JP2017008106A - ループス治療のための方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

【課題】ループス治療のための方法および組成物の提供。【解決手段】抗ＣＤ５２抗体により患者のループスを治療する方法を提供する。さらに、患者身体の患側への制御性Ｔ細胞の浸潤を増大させる方法、尿タンパク質および/またはアルブミンレベルの減少させる方法、およびループス症状を緩和するためにリンパ球を枯渇させる方法を含む。ある態様では、本発明はループスの患者のＦｏｘＰ３＋(例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋)制御性Ｔ細胞を増加させる方法を提示し、抗ＣＤ５２抗体の治療有効量を患者に投与することを含む。【選択図】なし

Description

本願は、２００９年５月１３日に出願された米国特許仮出願第６１/１７７、９２４号の優先権を主張する。上記出願のすべての開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ループスは、血液、中枢神経系（ＣＮＳ）、心臓、肝臓、関節、腎臓、肺、皮膚、腸管、および血管系などの体の多くの部分に影響を与える自己免疫疾患である。ループスに侵された組織または臓器には炎症が通常認められる。ループスの症状は血液パネル異常、関節痛、アテローム硬化、ＣＮＳ疾患、感染、関節痛、倦怠感、発疹、潰瘍、腎炎、心血管疾患、および自己抗体の産生を含む。ループスには、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚エリテマトーデス、ＣＮＳループス、心血管系の発現、肺の発現、肝臓の発現、血液学的な発現、消化管の発現、筋骨格系の発現、新生児エリテマトーデス、小児期発症全身性エリテマトーデス、薬剤誘導性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、およびループス発現となる補体欠乏症候群を含有する発現がある。Ｒｏｂｅｒｔ Ｇ． Ｌａｈｉｔａ， Ｅｄｉｔｏｒ， Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ， ４ｔｈ Ｅｄ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２００４を参照。米国では約１５０万から２００万人がループスに罹患している。ループス患者の９０％が女性である。現在、典型的には、ループスはコルチコステロイドおよび免疫抑制薬で治療する。ループス治療のために改善された治療法と組成物が急務である。
抗ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブ）を用いてループスの治療のために新規で有効な治療法と組成物を私たちは考案した。いくつかの実施形態では、リンパ球を有意に枯渇させる抗体を使用する。別の実施形態では、リンパ球を有意に枯渇することがない方法、抗体を使用することもできる。
ある態様では、本発明はループスの患者のＦｏｘＰ３＋(例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋)制御性Ｔ細胞を増加させる方法を提示し、抗ＣＤ５２抗体の治療有効量を患者に投与することを含む。ある実施形態では、本発明の方法は前記制御性Ｔ細胞を刺激する薬剤、例えば、ラパマイシン、ＴＧＦ−β（活性なまたは潜在性のＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５）、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α、ビタミンＤ３、デキサメタゾン、またはミコフェノール酸モフェチルを患者に投与することをさらに含む。制御性Ｔ細胞がループスの患者の炎症部位、例えば、血液、中枢神経系（ＣＮＳ）、心臓、肝臓、関節、腎臓、肺、皮膚、腸管、または血管系などに浸潤してもよい。
別の様態では、本発明はループスの患者の尿タンパク質および/またはアルブミンのレベルを減少する方法を提示し、抗ＣＤ５２抗体の治療有効量を患者に投与することを含む。
別の様態では、本発明はループスの患者のリンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）を枯渇させる方法をさらに提示し、抗ＣＤ５２抗体の治療有効量を患者に投与することを含む。
別の様態では、本発明は治療を必要としている患者（例えば、ループスの患者）の治療法をさらに提示し、少なくとも第２の化合物と混合した抗ＣＤ５２抗体の治療有効量を患者に投与することを含む。典型的には第２の化合物は例えば、標準療法または実験的治療法などのループスの治療に使用するものである。
本発明の方法は、限定はされないが、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚エリテマトーデス、中枢神経系（ＣＮＳ）ループス、心血管系の発現、肺の発現、肝臓の発現、血液学的な発現、消化管の発現、筋骨格系の発現、新生児エリテマトーデス、小児期発症全身性エリテマトーデス、薬剤誘導性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、またはループス発現となる補体欠乏症候群を含有する発現などの、ループスが１つ以上発現している患者の治療に使用することができる。
本発明の併用療法においては、抗ＣＤ５２抗体および追加の治療剤を患者に適宜、任意の順序で投与することができる。抗ＣＤ５２抗体および追加の治療剤を同時にまたは連続的に、あるいはその両方で投与することができる。例えば、追加の治療剤を抗ＣＤ５２治療法前後で投与することができる。本発明においては、かかる併用療法に有効なキットも提供する。
いくつかの実施形態では、患者はヒト患者であり、抗ＣＤ５２抗体はヒトＣＤ５２に対して直接働きかける。そのような実施形態では、抗ＣＤ５２抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、またはヒトＦｃ部分を持つキメラ抗体であることが好ましい。
本発明はさらに、本発明の治療法に有効な医薬を製造する抗ＣＤ５２抗体の使用を提示する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
抗ＣＤ５２抗体の治療有効量をループスの患者に投与することを含む、前記患者のＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を増加させる方法。
（項目２）
前記制御性Ｔ細胞を刺激する薬剤を前記患者に投与することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記薬剤がラパマイシン、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α、ビタミンＤ３、デキサメタゾン、またはミコフェノール酸モフェチルである、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、およびＴＧＦ−β５のうちのいずれか１つの活性形態または潜在性の形態である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記制御性Ｔ細胞が少なくとも１つの炎症部位で増大する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記炎症部位が血液、中枢神経系（ＣＮＳ）、心臓、肝臓、関節、腎臓、肺、皮膚、腸管、または血管系である、項目５に記載の方法。
（項目７）
抗ＣＤ５２抗体の治療有効量をループスの患者に投与することを含む、前記患者の尿タンパク質または尿中アルブミンのレベル、またはそれらの両方を減少させる方法。
（項目８）
ループスの患者のＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を増加させるための医薬を製造するための抗ＣＤ５２抗体の使用。
（項目９）
前記患者が前記制御性Ｔ細胞を刺激する薬剤を投与される、項目８に記載の使用。
（項目１０）
ループスの患者の尿タンパク質または尿中アルブミンのレベル、またはそれらの両方を減少させるための医薬を製造するための抗ＣＤ５２抗体の使用。
（項目１１）
前記患者が前記制御性Ｔ細胞を刺激する薬剤を投与される、項目９に記載の使用。
（項目１２）
前記薬剤がラパマイシン、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α、ビタミンＤ３、デキサメタゾン、またはミコフェノール酸モフェチルである、項目９または１１に記載の使用。
（項目１３）
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、およびＴＧＦ−β５のうちのいずれか１つの活性形態または潜在性の形態である、項目１２に記載の使用。
（項目１４）
（ａ）抗ＣＤ５２抗体をループス患者に投与する、および（ｂ）ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を刺激する薬剤を前記患者に投与する、ことを含む前記患者の治療方法。
（項目１５）
第２の投与ステップの前、それと同時に、またはその後に第１の投与ステップが行われる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記薬剤がラパマイシン、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α、ビタミンＤ３、デキサメタゾン、またはミコフェノール酸モフェチルである、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、およびＴＧＦ−β５のうちのいずれか１つの活性形態または潜在性の形態である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
抗ＣＤ５２抗体、およびＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を刺激する薬剤を含む、ループス治療用キット。
（項目１９）
前記薬剤がラパマイシン、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α、ビタミンＤ３、デキサメタゾン、またはミコフェノール酸モフェチルである、項目１８に記載のキット。
（項目２０）
前記ＴＧＦ−βがＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、およびＴＧＦ−β５のうちのいずれか１つの活性形態または潜在性の形態である、項目１９に記載のキット。
（項目２１）
前記患者がヒトであり、かつ、前記抗ＣＤ５２抗体がヒト化抗ヒトＣＤ５２抗体またはヒト抗ヒトＣＤ５２抗体である、項目１ないし７および１４ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記患者がヒトであり、かつ、前記抗ＣＤ５２抗体がヒト化抗ヒトＣＤ５２抗体またはヒト抗ヒトＣＤ５２抗体である、項目８ないし１３のいずれか１項に記載の使用。
（項目２３）
前記抗ＣＤ５２抗体がヒト化抗ヒトＣＤ５２抗体またはヒト抗ヒトＣＤ５２抗体である、項目１８ないし２０のいずれか１項に記載のキット。
図１Ａと１Ｂはモノクローナルラット抗マウスＣＤ５２ ＩｇＧ２ａ抗体で治療したＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおけるリンパ球の枯渇の欠如を示す。対照ラットＩｇＧまたはラット抗マウスＣＤ５２抗体の初回の注射前にベースラインで、そして２日後の２回目の抗体注射前に個々のマウスから血液を採取した。ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の絶対数を得るために、血液試料を染色してフローサイトメトリーで分析した。 図１Ａと１Ｂはモノクローナルラット抗マウスＣＤ５２ ＩｇＧ２ａ抗体で治療したＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおけるリンパ球の枯渇の欠如を示す。対照ラットＩｇＧまたはラット抗マウスＣＤ５２抗体の初回の注射前にベースラインで、そして２日後の２回目の抗体注射前に個々のマウスから血液を採取した。ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の絶対数を得るために、血液試料を染色してフローサイトメトリーで分析した。 図２Ａから２Ｆまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿タンパク質レベルを首尾よく減らしたことを示す。図２Ａから２Ｅまでは抗マウスＣＤ５２治療マウスが陽性対照のシクロフォスファミド治療群のマウスと同等な尿タンパク質レベルであったことを示す一方、対照ラットＩｇＧ治療マウスが媒体対照（ＰＢＳ）治療マウスと同等の尿タンパク質レベルであったことを示す。図２Ｆは試験の終わりまでに、６７％のラットＩｇＧと６０％の媒体治療マウスと比べて、３８％の抗マウスＣＤ５２抗体治療マウスと２０％のシクロフォスファミド治療マウスだけが重度のタンパク尿（５００ｍｇ／ｄＬ／日超）に達したことを示す。 図２Ａから２Ｆまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿タンパク質レベルを首尾よく減らしたことを示す。図２Ａから２Ｅまでは抗マウスＣＤ５２治療マウスが陽性対照のシクロフォスファミド治療群のマウスと同等な尿タンパク質レベルであったことを示す一方、対照ラットＩｇＧ治療マウスが媒体対照（ＰＢＳ）治療マウスと同等の尿タンパク質レベルであったことを示す。図２Ｆは試験の終わりまでに、６７％のラットＩｇＧと６０％の媒体治療マウスと比べて、３８％の抗マウスＣＤ５２抗体治療マウスと２０％のシクロフォスファミド治療マウスだけが重度のタンパク尿（５００ｍｇ／ｄＬ／日超）に達したことを示す。 図２Ａから２Ｆまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿タンパク質レベルを首尾よく減らしたことを示す。図２Ａから２Ｅまでは抗マウスＣＤ５２治療マウスが陽性対照のシクロフォスファミド治療群のマウスと同等な尿タンパク質レベルであったことを示す一方、対照ラットＩｇＧ治療マウスが媒体対照（ＰＢＳ）治療マウスと同等の尿タンパク質レベルであったことを示す。図２Ｆは試験の終わりまでに、６７％のラットＩｇＧと６０％の媒体治療マウスと比べて、３８％の抗マウスＣＤ５２抗体治療マウスと２０％のシクロフォスファミド治療マウスだけが重度のタンパク尿（５００ｍｇ／ｄＬ／日超）に達したことを示す。 図２Ａから２Ｆまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿タンパク質レベルを首尾よく減らしたことを示す。図２Ａから２Ｅまでは抗マウスＣＤ５２治療マウスが陽性対照のシクロフォスファミド治療群のマウスと同等な尿タンパク質レベルであったことを示す一方、対照ラットＩｇＧ治療マウスが媒体対照（ＰＢＳ）治療マウスと同等の尿タンパク質レベルであったことを示す。図２Ｆは試験の終わりまでに、６７％のラットＩｇＧと６０％の媒体治療マウスと比べて、３８％の抗マウスＣＤ５２抗体治療マウスと２０％のシクロフォスファミド治療マウスだけが重度のタンパク尿（５００ｍｇ／ｄＬ／日超）に達したことを示す。 図２Ａから２Ｆまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿タンパク質レベルを首尾よく減らしたことを示す。図２Ａから２Ｅまでは抗マウスＣＤ５２治療マウスが陽性対照のシクロフォスファミド治療群のマウスと同等な尿タンパク質レベルであったことを示す一方、対照ラットＩｇＧ治療マウスが媒体対照（ＰＢＳ）治療マウスと同等の尿タンパク質レベルであったことを示す。図２Ｆは試験の終わりまでに、６７％のラットＩｇＧと６０％の媒体治療マウスと比べて、３８％の抗マウスＣＤ５２抗体治療マウスと２０％のシクロフォスファミド治療マウスだけが重度のタンパク尿（５００ｍｇ／ｄＬ／日超）に達したことを示す。 図２Ａから２Ｆまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿タンパク質レベルを首尾よく減らしたことを示す。図２Ａから２Ｅまでは抗マウスＣＤ５２治療マウスが陽性対照のシクロフォスファミド治療群のマウスと同等な尿タンパク質レベルであったことを示す一方、対照ラットＩｇＧ治療マウスが媒体対照（ＰＢＳ）治療マウスと同等の尿タンパク質レベルであったことを示す。図２Ｆは試験の終わりまでに、６７％のラットＩｇＧと６０％の媒体治療マウスと比べて、３８％の抗マウスＣＤ５２抗体治療マウスと２０％のシクロフォスファミド治療マウスだけが重度のタンパク尿（５００ｍｇ／ｄＬ／日超）に達したことを示す。 図３Ａから３Ｇまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿中アルブミンレベルを首尾よく減らしたことを示す。尿中アルブミンレベルは半定量的な「Ａｌｂｕｓｔｉｘ」法（図３Ａ）、および定量的なＥＬＩＳＡアッセイ（図３Ｂ）により評価した。図３Ａから３Ｆまでは抗ＣＤ５２抗体治療マウス中の尿中アルブミンレベルが媒体（ＰＢＳ）および対照ラットＩｇＧ治療マウスで見られるそれよりも低いことを示す。図３Ｇは試験の終わりまでに、８０％の媒体治療マウスと８９％のラットＩｇＧ治療マウスと比べて、５０％の抗ＣＤ５２抗体治療マウスだけに有意なアルブミン尿（４０ｍｇ／ｄＬ／日超）を発症したことを示す。 図３Ａから３Ｇまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿中アルブミンレベルを首尾よく減らしたことを示す。尿中アルブミンレベルは半定量的な「Ａｌｂｕｓｔｉｘ」法（図３Ａ）、および定量的なＥＬＩＳＡアッセイ（図３Ｂ）により評価した。図３Ａから３Ｆまでは抗ＣＤ５２抗体治療マウス中の尿中アルブミンレベルが媒体（ＰＢＳ）および対照ラットＩｇＧ治療マウスで見られるそれよりも低いことを示す。図３Ｇは試験の終わりまでに、８０％の媒体治療マウスと８９％のラットＩｇＧ治療マウスと比べて、５０％の抗ＣＤ５２抗体治療マウスだけに有意なアルブミン尿（４０ｍｇ／ｄＬ／日超）を発症したことを示す。 図３Ａから３Ｇまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿中アルブミンレベルを首尾よく減らしたことを示す。尿中アルブミンレベルは半定量的な「Ａｌｂｕｓｔｉｘ」法（図３Ａ）、および定量的なＥＬＩＳＡアッセイ（図３Ｂ）により評価した。図３Ａから３Ｆまでは抗ＣＤ５２抗体治療マウス中の尿中アルブミンレベルが媒体（ＰＢＳ）および対照ラットＩｇＧ治療マウスで見られるそれよりも低いことを示す。図３Ｇは試験の終わりまでに、８０％の媒体治療マウスと８９％のラットＩｇＧ治療マウスと比べて、５０％の抗ＣＤ５２抗体治療マウスだけに有意なアルブミン尿（４０ｍｇ／ｄＬ／日超）を発症したことを示す。 図３Ａから３Ｇまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿中アルブミンレベルを首尾よく減らしたことを示す。尿中アルブミンレベルは半定量的な「Ａｌｂｕｓｔｉｘ」法（図３Ａ）、および定量的なＥＬＩＳＡアッセイ（図３Ｂ）により評価した。図３Ａから３Ｆまでは抗ＣＤ５２抗体治療マウス中の尿中アルブミンレベルが媒体（ＰＢＳ）および対照ラットＩｇＧ治療マウスで見られるそれよりも低いことを示す。図３Ｇは試験の終わりまでに、８０％の媒体治療マウスと８９％のラットＩｇＧ治療マウスと比べて、５０％の抗ＣＤ５２抗体治療マウスだけに有意なアルブミン尿（４０ｍｇ／ｄＬ／日超）を発症したことを示す。 図３Ａから３Ｇまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿中アルブミンレベルを首尾よく減らしたことを示す。尿中アルブミンレベルは半定量的な「Ａｌｂｕｓｔｉｘ」法（図３Ａ）、および定量的なＥＬＩＳＡアッセイ（図３Ｂ）により評価した。図３Ａから３Ｆまでは抗ＣＤ５２抗体治療マウス中の尿中アルブミンレベルが媒体（ＰＢＳ）および対照ラットＩｇＧ治療マウスで見られるそれよりも低いことを示す。図３Ｇは試験の終わりまでに、８０％の媒体治療マウスと８９％のラットＩｇＧ治療マウスと比べて、５０％の抗ＣＤ５２抗体治療マウスだけに有意なアルブミン尿（４０ｍｇ／ｄＬ／日超）を発症したことを示す。 図３Ａから３Ｇまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿中アルブミンレベルを首尾よく減らしたことを示す。尿中アルブミンレベルは半定量的な「Ａｌｂｕｓｔｉｘ」法（図３Ａ）、および定量的なＥＬＩＳＡアッセイ（図３Ｂ）により評価した。図３Ａから３Ｆまでは抗ＣＤ５２抗体治療マウス中の尿中アルブミンレベルが媒体（ＰＢＳ）および対照ラットＩｇＧ治療マウスで見られるそれよりも低いことを示す。図３Ｇは試験の終わりまでに、８０％の媒体治療マウスと８９％のラットＩｇＧ治療マウスと比べて、５０％の抗ＣＤ５２抗体治療マウスだけに有意なアルブミン尿（４０ｍｇ／ｄＬ／日超）を発症したことを示す。 図３Ａから３Ｇまではラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて尿中アルブミンレベルを首尾よく減らしたことを示す。尿中アルブミンレベルは半定量的な「Ａｌｂｕｓｔｉｘ」法（図３Ａ）、および定量的なＥＬＩＳＡアッセイ（図３Ｂ）により評価した。図３Ａから３Ｆまでは抗ＣＤ５２抗体治療マウス中の尿中アルブミンレベルが媒体（ＰＢＳ）および対照ラットＩｇＧ治療マウスで見られるそれよりも低いことを示す。図３Ｇは試験の終わりまでに、８０％の媒体治療マウスと８９％のラットＩｇＧ治療マウスと比べて、５０％の抗ＣＤ５２抗体治療マウスだけに有意なアルブミン尿（４０ｍｇ／ｄＬ／日超）を発症したことを示す。 図４はラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療がｄｓＤＮＡに対する自己抗体の発生に対して何ら検出可能な効果がなかったことを示す。抗マウスＣＤ５２で治療されたマウスの抗体力価は媒体およびラットＩｇＧ治療マウスの力価と同等であった。シクロフォスファミド治療のみがｄｓＤＮＡに対する血清抗体の上昇を効果的に減少させた。 図５はラット抗マウスＣＤ５２抗体での治療によりＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて有意な生存上の利益を提供したことを示す。同等のレベルの生存は抗マウスＣＤ５２抗体の２つの用量（７５％生存）とシクロフォスファミドの毎週の注射（８０％）で得た（Ｐ値＝０．９２１８、抗マウスＣＤ５２抗体 対 シクロフォスファミド）。対照ラットＩｇＧで治療したマウスでは生存は２０％だけであった（Ｐ値＝０．０４０１、抗マウスＣＤ５２抗体 対 対照ラットＩｇＧ）（図５）。 図６Ａから６Ｃまでは採取したマウスの腎臓についての組織学検査の結果を示す。治療群間において正中糸球体症、間質性炎症またはタンパク質カスト重症度スコアには統計的に有意な違いは無かったが、図６Ａに示すようにラットＩｇＧおよび媒体対照群と比べて抗マウスＣＤ５２抗体およびシクロフォスファミドでの治療が正中糸球体症スコアを減少させた。図６Ｂに示すようにシクロフォスファミド投与群において間質性炎症の減少も認められた。 図６Ａから６Ｃまでは採取したマウスの腎臓についての組織学検査の結果を示す。治療群間において正中糸球体症、間質性炎症またはタンパク質カスト重症度スコアには統計的に有意な違いは無かったが、図６Ａに示すようにラットＩｇＧおよび媒体対照群と比べて抗マウスＣＤ５２抗体およびシクロフォスファミドでの治療が正中糸球体症スコアを減少させた。図６Ｂに示すようにシクロフォスファミド投与群において間質性炎症の減少も認められた。 図６Ａから６Ｃまでは採取したマウスの腎臓についての組織学検査の結果を示す。治療群間において正中糸球体症、間質性炎症またはタンパク質カスト重症度スコアには統計的に有意な違いは無かったが、図６Ａに示すようにラットＩｇＧおよび媒体対照群と比べて抗マウスＣＤ５２抗体およびシクロフォスファミドでの治療が正中糸球体症スコアを減少させた。図６Ｂに示すようにシクロフォスファミド投与群において間質性炎症の減少も認められた。 図７Ａから７Ｃまでは腎臓に浸潤するＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の増大を示す。免疫蛍光的にタグを付けられた抗体を用いてマウス腎臓をＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＦｏｘＰ３＋細胞について染色した。陽性細胞の相対存在量について腎切片について盲検下で０から４までのスケールでスコアを付けた。シクロフォスファミド治療により腎臓に浸潤するＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＦｏｘＰ３＋細胞が有意に減少した。これに比べて、抗ＣＤ５２抗体治療ではＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球により腎臓への浸潤を防ぐことができなかったが、制御性Ｔ細胞のマーカーであるＦｏｘＰ３について陽性の細胞の存在を増大させた。 図７Ａから７Ｃまでは腎臓に浸潤するＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の増大を示す。免疫蛍光的にタグを付けられた抗体を用いてマウス腎臓をＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＦｏｘＰ３＋細胞について染色した。陽性細胞の相対存在量について腎切片について盲検下で０から４までのスケールでスコアを付けた。シクロフォスファミド治療により腎臓に浸潤するＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＦｏｘＰ３＋細胞が有意に減少した。これに比べて、抗ＣＤ５２抗体治療ではＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球により腎臓への浸潤を防ぐことができなかったが、制御性Ｔ細胞のマーカーであるＦｏｘＰ３について陽性の細胞の存在を増大させた。 図７Ａから７Ｃまでは腎臓に浸潤するＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の増大を示す。免疫蛍光的にタグを付けられた抗体を用いてマウス腎臓をＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＦｏｘＰ３＋細胞について染色した。陽性細胞の相対存在量について腎切片について盲検下で０から４までのスケールでスコアを付けた。シクロフォスファミド治療により腎臓に浸潤するＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＦｏｘＰ３＋細胞が有意に減少した。これに比べて、抗ＣＤ５２抗体治療ではＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球により腎臓への浸潤を防ぐことができなかったが、制御性Ｔ細胞のマーカーであるＦｏｘＰ３について陽性の細胞の存在を増大させた。 図８Ａと８ＢはＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて異なる用量レベル（１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ ｍｇ／ｋｇ）でのモノクローナルマウス抗マウスＣＤ５２抗体（クローンＷ１９）による有効なリンパ球の枯渇を示す。血液（図８Ａ）において、全でのリンパ球系集団において、５ｍｇ／ｋｇ用量と１０ｍｇ／ｋｇ用量で用量−依存性枯渇が認められ、これにより全ての細胞型（ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞）のほぼ完全な枯渇がおこる。脾臓（図８Ｂ）において、類似した用量−依存性枯渇が認められる。特に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の有意な枯渇が脾臓で認められる一方で、検査した全ての投与量レベルでＢ細胞がより少ない程度まで枯渇されるように思われる。 図８Ａと８ＢはＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて異なる用量レベル（１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ ｍｇ／ｋｇ）でのモノクローナルマウス抗マウスＣＤ５２抗体（クローンＷ１９）による有効なリンパ球の枯渇を示す。血液（図８Ａ）において、全でのリンパ球系集団において、５ｍｇ／ｋｇ用量と１０ｍｇ／ｋｇ用量で用量−依存性枯渇が認められ、これにより全ての細胞型（ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞）のほぼ完全な枯渇がおこる。脾臓（図８Ｂ）において、類似した用量−依存性枯渇が認められる。特に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の有意な枯渇が脾臓で認められる一方で、検査した全ての投与量レベルでＢ細胞がより少ない程度まで枯渇されるように思われる。
本発明は被験者への抗ＣＤ５２抗体投与に関連した我々の発見に基づいている。抗ＣＤ５２抗体がマウスループスモデルでの局所炎症組織へのＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の浸潤を増大させることを発見した。さらに、このマウスループスモデルにおいて抗ＣＤ５２抗体での治療が尿タンパク質およびアルブミンレベルを減少させることができることも発見した。
従って、本発明は患者（例えば、ヒト患者）において抗ＣＤ５２抗体によりループスを治療する方法を提示する。ある実施形態では、治療はＣＮＳ、腎臓、心臓、および肝臓などの局所炎症組織へのＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の補充に役立ち、それによりループス患者の症状の緩和または予防を行う。ある実施形態では、治療はループス患者の尿タンパク質および/またはアルブミンレベルの減少に役立つ。ある実施形態では、治療はループス患者のリンパ球を枯渇する。本発明のさらなる実施態様では、患者の免疫系を制御を改善し、かつ自己免疫の症状を緩和するためにＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の成長および/または活性化を刺激する薬剤で患者をさらに治療する。
Ｌｕｐｕｓループスの発現
本発明の方法は、限定するものではないが、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、皮膚エリテマトーデス、ＣＮＳループス、心血管系の、肺の、肝臓の、血液学的な、消化管の、および筋骨格系の発現、新生児エリテマトーデス、小児期発症全身性エリテマトーデス、薬剤誘導性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、およびループス発現となる補体欠乏症候群を含めたループスの各種の発現に罹患している患者に用いることができる。本発明の方法は活性なループスエピソードに罹患している患者、または不活性なループスの患者の治療に用いることができる。
抗ＣＤ５２抗体治療
本発明の方法ではＣＤ５２に対する抗体を罹患した器官系（例えば、ループス腎炎における血尿および／またはタンパク尿）のモニタリングによって、および／または数種類の器官系にわたっての疾患の重症度の複合スコアを示す疾患活動性指数（例えば、ＢＩＬＡＧ、ＳＬＡＭ、ＳＬＥＤＡＩ、ＥＣＬＡＭ）を用いることによって測定される臨床的エンドポイントに達する治療有効量を患者に投与する。Ｍａｎｄｌ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ” ｉｎ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ． ６１９−６３１， Ｒ．Ｇ． Ｌａｈｉｔａ， Ｅｄｉｔｏｒ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， （２００４）を参照。抗ＣＤ５２抗体の治療有効量とは、治療される被験者が１つ以上の所望の臨床エンドポイントへ到達するのに役立つ量である。
ＣＤ５２は正常および悪性のＢとＴリンパ球の両方により高レベルに発現される細胞表面タンパク質である（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ ｒｅｇｕｌ Ｈｏｍｅｏｓｔ Ａｇｅｎｔｓ １５：３８６−３９１ （２００１）； Ｈｕｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９２： Ａｂｓｔｒａｃｔ ４１９９ （１９９８）； Ｅｌｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８８：４６８４−４６９３ （１９９６）； Ｇｉｌｌｅｅｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８２：８０７−８１２ （１９９３）； Ｒｏｄｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：７１７４−７１７９ （２００６）； Ｇｉｎａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ ２２：１８５−１９１ （１９９８））。ＣＤ５２は単球、マクロファージ、および好酸球により低レベルに発現するが、成熟したナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、および血管系幹細胞での発現は僅かである。同文献。さらに、ＣＤ５２は精巣上体および精管の上皮細胞により産生され、生殖管を通過する間に精子がこれを獲得する（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１， ｓｕｐｒａ； Ｄｏｍａｇａｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｍｏｎｉｔ ７：３２５−３３１ （２００１））。ＣＤ５２の正確な生物学的機能については分かっていないがＴ細胞の移動および共刺激に関与すると示唆するいくつかの証拠もある（Ｒｏｗａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：６９−７７ （１９９５）； Ｍａｓｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８９：９７９−９８９ （１９９９）； Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２０：２４７−２５９ （２００６））。
ヒトＣＤ５２抗原ポリペプチド配列の例は、
ＭＫＲＦＬＦＬＬＬＴ ＩＳＬＬＶＭＶＱＩＱ ＴＧＬＳＧＱＮＤＴＳ ＱＴＳＳＰＳＡＳＳＮ ＩＳＧＧＩＦＬＦＦＶ ＡＮＡＩＩＨＬＦＣＦ Ｓ（配列番号１；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１７９４）である。成熟したヒトＣＤ５２抗原はわずか１２個のアミノ酸を有し、（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１（７）：１６７７−８４ （１９９１））、相当に短く、グリコシル化されている。例えば、成熟したヒトＣＤ５２抗原はＧＱＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ（配列番号２）のようなポリペプチド配列である。
本発明に含まれる抗ＣＤ５２抗体治療は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４などの任意の好適なアイソタイプの抗体を含有する抗ＣＤ５２抗体を用いた投与法を含む。さらに、有用な抗体は定常Ｆｃ領域が修飾されており、好中球および／またはＮＫ細胞におけるＦｃ受容体に同じかまたはより良好な親和性で結合するか、または他の方法で改善した抗体依存性細胞媒体性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有する抗体を含む。本発明において有用な抗ＣＤ５２抗体はＣＤ５２に特異的に結合するがＣＤ５２分子以外には特異的に結合しない抗体である。例えば、抗ＣＤ５２抗体とＣＤ５２との間の特異的結合はフローサイトメトリーにより、ＣＤ５２＋細胞へ結合する抗体のＥＣ５０を計測することで決定できる。特異的結合は例えば、ＥＣ５０が０．５から１０μｇ／ｍｌの範囲で表示することができる。臨床応用の場合、薬学的に許容される純度であれば好ましくは抗ＣＤ５２抗体はモノクローナルであってもよい。例えば、患者が所望の臨床エンドポイントへ到達するのに役立つ量の治療有効量を任意に薬学的に許容される担体で抗体を好適な方法で投与してもよい。
治療対象の患者がヒトである場合、抗ＣＤ５２抗体がヒトＣＤ５２に特異的に結合していることが好ましい。ヒト患者への反復投与時の免疫原性を最小限にするために、抗体がキメラ化（例えば、定常ドメインがヒト抗体の定常ドメインで置換されているマウス抗ＣＤ５２抗体）、ヒト化（ＣＤＲが、マウス抗ヒトＣＤ５２抗体からのＣＤＲで置換されているヒト抗体）、または完全ヒト抗体であることが更に好ましい。有用な抗体の例はアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（登録商標）およびそれらの改変体）である。アレムツズマブは２８ｋＤグリコシル化グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合細胞表面タンパク質であるヒトＣＤ５２（ｈＣＤ５２）に対する組換え型ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である（Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３５：１１８−２７ （１９９０）； Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１， ｓｕｐｒａ）。現在、アレムツズマブはＢ細胞慢性リンパ性白血病に対する第１選択療法として承認されており、多発性硬化症の治療目的で第３段階臨床試験にある。有用な抗体は限定するものではなく、ｈＣＤ５２への結合に関してアレムツズマブと競合する抗体、および／またはアレムツズマブまたはｈＣＤ５２上の他のエピトープと同じエピトープまたは重複エピトープと結合する抗体である。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３４７０４号に記載されたヒト化抗体を使用することができる。
当業者であれば例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標） ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ａｍｇｅｎ， Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ， ＣＡ）を用いてヒト抗ｈＣＤ５２抗体を作製することができる。キメラおよびヒト化抗ｈＣＤ５２抗体を例えば、ラット抗ｈＣＤ５２抗体またはマウス抗ｈＣＤ５２抗体から十分に確立された抗体技術により作製することができる。
所望により、本発明に有用な抗ＣＤ５２抗体は例えば、治療、診断、あるいはアッセイでのモニタリングを可能にする検出可能な標識を含んでもよい。好適な検出可能な標識は例えば、放射性同位元素（例えば、インジウム１１１、テクネチウム９９ｍまたはヨウ素１３１）、陽電子放出標識（フッ素１９）、常磁性イオン（ガドリニウム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ））、エピトープ標識（タグ）、親和性標識（ビオチン、アビジン）、スピン標識、酵素、蛍光基、または化学発光基を含む。標識を用いない場合は、複合体形成を表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、またはその他の好適な方法で決定することができる。本発明に用いる抗ＣＤ５２抗体は生物活性化合物（例えば、サイトカイン、および細胞毒性薬）などの別の治療剤に結合体化してもよい。本発明に用いる抗ＣＤ５２抗体は、さらに例えば、半減期などの抗体の薬物動態を向上させる化学反応または遺伝子改変を経由して他の部分（例えば、ＰＥＧ化部分）に結合体化してもよい。ある実施形態では、本発明に用いる抗ＣＤ５２抗体は、例えば、化学的結合体化または遺伝子改変（インフレームでサイトカインのコード配列を抗体コード配列に付着させ、これにより抗体‐サイトカイン融合タンパク質を創製する）を経由して好適なサイトカインに結合することができる。
ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の浸潤の増大
他のＴ細胞に比べた場合、例えば、炎症または組織障害部位などの局所組織へのこれら細胞の浸潤の増大を含めて、抗ＣＤ５２抗体が、ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を増大させる傾向があることを発見した。制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」またはサプレッサーＴ細胞としても知られる）は接触に依存するまたは接触に依存しない（例えば、サイトカインの産生）機構を経由して他のリンパ系細胞の増殖および/または機能を阻害することができる細胞である。γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびダブルネガティブＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞を含めて、いくつかのタイプの制御性Ｔ細胞が説明されている。Ｂａｃｈら、ＩＭＭＵＮＯＬ． ３：１８９〜９８（２００３）を参照のこと。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞は「天然に存在する」制御性Ｔ細胞として言及されており、ＣＤ４、ＣＤ２５およびホークヘッドファミリー転写因子ＦｏｘＰ３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐ３）を発現する。
治療している自己免疫疾患の症状を抑えるためにはＴｒｅｇの上昇が望ましくあり得る。従って、ＦｏｘＰ３＋（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）制御性Ｔ細胞を刺激する薬剤を患者に投与することができる。例えば、薬剤はこれらのＴ細胞を活性化し、これらの細胞の集団を拡大し、これらの細胞の循環を動員させかつ高め、および／またはこれらの細胞を標的部位に補充してもよい。かかる薬剤の例はラパマイシン、活性なまたは潜在性のＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、およびＴＧＦ−β５）、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＦＮ−α、ビタミンＤ３、デキサメタゾン、およびミコフェノール酸モフェチルである（例えば、Ｂａｒｒａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９５：６０３−６１６ （２００２）； Ｇｒｅｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６７： １９４５−１９５３ （２００１）； Ｂａｔｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １０５： ４７４３−４７４８ （２００５）； Ｂａｔｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７７： ８３３８−８３４７ （２０１０）を参照）。本発明のある実施形態では、Ｔｒｅｇの増大は１か所または複数の炎症部位（例えば、血液、中枢神経系、心臓、肝臓、関節、腎臓、皮膚、腸管、または血管系）で起こりうる。
抗ＣＤ５２抗体による治療前、その間、またはその後にＴｒｅｇ刺激剤を投与してもよい。本発明で使用する抗ＣＤ５２抗体は、Ｔエフェクター細胞およびＢ細胞を優先的に枯渇させるが、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇには優先的に影響を及ぼさない（例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２８： ２６０−２７０ （２００９）を参照）。従って、抗ＣＤ５２抗体およびＴｒｅｇ刺激剤の両方を用いる治療計画は患者の免疫系を再平衡させることでループス治療、または他の自己免疫疾患の治療の有効性を大いに高める。
尿タンパク質および／またはアルブミンレベルの減少
ループス患者は尿中の過剰な血清タンパク質またはアルブミンであるタンパク尿またはアルブミン尿を示す。ループスでは、尿中のタンパク質またはアルブミンのレベルで測定した腎損傷は最も急性の損傷の１つであり、死亡率の少なくとも５０％を占める。本発明の治療法（抗ＣＤ５２抗体のみ、または抗ＣＤ５２抗体とＴｒｅｇ刺激剤の併用）は患者の尿タンパク質および／またはアルブミンレベルを投与前のレベルと比べて少なくとも、２５％、５０％、７５％、または９０％減少させることができる。ある実施形態では、抗ＣＤ５２抗体の投与前の尿タンパク質レベルは少なくとも５００ｍｇ／Ｌ／日より大きいかまたは等しい（例えば、１、０００ｍｇ／Ｌ／日、２、０００ｍｇ／Ｌ／日、または３，０００ｍｇ／Ｌ／日）。抗ＣＤ５２抗体での最初の治療の後、尿タンパク質レベルが５００ｍｇ／Ｌ／日未満または１、０００ｍｇ／Ｌ／日未満に低下する。
併用療法
本発明のいくつかの様態では、併用療法ではループスの患者に１つ以上の追加の治療剤（例えば、免疫抑制剤）とともに抗ＣＤ５２抗体を投与することができる。第２の治療剤は例えば、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（例えば、シクロホスファミドまたはミコフェノール酸）、免疫抑制薬（例えば、メトトレキサートおよびアザチオプリン）、ＢまたはＴリンパ球を標的とする分子（例えば、ＣＤ２０抗体、例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）として知られているリツキシマブ、抗ＢＬｙｓ抗体、または抗ＢＡＦＦ−Ｒ抗体）であり得る。いくつかの実施様態では、追加の薬剤は、抗ＣＤ５２抗体によって媒介されたリンパ球除去の後に生じる再構成プロセスを歪曲し、操作し、および／または増強する、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ‐７）、抗サイトカイン受容体抗体、または可溶性受容体である（Ｓｐｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ： Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １１８２：２８−３８ （２００９）を参照）。抗ＣＤ５２抗体による治療前、その間、またはその後に追加の治療剤を投与することができる。
別途定義されないかぎり、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の技術者により一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本願において記載した同様のまたは等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することもできるが、代表的な例示的方法および材料について以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配するものとする。本明細書において多くの文献が引用されているが、この引用はこれらの文献のいかなるものも当該技術分野の技術常識の一部を形成するという容認を構成しない。本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む」、「含んでいる」または「含む」などの変法は、所定の整数または整数の群を含むことを意味することを理解されるべきであるが、任意の他の整数または整数の群を排除するものではない。材料、方法および実施例は例示のみを目的とするもので、限定するものではない。
実施例
以下の実施例は本発明の方法と材料を示すことを意図している。当該分野で通常見られるような記載した条件とパラメータについての好適な改変および調整は本発明の精神および範囲内にある。
マウスループスモデル
ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスは、ループスの自然発生モデルを示す。加齢とともに、動物は多くの細胞抗原に対する自己抗体を発生し、これは、最終的に腎臓における免疫複合体の沈着をもたらし、進行性の致死性の腎臓病となる（Ｐｅｕｔｚ−Ｋｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ １３７： ２４４−２６０ （２００１）を参照）。以下の実施例では、雌のＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスを使い全身性ループスの過程に対する抗ＣＤ５２抗体の効果を研究した。
抗ＣＤ５２抗体
実施例１から６では、モノクローナルラット抗マウスＣＤ５２ＩｇＧ２ａ抗体を使用した。そのラットアイソタイプはマウスでのエフェクター機能（例えば、補体結合および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）において最適なアイソタイプではない。実施例７と８では、モノクローナルＩｇＧ２ａマウス抗マウスＣＤ５２抗体を使用した。
実施例１から６では、ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウス（１５週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を４つの群に分け、それらを異なる試験項目で治療した（表１）。実施例１から６では、ナイトロジェンマスタードアルキル化剤であるシクロホスファミドを陽性対照として使用した。シクロホスファミドは各種の癌およびループスを含有した特定の自己免疫疾患の治療に使われてきた。
＊ラットＩｇＧ２ａＥＬＩＳＡにより、原液中の全タンパク質含有量の内１８４μｇ／ｍｌのみがラットＩｇＧ２ａから構成されていることが示され、これは有効用量がわずか１．７ｍｇ／ｋｇであることを示唆している。
実施例１から６の時間ポイントは以下の通りである。
ｉ）週齢１９週から開始してその後の４週間ごとに、ＩｇＧ抗２本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ）抗体力価を評価するために個々のマウスから血液を採取し、かつ、タンパク尿およびアルブミン尿を計測するために代謝ケージの中で２４時間の尿採取を行った。
ｉｉ）試験項目での治療を動物がｄｓＤＮＡに対する抗体の有意な力価および／またはタンパク尿の上昇を生じ始めた週齢３１週で開始した。正常ラットＩｇＧで治療するグループ２とラット抗マウスＣＤ５２抗体で治療するグループ３のそれぞれに合計２回の注射を与えた。シクロホスファミドで治療するグループ４は試験終了まで毎週注射を与えた。
ｉｉｉ）抗体の最初の注射の前に、ベースラインの蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）解析（ＣＤ３、ＣＤ１９陽性細胞を染色、リンパ球の絶対数を計数）のためにグループ２とグループ３から血液を採取した。
ｉｖ）抗体の最初の注射から２日後、２回目の抗体の注射をグループ２とグループ３に行った。２回目の注射の前に、フローサイトメトリー分析（ＣＤ３、ＣＤ１９陽性細胞を染色、絶対数を計数）のためにグループ２とグループ３から血液を採取した。さらにフローサイトメトリー染色のためにグループ２のマウス１匹およびグループ３のマウス１匹からの脾臓を採取した。試験期間中に瀕死状態になったあらゆる動物は屠殺し、可能な場合は腎臓１つを採取した。マウスが４３週齢に達したときに試験を終了し、組織学のために各動物から腎臓１つを採取した。
実施例１
ラット抗マウスＣＤ５２抗体で治療したＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおけるリンパ球の枯渇の欠如
モノクローナルラット抗マウスＣＤ５２抗体での治療がＣＤ５２＋リンパ球の枯渇に繋がったのかどうかを測定するために、ラットＩｇＧまたはラット抗マウスＣＤ５２の最初の注射の前にベースラインで、そしてその２日後抗体の第２回注射の前に個々のマウスから血液を採取した。ＣＤ３＋Ｔ細胞およびＣＤ１９＋Ｂ細胞の絶対数を得るために、血液試料を染色してフローサイトメトリーにより分析した。５０μｌの全血試料をＲＰＭＩ培地中の１０％正常マウス血清と０．０５％アジ化ナトリウムでブロッキングし、次にラット抗マウスＣＤ３‐ＡＰＣおよびラット抗マウスＣＤ１９‐ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で染色についてリンパ球を分析した。データ解析をＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。結果は、ＢまたはＴリンパ球の有意な枯渇は無いことを示した（図１Ａおよび１Ｂ）。
実施例２
タンパク尿およびアルブミン尿のレベル
Ａ．タンパク尿のレベル
製造業者（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ−ＰＲ，Ｓｉｇｍａ）の指示書に従い総タンパク質濃度を測定するように設計された比色検定を用いて個々のマウスの尿中のタンパク質レベルを測定した。試験試料のタンパク質濃度を計算するために標準物質を使用した。計測時点でのリンパ球の枯渇の欠如にもかかわらず、ラット抗マウスＣＤ５２抗体での治療は、尿中総タンパク質レベルによって計測される腎臓病の進行を阻害において成功であった（図２Ａから２Ｅ）。試験期間中、抗マウスＣＤ５２治療マウスが陽性対照のシクロフォスファミド治療群のマウスと同等な尿タンパク質レベルであったことを示した一方、対照ラットＩｇＧ治療マウスが媒体対照マウスと同等の尿タンパク質レベルを示した（図２Ａから２Ｅ）。６７％のラットＩｇＧと６０％の媒体治療マウスと比べて、３８％の抗マウスＣＤ５２抗体治療マウスと２０％のシクロフォスファミド治療マウスだけが重度の蛋白尿（５００ｍｇ／ｄＬ／日超）に達した（図２Ｆ）。
Ｂ．アルブミン尿のレベル
製造業者（Ａｌｂｕｗｅｌｌ−Ｍ， Ｅｘｏｃｅｌｌ， Ｉｎｃ．）の指示書に従って、尿中のアルブミンレベルは間接的競合ＥＬＩＳＡキットを用いて評価した。尿試料中のアルブミン濃度はマウスアルブミンの既知濃度で得た標準曲線由来である（図３Ｂ）。さらに、半定量的な「Ａｌｂｕｓｔｉｘ」法（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（図３Ａ）を使用した。ここでは、尿にあるアルブミン量によって色が変わるインジケーター濾紙に尿が沈着し、対応する０から６までのスコアを割り当てた。総タンパク質レベルと同じように、抗マウスＣＤ５２抗体による治療はＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスでのアルブミン尿の発現抑制に有効であった（図３Ａから３Ｇ）。抗ＣＤ５２抗体治療マウスの尿中アルブミンレベルは媒体およびラットＩｇＧ治療マウスに認められるレベルよりも低かった。しかしながら、この群に見られるアルブミン尿の抑制はシクロフォスファミド治療群で得られた抑制ほど大きくはなかった。試験の終わりまでに、８０％の媒体治療マウスと８９％のラットＩｇＧ治療マウスと比べて、５０％の抗ＣＤ５２抗体治療マウスだけに有意なアルブミン尿（４０ｍｇ／ｄＬ／日超）を発症した（図３Ｇ）。
実施例３
２本鎖ＤＮＡに対する抗体レベル
個々のマウスからの血清試料中のｄｓＤＮＡに対するＩｇＧ抗体の力価をＥＬＩＳＡで計測した。あらゆるｓｓＤＮＡを除去するためにマウスｄｓＤＮＡ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＢａｒＨａｒｂｏｒ， ＭＥ）をＳ１ヌクレアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）により消化して、次に、４℃で一晩、９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡプレートのウエルをコーティングをするのに使用した（１μｇ／ｍｌ ｄｓＤＮＡの１００μｇ／ウエル）。ＤＮＡの付着を促進するためにプレートを水中の０．０１％硫酸プロタミンで予め処理した。コーティングをした後、プレートを２．５％のウシ血清アルブミンブロッキングバッファーと共に３７℃で１時間インキュベートし、洗浄した。次に、血清の系列２倍希釈物１００μｌを２連のウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ｄｓＤＮＡに結合した抗体を検出するために西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を添加した（３７℃で１時間）。洗浄した後、ＨＲＰ基質を添加し、二重波長プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）で参照波長６５０ｎＭと共に４９０ｎＭの比色分析産物の光学密度（ＯＤ）を読み取った。抗体力価は０．１より大きい、または等しいＯＤを得る血清の希釈倍数の逆数として定義された。正常マウス血清を陰性対照（力価２００以下、試験での最小希釈）として使用し、老齢ループスマウスからのプール血清を陽性対照（２５，６００の力価）として使用した。ラット抗マウスＣＤ５２抗体での治療はｄｓＤＮＡに対する自己抗体の発生に対して何ら検出可能な効果がなかった（図４）。抗マウスＣＤ５２で治療されたマウスの抗体力価は媒体およびラットＩｇＧ治療マウスの力価と同等であった。シクロフォスファミド治療のみがｄｓＤＮＡに対する血清抗体の上昇を効果的に減少させた（図４）。
実施例４：生存の改善
ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいてラット抗マウスＣＤ５２抗体による治療の忍容性は良好であった。同等のレベルの生存は抗マウスＣＤ５２抗体の２回用量（７５％生存）とシクロフォスファミドの毎週の注射（８０％）で得た（Ｐ値＝０．９２１８、抗マウスＣＤ５２抗体 対 シクロフォスファミド）（図５）。対照ラットＩｇＧで治療されたマウスでは生存は２０％だけであった（Ｐ値＝０．０４０１、抗マウスＣＤ５２抗体 対 対照ラットＩｇＧ）（図５）。比較をすると、媒体治療マウスは６０％の生存率を示し、このことは、対照ラットＩｇＧ群に大量の免疫グロブリンタンパク質の注射により恐らくは腎臓のストレスで疾患を悪化させ得るが、一方では、同量の抗マウスＣＤ５２材料では治療上の利益を提供したことを示唆する。
実施例５
腎臓の組織学検査
屠殺時に、腎臓を収集し、１０％の中性緩衝ホルマリンで固定し、次にパラフィン包埋した。切片は５μｍの厚さに切断し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）、リンタングステン酸ヘマトキシリン（ＰＴＡＨ）および過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染料で染色した。試験期間中に、陰性対照群（媒体およびラットＩｇＧ）の数匹の動物は屠殺する必要があったか、死亡で発見された。結果的に、試験終了時の解析に使える腎臓の数が少なくなり統計学的検出を限定した。
採取した腎臓をさらに調べた。治療群間において正中糸球体症、間質性炎症またはタンパク質カスト重症度スコアには統計的に有意な違いは無かった（図６Ａから６Ｃ）。しかしながら、ある種の傾向が認められた。ラットＩｇＧおよび媒体対照群と比べて抗マウスＣＤ５２抗体およびシクロフォスファミドでの治療が正中糸球体症スコアを減少させた（図６Ａ）。シクロフォスファミド治療群において間質性炎症の減少も認められた（図６Ｂ）。
実施例６
腎臓におけるＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の増大
免疫蛍光的にタグを付けられた抗体を用いて実施例５で得た腎臓の切片を、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＦｏｘＰ３＋細胞の存在について更に染色した。ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞の染色については、陽性細胞上に褐色染色を出すために腎臓凍結切片をアセトン固定し、ペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）、アビジン、ビオチン（Ｂｉｏｃａｒｅ）、およびタンパク質（Ｄａｋｏ）ブロックで連続的にインキュベートし、次にビオチン化ラット抗マウスＣＤ４（クローンＬ３Ｔ４； ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはビオチン化ヤギ抗マウスＣＤ８（クローンＬｙ−２； ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ストレプトアビジン‐ＨＲＰおよびＤＡＢ（３−３’‐ジアミノベンジジン）でインキュベートした。ＦｏｘＰ３陽性細胞の染色については、腎臓凍結切片を１０％の中性緩衝ホルマリンで固定し、ペルオキシダーゼおよびタンパク質ブロックで連続的にインキュベートした。次に、陽性細胞上に褐色染色を出すためにラット抗マウスＦｏｘＰ３抗体を添加し（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、そして次にＭａｃｈ−２ＨＲＰ結合体化抗ウサギ抗体（Ｂｉｏｃａｒｅ）およびＤＡＢを添加した。次に、細胞を可視化するために全ての切片をヘマトキシリンでさらに染色した。陽性細胞の相対存在量について盲検下で切片を０から４までのスケールでスコアを付けた。シクロフォスファミド治療により腎臓に浸潤するＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＦｏｘＰ３＋細胞が有意に減少した（図７Ａから７Ｃ）。これに比べて、抗ＣＤ５２抗体での治療ではＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球により腎臓への浸潤を防ぐことができなかったが、制御性Ｔ細胞のマーカーであるＦｏｘＰ３について陽性の細胞の存在を増大させた（図７Ａから７Ｃ）。
実施例７
モノクローナルマウス抗マウスＣＤ５２抗体で治療したＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおけるリンパ球の枯渇
所内で作製したモノクローナルＩｇＧ２ａマウス抗マウスＣＤ５２抗体（クローンＷ１９）を用いてマウスＣＤ５２を標的にすることを介したリンパ球枯渇にループスマウスが感受性であるかどうかを測定するために枯渇実験を実施した。ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスを、媒体、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのモノクローナルマウス抗マウスＣＤ５２抗体で治療した。治療から３日後、脾細胞および末梢血を採取しフローサイトメトリーを用いてリンパ球枯渇の程度を評価した。抗体のすべての用量レベルで有意なレベルのリンパ球枯渇が血液と脾臓の両方で認められた。血液（図８Ａ）において、全てのリンパ球系集団に用量−依存性枯渇が認められ、５ｍｇ／ｋｇ用量と１０ｍｇ／ｋｇ用量は、全ての細胞型のほぼ完全な枯渇がおこる。脾臓（図８Ｂ）において、類似した用量−依存性枯渇が認められる。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の有意な枯渇が脾臓で認められる一方で、検査した全ての用量レベルでＢ細胞は、より少ない程度まで枯渇されるように思われる。
実施例８
雌のＮＺＢ／ＮＺＷマウスにおける抗マウスＣＤ５２抗体の有効性の分析
実施例７で使用したモノクローナル抗マウスＣＤ５２抗体をＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスループスモデルでの疾患の発症および／または進行に与える影響について試験した。初めに、明らかな疾患の発症の前に約２１週齢の１０匹のマウスの群に１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体またはモノクローナルマウス抗マウスＣＤ５２抗体の２回の注射を１週間あけて与える。疾患の過程の間に、約３２週齢の１０匹のマウスの個別の群に１０ｍｇ／ｋｇの対照抗体またはモノクローナルマウス抗マウスＣＤ５２抗体の２回の注射を１週間あけて与える。約２１週齢で開始し、陽性対照群に、５０ｍｇ／ｋｇのシクロフォスファミドを毎週与える。以下の読み取り値を調べる。１）フローサイトメトリーで測定したリンパ球の枯渇、２）ＥＬＩＳＡで測定したｄｓＤＮＡに対する自己抗体の発生、３）タンパク尿、および４）腎臓の組織学解析、ならびにこの方法によりＣＤ５２を標的にすることが腎損傷を緩和する程度をさらに測定する。

Claims (1)

  1. 本願図面に記載の発明。
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