JP2017114851A

JP2017114851A - キサンチンオキシダーゼ活性の阻害におけるβ−カルボリンアルカロイドの使用

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Publication number: JP2017114851A
Application number: JP2016234432A
Authority: JP
Inventors: ミン−デウー; Ming-Der Wu; ミン−ジェンチョン; Ming-Jen Cheng; チェン　イェン−リン; Yen-Lin Chen; イェン−リンチェン; シャオ−ジャンチェン; Siao-Jhen Chen; リー−ウェンユー; Li-Wen Yu; スン−インスー; Hsun-Yin Hsu
Original assignee: SHOKUHIN KOGYO HATTEN KENKYUSHO
Current assignee: SHOKUHIN KOGYO HATTEN KENKYUSHO
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2016-12-01
Publication date: 2017-06-29
Anticipated expiration: 2036-12-01
Also published as: TW201720441A; JP6472428B2; KR101846096B1; KR20170068387A; TWI627955B; US20170165239A1; CN106983748A; CN106983748B

Abstract

【課題】キサンチンオキシダーゼ活性を阻害することによる、痛風又は高尿酸血症の治療方法、及びキサンチンオキシダーゼ阻害活性をモニタリングする方法の提供。
【解決手段】式（Ｉ）で表されるβ−カルボリンアルカロイド構造を有するキサンチンオキシダーゼ阻害剤の使用。

（Ｒ_１はＨ、−ＣＯ_２Ｈ等、Ｒ_２はメチル、−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３等）
【選択図】なし

Description

本発明は、キサンチンオキシダーゼ活性の阻害を必要とする対象においてキサンチンオキシダーゼ活性を阻害する方法と、尿酸値の低減を必要とする対象において尿酸値を低減する方法と、キサンチンオキシダーゼ阻害活性レベルをモニタリングする方法とに関する。

尿酸は体内におけるプリン代謝の最終生成物である。血中の尿酸値が高いと、関節、腎臓及び他の器官において尿酸結晶の形成及び析出が起こる。７ｍｇ／ｄＬより高い血中尿酸濃度が高尿酸血症とされる。高尿酸血症は痛風、高血圧、心血管疾患、糖尿病及び腎疾患に関連する一般的な代謝障害である。

キサンチンオキシダーゼは尿酸の合成における重要な酵素である。結果として、キサンチンオキシダーゼ活性の阻害が尿酸の産生を低減することができる。実際、キサンチンオキシダーゼ阻害剤（ＸＯＩ）であるウリカーゼは血中の尿酸濃度を下げる効果がある。ウリカーゼはヒトでは見られない酵素である。ウリカーゼは通例、哺乳動物の組換えタンパク質として単離され、ＩＶ点滴にて投与される。そのためウリカーゼは、作製するのに費用がかかり、投与することが難しい場合がある。

２つのキサンチンオキシダーゼ阻害剤、アロプリノール及びフェブキソスタットは血清中の尿酸値を下げるために臨床投与されている。しかしながら、それらにはそれぞれアレルギー反応、胃腸の不快感、白血病及び血小板減少症、肝炎、腎症、並びに６−メルカプトプリン毒性等の副作用があり、場合よっては死に至ることもある。したがって、市場における安全で有効なキサンチンオキシダーゼ阻害剤に対する要求は満たされていない。

β−カルボリンアルカロイドであるフラジンと呼ばれる化合物が１９３６年に単離され、その構造は１９８６年に特徴付けられた。フラジンは日本の米酢、醤油及び味噌においても認められている（非特許文献１）。フラジンは２００２年に抗腫瘍活性があることが分かり、抗ＨＩＶ活性（非特許文献２）及びスーパーオキシドアニオン生成を阻害することができること（非特許文献３）も知られている。

Shin-ichi Nadatsuka et al., Tetrahedron Letters 27(29):3399-3402 Su BN et al., Planta Med. 68(8):730-733 Yang ML et al., J Nat Prod. 74(9):1996-2000

本開示は特に、β−カルボリンアルカロイド化合物を用いて、キサンチンオキシダーゼ活性を阻害する方法又は尿酸値を低減する方法を提供する。

幾つかの実施の形態では、キサンチンオキシダーゼ活性の阻害を必要とする対象においてキサンチンオキシダーゼ活性を阻害する方法が提供され、この方法は式（Ｉ）のβ−カルボリンアルカロイド化合物を含む又は該化合物から本質的になる組成物をキサンチンオキシダーゼと接触させる工程を含む。これらの方法では、式（Ｉ）のＲ_１はカルボキシル基、カルボキシレート基、カルボキサミド基及び水素からなる群から選択され、式（Ｉ）のＲ_２は−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、メトキシ基、水素及びメチル基からなる群から選択される。

尿酸値の低減を必要とする対象において尿酸値を低減する方法も本開示により提供され、この方法は対象に有効量の式（Ｉ）のβ−カルボリンアルカロイド化合物を投与する工程を含む。これらの方法では、式（Ｉ）のＲ_１はカルボキシル基、カルボキシレート基、カルボキサミド基及び水素からなる群から選択され、式（Ｉ）のＲ_２は−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、メトキシ基、水素及びメチル基からなる群から選択される。

加えて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性をモニタリングする方法も本開示により提供され、これらの方法は（ａ）キサンチンオキシダーゼ阻害活性の所望レベルと相関する式（Ｉ）のβ−カルボリンアルカロイド化合物の量（以下「所望量」と呼ぶ）を決定する工程と、（ｂ）モニタリング対象の組成物群における上記β−カルボリンアルカロイド化合物の量を測定する工程と、（ｃ）上記量が所望量以上である場合に上記群が上記所望のキサンチンオキシダーゼ阻害活性に達していると判断する工程とを含む。これらの方法では、式（Ｉ）のＲ_１はカルボキシル基、カルボキシレート基、カルボキサミド基及び水素からなる群から選択され、Ｒ_２は−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、メトキシ基、水素及びメチル基からなる群から選択される。

本発明の１つ又は複数の実施形態の詳細が明細書、図面及び下記の実施例に記載されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は幾つかの実施形態の詳細な説明、及び更には特許請求の範囲から明らかとなる。本明細書で言及される全ての刊行物及び特許文献はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

β−カルボリンアルカロイド化合物であるフラジンのキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示すグラフ図である。９つのサンプルのフラジン濃度及びキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示すグラフ図である。フラジン濃度とキサンチンオキシダーゼ阻害活性との相関関係を示すグラフ図である。

上記のように、本明細書においてキサンチンオキシダーゼ活性を阻害する方法が開示され、これらの方法は式（Ｉ）：
（式中、Ｒ_１はカルボキシル基、カルボキシレート基、カルボキサミド基及び水素からなる群から選択され、Ｒ_２は−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、メトキシ基、水素及びメチル基からなる群から選択される）のβ−カルボリンアルカロイド化合物を含む又は該化合物から本質的になる組成物をキサンチンオキシダーゼと接触させる工程を含む。式（Ｉ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｒ_１はカルボキシル基及び水素からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｒ_１は水素であり、Ｒ_２は水素である。１つの特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は１−［５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル］−９Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール−３−カルボン酸及び／又は１−（５−ヒドロキシメチル−２−フリル）−β−カルボリン−３−カルボン酸である。他の実施形態では、式（Ｉ）のβ−カルボリンアルカロイド化合物は、J. G. Tang et al., Chemistry & Biodiversity 5:447-460又はY. H. Wang et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 355:1091-1095に開示される方法によりフラジンから誘導することができる。

これらの方法の幾つかの実施形態では、接触工程をｉｎｖｉｔｒｏで行うことができる。例えば、キサンチンオキシダーゼの調製物は化合物とともに容器内に入れることができる。他の実施形態では、接触工程はキサンチンオキシダーゼを持つ対象に又はキサンチンオキシダーゼ阻害が必要な対象に組成物を経口投与することにより達成される。

幾つかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−カルボリンアルカロイド化合物は発酵産物に存在する場合がある。発酵産物を精製しても又は精製しなくてもよく、発酵産物は固液分離を用いること等により高度に精製しても、又は僅かだけ精製してもよい。

尿酸値の低減を必要とする対象において尿酸値を低減する方法も本開示により提供され、これらの方法は対象に有効量の式（Ｉ）（式中、Ｒ_１はカルボキシル基、カルボキシレート基、カルボキサミド基及び水素からなる群から選択され、Ｒ_２は−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、メトキシ基、水素及びメチル基からなる群から選択される）のβ−カルボリンアルカロイド化合物を投与する工程を含む。式（Ｉ）の化合物の幾つかの実施形態では、Ｒ_１はカルボキシル基及び水素からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｒ_１は水素であり、Ｒ_２は水素である。１つの特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は１−［５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル］−９Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール−３−カルボン酸及び／又は１−（５−ヒドロキシメチル−２−フリル）−β−カルボリン−３−カルボン酸である。

幾つかの実施形態では、対象は高尿酸血状態にある。他の実施形態では、対象は痛風を患っている。

幾つかの実施形態では、化合物は経口投与されるが、本明細書では、例えば静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与又は皮下注射を含む他の投与経路も企図される。

幾つかの実施形態では、化合物は唯一の活性剤として投与される。他の実施形態では、追加の活性剤が含まれる。これらの追加の活性剤としては、例えば、アロプリノール及びフェブキソスタット等の他のキサンチンオキシダーゼ阻害剤が挙げられ得る。幾つかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−カルボリンアルカロイド化合物は発酵産物に存在する場合がある。発酵産物を精製しても又は精製しなくてもよく、発酵産物は固液分離を用いること等により高度に精製しても、又は僅かだけ精製してもよい。

化合物の投与量は対象において尿酸値を低減するのに有効なものである。当業者であれば、例えば対象の血中の尿酸濃度の変化を測定することにより有効量を容易に決定することができる。幾つかの実施形態では、化合物の有効量は２００ｍｇ／ｋｇ体重〜４００ｍｇ／ｋｇ体重である。

加えて、キサンチンオキシダーゼ阻害活性をモニタリングする方法が本開示により提供され、これらの方法は、（ａ）キサンチンオキシダーゼ阻害活性の所望レベルと相関する式（Ｉ）のβ−カルボリンアルカロイド化合物の量（「所望量」）を決定する工程と、（ｂ）モニタリング対象の組成物群における上記β−カルボリンアルカロイド化合物の量を測定する工程と、（ｃ）上記量が所望量以上である場合に上記群が上記所望のキサンチンオキシダーゼ阻害活性に達していると判断する工程とを含む。これらの方法の幾つかの実施形態では、式（Ｉ）のＲ_１はカルボキシル基、カルボキシレート基、カルボキサミド基及び水素からなる群から選択され、式（Ｉ）のＲ_２は−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、メトキシ基、水素及びメチル基からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｒ_１はカルボキシル基及び水素からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｒ_１は水素であり、Ｒ_２は水素である。１つの特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は１−［５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル］−９Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール−３−カルボン酸及び／又は１−（５−ヒドロキシメチル−２−フリル）−β−カルボリン−３−カルボン酸である。

β−カルボリンアルカロイド化合物の量は当該技術分野において既知の多様な好適な技法により測定することができる。例えば、上記β−カルボリンアルカロイド化合物の量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定することができる。１つの特定の実施形態では、フラジンを測定するＨＰＬＣ分析条件は下記のとおりである：
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ（内径：４．６ｍｍ×２５ｃｍ）、
移動相：アセトニトリル（１００％）：リン酸（０．０８５％）＝３０：７０、
流量：１ｍｌ／分、
フラジンの保持時間は約１２．５分である。
フラジンのＵＶ／ＶＩＳ吸収スペクトルは１９６．１ｎｍ、２９０．４ｎｍ及び３６２．４ｎｍである。

幾つかの実施形態では、モニタリング対象の組成物は発酵産物であり、この発酵産物は精製しても又は精製しなくてもよく、発酵産物は固液分離を用いること等により高度に精製しても、又は僅かだけ精製してもよい。幾つかの実施形態では、モニタリング対象の組成物群におけるβ−カルボリンアルカロイド化合物の量を測定する工程（ｂ）の前に、モニタリング対象の組成物を水で希釈する。

更に精緻化することなく、当業者であれば、本明細書の開示に基づき、本発明を最大限利用することができると考えられる。

そのため下記の特定の実施例は単に説明するものであり、いかなる場合も本開示を限定するものとしては解釈されない。

実施例１：フラジンのキサンチンオキシダーゼ阻害活性
キサンチンオキシダーゼ阻害活性を下記のように測定した。初めに様々な濃度（０．６２５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０．０ｍｇ／ｍｌ及び２０．０ｍｇ／ｍｌ）のフラジンサンプルを準備した。次いで、キサンチンオキシダーゼ阻害活性を下記の手順でＨＰＬＣにより測定した。反応管にて、８８０μｌのキサンチン（１００ｍＭＰＢＳ中、５０μｇ／ｍｌ）及び４０μｌの５０ｍＭＰＢＳ又は４０μｌのフラジンサンプルを予め混合し、８０μｌのキサンチンオキシダーゼ（０．１Ｕ）を添加することで、反応を開始した。反応物を３０℃で３０分間インキュベートした後、等量の無水エタノールを添加することで、反応を終了させた。終了後の反応物を０．２２μｍ径の膜フィルターに通して濾過し、反応物におけるキサンチンの含量をＨＰＬＣによって分析した。サンプルのキサンチンオキシダーゼ阻害活性を下記のように算出した：
ＸＯＩ（％）＝１００×（［キサンチン］_{反応後サンプル}−［キサンチン］_{反応後対照}）／（［キサンチン］_初期−［キサンチン］_{反応後対照}）

結果を図１に示す。フラジンのＩＣ５０は約９．９１ｍｇ／ｍｌであった。

実施例２：
２つのフラジン試験サンプル（サンプルＡ及びサンプルＢ）を準備し、サンプルＡ及びサンプルＢにおけるフラジンの濃度をそれぞれ、６．４２ｐｐｍ及び１１．０６ｐｐｍと求めた。次いで、サンプルＡ及びサンプルＢのキサンチンオキシダーゼ阻害活性を実施例１の方法により測定した。結果から、サンプルＡ及びサンプルＢのＸＯＩ活性がそれぞれ５１％及び７５％であったことが分かる。結果から、サンプルにおけるフラジン濃度が高いほど、サンプルが有するＸＯＩ活性が高くなることが分かる。

実施例３：
２つの追加のフラジン試験サンプル（サンプルＣ及びサンプルＤ）を準備し、サンプルＣ及びサンプルＤにおけるフラジンの量をＨＰＬＣ分析により測定した。結果から、サンプルＣ及びサンプルＤにおけるフラジンの濃度がそれぞれ６．４２ｐｐｍ及び７．０５ｐｐｍであったことが分かる。次いでサンプルＣ及びサンプルＤのキサンチンオキシダーゼ阻害活性を実施例１の方法により測定した。結果から、サンプルＣ及びサンプルＤのキサンチンオキシダーゼ阻害活性がそれぞれ５１％及び５６％であったことが分かる。結果から、サンプルにおけるフラジン濃度が高いほど、サンプルが有するＸＯＩ活性が高くなることが分かる。

実施例４：
ＸＯＩ活性が異なる９つのフラジンサンプルを分析することで、フラジン濃度及びキサンチンオキシダーゼ阻害活性を測定した。結果を図２に示す。サンプル番号４が最大のフラジン濃度及び最大のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示す。フラジン濃度が５０ｐｐｍ未満のサンプルは３０％未満のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示す。結果からフラジン濃度（Ｘ；ｕｇ／１０ｍｇ）とキサンチンオキシダーゼ阻害活性（Ｙ；％）とに正の相関があることが分かる。フラジン濃度とキサンチンオキシダーゼ阻害活性との相関関係を図３に示す。フラジン濃度とキサンチンオキシダーゼ阻害活性との相関関係を示す指数方程式は下記のとおりに得られた。
Ｙ＝９．１１ｌｎ（Ｘ）−４．６４、Ｒ^２＝０．８３４８

結果から、フラジンをサンプルのＸＯＩ活性をモニタリングする指標として使用することができることが分かる。

他の実施形態
本明細書で開示された特徴は全てあらゆる組合せで組み合わせることができる。本明細書で開示される各特徴は同じ、同等の、又は同様の目的を果たす代替特徴に置き換えることができる。そのため特に明記しない限り、開示される各特徴は一連の包括的な同等又は同様の特徴の例にすぎない。

上記記載から、当業者であれば本発明の本質的な特性を容易に確かめることができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、本発明の様々な変更及び修正を行うことで、本発明を様々な用法及び条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。

Claims

キサンチンオキシダーゼ活性の阻害を必要とする対象においてキサンチンオキシダーゼ活性を阻害する方法であって、式（Ｉ）：
（式中、Ｒ_１はカルボキシル基、カルボキシレート基、カルボキサミド基及び水素からなる群から選択され、Ｒ_２は−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、メトキシ基、水素及びメチル基からなる群から選択される）のβ−カルボリンアルカロイド化合物を含む組成物をキサンチンオキシダーゼと接触させることを含む、方法。
Ｒ_１がカルボキシル基及び水素からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
Ｒ_１が水素であり、Ｒ_２が水素である、請求項１に記載の方法。
前記化合物が１−［５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル］−９Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール−３−カルボン酸、及び／又は１−（５−ヒドロキシメチル−２−フリル）−β−カルボリン−３−カルボン酸である、請求項１に記載の方法。
尿酸値の低減を必要とする対象において尿酸値を低減する方法であって、該対象に有効量の式（Ｉ）：
（式中、Ｒ_１はカルボキシル基、カルボキシレート基、カルボキサミド基及び水素からなる群から選択され、Ｒ_２は−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、メトキシ基、水素及びメチル基からなる群から選択される）のβ−カルボリンアルカロイド化合物を投与することを含む、方法。
前記尿酸値の低減を必要とする対象が痛風又は高尿酸血症を患っている、請求項５に記載の方法。
前記化合物が経口投与される、請求項５に記載の方法。
前記化合物が純粋な形態である、請求項５に記載の方法。
キサンチンオキシダーゼ阻害活性をモニタリングする方法であって、
（ａ）キサンチンオキシダーゼ阻害活性の所望レベルと相関する量である、式（Ｉ）：
（式中、Ｒ_１はカルボキシル基、カルボキシレート基、カルボキサミド基及び水素からなる群から選択され、Ｒ_２は−ＣＨ_２ＣＯＯＣＨ_３、メトキシ基、水素及びメチル基からなる群から選択される）のβ−カルボリンアルカロイド化合物の所望量を決定することと、
（ｂ）モニタリングされる組成物群における前記β−カルボリンアルカロイド化合物の量を測定することと、
（ｃ）前記量が前記所望量以上である場合に前記群が前記所望のキサンチンオキシダーゼ阻害活性に達していると判断することと、
を含む、方法。
Ｒ_１がカルボキシル基及び水素からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
Ｒ_１が水素であり、Ｒ_２が水素である、請求項９に記載の方法。
前記化合物が１−［５−（ヒドロキシメチル）フラン−２−イル］−９Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール−３−カルボン酸、及び／又は１−（５−ヒドロキシメチル−２−フリル）−β−カルボリン−３−カルボン酸である、請求項９に記載の方法。
前記β−カルボリンアルカロイド化合物の量が高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定される、請求項９に記載の方法。
モニタリング対象の前記組成物が発酵産物である、請求項９に記載の方法。
モニタリング対象の前記組成物が希釈されている、請求項９に記載の方法。