JP2017121255A5 - - Google Patents
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Claims (32)
- シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質を精製するための方法であって、該ＣＢＳタンパク質が、天然に存在するトランケーション、化学的に切断されるトランケーションまたは遺伝子操作されたトランケーションを含むトランケート型ＣＢＳタンパク質であり、該トランケーションは、該ＣＢＳタンパク質のＣ末端調節領域の少なくとも一部を含み、該ＣＢＳタンパク質が、精製タグを含有せず、該方法が、
（ａ）１つまたは複数の不純物を含むＣＢＳ含有溶液を用意するステップと、
（ｂ）イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して該ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施するステップと、
（ｃ）金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して該ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施し、それにより、該不純物を除去するステップと
を含む方法。 - 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを使用してクロマトグラフィーによる分離を実施するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- セラミックヒドロキシアパタイト樹脂を使用してクロマトグラフィーによる分離を実施するステップをさらに含む、請求項１から２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記イオン交換クロマトグラフィーカラムが弱陰イオン交換体である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記弱陰イオン交換体がＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラムである、請求項４に記載の方法。
- 前記金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂が二価金属陽イオンにより荷電している、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記二価金属陽イオンがニッケル、銅、コバルトまたは亜鉛である、請求項６に記載の方法。
- 前記二価金属イオンが亜鉛である、請求項７に記載の方法。
- イミダゾールを含む溶出緩衝液を用いて前記金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂からＣＢＳを溶出させるステップをさらに含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記トランケート型ＣＢＳタンパク質が、配列番号３によって識別されるアミノ酸配列を有する、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＣＢＳ含有溶液が清澄化されたＣＢＳ溶液である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＣＢＳが組換え細胞において産生される、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組換え細胞が細菌細胞である、請求項１２に記載の方法。
- 前記ＣＢＳ含有溶液が、ＣＢＳをコードする核酸配列を含む組換え構築物を発現する組換え細菌細胞をホモジナイズすることによって得られる、請求項１３に記載の方法。
- 前記ＣＢＳ核酸がトランケート型ＣＢＳタンパク質をコードする、請求項１４に記載の方法。
- 前記トランケート型ＣＢＳタンパク質が、配列番号２の３８２〜５３２、３８２〜５５０および５４３〜５５０からなる群における範囲のうちの１つから選択されるアミノ酸位置でトランケーションが開始するＣ末端欠失バリアントである、請求項１５に記載の方法。
- 前記ＣＢＳ核酸配列が配列番号４を含む、請求項１６に記載の方法。
- 前記組換え細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１２から１７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記トランケート型ＣＢＳタンパク質をコードする核酸配列が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において発現させるために最適化されている、請求項１６に記載の方法。
- 濃縮されたＣＢＳ溶液を作製するための方法であって、該ＣＢＳタンパク質が、天然に存在するトランケーション、化学的に切断されたトランケーションまたは遺伝子操作されたトランケーションを含むトランケート型ＣＢＳタンパク質であり、該トランケーションは、該ＣＢＳタンパク質のＣ末端調節領域の少なくとも一部を含み、該ＣＢＳタンパク質が、精製タグを含有せず、該方法が、
（ａ）１つまたは複数の不純物を含むＣＢＳ含有溶液を用意するステップと、
（ｂ）二価金属イオンにより荷電した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して該ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施し、それにより、該不純物を除去するステップと
を含む方法。 - 前記二価金属イオンがニッケル、銅、コバルトまたは亜鉛である、請求項２０に記載の方法。
- 前記二価金属イオンが亜鉛である、請求項２１に記載の方法。
- 前記トランケート型ＣＢＳタンパク質が、配列番号３によって識別されるアミノ酸配列を有する、請求項２０から２２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＣＢＳ溶液が清澄化されたＣＢＳ溶液である、請求項２０から２３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＣＢＳが組換え細胞において産生される、請求項２０から２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組換え細胞が細菌細胞である、請求項２５に記載の方法。
- 前記ＣＢＳ溶液が、ＣＢＳをコードする核酸配列を含む組換え構築物を発現する組換え細菌細胞をホモジナイズすることによって得られる、請求項２６に記載の方法。
- 前記ＣＢＳがトランケート型ＣＢＳタンパク質をコードする、請求項２７に記載の方法。
- 前記トランケート型ＣＢＳタンパク質が、配列番号２の３８２〜５３２、３８２〜５５０および５４３〜５５０からなる群における範囲のうちの１つから選択されるアミノ酸位置でトランケーションが開始するＣ末端欠失バリアントである、請求項２８に記載の方法。
- 前記ＣＢＳ核酸配列が配列番号４を含む、請求項２９に記載の方法。
- 前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項２０から３０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記トランケート型ＣＢＳタンパク質をコードする核酸配列が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において発現させるために最適化されている、請求項２０から３１のいずれか１項に記載の方法。
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