JP2017137269A - ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤 - Google Patents
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Abstract
Description
ヒアルロン酸はヒアルロン酸合成酵素(以下、HASと略す)により合成される。生体内のヒアルロン酸合成に関与している酵素は、HAS1mRNA、HAS2mRNA、HAS3mRNAが知られているが、線維芽細胞では主にHAS2mRNAの発現を介してヒアルロン酸合成が制御されていることが明らかとなっている。
ヒアルロン酸は、皮膚の弾力性の低下、シワ形成のみならず、関節炎もの有効なことが知られている。
退行性関節炎が起こると、関節内で潤滑作用をするヒアルロン酸の生成が減少し、蛋白酵素による破壊が増加し、関節内でヒアルロン酸が減少するとの報告がある。すなわち、関節内でヒアルロン酸が減少するにしたがって、関節で外部衝撃を吸収したり分散することができず、関節の損傷が激しくなることがある。これより、ヒアルロン酸を関節に注入して関節炎を緩和させる方法があるが、究極的には身体内のヒアルロン酸の合成を増加させる方法がさらに有効であると考えられる。
皮内のヒアルロン酸を増加させる物質はいくつか知られている。(特許文献1〜2)
コラーゲンは化粧料をはじめとする皮膚外用剤に広く利用されており、さらに、貝類のコラーゲンおよびその加水分解物も化粧品に利用されている。(特許文献3及び4)
コラーゲンは上記のように皮膚にとって非常に有用であることはすでにわかっているが、哺乳動物を由来とするコラーゲンは、一部の人にとっては利用したくないものであり、様々なニーズにも答えるべく、鋭意検討した結果、貝類肉より得られるコラーゲンが本発明の主旨にもっとも合致することがわかった。なお且つ、カキ、アワビ、アサリ等は貝肉は食料として利用されているがアコヤ貝の場合は真珠養殖が終了した時点で廃棄物として投棄されているのが現状であり、アコヤ貝を本発明の原料として用いるのが最も効果的である。
アコヤ貝は真珠養殖が終わって、真珠を取り出すときに、貝柱を除いたあとの貝肉を集める。食用できる貝柱を除くと外套膜にコラーゲン多く含まれるので、必要によっては、貝肉より外套膜を選別する。
コラーゲンの抽出の方法は、公知の方法で行えばよい。すなわち例えば、、水を加えたあと、攪拌したのち、遠心分離機で分離する方法や静置して上澄みを捨てる方法など選択すればよい。この不溶物よりさらに不純物を除くために、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の塩溶液や、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア水等の塩基性溶液或いは、エチレンジアミン四酢酸塩等のキレート剤を加えて攪拌して不溶物を集める。これにさらにエタノール等の水溶性有機溶媒で不純物を除いたのち、酢酸、クエン酸、乳酸、塩酸、リン酸などを用いて酸抽出することによりコラーゲンが得られる。濃度は酸の種類や各種の条件によって異なるが0.01〜2モルの濃度で行う。この液を加えて2〜48時間攪拌すると抽出される。なお、温度は30℃以下、好ましくは2〜10℃である。このほか、酵素を用いたのち、酸で抽出する方法等公知の方法で抽出すればよい。また、用途によってはさらに精製した方がよい場合があり、親水性有機溶媒や塩析法などを用いて精製する。
以上のようにして得られたコラーゲンを加水分解する。加水分解の方法はコラーゲナーゼ、パパイン、ペプシン等の蛋白分解酵素、塩酸、硫酸、硝酸などの無機酸、酢酸、乳酸、コハク酸などの有機酸、これらを単独或いは2種以上用いて分解し、必要に応じて不要な酵素や酸を除去する。また、酵素や酸以外のアルカリ等の分解方法を用いてもなんら問題はない。これらの加水分解方法を1つ又は組み合わせて必要な分子量とすればよいが、限外濾過、ゲル濾過、その他のクロマト等を用いて必要な分画を得たらよい。
さらに配列番号1のペプチドが含まれる範囲で、公知の分画方法で精製していけばよい。
また、合成し、配列番号1のペプチドを得ることも可能であり、用途等によって選択すればよい。
利用できる原料を例示すれば、
アボガド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物(硬化油等)等の各種油脂類。
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等のロウ類。
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等の鉱物油。
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の脂肪酸類。
エタノール、イソピロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール等のアルコール類。
エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、ガラクチトール、ソルビトール、ラクチトール、マルチトール等の多価アルコール類。
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛等の金属セッケン類。
アラビアゴム、グアヤク脂、カラヤゴム、トラガントゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン(C2〜C4)オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル(C2〜C4)キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等のガム質、糖類又は水溶性高分子化合物。
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等の各種アミノ酸類。
海洋成分深層水、海水塩、海水乾燥物、死海又は大西洋又は太平洋の海より得た無機塩、海泥等の海洋産物。
酵母菌抽出エキス、細菌代謝物、細菌抽出エキス、カビ又は放線菌代謝物、カビ又は放線菌抽出エキス、納豆菌代謝物、納豆抽出エキス、米発酵エキス、米糠(赤糠、白糠)発酵エキス、生乳又は脱脂粉乳の乳酸発酵物、マメ科植物の乳酸菌発酵物、ココヤシ属植物の乳酸菌発酵物等の菌類由来物質。
グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等のα-ヒドロキシ酸類。
無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミン等の無機顔料。
ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、メトキシ桂皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、ウロカニン酸誘導等の紫外線吸収または遮断剤。
イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、d-カンフル、dl-カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸又はその塩、グリチルレチン酸又はその塩の抗炎症剤。
アクリノール、イオウ、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、トリクロサン等の抗菌・殺菌・消毒薬。
ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カルダモン精油、シンナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、シダーウッド精油、ジャスミン精油、バラ精油、ベルガモット精油、ラベンダー精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油等の動植物性香料、その他合成香料等。
感光素101号、感光素201号、感光素401号、感光素301号、ヒノキチオール、パントテン酸又はその誘導体、アラントイン、ペンタデカン酸グリセリド、尿素、グアニジン等の各種薬剤。
その他ホルモン類、金属イオン封鎖剤、pH調整剤等が挙げられる。
1.アテロコラーゲンの抽出
生のアコヤガイから外套膜を採取し、冷凍保存したものを適時冷水などで解凍して以下に用いた。
この外套膜に1M NaCl水溶液を加えてホモジナイズした。これを遠心分離して沈殿を得た。次にこの沈殿を水中で分散したのち、遠心分離して沈殿を得た。これを繰り返すことにより、塩などの水溶性成分を除去した。
この沈殿を希クエン酸水溶液中で1時間程度撹拌したのち、必要であればクエン酸でpH2.5付近に調整した。外套膜重量に対して重量比1.0%程度のペプシンを加えて10℃以下条件下、15時間以上酵素分解してコラーゲンをアテロ化した。
これを遠心分離して上清を回収した。得られた上清に濃NaOH水溶液を加えてpH10に調整し、10℃以下条件下で一晩撹拌してペプシンを不活化した。
次にこの溶液にクエン酸を加えて再びpH2.5に調整したのち、NaClを徐々に添加して塩析させた。これを遠心分離することでアテロコラーゲンを含む沈殿を得た。
この沈殿を再度希クエン酸水溶液で溶解したのち、遠心分離等にて不溶な沈殿を除去した。これに上記と同様の操作により塩析して沈殿を得た。
この沈殿を含水エタノールに分散した後、遠心分離にてアテロコラーゲンからなる沈殿を回収した。
上記で得られたアテロコラーゲンを0.1Mリン酸緩衝液に固形分%として0.1%〜0.4%となるように分散したのち、60℃に加温した。更にこの溶液に対して重量比0.1%程度のパパインを加え、60℃で6時間反応させて酵素分解した。反応後、液温を90℃以上で30分間加熱して酵素を失活させた。
この溶液を冷却したのち、ガラスろ紙(GF−75、ADVANTEC社製)にてろ過してろ液を得た。
このろ液をMWCO5,000の限外ろ過装置(ビバフロー50、ザルトリウス社製)に通して浸出液を得た。
更にこの浸出液をMWCO1,000の限外ろ過装置(限外ろ過膜:PLAC、ミリポア社製)(装置:撹拌式セルタイプ、ミリポア社製)に通して浸出液を得た。(アテロコラーゲンのペプチド化物)
この分画の結果を図1に示す。
それぞれのフラクションをロータリーエバポレーターで乾固した後、少量の蒸留水に溶解後、凍結乾燥した。この分画操作を10回程度繰り返し、フラクションNo1からNo10までを以下の確認試験に供した。
試験は,ヒト線維芽細胞を用い、セミコンフルエントまで培養後、試験品を含む培地へ交換し、3日間培養した。RNAを抽出した後、逆転写してcDNAを得て、リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社)を用いて、HAS2遺伝子の発現量を測定した。内在性コントロールとしてはGAPDHを用いた。
なお、試験濃度は、終濃度が0.65mg/mlである。
この結果を図2に示す。
すなわち、フラクションNo.9を逆相カラムTSKgel Amido 80(4.6 mm I.D.x 25cm)を用いた液体クロマトグラフィーに再度供し、カラム吸着画分を0−45%のリニアグラジエント、流速1ml/min、70分間溶出を行った。ここで得られた溶出ピーク、No. 9-1、No. 9-2、No. 9-3を液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析計LC-MS/MS TripleTOF5600+ (AB Sciex)を用いて分析した。カラムはViolamo C18 (Φ2.1x100mm)を用い、0.1%ギ酸を含む溶媒で10-80%アセトニトリルのリニアグラジエントで溶出した。得られたMS/MSデータをDeNovoGUI解析ソフトウエア(Muth at al: J Proteome Res. 2014 Feb 7;13(2):1143-6)に供して、いくつかのアミノ酸配列を得た。
Claims (2)
- 配列番号1を有効成分とするヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤
- 配列番号1を含むアコヤガイのコラーゲンの加水分解物を有効成分とするヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤
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