JP2017137269A

JP2017137269A - Promoter for expression of hyaluronan synthase gene

Info

Publication number: JP2017137269A
Application number: JP2016020432A
Authority: JP
Inventors: 服部　文弘; Fumihiro Hattori; 文弘服部; 薫前山; Kaoru Maeyama; 暉公彦岡本; Kikuhiko Okamoto; 清仁永井; Kiyohito Nagai; 哲加納; Satoru Kano; 大輔舩原; Daisuke Funahara; 渡部　終五; Shugo Watabe; 終五渡部; 充神保; Mitsuru Jinbo
Original assignee: Mikimoto Pharmaceutical Co Ltd; Kitasato Institute; Mie University NUC
Current assignee: Mikimoto Pharmaceutical Co Ltd; Kitasato Institute; Mie University NUC
Priority date: 2016-02-05
Filing date: 2016-02-05
Publication date: 2017-08-10
Anticipated expiration: 2036-02-05
Also published as: JP6677954B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a pharmaceutical agent for suppressing wrinkle formation and reduction in skin elasticity, and preventing and improving arthritis.SOLUTION: According to the present invention, a peptide of SEQ ID NO: 1 or a hydrolysate of collagen of pearl oyster or its fraction containing the peptide of SEQ NO: 1 has a high effect of promoting expression of hyaluronan synthase gene and can be used as a promoter for expression of hyaluronan synthase gene.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、皮膚の弾力性の低下、シワ形成を抑制し、且つ関節炎の予防や改善の製剤に関する。 The present invention relates to a preparation that suppresses the reduction of skin elasticity, prevents wrinkle formation, and prevents or improves arthritis.

皮膚の弾力性の低下、シワ形成等の老化現象には真皮内のヒアルロン酸量の減少が関わっていることが知られている。
ヒアルロン酸はヒアルロン酸合成酵素（以下、ＨＡＳと略す）により合成される。生体内のヒアルロン酸合成に関与している酵素は、ＨＡＳ１ｍＲＮＡ、ＨＡＳ２ｍＲＮＡ、ＨＡＳ３ｍＲＮＡが知られているが、線維芽細胞では主にＨＡＳ２ｍＲＮＡの発現を介してヒアルロン酸合成が制御されていることが明らかとなっている。
ヒアルロン酸は、皮膚の弾力性の低下、シワ形成のみならず、関節炎もの有効なことが知られている。
退行性関節炎が起こると、関節内で潤滑作用をするヒアルロン酸の生成が減少し、蛋白酵素による破壊が増加し、関節内でヒアルロン酸が減少するとの報告がある。すなわち、関節内でヒアルロン酸が減少するにしたがって、関節で外部衝撃を吸収したり分散することができず、関節の損傷が激しくなることがある。これより、ヒアルロン酸を関節に注入して関節炎を緩和させる方法があるが、究極的には身体内のヒアルロン酸の合成を増加させる方法がさらに有効であると考えられる。
皮内のヒアルロン酸を増加させる物質はいくつか知られている。（特許文献１〜２）
コラーゲンは化粧料をはじめとする皮膚外用剤に広く利用されており、さらに、貝類のコラーゲンおよびその加水分解物も化粧品に利用されている。（特許文献３及び４） It is known that a decrease in the amount of hyaluronic acid in the dermis is involved in aging phenomena such as a decrease in skin elasticity and wrinkle formation.
Hyaluronic acid is synthesized by hyaluronic acid synthase (hereinafter abbreviated as HAS). As the enzymes involved in the synthesis of hyaluronic acid in vivo, HAS1 mRNA, HAS2 mRNA, and HAS3 mRNA are known. However, it is clear that fibroblasts regulate hyaluronic acid synthesis mainly through the expression of HAS2 mRNA. It has become.
Hyaluronic acid is known to be effective not only in reducing skin elasticity and wrinkle formation but also in arthritis.
It has been reported that when degenerative arthritis occurs, the production of hyaluronic acid that lubricates in the joint decreases, the destruction by protein enzymes increases, and hyaluronic acid decreases in the joint. That is, as hyaluronic acid decreases in the joint, external impact cannot be absorbed or dispersed in the joint, and joint damage may become severe. From this, there is a method of alleviating arthritis by injecting hyaluronic acid into the joint, but ultimately, a method of increasing the synthesis of hyaluronic acid in the body is considered to be more effective.
Several substances are known that increase hyaluronic acid in the skin. (Patent Documents 1 and 2)
Collagen is widely used in skin preparations such as cosmetics, and shellfish collagen and hydrolysates thereof are also used in cosmetics. (Patent Documents 3 and 4)

特開２００９−１９１０３９号公報JP 2009-191039 A 特開２０１１−１９５４９３号公報JP 2011-195493 A 特開２００３−０９５８５４号公報JP 2003-095854 A 特開２０１４−２１０７６６号公報JP, 2014-210766, A

本発明の目的は皮膚の弾力性の低下、シワ形成を抑制し、且つ関節炎の予防や改善の製剤に関する。 The object of the present invention relates to a preparation for suppressing the reduction of skin elasticity, preventing wrinkle formation, and preventing or improving arthritis.

本発明者らが鋭意検討した結果、コラーゲンのペプチドが本目的に最適なことを見出し、さらに分画したところ、配列番号１のペプチドにヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を非常に促進することがわかった。
コラーゲンは上記のように皮膚にとって非常に有用であることはすでにわかっているが、哺乳動物を由来とするコラーゲンは、一部の人にとっては利用したくないものであり、様々なニーズにも答えるべく、鋭意検討した結果、貝類肉より得られるコラーゲンが本発明の主旨にもっとも合致することがわかった。なお且つ、カキ、アワビ、アサリ等は貝肉は食料として利用されているがアコヤ貝の場合は真珠養殖が終了した時点で廃棄物として投棄されているのが現状であり、アコヤ貝を本発明の原料として用いるのが最も効果的である。
アコヤ貝は真珠養殖が終わって、真珠を取り出すときに、貝柱を除いたあとの貝肉を集める。食用できる貝柱を除くと外套膜にコラーゲン多く含まれるので、必要によっては、貝肉より外套膜を選別する。
コラーゲンの抽出の方法は、公知の方法で行えばよい。すなわち例えば、、水を加えたあと、攪拌したのち、遠心分離機で分離する方法や静置して上澄みを捨てる方法など選択すればよい。この不溶物よりさらに不純物を除くために、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等の塩溶液や、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア水等の塩基性溶液或いは、エチレンジアミン四酢酸塩等のキレート剤を加えて攪拌して不溶物を集める。これにさらにエタノール等の水溶性有機溶媒で不純物を除いたのち、酢酸、クエン酸、乳酸、塩酸、リン酸などを用いて酸抽出することによりコラーゲンが得られる。濃度は酸の種類や各種の条件によって異なるが０．０１〜２モルの濃度で行う。この液を加えて２〜４８時間攪拌すると抽出される。なお、温度は３０℃以下、好ましくは２〜１０℃である。このほか、酵素を用いたのち、酸で抽出する方法等公知の方法で抽出すればよい。また、用途によってはさらに精製した方がよい場合があり、親水性有機溶媒や塩析法などを用いて精製する。
以上のようにして得られたコラーゲンを加水分解する。加水分解の方法はコラーゲナーゼ、パパイン、ペプシン等の蛋白分解酵素、塩酸、硫酸、硝酸などの無機酸、酢酸、乳酸、コハク酸などの有機酸、これらを単独或いは２種以上用いて分解し、必要に応じて不要な酵素や酸を除去する。また、酵素や酸以外のアルカリ等の分解方法を用いてもなんら問題はない。これらの加水分解方法を１つ又は組み合わせて必要な分子量とすればよいが、限外濾過、ゲル濾過、その他のクロマト等を用いて必要な分画を得たらよい。
さらに配列番号１のペプチドが含まれる範囲で、公知の分画方法で精製していけばよい。
また、合成し、配列番号１のペプチドを得ることも可能であり、用途等によって選択すればよい。 As a result of intensive studies by the present inventors, it was found that a collagen peptide was optimal for this purpose, and further fractionation revealed that the peptide of SEQ ID NO: 1 greatly promotes the expression of the hyaluronic acid synthase gene. It was.
Collagen is already known to be very useful for the skin as described above, but collagen derived from mammals is not desired by some people and responds to various needs Therefore, as a result of intensive studies, it has been found that collagen obtained from shellfish meat most closely matches the gist of the present invention. In addition, oysters, abalone, clams, etc., shellfish are used as food, but in the case of pearl oysters, it is currently dumped as waste when pearl farming is finished, It is most effective to use as a raw material.
After the pearl farming is finished, the oyster shellfish collects the shellfish after removing the scallops when the pearls are removed. Except for edible scallops, the mantle contains a large amount of collagen. If necessary, the mantle is selected from the shellfish.
The method for extracting collagen may be performed by a known method. That is, for example, after adding water, after stirring, a method of separating with a centrifuge or a method of leaving the supernatant after standing still may be selected. In order to further remove impurities from this insoluble matter, salt solutions such as sodium chloride, potassium chloride, sodium acetate, sodium citrate, sodium hydrogen phosphate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, aqueous ammonia, etc. A basic solution or a chelating agent such as ethylenediaminetetraacetate is added and stirred to collect insoluble matter. Further, after removing impurities with a water-soluble organic solvent such as ethanol, collagen is obtained by acid extraction using acetic acid, citric acid, lactic acid, hydrochloric acid, phosphoric acid or the like. The concentration varies depending on the type of acid and various conditions, but the concentration is 0.01 to 2 mol. When this liquid is added and stirred for 2 to 48 hours, it is extracted. In addition, temperature is 30 degrees C or less, Preferably it is 2-10 degreeC. In addition, after using an enzyme, it may be extracted by a known method such as a method of extracting with an acid. Further, depending on the application, it may be better to further purify, and it is purified using a hydrophilic organic solvent or salting out method.
The collagen obtained as described above is hydrolyzed. The hydrolysis method includes proteases such as collagenase, papain, and pepsin, inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, and nitric acid, organic acids such as acetic acid, lactic acid, and succinic acid. Remove unnecessary enzymes and acids as needed. Moreover, there is no problem even if a decomposition method such as an alkali other than an enzyme or an acid is used. One or a combination of these hydrolysis methods may be used to obtain the required molecular weight, but the required fraction may be obtained using ultrafiltration, gel filtration, other chromatography, or the like.
Furthermore, purification may be performed by a known fractionation method as long as the peptide of SEQ ID NO: 1 is included.
Moreover, it is also possible to obtain a peptide of SEQ ID NO: 1 by synthesis, and it may be selected depending on the use and the like.

配列番号１のペプチド或いは配列番号１のペプチドを含むアコヤガイのコラーゲンの加水分解物或いはその分画物の他に、医薬品、食品、化粧品に利用できる原料とともに、製剤を作成するか、既存の医薬品、食品、化粧品にこれらを加えて利用することもできる。
利用できる原料を例示すれば、
アボガド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等の各種油脂類。
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等のロウ類。
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等の鉱物油。
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の脂肪酸類。
エタノール、イソピロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール等のアルコール類。
エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、ガラクチトール、ソルビトール、ラクチトール、マルチトール等の多価アルコール類。 In addition to the peptide of SEQ ID NO: 1 or the hydrolyzate of pearl oyster collagen containing the peptide of SEQ ID NO: 1 or a fraction thereof, a preparation is prepared together with raw materials that can be used for pharmaceuticals, foods, cosmetics, These can be added to foods and cosmetics.
Examples of available raw materials
Avocado oil, almond oil, fennel oil, egoma oil, olive oil, orange oil, orange rafa oil, sesame oil, cacao butter, chamomile oil, carrot oil, cucumber oil, beef tallow fatty acid, kukui nut oil, safflower oil, shea butter, liquid shea Fat, soybean oil, camellia oil, corn oil, rapeseed oil, persic oil, castor oil, cottonseed oil, peanut oil, turtle oil, mink oil, egg yolk oil, palm oil, palm kernel oil, owl, coconut oil, beef tallow, lard , Squalene, squalane, pristane or various fats and oils such as hydrogenated products (hardened oil, etc.) of these fats and oils.
Waxes such as beeswax, carnauba wax, whale wax, lanolin, liquid lanolin, reduced lanolin, hard lanolin, candelilla wax, montan wax, shellac wax, rice wax;
Mineral oils such as liquid paraffin, petrolatum, paraffin, ozokelide, ceresin, and microcristan wax.
Fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, behenic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, docosahexaenoic acid, eicosapentaenoic acid, 12-hydroxystearic acid, undecylenic acid, tall oil, and lanolin fatty acid.
Alcohols such as ethanol, isopyropanol, lauryl alcohol, cetanol, stearyl alcohol, oleyl alcohol, lanolin alcohol, cholesterol, phytosterol, phenoxyethanol, 2-hexyldecanol, isostearyl alcohol, 2-octyldodecanol.
Ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol monobutyl ether, diethylene glycol monomethyl ether, diethylene glycol monoethyl ether, polyethylene glycol, propylene glycol, polypropylene glycol, 1,3-butylene glycol, pentyl glycol, glycerin, Polyhydric alcohols such as pentaerythritol, threitol, arabitol, xylitol, galactitol, sorbitol, lactitol, and maltitol.

ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等のエステル類。
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛等の金属セッケン類。
アラビアゴム、グアヤク脂、カラヤゴム、トラガントゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン(Ｃ２〜Ｃ４)オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル(Ｃ２〜Ｃ４)キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等のガム質、糖類又は水溶性高分子化合物。 Isopropyl myristate, isopropyl palmitate, butyl stearate, hexyl laurate, myristyl myristate, oleyl oleate, decyl oleate, octyldodecyl myristate, hexyldecyl dimethyloctanoate, cetyl lactate, myristyl lactate, diethyl phthalate, phthalate Esters such as dibutyl acid, lanolin acetate, ethylene glycol monostearate, propylene glycol monostearate, propylene glycol dioleate.
Metal soaps such as aluminum stearate, magnesium stearate, zinc stearate, calcium stearate and zinc palmitate.
Gum arabic, guaiac fat, karaya gum, tragacanth gum, quince seed, agar, casein, lactose, fructose, sucrose or ester thereof, trehalose or derivative thereof, dextrin, gelatin, pectin, starch, carrageenan, carboxymethyl chitin or chitosan, ethylene oxide Hydroxyalkyl (C2 to C4) chitin or chitosan to which alkylene (C2 to C4) oxide is added, etc., low molecular chitin or chitosan, chitosan salt, sulfated chitin or chitosan, phosphorylated chitin or chitosan, alginic acid or a salt thereof, Hyaluronic acid or its salt, chondroitin sulfate or its salt, heparin, ethyl cellulose, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, carboxyethyl cellulose, carboxyethyl cellulose sodium, hyaluronan Droxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, nitrocellulose, crystalline cellulose, polyvinyl alcohol, polyvinyl methyl ether, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl methacrylate, polyacrylate, polyalkylene oxide such as polyethylene oxide and polypropylene oxide, or a crosslinked polymer thereof, carboxy Gum, saccharides or water-soluble polymer compounds such as vinyl polymer and polyethyleneimine.

アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩、カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤等のアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤。 Alkyl carboxylate, alkyl sulfonate, alkyl sulfate ester salt, alkyl phosphate ester salt, alkyl amine salt, alkyl quaternary ammonium salt, carboxylic acid type amphoteric surfactant, sulfate ester type amphoteric surfactant, sulfonic acid type Amphoteric surfactant, phosphate ester type amphoteric surfactant, ether type nonionic surfactant, ether ester type nonionic surfactant, ester type nonionic surfactant, block polymer type nonionic surfactant, nitrogen-containing Anionic surfactants such as type nonionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants, nonionic surfactants.

レチノール、レチナール、デヒドロレチナール、カロチン、リコピン、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ又はその誘導体、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類等の各種ビタミン類又はその誘導体。
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等の各種アミノ酸類。 Retinol, retinal, dehydroretinal, carotene, lycopene, thiamine hydrochloride, thiamine sulfate, riboflavin, pyridoxine, cyanocobalamin, folic acid, nicotinic acids, pantothenic acids, biotins, choline, inositols, vitamin C or derivatives thereof, ergocalci Ferrol, cholecalciferol, dihydrotaxosterol, vitamin E or its derivatives, various vitamins such as ubiquinones or their derivatives.
Valine, leucine, isoleucine, threonine, methionine, phenylalanine, tryptophan, lysine, glycine, alanine, asparagine, glutamine, serine, cysteine, cystine, tyrosine, proline, hydroxyproline, aspartic acid, glutamic acid, hydroxylysine, ornithine, histidine, etc. And various amino acids such as their sulfates, phosphates, nitrates, citrates, or amino acid derivatives such as pyrrolidone carboxylic acid.

赤芽柏、地黄、木通、地胆頭、一薬草、イチョウ、ウーロン茶、ウイキョウ、ウコン、夏枯草、陳皮、エゾウコギ、決明子、オウレン、白朮、オオバナサルスベリ、オクラ、オタネニンジン又はトチバニンジン (人参)、オリーブ、オレガノ、オレンジ、カミツレ又はローマカミツレ、カムカム、ガラナ、厚朴、ギョリュウ、グースベリー、クララ、クランベリー、グレープフルーツ、クローブ、コブシ、モクレン、威霊仙、サクラ、升麻、サンシチニンジン、山茱萸、山椒、サンズコン、シクンシ、シソ紫蘇、紫蘇、シャクヤク、スイカズラ、セイヨウトチノキ、セロリ、センキュウ、センブリ、ダイオウ、タチジャコウソウ、チクセツニンジン、テングサ、甜茶、テンダイウヤク、トクサ、ドクダミ、トチュウ、トネリコ、ナツメ、桂皮、五倍子、ノイバラ、ノバラ、ハトムギ、バラ、菱実、ビワ、ブラックベリー、プルーン、ホウノキ、ボウフウ(防風)、ホオノキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マオウ、マカ、マカデミアナッツ、桑白皮、苦参、マンネンタケ、枳実、ミロバラン、ムクロジ、ムラサキ、益母草、メマツヨイグサ、メリッサ、メリロート、モッコウ、ヤーコン、ユーカリ、ユキノシタ、ユッカ、ユズ、ユリ、ヨロイグサ、ヨモギ、ラベンダー、レモン、レモングラス、ローズマリー、地楡、クロレラ、クロレラ、コンブ、ワカメ、ジャイアントケルプ、ヒジキ、ヒバマタ、キリンサイ、アサクサノリ、スサビノリ、スピルリナ、イシゲ、イロロ、フクロノリ等の植物、海藻、藻類の各種抽出物。 Red buds, ground yellow, woody, gallbladder, monomedicine, ginkgo, oolong tea, fennel, turmeric, summer hay, Chen bark, Ezokogi, Akemiko, auren, white birch, giant crape myrtle, okra, ginseng or tochibaninjin (carrot), olive, oregano , Orange, chamomile or roman chamomile, cam come, guarana, magnolia, gorye, gooseberry, clara, cranberry, grapefruit, clove, kobushi, magnolia, mausoleum, sakura, hemp, sanchinin carrot, yam, yam, sandscon, Shikunshi, shiso shiso, shiso, peony, honeysuckle, horseradish, celery, cucumber, yellowtail, daisou, chimpanzee, chikutsujinjin, tengusa, mocha tea, ladybird, toxa, dokudami, tochu, ash, cinnamon, cinnamon Double, Neubara, Novara, Barley, Rose, Rhizome, Loquat, Blackberry, Prunes, Hornbill, Bowfish (Windbreak), Honoki, Bodaiju, Button, Hop, Jojoba, Maow, Maca, Macadamia nut, Mulberry bark, Bitter , Garlic mushroom, berry, milobaran, mugwort, purple, beetle grass, evening primrose, melissa, melirot, mokko, yacon, eucalyptus, saxifrage, yucca, yuzu, lily, licorice, mugwort, lavender, lemon, lemongrass, rosemary, earthenware, Various extracts of plants, seaweeds, and algae such as chlorella, chlorella, kombu, wakame, giant kelp, hijiki, hibamata, giraffe, asakusanori, susbinori, spirulina, shigege, iroro, fukuronori.

馬又は豚の胎盤抽出物、シルク蛋白及びその分解物又はそれらの誘導体、牛乳、カゼイン及びその分解物又はそれらの誘導体、脱脂粉乳及びその分解物又はそれらの誘導体、ラクトフェリン又はその分解物、鶏卵成分、魚肉分解物、核酸関連物質（リボ核酸、デオキシリボ核酸）等の動物系原料由来物質。
海洋成分深層水、海水塩、海水乾燥物、死海又は大西洋又は太平洋の海より得た無機塩、海泥等の海洋産物。
酵母菌抽出エキス、細菌代謝物、細菌抽出エキス、カビ又は放線菌代謝物、カビ又は放線菌抽出エキス、納豆菌代謝物、納豆抽出エキス、米発酵エキス、米糠（赤糠、白糠）発酵エキス、生乳又は脱脂粉乳の乳酸発酵物、マメ科植物の乳酸菌発酵物、ココヤシ属植物の乳酸菌発酵物等の菌類由来物質。
グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等のα-ヒドロキシ酸類。
無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミン等の無機顔料。
ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、メトキシ桂皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、ウロカニン酸誘導等の紫外線吸収または遮断剤。 Horse or pig placenta extract, silk protein and its degradation products or their derivatives, milk, casein and its degradation products or their derivatives, skim milk powder and its degradation products or their derivatives, lactoferrin or its degradation products, egg component Animal-derived materials such as fish meat degradation products and nucleic acid-related substances (ribonucleic acid, deoxyribonucleic acid).
Marine products such as deep sea water, sea salt, dried sea water, dead sea or Atlantic or Pacific ocean, marine products such as sea mud.
Yeast extract, Bacteria metabolite, Bacteria extract, Mold or actinomycete metabolite, Mold or actinomycetes extract, Natto metabolite, Natto extract, Rice fermented extract, Rice bran (red rice cake, White rice) fermented extract, Fungi-derived substances such as lactic acid fermentation products of raw milk or skim milk powder, lactic acid bacteria fermentation products of legumes, and lactic acid bacteria fermentation products of coconut palm plants.
Α-hydroxy acids such as glycolic acid, citric acid, malic acid, tartaric acid and lactic acid.
Silica, magnesium silicate, talc, kaolin, bentonite, mica, mica titanium, bismuth oxychloride, zirconium oxide, magnesium oxide, zinc oxide, titanium oxide, calcium carbonate, magnesium carbonate, yellow iron oxide, red iron oxide, black iron oxide , Inorganic pigments such as Gunjo, chromium oxide, chromium hydroxide, carbon black, and calamine.
UV absorbers or blocking agents such as benzophenone derivatives, paraaminobenzoic acid derivatives, methoxycinnamic acid derivatives, salicylic acid derivatives, urocanic acid derivatives.

パラアミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、ニコチン酸誘導体、コウジ酸又はその誘導体、オキシベンゾン、ベンゾフェノン、アルブチン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン、胎盤エキス、エラグ酸、ルシノール等の美白剤。
イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、d-カンフル、dl-カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸又はその塩、グリチルレチン酸又はその塩の抗炎症剤。
アクリノール、イオウ、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、トリクロサン等の抗菌・殺菌・消毒薬。
ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カルダモン精油、シンナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、シダーウッド精油、ジャスミン精油、バラ精油、ベルガモット精油、ラベンダー精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油等の動植物性香料、その他合成香料等。
感光素１０１号、感光素２０１号、感光素４０１号、感光素３０１号、ヒノキチオール、パントテン酸又はその誘導体、アラントイン、ペンタデカン酸グリセリド、尿素、グアニジン等の各種薬剤。
その他ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。 Paraaminobenzoic acid derivative, salicylic acid derivative, anthranilic acid derivative, coumarin derivative, amino acid compound, benzotriazole derivative, hydroquinone or derivative thereof, nicotinic acid derivative, kojic acid or derivative thereof, oxybenzone, benzophenone, arbutin, guaiazulene, shikonin, baicalin , Whitening agents such as baicalein, berberine, placenta extract, ellagic acid, lucinol.
Ictamol, indomethacin, kaolin, salicylic acid, sodium salicylate, methyl salicylate, acetylsalicylic acid, diphenhydramine hydrochloride, d-camphor, dl-camphor, hydrocortisone, guaiazulene, camazulene, chlorpheniramine maleate, glycyrrhizic acid or its salt, glycyrrhetinic acid or its Salt anti-inflammatory agent.
Antibacterial, bactericidal and antiseptics such as acrinol, sulfur, calcium gluconate, chlorhexidine gluconate and triclosan.
Musk, Civet, Castorium, Ambergris, Ylang Ylang Essential Oil, Iris Essential Oil, Fennel Essential Oil, Orange Essential Oil, Cardamom Essential Oil, Cinnamon Essential Oil, Geranium Essential Oil, Copaiba Balsam Essential Oil, Cedarwood Essential Oil, Jasmine Essential Oil, Rose Essential Oil, Bergamot Essential Oil, Lavender Essential Oil, Animal and vegetable fragrances such as lemongrass essential oil, lemon essential oil, rosemary essential oil, and other synthetic fragrances.
Photosensitive element 101, photosensitive element 201, photosensitive element 401, photosensitive element 301, hinokitiol, pantothenic acid or derivatives thereof, allantoin, pentadecanoic acid glyceride, urea, guanidine and other various drugs.
Other hormones, sequestering agents, pH adjusters and the like can be mentioned.

これらより、種々選択し、任意の形態にして利用に供する。形態の例としては、カプセル、粉末、顆粒、固形、液体、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート等が挙げられる。 From these, various selections are made and used in any form. Examples of forms include capsules, powders, granules, solids, liquids, gels, bubbles, emulsions, creams, ointments, sheets and the like.

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。 EXAMPLES Next, an Example is given and this invention is demonstrated in detail.

実施例
１．アテロコラーゲンの抽出
生のアコヤガイから外套膜を採取し、冷凍保存したものを適時冷水などで解凍して以下に用いた。
この外套膜に１ＭＮａＣｌ水溶液を加えてホモジナイズした。これを遠心分離して沈殿を得た。次にこの沈殿を水中で分散したのち、遠心分離して沈殿を得た。これを繰り返すことにより、塩などの水溶性成分を除去した。
この沈殿を希クエン酸水溶液中で１時間程度撹拌したのち、必要であればクエン酸でｐＨ２．５付近に調整した。外套膜重量に対して重量比１．０％程度のペプシンを加えて１０℃以下条件下、１５時間以上酵素分解してコラーゲンをアテロ化した。
これを遠心分離して上清を回収した。得られた上清に濃ＮａＯＨ水溶液を加えてｐＨ１０に調整し、１０℃以下条件下で一晩撹拌してペプシンを不活化した。
次にこの溶液にクエン酸を加えて再びｐＨ２．５に調整したのち、ＮａＣｌを徐々に添加して塩析させた。これを遠心分離することでアテロコラーゲンを含む沈殿を得た。
この沈殿を再度希クエン酸水溶液で溶解したのち、遠心分離等にて不溶な沈殿を除去した。これに上記と同様の操作により塩析して沈殿を得た。
この沈殿を含水エタノールに分散した後、遠心分離にてアテロコラーゲンからなる沈殿を回収した。 Example 1. Extracting atelocollagen A mantle was collected from raw pearl oysters and stored frozen and thawed with cold water or the like as appropriate.
A 1M NaCl aqueous solution was added to the mantle and homogenized. This was centrifuged to obtain a precipitate. Next, this precipitate was dispersed in water and then centrifuged to obtain a precipitate. By repeating this, water-soluble components such as salt were removed.
This precipitate was stirred in a dilute citric acid aqueous solution for about 1 hour, and then adjusted to about pH 2.5 with citric acid if necessary. Pepsin in a weight ratio of about 1.0% with respect to the outer membrane weight was added, and collagen was atelolated by enzymatic degradation for 15 hours or longer under conditions of 10 ° C or lower.
This was centrifuged and the supernatant was recovered. Concentrated aqueous NaOH was added to the resulting supernatant to adjust the pH to 10, and the mixture was stirred overnight at 10 ° C. or lower to inactivate pepsin.
Next, citric acid was added to this solution to adjust the pH again to 2.5, and then NaCl was gradually added to cause salting out. This was centrifuged to obtain a precipitate containing atelocollagen.
This precipitate was dissolved again with a dilute aqueous citric acid solution, and then the insoluble precipitate was removed by centrifugation or the like. This was salted out by the same operation as above to obtain a precipitate.
After the precipitate was dispersed in hydrous ethanol, the precipitate made of atelocollagen was collected by centrifugation.

２．アテロコラーゲンのペプチド化
上記で得られたアテロコラーゲンを０．１Mリン酸緩衝液に固形分％として０．１％〜０．４％となるように分散したのち、６０℃に加温した。更にこの溶液に対して重量比０．１％程度のパパインを加え、６０℃で６時間反応させて酵素分解した。反応後、液温を９０℃以上で３０分間加熱して酵素を失活させた。
この溶液を冷却したのち、ガラスろ紙（ＧＦ−７５、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）にてろ過してろ液を得た。
このろ液をＭＷＣO５，０００の限外ろ過装置（ビバフロー５０、ザルトリウス社製）に通して浸出液を得た。
更にこの浸出液をＭＷＣＯ１，０００の限外ろ過装置（限外ろ過膜：ＰＬＡＣ、ミリポア社製）（装置：撹拌式セルタイプ、ミリポア社製）に通して浸出液を得た。（アテロコラーゲンのペプチド化物） 2. Peptide formation of atelocollagen Atelocollagen obtained above was dispersed in 0.1M phosphate buffer so that the solid content was 0.1% to 0.4%, and then heated to 60 ° C. Further, papain at a weight ratio of about 0.1% was added to the solution, and the mixture was reacted at 60 ° C. for 6 hours for enzymatic degradation. After the reaction, the enzyme was inactivated by heating at a liquid temperature of 90 ° C. or higher for 30 minutes.
After cooling this solution, it filtered with the glass filter paper (GF-75, product made from ADVANTEC), and obtained the filtrate.
This filtrate was passed through an MWCO 5,000 ultrafiltration device (Vivaflow 50, manufactured by Sartorius) to obtain a leachate.
Further, this leachate was passed through an ultrafiltration device (ultrafiltration membrane: PLAC, manufactured by Millipore) (equipment: stirred cell type, manufactured by Millipore) of MWCO 1,000 to obtain a leachate. (Peptide product of atelocollagen)

３．アテロコラーゲンのペプチド化物の凍結乾燥物の０.２gを１mlの蒸留水に溶解し、逆相カラムTSKgel Amido80 (４．６mm I.D.x ２５cm)を用いた液体クロマトグラフィーに供した。カラム吸着成分の溶出は０−３０％アセトニトリルのリニアグラジエントで９０分間行った。流束は１ml/minで行った。グラジエント開始から１０mlずつ分画し、全部で１０フラクション得た。
この分画の結果を図１に示す。
それぞれのフラクションをロータリーエバポレーターで乾固した後、少量の蒸留水に溶解後、凍結乾燥した。この分画操作を１０回程度繰り返し、フラクションNo１からNo10までを以下の確認試験に供した。 3. 0.2 g of a freeze-dried product of atelocollagen peptide was dissolved in 1 ml of distilled water and subjected to liquid chromatography using a reverse phase column TSKgel Amido80 (4.6 mm IDx 25 cm). Elution of column adsorbing components was performed for 90 minutes with a linear gradient of 0-30% acetonitrile. The flux was 1 ml / min. Fractionation of 10 ml from the start of the gradient gave a total of 10 fractions.
The result of this fractionation is shown in FIG.
Each fraction was dried on a rotary evaporator, dissolved in a small amount of distilled water, and lyophilized. This fractionation operation was repeated about 10 times, and fractions No. 1 to No. 10 were subjected to the following confirmation test.

確認試験
試験は，ヒト線維芽細胞を用い、セミコンフルエントまで培養後、試験品を含む培地へ交換し、３日間培養した。ＲＮＡを抽出した後、逆転写してｃＤＮＡを得て、リアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ＨＡＳ２遺伝子の発現量を測定した。内在性コントロールとしてはＧＡＰＤＨを用いた。
なお、試験濃度は、終濃度が０．６５mg／mlである。
この結果を図２に示す。 Confirmation test In the test, human fibroblasts were used, cultured to semi-confluent, replaced with a medium containing the test product, and cultured for 3 days. After RNA extraction, reverse transcription was performed to obtain cDNA, and the expression level of the HAS2 gene was measured using a real-time PCR system (Applied Biosystems). GAPDH was used as an endogenous control.
The final concentration of the test concentration is 0.65 mg / ml.
The result is shown in FIG.

上記の結果、フラクションNo９がＨＡＳ２遺伝子の発現を非常に増大させたことがわかり、このフラクションに含まれるペプチドを以下の方法でアミノ酸配列を決定した。
すなわち、フラクションNo.９を逆相カラムTSKgel Amido 80(4.6 mm I.D.x 25cm)を用いた液体クロマトグラフィーに再度供し、カラム吸着画分を0−45%のリニアグラジエント、流速１ml/min、７０分間溶出を行った。ここで得られた溶出ピーク、No. 9-1、No. 9-2、No. 9-3を液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析計LC-MS/MS TripleTOF5600+ (AB Sciex)を用いて分析した。カラムはViolamo C18 (Φ２．１ｘ１００mm)を用い、０．１％ギ酸を含む溶媒で10-80%アセトニトリルのリニアグラジエントで溶出した。得られたMS/MSデータをDeNovoGUI解析ソフトウエア(Muth at al: J Proteome Res. 2014 Feb 7;13(2):1143-6）に供して、いくつかのアミノ酸配列を得た。
As a result, it was found that fraction No. 9 greatly increased the expression of the HAS2 gene, and the amino acid sequence of the peptide contained in this fraction was determined by the following method.
That is, fraction No. 9 was again subjected to liquid chromatography using a reverse phase column TSKgel Amido 80 (4.6 mm IDx 25 cm), and the column adsorption fraction was eluted with 0-45% linear gradient, flow rate 1 ml / min, 70 minutes. Went. The elution peaks obtained here, No. 9-1, No. 9-2, and No. 9-3 were analyzed using a liquid chromatography tandem mass spectrometer LC-MS / MS TripleTOF5600 + (AB Sciex). . The column used was Violamo C18 (Φ2.1 × 100 mm) and was eluted with a linear gradient of 10-80% acetonitrile with a solvent containing 0.1% formic acid. The obtained MS / MS data was subjected to DeNovoGUI analysis software (Muth at al: J Proteome Res. 2014 Feb 7; 13 (2): 1143-6) to obtain several amino acid sequences.

得られたいくつかアミノ酸配列のペプチドを合成し、確認試験を行った結果、配列番号１のペプチドが低濃度でＨＡＳ２遺伝子の発現を非常に増大させたことがわかった。 As a result of synthesizing the obtained peptides having several amino acid sequences and conducting a confirmation test, it was found that the peptide of SEQ ID NO: 1 greatly increased the expression of the HAS2 gene at a low concentration.

配列番号１のペプチド、或いは配列番号１を含むアコヤガイのコラーゲンの加水分解物をそのまま外用剤としても利用できるが、これに他の原料を配合して外用剤を作成することも可能である。
The peptide of SEQ ID NO: 1 or the hydrolyzate of pearl oyster collagen containing SEQ ID NO: 1 can be used as it is as an external preparation, but it is also possible to prepare an external preparation by blending with other raw materials.

アテロコラーゲンのペプチド化物の凍結乾燥物の逆相クロマトグラフィーの結果を示す。The result of the reverse phase chromatography of the freeze-dried material of the peptide product of atelocollagen is shown. アテロコラーゲンのペプチド化物の凍結乾燥物の逆相クロマトグラフィーによる分画物のＨＡＳ２遺伝子発現試験の結果を示す。The result of the HAS2 gene expression test of the fraction by the reverse phase chromatography of the freeze-dried product of the peptide product of atelocollagen is shown. 配列番号１のＨＡＳ２遺伝子発現試験の結果を示す。The result of the HAS2 gene expression test of sequence number 1 is shown.

Claims

Hyaluronic acid synthase gene expression promoter comprising SEQ ID NO: 1 as an active ingredient

Hyaluronic acid synthase gene expression promoter comprising a hydrolyzate of pearl oyster collagen containing SEQ ID NO: 1 as an active ingredient