転写活性化ドメインII（残基768-881）のコード配列は、Harvard大学、Cambridge、MassachusettsのDr．Jun Maから入手した。ＧＡＬ４タンパク質の転写活性化断片に関する研究は、Jun Ma and Mark Ptashn e、同上により提示され、ここでさらに種々のＧＡＬ４誘導体の構築が報告された。ＧＡＬ４の転写活性化ドメインIIのコード配列は、lacＩ^his遺伝子の唯一の上記ＳｐｅＩ制限部位にインフレームで挿入され、例１記載の実験で使用される LacＩ^his-Gal４のインフレーム融合遺伝子が形成される。この融合遺伝子において、ＧＡＬ４の転写活性化部位のコード配列、即ちアミノ酸768-881を含むほぼドメインIIを、LacＩのコード領域のコドン329および330の位置に導入されたＳｐｅＩ部位でLacＩコード領域に挿入した（上記参照）。融合遺伝子の構築は、上記のような改変されたLacＩ^his遺伝子を有するｐＷＢ100由来のベクターで行われた。植物においてLacＩ^his-Gal４融合遺伝子の発現を可能にするため、改変されたlacＩ翻訳開始部位におけるNdeＩ制限部位およびlacＩ遺伝子のBglII部位３’を用いて、LacＩ^his-Gal４融合遺伝子をNdeＩ-BqlII制限断片として単離し（Lehmingら（1987）同上におけるｐＷＢ100参照）、植物の発現ベクターｐＫＩ１０２のAseＩおよびBamHＩ制限部位に挿入した。植物発現ベクターｐＫＩ１０２は我々が目前で作成し、カリフラワーモザイクウイルスの35Ｓプロモーターとポリアデニル化シグナルとの間で発現するようなコード領域の挿入のためのポリリンカーから成る植物の発現カセットを含んでいた。35Ｓプロモーターは、ＣａＭＶ株ＣａｂｂＢ-Ｄの７０１６〜７４３４塩基対から成り、35Ｓポリアデニル化シグナルは、ＣａＭＶ株ＣａｂｂＢ-Ｄ（ＣＭ１８４１；Gardnerら（1981）Nucl.Acids Res.9，2871-2888）の７４３６〜７６３９塩基対に対応する。しかし、原則として何れの植物発現ベクターも使用することができる。適切な植物発現ベクター、例えばバイナリー植物形質転換ベクターは、文献にしばしば記載される普通のツールであり、当業者に公知である。 LacＩ^his−Gal４融合体の発現および転写活性化能力をタパコのプロトプラストで調べた。構築物の機能を確認して、ＣａＭＶ 35Ｓプロモーター、LacＩ^his−Gal４の融合遺伝子およびポリアデニル化シグナルから成る発現カセットの全体をPstＩ断片としてバイナリーベクターｐＶＫ１８に挿入し、ベクター構築物ｐＶＫＩＧａｌ４を作成した。ｐＶＫ１８は、普通の植物形質転換ベクターに相当する。ｐＶＫ１８は、Ｔ−ＤＮＡのその右端で遺伝子を挿入するためのポリリンカーを有しており、ｐＭＮ０１６−ＶＳ由来であり、これはｐＭＮ００１に基づき（Reiss ら（1994）Plant Phys．(Life Sci.Adv.)13，143-149）、これを二つの点で改変した：（ａ）ｐＭＮ０１６−ＶＳは、プラスミドｐＤＨ51由来のＣａＭＶ 35Ｓプロモーターを含む(Pietrzakら(1986)Nucl.Acids Res.14，5857-5869)、（ｂ）ｐＭＮ００１のmini−ＲＫレプリコンをｐＶＳ１由来のmini−ｐＶＳレプリコンにより置き換える（Itohら（1984）Plasmid 11，206-220；Deblaereら（1987）M ethods in Enzymology 153，277-292）。ｐＶＫ１８は、ｐＭＮ０１６−ＶＳからそのｐＢＲ３２２複製起点、ベーターラクタマーゼ遺伝子およびＣａＭＶ 35 Ｓ-ＮＰＴＩＩ−polyＡカセットを取り除き、これらを複製起点、細菌のカナマイシン耐性マーカーおよびプラスミドｐＫ１９のポリリンカーで置き換えることにより構築された（Pridmore（1987）Gene 56，309-312）。ｐＶＫＩＧａｌ４は、安定な形質転換体を作成ために使用される最終的な転写活性化構築物であり、1996年７月29日に、受託番号ＤＳＭ11108を付与され、Deu tsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ）、Mascher oder Weg Ib、D-38124 Braunschweig、GermanyにおいてE.coli中で寄託されている。原則として、何れもの植物形質転換ベクターを、LacＩ^his−Gal４融合遺伝子で植物を形質転換するのに使用することができる。図２は、LacＩ−Ｖｐ１６融合遺伝子を有するプラスミド構築物を示している。原則として、LacＩ−Gal４融合遺伝子に関する図１記載のクローニングストラテジーに従った。Princeton University、New JerseyのA.J.Levineから、我々は、これまでほ乳類細胞でしか試験されていないLacＩ−ＶＰ１６融合構築物（ｐＨＣＭＶＬＡＰ３４８）を入手した。該構築物は記載されており、そのデータは Labowら（1990）Mol.Cell.Biol.10,3343-3356で提示されている。LacＩ−Ｖｐ１６融合体のコード配列は、BglIIおよび一部SacＩの処理によりｐＨＣＭＶＬＡＰ３４８から単離した。この融合遺伝子において、ＶＰ１６の転写活性化部位のコード配列、即ちアミノ酸369−488を含むほぼカルボキシル末端酸性ドメインは、 LacＩアミノ酸348のコドンあたりでLacＩコード領域に挿入された（Labowら（19 90）同上）。単離されたLacＩ−Ｖｐ１６断片は、植物の発現ベクターｐＫＩ１０２に、ＣａＭＶ 35Ｓプロモーターの下流およびポリアデニル化シグナルの上流で挿入された。ｐＫＩ１０２は、自分で作成した植物の発現ベクターであるが（図１参照）、原則として、何れの植物発現ベクターも、植物の発現シグナルの制御下でLacＩ−Ｖｐ１６融合体のコード配列を提供するために使用することができる。安定に形質転換した植物を生産できるために、完全なＣａＭＶ 35Ｓ−LacＩ− Ｖｐ１６ポリＡ発現カセットをｐＫＩ１０２誘導体からHindIII制限断片として一部処理後に単離し、バイナリープラスミドｐＶＫ１８のポリリンカーに挿入し、プラスミドｐＶＫＩＶｐ１６を作成した。図３は、植物の発現ベクターｐＸ−９１０ＴＡＧのプラスミドマップを示しており、これはlacオペレーター配列を上流に挿入したＣａＭＶ 35Ｓ最小プロモーターの制御下でレポーター遺伝子ＧＵＳ（E.coli由来のuidＡ遺伝子）を運んでいる。植物細胞においてLacＩ^his−Gal４およびLacＩ−Ｖｐ１６融合構築物の活性をモニターするために、プラスミドｐＸ−９１０ＴＡＧを以下の手法により構築した。ｐＸ−９１０ＴＡＧおよびｐＸ−９４４ＴＡＧ構築物（lacオペレーター配列においてのみｐＸ−９１０ＴＡＧと異なるｐＸ−９４４ＴＡＧ）の不可欠な配列は、ＧＵＳ遺伝子の発現を制御するＣａＭＶ 35Ｓ最小プロモーター（転写の開始点［＋１］に対して−４６〜＋８）の上流に位置するLacオペレーター配列である。キメラLacＩ^his−Gal４またはLacＩ−ＶＰ１６転写アクチベーターの存在下において、該アクチベーターはコグネイト（cognate）なオペレーター配列に結合することができ、従って標的遺伝子、ここではＧＵＳレポーター遺伝子の転写および発現を活性化し、容易にし、および／または促進する。Ｔ−ＤＮＡが強力なエンハンサー配列を含まないことは注目するに値し、最も近くのプロモーターは２ｋｂ以上離れており、最小プロモーターが近傍プロモーター配列によりシスに活性化される可能性は低い。同様に標的遺伝子は、最小プロモーターとＴ−ＤＮＡの右端との間に位置し、最小プロモーターがその側面に位置する植物ゲノムＤＮＡにおけるプロモーター配列によりシスに活性化される可能性を最小限にする。ｐＸ−９１０ＴＡＧおよびｐＸ−９４４ＴＡＧにおけるＧＵＳレポーター遺伝子の発現は、（例えば、Jeffersonら（1987）EMBO J．6，3901-3907およびJeffe rson（1987）Plant Mol.Biol.Rep.5，387-405に記載の方法に従って）ＧＵＳ酵素活性を測定することにより容易にモニターすることができる。転写アクチベーターの非存在下において、バックグランド以上にＧＵＳ発現を検出することはあり得ない。その結果、上記プロモーターの活性は、非常に特異的で厳密な遺伝子発現の制御メカニズムであれば、機能的な転写アクチベータータンパク質の存在に依存する。二つのプラスミドｐＸ−９１０ＴＡＧおよびｐＸ−９４４ＴＡＧは、ＣａＭＶ 35Ｓ最小プロモーターの上流に挿入されたオペレーター配列においてのみ異なる。Lacオペレーター配列は、Cologne大学の遺伝学研究所から入手し（プラスミドｐＷＢ９１０およびｐＷＢ９４４）、Lehmingら（1987）同上において、それぞれ名称３１０および３４４で公表されている。これら二つのオペレーター配列は、野生型Lacリプレッサーおよび上記LacリプレッサーのＨｉｓ１突然変異体がそれぞれ３１０、並びに３１０および３４４オペレーター配列に堅く結合できることが細菌について見い出されたために選択された（Lehmingら（1987）同上；L ehmingら（1989）同上）。オペレーター配列は、ＸｂａＩ断片としてプラスミドｐＷＢ９１０（３１０）およびｐＷＢ９４４（３４４）から単離され、pBluescriptベクターの唯一のＸｂａＩ部位にまず挿入された（S tratagene、La Jolla、CA、USA）。pBluescriptにクローニングした後、オペレーター配列３１０および３４４は、pBluescriptポリリンカーの側面に位置する二つの平滑末端の制限部位：Ecl136IIおよびEcoＲＶを用いて、pBluescript誘導体から再度単離された。制限分析により、３１０の二つのＸｂａＩオペレーター断片がＸｂａＩ制限のpBluescriptベクターに二回挿入されたことが見出された。その結果、対応するEcl136II−EcoＲＶ断片は、二つの３１０オペレーターを含んでいた。オペレーター配列３１０または３４４の何れかを含むEcl136II−Ec oＲＶ断片は、バイナリーベクタ−ｐＶＨ−ＴＡＧに、ＣａＭＶ 35Ｓ最小プロモーター−ＧＵＳ−ポリアデニル化構築物の５’側で挿入された。平滑末端のEcl1 36II−EcoＲＶ断片を、ｐＶＨ−ＴＡＧの唯一のEcl136II部位に挿入し、（プラスミドｐＷＢ９１０由来のオペレーター配列３１０を有する）プラスミドｐＸ− ９１０ＴＡＧおよび（プラスミドｐＷＢ９４４由来のオペレーター配列３４４を有する）ｐＸ−９４４ＴＡＧを作成した。ｐＸ−９４４ＴＡＧの場合、制限分析から分かるように、対応するEcl136II−EcoＲＶ断片の二回の挿入が起こった。実際、両方のレポーター構築物、ｐＸ−９１０ＴＡＧおよびｐＸ−９４４ＴＡＧは、二つのオペレーター配列（それぞれ３１１および３４４）を含んでいる。上記のとおり、レポータープラスミドｐＸ−９１０ＴＡＧおよびｐＸ−９４４ＴＡＧは、我々が目前で構築したバイナリーベクターｐＶＨ−ＴＡＧにオペレーター配列３１０（プラスミドｐＷＢ９１０由来）または３４４（ｐＷＢ９４４由来）を挿入することにより入手された（図４も参照）。原則として、何れの植物形質転換ベクターも使用することができる。ここで、ｐＶＨ−ＴＡＧの重要な配列は、ＣａＭＶ 35Ｓ最小プロモーターの制御下でＧＵＳコード配列を含むＧＵＳ発現カセットであり、オペレーター配列の挿入後、LacＩ由来の転写アクチベーターに依存した調節ユニットが得られるという事実である。ｐＶＨ−ＴＡＧ、例えば図４で示されるプラスミドマップにおいて、ＧＵＳ発現カセットは、ポリアデニル化シグナルをＧＵＳコード配列およびＣａＭＶ最小プロモーターから成る。（E.col1のuidＡコード配列を改変した）ＧＵＳレポーター遺伝子を、ＣａＭＶ 35Ｓポリアデニル化シグナルとともにプラスミドｐＲＴ１０３ＧＵＳから単離した（Topferら（1988）Plant Cell Rep.7，225；Topferら（1993）Methods in Enzymology 217，66-78）。ＣａＭＶ 35Ｓ最小プロモーターは、ＣａＭＶ 35ＳＲＮＡプロモーターの最小ＴＡＴＡ領域に相当し、転写開始点（［＋１］；Odellら（1985）Nature 313，810-812；Benfey and Chua（1990）Science 250，959-966 参照）の回りの塩基対−46から＋８を含んでいる。 Ecl136II（SacI）制限部位は、ｐＶＨ−ＴＡＧにおいてＧＵＳ発現カセットのＣａＭＶ 35Ｓ最小ＴＡＴＡ領域の上流に位置する。この唯一の制限部位は、上記の方法でオペレーター配列を挿入するのに使用し、プラスミドｐＸ−９１０ＴＡＧおよびｐＸ−９４４ＴＡＧを作成した。 lacオペレーター配列は以下のとおりである：野生型lacオペレーター配列（E. coliにおけるオペレーター１）：ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ；lacオペレーターのコンセンサス配列：ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＳＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴ（ＳはＧまたはＣである）；９１０（理想的なlacオペレーター）：ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴ；９４４：ＡＡＴＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＡＴＴ（Lehming（1990）同上；Lehmingら（1987）（1989）同上）。植物においてその酵素活性が容易に測定可能なために選択されたＧＵＳ遺伝子は、このような転写アクチベーター依存の遺伝子発現の制御下にあることが望まれるような何れの他のレポーター遺伝子または標的遺伝子でも、原則として置き換えることができる。プラスミドｐＸ−９１０ＴＡＧは、1996年７月29日に、受託番号ＤＳＭ11107 を付与され、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH （DSMZ）、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig、Germanyにおいて、E.c oli中で寄託されている。図４は、バイナリー植物形質転換ベクターｐＶＨ−ＴＡＧのプラスミドマップを示しており、上記で詳細に説明した（図３の説明）。図５は、Ｆ１タバコ芽生えにおけるＧＵＳ酵素活性を示している。レポーター構築物ｐＸ−９１０ＴＡＧ（レポーター、16/56）およびLacＩ−GAL４結合部位を欠くコントロール構築物ｐＶＨ−ＴＡＧ（コントコール、13/4）を含むタバコ植物を雌株植物として使用した。これら植物は、アクチベーター構築物：系統47 /1-21（Ａ）、10/1-2（Ｂ）および10/1-6（Ｃ）を含む植物からの花粉により受粉した。各交配から、約５０子孫の芽生え（４週齢）をＸ−Glucにより組織化学的に染色した。アクチベーター植物とコントロール植物との交配による子孫においてＧＵＳ活性は検出されなかったが、アクチベーター植物とレポーター植物との交配による子孫はＧＵＳ活性を示した。各交配において、子孫の集団の中でＧＵＳ発現を典型的に表す三個の芽生えを示した。（Ｄ）レポーター構築物（レポーター、16/56）のみで形質転換した植物に由来する芽生えにおいてＧＵＳ活性は検出されなかった。（Ｅ）陽性コントロール構築物により形質転換された植物に由来するタバコ芽生えにおいてＧＵＳ活性の構成的発現が検出された。この陽性コントロール35Ｓ/ＧＵＳ構築物は、完全に活性な35ＳＲＮＡプロモーターの制御下でＧＵＳコード領域を含み、35Ｓプロモーターの制御下でＧＵＳレポーター遺伝子を有する何れもの植物形質転換ベクターは、陽性コントロールプラスミドとして使用され得る。図６において、種々のＦ１タバコ芽生えにおけるＧＵＳ酵素活性を定量的に比較する。タバコ植物をアクチベーターおよびレポーター構築物により形質転換することに成功した。種子を収穫し、ハイグロマイシン（１５ｍｇ／Ｌ）およびメトトレキセート（０．２ｍｇ／Ｌ）を含むＭＳ培地上で発芽させた。４週間後、６個の芽生えのプールにおいてＧＵＳ活性を測定した。データは、４個の繰り返しサンプルの平均値および標準偏差を示している。ＳＲ１タバコの野生型の芽生えおよびレポーター構築物のみを含む芽生え16/12および16/56において、活性は検出されなかった。ＳＲ１、16/12および16/56（陰性コントロール）、16/12-G3、16/12-G22、16/ 56-G22、16/12-G24、16/12-G28、16/56-G13（二回形質転換体）、35Ｓ−ＧＵＳ（上記の陽性コントロール）。図６で示された結果は、表１にも示す。図７および図８は、バイナリー形質転換ベクターのプラスミドマップを略図で示しており、これは、未熟ストップコドンを含む標的遺伝子（ここでは、例としてＧＵＳ遺伝子）またはサプレッサーｔＲＮＡの何れかを含む植物間の交配による子孫において、サプレッサーｔＲＮＡによりＧＵＳレポーター遺伝子の発現を活性化するための植物の形質転換のために使用される。両方のベクターにおいて、選択マーカーＮＰＴIIは、構成的なＣａＭＶ 35Ｓプロモーターの制御下にある。ＲＢ、ＬＢは、Ｔ−ＤＮＡの右端および左端である。これら、および全ての他の配列は、文献に記載された標準のバイナリーベクターのことをいう。当然、他の選択マーカー遺伝子を有するバイナリーベクターも、例えば同じ植物細胞において二つの異なるＤＮＡ分子（即ち、サプレッサーｔＲＮＡをコードしている構築物および標的遺伝子をコードしている構築物）の存在をモニターすることを容易にするために使用することができる。表１は、アクチベーターおよびレポーター構築物により予め形質転換された植物のＦ１タバコ芽生えにおけるＧＵＳ酵素活性の蛍光分析の結果を示す。この結果は表６に示すものに対応する。グルクロニダーゼ酵素活性は、Jeffersonら、同上により記載されたとおりに定量的に測定した。ＧＵＳ酵素活性は、nmol Mu （４−メチルウンベリフェロン）×ｍｇ^-1タンパク質×分^-1で表す。表２は、種々のレポーター植物とアクチベーター植物との交配に由来する子孫のＧＵＳ酵素活性の分析、並びに該芽生えの抗生物質耐性による芽生えの分離パターンを示している。レポーター構築物ｐＸ−９１０ＴＡＧ（系統：16/12、16/ 51、16/56）もしくはｐＸ−９４４ＴＡＧ（系統：34/5）、またはコントロール構築物ｐＶＨ−ＴＡＧ（lacオペレーター配列を欠いている系統13/4）を含むタバコ植物を雌株植物として使用した。これらトランスジェニック植物は、選択マーカーとしてＨＹＧ耐性を含むレポーターまたはコントロール構築物の組み込みのため、ハイグロマイシン（ＨＹＧ）耐性である。これら植物は、選択マーカーとしてメトトレキセート（ＭＴＸ）耐性を備えたアクチベーター構築物ｐＶＫＩＧａｌ４（系統47/1-21、10/1-2および10/1-6）を含む植物からの花粉により受粉した。各交配から、所定の数の子孫の芽生え（ＳＴ）を、二つの抗生物質ＨＹＧおよびＭＴＸ(２０μｇ／ｍＬ植物培地のハイグロマイシン（Calbiochem、Fra nkfurt、Germany）および0.2μｇ／ｍＬ植物培地のメトトレキセート(Sigma、Mu nich、Germany))を含むＭＳ培地(Murashige and Skook(1973)Physiol.Plant 15 ，473-497)上で発芽させた。ＨＹＧおよびＭＴＸの両方に耐性のあるトランスジェニック植物（ＳＧ）のパーセンテージ（Ｒ）を測定した。各交配から、約５０子孫の芽生え（４週齢）をX-Glucで組織化学的に染色した。（陰性レポーターコントロールプラスミドを有する）コントロール植物13/4と種々のアクチベーター植物との交配から得られた芽生えは、ＧＵＳ染色を示さなかった。ＧＵＳ活性を示す器官を表に記載し、16/56交配に関する外観は表５に示されている。実験例例１トランスジェニック植物レポーター系統の構築 Nicotiana tabacumcv.PetitHavanna ＳＲ１ (Meligaら（1973）Nature New Bi ol．244，29-30）植物を、Horschら（1985）Science 277，1229-1231に記載されたリーフディスク技術を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agro bacterium tumefaciens）介在の形質転換により、上記レポータープラスミドをｐＸ-９１０ＴＡＧ（ＤＳＭ11107）またはｐＸ-９４４ＴＡＧで形質転換した。タバコのリーフディスクに感染させて、植物のレポーターＴ-ＤＮＡ形質転換を容易にするため、アグロバクテリウム株、A.tumefaciens ＰＧＶ3101 ｐＭＰ90 （Koncz and Schell（1986）Mol.Gen.Genet.204，383-396）を使用した。幾つかのトランスジェニックカルスおよび最終的に植物系統を再生した：ｐＸ-９１０ＴＡＧを用いた形質転換実験に由来する系統１６/・・およびｐＸ-９４４ＴＡＧを用いた形質転換実験に由来する系統３４/・・。Ｔ-ＤＮＡ上に位置するハイグロマイシン耐性の植物選択マーカーを利用して、トランスジェニック植物を選択した(ｐＸ-９１０ＴＡＧおよびｐＶＨ-ＴＡＧのプラスミドマップ、図３および４参照)。２０μｇ／ｍＬ植物培地のハイグロマイシン(Calbiochem、Frankfurt 、Germany)を選択の間使用した。 Jeffersonら（1987）同上のプロトコールに従ってＧＵＳアッセイを行ったところ、対応する転写アクチベーターが存在しないと思われるため、レポーター植物においてＧＵＳ活性は検出できなかった。ＧＵＳ活性の誘導をモニターするため、幾つかの植物レポーター系統を選択し、アクチベーター構築物で再度形質転換し、および／または幾つかの予め再生されたアクチベーター植物（以下の例に記載）と交配させた。例２トランスジェニック植物アクチベーター系統の構築 Nicotiana tabacum cv.Petit Havanna ＳＲ１（Meligaら（1973）Nature New Biol．244，29-30）植物を、Horschら（1985）Science 277，1229-1231に記載されたリーフディスク技術を用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ag robacterium tumefaciens）介在の形質転換により、上記アクチベータープラスミドをｐＶＫＩＧａｌ４（ＤＳＭ11108）またはｐＶＫＩＶｐ１６で形質転換した。タバコのリーフディスクに感染させて、植物のレポーターＴ-ＤＮＡ形質転換を容易にするため、アグロバクテリウム株、A.tumefaciens ＰＧＶ3101 ｐＭＰ90（Koncz and Schell（1986）Mol.Gen.Genet.204， 383-396）を使用した。幾つかのトランスジェニックカルスおよび最終的に植物系統を再生した：ｐＶＫＩＧａｌ４を用いた形質転換実験に由来する系統１０/ ・・および系統４７/・・、並びにｐＶＫＩＶｐ１６を用いた形質転換実験に由来する他の系統（図の説明で記載せず）。Ｔ-ＤＮＡ上に位置するメトトレキセート耐性（ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ＤＨＦＲ）の植物選択マーカーを利用して、トランスジェニック植物を選択した（ｐＶＫＩＧａｌ４およびｐＶＫＩＶｐ１６のプラスミドマップ、図１および２参照）。０．２μｇ／ｍＬ植物培地のメトトレキセート（Sigma、Munich、Germany）を選択の間使用した。トランスジェニックアクチベーター植物は、観察される異常もなく野生型の表現型を示し、温室で栽培された。幾つかのアクチベーター植物をランダムに選択し、レポーター系統と交配させた（例１参照）。例３トランスジェニックレポーター系統のアクチベーター構築物による再形質転換プロセス（植物の栽培、交配、種子の収穫など）期間を短くし、本発明の転写活性化システムの機能についてのデータを得るため、レポーター植物（例１参照）を、Horschら（1985）Science 277，1229-1231に記載されたリーフディスク形質転換技術を用いて、上記アクチベータープラスミド、ｐＶＫＩＧａ１４またはｐＶＫＩＶｐ１６で形質転換した。トランスジェニックレポータータバコ系統のリーフディスクに感染させて、植物のアクチベーターＴ-ＤＮＡ形質転換を容易にするため、アグロバクテリウム株、A.tumefaciens ＰＧＶ3101 ｐＭＰ90（K oncz and Schell（1986）Mol.Gen.Genet.204，383-396）を使用した。幾つかの二回トランスジェニックカルスおよび最終的に植物系統を再生した：このうち幾つかが図６に記載されており、例えば１６/１２-Ｇ３および１６/５６-Ｇ２２である。アクチベータープラスミドｐＶＫＩＧａｌ４およびｐＶＫＩＶｐ１６のＴ -ＤＮＡ上に位置するメトトレキセート耐性の植物選択マーカーを利用して、再度形質転換された植物を選択した。０．２μｇ／ｍＬ植物培地のメトトレキセートを選択の間使用した。 X-Gluc染色および定量的ＧＵＳアッセイ、即ちβ-グルクロニダーゼ酵素活性の組織化学的および蛍光比色による分析を、Jeffersonら（1987）EMBO J．6，39 01-3907 およびJeffersonら（1987）Plant Mol.Biol.Rep.5，387-405に記載されたとおり行った。再度形質転換されたカルス、再生された第一の二回形質転換体および二回形質転換体のＦ１世代を分析し、その結果の幾つかを図６および表１に示す。ＧＵＳ酵素活性をnmol Mu（4-メチルウンベリフェロン）×ｍｇ^-1タンパク質× 分^-1で表し；Ｘ-Gluc（5-ブロモ−4-クロロ-3-インドールイル-β-Ｄ-グルクロン酸）をSigma、Munich、Germanyから入手した。二回トランスジェニック植物系統において、レポーター遺伝子ＧＵＳの発現が LacＩ由来の転写アクチベーターの存在下で効率よく転写活性化されることが見出された（図６および表１参照）。驚くべきことに、ＧＵＳ発現のレベルは非常に強力な構成的プロモーターとして公知の35Ｓプロモーターの発現レベル（陽性コントロール系統）と同じくらい高かった。トランスジェニックタバコ系統１６ /５６-Ｇ１３において、検出されたＧＵＳ活性はコントロール系統よりさらに高かった。アクチベーターおよびレポータープラスミドがタバコプロトプラストにおいて一過性発現している時に同様の結果が得られることは言及するに値する。従って本発明の転写活性化システムは、植物細胞において一過性発現が望まれるときに都合良く使用され得る。例４トランスジェニックレポーター系統とトランスジェニックアクチベーター系統との交配幾つかのアクチベーター植物（例２参照）を幾つかのレポーター系統（例１参照）と交配させた。この交配の種子を２０μｇ／ｍＬ植物培地のハイグロマイシン（Calbiochem、Frankfurt、Germany）および０．２μｇ／ｍＬ植物培地のメトトレキセート(Sigma、Munich、Germany)を含むＭＳ培地(Murashige and Skoog(1 973)Physiol.Plant 15，473-497)上で発芽させて、レポーター構築物およびアクチベーター構築物の両方にトランスジェニックであるＦ１子孫を選択した。 Jeffersonら（1987）同上のプロトコールに従って行われた、ハイグロマイシンおよびメトトレキセート耐性のＦ１世代のＸ-Gluc染色および定量的ＧＵＳアッセイにより、LacＩ由来の転写アクチベーターの存在下においてＧＵＳ活性が誘導されることが実証された。その結果が図５および表２に示されている。ＣａＭＶの35Ｓ-ＧＵＳ構築物（陽性コントロールの構築物）で形質転換された植物を、ＧＵＳアッセイのための陽性コントロールおよび誘導レベルの比較基準として使用した。例５植物におけるサプレッサーｔＲＮＡの転写活性化システムサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomy cescerevisae）からのｔＲＮＡ遺伝子（例えばｔＲＮＡ Leu、ｔＲＮＡ Serなど）を使用した。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae）のゲノムは完全に配列決定されており、ＤＮＡ配列は公共のデータベース（例えばＮＣＢＩ）から入手できる。例えば、前記ｔＲＮＡの遺伝子の配列は、以下の受託番号で得ることができる：Ｋ０１８６９は酵母のｔＲＮＡ-Leu-３遺伝子；Ｘ７４２６８は酵母のｔＲＮＡ-Ser遺伝子；およびＸ０６９９２は酵母のマイナーｔＲＮＡ-Ser（ＡＧＹ）遺伝子である。しかし、植物における発現に適した他の何れものｔＲＮＡ遺伝子を、本発明のこの転写活性化システムのために都合良く使用することができる。ｔＲＮＡ− アンバー遺伝子の単離およびクローニングは、Carneiroら（1993）Plant Mol.Bl ol.22，681-690にも記載されている。各々のｔＲＮＡ遺伝子を、アンバー、オーカーおよびオパールのストップコドンを各々認識する３つのアンチコドン配列（ＣＵＡ、ＵＵＡおよびＵＣＡ）の各々をコードするように部位特異的に突然変異させた。この遺伝子を普通のpBlues criptベクター（Stratagene、La Jolla、ＣＡ、ＵＳＡ）にサブクローニングした。公表された標準手法（例えばKunkelら（1985）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82，488-492；Kunkelら（1985）Meth．Enzymol．154，367-382）を用いて、位置指定突然変異誘発を行った。その遺伝子を植物形質転換ベクターｐＶＫ１８に導入した（プラスミド構築の上記の記載を参照）。このようにして得られたサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子（例えば、アンバーｔＲＮＡ^Leu遺伝子）が例えばnos- プロモーターの制御下にあるプラスミドは、図７に模式的に示されている。例えばPouteauら（1991）により公表されたＧＵＳレポーター遺伝子は、位置指定突然変異誘発（Kunkelら、同上）を介して、Leuコドン（例えばアミノ酸３２の位置）にストップコドンを導入することにより不活性化された（Carneiroら（1993）Plant Mol.Biol.22，681-690）。突然変異ＧＵＳ遺伝子を、植物形質転換ベクター（例えばｐＶＫ１８）にかなり強力なプロモーター（例えば35ＳＲＮＡプロモーター）の制御下に導入した。ＤＮＡクローニング、操作および分析は、全て標準手法（例えばSambrookら、同上）に従って行った。当然、サプレッサーｔＲＮＡをコードする構築物および少なくとも一つの未熟ストップコドン、好ましくはアンバーストップコドンを含む標的遺伝子をコードする構築物により植物を形質転換するためには、何れもの適切なバイナリーベクターを使用することができる。形質転換、選択および再生方法の間の便宜のため、この構築物は異なる選択マーカーを含むべきである。標的遺伝子を有するトランスジェニック植物（レポーター植物）およびサプレッサーｔＲＮＡを有する植物（アクチベーター植物）を、例３および４記載と同じ方法で処理した。即ち、レポーター植物およびアクチベーター（サプレッサーｔＲＮＡ）植物の交配に由来するＦ１世代をＧＵＳ酵素活性について分析した。図５および図６、並びに表１および表２に示されるのと同様の結果が、構築物の同時発現に基づいて得られた（が、ＧＵＳ遺伝子の構築物のみを含む植物においてＧＵＳ活性は検出されなかった）。寄託された微生物への言及（ＰＣＴ第１３規則の２）国際様式マックス−デルブリュック−ラボラトリウムインデアマックス−プランク−ゲゼルシャフトカール−フォン−リンネ−ベーク１０下記国際寄託当局により５０８２９ケルン規則７．１に従い交付された原寄託についての受託証 ¹ 規則６．４(ｄ)が適用される場合、当該日付は国際寄託当局としての地位を取得した日付である。国際様式マックス−デルブリュック−ラボラトリウムインデアマックス−プランク−ゲセルシャフトカール−フォン−リンネ−ベーク１０下記国際寄託当局により５０８２９ケルン規則１０．２に従い交付された生存に関する証明書 ¹ 原寄託の日付、または再寄託もしくは移送が行われた場合は最近の当該日付（再寄託の日付もしくは移送の日付）を示す。² 規則１０．２(ａ)(ii)および(iii)が適用される場合、最近の生存試験をいう。³ 該当する箇所に×印を付す。⁴ 当該情報を要請した場合および生存試験の結果が否定的であった場合に記載する。寄託された微生物への言及（ＰＣＴ第１３規則の２）国際様式マックス−デルブリュック−ラボラトリウムインデアマックス−プランク−ゲゼルシャフトカール−フォン−リンネ−ベーク１０下記国際寄託当局により５０８２９ケルン規則７．１に従い交付された原寄託についての受託証 ¹ 規則６．４(ｄ)が適用される場合、当該日付は国際寄託当局としての地位を取得した日付である。国際様式マックス−デルブリュック−ラボラトリウムインデアマックス−プランク−ゲゼルシャフトカール−フォン−リンネ−ベーク１０下記国際寄託当局により５０８２９ケルン規則１０．２に従い交付された生存に関する証明書 ¹ 原寄託の日付、または再寄託もしくは移送が行われた場合は最近の当該日付（再寄託の日付もしくは移送の日付）を示す。² 規則１０．２(ａ)(ii)および(iii)が適用される場合、最近の生存試験をいう。³ 該当する箇所に×印を付す。⁴ 当該情報を要請した場合および生存試験の結果が否定的であった場合に記載する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１０月１２日（１９９８．１０．１２）【補正内容】り不活性化したり変化させたりする調節システムに関する。テトラサイクリンで制御可能なトランスアクチベーター（ｔＴＡ）およびｔＴＡ-応答プロモーターに基づくこのシステムは、トランスジェニック動物における使用について説明がなされている。米国特許第４，８３３，０８０号は、転写を活性化または抑制できる原核生物のタンパク質またはペプチドにより、真核生物の遺伝子発現を制御することに関し、例えばＬｅｘＡ/ＧＡＬ４融合タンパク質により、酵母細胞においてレポーター遺伝子の発現を刺激することを開示している。植物において機能するトランス活性化システムについて、米国特許第５，３６２，８６４号は、植物の転写活性化因子、ＴＡＦ−１の単離および特性を開示している。さらに、ＴＡＦ−１を細胞培養システムまたはトランスジェニック植物に導入して、ＴＡＦ−１が結合することが公知であるシス作用性配列の一コピーまたは数コピーを含むプロモーター配列に融合した異種（heterologous）遺伝子の発現を増大させたり、変化させたりすることが示唆されている。さらに、ＥＰ-Ａ１-０６９３５５４は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thal iana）由来の植物の転写アクチベーター（ＡＦＴ１）、および別のタンパク質由来のＤＮＡ結合領域（例えばＧＡＬ４またはＬｅｘＡ）と組み合わせたＡＦＴ１の活性化領域を含むＡＦＴ１転写活性化キメラタンパク質に関する。特許出願ＷＯ９５/２０６６８は、改変された植物を生産するための方法を記載しており、該方法は、第一系統も第二系統もその交配植物の特性を示さないが、親植物の少なくとも片方がトランスジェニックであるような第一系統と第二系統とを交配させて、ある表現型特性を備えた植物を作り出すことを含む。特に、この方法は、雄性不稔の植物を作り出すため、および回復遺伝子の発現により雄性不稔を復活させるために使用される。従って、この出願は、ハイブリッド種子の生産に有効である植物生産方法を記載している。同様に、特許出願ＥＰ０５８９８４１は、雄性不稔の植物を作り出すための方法に関し、該方法は、トランスアクチベーターポリペプチドをコードする配列に機能的に連結した葯-特異的プロモーター領域と、花粉形成を混乱させ得るアンチセンスＲＮＡまたはポリフェノールをコードする配列に機能的に連結したトランスアクチベーターポリペプチドにより活性化され得る標的配列とに基づくものである。この発明は、また、雄性不稔の植物およびハイブリッド種子を作り出すための方法に関する。欧州特許出願０４９４７２４号は、植物において発現を制御するためのプラスミドを記載しており、該プラスミドは、異種産物および植物の時間的および位置的に制御された発現を可能にするＤＮＡ配列を含む。原則として、この制御システムは、各プロモーター領域内でそのオペレーター配列にテトラサイクリンを介して結合したＴｅｔリプレッサータンパク質を不活性化することにより、標的遺伝子の発現を誘導することに依る。ＤＮＡに結合すると同時に転写を活性化する転写アクチベーターの能力は、このよう請求の範囲１．(i)ＤＮＡ結合性タンパク質の機能的部位および(ii)転写アクチベータータンパク質の機能的部位を含む、植物において活性なトランスアクチベーターキメラタンパク質であって、前記ＤＮＡ結合性タンパク質が、細菌のlacＩタンパク質、好ましくは少なくとも一つのアミノ酸置換を有するlacＩタンパク質の突然変異体、より好ましくはlacＩタンパク質のＤＮＡ認識ヘリックスが位置１にアミノ酸置換を有するlacＩタンパク質の突然変異体、最も好ましくはＤＮＡ認識ヘリックスの位置１で野生型のアミノ酸チロシン(17)がヒスチジンに変換されたlacＩタンパク質の突然変異体であるトランスアクチベーターキメラタンパク質。２．前記転写アクチベーターが、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyce s cerevisiae）のＧＡＬ４または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＶＰ１６である請求項１記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質。３．請求項２記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質であって、前記ＧＡＬ４の一部であるアミノ酸768〜アミノ酸881を、lacＩのアミノ酸330に対応するコドンの周囲でlacＩまたはlacＩ突然変異体のコード領域に挿入するか、またはＶＰ１６の一部であるアミノ酸369〜アミノ酸488を、lacＩのアミノ酸348に対応するコドンの周囲でlacＩまたはlacＩ突然変異体のコード領域に挿入したトランスアクチベーターキメラタンパク質。４．プラスミドｐＶＫＩＧａｌ４（ＤＳＭ 11108）によりコードされるトランスアクチベーターキメラタンパク質。５．請求項１ないし３のいずれか１項記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質をコードする組み換え核酸分子。６．プラスミドｐＶＫＩＧａｌ４（ＤＳＭ 11108）。７．プラスミドｐＸ-９１０ＴＡＧ（ＤＳＭ 11107）。８．植物において未熟ストップコドンを含む標的遺伝子の発現を提供するサプレッサーｔＲＮＡをコードし、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ由来のサプレッサーｔＲＮＡをコードし、より好ましくはアンバーサプレッサーｔＲＮＡをコードする組み換え核酸分子。９．請求項１ないし３のいずれか１項記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質をコードする導入遺伝子を含んだトランスジェニック植物。１０．請求項５ないし８のいずれか１項記載の組み換え核酸分子を含んだトランスジェニック植物。１１．プラスミドｐＶＫＩＧａｌ４（ＤＳＭ 11108）および／またはプラスミドｐＸ-９１０ＴＡＧ（ＤＳＭ 11107）を含んだトランスジェニック植物。１２．プロトプラスト、植物細胞、カルス、種子、塊茎、挿し木などを含む請求項９ないし１１のいずれか１項記載の植物の一部および産物、並びに前記植物の子孫。１３．トランスジェニック植物において標的遺伝子の発現を制御する方法であって、植物において活性な請求項１ないし４のいずれか１項記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質を利用して、少なくとも一つのトランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列を含む標的遺伝子の発現を特異的に制御することを具備する方法。１４．植物細胞において標的遺伝子の発現を制御する方法であって、植物において活性な請求項１ないし４のいずれか１項記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質を利用して、少なくとも一つのトランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列を含む標的遺伝子の発現を特異的に制御することを具備し、前記トランスアクチベーターキメラタンパク質および標的遺伝子が一過性発現する方法。１５．請求項１３または１４記載の方法であって、前記トランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列が野生型のLacオペレーター配列ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ（lacオペレーター１）であるか、またはlacオペレーターのコンセンサス配列ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＳＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴ（ＳはＧまたはＣ）であり、好ましくは、前記トランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列が野生型Lacオペレーター配列またはlacオペレーターのコンセンサス配列と一塩基対または複数の塩基対で異なっており、および／または前記トランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列が野生型のLacオペレーター配列またはlacオペレーターのコンセンサス配列と比較して一塩基対または複数の塩基対を欠損しており、より好ましくは、前記トランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列が理想化されたLacオペレーター配列ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴであるか、または配列ＡＡＴＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＡＴＴを有する改変されたLacオペレーターである方法。１６．請求項１３または１４記載の方法であって、プラスミドｐＸ-９１０ＴＡＧ（ＤＳＭ 11107）およびプラスミドｐＶＫＩＧａｌ４（ＤＳＭ 11108）を植物に導入する方法。１７．トランスジェニック植物において標的遺伝子の発現を制御する方法であって、植物において活性なサプレッサーｔＲＮＡ、好ましくは酵母由来のサプレッサーｔＲＮＡ、より好ましくはアンバーサプレッサーｔＲＮＡを利用して、少なくとも一つの未熟ストップコドン、好ましくは未熟アンバーストップコドンを含む標的遺伝子の発現を特異的に制御することを具備する方法。１８．植物細胞において標的遺伝子の発現を制御する方法であって、植物において活性なサプレッサーｔＲＮＡ、好ましくは酵母由来のサプレッサーｔＲＮＡ、より好ましくはアンバーサプレッサーｔＲＮＡを利用して、少なくとも一つの未熟ストップコドン、好ましくば未熟アンバーストップコドンを含む標的遺伝子の発現を特異的に制御することを具備し、サプレッサーｔＲＮＡおよび標的遺伝子が一過性発現する方法。１９．所望の表現型特性を有する植物を生産する方法であって、 −請求項１ないし４のいずれか１項記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質をコードする組み換え核酸分子により第一の植物を形質転換すること、 −少なくとも一つのlacＩ（もしくはlacＩ突然変異体）/ＧＡＬ４-トランスアクチベーターまたはlacＩ（もしくはlacＩ突然変異体）/Ｖ１６-応答配列を含む標的遺伝子をコードする組み換え核酸分子により第二の植物を形質転換すること、 −前記第一のトランスジェニック植物と前記第二のトランスジェニック植物とを交配すること、および −前記標的遺伝子の発現のトランス活性化を生じさせることを具備する方法。２０．一方の植物はプラスミドｐＸ−９１０ＴＡＧ（ＤＳＭ 11107）により形質転換され、他方の植物はｐＶＫＩＧａｌ４（ＤＳＭ 11108）により形質転換される請求項１９記載の方法。２１．所望の表現型特性を有する植物を生産するための方法であって、 −サプレッサーｔＲＮＡ、好ましくは酵母のサプレッサーｔＲＮＡ、より好ましくはアンバーサプレッサーｔＲＮＡをコードする組み換え核酸分子により第一の植物を形質転換すること、 −未熟ストップコドン、好ましくは未熟アンバーストップコドンを運ぶ標的遺伝子をコードする組み換え核酸分子により第二の植物を形質転換すること、 −前記第一のトランスジェニック植物と前記第二のトランスジェニック植物とを交配すること、および −前記標的遺伝子の発現のトランス活性化を生じさせることを具備する方法。２２．前記標的遺伝子の産物が、前記植物細胞にとって有害である請求項１３ないし２１のいずれか１項記載の方法。２３．前記表現型特性が、前記植物細胞における細胞傷害性産物の生産である請求項１３ないし２２のいずれか１項記載の方法。２４．前記表現型特性が細胞死である請求項１３ないし２３のいずれか１項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (72)発明者グロスコプフ―クロイラー、デボラドイツ連邦共和国、50859 ケルン、ブラウガッセ 13 (72)発明者ムーア、イアンイギリス国、オーエックス４・３エヌエヌ、オクスフォード、コーンウォーリス・ロード 61 (72)発明者シェル、ヨーゼフドイツ連邦共和国、50829 ケルン、カール―ファウ―リンネ―ベーク 10

Claims

【特許請求の範囲】１．(i)ＤＮＡ結合性タンパク質の機能的部位および(ii)転写アクチベータータンパク質の機能的部位を含む、植物において活性なトランスアクチベーターキメラタンパク質。２．請求項１記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質であって、ＤＮＡ結合性タンバク質が、細菌のlacＩタンパク質、好ましくは少なくとも一つのアミノ酸置換を有するlacＩタンパク質の突然変異体、より好ましくはlacＩタンパク質のＤＮＡ認識ヘリックスが位置１にアミノ酸置換を有するlacＩタンパク質の突然変異体、最も好ましくはＤＮＡ認識ヘリックスの位置１で野生型のアミノ酸チロシン(17)がヒスチジンに変換されたlacＩタンパク質の突然変異体であるトランスアクチベーターキメラタンパク質。３．転写アクチベーターが、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces ce revisiae）のＧＡＬ４または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＶＰ１６である請求項１または２記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質。４．請求項１記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質であって、転写アクチベーターが、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＧＡＬ４または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のＶＰ１６であり、かつＤＮＡ結合性タンパク質が、少なくとも一つのアミノ酸置換を有するlacＩタンパク質の突然変異体、好ましくはlacＩタンパク質のＤＮＡ認識ヘリックスが位置１にアミノ酸置換を有するlacＩタンパク質の突然変異体、より好ましくはＤＮＡ認識ヘリックスの位置１で野生型のアミノ酸チロシン(17)がヒスチジンに変換されたlacＩタンパク質の突然変異体であるトランスアクチベーターキメラタンパク質。５．請求項４記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質であって、ＧＡＬ４の一部であるアミノ酸768〜アミノ酸881を、lacＩのアミノ酸330に対応するコドンの周囲でlacＩまたはlacＩ突然変異体のコード領域に挿入するか、またはＶＰ１６の一部であるアミノ酸369〜アミノ酸488を、lacＩのアミノ酸348に対応するコドンの周囲でlacＩまたはlacＩ突然変異体のコード領域に挿入したトランスアクチベーターキメラタンパク質。６．プラスミドｐＶＫＩＧａｌ４（ＤＳＭ 11108）によりコードされるトランスアクチベーターキメラタンパク質。７．請求項１ないし５のいずれか１項記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質をコードする組み換え核酸分子。８．プラスミドｐＶＫＩＧａｌ４（ＤＳＭ 11108）。９．プラスミドｐＸ−９１０ＴＡＧ（ＤＳＭ 11107）。１０．植物において未熟ストップコドンを含む標的遺伝子の発現を提供するサプレッサーｔＲＮＡをコードし、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ由来のサプレッサーｔＲＮＡをコードし、より好ましくはアンバーサプレッサーｔＲＮＡをコードする組み換え核酸分子。１１．請求項１ないし５のいずれか１項記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質をコードする導入遺伝子を含んだトランスジェニック植物。１２．請求項７ないし１０のいずれか１項記載の組み換え核酸分子を含んだトランスジェニック植物。１３．プラスミドｐＶＫＩＧａｌ４（ＤＳＭ 11108）および／またはプラスミドｐＸ-９１ＯＴＡＧ（ＤＳＭ 11107）を含んだトランスジェニック植物。１４．プロトブラスト、植物細胞、カルス、種子、塊茎、挿し木などを含む請求項１１ないし１３のいずれか１項記載の植物の一部および産物、並びに前記植物の子孫。１５．トランスジェニック植物において標的遺伝子の発現を制御する方法であって、植物において活性な請求項１ないし６のいずれか１項記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質を利用して、少なくとも一つのトランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列を含む標的遺伝子の発現を特異的に制御することを具備する方法。１６．植物細胞において標的遺伝子の発現を制御する方法であって、植物において活性な請求項１ないし６のいずれか１項記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質を利用して、少なくとも一つのトランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列を含む標的遺伝子の発現を特異的に制御することを具備し、トランスアクチベーターキメラタンパク質および標的遺伝子が一過性発現する方法。１７．請求項１５または１６記載の方法であって、トランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列が野生型のLacオペレーター配列ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ（lacオペレーター１）であるか、またはlacオペレーターのコンセンサス配列ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＳＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴ（ＳはＧまたはＣ）であり、好ましくはトランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列が野生型Lacオペレーター配列またはlacオペレーターのコンセンサス配列と一塩基対または複数の塩基対で異なっており、および／またはトランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列が野生型のLacオペレーター配列またはlacオペレーターのコンセンサス配列と比較して一塩基対または複数の塩基対を欠損しており、より好ましくはトランスアクチベーターキメラタンパク質応答配列が理想化されたLacオペレーター配列ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴであるか、または配列ＡＡＴＴＧＴＴＡＧＣＧＣＴＡＡＣＡＡＴＴを有する改変されたLacオペレーターである方法。１８．請求項１５または１６記載の方法であって、プラスミドｐＸ−９１０ＴＡＧ（ＤＳＭ 11107）およびブラスミドｐＶＫＩＧａｌ４（ＤＳＭ 11108）を植物に導入する方法。１９．トランスジェニック植物において標的遺伝子の発現を制御する方法であって、植物において活性なサプレッサーｔＲＮＡ、好ましくは酵母由来のサプレッサーｔＲＮＡ、より好ましくはアンバーサプレッサーｔＲＮＡを利用して、少なくとも一つの未熟ストップコドン、好ましくは未熟アンバーストップコドンを含む標的遺伝子の発現を特異的に制御することを具備する方法。２０．植物細胞において標的遺伝子の発現を制御する方法であって、植物において活性なサプレッサーｔＲＮＡ、好ましくは酵母由来のサプレッサーｔＲＮＡ、より好ましくはアンバーサプレッサーｔＲＮＡを利用して、少なくとも一つの未熟ストップコドン、好ましくは未熟アンバーストップコドンを含む標的遺伝子の発現を特異的に制御することを具備し、サプレッサーｔＲＮＡおよび標的遺伝子が一過性発現する方法。２１．所望の表現型特性を有する植物を生産する方法であって、 −請求項１ないし６のいずれか１項記載のトランスアクチベーターキメラタンパク質をコードする組み換え核酸分子により第一の植物を形質転換すること、 −少なくとも一つのlacＩ（もしくはlacＩ突然変異体）／ＧＡＬ４−トランスアクチベーターまたばlacＩ（もしくはlacＩ突然変異体）／Ｖ１６-応答配列を含む標的遺伝子をコードする組み換え核酸分子により第二の植物を形質転換すること、 −前記第一のトランスジェニック植物と前記第二のトランスジェニック植物とを交配すること、および −前記標的遺伝子の発現のトランス活性化を生じさせることを具備する方法。２２．一方の植物はプラスミドｐＸ−９１０ＴＡＧ（ＤＳＭ 11107）により形質転換され、他方の植物はｐＶＫＩＧａｌ４（ＤＳＭ 11108）により形質転換される請求項２１記載の方法。２３．所望の表現型特性を有する植物を生産するための方法であって、 −サプレッサーｔＲＮＡ、好ましくは酵母のサプレッサーｔＲＮＡ、より好ましくはアンバーサプレッサーｔＲＮＡをコードする組み換え核酸分子により第一の植物を形質転換すること、 −未熟ストップコドン、好ましくは未熟アンバーストップコドンを有する標的遺伝子をコードする組み換え核酸分子により第二の植物を形質転換すること、 −前記第一のトランスジェニック植物と前記第二のトランスジェニック植物とを交配すること、および −標的遺伝子の発現のトランス活性化を生じさせることを具備する方法。２４．前記標的遺伝子の産物が植物細胞にとって有害である請求項１５ないし２３のいずれか１項記載の方法。２５．前記表現型特性が植物細胞における細胞傷害性産物の生産である請求項１５ないし２４のいずれか１項記載の方法。２６．前記表現型特性が細胞死である請求項１５ないし２５のいずれか１項記載の方法。