JP2017151111A - 血漿レニンの質量分析法 - Google Patents
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Abstract
Description
et al.,Horm Res.37:171−175(1992)参照)。典型的放射免疫測定法は、それぞれ、同濃度の標識抗原および特異抗体を含有する、一連の標準物質と未知の混合物を試験管内に同時調製することによって行われる。適切な反応時間後、標識抗原の抗体結合画分(B)と遊離(F)画分とは、種々の技術のうちの1つによって分離される。標準物質中のB/F比は、非標識抗原の濃度の関数としてプロットされ(標準曲線)、抗原の未知の濃度は、観察されたB/F比を標準曲線と比較することによって決定される。放射免疫測定法は、競合的結合原理に基づいており、使用される抗体は、内因性アンジオテンシン等の他の血漿タンパク質との非特異的結合を受け得る。この潜在的交差反応性は、PRAの過大評価を生じさせ得る。別のアプローチは、RIAによる定量化前に、HPLCを使用して、Ang1を他のアンジオテンシンから単離するものである(Meng et al.,J.Am.Soc.Nephrol.6:1209−1215(1995);Meng et al.,J.Chromatogr.21、614(1):19−25(1993);Kohara et al.,Peptides 12:1135−1141(1991)の例を参照)。Ang1の定量化のためのこれらのHPLC法は、紫外線、蛍光、および質量分析計による検出を使用して開発されてきた(Klickstein et al.Anal Biochem 120:146−150(1982);Miyazaki et al.J Chromatogr。490:43−51(1989)and Fredline et al.Clin.Chem.45:659−664(1999)の例を参照)。
メチルスルホニル(PMSF))の存在下で血漿試料をインキュベーションし、649の(m/z)を有する前駆体イオンの衝突誘起解離を観察することによって、インキュベーション中に生成されたアンジオテンシン1の量を測定する。
ンジオテンシン1の量の測定を提供する。ある実施形態では、分解標準物質を使用して、その生成後のアンジオテンシン1の分解度を決定してもよい。
アンジオテンシン1の分解度を決定してもよい。
ベーションするステップと、(b)液体クロマトグラフィーによって、試料中のアンジオテンシン1を精製するステップと、(c)精製されたアンジオテンシン1をイオン化して、質量分析法によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するステップと、(d)質量分析法によって、アンジオテンシン1イオンの量を検出するステップであって、イオンは、433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5、および1297±0.5の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択されるステップと、(e)検出されたイオンの量を使用して、試料中のアンジオテンシン1の量を測定するステップと、(f)試料中のアンジオテンシン1の量を使用して、試料中のレニン活性を計算するステップと、を含む。ある実施形態では、この方法の定量限界は、0.1ng/mL以下、例えば、0.05ng/mL以下、例えば、約0.03ng/mLである。ある実施形態では、インキュベーションは、水安定性プロテアーゼ阻害剤の存在下において行う。好ましい関連実施形態では、水安定性プロテアーゼ阻害剤は、フッ化アミノエチルベンジルスルホニルである。ある実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)である。ある実施形態では、この方法のステップ(b)は、固相抽出カラムによって、アンジオテンシン1を精製するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、アンジオテンシン1イオンの量は、内部標準物質との比較によって、試験試料中のアンジオテンシン1の量と関連付けられる。ある実施形態では、分解標準物質を使用して、その生成後のアンジオテンシン1の分解度を決定してもよい。
れ、窒素原子が15N同位体と置換されており、天然アンジオテンシン1と比較して6Daの質量の増加をもたらす、バリンサブユニットを有する。好ましい関連実施形態では、同位体標識アンジオテンシン1は、炭素原子が13C同位体と置換され、窒素原子が15N同位体と置換されているバリンおよびイソロイシンサブユニットを有する。この同位体標識アンジオテンシン1の質量は、通常、天然アンジオテンシン1より13Da高い。
ムと組み合わせて使用されてもよい。例えば、試料は、TFLC抽出カラムで精製後、HPLC分析カラムでさらに精製されてもよい。
される。好ましい実施形態では、分析カラムは、直径約4μmの粒子を含有する。
Attachment And Release For Desorption And Detecton Of Analytes」、Wright et al.,Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2:264−76(1999)、およびMerchant and Weinberger,Electrophoresis 21:1164−67(2000)を参照されたい。
向流を使用して、溶媒の除去を向上させてもよい。APCIにおける気相イオン化は、低極性種を分析するために、ESIよりも効果的であり得る。
ストステロン等の非極性化合物は、通常、M+を形成する。例えば、Robb et al.,Atmospheric pressure photoionization:An ionization method for liquid chromatography−mass spectrometry.Anal.Chem.72(15):3653−59(2000)を参照されたい。
化するための方法について、説明する。この方法は、液体クロマトグラフィー(LC)、最も好ましくは、HPLCを利用して、選択された検体の精製を行い、この精製を固有の質量分析法(MS)と組み合わせ、それによって、試験試料中のアンジオテンシン1を検出および定量化するための高スループットアッセイシステムを提供する。好ましい実施形態は、自動PRAアッセイのための大規模臨床実験における用途に特に好適である。本発明により提供される方法は、感度を向上させ、他のPRAアッセイにおいて必要とされるものよりも短時間かつ少ない調製試料で行うことができる。
形態では、SPEカラムおよびHPLCによる試料の精製は、移動相として、水中0.1%のHPLC等級超純粋ギ酸およびアセトニトリル中0.1%のギ酸を使用して行われてもよい。好ましくは、これらの実施形態で使用されるSPEカラムは、血漿からアンジオテンシンの80%超を回収可能である。
濾過または走査されてもよい。
(Q2)内へと通過することができるが、任意の他の質量/電荷比を有する望ましくないイオンは、四重極の両側に衝突して排除される。Q2に流入する前駆体イオンは、中性衝突ガス分子、例えば、アルゴンガス分子と衝突し、断片化する。このプロセスは、衝突活性化解離(CAD)と呼ばれる。生成された断片イオンは、四重極3(Q3)内へと通過し、ここでは、アンジオテンシン1の断片イオンが選択されるが、他のイオンは排除される。
ができる。分解標準物質は、1つ以上の13Cおよび/または15N標識アミノ酸が組み込まれた合成ペプチドであってもよい。これは、イオン化されたときに、非標識アンジオテンシン1および内部標準物質のイオン化により生成されるイオンとは異なるm/zを有する、少なくとも1つのイオンを生成する。そのような実施形態における分解係数の計算は、さらなる考慮を必要とする。%分解は、以下のように計算することができる。
試薬:アンジオテンシン1、フッ化アミノエチルベンジルスルホニル(AEBSF)、ウシ血清アルブミン(プロテアーゼ無し)、無水マレイン酸、リン酸緩衝生理食塩水錠剤(PBS錠剤)、ギ酸、およびBio−Rad Lyphocheck対照は、それぞれの供給者から購入した。同位体標識Ang1標準物質はカスタム合成した。内部標準物質は、質量差+6Daとなるように、天然バリンを13Cおよび15N原子を含有するバリンと全置換した単一同位体標識Ang1である。同様に、アッセイで使用される分解標準物質は、質量差+13Daとなるように、天然バリンとイソロイシンを13Cおよび15N原子を含有するバリンとイソロイシンと全置換した二重同位体標識Ang1である。
疑似血清を使用したマトリクスに既知の量のアンジオテンシン1を注入することによって、較正物質を調製した。較正系の濃度は、0.0(空包)、0.14、0.27、1.1、2.19、8.79、35.15、および43.2ng/mLとした。QCプールは、1.1、8.7、および35ng/mLで調製した。対照は、BioRadから入手し、高、中、低レニン活性の試料からなる。品質保証のために、QCプールおよび較正物質は、各試料バッチごとに用いた。
送風機または室温水浴を使用して、凍結試料を急速に室温に戻した。急速解凍は、プロレニンからレニンへの低温活性化を防止するために重要であるため、標本を断続的に反転されて解凍プロセスを加速させた。解凍後、試料を室温で静置した。全血漿試料は、試験前に十分にボルテックスした。
250uLのEDTA血漿を、25uLの生成カクテル(マレイン酸0.275M、AEBSF1mM、分解標準物質4uM)と混合した。約1−3時間、約37℃で試料をインキュベーションし、続いて、2uMの分析内部標準物質を含有する略等体積の10%ギ酸と混合した。
クロマトグラフィーステップはすべて、Cohesive TLX4経路式システムを使用して実行された。
00uLを使用して、溶離させた。溶出液を溶媒Aと1:3の比率で混合し、2.1mmx50mm5uM Xbridge 130 BEH分析カラムに適用した。検体を分析カラムに移した後、95%A乃至65%溶媒Aの勾配を作成した。勾配の間の適切な時間において、流れを廃棄物から変えて質量分析計に向けた。次の注入前に、抽出カートリッジおよび分析カラムの両方を洗浄し、その場で再平衡化した。
正イオンモードにおいて、HESI(加熱エレクトロスプレーイオン化)源を備えるTSQ Quantum Ultraを使用して、MS/MSを行った。検体および内部標準物質の定量的分析のために、選択的反応モニタリングを使用した。検体、分析内部標準物質、および分解標準物質それぞれに対して、2つずつ、6つの遷移をモニタリングした。検体と内部標準物質との間のピーク面積比を、一連の既知のアンジオテンシン1保存物に対して較正し、次いで、1/x加重線形回帰を使用して、較正曲線を構築した。選択されたMS/MSパラメータを、以下の表2に列挙する。
単回アッセイにおいて、3つのQCプールのそれぞれから8つのアリコートを分析し、アッセイ内の試料の再現性(CV)を判定した。以下の値が測定された。
検出限界(LOD)は、測定値がその付随する不確定性を上回る点である。アンジオテンシン1ゼロ標準物質を17回複製し、得られた面積比を、較正物質に基づいて濃度に逆算し、アッセイの検出限界を決定した。アンジオテンシン1アッセイの検出限界(LOD)は、30fmol/mLであった。
アッセイにおいて、アンジオテンシン1検出の線形性を確立するために、ゼロ標準物質として割り当てられた1つの空包と、8つの人工血清注入試料(較正物質)を調製し、連続しない5日間にわたって分析した。連続5回の加重(1/x)線形回帰分析から、相関係数0.995以上が得られ、正確度±20%で、77乃至100,000fmol/mLの定量化可能な線形範囲を示した。
3時間インキュベーションに対して、データ還元の基礎プロセスを行った。以下の計算に従って、上述の実施例3−9で分析された試料の最終PRA値を決定する際、血漿の希釈および生成時間を考慮した。
するであろう。
Claims (49)
- 試料中のアンジオテンシン1の量を測定するための方法であって、
(a)前記試料中のアンジオテンシン1をイオン化して、質量分析法によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するステップと、
(b)質量分析法によって、アンジオテンシンイオンの量を検出するステップであって、前記イオンは、433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5、および1297±0.5の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択されるステップと、
(c)検出されたイオンの量を使用して、前記試料中のアンジオテンシン1の量を測定するステップと、
を含む方法。 - 前記方法は、0.1ng/mL以下の定量限界を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって、前記試料からアンジオテンシン1を精製するステップをさらに含む、請求項1−2のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は、固相抽出カラムによって、前記試料からアンジオテンシン1を精製するステップをさらに含む、請求項1−3のいずれか1項に記載の方法。
- アンジオテンシン1イオンの量は、内部標準物質との比較によって、試験試料中のアンジオテンシン1の有無または量と関連付けられる、請求項1−4のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中のアンジオテンシン1の量を測定するための方法であって、
(a)前記試料中のレニンによるアンジオテンシン1の生成に好適な条件下で、レニンに対して有効ではない水安定性プロテアーゼ阻害剤と予混合された試料をインキュベーションするステップと、
(b)液体クロマトグラフィーによって、前記試料中のアンジオテンシン1を精製するステップと、
(c)前記試料から精製されたアンジオテンシン1をイオン化して、質量分析法によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するステップと、
(d)質量分析法によって、アンジオテンシン1イオンの量を検出するステップと、
(e)検出されたイオンの量を使用して、前記試料中のアンジオテンシン1の量を測定するステップと、
を含む方法。 - 前記方法は、0.1ng/mL以下の定量限界を有する、請求項6に記載の方法。
- 前記アンジオテンシン1イオンは、433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5、および1297±0.5の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択される1つ以上のイオンを含む、請求項6−7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イオン化ステップは、433.0±0.5の質量/電荷比をもつ前駆体イオンを生成するステップと、619.4±0.5および647.4±0.5の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択される、1つ以上の断片イオンを生成するステップとを含む、請求項6−8のいずれか1項に記載の方法。
- アンジオテンシン1イオンの量は、内部標準物質との比較によって、試験試料中のアンジ
オテンシン1の有無または量と関連付けられる、請求項6−9のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ステップ(b)は、固相抽出カラムによって、前記試料からアンジオテンシン1を精製するステップを含む、請求項6−10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水安定性プロテアーゼ阻害剤は、フッ化アミノエチルベンジルスルホニルである、請求項6−11のいずれか1項に記載の方法。
- 分解標準物質との比較によって、試料中のアンジオテンシン1の分解度を測定するステップをさらに含む、請求項6−12のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中のアンジオテンシン1の量を測定するための方法であって、
(a)試料中のレニンによるアンジオテンシン1の生成に好適な条件下で試料をインキュベーションするステップと、
(b)固相抽出によって、前記試料中のアンジオテンシン1を精製するステップと、
(c)オンライン処理を備えた液体クロマトグラフィーによって、前記試料中のアンジオテンシン1をさらに精製するステップと、
(d)前記試料から精製されたアンジオテンシン1をイオン化して、質量分析法によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するステップと、
(e)質量分析法によって、アンジオテンシン1イオンの量を検出するステップと、
(f)検出されたイオンの量を使用して、前記試料中のアンジオテンシン1の量を測定するステップと、
を含む方法。 - 前記液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)である、請求項14に記載の方法。
- 前記方法は、0.1ng/mL以下の定量限界を有する、請求項14−15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アンジオテンシン1イオンは、433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5、および1297±0.5.の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択される1つ以上のイオンを含む、請求項14−16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イオン化ステップは、433.0±0.5の質量/電荷比をもつ前駆体イオンを生成するステップと、619.4±0.5または647.4±0.5の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択される、1つ以上の断片イオンを生成するステップとを含む、請求項14−17のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)におけるインキュベーションステップは、レニンに対して有効ではない水安定性プロテアーゼ阻害剤の存在下でインキュベーションするステップを含む、請求項14−18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水安定性プロテアーゼ阻害剤は、フッ化アミノエチルベンジルスルホニルである、請求項19に記載の方法。
- アンジオテンシン1イオンの有無または量は、内部標準物質との比較によって、試験試料中のアンジオテンシン1の有無または量と関連付けられる、請求項14−20のいずれか1項に記載の方法。
- 分解標準物質との比較によって、試料中のアンジオテンシン1の分解度を測定するステップをさらに含む、請求項14−21のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中のレニン活性を測定するための方法であって、
(a)試料中のレニンによるアンジオテンシン1の生成に好適な条件下で試料をインキュベーションするステップと、
(b)固相抽出によって、前記試料からアンジオテンシン1を精製するステップと、
(c)オンライン処理を備えた液体クロマトグラフィーによって、アンジオテンシン1をさらに精製するステップと、
(d)前記試料から精製されたアンジオテンシン1をイオン化して、質量分析法によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するステップと、
(e)質量分析法によって、アンジオテンシン1イオンの量を検出するステップと、
(f)検出されたイオンの量を使用して、前記試料中のアンジオテンシン1の量を測定するステップと、
(g)前記試料中で測定されたアンジオテンシン1の量を使用して、試料中のレニン活性を計算するステップと、
を含む方法。 - 前記液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)である、請求項23に記載の方法。
- 前記方法は、0.1ng/mL以下の定量限界を有する、請求項23−24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アンジオテンシン1イオンは、433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5、および1297±0.5の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択される1つ以上のイオンを含む、請求項23−25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イオン化ステップは、433.0±0.5の質量/電荷比をもつ前駆体イオンを生成するステップと、619.4±0.5または647.4±0.5の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択される、1つ以上の断片イオンを生成するステップとを含む、請求項23−26のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)におけるインキュベーションステップは、レニンに対して有効ではない水安定性プロテアーゼ阻害剤の存在下でインキュベーションするステップを含む、請求項23−27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水安定性プロテアーゼ阻害剤は、フッ化アミノエチルベンジルスルホニルである、請求項28に記載の方法。
- アンジオテンシン1イオンの有無または量は、内部標準物質との比較によって、試験試料中のアンジオテンシン1の有無または量と関連付けられる、請求項23−29のいずれか1項に記載の方法。
- 分解標準物質との比較によって、試料中のアンジオテンシン1の分解度を測定するステップをさらに含む、請求項23−30のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中のレニン活性を測定するための方法であって、
(a)試料中のレニンによるアンジオテンシン1の生成に好適な条件下で、レニンに対し
て有効ではない水安定性プロテアーゼ阻害剤と予混合された試料をインキュベーションするステップと、
(b)液体クロマトグラフィーによって、アンジオテンシン1を精製するステップと、
(c)前記試料から精製されたアンジオテンシン1をイオン化して、質量分析法によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するステップと、
(d)質量分析法によって、アンジオテンシン1イオンの量を検出するステップと、
(e)検出されたイオンの量を使用して、前記試料中のアンジオテンシン1の量を測定するステップと、
(f)前記試料中で測定されたアンジオテンシン1の量を使用して、試料中のレニン活性を計算するステップと、
を含む方法。 - 前記液体クロマトグラフィーは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)である、請求項32に記載の方法。
- 前記方法は、0.1ng/mL以下の定量限界を有する、請求項32−33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アンジオテンシン1イオンは、433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5、および1297±0.5の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択される1つ以上のイオンを含む、請求項32−34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イオン化ステップは、433.0±0.5の質量/電荷比をもつ前駆体イオンを生成するステップと、619.4±0.5または647.4±0.5の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択される、1つ以上の断片イオンを生成するステップとを含む、請求項32−35のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)におけるアンジオテンシン1を精製するステップは、固相抽出カラムによって、アンジオテンシン1を精製するステップを含む、請求項32−36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水安定性プロテアーゼ阻害剤は、フッ化アミノエチルベンジルスルホニルである、請求項32−37のいずれか1項に記載の方法。
- アンジオテンシン1イオンの有無または量は、内部標準物質との比較によって、試験試料中のアンジオテンシン1の有無または量と関連付けられる、請求項32−38のいずれか1項に記載の方法。
- 分解標準物質との比較によって、試料中のアンジオテンシン1の分解度を測定するステップをさらに含む、請求項32−39のいずれか1項に記載の方法。
- 試料中のレニン活性を測定するための方法であって、
(a)試料中のレニンによるアンジオテンシン1の生成に好適な条件下で試料をインキュベーションするステップと、
(b)液体クロマトグラフィーによって、前記試料中のアンジオテンシン1を精製するステップと、
(c)前記試料から精製されたアンジオテンシン1をイオン化して、質量分析法によって検出可能な1つ以上のイオンを生成するステップと、
(d)質量分析法によって、アンジオテンシン1イオンの量を検出するステップであって、前記イオンは、433.0±0.5、619.4±0.5、647.4±0.5、およ
び1297±0.5の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択されるステップと、(e)検出されたイオンの量を使用して、前記試料中のアンジオテンシン1の量を測定するステップと、
(f)前記試料中で測定されたアンジオテンシン1の量を使用して、試料中のレニン活性を計算するステップと、
を含む方法。 - 前記イオン化ステップは、433.0±0.5の質量/電荷比をもつ前駆体イオンを生成するステップと、619.4±0.5または647.4±0.5の質量/電荷比をもつイオンから成る群から選択される、1つ以上の断片イオンを生成するステップとを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記方法は、0.1ng/mL以下の定量限界を有する、請求項41−42のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)におけるインキュベーションステップは、レニンに対して有効ではない水安定性プロテアーゼ阻害剤の存在下でインキュベーションするステップを含む、請求項41−43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水安定性プロテアーゼ阻害剤は、フッ化アミノエチルベンジルスルホニルである、請求項44に記載の方法。
- 前記精製されたアンジオテンシン1は、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製される、請求項41−45のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法は、固相抽出カラムによって、前記試料からアンジオテンシン1を精製するステップをさらに含む、請求項41−46のいずれか1項に記載の方法。
- アンジオテンシン1イオンの有無または量は、内部標準物質との比較によって、試験試料中のアンジオテンシン1の有無または量と関連付けられる、請求項41−47のいずれか1項に記載の方法。
- 分解標準物質との比較によって、試料中のアンジオテンシン1の分解度を測定するステップをさらに含む請求項41−48のいずれか1項に記載の方法。
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