JP2017156107A - 癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法 - Google Patents

癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法 Download PDF

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Abstract

【課題】特定の臓器における早期癌を発見するだけではなく、いずれの部位にある微小癌、臨床癌期の早期癌について、その高危険群を判定し、進行癌のステージを分類して癌の予防と治療に貢献する。【解決手段】緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、該支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液で発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、それぞれの移動度、染色体の形、濃淡等を判定して、発生する微小な癌の動静を発見し、腫瘍マーカーの解析結果と合わせてその腫瘍の危険度と癌の危険度を評価して癌の一生を分類し、タンパク分画像にあらわれる、アルブミン分画の低下と、α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画及びγ−グロブリン分画の増加という変化状態を判定することにより、腫瘍の危険度と癌の危険度評価を３〜４段階に分類する。【選択図】図２

Description

本発明は、癌の疑いが有る人の血液や尿を検査して生化学的に微小癌を検出し、かつ定量的に癌を早期に発見・評価する方法に係り、特に癌の一生における前臨床癌期の微小癌と臨床癌期のステージの何れも検出し、その危険度を的確に判定し、分類する癌の一生を分類する方法に関する。
癌は、早期に発見して診断することが、癌の治療にとって重要とされている。特に、早期に発見された微小な癌であれば自然治癒力で完治したという事例もある。そこで、胃癌、肺癌、大腸癌、肝臓癌、乳癌等の癌を早期に発見しようとする方法が数多く提案され、かつ実施されている。
また、癌化した細胞は分裂を繰り返してがん組織を作り、病気として現れてくる。癌の一生は図１に示すように、「前癌期（健常期）」、「前臨床癌期」、「臨床癌期」の３期に分類される。細胞の癌化は前癌期に起こるが、前臨床癌期までは癌細胞の集団は微小であるためこの時点で癌の存在を眼で確認することは困難である。通常肉眼で発見できるのは、臨床癌期にある直径１０ｍｍ以上の癌であり、約１０億個（１０9 個）以上の癌細胞から成る。一般的に病気として認識され、治療の対象となるのは、この臨床癌期の癌である。
癌細胞は、正常な細胞にはない特殊な成分をつくり出す場合が多い。また、正常人ではごく微量な成分が、癌患者では大量に作られる場合がある。このような癌細胞に特徴的な成分は、癌細胞の目印（マーカー）という意味で「腫瘍マーカー」と称されている。
このような腫瘍マーカーには、肝臓癌における「アルファ−フェトタンパク質、α-フェトプロテイン、ＡＦＰ」、胃癌や大腸癌における「癌胎児性抗原、Carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ」等の癌細胞や胎児にのみ作られるタンパク質、「糖鎖抗原１９−９、carbohydrate antigen 19-9、ＣＡ19-9」と反応する膵臓癌等の腫瘍特異的抗原、子宮の絨毛癌における「ゴナドトロビン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Human chorionic gonadotropin、ＨＣＧ」、副甲状腺癌における「カルチトニン又はカルシトニン、calcitonin」等のホルモン、骨癌や肝臓癌における癌性「アルカリフォスファターゼ（以下「ＡＬＰ」という）等の種々のものがある。
このＡＬＰは、条件を正せば重要な腫瘍マーカーであり、リン酸を切り離す働きを持つ酵素で、ヒトでは、上記の骨、肝臓以外に胎盤、小腸等の臓器ごとにそれぞれ分子量が異なる数種類のものがある。このＡＬＰのように、臓器ごとに同じ作用を持つ複数の種類の酵素がある場合、それらは互いにアイソザイムと称されている。例えば、骨癌や肝臓癌、多発性骨髄腫等の患者では、正常な人の酵素とは分子量が違うアイソザイムがつくられる。これらの癌細胞では、それぞれのアイソザイムを支配する遺伝子の働きが正常さを失ったため、アイソザイムが異なるパターン変化したものである。そこで、このようなアイソザイムのパターンを検査及び的確に評価すれば、骨、肝臓、大腸や肺等に発生した微小癌を発見することができる。
そこで、従来よりＡＬＰアイソザイムは、電気泳動法により検査する方法が提案されている。この検査方法は、電気泳動によって血清タンパクを分離したのち、ナフトール系リン酸化合物と反応させ、遊離するナフトール系物質をジアゾニウム塩によりジアゾ化して発色させ、アイソザイムを検出する方法である。
このＡＬＰアイソザイムの検査方法は、例えば次のような手段で実施している。
（１）試料の塗布
先ず、１時間以上泳動用緩衝液に浸しておいたセルロゲルを２．５×６ｃｍに半切し、その陰極側から１ｃｍの位置に、癌の評価対象となるヒトの血液から分離した血清８〜１０μlを塗布する。高活性の場合は塗布量を加減する。
（２）電気泳動
１００Ｖでアルブミンが、陽極端より１ｃｍに移動するまで泳動させる。このとき冷却することが望ましい。
（３）染色泳動終了後
染色泳動終了後、セルロゲルを更に半切し、一片でタンパク染色を、他の片でＡＬＰ染色を行う。ＡＬＰ染色は染色液を染み込ませたろ紙上に泳動した膜を、間に空気の入らないようにして重ね、遮光して３７℃、約１時間加温する。染色後に１％酢酸に入れ固定する。
（４）評価方法
タンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、染色体の形、濃淡などを観察する。電気泳動で血清中にI 〜ＶI までのバンドが検出されるが、抗原性の点から区別すると由来臓器の異なる肝性ＡＬＰ、胎盤性ＡＬＰ、小腸性ＡＬＰ、全身性ＡＬＰ、骨性ＡＬＰの５種類に属し、これら５種類のアイソザイムの修飾型、糖鎖の違いによると考えられていた。
正常人の血清ＡＬＰは肝性（α２位）が主で、α２＞α２βのことが多い。血液型Ｏ及びＢの分泌型では高頻度に小腸性が検出される。小児期では骨性（幅広い活性帯として染色される）が、妊娠後期には耐熱性の胎盤性ＡＬＰが出現する。肝、胆道疾患で上昇するＡＬＰは、主にα２位の肝由来のものであるが、肝内、肝外胆汁うっ滞、転移性肝癌、薬物性障害等では高分子性のα１位のアイソザイムが出現する。慢性肝炎、肝硬変では小腸性ＡＬＰの出現頻度が高い。骨性ＡＬＰは、クル病、ページェット病、副甲状腺機能こう進症、甲状腺機能こう進症、骨折、癌の骨転移、骨肉腫等で増加し、人工透析患者では、骨性、小腸性等のＡＬＰがみられることがある。電気泳動で検出されるＡＬＰの異常には腫瘍産生によるものと、免疫グロブリンとの結合、シアル酸、ニューラミニターゼによる修飾等がある。
（５）腫瘍産生によるＡＬＰアイソザイムは、上述した評価方法によって検出された腫瘍産生によるＡＬＰとしては、胎盤型のＲｅｇａｎ ＡＬＰとＮａｇａｏ ＡＬＰ、また小腸型のＫａｓａｈａｒａＡＬＰとがある。胎盤型のＡＬＰがシャープなバンドとして検出される。胎盤型のＡＬＰは、卵巣癌や子宮癌で検出頻度が高く、癌患者では１０〜１５％の頻度で検出される。小腸型のＫａｓａｈａｒａＡＬＰは、セルロースアセテート膜電気泳動でＡＬＰ１の位置に泳動されるが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理によりＡＬＰ１の易動度を陰極側に変化させることで評価でき、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動では最も陽極側に泳動されることから確認できる。また、Ｌ−フェニルアラニンで阻害される特徴がある。ＫａｓａｈａｒａＡＬＰは癌患者の約１５％に検出される。
正常及び各種の疾患にヒトの血清中には、表４に示すように、肝性、骨性、胎盤性、小腸性等の数種類のＡＬＰアイソザイムが出現し、これらの間に電気泳動移動度、耐熱性、各種アミノ酸による阻害度、免疫交叉反応性などにかなりの相違がみられ、相互の分別に利用されている。
ＡＬＰは分子量１２〜１６万の２量体で、各組織細胞の細胞膜と結合した複合体として存在しているが、組織障害時には細胞膜の細片となった巨大（高い）分子性のＡＬＰが血中に遊出することがある。低分子性の肝性、骨性、胎盤性、小腸性由来のＡＬＰは一般の電気泳動でα１ 〜βの間に移動するが、高分子性ＡＬＰは支持体の種類（特に分子篩効果の有無）によって移動度が異なり、セルロースアセテート膜、寒天ではα１位（肝由来）と原点にとどまる成分に分かれるが（後者は染色時に剥がれて検出されない）、ポリアクリルアミドゲル、デンプンゲルでは分子篩効果によって移動度が小さくなり、原点位とそれからわずかに移動する２分画に分かれる。
後述する肝癌性ＡＬＰはポリアクリルアミドゲルでは肝性より移動度の大きい成分として検出されるが、セルロースアセテート膜、寒天では肝性と重なり検出されない。また、免疫グロブリン結合性のＡＬＰもポリアクリルアミドゲルのほうが小腸性とよく分離する。従って、血清ＡＬＰアイソザイムの電気泳動による分析には、セルロースアセテート膜又は寒天とポリアクリルアミドゲルを併用する。
癌検診の結果に基づいて変化する癌発症リスクを、特定の条件の下に予測するシステムに関する技術が種々提案されている。例えば特許文献１の特開２００６−３０２２２２号公報「癌発症リスク予測システム及び方法、並びに癌デリバティブ方法」のように、少なくとも演算手段と記憶手段とを備え、特定の条件の下に、臨床癌発症リスクを予測する予測システムであって、前記記憶手段には、前臨床癌の検出が可能な特定の高精度癌検診における過去の検診結果を、癌の存在可能性を示す特定の数値を元に、健常状態と、該癌の存在可能性を否定できない見かけ上の健常状態と、臨床癌状態と、に分類し、前記各分類毎にデータの参照を可能に記録した、高精度癌検診クラスタリングデータベースと、前記高精度癌検診クラスタリングデータベースにおいて、前記各分類毎に特定の期間後に受けた前記高精度癌検診の再診結果を前記各分類毎にデータの参照を可能に記録した、高精度癌検診再診結果データベースと、を備え、前記高精度癌検診クラスタリングデータ及び前記高精度癌検診再診結果データの相関を演算して、前記高精度癌検診の結果又は前記特定の期間を変数とした臨床癌状態分布を算出する臨床癌状態分布算出手段と、前記高精度癌検診を受診した特定の受診者が、その受診結果によって計算される、特定期間後に臨床癌に罹患する可能性の予測を生成するシミュレーション手段と、を備える予測システムが提案されている。
特開２００６−３０２２２２号公報
しかし、上述したＡＬＰアイソザイムの検査方法では、その癌がある程度の大きさに成長しないと検出しづらいものであった。従って、従来におけるアイソザイムによる癌の発見・評価方法では、有病正診率（sensitivity）及び無病正診率（specificity）がそれぞれ低いものであった。この有病正診率とは癌患者を癌であると正しく評価した割合をいい、無病正診率とは健常人を癌でないと正しく評価した人の割合をいう。従って、従来のアイソザイムによる癌の発見方法は、主として癌を診断していく上での一種の補助的な検査、或いは癌を治療していく上での経過観察の検査として行われるものであった。
本発明の発明者は、微小癌の存在の指標としてＡＬＰアイソザイムとΔＣＥＡ（癌胎児性抗原、Carcinoembryonic antigen）やΔフェリチンの一定時間あたりのパターン変化を用いて、生化学的に微小癌を検出（腫瘍マーカーの誘発を含む）する方法に着目した。脱分化あるいは異分化現象として見なされている癌化の過程においてＡＬＰは重要な役割を果たしている。血清中のＡＬＰ総活性が正常値の範囲内で、癌細胞の増殖とＡＬＰ Ｉ〜ＡＬＰ ＩＶのアイソザイムパターンとの間に密接な関係がある。そこで、一定時間における腫瘍マーカー値の変化（Δ）とアイソザイムの解析により、細胞数１０4 〜１０9 個（重さにして、10μg 〜1g）の微小癌の推定が可能である。即ち、ＡＬＰアイソザイムのパターン変化を解析することによる新しい早期癌の評価方法を発明した。
このような腫瘍マーカーには、肝臓癌における「アルファ−フェトタンパク質、α-フェトプロテイン、ＡＦＰ」、胃癌や大腸癌における「癌胎児性抗原、Carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ」等の癌細胞で作られるタンパク質、「糖鎖抗原１９−９、carbohydrate antigen 19-9、ＣＡ19-9」と反応する膵臓癌等の腫瘍特異的抗原、子宮の絨毛癌における「ゴナドトロピン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Human chorionic gonadotropin,ＨＣＧ」、副甲状腺癌における「カルチトニン又はカルシトニン、calcitonin」等のホルモン、骨癌や肝臓癌における癌性「アルカリフォスファターゼ（以下「ＡＬＰ」という）等の種々のものがある。
図１６は早期大腸癌、大腸良性疾患及び健常人における各腫瘍マーカーの陽性率を示すグラフである。図１７は早期大腸癌、大腸良性疾患及び健常人における各腫瘍マーカーの陽性率を示すグラフである。
単独の腫瘍マーカーを用いて、骨、肝臓、腸や肺等に発生した微小癌を発見することができる。しかし、従来より多くの癌学者が指摘するように、有病正診率（sensitivity）の感度を向上させようとすると、特異度、即ち無病正診率（specificity）が下がるので、正診度（accuracy）の向上は望めなかった。そこで、本発明の発明者は、表５に示すように、比較的、特異性の低い腫瘍マーカーを複数扱い、有効な複合マーカーを見つけだした。例えば、ＣＥＡ×ＴＰＡ,ＦＴ／Ｆｅ，更にそれらを組み合わせることに着目した。この表は初期大腸癌と肺癌に対して調査したものである。ＣＥＡやＴＰＡの単独腫瘍マーカーでは、sensitivityとspecificityを両方上げることは不可能であるが、複合マーカ―の組み合わせを増やせば、感度と正診度の精度を向上させることができることに着目した。
図１７に示すように、早期大腸癌、大腸良性疾患と健常人とにおける早期癌と良性腫瘍（良性疾患）の区別は可能である。なぜならば、本発明の発明者は、図１６の各腫瘍マーカーの陽性率を示すグラフにあるように、良性腫瘍（良性疾患）と健常人（正常）の区別をする複合マーカーを見つけたからである。そこで、第１段階で、健常人（正常）と癌の区別をつけて、第２段階で、癌と良性腫瘍（良性疾患）の区別をする複合マーカー（Ｆｅ／ＳＡ）を用いれば分類が可能になる。この炎症性疾患による原因関与を回避するために、α１−グロブリン分画の評価の際に、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定し、炎症の寄与部分を差し引くことで区別できることに着目した。
更に、本発明の発明者は、細胞数１０9個以上の癌については、血清蛋白分画による解析を癌のスクリーニング（鑑別診断）を用いることに着目した。この血清蛋白分画による癌のスクリーニングの診断法は安価かつ簡便であり臨床医にとっても活用しやすいものである。「前臨床癌期」の癌は腫瘍マーカーの組み合わせにより、「臨床癌期」の癌は血清蛋白分画解析を加えて、両者を併用することで癌の一生を分類できると考えた。
本発明は、かかる問題点を解決するために創案されたものである。すなわち、本発明の目的は、身体のどこかに微小癌があるか否かを検査すると共に、ＡＬＰアイソザイムパターンの解析と腫瘍マーカーの解析、又は血清蛋白分画の解析を行い、総合的に評価することで、特定の臓器における早期癌を発見するだけではなく、いずれの部位にもある微小癌、臨床癌期の早期癌の高危険群を同定し、進行癌のステージを分類して癌の予防と治療に貢献し、癌患者に関しては治療経過を正しく評価して科学的な対処を提案することができる癌の一生を分類する方法を提供することにある。
換言すると、第１段階で正常と癌の区別を判断し、第２段階で癌と良性腫瘍の区別を判断することにより、癌の一生における前臨床癌期の微小癌と臨床癌期のステージの何れも検出し、その危険度を的確に判定し、分類することができる癌の一生を分類する方法を提供することにある。
本発明の前臨床癌期の分類方法は、緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、該支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液で発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、染色体の形、濃淡等を判定して、発生する微小な癌の動静を発見し、かつその腫瘍の危険度と癌の危険度を評価して癌の一生を分類する方法であって、
前記ＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ IからＡＬＰ ＩＶ のパターンにおける、ＡＬＰ Ｉの出現とその割合、ＡＬＰ ＩＩ とＡＬＰ ＩＩＩの活性値の比の検討、及びＡＬＰ ＩＩ とＡＬＰ ＩＩＩの急峻さを示すＡＬＰアイソザイム角度から割り出すＡＰＡ値から癌細胞の増殖活動を総合的に解析し、
更に、炎症性疾患による原因を回避するために、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定し、当該部分を差し引いて判断することにより、発生する微小癌の存在とその増殖状況を評価する、ことを特徴とする。
前記ＡＬＰアイソザイムから得られるＡＰＡは、
前記ＡＬＰ ＩＩの陽極側の接線とＡＬＰ ＩＩ 及びＡＬＰ ＩＩＩのピークを結んだ線の角度をθ1 °とし、
この二接線の交点から、ＡＬＰ ＩＩＩのピークまでの距離をω１ｃｍとして、ＡＰＡ＝ω１／θ1 で示し、ＡＬＰ ＩＶが出現しているときに、ＡＬＰ ＩＩの接線との交点とＡＬＰ ＩＩＩ〜ＩＶのピークまでの長さをω２ｃｍとして、ＡＰＡ＝ω２／θ2 であらわすものである。
前記血清を５６°Ｃで１０分間熱処理して、ＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶの各ＡＬＰアイソザイムパターンの再構成パターンの解析を行い、ＡＬＰ ＩＩ 、ＡＬＰ ＩＩＩ及びＡＬＰＩＶを正確に同定することができる。
また、本発明の前臨床癌期の分類方法は、前記ＡＬＰアイソザイムの各パターンの変化から癌細胞の増殖活動を解析すると共に、
腫瘍マーカーによる腫瘍の成長レベルを、微小癌もない理想的な状態をステージＩ、ミクログラムレベルの前癌状態をステージＩＩ、ミリグラムレベルの前癌状態をステージＩＩＩ、前臨床癌状態をステージＩＶ、及び１ｇ以上の癌が存在すると推定される状態をステージＶとする５段階の腫瘍成長度ステージに分類し、
この腫瘍マーカーの経時的変化の解析を併用することにより、微小癌の存在とその増殖状況の判定をすることが可能である。
本発明の臨床癌期の分類方法は、緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、該支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液で発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、その内容、濃淡等を判定して、発生する微小な癌の動静を発見し、かつその腫瘍の危険度と癌の危険度を評価して癌の一生を分類する方法であって、
前記タンパク分画像にあらわれる、アルブミン分画の低下と、
α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画及びγ−グロブリン分画の増加という変化状態を判定し、
更に、炎症性疾患による原因を回避するために、前記タンパク分画像の評価の際に、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定し、当該部分を差し引いて判断することにより、腫瘍の危険度と癌の危険度評価を数段階に分類する、ことを特徴とする。
また、本発明の臨床癌期の分類方法は、緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、該支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液で発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、その内容、濃淡等を判定して、発生する微小な癌の動静を発見し、かつその腫瘍の危険度と癌の危険度を評価して癌の一生を分類する方法であって、
臨床癌期における１グラム以上になった癌について、
第１期は、アルブミン分画が６５％以上、α1−グロブリン分画が２．５％未満、γ−グロブリン分画が１６％未満のとき、
第２期は、アルブミン分画が６０％〜６５％未満、α1−グロブリン分画が２．５％〜３．０％未満、γ−グロブリン分画が１６％〜２０％未満のとき、
第３期は、アルブミン分画が５５％〜６０％未満、α1−グロブリン分画が３．０％〜４．０％未満、γ−グロブリン分画が２０％〜２３％未満のとき、
第４期は、アルブミン分画が５５％未満、α1−グロブリン分画が４．０％以上、γ一グロブリン分画が２３％以上のときに、癌の危険度を４段階に分類すると共に、
炎症性疾患による原因を回避するために、前記タンパク分画像の評価の際に、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定し、当該部分を差し引いて判断することにより、腫瘍の危険度と癌の危険度評価をする、ことを特徴とする。
前記Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）の測定値の高さに応じて、その関与部分をα1−グロブリン分画から差し引いて判定し、
前記シアル酸値の測定値の高い測定値に応じてα１−グロブリン分画から差し引いて判定することにより、評価に際して炎症性疾患が原因ではなく癌であると判断する。
本発明の前臨床癌期の分類方法では、癌細胞の増殖とＡＰＡの間に密接な関係があるため、これらのＡＬＰアイソザイムパターンを解析することにより、細胞数104 〜109 個の微小癌を検出することができる。このＡＬＰ Ｉがしばしば出現し、癌の進行に伴って、ＡＬＰ Ｉが増加することを見出すことができる。ＡＬＰ ＩＩは、全身性ＡＬＰと称され全ての臓器のＡＬＰで関与も認められるものである。ＡＬＰ ＩＩＩはＡＬＰ総活性が上昇している場合には、造骨新生とか肝硬変ならびに慢性腎不全などで、増加することが知られている。ＡＬＰが正常値の範囲内の場合には、ＡＬＰ ＩＩＩは細胞新生のある時、例えば、微小癌の増殖とか、肝臓の再生時、ならびに進行の遅い臨床癌などの場合に増加するものである。
更に、本発明の前臨床癌期の分類方法では、臨床癌で癌の進行が早くなると血中のノイラミニダーゼにより、ＡＬＰ ＩＩＩがＡＬＰ ＩＩに移動し、ＡＬＰ ＩＩＩは減少してくる。このＡＬＰ ＩＩＩは新生細胞の増殖に関連した脱燐酸化作用をもつ修飾酵素である可能性が強い。
本発明の前臨床癌期の分類方法では、ＡＬＰ各アイソザイムの再構成パターンの解析より、ＡＬＰ ＩＩ（ＡＬＰ２）、ＡＬＰ ＩＩＩ（ＡＬＰ３）、ＡＬＰ ＩＶ（ＡＬＰ４）を正確かつ高率に同定することができる。特に、ＡＬＰ ＩＶは、癌組織には高率に検出されるにもかかわらず、癌患者の血中ＡＬＰ ＩＶの出現頻度は１〜３０％といわれ、その活性が低くて、見過ごされたり、ＡＬＰ ＩＩＩと誤認されていた。本発明の再構成パターンの解析によりこのＡＬＰ ＩＶを高率に検出できる。
本発明の前臨床癌期の分類方法では、ＡＬＰアイソザイムパターンの同定が明確でないときに、癌の発生段階を腫瘍マーカーに基づいて腫瘍ステージを分類し、これらのステージ分類モデルを導入したことによって、微小癌から臨床癌に至るまでを正確に評価することができる。
上述したように、ＡＬＰアイソザイムＩが原発性肝癌、肝浸潤、うっ血肝、脂肪肝など総活性が上昇している時に出現し、ＡＬＰ ＩＩが肝性ＡＬＰと称され癌性心のう水の中にも認められ、ＡＬＰ ＩＩＩはＡＬＰ総活性が上昇している場合には、造骨新生や肝硬変ならびに慢性腎不全などで増加するものであり、癌細胞の増殖とＡＬＰ Ｉ〜ＡＬＰ ＩＶのＡＬＰアイソザイムパターンとの間に密接な関係があるため、これらのＡＬＰアイソザイムパターンを解析することにより、細胞数１０4 〜１０9 個の微小癌を検出し、かつその微小癌の危険度を評価することができる。
また、ＡＬＰアイソザイムパターンの同定が明確でないときに、癌の発生段階を腫瘍マーカーに基づいて腫瘍ステージを分類し、これらのステージ分類モデルを導入したことによって、微小癌から臨床癌に至るまでを正確に評価することができる、等の優れた効果がある。
本発明の臨床癌期の分類方法では、蛋白分画に生化学的生検を加えることにより、癌が臨床癌の１グラム以上になってからの危険度を正確に分類できる。本発明の方法に従って危険度分類をすれば、癌の予防、再発予防、制癌剤の治療効果、癌の進行具合について、ほぼ正確に数字的に解析できる。
健康食品がその人に効いているかどうか、食生活が合っているかどうか、癌の治療が適切かどうかを明確に判定できる。癌の手術前後に、ＴＭＣＡ検診をすれば、開腹手術をしなくても、初期癌か、進行癌かについて明確に判定できる。当然、手術をして、その前後でＴＭＣＡ検診の検査結果比較をすれば、癌の切り残しがあったのか、手術が成功したのかについて簡単に判定できる。
本発明の癌の一生の分類方法は、健康のバロメーターに相当し、併せて、画像診断などで判定していた多くの誤診が確実に防げる。ここでＴＭＣＡ検診とは、後述するように腫瘍マーカー総合診断法をいう。生体内部環境の毒素の総合判定、即ち内部環境汚染の度合いを判定することができる。これは癌が出す毒素と、いわゆる「腫瘍マーカー」の判定によって総合的に危険度を分類する方法である。
なお、タンパク分画像の変化は、慢性炎症性疾患においても生じる現象である。その炎症性疾患による関与割合を回避する必要がある。そこで、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定することが必要である。この測定をすることで、より正確な癌の分類が可能になる。
本発明の臨床癌期の分類方法は、通常の癌の分類に実施できる。肉腫などでは少し基準が異なるが、本発明の臨床癌期の分類方法を適用することが可能である。
「前癌期」、「前臨床癌期」、「臨床癌期」の３期に分類される癌の一生を示し、癌細胞の大きさとの相関関係を示す説明図である。 本発明の癌の一生を分類する方法により「前臨床癌期」と「臨床癌期」における判断方法を示すフロー図である。 実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフである。 実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフと表であり、（ａ）は６０才男性の直腸癌の術前、術後のＡＬＰアイソザイムパターンを示し、（ｂ）は食道癌患者のＡＬＰアイソザイムを示すものである。 実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフと表であり、（ａ）は３３才女性の乳癌（約１ｇ）の単純乳房切除術術前後のマーカーとアイソザイムの変動を示し、（ｂ）は同一患者の再手術前後のＡＬＰアイソザイムを示すものである。 実施例１の前臨床癌期の分類方法における各アイソザイムの熱処理と再構成実験におけるＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフである。 実施例１の前臨床癌期の分類方法における第ＩＶ期の胆のう癌患者（５０才、女）の血清中の腫瘍マーカーの経時的変化（ａ）と、Δフェリチン値の時間経過を上昇型と不変型と下降型の三型に分類した例（ｂ）を示すものである。 実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるΔフェリチンの上昇型（ａ）と下降型（ｂ）を示すものである。 癌の成長過程とＡＬＰアイソザイムによる５段階評価方法を示す説明図である。 実施例２の臨床癌期の分類方法により、分類した蛋白分画名と、その結果、単位、基準値を示すグラフ図である。 実施例２の臨床癌期の分類方法により、分類した蛋白分画解析図である。 実施例２の臨床癌期の分類方法により、分類したときの早期大腸癌における血清α１−グロブリン×α２−グロブリンの積値の分布状態を示す分布図であり、上段が初期の大腸癌（４０例）、中段が良性腫瘍（３０例）、下段が健常者（５０例）を示す。 実施例２の臨床癌期の分類方法により、分類したときの早期大腸癌における血清ＴＰＡ×α１−グロブリンの積値の分布状態を示す分布図であり、上段が初期の大腸癌（４０例）、中段が良性腫瘍（３０例）、下段が健常者（５０例）を示す。 各種癌症例におけるα１−グロブリン×α２−グロブリンの積値について調べた分布図である。 各種癌症例におけるＴＰＡ×α１−グロブリンの積値について調べた分布図である。 早期大腸癌、大腸良性疾患及び健常人における各腫瘍マーカーの陽性率を示すグラフである。 早期大腸癌、大腸良性疾患及び健常人における各腫瘍マーカーの陽性率を示すグラフである。
本発明の癌の一生を分類する方法は、臨床癌期の癌を分類するに際して、タンパク分画像にあらわれる、アルブミン分画の低下と、α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画及びγ−グロブリン分画の増加という変化状態を同定することにより、腫瘍の危険度と癌の危険度評価を１〜４段階に分類する方法である。
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
＜癌の一生のうち「前臨床癌期の微小癌」を分類する方法＞
以下、本発明の癌の一生を分類する方法の好ましい実施の形態について図面を参照して説明する。
図１は「前癌期」、「前臨床癌期」、「臨床癌期」の３期に分類される癌の一生を示し、癌細胞の大きさとの相関関係を示す説明図である。図２は本発明の癌の一生を分類する方法により「前臨床癌期」と「臨床癌期」における判断方法を示すフロー図である。図３から図８は実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すものである。
本発明の実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるＡＬＰアイソザイムによる癌の分類方法は、微小癌の存在に係る分化の指標として重要なアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）アイソザイムとΔＣＥＡやΔフェリチン（一定時間あたりの変化）を用いて、生化学的に微小癌の検出（腫瘍マーカーの誘発を含む）し、その分類をする方法である。ＡＬＰは、生体内に広く分布し、エネルギー代謝及び白血球や乳腺の分化と化骨形成及び、再生しつつある結合織にもＡＬＰ活性が高くなるものである。そこで、脱分化あるいは異分化現象として見なされている癌化の過程においてＡＬＰは重要な役割を果たしていると考えられている。即ち、血清中のＡＬＰ総活性が正常値の範囲内で、癌細胞の増殖とＡＬＰ Ｉ〜ＡＬＰ ＩＶのアイソザイムパターンとの間に密接な関係があり、例えば、病理学的見地から細胞数１０6 個が生物学的限界（可逆的段階）ではないかと推定している。実施例１の前臨床癌期の分類方法は、一定時間における腫瘍マーカー値の変化（Δ）とアイソザイムの解析により、細胞数１０4 〜１０9 個（重さにして、１０μｇ〜1ｇ） の微小癌を検出するものである。微小癌は可逆的段階であり、１ｇ以上の臨床癌は不可逆的段階と考えられる。
検出可能な微小癌は細胞数１０4〜１０6個のμｇレベルのミクロガンと細胞数１０6〜１０9個のｍｇレベルのミリガンとに便宜上分類した。本発明のＡＬＰアイソザイムによる癌の評価方法は、緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、該支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液にて発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、染色体の形、濃淡等を判定して、発生する微小な癌の動静を発見し、かつその癌の危険度を分類する方法である。
実施例１の前臨床癌期の分類方法にけるＡＬＰアイソザイムによる癌の分類方法は、ＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンにおける、ＡＬＰ Ｉの出現とその割合、ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの活性値の比の検討、及びＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの急峻さを示すＡＬＰアイソザイム角度から割り出すＡＰＡから癌細胞の増殖活動を総合的に解析することにより、発生する微小癌の存在とその増殖状況を評価するようになっている。
＜分類方法＞
身体のどこかに微小癌があるか否かをチェックするため、ΔＣＥＡとΔフェリチンとＡＬＰアイソザイムパターンの解析を行い、総合的に判断する。
（１）ΔＣＥＡの定量には微量定量出来る酵素免疫測定法（Ａｂｏｔｔ）を用いた。ＣＥＡは個体差が著明であるが、個人では長時間１．０ｎｇ／ｍｌ以内の変動しかないことはよく知られている。ここで、ＣＥＡ値α1 と一定時間後のＣＥＡ値α2の変化量をΔＣＥＡ＝α2−α1とする。ΔＣＥＡが、０．４±０．１ｎｇ／ｍｌ以上ならば、有意の変動幅とみなすことができる。
（２）Δフェリチンとしては、本発明の実施の形態では、肝由来のものを用いた。例えばフェリチン値β1と一定時間後のフェリチンβ2の変化量をΔフェリチン＝β2−β1とする。４±１ｎｇ／ｍｌ以上ならば、微小癌存在の可能性を推定する。但し、肝実質障害や、膵実質障害あるいは、ヘモクロマトージス等のある場合、フェリチン値が上昇する。一方、鉄欠乏性貧血のある場合、下降するので別途検討が必要である。
図３は実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶ のパターンを示すグラフである。
（３）ＡＬＰアイソザイムの総合判定法ＡＬＰアイソザイムパターンは次の三点から総合的に判定する。
１）ＡＬＰ Ｉの出現とその割合。
２）ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの活性値の比を見る。
３）ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの急峻さを示すＡＬＰアイソザイム角度（ＡＰ−Ａ）。ＡＰ−Ａは次のように測定する（図３参照）。ＡＬＰ ＩＩの陽極側の接線とＡＬＰ ＩＩ及びＡＬＰ ＩＩＩのピークを結んだ線の角度をθ°1とする。この二接線の交点から、ＡＬＰ ＩＩＩのピークまでの距離をω１ｃｍとすればＡＰ−Ａはω１／θ1で示す。ＡＬＰＩＶが出現していると考えられる場合には、ＡＬＰ ＩＩＩの接線との交点とＡＬＰ ＩＩＩ〜ＩＶのピークまでの長さをω２ｃｍとすれば、ＡＰ−Ａはω２／θ2で算定する。
なお、実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるＡＬＰアイソザイムによる癌の分類方法では、炎症性疾患においても生じる現象であるため、その炎症性疾患による関与部分を差し引いて判定する必要がある。そこで、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定することで、より正確な癌の分類が可能になる。
例えば、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）の測定値の高さに応じて、その関与部分をα1−グロブリン分画から差し引いて判定する。シアル酸値の測定値の数値による程度（関与程度）を差し引いて判定する。
次に、本発明の本発明の癌の一生を分類する方法の実施例について説明する。
図４は実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフと表であり、（ａ）は６０才男性の直腸癌の術前、術後のＡＬＰアイソザイムパターンを示し、（ｂ）は食道癌患者のＡＬＰサイモグラムを示すものである。
症例（１）
６０才男性の直腸癌（第Ｉ期ｐｍＮ0 Ｐ0 Ｈ 0）をＭｉｌｅｓの方法で手術した。手術日をゼロ日として、術前、術後のＡＬＰアイソザイムパターンを総合判定法に従って解析した（図４−（ａ））。ＡＬＰ Ｉは術後４８日目に１％残存しているが、９９日目には消失している。ＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩの比は、手術前ではＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの逆転パターンを示し、１．０以下となっている。一方、手術後、ＡＬＰ ＩＩＩが少なくなり、４８日、９９日には、１．８、１．３と正常値（１．６±０．４）の範囲内に納まってきている。またＡＰ−Ａも術前、段々悪化しているが、一方、手術後４８日目以後、正常値（０．１±０．０１以下）の範囲内に納まっている。手術後、ＡＰ−Ａが正常値に回復するのにかなりの日数が経っているが、これは、切除した直腸癌の周辺に微小癌が残っていて、それが徐々に縮小してゆくのに時間がかかったものと考えられる。
症例（２）
食道癌患者（肝転移をともなう）のＡＬＰサイモグラムを図４（ｂ）に示す。ＡＬＰ総活性は検査期間中、正常範囲内であった。月数が経つに従い、癌は進行し、ＣＥＡ値の増加がみられる（図４−（ｂ））。また、ＡＬＰ Ｉ、ＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩおよびＡＰ−Ａの漸増も認められた。
図５は実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフと表であり、（ａ）は３３才女性の乳癌（約１ｇ）の単純乳房切除術術前後のマーカーとアイソザイムの変動を示し、（ｂ）は同一患者の再手術前後のＡＬＰアイソザイムを示すものである。
症例（３）
３３才女性の乳癌（約１ｇ）の単純乳房切除手術前後のマーカーとＡＬＰアイソザイムの変動を検討した（図５−（ａ））。表の中のΔ値は、α−ＦＰ、ＣＥＡをそれぞれ２ｎｇ／ｍｌ、１．１ｎｇ／ｍｌ（期間中の最小値）を差し引いた値である。外科的切除後、２回だけＩＴＣ療法を行った。図４−（ａ）は、その後、手術部位周辺に散在していた微小癌の１つが徐々に大きくなってゆく経過を示していると考えられる。ＡＬＰアイソザイムの反応は敏速であり、α−ＦＰやＣＥＡは少し遅れて反応しているようである。特にＡＬＰ ＩＩＩが減少してゆく特異なパターンは、ＡＰ−Ａによって、数値的によく把握出来た。ＡＰ−Ａは手術によって少し低下しているが、やがてまた急増して、術後２４日目では、０．２９４となって再発の兆候を示している。
次に、同一患者が９カ月後、手術創の近辺に約０．５ｇの癌を再発して、それを切除した。漢方薬と基本療法を手術一週間前から開始した。再手術前後のＡＬＰアイソザイムの解析を図４−（ｂ）に示す。図中の数字は手術日をゼロとした日数である。ΔＣＥＡとΔフェリチンはそれぞれ、１．７ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌを差し引いた値である。手術直前までに、フェリチンやＣＥＡが増加していることが明らかである。
癌患者の術前、術後の血清ＡＬＰアイソザイムの解析をしてみると、特にＡＬＰ Ｉの出現、及び、ＡＬＰ ＩＩ〜ＩＩＩのパターン変化が癌細胞の増殖活動と密接な関係にあることが示唆された。腫瘍マーカーの経時的変化をチェックすることと、ＡＬＰアイソザイムの解析を併用すれば微小癌の存在と増殖状況の判定が可能と考えられた。
実施例１の前臨床癌期の分類方法における解析について説明する。ＡＬＰ ＩＩ〜ＩＶの各アイソザイムの同定が明確でない現状において、それらのパターンの解析をより正確に行うために、各アイソザイムの熱処理と再構成実験を行った。
＜実験材料及び方法＞
図６は実施例１の前臨床癌期の分類方法における各アイソザイムの熱処理と再構成実験におけるＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフである。
実験にはＡＬＰ ＩＩＩが著減してＡＬＰ ＩＩが主体の癌患者血清（図６（ａ）−０）（血清２と略す）とＡＬＰ ＩＩＩが、主体の２才児血清（図６（ｂ）−０）（血清３）と、ＡＬＰ ＩＶが主体の出産直後の妊婦血清（図６（ｃ）−０）（血清４）を用いた。
＜実験の結果＞
各血清の熱処理による効果、図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は各血清を５６°Ｃにて１０分間熱処理したアイソザイムである。（図中の数字は、熱処理した時間を示している。）ＡＬＰ ＩＩは５６°Ｃ、５分間の熱にかなり安定で、急峻なピークであった（図６−（ａ））。
ＡＬＰ ＩＩＩ は５６°Ｃ、１０分間の熱処理によって、大きく阻害され、易熱性である（図６−（ｂ））。また、ＡＬＰ ＩＩＩの円滑なカーブは分子種に幅のあることが示唆された。ＡＬＰ ＩＶは、耐熱性であり、急峻なピークは後期胎盤由来の特徴をよく示している（図６（ｃ））。
再構成実験１（図６（ｄ））：ＡＬＰ ＩＩに注目して、血清２と血清３を色々な割合で組み合わせた血清について、電気泳動し、分析した。ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの各活性を総活性より算出して、それぞれの活性の割合を求めた。ＡＬＰ ＩＩＩを１、２５、７５、９２％と徐々に増加させるとそれに応じて、ＡＬＰ ＩＩは、９９、７５、２５、８％と減少する。ＡＬＰ ＩＩ、ＩＩＩのピークは、ＡＬＰ ＩＩＩ分画の増加に伴い、丸味を帯びて鈍角になっている。
再構成実験２（図６（ｅ））ＡＬＰ Ｉについて、本実験では無視した。血清２と血清３を混合し、ＡＬＰ ＩＩ３０％、ＡＬＰ ＩＩＩ７０％のアイソザイムパターンを得た（図中で０と表記する）。これは健康成人のパターンと同じものである。血清２と３の割合を一定にし、血清４を徐々に加えて、分析した。ＡＬＰ ＩＶの占める割合（％）が増加するにつれ、肩が出来、二峰性のパターンに変化した。再構成実験１（図６（ａ））と比較すれば、ＡＬＰ ＩＩＩのピークに鋭角な肩のある場合、あるいは、二峰性を示す場合は、ＡＬＰ ＩＶが増加したアイソザイムパターンであることが判る。
再構成実験３（図６（ｆ））：本実験ではＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＶの割合を変化させると、どのようにアイソザイムパターンが変わるかを調べた。ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＶのパターンはＡＬＰ ＩＶが２５〜７５％の場合、谷の深い急峻な二峰性のパターンになる。
ＡＬＰ各アイソザイムの再構成パターンの解析より、ＡＬＰ ＩＩ、ＡＬＰ ＩＩＩ、ＡＬＰ ＩＶの簡便な同定が可能になった。癌の場合の分子種は多様なので、癌胎児性ＡＬＰの検出には、熱処理によるチェックだけでは検出率は低くなる。従来、癌組織にはＡＬＰ ＩＶが高率に検出されるにもかかわらず、癌患者の血中ＡＬＰ ＩＶの出現頻度は１〜３０％といわれている。この検出率の低い理由は、ＡＬＰ ＩＶの血中漏出に何らかの機作が関与している、可能性とＡＬＰ ＩＶの活性が低くて、見過ごされてきた場合と、ＡＬＰ ＩＩＩと誤認されている場合もかなりあったと考えられる。これらの再構成実験で得られたアイソザイムパターンを参考にして検索すれば、もっと高率にＡＬＰＩＶが検出できる。ＡＬＰ Ｉは原発性肝癌、肝浸潤、うっ血肝、脂肪肝など総活性が上昇している時に出現する。しかし、我々はＡＬＰが正常値の範囲内でも、癌胎児性のＡＬＰ Ｉがしばしば出現し、癌の進行にともなって、ＡＬＰ Ｉが増加することを見出した（図６（ｂ））。
ところで、ＡＬＰ ＩＩは全身性ＡＬＰと云われてきたので基本型ＡＬＰと考えている。ＡＬＰ ＩＩＩはＡＬＰ総活性が上昇している場合には、造骨新生とか肝硬変ならびに慢性腎不全などで、増加することが知られている。ＡＬＰが正常値の範囲内の場合には、ＡＬＰ ＩＩＩ は細胞新生のある時、例えば、微小癌の増殖とか、肝臓の再生時、ならびに進行の遅い臨床癌などの場合に増加する。臨床癌で癌の進行が早くなると血中のノイラミニターゼ活性が働くためか、ＡＬＰ ＩＩＩがＡＬＰ ＩＩに移動してかＡＬＰ ＩＩＩは減少してくる。おそらくＡＬＰ ＩＩＩは新生細胞の増殖に関連した脱燐酸化作用をもつ修飾酵素である可能性が強い。ノイラミニターゼはシアル酸を遊離させる酵素でシアリターゼともいわれており、オリゴ糖からシアル酸（ノイラミン酸）を分離するアシアロ蛋白である。
血清アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）アイソザイム、ΔＣＥＡ、Δフェチリン（一定時間あたりの差）等の腫瘍マーカーによる診断法により微小癌の推定が可能になった。しかし、ＡＬＰ ＩＶの血清中の出現率は１〜３０％程度であるといわれているが、癌組織では、かなりの率でＡＬＰ ＩＶが検出されている。これは、腫瘍マーカーが癌細胞で、産生されても、血中へ出るためには、何らかの機序が介在していることが予想される。そこで、培養癌細胞の腫瘍マーカーをビタミンＡと熱が高める事がｉｎ ｖｉｔｒｏで明らかになっているので、微小癌の存在を確かめる為にビタミンＡと体内深部まで加温効果のある遠赤外線によるハイパーサーミヤを用いて、癌組織由来のマーカーの血中への漏出を高める腫瘍マーカーの誘発法を試みた。
＜方法＞
対象に１５名（男４・女１１）のボランティアを用いた。これらは全て癌を持たない健康と思われる人達で、年齢は２８〜３８才に及んだ。臨床癌の一例として、第IV期の胆のう癌患者（４５才、女）を用いた。誘発は、ビタミンＡ（retinol palmitate）を５００００I Ｕ筋肉注射を行い、一時間後、被検査に遠赤外線によるハイパーサーミア（５６°Ｃ、２０分間）を行った。
＜結果＞
図７は実施例１の前臨床癌期の分類方法における第ＩＶ期の胆のう癌患者（５０才、女）の血清中の腫瘍マーカーの経時的変化（ａ）と、Δフェリチン値の時間経過を上昇型と不変型と下降型の三型に分類した例（ｂ）を示すものである。
胆嚢癌患者に腫瘍マーカー誘発法を適用し、血清中の腫瘍マーカーの経時的変化を調べた（図７−（ａ））。フェリチンやα−ＦＰは６時間後に急速な血中漏出が認められる。フェリチンは２１３ｎｇ／ｍｌ、α−ＦＰは５０ｎｇ／ｍｌの変動が認められた。
ＣＥＡは４８時間後に僅か０．３ｎｇ／ｍｌしか増加しなかった。次に１５名のボランティアに誘発を適用し、処置前と処置後６、２４、３６、４８時間目に採血して、各時間と処置前との血清フェリチン値の差をΔフェリチン値として、時間経過を、上昇型と不変型と下降型の三型に分類した（図７−（ｂ））。
図８は実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるΔフェリチンの上昇型（ａ）と下降型（ｂ）を示すものである。
不変型の場合（ｎ＝４）変動幅は４ｎｇ以下であった。上昇型（ｎ＝６）は２４時間でΔフェリチン値が上昇しはじめて、４８時間で最高に達する場合が多い。変動幅は７〜１２ｎｇであった。下降型の場合（ｎ＝３）、６時間目で、フェリチンの急速な減少を認めた（７．７ｎｇ／ｍｌ±０．９ｎｇ）。変動幅は７〜１３ｎｇであった。その後、徐々に元の値に戻っている。ここで、前述した我々の方法によるＡＬＰアイソザイムパターンの解析を行った。Δフェリチン不変型の場合、ＡＬＰ ＩＩ／ ＩＩＩの活性比も全く、正常値１．６±０．４の範囲内であり、ＡＰ−Ａも０．１以下で全く正常であった。この不変型は、微小癌以前、恐らく、細胞数にして１０4 個以下の検出不能の段階であり、ほぼ正常者とみなしてよいと考えられた。図８（ａ）に、Δフェリチン上昇型のＡＬＰアイソザイムの解析を示した。図中の数字は、誘発処置後の時間である。
この図表に解析されているように、ＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩの比は３６時間で、異常低値（１．０以下）になり、その後徐々に回復している。誘発法によるＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩ および、ＡＰ−Ａの異常値から、Δフェリチン上昇型は微小癌の存在を示唆する。最後に、下降型について、ＡＬＰアイソザイムの解析を図８（ｂ）に示した。下降型の場合ＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩの比は６時間で異常低値を示し、その後徐々に元に戻っている。ＡＰ−Ａは６時間目以後から正常値に近い値を示している。Δフェリチンと時間的相関関係をもって変動している点から類推すると、恐らく、Δフェリチン下降型は炎症を伴った微小癌の存在を示すのではないかと考えられた。
このように、微小変動といえども同一被検者について、誘発法を行って、ΔＣＥＡが０．４±０．１ｎｇ／ｍｌ以上、Δフェリチン値が４〜７ｎｇ／ｍｌ以上の変動があれば、微小癌としての検索をすすめる必要がある。その上でＡＬＰアイソザイムの解析を行うことによって確かめられる。特に、５６°Ｃ、１０分間の熱処理によって残存する耐熱性ＡＬＰアイソザイム分画の存在をチェックする事と、蛍光分光光度計測定によるＡＬＰ活性（６５°Ｃ、１０分間熱処理）の超微量測定法を行って、耐熱性ＡＬＰ活性を測ることを併用すれば、微小癌の存在は更に確実となる。
臨床癌ではΔＣＥＡが１．０±０．１ｎｇ／ｍｌ以上、Δフェリチン値が２０ｎｇ／ｍｌ以上の変動幅となる。本発明では、臨床癌の誘発パターンで上昇型しか示さなかったが、下降型もかなりの頻度である。ボランティア中の上昇型、下降型は共に臨床癌の誘発パターンを縮小形であると考えられる。下降型と上昇型の微小癌の存在形態の違いが炎症の有無だけなのか、それとも、癌の存在状態が異なるためなのかどうか、今後の検討を要する。当然ながら、フェリチン値の上昇する実質性臓器の炎症ならびに、ヘモクロマトージスなどでは、慎重な検討が必要である。ＬＤＨアイソザイムのパターン解析も重要な資料となる。また血清鉄が低い時はフェリチン値が低く出るので、血清鉄値を正常に戻してから誘発を行う。消化器系の癌ではフェリチン値は低く出る傾向にあるので注意が必要である。又、断食により、フェリチン値の一時的急増が見られる場合がある。肝炎などの単なる炎症の場合は、フェリチン値は急減するだけで、ΔＣＥＡやＡＬＰアイソザイムに異常が認められない。
ビタミンＡと遠赤外線ハイパーサーミヤによりΔフェリチンが上昇するタイプと下降するタイプと不変型に分けられた。不変型は微小癌をも持たない健康人と考えられた。Δフェリチンが４〜２０ｎｇ／ｍｌ、ΔＣＥＡならば０．４〜１．０ｎｇ／ｍｌならば、微小癌の存在を推定できると考えられた。また、ＡＬＰアイソザイムの解析で、（ＡＬＰ活性が正常値の範囲内で）ＡＬＰ Ｉの割合、ＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩの比、ＡＰ−Ａの変化は、微小癌の存在をより確定的なものと出来る。
図９は癌の成長過程とＡＬＰアイソザイムによる５段階評価方法を示す説明図である。
腫瘍マーカーのスクリーニングによる腫瘍の成長レベルを、数段階の腫瘍成長度ステージに分類することにより、見掛け上の健常人に発生する癌を発見し、かつその癌の危険度を評価する。例えば、この腫瘍の成長レベルの分類は、２以上の異常レベルのステージを含むものであり、微小癌もない理想的な状態をステージＩとし、前癌状態をステージＩＩ、ＩＩＩとし、前臨床癌状態をステージＩＶとし、及び１ｇ以上の癌が存在すると推定される状態をステージＶと、する５段階に設定した。
＜癌の一生のうち「臨床癌期の癌」を分類する方法＞
実施例２は癌の一生を分類する方法における「臨床癌期の癌」を分類する方法である。実施例２の癌の一生を分類する方法は血清蛋白分画の多変量解析により癌をスクリーニングする方法である。この実施例２の方法によるスクリーニングとは、癌の早期発見により適切な治療法へと導く方法であり、簡易的なスクリーニングの後、精密検査によって確定診断する方法がある場合に行われる。本発明は疾病や障害の有無を最終的に診断することが目的ではなく、確定診断するための精密検査の前段階として実施する方法である。なお、実施例２の「臨床癌期の癌」を分類する方法に際しても、α、β、γなどの記号を用いて、蛋白分画の説明をしているが、実施例１の「前臨床癌期の癌」を分類する方法に使用したα、β、γなどの記号とは異なる意味で用いているものがある。
実施例２の方法は、図２のフロー図に示す「臨床癌期」における判断方法である。実施例２の方法による蛋白分画単独で癌のスクリーニングは、アルブミン［％］、α１−グロブリン分画［％］，α２−グロブリン分画［％］とγ−グロブリン分画［％］の阻み合わせによる多変量解析を行い、腫瘍の危険度と癌の危険度を分類、評価する方法である。
実施例２の分類する方法では、緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液で発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、染色体の形、濃淡等を判定して、発生する微小な癌の動静を発見し、かつその腫瘍の危険度と癌の危険度を評価する。
実施例２の分類する方法は、タンパク分画像にあらわれる、アルブミン分画の低下と、α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画及びγ−グロブリン分画の増加という変化状態を同定することにより、腫瘍の危険度と癌の危険度評価を数段階に分類する。
＜アルブミン分画の説明＞
実施例２の臨床癌期の分類方法では、アルブミン、α１−グロブリン分画（多くの免疫抑制物質）を用いる。特にα１−グロブリン分画は良好なパラメータとして機能する。なお、タンパク分画像の変化は、炎症性疾患においても生じる現象であるため、その炎症性疾患による場合を回避する必要がある。そこで、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定することで、より正確な癌の分類が可能になる。
例えば、肝硬変と慢性肝炎の場合、アルブミン減少とγ−グロブリンが増加する傾向にある。アルブミンは、肝臓で生成されて、血液の浸透圧の調整に利用され、ホルモンと有害物質を運ぶ際に用いられる物質である。アルブミンは多くの病気があるときに減少する性質がある。
＜グロブリン分画の説明＞
（１）α１−グロブリン分画
α１−グロブリン分画は、炎症、癌、ストレスとリウマチ性疾患の急性相のこの分画が増加する。Antitrypsin、α１に溶けるグリコプロテイン、プロトロンビン、キモトリプシン、エラスターゼとプロテアーゼは、この分画に含まれる。ここの２つの酵素は顆粒白血球が破壊することができる多形核球から作り出される肺組織、妨げられて、このように、人の中のα１アンチトリプシンの主役は肺組織の保護であるように見える。なお、ＡＦＰは、この分画に含まれる。
（２）α２−グロブリン分画
α２−グロブリン分画は、α２−ＨＳグロブリン分画、セルロプラスミン、erythropoetin、コリンエステラーゼ、接触グロブリン、α２−マクログロブリンはこの分画に含まれる。aptoglobulinはヘモグロビンと結合して、血液循環に回送されて、非特異性のストレス反応が増加する。慢性のタンパク質損失のα２−マクログロブリンが増加する。酸化性酵素に鉄を付加させて、トランスフェリンで鉄の輸送を促進する肝臓とで、セルロプラスミンは生み出される。
α２−ＨＳグリコプロテインは、非特定のオプソニンであると考えられる。
（３）β−グロブリン分画
β−グロブリン分画は、トランスフェリン、βリポタンパク質、補体（Complements）とhemopexinは、この分画に含まれる。トランスフェリンは肝臓で生産されて、鉄の輸送機関と相関している、そして、この分画の６０%はこのメカニズムによるとされている。脂質は細胞膜の前駆細胞としての統合するような役割をし、ステロイドと胆汁酸、これらの間で、最大の断片はβリポタンパク質である。
Hemopexinは、鉄の核でヘムを作るヘモグロビン分子で活用する。Complementsは、感染に対する血清タンパク質の複雑なシステムである。
（４）γ−グロブリン分画
γ−グロブリン分画は、ＩｇＡ、ＩｇＧとＩｇＭは、この分画に含まれまれる。ＩｇＡの分画において、抗毒素、抗菌性凝集素、冷たいagglutinとisoagglutinは、含まれる。これは、saliveryと相関している。
ＩｇＧは、バクテリア、ウイルスと毒素の抗体を含む。この分画は、急性および慢性の疾病ので増加する。多くの病気でＩｇＭは増加する。
図１０は蛋白分画名と、その結果、単位、基準値を示し、各蛋白分画の変異点にチェックを入れ、それぞれの面積比を表すグラフ図である。図１１は各蛋白分画の解析図である。
蛋白分画と、その結果、単位、基準値は図示と表１に示すように、分画Ｎｏ．１は、アルブミン分画（Ａｌｂ）、蛋白分画結果が５８．７、基準値が５５．８〜６６．１を示す。
分画Ｎｏ．２は、α１−グロブリン分画（α１−Ｇ）、蛋白分画結果が３．１、基準値が２．９〜４．９を示す。
分画Ｎｏ．３は、α２−グロブリン分画（α２−Ｇ）、蛋白分画結果が８．７、基準値が７．１〜１１．８を示す。
分画Ｎｏ．４は、β１−グロブリン分画（β１−Ｇ）、蛋白分画結果が６．１、基準値が７．７〜７．２を示す。
分画Ｎｏ．５はβ２−グロブリン分画（β２−Ｇ）、蛋白分画結果が３．７、基準値が３．２〜６．５を示す。
分画Ｎｏ．６はγ−グロブリン分画（γ−Ｇ）、蛋白分画結果が１９．７、基準値が１１．１〜１８．８を示す。
＜４期に分類する方法＞
上記表１、図１１、図１２の結果に基づいて、実施例２の臨床癌期の分類方法では、癌の一生について１グラム以上になった臨床癌期の癌について４期に分類する。例えば、臨床癌期における癌の危険度について次のように分類する。
第１期は、アルブミン分画が６５％以上、α1−グロブリン分画が２．５％未満、γ−グロブリン分画が１６％未満のとき、
第２期は、アルブミン分画が６０％〜６５％未満、α1−グロブリン分画が２．５％〜３．０％未満、γ−グロブリン分画が１６％〜２０％未満のとき、
第３期は、アルブミン分画が５５％〜６０％未満、α1−グロブリン分画が３．０％〜４．０％未満、γ−グロブリン分画が２０％〜２３％未満のとき、
第４期は、アルブミン分画が５５％未満、α1−グロブリン分画が４．０％以上、γ−グロブリン分画が２３％以上のときに、癌の危険度を４段階に分類する。
なお、これらの数値は例示であって、この数値に限定されない。
このように、実施例２の臨床癌期の分類方法では、蛋白分画の生化学的生検を加えることにより、癌が、臨床癌、１グラム以上になってからの癌のステージを正確に分類できる。本発明の分類方法に従って癌のステージ分類をすれば、癌の予防も、再発予防も、制癌剤の治療効果も、癌の進行具合も、ほぼ正確に、数字的に解析できる。健康食品がその人に効いているかどうか、食生活があっているかどうか、癌の治療が適切かどうか、癌の手術前後に、ＴＭＣＡ検診をすれば、開腹手術をしなくても、初期癌か、進行癌か、明確に判定できる。当然、手術をして、手術後にＴＭＣＡ検診をすれば、癌の切り残しがあったのか、手術が成功したのかも確実に判定できる。
ＴＭＣＡ法（tumor marker combination assay）とは、生体内（内部環境）の毒素の総合判定する方法である。この方法は、癌が出す毒素（腫瘍マーカー）の判定によって総合的に危険度を分類し、それを健康度分類として利用できるものである。この検診はもともと癌の予知診断を行える唯一の検査法ということで注目を集めてきた。このＴＭＣＡ法はわずか２０ccの採血と簡単な東洋医学的検査のみで、癌の危険度を「臨床癌」から「理想的健康状態」まで５段階に正確に分類する方法である。
生体内部環境の健康度分類は、一人ひとりの健康状態を未病の段階で判定できる。これは運動、健康食品等、各人の生活習慣が、より健康の方向を向いているのか、不健康の方向に行っているのか、客観的に判定できる極めて有効な方法である。
実施例２の臨床癌期の分類方法は、健康のバロメーターに相当し、併せて不充分な画像診断などだけで判定していた多くの誤診が確実に防げる。
なお、タンパク分画像の変化は、炎症性疾患においても生じる現象であるため、その炎症性疾患による関与割合を回避する必要がある。そこで、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定することで、より正確な癌の分類が可能になる。
Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）の測定値の高さに応じて、その関与部分をα1−グロブリン分画から差し引いて判定し、シアル酸値の測定値の高い測定値に応じてα1−グロブリン分画から差し引いて判定することにより、評価に際して炎症性の関与部分を除いて、癌の危険度を分類できる。
本発明の臨床癌期の分類方法は、通常の癌の分類に実施できる。肉腫などでは少し基準が異なるが、本発明の臨床癌期の分類方法を適用することも可能である。
＜試験＞
次に、本発明の臨床癌期の分類方法を試験例について説明する。
本発明の癌の一生を分類する方法は、そこで腫瘍マーカーによる早期癌と良性の鑑別診断能を向上させるためにいくつかの試みをした。その中で血清蛋白分画（immuno−regulatory α−ｇlobulinと組織ポリペプチド抗原（tissue po1ypeptide antigen（ＴＰＡ））を組み合わせ、α1−グロブリン×α２−グロブリンの積値およびＴＰＡ×α1−グロブリンの積値の腫瘍マーカーとしての臨床的有用性を評価した。α１−グロブリン、α２−グロブリン分画は癌の増殖を反映する。多変量解析の導入により癌のスクリーニングに有用である。またＴＰＡは各種の癌組織に含まれ血中に漏出されるtumor−specific並びにgrowth−related tumor marker（細胞の増殖力を反映）として知られている。
＜対象および方法＞
対象は（１）血清１２０検体（早期大腸癌４０、良性大腸疾患３０、健常５０、年齢は各々６３．２±１２．８平均±標準偏差（mean±SD）、６１．８±１４．１、６０．８±１２．１、男女同数ずつ）と、
（２）癌患者２３７例（乳癌５８、胃癌３８、直腸結腸癌２９、肺癌２０、子宮癌１８、卵巣癌１５、咽頭咽頭癌７、脾癌５、肝癌４、舌癌１、その他２９）、良性疾患１００例、および健常人（年齢２２−８１歳、４６．４±１３．５、男女比２：３）５０例とした。
α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画はセルロースアセテート電気泳動法による血清蛋白分画法，血清ＴＰＡはＲＩＡ 二抗体法を用いて測定した。α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画、ＴＰＡを同時測定し、α１×α２ 積値およびＴＰＡ×α１積値を計算し、各症例における積値の分布、陽性率、ｍｅａｎ±ＳＤを求めた。さらに対象（２）においては癌症例を臨床進行度別（Ｉ−ＩＶ期）に分類し、各stageにおける陽性率および平均±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）を対比した。
＜測定結果＞
図１２は実施例２の臨床癌期の分類方法により、分類したときの早期大腸癌における血清α１−グロブリン×α２−グロブリンの積値の分布状態を示す分布図であり、上段が初期の大腸癌（４０例）、中段が良性腫瘍（３０例）、下段が健常者（５０例）を示す。図１３は実施例２の臨床癌期の分類方法により、分類したときの早期大腸癌における血清ＴＰＡ×α１−グロブリンの積値の分布状態を示す分布図であり、上段が初期の大腸癌（４０例）、中段が良性腫瘍（３０例）、下段が健常者（５０例）を示す。
早期大腸癌におけるα１−グロブリン×α２−グロブリンの積値、ＴＰＡ×α１−グロブリンの積値の分布を調べた。ここで健常者例のｍｅａｎ＋ＳＤはα１×α２が３０．０、ＴＰＡ×α１が４１ｌ．８となり、ｃｕｔ ｏｆｆ値を各々３０および５００に設定した。α１−グロブリン×α２−グロブリンの各疾患別のｍｅａｎ±ＳＤおよび陽性率は
早期大腸癌：３４．８（±１６．７）、（４８％）、
良性大腸疾患：２７．５（±９．８）、（２０％）、
健常者：２０．９（±４．５）、２％）であり、３者間には各々有意差が認められた。
ＴＰＡ×α１−グロブリンについては
早期大腸癌：５２７．８（±３５３．６）、（５３％）、
良性大腸疾患：３９３．３（±１９５）、（２３％）、
健常：２５ｌ．５（±８０．２）、（２％）であり、３者間には各々有意差が認められた。
次にα１−グロブリン×α２−グロブリン、ＴＰＡ×α１−グロブリンをCombination assayすると早期大腸癌では．表２に示すように、いずれか一方でも陽性を示したのは６８％であり、各々単独の場合より陽性率が高くなった。両者ともに陽牲例，および両者ともに陰性例はともに３２．５％（１３／４０）であり、両者ともに上昇する傾向がみられた。健常群のspecificityは９６％と高いが，良性群では６７％とやや低下した。
＜各種癌症例の結果＞
図１４は各種癌症例におけるα１−グロブリン×α２−グロブリンの積値について調べた分布図である。図１５は各種癌症例におけるＴＰＡ×α１−グロブリンの積値について調べた分布図である。
検体について各種癌症例におけるα１−グロブリン×α２−グロブリンの積値、ＴＰＡ×α１−グロブリンの積値の分布を調べた。両者とも陽性率は癌の部位に関係なく、癌の進行に伴ない上昇した。ちなみに癌の進行度とｍｅａｎ±ＳＤ，陽性率（表３）との関連をみた。
α１−グロブリン×α２−グロブリンについては
Ｉ期：１７．３（±６．ｌ）、
ＩＩ期：２２．５（±１０．２）、
ＩＩＩ期：２８．８（±１２．６）、
ＩＶ期：４４．３（±３２．９）であり、
陽性率は各々６，１７，３８．７９％と上昇した。良性疾患と健常者のｍｅａｎ±ＳＤは各々１７．９±４．６および１７．７±３．０ 偽陽性率は１及び０％であり、両者間に有意差は認めなかったが、癌群（Ｉ期を除く）との間に有意差を認めた。
ＴＰＡ×α１−グロブリンについては、
Ｉ期：３０８．５（±４０３．２）、
ＩＩ期：３５６．６（±２３６．５）、
ＩＩＩ期： ７２３．５（±１０１２．４）、
ＩＶ期：３１３２．２（±５６２４．２）であり、
陽牲率は各々６，１４，４４．７６％と上昇した。良性と健常のｍｅａｎ±ＳＤは各々２２３．６±９０．０および２０５．９（±４０．７）、偽陽牲率は１及び０％であり、両者間に有意差は認めなかったが、癌群との間に有意差を認めた。
次にα１−グロブリン×α２−グロブリンとＴＰＡ×α１−グロブリンをcombination assayすると、いずれか一方でも陽性を示したものは癌の進行にともない、
Ｉ（期）：１１（％）、
ＩＩ（期）：２６、
ＩＩＩ（期）：５８、
ＩＶ（期）：８８と上昇し、また各stageごとにみると各々単独の場合より陽性率がさらに高上した。良性および健常では２および０％であり、早期癌を含む癌群との間に有意差を認めた。
なお当施設の健常群におけるｍｅａｎ十２ＳＤは、α１×α２：２３．８、ＴＰＡ×α１：２８７．３であった。
α１−グロブリン×α２−グロブリンの積値、ＴＰＡ×α１−グロブリンの積値は各種癌症例において平均値・陽性率とも癌の進行にともない上昇し，腫瘍マーカーとしての有用性が示唆された。特に両者のCombination assayでは陽性率がさらに高上し、早期癌と良性の鑑別診断においても有用であり，スクリーニングへの適用が期待される。
＜判別関数の決定＞
１．判別関数の決定
次に、本発明の実施例２の分類方法を用いて、形態学的に癌と診断された１００例と、癌と診断されなかった１００例を無作為に抽出し、それぞれ患者群、健常群として試験してみた。これを標本Ａとする。
解析Ｉ：標本Ａのデータをそのまま解析した。
解析ＩＩ：標本Ａのデータのうち肝疾患・境界域値、および特に異常な値を除く患者群．健常群それぞれ５０例を選択し解析した。
解析ＩＩＩ：標本Ａのうち各測定値を正常範囲（Ａｌｂ≧５８．０，ａｌ≦３．０、α２≦９．０とする〉からの距離（ｃｕｔ ｏｆｆ値からの距離）に変換したデータ（それぞれ（Ａｌｂ）’−（ａｌ）′．（α２）′とする）を解析した。Ａｌｂを例にすると、５８．０より大きな値は、すべて０．５７は１．０に、５６．０は２．０にそれぞれ変換される。
なお解析には、コンピュータを用い、データを入力することにより、判別式の各係数、各々の値分布、相関性などが得られるプログラムを利用し判別関数を決定した。
＜得られた判別関数の検定＞
上記標本Ａとは別に患者群・健常群それぞれ１００例を無作為に抽出して標本Ｂとした。それぞれの判別関数を検定した。
＜得られた判別関数の臨床応用＞
更に他から供与された検体（健康体１５例、初期肺癌２０例、初期大腸癌２０例、良性腫瘍は除く）について、上記判別関数の決定により得られた判別関数により癌診断を行った。
＜計算式＞
実施例２の分類方法に用いる計算式は、次に数１に示す数式が有用と考えられた。
この数１の数式においてＺ≧０のとき健常人（正常）と、Ｚ＜０のとき癌と判定する。
癌を癌と判定する有病正診率（sensibitinity：以下serと略）、健常を健常と判定する無病正診率（specificity：以下speと略）、両者の総和の正診率は、数１の数式を決定する際の標本ＡではＳｅｎ６４％、ｓｐｅ９１％、正診率７７．５％であった。また標本Ｂの検定ではＳｅｎ７５%、ｓｐｅ９２％、正診率８３．５％であった。その他の別の検体ではＳｅｎ９７．６%、ｓｐｅ２６．７％、正診率７８％であった。
実施例２の分類方法では、血清蛋白分画の多変量解析を用いることにより 良好な正診率が得られた。これは癌の成長に伴い、個人個人の各分画に異常が現れるが、それらを総合的に判断可能にしたためと考えられた。
２）従来の文献ではアルブミンとα２−グロブリンを用い、人間ドック対象者に対し肺癌の判別を行った時、５５．２％判別能があったとの報告がある。これにα１−グロブリンを加えると正診率はさらに上昇ことがわかった。実施例２の分類方法ではアルブミンとα１−グロブリンとα２−グロブリンを用いたが、β−グロブリン分画は癌の判別には効果は薄く、他にも同様の効果がある。
＜蛋白分画の生化学的バイオプシー＞
蛋白分画について生化学的バイオプシーを実施した。即ち、蛋白分画について生体の組織や臓器の一部を採取して、病気を診断する解析をした。この生化学的バイオプシーは、悪性腫瘍である癌が疑われる患者に行われることができ、皮膚や胃、腸、肝臓、肺、腎臓などの組織を使って病理的に診断されるものと同じである。
蛋白分画は電気泳動で５つの基本的バンドに電気泳動される。その中で、アルブミン、α1−グロブリン分画、α２−グロブリン分画が癌の成長との関係が深い。第１のバンドはアルブミンである。肝臓で特徴的に産生されて血液の浸透圧を調整し、物質の輸送と蛋白の保全に役立つ。肝臓病、腎臓病、全身病でアルブミンが減少する。
第２のバンドはα1−グロブリン分画である。この中にはα１−アンチトリプシンが７０〜９０％ある。α１−酸性糖蛋白か、α1−リポ蛋白、プロトロンビン、トランスコーテン、テロキシン結合性グロブリンが含まれる。
α１の分画の増加は炎症、癌、ストレス、出血性異常の急性反応として生じる。
α１−酸性糖蛋白は肝炎、腎障害、カヘキシアで減少する。
α１−アンチトリプシンは蛋白分解酵素に対する代表的なプロテアーゼインヒビターであります。α１胎児性蛋白はこのバンドに生じる。
α２−グロブリン分画には、ハプトグロブリン、α２−マクログロブリン、α２−ＨＳ糖蛋白、セルロプラスミン、エリスロポエチン、コリンエステラーゼが含まれている。
ハプトグロブリンはヘモグロビンと結合するように働く。
ハプトグロブリンは癌の初期に増加する。α２−マクログロブリンはα２バンドの前傾に現れる。α２ＨＳグロブリン糖蛋白は非特異的なオプソニンの可能性がある。
なお、本発明は、身体のどこかに微小癌があるか否かを検査すると共に、ＡＬＰアイソザイムパターンの解析と腫瘍マーカーの解析、及び血清蛋白分画の解析を行い、総合的に評価することで、特定の臓器における早期癌を発見するだけではなく、いずれの部位にもある微小癌、臨床癌期の早期癌の高危険群を同定し、進行癌のステージを分類して癌の予防と治療に貢献し、既往症に関しては治療経過を正しく評価して科学的な対処を提案することができれば、上述した発明の実施の形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変更できることは勿論である。
また、癌の一生における前臨床癌期の微小癌と臨床癌期のステージの何れも検出し、その危険度を的確に判定し、分類することができれば、上述した発明の実施の形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変更できる。
本発明は、癌の一生における前臨床癌期の微小癌と臨床癌期の早期癌の何れも検出し、その危険度を的確に判定し、分類することに利用することができる。本発明は、癌の一生を測るバロメーターとして利用することができる。換言すると、人類の最大の敵であった癌の一生を逆手に取ることで、真の健康のバロメーターとして利用することができる。
本発明は、癌の疑いが有る人の血液や尿を検査して生化学的に微小癌を検出し、かつ定量的に癌を早期に発見・評価する際に用いるデータを採取する方法に係り、特に癌の一生における前臨床癌期の微小癌と臨床癌期のステージの何れも検出し、その危険度を的確にデータ解析して癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法に関する。
癌は、早期に発見して診断することが、癌の治療にとって重要とされている。特に、早期に発見された微小な癌であれば自然治癒力で完治したという事例もある。そこで、胃癌、肺癌、大腸癌、肝臓癌、乳癌等の癌を早期に発見しようとする方法が数多く提案され、かつ実施されている。
また、癌化した細胞は分裂を繰り返してがん組織を作り、病気として現れてくる。癌の一生は図１に示すように、「前癌期（健常期）」、「前臨床癌期」、「臨床癌期」の３期に分類される。細胞の癌化は前癌期に起こるが、前臨床癌期までは癌細胞の集団は微小であるためこの時点で癌の存在を眼で確認することは困難である。通常肉眼で発見できるのは、臨床癌期にある直径１０ｍｍ以上の癌であり、約１０億個（１０9 個）以上の癌細胞から成る。一般的に病気として認識され、治療の対象となるのは、この臨床癌期の癌である。
癌細胞は、正常な細胞にはない特殊な成分をつくり出す場合が多い。また、正常人ではごく微量な成分が、癌患者では大量に作られる場合がある。このような癌細胞に特徴的な成分は、癌細胞の目印（マーカー）という意味で「腫瘍マーカー」と称されている。
このような腫瘍マーカーには、肝臓癌における「アルファ−フェトタンパク質、α-フェトプロテイン、ＡＦＰ」、胃癌や大腸癌における「癌胎児性抗原、Carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ」等の癌細胞や胎児にのみ作られるタンパク質、「糖鎖抗原１９−９、carbohydrate antigen 19-9、ＣＡ19-9」と反応する膵臓癌等の腫瘍特異的抗原、子宮の絨毛癌における「ゴナドトロビン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Human chorionic gonadotropin、ＨＣＧ」、副甲状腺癌における「カルチトニン又はカルシトニン、calcitonin」等のホルモン、骨癌や肝臓癌における癌性「アルカリフォスファターゼ（以下「ＡＬＰ」という）等の種々のものがある。
このＡＬＰは、条件を正せば重要な腫瘍マーカーであり、リン酸を切り離す働きを持つ酵素で、ヒトでは、上記の骨、肝臓以外に胎盤、小腸等の臓器ごとにそれぞれ分子量が異なる数種類のものがある。このＡＬＰのように、臓器ごとに同じ作用を持つ複数の種類の酵素がある場合、それらは互いにアイソザイムと称されている。例えば、骨癌や肝臓癌、多発性骨髄腫等の患者では、正常な人の酵素とは分子量が違うアイソザイムがつくられる。これらの癌細胞では、それぞれのアイソザイムを支配する遺伝子の働きが正常さを失ったため、アイソザイムが異なるパターン変化したものである。そこで、このようなアイソザイムのパターンを検査及び的確に評価すれば、骨、肝臓、大腸や肺等に発生した微小癌を発見することができる。
そこで、従来よりＡＬＰアイソザイムは、電気泳動法により検査する方法が提案されている。この検査方法は、電気泳動によって血清タンパクを分離したのち、ナフトール系リン酸化合物と反応させ、遊離するナフトール系物質をジアゾニウム塩によりジアゾ化して発色させ、アイソザイムを検出する方法である。
このＡＬＰアイソザイムの検査方法は、例えば次のような手段で実施している。
（１）試料の塗布
先ず、１時間以上泳動用緩衝液に浸しておいたセルロゲルを２．５×６ｃｍに半切し、その陰極側から１ｃｍの位置に、癌の評価対象となるヒトの血液から分離した血清８〜１０μlを塗布する。高活性の場合は塗布量を加減する。
（２）電気泳動
１００Ｖでアルブミンが、陽極端より１ｃｍに移動するまで泳動させる。このとき冷却することが望ましい。
（３）染色泳動終了後
染色泳動終了後、セルロゲルを更に半切し、一片でタンパク染色を、他の片でＡＬＰ染色を行う。ＡＬＰ染色は染色液を染み込ませたろ紙上に泳動した膜を、間に空気の入らないようにして重ね、遮光して３７℃、約１時間加温する。染色後に１％酢酸に入れ固定する。
（４）評価方法
タンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、染色体の形、濃淡などを観察する。電気泳動で血清中にI 〜ＶI までのバンドが検出されるが、抗原性の点から区別すると由来臓器の異なる肝性ＡＬＰ、胎盤性ＡＬＰ、小腸性ＡＬＰ、全身性ＡＬＰ、骨性ＡＬＰの５種類に属し、これら５種類のアイソザイムの修飾型、糖鎖の違いによると考えられていた。
正常人の血清ＡＬＰは肝性（α２位）が主で、α２＞α２βのことが多い。血液型Ｏ及びＢの分泌型では高頻度に小腸性が検出される。小児期では骨性（幅広い活性帯として染色される）が、妊娠後期には耐熱性の胎盤性ＡＬＰが出現する。肝、胆道疾患で上昇するＡＬＰは、主にα２位の肝由来のものであるが、肝内、肝外胆汁うっ滞、転移性肝癌、薬物性障害等では高分子性のα１位のアイソザイムが出現する。慢性肝炎、肝硬変では小腸性ＡＬＰの出現頻度が高い。骨性ＡＬＰは、クル病、ページェット病、副甲状腺機能こう進症、甲状腺機能こう進症、骨折、癌の骨転移、骨肉腫等で増加し、人工透析患者では、骨性、小腸性等のＡＬＰがみられることがある。電気泳動で検出されるＡＬＰの異常には腫瘍産生によるものと、免疫グロブリンとの結合、シアル酸、ニューラミニターゼによる修飾等がある。
（５）腫瘍産生によるＡＬＰアイソザイムは、上述した評価方法によって検出された腫瘍産生によるＡＬＰとしては、胎盤型のＲｅｇａｎ ＡＬＰとＮａｇａｏ ＡＬＰ、また小腸型のＫａｓａｈａｒａＡＬＰとがある。胎盤型のＡＬＰがシャープなバンドとして検出される。胎盤型のＡＬＰは、卵巣癌や子宮癌で検出頻度が高く、癌患者では１０〜１５％の頻度で検出される。小腸型のＫａｓａｈａｒａＡＬＰは、セルロースアセテート膜電気泳動でＡＬＰ１の位置に泳動されるが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理によりＡＬＰ１の易動度を陰極側に変化させることで評価でき、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動では最も陽極側に泳動されることから確認できる。また、Ｌ−フェニルアラニンで阻害される特徴がある。ＫａｓａｈａｒａＡＬＰは癌患者の約１５％に検出される。
正常及び各種の疾患にヒトの血清中には、表４に示すように、肝性、骨性、胎盤性、小腸性等の数種類のＡＬＰアイソザイムが出現し、これらの間に電気泳動移動度、耐熱性、各種アミノ酸による阻害度、免疫交叉反応性などにかなりの相違がみられ、相互の分別に利用されている。
ＡＬＰは分子量１２〜１６万の２量体で、各組織細胞の細胞膜と結合した複合体として存在しているが、組織障害時には細胞膜の細片となった巨大（高い）分子性のＡＬＰが血中に遊出することがある。低分子性の肝性、骨性、胎盤性、小腸性由来のＡＬＰは一般の電気泳動でα１ 〜βの間に移動するが、高分子性ＡＬＰは支持体の種類（特に分子篩効果の有無）によって移動度が異なり、セルロースアセテート膜、寒天ではα１位（肝由来）と原点にとどまる成分に分かれるが（後者は染色時に剥がれて検出されない）、ポリアクリルアミドゲル、デンプンゲルでは分子篩効果によって移動度が小さくなり、原点位とそれからわずかに移動する２分画に分かれる。
後述する肝癌性ＡＬＰはポリアクリルアミドゲルでは肝性より移動度の大きい成分として検出されるが、セルロースアセテート膜、寒天では肝性と重なり検出されない。また、免疫グロブリン結合性のＡＬＰもポリアクリルアミドゲルのほうが小腸性とよく分離する。従って、血清ＡＬＰアイソザイムの電気泳動による分析には、セルロースアセテート膜又は寒天とポリアクリルアミドゲルを併用する。
癌検診の結果に基づいて変化する癌発症リスクを、特定の条件の下に予測するシステムに関する技術が種々提案されている。例えば特許文献１の特開２００６−３０２２２２号公報「癌発症リスク予測システム及び方法、並びに癌デリバティブ方法」のように、少なくとも演算手段と記憶手段とを備え、特定の条件の下に、臨床癌発症リスクを予測する予測システムであって、前記記憶手段には、前臨床癌の検出が可能な特定の高精度癌検診における過去の検診結果を、癌の存在可能性を示す特定の数値を元に、健常状態と、該癌の存在可能性を否定できない見かけ上の健常状態と、臨床癌状態と、に分類し、前記各分類毎にデータの参照を可能に記録した、高精度癌検診クラスタリングデータベースと、前記高精度癌検診クラスタリングデータベースにおいて、前記各分類毎に特定の期間後に受けた前記高精度癌検診の再診結果を前記各分類毎にデータの参照を可能に記録した、高精度癌検診再診結果データベースと、を備え、前記高精度癌検診クラスタリングデータ及び前記高精度癌検診再診結果データの相関を演算して、前記高精度癌検診の結果又は前記特定の期間を変数とした臨床癌状態分布を算出する臨床癌状態分布算出手段と、前記高精度癌検診を受診した特定の受診者が、その受診結果によって計算される、特定期間後に臨床癌に罹患する可能性の予測を生成するシミュレーション手段と、を備える予測システムが提案されている。
特開２００６−３０２２２２号公報
しかし、上述したＡＬＰアイソザイムの検査方法では、その癌がある程度の大きさに成長しないと検出しづらいものであった。従って、従来におけるアイソザイムによる癌の発見・評価方法では、有病正診率（sensitivity）及び無病正診率（specificity）がそれぞれ低いものであった。この有病正診率とは癌患者を癌であると正しく評価した割合をいい、無病正診率とは健常人を癌でないと正しく評価した人の割合をいう。従って、従来のアイソザイムによる癌の発見方法は、主として癌を診断していく上での一種の補助的な検査、或いは癌を治療していく上での経過観察の検査として行われるものであった。
本発明の発明者は、微小癌の存在の指標としてＡＬＰアイソザイムとΔＣＥＡ（癌胎児性抗原、Carcinoembryonic antigen）やΔフェリチンの一定時間あたりのパターン変化を用いて、生化学的に微小癌を検出（腫瘍マーカーの誘発を含む）する方法に着目した。脱分化あるいは異分化現象として見なされている癌化の過程においてＡＬＰは重要な役割を果たしている。血清中のＡＬＰ総活性が正常値の範囲内で、癌細胞の増殖とＡＬＰ Ｉ〜ＡＬＰ ＩＶのアイソザイムパターンとの間に密接な関係がある。そこで、一定時間における腫瘍マーカー値の変化（Δ）とアイソザイムの解析により、細胞数１０4 〜１０9 個（重さにして、10μg 〜1g）の微小癌の推定が可能である。即ち、ＡＬＰアイソザイムのパターン変化を解析することによる新しい早期癌の評価方法を発明した。
このような腫瘍マーカーには、肝臓癌における「アルファ−フェトタンパク質、α-フェトプロテイン、ＡＦＰ」、胃癌や大腸癌における「癌胎児性抗原、Carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ」等の癌細胞で作られるタンパク質、「糖鎖抗原１９−９、carbohydrate antigen 19-9、ＣＡ19-9」と反応する膵臓癌等の腫瘍特異的抗原、子宮の絨毛癌における「ゴナドトロピン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Human chorionic gonadotropin,ＨＣＧ」、副甲状腺癌における「カルチトニン又はカルシトニン、calcitonin」等のホルモン、骨癌や肝臓癌における癌性「アルカリフォスファターゼ（以下「ＡＬＰ」という）等の種々のものがある。
図１６は早期大腸癌、大腸良性疾患及び健常人における各腫瘍マーカーの陽性率を示すグラフである。図１７は早期大腸癌、大腸良性疾患及び健常人における各腫瘍マーカーの陽性率を示すグラフである。
単独の腫瘍マーカーを用いて、骨、肝臓、腸や肺等に発生した微小癌を発見することができる。しかし、従来より多くの癌学者が指摘するように、有病正診率（sensitivity）の感度を向上させようとすると、特異度、即ち無病正診率（specificity）が下がるので、正診度（accuracy）の向上は望めなかった。そこで、本発明の発明者は、表５に示すように、比較的、特異性の低い腫瘍マーカーを複数扱い、有効な複合マーカーを見つけだした。例えば、ＣＥＡ×ＴＰＡ,ＦＴ／Ｆｅ，更にそれらを組み合わせることに着目した。この表は初期大腸癌と肺癌に対して調査したものである。ＣＥＡやＴＰＡの単独腫瘍マーカーでは、sensitivityとspecificityを両方上げることは不可能であるが、複合マーカ―の組み合わせを増やせば、感度と正診度の精度を向上させることができることに着目した。
図１７に示すように、早期大腸癌、大腸良性疾患と健常人とにおける早期癌と良性腫瘍（良性疾患）の区別は可能である。なぜならば、本発明の発明者は、図１６の各腫瘍マーカーの陽性率を示すグラフにあるように、良性腫瘍（良性疾患）と健常人（正常）の区別をする複合マーカーを見つけたからである。そこで、第１段階で、健常人（正常）と癌の区別をつけて、第２段階で、癌と良性腫瘍（良性疾患）の区別をする複合マーカー（Ｆｅ／ＳＡ）を用いれば分類が可能になる。この炎症性疾患による原因関与を回避するために、α１−グロブリン分画の評価の際に、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定し、炎症の寄与部分を差し引くことで区別できることに着目した。
更に、本発明の発明者は、細胞数１０9個以上の癌については、血清蛋白分画による解析を癌のスクリーニング（鑑別診断）を用いることに着目した。この血清蛋白分画による癌のスクリーニングの診断法は安価かつ簡便であり臨床医にとっても活用しやすいものである。「前臨床癌期」の癌は腫瘍マーカーの組み合わせにより、「臨床癌期」の癌は血清蛋白分画解析を加えて、両者を併用することで癌の一生を分類できると考えた。
本発明は、かかる問題点を解決するために創案されたものである。すなわち、本発明の目的は、身体のどこかに微小癌があるか否かを検査すると共に、ＡＬＰアイソザイムパターンの解析と腫瘍マーカーの解析、又は血清蛋白分画の解析を行い、総合的に評価することで、特定の臓器における早期癌を発見するだけではなく、いずれの部位にもある微小癌、臨床癌期の早期癌の高危険群を同定し、進行癌のステージを分類して癌の予防と治療に貢献し、癌患者に関しては治療経過を正しく評価して科学的な対処を提案することができる癌の一生を分類する方法を提供することにある。
換言すると、第１段階で正常と癌の区別を判断し、第２段階で癌と良性腫瘍の区別を判断することにより、癌の一生における前臨床癌期の微小癌と臨床癌期のステージの何れも検出し、その危険度を的確に判定し、分類することができる癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法を提供することにある。
本発明は、人体に発生する微小な癌の動静を発見し、かつその腫瘍の危険度と癌の危険度を前臨床癌期と臨床癌期の２段階に分けてデータ解析するために癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法であって、
前臨床癌期の解析に用いるデータについて、
前記ＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ IからＡＬＰ ＩＶのパターンにおける、ＡＬＰ Ｉの出現とその割合、ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの活性値のデータを収集し、その数値データ比の検討、及びＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの急峻さを示すＡＬＰアイソザイム角度から割り出すＡＰＡから癌細胞の増殖活動についてデータ解析し、
更に、炎症性疾患による原因を回避するために、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定した各数値データから、炎症性疾患においても生じる関与部分の数値データを差し引いて解析することにより、発生する微小癌の存在とその増殖状況についてデータ解析し、
臨床癌期の解析に用いるデータについて、
前記タンパク分画像にあらわれる、アルブミン分画の低下と、
α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画及びγ−グロブリン分画の増加という変化状態のデータを収集し、各データについて解析し、
更に、炎症性疾患による原因を回避するために、前記タンパク分画像のデータ解析の際に、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値のデータを併せて測定し、測定した各数値データから、炎症性疾患においても生じる関与部分の数値データを差し引いて解析することにより、腫瘍の危険度と癌の危険度評価を数段階にデータ解析するために、
緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、該支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液で発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、染色体の形、濃淡に関する各データを採取する、ことを特徴とする。
また、本発明は、人体に発生する微小な癌の動静を発見し、かつその腫瘍の危険度と癌の危険度を前臨床癌期と臨床癌期の２段階に分けてデータ解析するために癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法であって、
前臨床癌期の解析に用いるデータについて、
前記ＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ IからＡＬＰ ＩＶのパターンにおける、ＡＬＰ Ｉの出現とその割合、ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの活性値のデータを収集し、その数値データ比の検討、及びＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの急峻さを示すＡＬＰアイソザイム角度から割り出すＡＰＡから癌細胞の増殖活動についてデータ解析し、
更に、炎症性疾患による原因を回避するために、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定した各数値データから、炎症性疾患においても生じる関与部分の数値データを差し引いて解析することにより、発生する微小癌の存在とその増殖状況についてデータ解析し、
臨床癌期の解析に用いるデータについて、
臨床癌期における１グラム以上になった癌について、
第１期は、アルブミン分画が６５％以上、α1−グロブリン分画が２．５％未満、γ−グロブリン分画が１６％未満のとき、
第２期は、アルブミン分画が６０％〜６５％未満、α1−グロブリン分画が２．５％〜３．０％未満、γ−グロブリン分画が１６％〜２０％未満のとき、
第３期は、アルブミン分画が５５％〜６０％未満、α1−グロブリン分画が３．０％〜４．０％未満、γ−グロブリン分画が２０％〜２３％未満のとき、
第４期は、アルブミン分画が５５％未満、α1−グロブリン分画が４．０％以上、γ一グロブリン分画が２３％以上のときに、癌の危険度を４段階になるように分類データ解析すると共に、
炎症性疾患による原因を回避するために、前記タンパク分画像のデータ解析の際に、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定した各数値データから、炎症性疾患においても生じる関与部分の数値データを差し引いて解析することにより、腫瘍の危険度と癌の危険度評価を数段階にデータ解析するために、
緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、該支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液で発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、染色体の形、濃淡に関する各データを採取する、ことを特徴とする。
前臨床癌期の解析に用いるために、前記ＡＬＰアイソザイムから得られるＡＰＡに関するデータについて、
前記ＡＬＰ ＩＩの陽極側の接線とＡＬＰ ＩＩ 及びＡＬＰ ＩＩＩのピークを結んだ線の角度をθ1 °とし、
この二接線の交点から、ＡＬＰ ＩＩＩのピークまでの距離をω１ｃｍとして、ＡＰＡ＝ω１／θ1 で示し、ＡＬＰ ＩＶが出現しているときに、ＡＬＰ ＩＩの接線との交点とＡＬＰ ＩＩＩ〜ＩＶのピークまでの長さをω２ｃｍとして、ＡＰＡ＝ω２／θ2 であらわすことができる。
前臨床癌期の解析に用いるデータについて、前記血清を５６°Ｃで１０分間熱処理して、ＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶの各ＡＬＰアイソザイムパターンの再構成パターンのデータ解析を行い、ＡＬＰ ＩＩ 、ＡＬＰ ＩＩＩ及びＡＬＰ ＩＶを正確に同定することができる。
また、前臨床癌期の解析に用いるデータについて、前記ＡＬＰアイソザイムの各パターンの変化から癌細胞の増殖活動をデータ解析すると共に、
腫瘍マーカーによる腫瘍の成長レベルを、微小癌もない理想的な状態をステージＩ、ミクログラムレベルの前癌状態をステージＩＩ、ミリグラムレベルの前癌状態をステージＩＩＩ、前臨床癌状態をステージＩＶ、及び１ｇ以上の癌が存在すると推定される状態をステージＶとする５段階の腫瘍成長度ステージについてデータ解析し、
この腫瘍マーカーの経時的変化のデータ解析を併用することにより、微小癌の存在とその増殖状況についてデータ解析することが可能である。
臨床癌期の解析に用いるデータについて、前記Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）の測定値と、前記シアル酸値の測定値の各数値データから、炎症性疾患においても生じる関与部分のα1−グロブリン分画を差し引いて解析する。
前記シアル酸値の測定値の高い測定値に応じてα１−グロブリン分画から、炎症性疾患においても生じる関与部分を差し引いて判定することにより、評価に際して炎症性疾患が原因ではなく癌であると判断する。
本発明の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法では、癌細胞の増殖とＡＰＡの間に密接な関係があるため、これらの採取した各データを用いてＡＬＰアイソザイムパターンを解析することにより、細胞数104 〜109 個の微小癌を検出することができる。このＡＬＰ Ｉがしばしば出現し、癌の進行に伴って、ＡＬＰ Ｉが増加することを見出すことができる。ＡＬＰ ＩＩは、全身性ＡＬＰと称され全ての臓器のＡＬＰで関与も認められるものである。ＡＬＰ ＩＩＩはＡＬＰ総活性が上昇している場合には、造骨新生、肝硬変ならびに慢性腎不全などで、増加することが知られている。ＡＬＰが正常値の範囲内の場合には、ＡＬＰ ＩＩＩは細胞新生のある時、例えば、微小癌の増殖、肝臓の再生時、ならびに進行の遅い臨床癌などの場合に増加するものである。
更に、本発明の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法では、臨床癌で癌の進行が早くなると血中のノイラミニダーゼにより、ＡＬＰ ＩＩＩがＡＬＰ ＩＩに移動し、ＡＬＰ ＩＩＩは減少してくる。このＡＬＰ ＩＩＩは新生細胞の増殖に関連した脱燐酸化作用をもつ修飾酵素である可能性が高い。
本発明の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法では、ＡＬＰ各アイソザイムの再構成パターンの解析により、ＡＬＰ ＩＩ（ＡＬＰ２）、ＡＬＰ ＩＩＩ（ＡＬＰ３）、ＡＬＰ ＩＶ（ＡＬＰ４）を正確かつ高率に同定することができる。特に、ＡＬＰ ＩＶは、癌組織には高率に検出されるにもかかわらず、癌患者の血中ＡＬＰ ＩＶの出現頻度は１〜３０％といわれ、その活性が低くて、見過ごされたり、ＡＬＰ ＩＩＩと誤認されていた。本発明の再構成パターンの解析によりこのＡＬＰ ＩＶを高率に検出できるデータを採取することができる。
本発明の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法では、ＡＬＰアイソザイムパターンの同定が明確でないときに、癌の発生段階を腫瘍マーカーに基づいて腫瘍ステージを分類し、これらのステージ分類モデルを導入したことによって、微小癌から臨床癌に至るまでを正確に評価できるデータを採取することができる。
上述したように、本発明のデータ採取方法で採取した各データを用いることで、ＡＬＰアイソザイムＩが原発性肝癌、肝浸潤、うっ血肝、脂肪肝など総活性が上昇している時に出現し、ＡＬＰ ＩＩが肝性ＡＬＰと称され癌性心のう水の中にも認められ、ＡＬＰ ＩＩＩはＡＬＰ総活性が上昇している場合には、造骨新生や肝硬変ならびに慢性腎不全などで増加するものであり、癌細胞の増殖とＡＬＰ Ｉ〜ＡＬＰ ＩＶのＡＬＰアイソザイムパターンとの間に密接な関係があるため、これらのＡＬＰアイソザイムパターンを解析することにより、細胞数１０4 〜１０9 個の微小癌を検出し、かつその微小癌の危険度を評価することができる。
また、ＡＬＰアイソザイムパターンの同定が明確でないときに、癌の発生段階を腫瘍マーカーに基づいて腫瘍ステージを分類し、これらのステージ分類モデルを導入したことによって、微小癌から臨床癌に至るまでを正確に評価できるデータを採取することができる、等の優れた効果がある。
本発明の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法では、蛋白分画に生化学的生検を加えることにより、癌が臨床癌の１グラム以上になってからの危険度を正確に分類できる。本発明の方法に従って危険度分類をすれば、癌の予防、再発予防、制癌剤の治療効果、癌の進行具合について、ほぼ正確に数字的に解析できるデータを採取することができる。
健康食品がその人に効いているかどうか、食生活が合っているかどうか、癌の治療が適切かどうかを明確に判定できる。癌の手術前後に、ＴＭＣＡ検診をすれば、開腹手術をしなくても、初期癌か、進行癌かについて明確に判定できる。当然、手術をして、その前後でＴＭＣＡ検診の検査結果比較をすれば、癌の切り残しがあったのか、手術が成功したのかについて簡単に判定できるデータを採取することができる。
本発明の癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法は、健康のバロメーターに相当し、併せて、画像診断などで判定していた多くの誤診が確実に防げる。ここでＴＭＣＡ検診とは、後述するように腫瘍マーカー総合診断法をいう。生体内部環境の毒素の総合判定、即ち内部環境汚染の度合いを判定できるデータを採取することができる。これは癌が出す毒素と、いわゆる「腫瘍マーカー」の判定によって総合的に危険度を分類する際に用いるデータを採取する方法である。
なお、タンパク分画像の変化は、慢性炎症性疾患においても生じる現象である。その炎症性疾患による関与割合を回避する必要がある。そこで、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定することが必要である。この測定をすることで、より正確な癌の分類が可能になる。
本発明の癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法は、通常の癌の分類に実施できる。肉腫などでは少し基準が異なるが、本発明の癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法を適用することが可能である。
「前癌期」、「前臨床癌期」、「臨床癌期」の３期に分類される癌の一生を示し、癌細胞の大きさとの相関関係を示す説明図である。 本発明の癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法により「前臨床癌期」と「臨床癌期」における判断方法を示すフロー図である。 実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフである。 実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフと表であり、（ａ）は６０才男性の直腸癌の術前、術後のＡＬＰアイソザイムパターンを示し、（ｂ）は食道癌患者のＡＬＰアイソザイムを示すものである。 実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフと表であり、（ａ）は３３才女性の乳癌（約１ｇ）の単純乳房切除術術前後のマーカーとアイソザイムの変動を示し、（ｂ）は同一患者の再手術前後のＡＬＰアイソザイムを示すものである。 実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法における各アイソザイムの熱処理と再構成実験におけるＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフである。 実施例１の前臨床癌期の分類方法における第ＩＶ期の胆のう癌患者（５０才、女）の血清中の腫瘍マーカーの経時的変化（ａ）と、Δフェリチン値の時間経過を上昇型と不変型と下降型の三型に分類した例（ｂ）を示すものである。 実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法におけるΔフェリチンの上昇型（ａ）と下降型（ｂ）を示すものである。 癌の成長過程とＡＬＰアイソザイムによる５段階評価方法を示す説明図である。 実施例２の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法により、分類した蛋白分画名と、その結果、単位、基準値を示すグラフ図である。 実施例２の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法により、分類した蛋白分画解析図である。 実施例２の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法により、分類したときの早期大腸癌における血清α１−グロブリン×α２−グロブリンの積値の分布状態を示す分布図であり、上段が初期の大腸癌（４０例）、中段が良性腫瘍（３０例）、下段が健常者（５０例）を示す。 実施例２の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法により、分類したときの早期大腸癌における血清ＴＰＡ×α１−グロブリンの積値の分布状態を示す分布図であり、上段が初期の大腸癌（４０例）、中段が良性腫瘍（３０例）、下段が健常者（５０例）を示す。 各種癌症例におけるα１−グロブリン×α２−グロブリンの積値について調べた分布図である。 各種癌症例におけるＴＰＡ×α１−グロブリンの積値について調べた分布図である。 早期大腸癌、大腸良性疾患及び健常人における各腫瘍マーカーの陽性率を示すグラフである。 早期大腸癌、大腸良性疾患及び健常人における各腫瘍マーカーの陽性率を示すグラフである。
本発明の癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法は、臨床癌期の癌を分類するに際して、タンパク分画像にあらわれる、アルブミン分画の低下と、α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画及びγ−グロブリン分画の増加という変化状態を同定することにより、腫瘍の危険度と癌の危険度評価を１〜４段階に分類する際に用いるデータ採取方法である。
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
＜癌の一生のうち「前臨床癌期の微小癌」を分類する際に用いるデータを採取する方法＞
以下、本発明の癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法の好ましい実施の形態について図面を参照して説明する。
図１は「前癌期」、「前臨床癌期」、「臨床癌期」の３期に分類される癌の一生を示し、癌細胞の大きさとの相関関係を示す説明図である。図２は本発明の癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法により「前臨床癌期」と「臨床癌期」における採取したデータを用いて判断する方法を示すフロー図である。図３から図８は実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すものである。
本発明の実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法におけるＡＬＰアイソザイムによる癌の分類方法は、微小癌の存在に係る分化の指標として重要なアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）アイソザイムとΔＣＥＡやΔフェリチン（一定時間あたりの変化）を用いて、生化学的に微小癌の検出（腫瘍マーカーの誘発を含む）し、その分類をする方法である。ＡＬＰは、生体内に広く分布し、エネルギー代謝及び白血球や乳腺の分化と化骨形成及び、再生しつつある結合織にもＡＬＰ活性が高くなるものである。そこで、脱分化あるいは異分化現象として見なされている癌化の過程においてＡＬＰは重要な役割を果たしていると考えられている。即ち、血清中のＡＬＰ総活性が正常値の範囲内で、癌細胞の増殖とＡＬＰ Ｉ〜ＡＬＰ ＩＶのアイソザイムパターンとの間に密接な関係があり、例えば、病理学的見地から細胞数１０6 個が生物学的限界（可逆的段階）ではないかと推定している。実施例１の前臨床癌期の分類方法は、一定時間における腫瘍マーカー値の変化（Δ）とアイソザイムの解析により、細胞数１０4 〜１０9 個（重さにして、１０μｇ〜1ｇ） の微小癌を検出するものである。微小癌は可逆的段階であり、１ｇ以上の臨床癌は不可逆的段階と考えられる。
検出可能な微小癌は細胞数１０4〜１０6個のμｇレベルのミクロガンと細胞数１０6〜１０9個のｍｇレベルのミリガンとに便宜上分類した。本発明のＡＬＰアイソザイムによる癌の評価方法は、緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、該支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液にて発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、染色体の形、濃淡等を判定して、発生する微小な癌の動静を発見し、かつその癌の危険度を分類する方法である。
実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法におけるＡＬＰアイソザイムによる癌の分類方法は、ＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンにおける、ＡＬＰ Ｉの出現とその割合、ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの活性値の比の検討、及びＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの急峻さを示すＡＬＰアイソザイム角度から割り出すＡＰＡから癌細胞の増殖活動を総合的に解析することにより、発生する微小癌の存在とその増殖状況を評価するようになっている。
＜分類方法＞
身体のどこかに微小癌があるか否かをチェックするため、ΔＣＥＡとΔフェリチンとＡＬＰアイソザイムパターンの解析を行い、総合的に判断する。
（１）ΔＣＥＡの定量には微量定量出来る酵素免疫測定法（Ａｂｏｔｔ）を用いた。ＣＥＡは個体差が著明であるが、個人では長時間１．０ｎｇ／ｍｌ以内の変動しかないことはよく知られている。ここで、ＣＥＡ値α1 と一定時間後のＣＥＡ値α2の変化量をΔＣＥＡ＝α2−α1とする。ΔＣＥＡが、０．４±０．１ｎｇ／ｍｌ以上ならば、有意の変動幅とみなすことができる。
（２）Δフェリチンとしては、本発明の実施の形態では、肝由来のものを用いた。例えばフェリチン値β1と一定時間後のフェリチンβ2の変化量をΔフェリチン＝β2−β1とする。４±１ｎｇ／ｍｌ以上ならば、微小癌存在の可能性を推定する。但し、肝実質障害や、膵実質障害あるいは、ヘモクロマトージス等のある場合、フェリチン値が上昇する。一方、鉄欠乏性貧血のある場合、下降するので別途検討が必要である。
図３は実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶ のパターンを示すグラフである。
（３）ＡＬＰアイソザイムの総合判定法ＡＬＰアイソザイムパターンは次の三点から総合的に判定する。
１）ＡＬＰ Ｉの出現とその割合。
２）ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの活性値の比を見る。
３）ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの急峻さを示すＡＬＰアイソザイム角度（ＡＰ−Ａ）。ＡＰ−Ａは次のように測定する（図３参照）。ＡＬＰ ＩＩの陽極側の接線とＡＬＰ ＩＩ及びＡＬＰ ＩＩＩのピークを結んだ線の角度をθ°1とする。この二接線の交点から、ＡＬＰ ＩＩＩのピークまでの距離をω１ｃｍとすればＡＰ−Ａはω１／θ1で示す。ＡＬＰＩＶが出現していると考えられる場合には、ＡＬＰ ＩＩＩの接線との交点とＡＬＰ ＩＩＩ〜ＩＶのピークまでの長さをω２ｃｍとすれば、ＡＰ−Ａはω２／θ2で算定する。
なお、実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法におけるＡＬＰアイソザイムによる癌の分類方法では、炎症性疾患においても生じる現象であるため、その炎症性疾患による関与部分を差し引いて判定する必要がある。そこで、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定することで、より正確な癌の分類が可能になる。
例えば、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）の測定値の高さに応じて、その関与部分をα1−グロブリン分画から差し引いて判定する。シアル酸値の測定値の数値による程度（関与程度）を差し引いて判定する。
次に、本発明の本発明の癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法の実施例について説明する。
図４は実施例１の前臨床癌期の分類方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフと表であり、（ａ）は６０才男性の直腸癌の術前、術後のＡＬＰアイソザイムパターンを示し、（ｂ）は食道癌患者のＡＬＰサイモグラムを示すものである。
症例（１）
６０才男性の直腸癌（第Ｉ期ｐｍＮ0 Ｐ0 Ｈ 0）をＭｉｌｅｓの方法で手術した。手術日をゼロ日として、術前、術後のＡＬＰアイソザイムパターンを総合判定法に従って解析した（図４−（ａ））。ＡＬＰ Ｉは術後４８日目に１％残存しているが、９９日目には消失している。ＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩの比は、手術前ではＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの逆転パターンを示し、１．０以下となっている。一方、手術後、ＡＬＰ ＩＩＩが少なくなり、４８日、９９日には、１．８、１．３と正常値（１．６±０．４）の範囲内に納まってきている。またＡＰ−Ａも術前、段々悪化しているが、一方、手術後４８日目以後、正常値（０．１±０．０１以下）の範囲内に納まっている。手術後、ＡＰ−Ａが正常値に回復するのにかなりの日数が経っているが、これは、切除した直腸癌の周辺に微小癌が残っていて、それが徐々に縮小してゆくのに時間がかかったものと考えられる。
症例（２）
食道癌患者（肝転移をともなう）のＡＬＰサイモグラムを図４（ｂ）に示す。ＡＬＰ総活性は検査期間中、正常範囲内であった。月数が経つに従い、癌は進行し、ＣＥＡ値の増加がみられる（図４−（ｂ））。また、ＡＬＰ Ｉ、ＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩおよびＡＰ−Ａの漸増も認められた。
図５は実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法におけるＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフと表であり、（ａ）は３３才女性の乳癌（約１ｇ）の単純乳房切除術術前後のマーカーとアイソザイムの変動を示し、（ｂ）は同一患者の再手術前後のＡＬＰアイソザイムを示すものである。
症例（３）
３３才女性の乳癌（約１ｇ）の単純乳房切除手術前後のマーカーとＡＬＰアイソザイムの変動を検討した（図５−（ａ））。表の中のΔ値は、α−ＦＰ、ＣＥＡをそれぞれ２ｎｇ／ｍｌ、１．１ｎｇ／ｍｌ（期間中の最小値）を差し引いた値である。外科的切除後、２回だけＩＴＣ療法を行った。図４−（ａ）は、その後、手術部位周辺に散在していた微小癌の１つが徐々に大きくなってゆく経過を示していると考えられる。ＡＬＰアイソザイムの反応は敏速であり、α−ＦＰやＣＥＡは少し遅れて反応しているようである。特にＡＬＰ ＩＩＩが減少してゆく特異なパターンは、ＡＰ−Ａによって、数値的によく把握出来た。ＡＰ−Ａは手術によって少し低下しているが、やがてまた急増して、術後２４日目では、０．２９４となって再発の兆候を示している。
次に、同一患者が９カ月後、手術創の近辺に約０．５ｇの癌を再発して、それを切除した。漢方薬と基本療法を手術一週間前から開始した。再手術前後のＡＬＰアイソザイムの解析を図４−（ｂ）に示す。図中の数字は手術日をゼロとした日数である。ΔＣＥＡとΔフェリチンはそれぞれ、１．７ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌを差し引いた値である。手術直前までに、フェリチンやＣＥＡが増加していることが明らかである。
癌患者の術前、術後の血清ＡＬＰアイソザイムの解析をしてみると、特にＡＬＰ Ｉの出現、及び、ＡＬＰ ＩＩ〜ＩＩＩのパターン変化が癌細胞の増殖活動と密接な関係にあることが示唆された。腫瘍マーカーの経時的変化をチェックすることと、ＡＬＰアイソザイムの解析を併用すれば微小癌の存在と増殖状況の判定が可能と考えられた。
実施例１の前臨床癌期の分類方法における解析について説明する。ＡＬＰ ＩＩ〜ＩＶの各アイソザイムの同定が明確でない現状において、それらのパターンの解析をより正確に行うために、各アイソザイムの熱処理と再構成実験を行った。
＜実験材料及び方法＞
図６は実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法における各アイソザイムの熱処理と再構成実験におけるＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶのパターンを示すグラフである。
実験にはＡＬＰ ＩＩＩが著減してＡＬＰ ＩＩが主体の癌患者血清（図６（ａ）−０）（血清２と略す）とＡＬＰ ＩＩＩが、主体の２才児血清（図６（ｂ）−０）（血清３）と、ＡＬＰ ＩＶが主体の出産直後の妊婦血清（図６（ｃ）−０）（血清４）を用いた。
＜実験の結果＞
各血清の熱処理による効果、図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は各血清を５６°Ｃにて１０分間熱処理したアイソザイムである。（図中の数字は、熱処理した時間を示している。）ＡＬＰ ＩＩは５６°Ｃ、５分間の熱にかなり安定で、急峻なピークであった（図６−（ａ））。
ＡＬＰ ＩＩＩ は５６°Ｃ、１０分間の熱処理によって、大きく阻害され、易熱性である（図６−（ｂ））。また、ＡＬＰ ＩＩＩの円滑なカーブは分子種に幅のあることが示唆された。ＡＬＰ ＩＶは、耐熱性であり、急峻なピークは後期胎盤由来の特徴をよく示している（図６（ｃ））。
再構成実験１（図６（ｄ））：ＡＬＰ ＩＩに注目して、血清２と血清３を色々な割合で組み合わせた血清について、電気泳動し、分析した。ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＩＩの各活性を総活性より算出して、それぞれの活性の割合を求めた。ＡＬＰ ＩＩＩを１、２５、７５、９２％と徐々に増加させるとそれに応じて、ＡＬＰ ＩＩは、９９、７５、２５、８％と減少する。ＡＬＰ ＩＩ、ＩＩＩのピークは、ＡＬＰ ＩＩＩ分画の増加に伴い、丸味を帯びて鈍角になっている。
再構成実験２（図６（ｅ））ＡＬＰ Ｉについて、本実験では無視した。血清２と血清３を混合し、ＡＬＰ ＩＩ３０％、ＡＬＰ ＩＩＩ７０％のアイソザイムパターンを得た（図中で０と表記する）。これは健康成人のパターンと同じものである。血清２と３の割合を一定にし、血清４を徐々に加えて、分析した。ＡＬＰ ＩＶの占める割合（％）が増加するにつれ、肩が出来、二峰性のパターンに変化した。再構成実験１（図６（ａ））と比較すれば、ＡＬＰ ＩＩＩのピークに鋭角な肩のある場合、あるいは、二峰性を示す場合は、ＡＬＰ ＩＶが増加したアイソザイムパターンであることが判る。
再構成実験３（図６（ｆ））：本実験ではＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＶの割合を変化させると、どのようにアイソザイムパターンが変わるかを調べた。ＡＬＰ ＩＩとＡＬＰ ＩＶのパターンはＡＬＰ ＩＶが２５〜７５％の場合、谷の深い急峻な二峰性のパターンになる。
ＡＬＰ各アイソザイムの再構成パターンの解析より、ＡＬＰ ＩＩ、ＡＬＰ ＩＩＩ、ＡＬＰ ＩＶの簡便な同定が可能になった。癌の場合の分子種は多様なので、癌胎児性ＡＬＰの検出には、熱処理によるチェックだけでは検出率は低くなる。従来、癌組織にはＡＬＰ ＩＶが高率に検出されるにもかかわらず、癌患者の血中ＡＬＰ ＩＶの出現頻度は１〜３０％といわれている。この検出率の低い理由は、ＡＬＰ ＩＶの血中漏出に何らかの機作が関与している、可能性とＡＬＰ ＩＶの活性が低くて、見過ごされてきた場合と、ＡＬＰ ＩＩＩと誤認されている場合もかなりあったと考えられる。これらの再構成実験で得られたアイソザイムパターンを参考にして検索すれば、もっと高率にＡＬＰＩＶが検出できる。ＡＬＰ Ｉは原発性肝癌、肝浸潤、うっ血肝、脂肪肝など総活性が上昇している時に出現する。しかし、我々はＡＬＰが正常値の範囲内でも、癌胎児性のＡＬＰ Ｉがしばしば出現し、癌の進行にともなって、ＡＬＰ Ｉが増加することを見出した（図６（ｂ））。
ところで、ＡＬＰ ＩＩは全身性ＡＬＰと云われてきたので基本型ＡＬＰと考えている。ＡＬＰ ＩＩＩはＡＬＰ総活性が上昇している場合には、造骨新生とか肝硬変ならびに慢性腎不全などで、増加することが知られている。ＡＬＰが正常値の範囲内の場合には、ＡＬＰ ＩＩＩ は細胞新生のある時、例えば、微小癌の増殖とか、肝臓の再生時、ならびに進行の遅い臨床癌などの場合に増加する。臨床癌で癌の進行が早くなると血中のノイラミニターゼ活性が働くためか、ＡＬＰ ＩＩＩがＡＬＰ ＩＩに移動してかＡＬＰ ＩＩＩは減少してくる。おそらくＡＬＰ ＩＩＩは新生細胞の増殖に関連した脱燐酸化作用をもつ修飾酵素である可能性が強い。ノイラミニターゼはシアル酸を遊離させる酵素でシアリターゼともいわれており、オリゴ糖からシアル酸（ノイラミン酸）を分離するアシアロ蛋白である。
血清アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）アイソザイム、ΔＣＥＡ、Δフェチリン（一定時間あたりの差）等の腫瘍マーカーによる診断法により微小癌の推定が可能になった。しかし、ＡＬＰ ＩＶの血清中の出現率は１〜３０％程度であるといわれているが、癌組織では、かなりの率でＡＬＰ ＩＶが検出されている。これは、腫瘍マーカーが癌細胞で、産生されても、血中へ出るためには、何らかの機序が介在していることが予想される。そこで、培養癌細胞の腫瘍マーカーをビタミンＡと熱が高める事がｉｎ ｖｉｔｒｏで明らかになっているので、微小癌の存在を確かめる為にビタミンＡと体内深部まで加温効果のある遠赤外線によるハイパーサーミヤを用いて、癌組織由来のマーカーの血中への漏出を高める腫瘍マーカーの誘発法を試みた。
＜方法＞
対象に１５名（男４・女１１）のボランティアを用いた。これらは全て癌を持たない健康と思われる人達で、年齢は２８〜３８才に及んだ。臨床癌の一例として、第IV期の胆のう癌患者（４５才、女）を用いた。誘発は、ビタミンＡ（retinol palmitate）を５００００I Ｕ筋肉注射を行い、一時間後、被検査に遠赤外線によるハイパーサーミア（５６°Ｃ、２０分間）を行った。
＜結果＞
図７は実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法における第ＩＶ期の胆のう癌患者（５０才、女）の血清中の腫瘍マーカーの経時的変化（ａ）と、Δフェリチン値の時間経過を上昇型と不変型と下降型の三型に分類した例（ｂ）を示すものである。
胆嚢癌患者に腫瘍マーカー誘発法を適用し、血清中の腫瘍マーカーの経時的変化を調べた（図７−（ａ））。フェリチンやα−ＦＰは６時間後に急速な血中漏出が認められる。フェリチンは２１３ｎｇ／ｍｌ、α−ＦＰは５０ｎｇ／ｍｌの変動が認められた。
ＣＥＡは４８時間後に僅か０．３ｎｇ／ｍｌしか増加しなかった。次に１５名のボランティアに誘発を適用し、処置前と処置後６、２４、３６、４８時間目に採血して、各時間と処置前との血清フェリチン値の差をΔフェリチン値として、時間経過を、上昇型と不変型と下降型の三型に分類した（図７−（ｂ））。
図８は実施例１の前臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法におけるΔフェリチンの上昇型（ａ）と下降型（ｂ）を示すものである。
不変型の場合（ｎ＝４）変動幅は４ｎｇ以下であった。上昇型（ｎ＝６）は２４時間でΔフェリチン値が上昇しはじめて、４８時間で最高に達する場合が多い。変動幅は７〜１２ｎｇであった。下降型の場合（ｎ＝３）、６時間目で、フェリチンの急速な減少を認めた（７．７ｎｇ／ｍｌ±０．９ｎｇ）。変動幅は７〜１３ｎｇであった。その後、徐々に元の値に戻っている。ここで、前述した我々の方法によるＡＬＰアイソザイムパターンの解析を行った。Δフェリチン不変型の場合、ＡＬＰ ＩＩ／ ＩＩＩの活性比も全く、正常値１．６±０．４の範囲内であり、ＡＰ−Ａも０．１以下で全く正常であった。この不変型は、微小癌以前、恐らく、細胞数にして１０4 個以下の検出不能の段階であり、ほぼ正常者とみなしてよいと考えられた。図８（ａ）に、Δフェリチン上昇型のＡＬＰアイソザイムの解析を示した。図中の数字は、誘発処置後の時間である。
この図表に解析されているように、ＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩの比は３６時間で、異常低値（１．０以下）になり、その後徐々に回復している。誘発法によるＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩ および、ＡＰ−Ａの異常値から、Δフェリチン上昇型は微小癌の存在を示唆する。最後に、下降型について、ＡＬＰアイソザイムの解析を図８（ｂ）に示した。下降型の場合ＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩの比は６時間で異常低値を示し、その後徐々に元に戻っている。ＡＰ−Ａは６時間目以後から正常値に近い値を示している。Δフェリチンと時間的相関関係をもって変動している点から類推すると、恐らく、Δフェリチン下降型は炎症を伴った微小癌の存在を示すのではないかと考えられた。
このように、微小変動といえども同一被検者について、誘発法を行って、ΔＣＥＡが０．４±０．１ｎｇ／ｍｌ以上、Δフェリチン値が４〜７ｎｇ／ｍｌ以上の変動があれば、微小癌としての検索をすすめる必要がある。その上でＡＬＰアイソザイムの解析を行うことによって確かめられる。特に、５６°Ｃ、１０分間の熱処理によって残存する耐熱性ＡＬＰアイソザイム分画の存在をチェックする事と、蛍光分光光度計測定によるＡＬＰ活性（６５°Ｃ、１０分間熱処理）の超微量測定法を行って、耐熱性ＡＬＰ活性を測ることを併用すれば、微小癌の存在は更に確実となる。
臨床癌ではΔＣＥＡが１．０±０．１ｎｇ／ｍｌ以上、Δフェリチン値が２０ｎｇ／ｍｌ以上の変動幅となる。本発明では、臨床癌の誘発パターンで上昇型しか示さなかったが、下降型もかなりの頻度である。ボランティア中の上昇型、下降型は共に臨床癌の誘発パターンを縮小形であると考えられる。下降型と上昇型の微小癌の存在形態の違いが炎症の有無だけなのか、それとも、癌の存在状態が異なるためなのかどうか、今後の検討を要する。当然ながら、フェリチン値の上昇する実質性臓器の炎症ならびに、ヘモクロマトージスなどでは、慎重な検討が必要である。ＬＤＨアイソザイムのパターン解析も重要な資料となる。また血清鉄が低い時はフェリチン値が低く出るので、血清鉄値を正常に戻してから誘発を行う。消化器系の癌ではフェリチン値は低く出る傾向にあるので注意が必要である。又、断食により、フェリチン値の一時的急増が見られる場合がある。肝炎などの単なる炎症の場合は、フェリチン値は急減するだけで、ΔＣＥＡやＡＬＰアイソザイムに異常が認められない。
ビタミンＡと遠赤外線ハイパーサーミヤによりΔフェリチンが上昇するタイプと下降するタイプと不変型に分けられた。不変型は微小癌をも持たない健康人と考えられた。Δフェリチンが４〜２０ｎｇ／ｍｌ、ΔＣＥＡならば０．４〜１．０ｎｇ／ｍｌならば、微小癌の存在を推定できると考えられた。また、ＡＬＰアイソザイムの解析で、（ＡＬＰ活性が正常値の範囲内で）ＡＬＰ Ｉの割合、ＡＬＰ ＩＩ／ＩＩＩの比、ＡＰ−Ａの変化は、微小癌の存在をより確定的なものと出来る。
図９は癌の成長過程とＡＬＰアイソザイムによる５段階評価方法を示す説明図である。
腫瘍マーカーのスクリーニングによる腫瘍の成長レベルを、数段階の腫瘍成長度ステージに分類することにより、見掛け上の健常人に発生する癌を発見し、かつその癌の危険度を評価する。例えば、この腫瘍の成長レベルの分類は、２以上の異常レベルのステージを含むものであり、微小癌もない理想的な状態をステージＩとし、前癌状態をステージＩＩ、ＩＩＩとし、前臨床癌状態をステージＩＶとし、及び１ｇ以上の癌が存在すると推定される状態をステージＶと、する５段階に設定した。
＜癌の一生のうち「臨床癌期の癌」を分類する方法＞
実施例２は癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法における「臨床癌期の癌」を分類する方法である。実施例２の癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法は血清蛋白分画の多変量解析により癌をスクリーニングする方法である。この実施例２の方法によるスクリーニングとは、癌の早期発見により適切な治療法へと導く方法であり、簡易的なスクリーニングの後、精密検査によって確定診断する方法がある場合に行われる。本発明は疾病や障害の有無を最終的に診断することが目的ではなく、確定診断するための精密検査の前段階として実施する方法である。なお、実施例２の「臨床癌期の癌」を分類する方法に際しても、α、β、γなどの記号を用いて、蛋白分画の説明をしているが、実施例１の「前臨床癌期の癌」を分類する方法に使用したα、β、γなどの記号とは異なる意味で用いているものがある。
実施例２の方法は、図２のフロー図に示す「臨床癌期」における判断方法である。実施例２の方法による蛋白分画単独で癌のスクリーニングは、アルブミン［％］、α１−グロブリン分画［％］，α２−グロブリン分画［％］とγ−グロブリン分画［％］の阻み合わせによる多変量解析を行い、腫瘍の危険度と癌の危険度を分類、評価する方法である。
実施例２の分類する際に用いるデータ採取方法では、緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液で発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、染色体の形、濃淡等を判定して、発生する微小な癌の動静を発見し、かつその腫瘍の危険度と癌の危険度を評価する。
実施例２の分類する際に用いるデータ採取方法は、タンパク分画像にあらわれる、アルブミン分画の低下と、α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画及びγ−グロブリン分画の増加という変化状態を同定することにより、腫瘍の危険度と癌の危険度評価を数段階に分類する。
＜アルブミン分画の説明＞
実施例２の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法では、アルブミン、α１−グロブリン分画（多くの免疫抑制物質）を用いる。特にα１−グロブリン分画は良好なパラメータとして機能する。なお、タンパク分画像の変化は、炎症性疾患においても生じる現象であるため、その炎症性疾患による場合を回避する必要がある。そこで、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定することで、より正確な癌の分類が可能になる。
例えば、肝硬変と慢性肝炎の場合、アルブミン減少とγ−グロブリンが増加する傾向にある。アルブミンは、肝臓で生成されて、血液の浸透圧の調整に利用され、ホルモンと有害物質を運ぶ際に用いられる物質である。アルブミンは多くの病気があるときに減少する性質がある。
＜グロブリン分画の説明＞
（１）α１−グロブリン分画
α１−グロブリン分画は、炎症、癌、ストレスとリウマチ性疾患の急性相のこの分画が増加する。Antitrypsin、α１に溶けるグリコプロテイン、プロトロンビン、キモトリプシン、エラスターゼとプロテアーゼは、この分画に含まれる。ここの２つの酵素は顆粒白血球が破壊することができる多形核球から作り出される肺組織、妨げられて、このように、人の中のα１アンチトリプシンの主役は肺組織の保護であるように見える。なお、ＡＦＰは、この分画に含まれる。
（２）α２−グロブリン分画
α２−グロブリン分画は、α２−ＨＳグロブリン分画、セルロプラスミン、erythropoetin、コリンエステラーゼ、接触グロブリン、α２−マクログロブリンはこの分画に含まれる。aptoglobulinはヘモグロビンと結合して、血液循環に回送されて、非特異性のストレス反応が増加する。慢性のタンパク質損失のα２−マクログロブリンが増加する。酸化性酵素に鉄を付加させて、トランスフェリンで鉄の輸送を促進する肝臓とで、セルロプラスミンは生み出される。
α２−ＨＳグリコプロテインは、非特定のオプソニンであると考えられる。
（３）β−グロブリン分画
β−グロブリン分画は、トランスフェリン、βリポタンパク質、補体（Complements）とhemopexinは、この分画に含まれる。トランスフェリンは肝臓で生産されて、鉄の輸送機関と相関している、そして、この分画の６０%はこのメカニズムによるとされている。脂質は細胞膜の前駆細胞としての統合するような役割をし、ステロイドと胆汁酸、これらの間で、最大の断片はβリポタンパク質である。
Hemopexinは、鉄の核でヘムを作るヘモグロビン分子で活用する。Complementsは、感染に対する血清タンパク質の複雑なシステムである。
（４）γ−グロブリン分画
γ−グロブリン分画は、ＩｇＡ、ＩｇＧとＩｇＭは、この分画に含まれまれる。ＩｇＡの分画において、抗毒素、抗菌性凝集素、冷たいagglutinとisoagglutinは、含まれる。これは、saliveryと相関している。
ＩｇＧは、バクテリア、ウイルスと毒素の抗体を含む。この分画は、急性および慢性の疾病ので増加する。多くの病気でＩｇＭは増加する。
図１０は蛋白分画名と、その結果、単位、基準値を示し、各蛋白分画の変異点にチェックを入れ、それぞれの面積比を表すグラフ図である。図１１は各蛋白分画の解析図である。
蛋白分画と、その結果、単位、基準値は図示と表１に示すように、分画Ｎｏ．１は、アルブミン分画（Ａｌｂ）、蛋白分画結果が５８．７、基準値が５５．８〜６６．１を示す。
分画Ｎｏ．２は、α１−グロブリン分画（α１−Ｇ）、蛋白分画結果が３．１、基準値が２．９〜４．９を示す。
分画Ｎｏ．３は、α２−グロブリン分画（α２−Ｇ）、蛋白分画結果が８．７、基準値が７．１〜１１．８を示す。
分画Ｎｏ．４は、β１−グロブリン分画（β１−Ｇ）、蛋白分画結果が６．１、基準値が７．７〜７．２を示す。
分画Ｎｏ．５はβ２−グロブリン分画（β２−Ｇ）、蛋白分画結果が３．７、基準値が３．２〜６．５を示す。
分画Ｎｏ．６はγ−グロブリン分画（γ−Ｇ）、蛋白分画結果が１９．７、基準値が１１．１〜１８．８を示す。
＜４期に分類する方法＞
上記表１、図１１、図１２の結果に基づいて、実施例２の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法では、癌の一生について１グラム以上になった臨床癌期の癌について４期に分類する。例えば、臨床癌期における癌の危険度について次のように分類する。
第１期は、アルブミン分画が６５％以上、α1−グロブリン分画が２．５％未満、γ−グロブリン分画が１６％未満のとき、
第２期は、アルブミン分画が６０％〜６５％未満、α1−グロブリン分画が２．５％〜３．０％未満、γ−グロブリン分画が１６％〜２０％未満のとき、
第３期は、アルブミン分画が５５％〜６０％未満、α1−グロブリン分画が３．０％〜４．０％未満、γ−グロブリン分画が２０％〜２３％未満のとき、
第４期は、アルブミン分画が５５％未満、α1−グロブリン分画が４．０％以上、γ一グロブリン分画が２３％以上のときに、癌の危険度を４段階に分類する。
なお、これらの数値は例示であって、この数値に限定されない。
このように、実施例２の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法では、蛋白分画の生化学的生検を加えることにより、癌が、臨床癌、１グラム以上になってからの癌のステージを正確に分類できる。本発明の分類方法に従って癌のステージ分類をすれば、癌の予防も、再発予防も、制癌剤の治療効果も、癌の進行具合も、ほぼ正確に、数字的に解析できる。健康食品がその人に効いているかどうか、食生活があっているかどうか、癌の治療が適切かどうか、癌の手術前後に、ＴＭＣＡ検診をすれば、開腹手術をしなくても、初期癌か、進行癌か、明確に判定できる。当然、手術をして、手術後にＴＭＣＡ検診をすれば、癌の切り残しがあったのか、手術が成功したのかも確実に判定できる。
ＴＭＣＡ法（tumor marker combination assay）とは、生体内（内部環境）の毒素を総合判定する方法である。この方法は、癌が出す毒素（腫瘍マーカー）の判定によって総合的に危険度を分類し、それを健康度分類として利用できるものである。この検診はもともと癌の予知診断を行える唯一の検査法ということで注目を集めてきた。このＴＭＣＡ法はわずか２０ccの採血と簡単な東洋医学的検査のみで、癌の危険度を「臨床癌」から「理想的健康状態」まで５段階に正確に分類する方法である。
生体内部環境の健康度分類は、一人ひとりの健康状態を未病の段階で判定できる。これは運動、健康食品等、各人の生活習慣が、より健康の方向を向いているのか、不健康の方向に行っているのか、客観的に判定できる極めて有効な方法である。
実施例２の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法は、健康のバロメーターに相当し、併せて不充分な画像診断などだけで判定していた多くの誤診が確実に防げる。
なお、タンパク分画像の変化は、炎症性疾患においても生じる現象であるため、その炎症性疾患による関与割合を回避する必要がある。そこで、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定することで、より正確な癌の分類が可能になる。
Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）の測定値の高さに応じて、その関与部分をα1−グロブリン分画から差し引いて判定し、シアル酸値の測定値の高い測定値に応じてα1−グロブリン分画から差し引いて判定することにより、評価に際して炎症性の関与部分を除いて、癌の危険度を分類できる。
本発明の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法は、通常の癌の分類に実施できる。肉腫などでは少し基準が異なるが、本発明の臨床癌期の分類方法を適用することも可能である。
＜試験＞
次に、本発明の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法による試験例について説明する。
本発明の癌の一生を分類する際に用いるデータ採取方法は、そこで腫瘍マーカーによる早期癌と良性の鑑別診断能を向上させるためにいくつかの試みをした。その中で血清蛋白分画（immuno−regulatory α−ｇlobulinと組織ポリペプチド抗原（tissue po1ypeptide antigen（ＴＰＡ））を組み合わせ、α1−グロブリン×α２−グロブリンの積値およびＴＰＡ×α1−グロブリンの積値の腫瘍マーカーとしての臨床的有用性を評価した。α１−グロブリン、α２−グロブリン分画は癌の増殖を反映する。多変量解析の導入により癌のスクリーニングに有用である。またＴＰＡは各種の癌組織に含まれ血中に漏出されるtumor−specific並びにgrowth−related tumor marker（細胞の増殖力を反映）として知られている。
＜対象および方法＞
対象は（１）血清１２０検体（早期大腸癌４０、良性大腸疾患３０、健常５０、年齢は各々６３．２±１２．８平均±標準偏差（mean±SD）、６１．８±１４．１、６０．８±１２．１、男女同数ずつ）と、
（２）癌患者２３７例（乳癌５８、胃癌３８、直腸結腸癌２９、肺癌２０、子宮癌１８、卵巣癌１５、咽頭咽頭癌７、脾癌５、肝癌４、舌癌１、その他２９）、良性疾患１００例、および健常人（年齢２２−８１歳、４６．４±１３．５、男女比２：３）５０例とした。
α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画はセルロースアセテート電気泳動法による血清蛋白分画法，血清ＴＰＡはＲＩＡ 二抗体法を用いて測定した。α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画、ＴＰＡを同時測定し、α１×α２ 積値およびＴＰＡ×α１積値を計算し、各症例における積値の分布、陽性率、ｍｅａｎ±ＳＤを求めた。さらに対象（２）においては癌症例を臨床進行度別（Ｉ−ＩＶ期）に分類し、各stageにおける陽性率および平均±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）を対比した。
＜測定結果＞
図１２は実施例２の臨床癌期を分類する際に用いるデータ採取方法により、分類したときの早期大腸癌における血清α１−グロブリン×α２−グロブリンの積値の分布状態を示す分布図であり、上段が初期の大腸癌（４０例）、中段が良性腫瘍（３０例）、下段が健常者（５０例）を示す。図１３は実施例２の臨床癌期の分類方法により、分類したときの早期大腸癌における血清ＴＰＡ×α１−グロブリンの積値の分布状態を示す分布図であり、上段が初期の大腸癌（４０例）、中段が良性腫瘍（３０例）、下段が健常者（５０例）を示す。
早期大腸癌におけるα１−グロブリン×α２−グロブリンの積値、ＴＰＡ×α１−グロブリンの積値の分布を調べた。ここで健常者例のｍｅａｎ＋ＳＤはα１×α２が３０．０、ＴＰＡ×α１が４１ｌ．８となり、ｃｕｔ ｏｆｆ値を各々３０および５００に設定した。α１−グロブリン×α２−グロブリンの各疾患別のｍｅａｎ±ＳＤおよび陽性率は
早期大腸癌：３４．８（±１６．７）、（４８％）、
良性大腸疾患：２７．５（±９．８）、（２０％）、
健常者：２０．９（±４．５）、２％）であり、３者間には各々有意差が認められた。
ＴＰＡ×α１−グロブリンについては
早期大腸癌：５２７．８（±３５３．６）、（５３％）、
良性大腸疾患：３９３．３（±１９５）、（２３％）、
健常：２５ｌ．５（±８０．２）、（２％）であり、３者間には各々有意差が認められた。
次にα１−グロブリン×α２−グロブリン、ＴＰＡ×α１−グロブリンをCombination assayすると早期大腸癌では．表２に示すように、いずれか一方でも陽性を示したのは６８％であり、各々単独の場合より陽性率が高くなった。両者ともに陽牲例，および両者ともに陰性例はともに３２．５％（１３／４０）であり、両者ともに上昇する傾向がみられた。健常群のspecificityは９６％と高いが，良性群では６７％とやや低下した。
＜各種癌症例の結果＞
図１４は各種癌症例におけるα１−グロブリン×α２−グロブリンの積値について調べた分布図である。図１５は各種癌症例におけるＴＰＡ×α１−グロブリンの積値について調べた分布図である。
検体について各種癌症例におけるα１−グロブリン×α２−グロブリンの積値、ＴＰＡ×α１−グロブリンの積値の分布を調べた。両者とも陽性率は癌の部位に関係なく、癌の進行に伴ない上昇した。ちなみに癌の進行度とｍｅａｎ±ＳＤ，陽性率（表３）との関連をみた。
α１−グロブリン×α２−グロブリンについては
Ｉ期：１７．３（±６．ｌ）、
ＩＩ期：２２．５（±１０．２）、
ＩＩＩ期：２８．８（±１２．６）、
ＩＶ期：４４．３（±３２．９）であり、
陽性率は各々６，１７，３８．７９％と上昇した。良性疾患と健常者のｍｅａｎ±ＳＤは各々１７．９±４．６および１７．７±３．０ 偽陽性率は１及び０％であり、両者間に有意差は認めなかったが、癌群（Ｉ期を除く）との間に有意差を認めた。
ＴＰＡ×α１−グロブリンについては、
Ｉ期：３０８．５（±４０３．２）、
ＩＩ期：３５６．６（±２３６．５）、
ＩＩＩ期： ７２３．５（±１０１２．４）、
ＩＶ期：３１３２．２（±５６２４．２）であり、
陽牲率は各々６，１４，４４．７６％と上昇した。良性と健常のｍｅａｎ±ＳＤは各々２２３．６±９０．０および２０５．９（±４０．７）、偽陽牲率は１及び０％であり、両者間に有意差は認めなかったが、癌群との間に有意差を認めた。
次にα１−グロブリン×α２−グロブリンとＴＰＡ×α１−グロブリンをcombination assayすると、いずれか一方でも陽性を示したものは癌の進行にともない、
Ｉ（期）：１１（％）、
ＩＩ（期）：２６、
ＩＩＩ（期）：５８、
ＩＶ（期）：８８と上昇し、また各stageごとにみると各々単独の場合より陽性率がさらに高上した。良性および健常では２および０％であり、早期癌を含む癌群との間に有意差を認めた。
なお当施設の健常群におけるｍｅａｎ十２ＳＤは、α１×α２：２３．８、ＴＰＡ×α１：２８７．３であった。
α１−グロブリン×α２−グロブリンの積値、ＴＰＡ×α１−グロブリンの積値は各種癌症例において平均値・陽性率とも癌の進行にともない上昇し，腫瘍マーカーとしての有用性が示唆された。特に両者のCombination assayでは陽性率がさらに高上し、早期癌と良性の鑑別診断においても有用であり，スクリーニングへの適用が期待される。
＜判別関数の決定＞
１．判別関数の決定
次に、本発明の実施例２の癌を分類する際に用いるデータ採取方法を用いて、形態学的に癌と診断された１００例と、癌と診断されなかった１００例を無作為に抽出し、それぞれ患者群、健常群として試験してみた。これを標本Ａとする。
解析Ｉ：標本Ａのデータをそのまま解析した。
解析ＩＩ：標本Ａのデータのうち肝疾患・境界域値、および特に異常な値を除く患者群．健常群それぞれ５０例を選択し解析した。
解析ＩＩＩ：標本Ａのうち各測定値を正常範囲（Ａｌｂ≧５８．０，ａｌ≦３．０、α２≦９．０とする〉からの距離（ｃｕｔ ｏｆｆ値からの距離）に変換したデータ（それぞれ（Ａｌｂ）’−（ａｌ）′．（α２）′とする）を解析した。Ａｌｂを例にすると、５８．０より大きな値は、すべて０．５７は１．０に、５６．０は２．０にそれぞれ変換される。
なお解析には、コンピュータを用い、データを入力することにより、判別式の各係数、各々の値分布、相関性などが得られるプログラムを利用し判別関数を決定した。
＜得られた判別関数の検定＞
上記標本Ａとは別に患者群・健常群それぞれ１００例を無作為に抽出して標本Ｂとした。それぞれの判別関数を検定した。
＜得られた判別関数の臨床応用＞
更に他から供与された検体（健康体１５例、初期肺癌２０例、初期大腸癌２０例、良性腫瘍は除く）について、上記判別関数の決定により得られた判別関数により癌診断を行った。
＜計算式＞
実施例２の癌を分類する際に用いるデータ採取方法に用いる計算式は、次に数１に示す数式が有用と考えられた。
この数１の数式においてＺ≧０のとき健常人（正常）と、Ｚ＜０のとき癌と判定する。
癌を癌と判定する有病正診率（sensibitinity：以下serと略）、健常を健常と判定する無病正診率（specificity：以下speと略）、両者の総和の正診率は、数１の数式を決定する際の標本ＡではＳｅｎ６４％、ｓｐｅ９１％、正診率７７．５％であった。また標本Ｂの検定ではＳｅｎ７５%、ｓｐｅ９２％、正診率８３．５％であった。その他の別の検体ではＳｅｎ９７．６%、ｓｐｅ２６．７％、正診率７８％であった。
実施例２の癌を分類する際に用いるデータ採取方法では、血清蛋白分画の多変量解析を用いることにより 良好な正診率が得られた。これは癌の成長に伴い、個人個人の各分画に異常が現れるが、それらを総合的に判断可能にしたためと考えられた。
２）従来の文献ではアルブミンとα２−グロブリンを用い、人間ドック対象者に対し肺癌の判別を行った時、５５．２％判別能があったとの報告がある。これにα１−グロブリンを加えると正診率はさらに上昇ことがわかった。実施例２の分類方法ではアルブミンとα１−グロブリンとα２−グロブリンを用いたが、β−グロブリン分画は癌の判別には効果は薄く、他にも同様の効果がある。
＜蛋白分画の生化学的バイオプシー＞
蛋白分画について生化学的バイオプシーを実施した。即ち、蛋白分画について生体の組織や臓器の一部を採取して、病気を診断する解析をした。この生化学的バイオプシーは、悪性腫瘍である癌が疑われる患者に行われることができ、皮膚や胃、腸、肝臓、肺、腎臓などの組織を使って病理的に診断されるものと同じである。
蛋白分画は電気泳動で５つの基本的バンドに電気泳動される。その中で、アルブミン、α1−グロブリン分画、α２−グロブリン分画が癌の成長との関係が深い。第１のバンドはアルブミンである。肝臓で特徴的に産生されて血液の浸透圧を調整し、物質の輸送と蛋白の保全に役立つ。肝臓病、腎臓病、全身病でアルブミンが減少する。
第２のバンドはα1−グロブリン分画である。この中にはα１−アンチトリプシンが７０〜９０％ある。α１−酸性糖蛋白か、α1−リポ蛋白、プロトロンビン、トランスコーテン、テロキシン結合性グロブリンが含まれる。
α１の分画の増加は炎症、癌、ストレス、出血性異常の急性反応として生じる。
α１−酸性糖蛋白は肝炎、腎障害、カヘキシアで減少する。
α１−アンチトリプシンは蛋白分解酵素に対する代表的なプロテアーゼインヒビターであります。α１胎児性蛋白はこのバンドに生じる。
α２−グロブリン分画には、ハプトグロブリン、α２−マクログロブリン、α２−ＨＳ糖蛋白、セルロプラスミン、エリスロポエチン、コリンエステラーゼが含まれている。
ハプトグロブリンはヘモグロビンと結合するように働く。
ハプトグロブリンは癌の初期に増加する。α２−マクログロブリンはα２バンドの前傾に現れる。α２ＨＳグロブリン糖蛋白は非特異的なオプソニンの可能性がある。
なお、本発明は、身体のどこかに微小癌があるか否かを検査すると共に、ＡＬＰアイソザイムパターンの解析と腫瘍マーカーの解析、及び血清蛋白分画の解析を行い、総合的に評価することで、特定の臓器における早期癌を発見するだけではなく、いずれの部位にもある微小癌、臨床癌期の早期癌の高危険群を同定し、進行癌のステージを分類して癌の予防と治療に貢献し、既往症に関しては治療経過を正しく評価して科学的な対処を提案することができれば、上述した発明の実施の形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変更できることは勿論である。
また、癌の一生における前臨床癌期の微小癌と臨床癌期のステージの何れも検出し、その危険度を的確に判定し、分類することができれば、上述した発明の実施の形態に限定されず、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々変更できる。
本発明は、癌の一生における前臨床癌期の微小癌と臨床癌期の早期癌の発見に用いるデータの何れも検出し、その危険度を的確に判定し、分類することに利用することができる。本発明は、癌の一生を測るバロメーターとして利用することができる。換言すると、人類の最大の敵であった癌の一生を逆手に取ることで、真の健康のバロメーターとして利用することができる。

Claims (7)

  1. 緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、該支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液で発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、染色体の形、濃淡等を判定して、発生する微小な癌の動静を発見し、かつその腫瘍の危険度と癌の危険度を評価して癌の一生を分類する方法であって、
    前記ＡＬＰアイソザイムのＡＬＰ IからＡＬＰ ＩＶ のパターンにおける、ＡＬＰ Ｉの出現とその割合、ＡＬＰ ＩＩ とＡＬＰ ＩＩＩの活性値の比の検討、及びＡＬＰ ＩＩ とＡＬＰ ＩＩＩの急峻さを示すＡＬＰアイソザイム角度から割り出すＡＰＡから癌細胞の増殖活動を総合的に解析し、
    更に、炎症性疾患による原因を回避するために、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定し、当該部分を差し引いて判断することにより、発生する微小癌の存在とその増殖状況を評価する、ことを特徴とする癌の一生を分類する方法。
  2. 前記ＡＬＰアイソザイムから得られるＡＰＡは、
    前記ＡＬＰ ＩＩの陽極側の接線とＡＬＰ ＩＩ 及びＡＬＰ ＩＩＩのピークを結んだ線の角度をθ1 °とし、
    この二接線の交点から、ＡＬＰ ＩＩＩのピークまでの距離をω１ｃｍとして、ＡＰＡ＝ω１／θ1 で示し、ＡＬＰ ＩＶが出現しているときに、ＡＬＰ ＩＩの接線との交点とＡＬＰ ＩＩＩ〜ＩＶのピークまでの長さをω２ｃｍとして、ＡＰＡ＝ω２／θ2 であらわすこと、を特徴とする請求項１の癌の一生を分類する方法。
  3. 前記血清を５６°Ｃで１０分間熱処理して、ＡＬＰ ＩからＡＬＰ ＩＶの各ＡＬＰアイソザイムパターンの再構成パターンの解析を行い、ＡＬＰ ＩＩ 、ＡＬＰ ＩＩＩ及びＡＬＰ ＩＶを正確に同定する、ことを特徴とする請求項１又は２の癌の一生を分類する方法。
  4. 前記ＡＬＰアイソザイムの各パターンの変化から癌細胞の増殖活動を解析すると共に、
    腫瘍マーカーによる腫瘍の成長レベルを、微小癌もない理想的な状態をステージＩ、ミクログラムレベルの前癌状態をステージＩＩ、ミリグラムレベルの前癌状態をステージＩＩＩ、前臨床癌状態をステージＩＶ、及び１ｇ以上の癌が存在すると推定される状態をステージＶとする５段階の腫瘍成長度ステージに分類し、
    この腫瘍マーカーの経時的変化の解析を併用することにより、微小癌の存在とその増殖状況の判定をすること、を特徴とする請求項３の癌の一生を分類する方法。
  5. 緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、該支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液で発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、その内容、濃淡等を判定して、発生する微小な癌の動静を発見し、かつその腫瘍の危険度と癌の危険度を評価して癌の一生を分類する方法であって、
    前記タンパク分画像にあらわれる、アルブミン分画の低下と、
    α１−グロブリン分画、α２−グロブリン分画及びγ−グロブリン分画の増加という変化状態を判定し、
    更に、炎症性疾患による原因を回避するために、前記タンパク分画像の評価の際に、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定し、当該部分を差し引いて判断することにより、腫瘍の危険度と癌の危険度評価を数段階に分類する、ことを特徴とする癌の一生を分類する方法。
  6. 緩衝液に浸漬しておいた支持体に血清を塗布し、該支持体を所定の液温で電気泳動して分画し、血清中のタンパクを分離して、ＡＬＰアイソザイム染色液で発色させてＡＬＰアイソザイムを検出し、そのタンパク分画像と、ＡＬＰアイソザイムを合わせ、各アイソザイムの移動度、その内容、濃淡等を判定して、発生する微小な癌の動静を発見し、かつその腫瘍の危険度と癌の危険度を評価して癌の一生を分類する方法であって、
    臨床癌期における１グラム以上になった癌について、
    第１期は、アルブミン分画が６５％以上、α1−グロブリン分画が２．５％未満、γ−グロブリン分画が１６％未満のとき、
    第２期は、アルブミン分画が６０％〜６５％未満、α1−グロブリン分画が２．５％〜３．０％未満、γ−グロブリン分画が１６％〜２０％未満のとき、
    第３期は、アルブミン分画が５５％〜６０％未満、α1−グロブリン分画が３．０％〜４．０％未満、γ−グロブリン分画が２０％〜２３％未満のとき、
    第４期は、アルブミン分画が５５％未満、α1−グロブリン分画が４．０％以上、γ一グロブリン分画が２３％以上のときに、癌の危険度を４段階に分類すると共に、
    炎症性疾患による原因を回避するために、前記タンパク分画像の評価の際に、Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）と、シアル酸値を併せて測定し、当該部分を差し引いて判断することにより、腫瘍の危険度と癌の危険度評価をする、ことを特徴とする癌の一生を分類する方法。
  7. 前記Ｃリアクティブ・プロテイン値（Ｃ炎症性蛋白値、ＣＲＰ値）の測定値と、前記シアル酸値の測定値の各数値に応じて、α1−グロブリン分画を差し引いて判定する、ことを特徴とする請求項１、５又は６の癌の一生を分類する方法。
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