JP2016540777A - リポソーム粒子、前述のものを作製する方法及びその使用 - Google Patents

Abstract

小単層小胞（ＳＵＶ）と呼ばれるリポソームは、２０−５０ｎｍサイズの範囲で合成することができるが、粒子間の融合をまねく不安定性及び凝集などの課題に遭遇し得る。これは、治療上の送達薬剤としてのこれらの使用を制限する。ＳＵＶの表面陰電荷を増加させることは、ＤＮＡ／ＲＮＡなどの陰イオン性実体の付着を介して、これらの小胞のコロイド性安定度を増加させる。加えて、核酸の密度の高い球状配置及び放射状配向は、これらの直鎖状の対応物と異なった独特の化学的及び生物学的特性を示す。これらのリポソーム粒子は、無毒性及びしかし陰イオン性であり、非免疫原性様式で補助的な陽イオントランスフェクション薬剤を用いずに、細胞に効率的に入ることができる。これらの例外的な特性は、異なる療法における遺伝子制御のための送達薬剤としてのこれらの使用を可能にし、及び金属コア球状核酸に代わるプラットフォームを提供する。

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１３年１２月３日に出願のＵ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ６１／９１１，３３４及び２０１４年４月２１日に出願のＵ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ６１／９８２，２６９の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）下での優先権利益を主張し、その開示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
政府関心対象の記載
本発明は、Ｄｅｆｅｎｓｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ａｇｅｎｃｙによって授与されるＨＲ００１１−１３−２−００１８及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与されるＣＡ１５１８８０下で政府の支援を伴って行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

配列表
本出願は、本開示の別々の部分として、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含み（ファイル名：２０１３−２０１＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇｔｘｔ；作製：２０１４年１２月３日；１，８９３バイト）、それはその全体が参照により援用される。

本開示は、リポソーム粒子、前述のものを作製する方法及びその使用に関する。リポソーム粒子は、遺伝子制御及び薬物送達において有用である。

化学は、リポソーム及び小単層小胞（ＳＵＶ）を作製することを探索してきた。たとえば、Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， “ＤＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ２０１０／０１４４８４８は、２つの親油性アンカーで修飾されたＤＮＡが、リポソームまたはＳＵＶを形成することができることを開示する。この後修飾技術は、高表面密度修飾には馴染まない。

Ｈｏｏｋ ｅｔ ｅｌ．， “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ”， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ２０１３／０２５２８５２は、作製されるリポソームまたはＳＵＶが核酸の第１の鎖及び第２の鎖、並びにその末端に位置した２つ以上の疎水性のアンカリング部分を有するオリゴヌクレオチドを有し、疎水性のアンカリング部分は、二重層において見いだされるものを記述する。２つのコレステロール分子が脂質二重層の中に分子をアンカーするのに使用されるので、この後修飾技術は、高表面密度修飾には馴染まない。

Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， “Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ”， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ２０１０／０１６６８４２は、互いにハイブリダイズされる少なくとも２つのヌクレオチドセグメントを含むリポソームまたはＳＵＶを記述する。小胞に基づいたこの非修飾後技術は、それが脂質二重層の両側に安定化部分を組み込むので、小胞を安定させることにはあまり効率的でない。

また、非特許文献は、リポソーム及びＳＵＶを作製するための化学を示すが、これらの化学のそれぞれは、その問題も有する。たとえば、“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−Ａｎｃｈｏｒｅｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ａｐｔａｍｅｒｓ” Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， １９９８， ９， ５７３−５８２は、アプタマーＤＮＡ機能性リポソームの合成及び選択的な癌細胞ターゲティングへのこれらの応用を記述する。この方法によって作製されるリポソームは、８０ナノメートルのサイズの平均で、双脂質層の両側にアプタマーＤＮＡ分子を有し、及び遺伝子制御を示さなかった。

“Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ Ａｐｔａｍｅｒ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ” Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００９， ４８， ６４９４−６４９８は、アプタマーＤＮＡ機能性リポソームの合成及び選択的癌細胞ターゲティング及び薬物送達へのこれらの応用を記述する。１４０ナノメートル〜２００ナノメートルの間の平均になるこの方法によって作製されるリポソームは、コレステロールユニットを利用して脂質二重層にＤＮＡをアンカーし、双脂質層の両側にアプタマーＤＮＡ分子を含み、及び遺伝子制御を示さなかった。

“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｗｉｔｈ ａｐｔａｍｅｒ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ” Ｊ． Ｍａｔｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， ２０１３， １， ５２８８は、アプタマーＤＮＡ機能性リポソームの合成及び選択的な癌細胞ターゲティング及び薬物送達へのこれらの応用を開示する。この研究は、上の“Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ Ａｐｔａｍｅｒ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”において開示された研究の延長である。以前のように、これらの粒子は、コレステロールユニットを利用して脂質二重層の中にＤＮＡをアンカーし、双脂質層の両側にアプタマーＤＮＡ分子を含み、及び遺伝子制御を示さなかった。

“Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｄｅｃｏｒａｔｅｄ ｂｙ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−Ｂａｓｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ｓｏｆｔ Ｈｙｂｒｉｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ” Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， ２００８， １１２， １０９４２−１０９５２における研究は、コレステロールＤＮＡ機能性リポソームを特徴づける。この報告において、３３〜３５ｎｍのサイズのリポソームは、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）脂質から作製され、及びコレステロール修飾ＤＮＡ分子で後機能化された。この報告は、遺伝子制御を示さず、及びこれらの粒子は、コレステロールユニットを利用して脂質二重層にＤＮＡをアンカーする。

“Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−Ｂａｓｅｄ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ” Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００４， １２６， １０２２４−１０２２５は、脂質二重層の中へのアンカリングのための２つのコレステロールユニットを含む部分的に二重化されたＤＮＡ鎖の開発を記述する。脂質二重層の中にＤＮＡ鎖をアンカーする２つのコレステロールユニットの使用は、リポソームと会合するオリゴヌクレオチドの表面密度の減少をもたらす。

“Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ” Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２００６， ７８， ７４９３−７４９８において、研究者は、機能性リポソームナノ粒子上のＤＮＡ鎖の定量化のための技術の開発を記述する。記述された粒子は、脂質二重層の中へのアンカリングのための２つのコレステロールユニットを含む部分的に二重化されたＤＮＡ鎖を含む。脂質二重層の中にＤＮＡ鎖をアンカーする２つのコレステロールユニットの使用は、リポソームと会合するオリゴヌクレオチドの表面密度の減少をもたらす。

“Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ Ｔａｒｇｅｔｓ” Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ． ２００８， ８， １８３−１８８は、２つのコレステロールユニットを含む部分的に二重化されたＤＮＡ鎖で機能化された１００ナノメートルサイズのリポソームを開示する。この研究は、上の“Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−Ｂａｓｅｄ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ”及び“Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ”において開示された研究の延長である。以前のように、これらの粒子は、脂質二重層の中へのアンカリングのための２つのコレステロールユニットを含む部分的に二重化されたＤＮＡ鎖を含む。脂質二重層の中にＤＮＡ鎖をアンカーする２つのコレステロールユニットの使用は、リポソームと会合するオリゴヌクレオチドの表面密度の減少をもたらす。

“ＤＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ” Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００７， １２９， ９５８４−９５８５は、コレステロールＤＮＡ機能性リポソームナノ粒子の融合の解析論文である。この論文において利用される小胞は、少なくとも１００ナノメートルのサイズであった。

“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ｚｉｐｐｅｒｓ” Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， ２００８， １１２， ８２６４−８２７４は、コレステロールＤＮＡ機能性リポソームナノ粒子の融合の解析論文であり、及び上で記述された“ＤＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ”からの研究の続きである。この論文は、配列特異的融合を脂質二重層にオリゴヌクレオチドをアンカーするための２つのコレステロールユニットを含む部分的に二重化されたＤＮＡ鎖（たとえば、上の“Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ”において見いだされた部分的に二重化されたＤＮＡ鎖）の利用と組み合わせる。

“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−Ｂａｓｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂａｒｃｏｄｅｓ ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ” Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， ２０１０， １０， ７３２−７３７は、ＤＮＡ配列に応じて特異的ＤＮＡ標的の検出の解析論文である。これは、配列特異的融合を異なるＤＮＡアンカリング（ビスコレステリルアンカーを使用して、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２００６， ７８， ７４９３−７４９８を参照されたい）と組み合わせる報告された“ＤＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ”と同じグループからの研究の延長である。
“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｂｙ ＤＮＡ”は、コレステロールＤＮＡ機能性リポソームのアセンブリーを開示する解析論文である。この論文では、１１４及び２５１ｎｍの流体力学的直径をもつリポソームが合成され、及びコレステロール修飾ＤＮＡ分子で合成的に後機能化された。この報告における粒子は、脂質二重層の中へのオリゴヌクレオチド分子のコレステロールアンカリングを利用する。

米国特許出願公開第２０１０／０１４４８４８号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０２５２８５２号明細書 米国特許出願公開第２０１０／０１６６８４２号明細書

"Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−Ａｎｃｈｏｒｅｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ａｐｔａｍｅｒｓ" Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， １９９８， ９， ５７３−５８２ "Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃｅｌｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｗｉｔｈ Ａｐｔａｍｅｒ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ" Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ２００９， ４８， ６４９４−６４９８ "Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｗｉｔｈ ａｐｔａｍｅｒ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ" Ｊ． Ｍａｔｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， ２０１３， １， ５２８８ "Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ Ｄｅｃｏｒａｔｅｄ ｂｙ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−Ｂａｓｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ｓｏｆｔ Ｈｙｂｒｉｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ" Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， ２００８， １１２， １０９４２−１０９５２ "Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−Ｂａｓｅｄ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ" Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００４， １２６， １０２２４−１０２２５ "Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ" Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２００６， ７８， ７４９３−７４９８ "Ｓｉｎｇｌｅ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ Ｔａｒｇｅｔｓ" Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ． ２００８， ８， １８３−１８８ "ＤＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ" Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００７， １２９， ９５８４−９５８５ "Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ｚｉｐｐｅｒｓ" Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ， ２００８， １１２， ８２６４−８２７４ "Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−Ｂａｓｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂａｒｃｏｄｅｓ ｆｏｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ" Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， ２０１０， １０， ７３２−７３７

リポソームは、親水性のコアをもつ１つまたはいくつかの疎水性の脂質二重層からなる様々なサイズ範囲の球状の、自己閉鎖構造である。これらの脂質の直径は、０．１５〜１マイクロメートルの範囲の担体を基礎とし、それは、２０〜１００ナノメートルの有効な治療上の範囲より有意に高い。小単層小胞（ＳＵＶ）と呼ばれるリポソームは、２０〜５０ナノメートルのサイズ範囲で合成されることができるが、粒子間融合をまねく不安定性及び凝集などの課題に遭遇し得る。この粒子間融合は、治療におけるＳＵＶの使用を限定する。

この不安定性と戦うために、ＳＵＶは、２つの異なる技術によって関心対象の重合体、ペプチド、ＤＮＡ及びその他の分子で機能化することができる。第１のアプローチにおいて、関心対象の修飾された分子は、リポソームの合成の間に脂質、脂質フィルムまたは水和緩衝液の混合物に添加される。このアプローチは、リポソーム膜の内側及び外側層両方に関心対象の機能分子を含むリポソームを生じる。一般的にいって、この方法によって作製される構造は、８０ナノメートル（ｎｍ）より小さいサイズで安定でない。代わりのアプローチにおいて、ＳＵＶは、予め形成された小胞（「修飾後技術」）の脂質二重層の中に関心対象の基質をアンカーすることによって作製され得る。この代わりのアプローチは、リポソーム膜の外層に関心対象の機能分子を含むリポソームナノ粒子をもたらす。重要なことに、この代わりの修飾後アプローチは、５０ナノメートル未満でさえ、任意のサイズのリポソームの作製を可能になる。

したがって、一つの態様において、本開示は、親油性末端及び非親油性末端を含む構築物を提供する。親油性末端は、いくつかの実施形態において、トコフェロールを含む。さらなる実施形態において、トコフェロールは、アルファ−トコフェロール、ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール及びデルタ−トコフェロールからなる群より選択される。

非親油性末端は、さらなる実施形態において、荷電重合体である。いくつかの実施形態において、荷電重合体は、オリゴヌクレオチドである。関連した実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み、及び種々の実施形態において、ＲＮＡは、調節性機能を行う阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。なおさらなる実施形態において、ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡと三本鎖を形成するＲＮＡ及びリボザイムからなる群より選択される。さらなる実施形態において、ＲＮＡは、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）であり、またはＲＮＡは、調節性機能を行うマイクロＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、アンチセンスＤＮＡである。

もう一つの態様において、本開示は、本開示の構築物を作製するための方法であって、方法は、オリゴヌクレオチドを提供すること、ホスホラミダイト−修飾−トコフェロールを提供すること、及び前記オリゴヌクレオチドを前記ホスホラミダイト−修飾−トコフェロールに曝露して本開示の構築物を作製することを含む方法を提供する。

さらなる態様において、リポソーム粒子は、本開示によって提供され、前記リポソーム粒子は、実質的に球状形状を有し、前記リポソーム粒子は、複数の脂質基を含む脂質二重層及びオリゴヌクレオチドを含む。

種々の実施形態において、前記複数の脂質基が脂質のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジルエタノールアミンファミリーからなる群より選択される脂質を含むことが、本開示によって想定される。

種々の実施形態において、前記脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）からなる群より選択される。

さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、親油性連結基を含むオリゴヌクレオチド−脂質抱合体であり、前記親油性連結基は、脂質二重層に吸着される。種々の実施形態において、親油性連結基は、トコフェロールまたはコレステロールを含む。

また、本開示は、種々の実施形態において、トコフェロールが、トコフェロール誘導体、アルファ−トコフェロール、ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール及びデルタ−トコフェロールからなる群より選択されることを想定する。さらに他の実施形態において、また、本開示は、親油性連結基（すなわち、脂質アンカー）が、たとえば及び限定なしに、パルミトイル、ジパルミトイル、ステアリルまたはジステアリルを含むことを想定する。

オリゴヌクレオチドは、さらなる実施形態において、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。さらなる実施形態において、ＲＮＡは、非コードＲＮＡであり、及びなおさらなる実施形態において、非コードＲＮＡは、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。本開示は、いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉが低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡと三本鎖を形成する一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及びリボザイムからなる群より選択されることをさらに想定する。さらなる実施形態において、ＲＮＡは、マイクロＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡは、アンチセンスＤＮＡである。

種々の実施形態において、前記リポソーム粒子の直径は、約５０ナノメートル以下である。表面密度に関して、本開示は、組成物及び方法を提供し、リポソーム粒子は、約１０〜約１００オリゴヌクレオチドまたは約１０〜約８０オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、粒子は、７０オリゴヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾されたオリゴヌクレオチドである。

本開示のもう一つの態様において、リポソーム粒子を作製する方法であって、方法は、溶媒にリン脂質を添加して第１の混合物を形成することであり、前記第１の混合物は、複数のリポソームを含むこと；前記複数のリポソームを破壊して第２の混合物を作製することであり、前記第２の混合物は、リポソーム及び小単層小胞（ＳＵＶ）を含むこと；前記第２の混合物から前記ＳＵＶを単離することであり、前記ＳＵＶは、約２０ナノメートル〜５０ナノメートルの間の粒径を有すること；及びオリゴヌクレオチドを単離されたＳＵＶに添加してリポソーム粒子を作製することを含む方法が提供され。

いくつかの実施形態において、前記第１の混合物中の複数のリポソームの粒径は、約１００ナノメートル〜１５０ナノメートルの間にある。さらなる実施形態において、前記第２の混合物中のリポソーム及びＳＵＶの粒径は、約２０ナノメートル〜約１５０ナノメートルの間にある。なおさらなる実施形態において、リポソーム粒子は、約５０ナノメートル以下の粒径を有する。

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、親油性連結基を含むオリゴヌクレオチド−脂質抱合体であり、前記親油性連結基は、脂質二重層に吸着される。関連した実施形態において、親油性連結基は、トコフェロールまたはコレステロールを含む。さらなる実施形態において、トコフェロールは、トコフェロール誘導体、アルファ−トコフェロール、ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール及びデルタ−トコフェロールからなる群より選択される。

さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。ＲＮＡは、いくつかの実施形態において、非コードＲＮＡである。さらなる実施形態において、非コードＲＮＡは、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。本開示は、さらなる実施形態において、ＲＮＡｉが、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡと三本鎖を形成する一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及びリボザイムからなる群より選択されることをさらに想定する。

いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、マイクロＲＮＡである。種々の実施形態において、ＤＮＡは、アンチセンスＤＮＡである。

いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾されたオリゴヌクレオチドである。

本開示のもう一つの態様において、遺伝子の発現を阻害する方法であって、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを前記ポリヌクレオチドの全体または一部に相補的な１つまたは複数のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする工程を含み、前記オリゴヌクレオチドは、本開示のリポソーム粒子に付着され、前記ポリヌクレオチドと前記オリゴヌクレオチドとの間でハイブリダイズすることは、前記遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な相補性の程度で前記ポリヌクレオチドの長さにわたって起こる方法が提供される。

いくつかの実施形態において、前記遺伝子産物の発現は、インビボで阻害される。さらなる実施形態において、前記遺伝子産物の発現は、インビトロで阻害される。

さらなる実施形態において、リポソーム粒子は、約５０ナノメートル以下の直径を有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。ＲＮＡは、いくつかの実施形態において、非コードＲＮＡである。関連した実施形態において、非コードＲＮＡは、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。また、本開示は、ＲＮＡｉが、種々の実施形態において、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡと三本鎖を形成する一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及びリボザイムからなる群より選択されることを想定する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、マイクロＲＮＡである。さらなる実施形態において、ＤＮＡは、アンチセンスＤＮＡである。

本開示のもう一つの態様において、トール様受容体（ＴＬＲ）を有する細胞を開本示のリポソーム粒子と接触させることを含むトール様受容体の活性をアップレギュレートするための方法が、提供される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲアゴニストである。さらなる実施形態において、トール様受容体は、トール様受容体１、トール様受容体２、トール様受容体３、トール様受容体４、トール様受容体５、トール様受容体６、トール様受容体７、トール様受容体８、トール様受容体９、トール様受容体１０、トール様受容体１１、トール様受容体１２及びトール様受容体１３からなる群より選択される。

さらなる態様において、本開示は、トール様受容体（ＴＬＲ）を有する細胞を本開示のリポソーム粒子と接触させることを含むトール様受容体の活性をダウンレギュレートするための方法を提供する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲアンタゴニストである。さらなる実施形態において、トール様受容体は、トール様受容体１、トール様受容体２、トール様受容体３、トール様受容体４、トール様受容体５、トール様受容体６、トール様受容体７、トール様受容体８、トール様受容体９、トール様受容体１０、トール様受容体１１、トール様受容体１２及びトール様受容体１３からなる群より選択される。

また、本開示は、種々の実施形態において、本明細書において開示される方法がインビトロで行われることを想定する。さらなる実施形態において、本開示は、本明細書において開示される方法がインビボで行われることを想定する。

脂質小胞の表面上のＤＮＡまたはＲＮＡで機能化された小単層小胞（ＳＵＶ）の合成を示す。より大きいサイズのリポソームは、プローブ超音波処理器を使用してＳＵＶに音波破砕され、及び超遠心分離によって重い不純物から分離される。 小単層小胞（ＳＵＶ）からのリポソーム粒子の特性付けを示す。動的光散乱法（ＤＬＳ）粒径データ及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を機能付与前及び後に得た。 リポソームにオリゴヌクレオチドをアンカーするための異なる親油性末端を有するオリゴヌクレオチドで安定するリポソーム粒子の安定度を示す。トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドで安定するリポソームは、裸のリポソーム、コレステロール修飾オリゴヌクレオチドで安定するリポソーム、及びステアリル修飾オリゴヌクレオチドで安定するリポソームより優れた安定度を示す。ａ）異なる親油性末端を有するオリゴヌクレオチドで機能化されたＦＩＴＣカプセル化ＳＵＶのゲル電気泳動画像；ｂ）及びｃ）Ｃｙ５標識されたＤＮＡで機能化されたＦＩＴＣカプセル化ＳＵＶのゲル電気泳動画像。 オリゴヌクレオチドで安定したリポソーム粒子が、優れた温度安定性を有することを示し、及びＳＵＶを安定させるのに使用されたトコフェロール修飾ＤＮＡ濃度の範囲を示す。ａ）４℃にて貯蔵されたＬＳＮＡと比較して２４時間３７℃にて貯蔵された後のリポソームＳＮＡ（ＬＳＮＡ）の安定性ｂ）。ＳＵＶを安定させるのに使用されたα−トコフェロール修飾ＤＮＡ濃度の範囲を示すゲル電気泳動。 本明細書において開示したリポソーム粒子が細胞に入ることができることを示す共焦点画像を含む。ＨｅＬａ細胞を無血清培地中１００ｎＭの濃度でのＤＮＡ（ｄＴ_３０−Ｃｙ５またはｄＴ_３０）で処理し、及び１６時間後に解析した。 トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドで安定するリポソームが、修飾されていないままのリポソームと比較して細胞における実質的細胞毒性効果を示さないことを示す細胞生存度アッセイデータを示す。 ＤＯＰＣ ＳＵＶ及びトコフェロール修飾ＤＮＡからのリポソーム球状核酸（ＳＮＡ）のアセンブリーを示す。 ＳＵＶ及びＬＳＮＡの安定度研究を示す。（Ａ）緩衝液中で加熱後のＳＵＶの動的光散乱特性。（Ｂ）緩衝液中で加熱後のＬＳＮＡの動的光散乱特性。（Ｃ）ウシ血清アルブミン、ウシ胎児血清の主要成分の存在下でのリポソーム分解の略図。（Ｄ）溶液の蛍光における増加を生じさせるカプセル化されたローダミン色素の放出によってモニターしたときの、１０％ウシ胎児血清の存在下でのＳＵＶ（上側線）及びＬＳＮＡ（下側線）の分解。 （Ａ）２６０ｎｍにて吸光度としてモニターされるリポソーム−ＳＮＡ凝集体の融解転移（Ｂ）凝集（下側線）の前及びリンカーＤＮＡ鎖の存在下での凝集の後（上側線）のリポソーム−ＳＮＡの吸光度スペクトルを示す。 （Ａ）２４時間１００ｎＭ Ｃｙ５標識リポソーム−ＳＮＡとインキュベートしたＳＫＯＶ３細胞の共焦点顕微鏡写真を示す。細胞核をヘキスト３３３４２で染色する。（Ｂ）ＭＴＴアッセイによるＳＫＯＶ３細胞におけるリポソーム−ＳＮＡ及びＤｈａｒｍａＦＥＣＴ−ＤＮＡ複合体の細胞毒性測定。（Ｃ）インキュベーションの１時間（それぞれの群における左棒）及び３６時間（それぞれの群における右棒）後にフローサイトメトリーによって定量化されたＳＫＯＶ３細胞における５−Ｃｙ５標識ＤＮＡ鎖及び５’−Ｃｙ５標識リポソーム−ＳＮＡの細胞取り込み。（Ｄ）１μＭ ＤＮＡ濃度にて抗ＨＥＲ２リポソーム−ＳＮＡ構築物を使用するＳＫＯＶ３細胞におけるＨＥＲ２遺伝子ノックダウン。 単離及び精製の後のＳＵＶのＴＥＭ顕微鏡写真を示す。 Ａ）所与の溶液におけるリポソームの総数を算出する際に使用した方程式。脂質の濃度を、ＩＣＰを使用して決定することができる。本明細書において記述した大部分の研究については、使用脂質濃度１．３ｍＭは、粒子（４ｐｍｏｌ ｃｍ^−２）あたり１．３６１×１０^１７リポソーム／Ｌ及び７１ ＤＮＡ鎖のＤＮＡ充填を示す。Ｂ）見積もられたオリゴヌクレオチド充填に応じたリポソームＳＮＡの粒子移動度を示す。 １％ アガロースゲル電気泳動画像上の５’−Ｃｙ５標識ＤＮＡ鎖で機能化されたＦＩＴＣカプセル化ＬＳＮＡの移動を示す。Ｂ）ネガティブに荷電されたＤＮＡコロナの存在のためにゲル上のリポソームコアの移動を示すＦＩＴＣチャンネル。Ｃ）Ｃｙ５チャンネルは、リポソーム構築物上で遊離鎖と機能化されたそれらとの間のサイズ相違のための移動度における相違を示す。両方のチャンネルは、同じバンド上で局在する。 Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦ−κＢ／ＡＰ−１リポーターシステムを示す。 ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドに曝露されるときのＲａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞の活性化を示す。 リポソームＳＮＡの合成の図描写である。 様々な数のオリゴヌクレオチドで機能化された表面であったリポソームＳＮＡのゲル電気泳動画像を示す。３０ｎｍ ＳＵＶの濃度は、０．２２μＭ（元素分析によってリン脂質含有量の解析によって決定し、及びおおよそ３０ｎｍ ＳＵＶあたり２．２×１０^３リン脂質）であった。 リポソーム粒子がＨＩＦ１−αの発現をノックダウンするのに使用された実験の結果を示す。 リポソーム粒子がＢＡＸの発現をノックダウンするのに使用された実験の結果を示す。

詳細な説明
球状核酸（ＳＮＡ）ナノ粒子抱合体は、無機ナノ粒子鋳型から典型的に合成される構造及びこのような粒子の表面に固定された高度に配向された核酸リガンドのシェルである［Ｍｉｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８２： ６０７ （１９９６）］。ＳＮＡは、様々な異なる形態で作成された［Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３４： １３７６ （２０１２）； Ｗｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ； Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ： Ｖｏｌ． １１１９， ｐ １−２０ （２０１２）］。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ［Ｓｅｆｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ８： １２３０ （２００７）］及びＰＮＡ［Ｌｙｔｔｏｎ−Ｊｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２１： ７０６ （２００９）］からなるシェル組成物をもつ金、シリカ［Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ． １２： ３８６７ （２０１２）］、酸化鉄［Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ． １０： １４７７ （２０１０）； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍａｔｅｒ． １２： ７４１ （２０１３）］及びＡｇ［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ． ７： ２１１２ （２００７）］を含むコア組成物は、全て作製され、及び探索された。架橋されたオリゴヌクレオチド［Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３３： ９２５４ （２０１１）］からなる中空ＳＮＡ構造は、ミセル−ブロック共重合体構造とともに合成された［Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ． ４： １０５５ （２００４）； Ａｌｅｍｄａｒｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０： ８９９ （２００８）； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ − Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ １６： ３７９１ （２０１０）； Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ４７： １６７ （２０１１）］。現在、公知のＳＮＡの中には相当な構造的及び組成的な多様性があるが、これら全ては、いくつかの共通の特性及び特徴を共有する。これらの多価構築物は、これらが協同的にオリゴヌクレオチドを結合し、及び非常に狭い融解転移を示す二重鎖構造を形成することを可能にする。これらの特性は、高感度及び高い選択性ゲノム検出システムの開発に活用されてきた［Ｒｏｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １０５： １５４７ （２００５）］。直鎖状核酸が重合体、ペプチドまたはウイルスのトランスフェクション薬剤なしに細胞にうまく入らない一方で、３次元ＳＮＡ構造は、クラスＡスカベンジャー受容体によって認識され［Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２１： ２２５０ （２０１０）； Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． １１０： ７６２５ （２０１３）］、及び補助的トランスフェクション薬剤の必要なしに６０を超える異なる細胞型の中に迅速に取り込まれる［ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２４： １５１９８ （２００２）； Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ８： １２９ （２００９）； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１： １８０５ （２０１０）］。この特性は、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ経路［Ｒｏｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１２： １０２７ （２００６）； Ａｇｂａｓｉ−Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １７： １１７８ （２００６）； Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３１： ２０７２ （２００９）； Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５： ２０９ｒａ１５２ （２０１３）］を介した細胞内検出［Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ． ９： ３２５８ （２００９）； Ｐｒｉｇｏｄｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｎａｎｏ ３： ２１４７ （２００９）］及び遺伝子制御の両方のためのストラテジーにおいてこのような構造重要要素を作製した。

しかし、治療上の使用に対する障壁は、特にこのような構造がクリアランスまたは未知の体内分布特徴の公知の問題を有する材料から作製されるときに高い。理想的には、すぐに利用できる出発材料から作製され、大規模に合成することができ、及びＦＤＡ認可医薬品の一部であった成分からなるＳＮＡ構造が望まれる［Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｍ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ １３４：１３７６（２０１２）； Ｆａｒｏｋｈｚａｄ ｅｔ ａｌ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ ５８：１４５６（２００６）］。本明細書において、リポソーム構造を定義するリン脂質の間に差し込むことができる疎水性の尾部をもつ荷電重合体の高密度シェルで安定する小リポソームコアからなるこのような構造を作製するためのストラテジーが提供される。使用のための想定される１つのこのような荷電重合体は、核酸である。従来のＳＮＡと同様に、これらのリポソーム構造は、迅速に複数の株化細胞に入り、及びアンチセンス経路を介して遺伝子発現を効率的にノックダウンするためにいくつかの実施形態において使用される。従来のＳＮＡは、胸（ＳＫＢＲ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＡＵ−５６５）、脳（Ｕ８７、ＬＮ２２９、Ｕ１１８）、膀胱（ＨＴ−１３７６、５６３７、Ｔ２４）、結腸（ＬＳ５１３）、子宮頸部（ＨｅＬａ、ＳｉＨａ）、皮膚（Ｃ１６６、ＫＢ、ＭＣＦ １０Ａ）、腎臓（ＭＤＣＫ）、脳（ラット海馬神経細胞、アストロサイト、グリア細胞）、膀胱、血液（ＰＢＭＣ、Ｔ細胞）、膵臓（ヒトβ−島）、皮膚（ヒト）、血液（Ｓｕｐ Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ）、白血病（Ｋ５６２）、肝臓（ＨｅｐＧ２）、腎臓（２９３Ｔ）、卵巣（ＣＨＯ）、線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を含む多くの器官及び組織に由来する細胞に入ることが示されてきた。球状核酸アーキテクチャは、スカベンジャー受容体Ａ、細胞−膜受容体に結合することによって細胞の中にこれらの構築物の侵入を容易にする。この受容体を発現する株化細胞の少数の非限定的な例は、ＨｅＬａ、ＳＫＯＶ−３、Ｕ８７、Ｎｅｕｒｏ ２Ａ、ＲＡＷ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７、Ｃ８Ｓ、Ｃ１６６ Ｂｅｎｄ３、Ａ５４９、Ｒａｂ９、ＨｅｙＡ８、Ｊｕｒｋａｔ細胞である。

ＳＵＶの使用の主要な欠点は、より大きいリポソーム構造に融合する傾向が高いことによる溶液中でのこれらの固有の不安定性である。負に荷電したＤＮＡの高密度層でのこれらの構造の機能付与が、たとえば負に荷電した粒子表面の反発作用のために粒子−粒子相互作用を減少させることによってこれらの安定度を増加させることが、本明細書において開示される。本明細書において記述した本研究の過程において、トコフェロール機能性ＤＮＡが、その他の公知の疎水性ＤＮＡ類似体と比較して粒子上にＤＮＡ鎖のより高い密度を提供し、有意に粒子の安定度を増加させることが判明した。一般的なコロイド性安定度に加えて、ＤＮＡの高密度は、スカベンジャー受容体Ｂ経路を介してこのナノ粒子の取り込みを増加させるだろうし、及び細胞の中に遺伝的材料の効率的な送達を可能にするだろう。最後に、ＤＮＡの高密度層は、身体、その循環割合における粒子安定度を上昇させ、及びしたがって、このナノ医薬の生体分布を改善すると予想される。

本開示は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むが、限定されない陰イオン性実体の付着を介してＳＵＶの表面負電荷を増加させることによって、これらの小胞のコロイド性安定度が、増加することを教示する。加えて、核酸の高密度の球状配置及び放射状配向は、これらの直鎖状の対応物と異なった独特の化学的及び生物学的特性を示す。これらの球状核酸（ＳＮＡ）は、無毒性及びしかし陰イオン性であり、非免疫原性様式で補助的陽イオントランスフェクション薬剤を用いずに細胞に効率的に入ることができる。これらの例外的な特性は、異なる療法における遺伝子制御のための送達薬剤としてのこれらの使用を可能にする。ＳＮＡのリポソーム−鋳型媒介された合成は、金属コアの生物濃縮でＳＮＡ治療上の多様性を限定する金属コアＳＮＡ及び治療上の実体をカプセル化することができないことに代わりのプラットフォームを提供する。

これから、トコフェロール修飾オリゴヌクレオチド及びこのようなオリゴヌクレオチドを作製する方法、リポソーム粒子及び前述ものを作製する方法及びリポソーム粒子の使用は、以下に完全に記述されるだろう。実際は、本開示は、多くの異なる形態において具体化されてもよく、及び本明細書に記載される実施形態に限定されるように解釈されるべきでない。これらの実施形態は、特許請求の範囲及びその均等物によって定義されるとおり、本発明を実施するための最良の形態の開示とともに、当業者が本発明を作製し、及び使用することができるように十分に詳細に記述されて提供される。

同様に、本明細書において記述した方法の多くの改良及びその他の実施形態は、前述及び関連する図面において示した教示の助けをかりて、本発明が属する当業者に思い浮かぶだろう。したがって、本発明が、開示される具体的実施形態に限定されるべきでないこと、及び改良及びその他の実施形態が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図されることを理解すべきである。特定の用語を本明細書において使用したが、これらは、一般的及び説明的意味のみにおいて使用され、及び限定の目的のためでない。

用語法
別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門的及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記述したものに類似の、またはそれと均等な任意の方法及び材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を本明細書において記述した。

一定の用語は、最初に定義される。さらなる用語は、本明細書の全体にわたって定義される。

簡潔さのために、また、小単層小胞（ＳＵＶ）、リポソームＳＮＡ（ＬＳＮＡ）、リポソーム粒子または球状核酸（ＳＮＡ）に関する本開示の実施形態の記述は、その他の前述の用語のいずれかを使用する実施形態に適用でき得る。例として、また、リポソームＳＮＡを使用して遺伝子発現を調節する方法は、リポソーム粒子を使用して遺伝子発現を調節する方法として本明細書において記述され得る。小単層小胞（ＳＵＶ）は、１００ナノメートル以下のサイズのリポソーム粒子であり、及びＬＳＮＡの前駆体として使用される。ＳＵＶ及びＬＳＮＡは、したがって、リポソーム粒子のサブクラスとみなすことができる。

本明細書において使用される用語は、「オープンな」用語として意図される（たとえば、用語「含む」は、「含むが、限定されない」として解釈されるべきであり、用語「有する」は、「少なくとも有する」として解釈されるべきであり、用語「含む」は、「含むが、限定されない」として解釈されるべきである）。

さらにまた、「Ａ、Ｂ及びＣ、その他の少なくとも１つ」に類似の慣例が使用されるこれらの例において、一般に、このような構成は、当業者が慣例を理解するだろうという意味で意図される（たとえば、「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つを有するシステム」が、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢ共に、Ａ及びＣ共に、Ｂ及びＣ共に、及び／またはＡ、Ｂ及びＣ共に有するシステムを含むが、限定されないだろう）。２つ以上の代わりの用語を提示する任意の選言的語及び／またはフレーズは、記述か、または図においてか、用語の１つ、用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を想定すると実質的に理解されるべきであることは、当業者によってさらに十分に理解されるだろう。たとえば、フレーズ「ＡまたはＢ」は、「ＡまたはＢ」または「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解されるだろう。

「から」、「に」、「まで」、「少なくとも」、「を上回る」、「より小さい」及び同様のものなどの全ての言語は、詳述される数を含み、及び上で議論したようにサブレンジにその後分類されることができる範囲をいう。

範囲は、それぞれの個々の要素を含む。したがって、たとえば、１〜３の要素を有する群は、１、２または３の要素を有する群をいう。同様に、６の要素を有する群は、１、２、３、４または６の要素を有する群、などをいう。

法助動詞「でもよい」は、同じものの中に含まれるいくつかの記述された実施形態または特徴間の１つまたは複数の選択肢または選択の好ましい用途または選択をいう。選択肢または選択が、同じものに含まれる特定の実施形態または特徴に関して開示されない場合、法状動詞「でもよい」は、同じものに含まれる記述された実施形態または特徴の態様または同じものに含まれる記述された実施形態または特徴に関して特定の技術を使用するという決定的な決定をする、または使用する方法に関して肯定の行為をいう。この後の文脈において、法助動詞「でもよい」は、助動詞「ことができる」と同じ意味及び暗示的意味を有する。

本明細書に使用される、冠詞「１つ」及び「１つ」は、冠詞の文法の目的語の１つまたは１つより多く（たとえば、少なくとも１つ）をいう。

「約」及び「およそ」は、測定の性質または精度を考慮して測定された量についての誤差の許容される程度を一般に意味するものとする。エラーの例示的な程度は、所与の値または値の範囲の２０〜２５パーセント（％）以内、典型的には、１０％以内及びより典型的には、５％以内である。

本明細書において記述した化学構造は、ＩＵＰＡＣ命名法に従って命名し、及び適切な場合技術分野に認められた一般名及び略語を含む。ＩＵＰＡＣ命名法は、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， Ｉｎｃ）、ＣｈｅｍＤｏｏｄｌｅ（登録商標）（ｉＣｈｅｍＬａｂｓ， ＬＬＣ）及びＭａｒｖｉｎ（ＣｈｅｍＡｘｏｎ Ｌｔｄ．）などの化学的構造を描いているソフトウェアプログラムに由来し得る。化学構造は、ＩＵＰＡＣ名が誤った名で呼ばれる、または別途本明細書において開示される化学構造と矛盾する範囲まで本開示において調整する。

見出し、たとえば、（Ａ）、（Ｂ）、（ｉ）その他は、本明細書及び特許請求の範囲を読みやすくするために単に示してある。本明細書または特許請求の範囲における見出しの使用は、工程または要素がアルファベットまたは数値的な順番またはこれらが示される順番で行われることを必要としない。

本開示は、新規の粒子、名付けられたリポソーム粒子、前述のものを作製する方法及びこれらの粒子の使用を記述する。本リポソーム粒子は、これらがその他の公知のリポソーム粒子より小さい粒径にて安定であり、及びＤＮＡの高密度層が身体における粒子安定度を上昇させ、及びしたがって、リポソーム小胞の循環割合を増加させ、それは身体内部でこれらの粒子の生体分布を改善することにおいてその他の公知のリポソームに基づいた材料と比較して有益である。

Ａ．トコフェロール修飾オリゴヌクレオチド
第一の実施形態において、トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドを含む構築物が開示される。トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドは、親油性末端及び非親油性末端を含む。親油性末端は、トコフェロールを含み、及びトコフェロール誘導体、アルファ−トコフェロール、ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール及びデルタ−トコフェロールからなる群より選択されてもよい。親油性末端は、さらなる実施形態において、パルミトイル、ジパルミトイル、ステアリルまたはジステアリルを含む。

トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドの非親油性末端は、オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである。ＲＮＡは、調節性機能を行う阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であることができ、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡと三本鎖を形成するＲＮＡ及びリボザイムからなる群より選択される小ＲＮＡｉからなる群より選択される。あるいは、ＲＮＡは、調節性機能を行うマイクロＲＮＡである。なおさらなる実施形態において、ＲＮＡは、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）である。ＤＮＡは、いくつかの実施形態において、アンチセンスＤＮＡである。

本開示に従った使用のために想定されるオリゴヌクレオチドは、約５〜約１００ヌクレオチドの長さである。また、方法及び組成物は、オリゴヌクレオチドが約５〜約９０ヌクレオチドの長さ、約５〜約８０ヌクレオチドの長さ、約５〜約７０ヌクレオチドの長さ、約５〜約６０ヌクレオチドの長さ、約５〜約５０ヌクレオチドの長さ、約５〜約４５ヌクレオチドの長さ、約５〜約４０ヌクレオチドの長さ、約５〜約３５ヌクレオチドの長さ、約５〜約３０ヌクレオチドの長さ、約５〜約２５ヌクレオチドの長さ、約５〜約２０ヌクレオチドの長さ、約５〜約１５ヌクレオチドの長さ、約５〜約１０ヌクレオチドの長さであり、及び全てのオリゴヌクレオチド中間体のサイズの長さが、オリゴヌクレオチドが所望の結果を達成することができる程度まで具体的に開示されることが想定される。したがって、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４，２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが、想定される。

修飾されたオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドの特定の例は、修飾されたバックボーンまたは非天然ヌクレオシド間結合を含むものを含む。修飾されたバックボーンを有するオリゴヌクレオチドは、バックボーンにおけるリン原子を保持するもの及びバックボーンにおけるリン原子を有しないものを含む。これらのヌクレオシド間バックボーンにおいてリン原子を有しない修飾されたオリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味の範囲内であると考慮される。

リン原子を含む修飾されたオリゴヌクレオチドバックボーンは、たとえば、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、３’−アルキレンホスホナート、５’−アルキレンホスホナート及びキラルホスホナートを含むメチル及びその他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、３’−アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノホスフェート及びボラノリン酸を、正常な３’−５’結合、２’−５’結合したこれらの類似体及び１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’または２’−２’結合である極性を反転したものを有して、含む。また、３’−大部分のヌクレオチド間結合にて単一の３’−３’結合を含む極性を反転したオリゴヌクレオチド、すなわち脱塩基でもよい（ヌクレオチドは失っている、またはその場所にヒドロキシル基を有する）単一の反転されたヌクレオシド残基が、想定される。また塩、混合塩及び遊離酸の形態が、想定される。上のリン含有結合の作成を教示する代表的なアメリカ特許は、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９６；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；５，１９４，５９９；５，５６５，５５５；５，５２７，８９９；５，７２１，２１８；５，６７２，６９７及び５，６２５，０５０を含み、その開示は、本明細書において参照により援用される。

その中にリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されるバックボーンを有する。これらは、モルホリノ結合を有するもの；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシド及びスルホンバックボーン；ギ酸アセチル及びチオギ酸アセチルバックボーン；メチレンギ酸アセチル及びチオギ酸アセチルバックボーン；リボアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファマートバックボーン；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノバックボーン；スルホナート及びスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；及び混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ_２成分部分を有するその他のものを含む。たとえば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；５，７９２，６０８；５，６４６，２６９及び５，６７７，４３９を参照されたい、その開示は、これらの全体が参照により本明細書に援用される。

さらに他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド単位の１つまたは複数の糖及び／または１つまたは複数のヌクレオチド間結合の両方が、「天然に存在しない」基で置換されることを模倣する。一つの態様において、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を想定する。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンは、アミド含有バックボーンで置換される。たとえばＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；及び５，７１９，２６２並びにＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ， ２５４： １４９７−１５００を参照されたい、その開示は、本明細書において参照により援用される。

さらに他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートバックボーン及びヘテロ原子バックボーンをもつオリゴヌクレオシドが提供され、及びＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，４８９，６７７及び５，６０２，２４０において記述された−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を含む。また。ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，０３４，５０６において記述されたモルホリノバックボーン構造をもつオリゴヌクレオチドが、想定される。

様々な形態において、オリゴヌクレオチドにおける２つの連続する単量体間の結合は、−ＣＨ_２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ^Ｈ−、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲ^Ｈ、＞Ｃ＝Ｓ、−Ｓｉ（Ｒ”）_２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｐ（Ｏ）_２−、−ＰＯ（ＢＨ_３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）_２−、−ＰＯ（Ｒ”）−、−ＰＯ（ＯＣＨ_３）−及び−ＰＯ（ＮＨＲ^Ｈ）−から選択される２〜４、望ましくは３つの基／原子からなり、ＲＨは水素及びＣ_１−４−アルキルから選択され、及びＲ”は、Ｃ_１−６−アルキル及びフェニルから選択される。このような結合の図解例は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＯ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨＯＨ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝（次の単量体に対する結合として使用されるときに、Ｒ^５を含む）、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＮＲ^Ｈ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−、−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲ^Ｈ−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−ＣＳ−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−Ｃ（＝ＮＲ^Ｈ）−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−ＣＯ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−、−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−Ｏ−、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ＝（次の単量体に対する結合として使用されるときに、Ｒ^５を含む）、−ＣＨ_２−Ｏ−ＮＲ^Ｈ−、−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲ^Ｈ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＮＲ^Ｈ、−Ｏ−ＣＨ_２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ＝（次の単量体に対する結合として使用されるときに、Ｒ^５を含む）、−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−、−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−、−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＳＯ−ＣＨ_２−、ＣＨ_２−ＳＯ_２−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ_２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−ＮＲ^Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ_２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ_２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）_２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）_２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）_２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ_３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ ＣＨ_２ＣＨ_３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ_３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲ^Ｎ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−ＮＲ^Ｈ Ｈ−、−ＮＲ^Ｈ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲ^Ｈ）−Ｏ−、ＣＨ_２−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−ＣＨ_２−及び−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ”）_２−Ｏ−であり；その中で−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＲ^Ｈ−、−ＣＨ_２−ＮＲ^Ｈ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−Ｏ−Ｐ（−Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）_２−Ｏ−、−ＮＲ^Ｈ Ｐ（Ｏ）_２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲ^Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ_３）−Ｏ−及び−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲ^Ｎ）−Ｏ−が想定され、ＲＨは、水素及びＣ_１−４−アルキルから選択され、及びＲ”は、Ｃ_１−６−アルキル及びフェニルから選択される。さらなる図解例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ． ａｌ．， １９９５， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５： ３４３−３５５及びＳｕｓａｎ Ｍ． Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ ２５： ｐｐ ４４２９−４４４３において与えられる。

オリゴヌクレオチドのさらに他の修飾された形態は、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ２００４０２１９５６５に詳細に記述され、その開示は、その全体が本明細書において参照により援用される。

また、修飾されたオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の置換された糖部分を含んでもよい。一定の態様において、オリゴヌクレオチドは、２’位置にて以下の１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、式中アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換された、または置換されないＣ_１〜Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルでもよい。その他の実施形態は、Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２及びＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３］_２を含み、式中ｎ及びｍは、１〜約１０である。その他のオリゴヌクレオチドは、２’位置にて以下の１つを含む：Ｃ_１〜Ｃ_１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基及び類似の特性を有するその他の置換基。一つの態様において、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、別名２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， ７８： ４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。その他の修飾は、下で本明細書において実施例において記述したように、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、別名２’−ＤＭＡＯＥを含み、及び、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（また、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとして当該技術分野において公知である）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２が、下で本明細書において実施例において記述される。

さらに他の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、２’−アリル（２’−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置であってもよい。一つの態様において、２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。また、類似の修飾は、オリゴヌクレオチドのその他の位置にて、たとえば、３’末端ヌクレオチドの糖の３’位置にて、または２’−５’結合したオリゴヌクレオチド及び５’末端ヌクレオチドの５’位置において作製されてもよい。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。たとえば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ４，９８１，９５７；５，１１８，８００；５，３１９，０８０；５，３５９，０４４；５，３９３，８７８；５，４４６，１３７；５，４６６，７８６；５，５１４，７８５；５，５１９，１３４；５，５６７，８１１；５，５７６，４２７；５，５９１，７２２；５，５９７，９０９；５，６１０，３００；５，６２７，０５３；５，６３９，８７３；５，６４６，２６５；５，６５８，８７３；５，６７０，６３３；５，７９２，７４７；及び５，７００，９２０を参照されたい、この開示は、これらの全体が参照により本明細書に援用される。

一つの態様において、糖の修飾は、２’−ヒドロキシル基が、糖環の３’または４’炭素原子に結合するロック核酸（ＬＮＡ）を含み、これにより二環式糖部分を形成する。結合は、一定の態様においてであり、２’酸素原子及び４’炭素原子に架橋するメチレン（−ＣＨ_２−）_ｎ基であり、式中ｎは、１または２である。ＬＮＡ及びその作成は、ＷＯ ９８／３９３５２及びＷＯ ９９／１４２２６において記述される。

また、オリゴヌクレオチドは、塩基修飾または置換を含んでいてもよい。本明細書に使用される「修飾されていない」、または「天然の」塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル及びアデニン及びグアニンのその他のアルキル誘導体、２−プロピル及びアデニン及びグアニンのその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン及びピリミジン塩基のその他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（擬ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及びその他の８置換されたアデニン及びグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及びその他の５置換されたウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどのその他の合成及び天然塩基を含む。さらなる修飾された塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノサイアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換されたフェノキサジンシチジン（たとえば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などの三環系ピリミジンを含む。また、修飾された塩基は、プリンまたはピリミジン塩基がその他のヘテロ環で置換されたもの、たとえば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンを含んでいてもよい。さらなる塩基は、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ３，６８７，８０８において開示されたもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８−８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｉ．， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０で開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ３０： ６１３によって開示されたもの及びＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ． Ｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ２８９−３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３によって開示されたものを含む。これらの塩基のいくつかは、結合親和性を増加させるために有用であり、及び５−置換されたピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換されたプリンを含み、及び２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６−１．２℃によって核酸二重鎖安定度を上昇させることを示し、及び一定の態様において、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ３，６８７，８０８， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ４，８４５，２０５；５，１３０，３０２；５，１３４，０６６；５，１７５，２７３；５，３６７，０６６；５，４３２，２７２；５，４５７，１８７；５，４５９，２５５；５，４８４，９０８；５，５０２，１７７；５，５２５，７１１；５，５５２，５４０；５，５８７，４６９；５，５９４，１２１， ５，５９６，０９１；５，６１４，６１７；５，６４５，９８５；５，８３０，６５３；５，７６３，５８８；６，００５，０９６；５，７５０，６９２及び５，６８１，９４１を参照され、その開示は、参照により本明細書に援用される。

「修飾された塩基」またはその他の類似の用語は、天然塩基（たとえば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル及び／またはチミン）と対にすることができる、及び／または天然に存在しない塩基と対にすることができる組成物をいう。一定の態様において、修飾された塩基は、１５、１２、１０、８、６、４または２℃以下のＴ_ｍ差異を提供する。例示的な修飾された塩基は、ＥＰ １ ０７２ ６７９及びＷＯ ９７／１２８９６において記述される。

「核酸塩基」によって、天然に存在する核酸塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）並びにキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ^６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ^４，Ｎ^４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ^３−Ｃ^６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、擬イソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンなどの天然に存在しない核酸塩基及びＢｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，４３２，２７２及びＳｕｓａｎ Ｍ． Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｖｏｌ． ２５： ｐｐ ４４２９−４４４３において記載された「天然に存在しない」核酸塩基を意味する。したがって、用語「核酸塩基」は、公知のプリン及びピリミジンヘテロ環のみでなく、また複素環式類似体及びその互変異性体を含む。さらなる天然に存在する、及び天然に存在しない核酸塩基は、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ３，６８７，８０８ （Ｍｅｒｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．）において、Ｃｈａｐｔｅｒ １５ ｂｙ Ｓａｎｇｈｖｉ， ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｅｄ． Ｓ． Ｔ． Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｂ． Ｌｅｂｌｅｕ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３において、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ３０： ６１３−７２２ （特にページ６２２及び６２３を参照されたい、及びｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｊ． Ｉ． Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０， ｐａｇｅｓ ８５８−８５９， Ｃｏｏｋ， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９１， ６， ５８５−６０７において、これらの全体が参照により本明細書に援用される）において開示されたものを含む。用語「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」は、最も古典的意味でヌクレオシド塩基でない一定の「普遍的な塩基」を含む核酸塩基のように働くが、ヌクレオシド塩基のように働くことができる複素環式化合物などの化合物を含むことが意図される。特に、普遍的な塩基として言及されるのは、３−ニトロピロール、任意に置換されたインドール（たとえば、５−ニトロインドール）及び任意に置換されたヒポキサンチンである。その他の望ましい普遍的な塩基は、ピロール、ジアゾールまたはトリアゾール誘導体を含み、当該技術分野において公知のこれらの普遍的な塩基を含む。

Ｂ．トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドを作製する方法
第２の実施形態において、トコフェロールオリゴヌクレオチドを作製する方法が開示される。最初に、オリゴヌクレオチド及びホスホラミダイト修飾トコフェロールが提供される。次いで、オリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト修飾トコフェロールに曝露されて、トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドを作製する。限定することを意味しないが、当業者に対する化学は、オリゴヌクレオチドにトコフェロールを付着させるのに使用することができ、アミド結鎖またはクリック化学を含む。

Ｃ．リポソーム粒子
第３の実施形態において、リポソーム粒子が、開示される。リポソーム粒子は、少なくとも実質的に球状形状、内側及び外側を有し、及び脂質二重層を含む。脂質二重層は、第１の脂質及び第２の脂質からなる。第１の脂質及び第２の脂質は、いくつかの実施形態において、同じである。さらなる実施形態において、第１の脂質及び第２の脂質は、異なる。

第１の脂質は、脂質のホスホコリンファミリーまたは脂質のホスホエタノールアミンファミリーから選ばれる。限定することを意味しないが、第１の脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）からなる群より選択される。

第２の脂質は、脂質のホスホコリンファミリーまたは脂質のホスホエタノールアミンファミリーから選ばれる。限定することを意味しないが、第２の脂質は、１，２−ジオレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２−ジオレオイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）からなる群より選択される。

リポソーム粒子は、トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドの親油性末端が脂質二重層に吸収されるトコフェロール修飾オリゴヌクレオチドをさらに含む。トコフェロールは、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール及びデルタ−トコフェロールからなる群より選択される。トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドの非親油性末端は、オリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、種々の実施形態において、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである。ＲＮＡは、調節機能を実行する阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であることができ、種々の実施形態において、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡと三本鎖を形成するＲＮＡ及びリボザイムからなる群より選択される。あるいは、及びさらなる実施形態において、ＲＮＡは、調節機能を実行するマイクロＲＮＡである。ＤＮＡは、任意にアンチセンスＤＮＡである。なおさらなる実施形態において、ＲＮＡは、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）である。

もう一つの方法において、本開示は、リポソーム粒子、実質的に球状形状を有する前記リポソーム粒子、複数の脂質基を含む脂質二重層を含む前記リポソーム粒子；及びオリゴヌクレオチドを提供する。種々の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、脂質基の複数は、脂質のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジルエタノールアミンファミリーからなる群より選択される脂質を含む。オリゴヌクレオチドは、さらなる実施形態において親油性連結基を含むオリゴヌクレオチド−脂質抱合体であり、前記親油性連結基は、脂質二重層に吸着される。親油性連結基は、種々の実施形態において、トコフェロール、パルミトイル、ジパルミトイル、ステアリル、ジステアリルまたはコレステロールを含む。

あるいは、リポソーム粒子は、リポソーム粒子の内側にカプセル化された治療薬をさらに含む。さらなる実施形態において、本開示のリポソーム粒子は、リポソーム粒子に直接または間接的のいずれかで付着された治療薬をさらに含む。間接的な付着は、たとえば及び限定されないが、オリゴヌクレオチドに対して付着され、これが次いでリポソーム粒子に付着されたものを含む。

いくつかの実施形態において、リポソーム粒子は、リポソーム粒子の内側にカプセル化された診断薬をさらに含む。この診断薬は、いくつかの実施形態において、ガドリニウムである。

本開示のリポソーム粒子の表面上のオリゴヌクレオチドの面密度に関して、本明細書において記述したとおりのリポソーム粒子は、その表面上に約１〜約１００オリゴヌクレオチドを含むことが想定される。種々の実施形態において、リポソーム粒子は、約１０〜約１００または約１０〜約９０または約１０〜約８０または約１０〜約７０または約１０〜約６０または約１０〜約５０または約１０〜約４０または約１０〜約３０または約１０〜約２０のオリゴヌクレオチドをその表面上に含む。さらなる実施形態において、リポソーム粒子は、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００オリゴヌクレオチドをその表面上に含む。

Ｄ．リポソーム粒子を作製する方法
第４の実施形態において、リポソーム粒子を作製する方法が開示される。最初に、リン脂質、溶媒及びトコフェロール修飾オリゴヌクレオチドが提供される。次いで、リン脂質を溶媒に添加して、リポソームを含む第１の混合物を形成する。第１の混合物中のリポソームのサイズは、約１００ナノメートル〜約１５０ナノメートルの間である。

次に、リポソーム及び小単層小胞（ＳＵＶ）を含む第２の混合物を作製するために、リポソームを破壊する。第２の混合物中のリポソーム及びＳＵＶのサイズは、約２０ナノメートル〜約１５０ナノメートルの間である。

次に、約２０ナノメートル〜約５０ナノメートルの間の粒径を有するＳＵＶを第２の混合物から単離する。最後に、トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドを単離されたＳＵＶに添加して、リポソーム粒子を作製する。

本開示の方法によって作製したリポソーム粒子の粒径は、約５０ナノメートル以下である。いくつかの実施形態において、複数のリポソーム粒子が生成され、及び複数の粒子は、約５０ナノメートル以下（たとえば、約５ナノメートル〜約５０ナノメートルまたは約５ナノメートル〜約４０ナノメートルまたは約５ナノメートル〜約３０ナノメートルまたは約５ナノメートル〜約２０ナノメートルまたは約１０ナノメートル〜約５０ナノメートルまたは約１０ナノメートル〜約４０ナノメートルまたは約１０ナノメートル〜約３０ナノメートルまたは約１０ナノメートル〜約２０ナノメートル）の平均粒径を有する。さらなる実施形態において、本開示の方法によって作製したリポソーム粒子の複数における粒子は、約２０ナノメートル以下または約２５ナノメートル以下または約３０ナノメートル以下または約３５ナノメートル以下、または約４０ナノメートル以下または約４５ナノメートル以下の平均粒径を有する。

もう一つの方法において、いくつかの態様において、本開示は、リポソーム粒子を作製する方法であって、溶媒にリン脂質を添加して第１の混合物を形成することであって、前記第１の混合物は、複数のリポソームを含むこと；前記複数のリポソームを破壊して第２の混合物を作り出すことであって、前記第２の混合物は、リポソーム及び小単層小胞（ＳＵＶ）を含むこと；前記第２の混合物から前記ＳＵＶを単離することであって、前記ＳＵＶは、約２０ナノメートルと５０ナノメートルとの間の粒径を有すること；単離されたＳＵＶにオリゴヌクレオチドを添加してリポソーム粒子を作製することを含む方法を提供する。

Ｅ．遺伝子制御／療法におけるリポソーム粒子の使用
本明細書に提供された遺伝子産物発現を阻害するための方法は、標的遺伝子産物の発現が、リポソームＳＮＡ非存在下での遺伝子産物発現と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％まで阻害されたものをを含む。その他の文言において、提供される方法は、本質的に標的遺伝子産物の発現の阻害の任意の程度を生じるものを包含する。

阻害の程度は、体液試料からもしくは生検試料からインビボで、または当該技術分野において周知の撮像技術によって決定される。あるいは、阻害の程度は、一般にリポソームＳＮＡの特異的タイプ及び特異的オリゴヌクレオチドの使用から生じるインビボで予想することができる阻害の程度の予測可能な計測として、細胞培養アッセイで決定される。

本開示のいくつかの態様において、リポソーム粒子は、遺伝子阻害性機能、並びに治療薬送達機能の両方を実行すると考えられる。このような態様において、治療薬は、本開示のリポソーム粒子にカプセル化し、及び粒子は、加えて、標的遺伝子発現の効果阻害に影響を及ぼすようにデザインされた一つまたは複数のオリゴヌクレオチドで機能化される。さらなる実施形態において、治療薬は、本開示のリポソーム粒子に付着される。

種々の態様において、方法は、標的ポリヌクレオチドに１００％相補的、すなわち完全マッチであるオリゴヌクレオチドの使用を含み、その一方で、その他の態様において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さにわたってポリヌクレオチドに少なくとも（以上を意味する）約９５％相補的、オリゴヌクレオチドが所望の程度の標的遺伝子産物の阻害を達成することができる程度にオリゴヌクレオチドの長さにわたってポリヌクレオチドに少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％相補的である。

アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸のものに１００％相補的である必要がないことは、当該技術分野において十分に理解されている。その上、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーションイベントに含まれないように、１つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい（たとえば、ループ構造またはヘアピン構造）。パーセント相補性は、オリゴヌクレオチドの長さにわたって決定される。たとえば、アンチセンス化合物の２０ヌクレオチドのうちの１８が１００ヌクレオチドの全長の標的ポリヌクレオチドにおける２０ヌクレオチド領域に相補的であるアンチセンス化合物を考えると、オリゴヌクレオチドは、９０パーセント相補的だろう。この実施例において、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的な核酸塩基とクラスター形成しても、または点在してもよく、及び互いにまたは相補的なヌクレオチドに隣接する必要がない。標的核酸の領域とのアンチセンス化合物のパーセント相補性は、当該技術分野において公知のＢＬＡＳＴプログラム（基本の局所的整列サーチツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを使用してルーチンで決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、１９９０、２１５、４０３−４１０； Ｚｈａｎｇ及びＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、１９９７、７、６４９−６５６）。

したがって、第５の実施形態において、遺伝子制御療法においてリポソーム粒子を利用する方法が提供される。この方法は、前記ポリヌクレオチドの全体または一部に１つまたは複数の相補的なオリゴヌクレオチドと前記遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドをハイブリダイズする工程であって、前記オリゴヌクレオチドがリポソーム粒子に付着される工程を含み、前記ポリヌクレオチドと前記オリゴヌクレオチドの間のハイブリダイズは、前記遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な相補性の程度で前記ポリヌクレオチドの長さにわたって生じる。リポソーム粒子は、約５０ナノメートル以下である直径を有する。遺伝子発現の阻害は、インビボでまたはインビトロで生じてもよい。

この方法において利用されるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである。ＲＮＡは、調節機能を実行する阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）であることができ、種々の実施形態において、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡで三本鎖を形成するＲＮＡ及びリボザイムからなる群より選択される。あるいは、ＲＮＡは、調節機能を実行するマイクロＲＮＡである。ＤＮＡは、いくつかの実施形態において、アンチセンスＤＮＡである。

本開示のもう一つの態様において、リポソーム粒子は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を治療するための方法において使用される。米国において、軍隊において２４４，０００以上のＴＢＩの症例が２０００年以降にあり、及びそれは４５歳未満の人々における主要な死因及び障害である。さらに、「軽度の重症度」症例の神経性の予後を予測することは現在困難であり、及び傷害（たとえば、炎症、虚血及びアポトーシス）の二次的段階を治療するのは、非常に困難である。

したがって、いくつかの実施形態において、本開示の方法は、ＴＢＩに関係する遺伝子産物の発現をターゲットし、及び調節するようにデザインされたリポソーム粒子の使用のに向けられる。たとえば及び限定されないが、標的遺伝子産物は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ＢＣＬ２関連Ｘ（ＢＡＸ）、マトリックスメタロペプチダーゼ／メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ、限定されないが、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）を含む）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ、限定されないが、低酸素誘導性演算項目１アルファ（ＨＩＦ１−α）を含む）及びカルパインからなる群から選択される。

Ｆ．免疫制御におけるリポソーム粒子の使用
トール様受容体（ＴＬＲ）は、先天性免疫系の制御において重要な役割を果たすセンチネル細胞において発現されるタンパク質のクラスである。哺乳動物の免疫系は、２つの一般的なストラテジーを使用して感染性の疾患と戦う。病原体曝露は、免疫賦活性サイトカイン、ケモカイン及び多反応性ＩｇＭ抗体の産生によって特徴づけられる先天性免疫応答を迅速にトリガーする。先天性免疫系は、感染性微生物の多様な群によって発現される病原関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に対する曝露によって活性化される。ＰＡＭＰの認識は、受容体のトール様ファミリーのメンバーによって媒介される。特異的オリゴヌクレオチドに対して応答するＴＬＲ ４、ＴＬＲ ８及びＴＬＲ ９などのＴＬＲ受容体は、特別な細胞内コンパートメントに位置して、エンドソームを呼ばれる。ＴＬＲ ４、ＴＬＲ ８及びＴＬＲ９受容体の調整の機構は、ＤＮＡ−タンパク質相互作用に基づいている。

細菌ＤＮＡにおいて見いだされたものに類似するＣｐＧのモチーフを含む合成免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ受容体の類似の応答を刺激する。したがって、免疫調節性ＯＤＮは、免疫欠損及び癌の治療を含む種々の潜在的な治療上の用途を有する。免疫調節性ＯＤＮで機能化されたリポソームナノ粒子の使用は、優先的な取り込みを増大及びしたがって、治療有効性を増大させるだろう。注目すべきことに、本明細書に提供されたものなどのより小さい粒子（２５〜４０ｎｍ）は、より効率的に組織バリアを貫通し、したがって、先天性免疫応答のより有効な活性化を提供する。したがって、機能的ＣｐＧモチーフ含有ＤＮＡで機能化され安定化されたサイズが３０ｎｍの小さいリポソームナノ粒子は、増強された治療効果を提供するだろう。

免疫系のダウンレギュレーションは、トール様受容体の発現を担う遺伝子をノックダウンすることを含むだろう。このアンチセンスアプローチは、特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド配列で機能化された任意のトール様タンパク質の発現をノックアウトするリポソームナノ粒子の使用を含む。

したがって、第６の実施形態において、トール様受容体を調節するためにリポソーム粒子を利用する方法が開示される。本方法は、それぞれＴＬＲアゴニストまたはＴＬＲアンタゴニストを用いることによりトール様受容体をアップレギュレートする、またはダウンレギュレートする。本方法は、リポソーム粒子とトール様受容体を有する細胞に接触することを含む。調節されるトール様受容体は、トール様受容体１、トール様受容体２、トール様受容体３、トール様受容体４、トール様受容体５、トール様受容体６、トール様受容体７、トール様受容体８、トール様受容体９、トール様受容体１０、トール様受容体１１、トール様受容体１２及びトール様受容体１３を含む。

Ｇ．ナノフレア技術におけるリポソーム粒子の使用
本開示のさらなる態様において、リポソーム粒子は、細胞内標的を検出するために使用される。このような方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｕｍｂｅｒ８，５０７，２００において開示され、これはその全体が本明細書に参照により援用される。

簡潔には、標的分子に対して特異的である認識配列を含むオリゴヌクレオチドを、本明細書において記述したリポソーム粒子に付着させる。したがって、本明細書に使用される「認識配列」は、関心対象の標的分子に部分的に、または完全に相補的である配列を意味することが理解される。

認識配列を含む付着したオリゴヌクレオチドをもつリポソーム粒子は、まず最初にリポーター配列と会合する。本明細書に使用される、「リポーター配列」は、部分的にまたは完全に相補的な、及びしたがって、認識配列にハイブリダイズすることができる配列を意味することが理解される。リポーター配列は、検出可能標識（限定されないが、蛍光体など）で標識され、及びまたナノフレアともいわれる。リポーター配列は、種々の態様において少数の、同じまたは認識配列より多くの基部からなり、その結果その標的分子に対する認識配列の結合により、ハイブリダイズされたリポーター配列の放出を生じさせ、これによってリポーター配列に付着された標識の検出可能な、及び測定可能な変化を生じる。

本発明は、以下の実施例によって図示され、これは任意の方法に限定することは意図されない。

実施例１−全般
全ての試薬は、最高の純度で供給元から得て、及び任意のさらなる精製を伴わずに使用した。ＨＰＬＣは、Ｖａｒｉａｎ Ｐｒｏｓｔａｒシステムで行った。ＵＶ／Ｖｉは、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ３００分光光度計で記録した。蛍光スペクトルは、ＳＰＥＸ ＦｌｕｏｒｏＬｏｇ蛍光光度計で得た。

実施例２−オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡシンセサイザー（ＡＢＩ ３４００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ）で１．０マイクロモル濃度のスケールで合成した。水酸化アンモニウム水溶液（５５℃、１４時間）での切断及び脱保護の後、ＤＮＡを逆相ＨＰＬＣによって精製して、ＵＶ分光計によって定量化した。

実施例３−リポソーム粒子の合成
脂質単量体（クロロホルムに溶解した４０μｍｏｌの１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ））を２０ｍＬバイアルに添加して、次いで一晩凍結乾燥前に蒸発させて、溶媒を除去して薄い脂質フィルムを生じる。次いで、フィルムをＨＢＳ緩衝液（５０ｍＬ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ ７．４にて１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で再水和して、続いて激しく混合してリポソーム懸濁液を形成し、次いでパルス化することなく３０分間氷浴においてプローブ音波破砕した。次いで、生じる懸濁液を１０４，９８６ｇ及び９０分間４℃にて超遠心分離機にした。リン脂質濃度は、元素分析を使用して算出した。

次に、ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖を、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで標準的な固相ホスホロアミダイト化学を経てα−トコフェロール修飾で合成した。鎖を固体支持体から切断して、逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製した。

最後に、適切なＤＮＡ／ＲＮＡ（１６μＭ）を１．３ｍＭのＳＵＶ溶液に添加して、一晩撹拌させた。次いで、粒子を１００ｋＤａのカットオフの遠心分離フィルタによって翌日精製した。次いで、粒子をＴＥＭ及び動的光散乱法によって解析した。ＦＩＴＣでカプセル化し、及びＣＹ５標識したＤＮＡで表面機能化したリポソーム粒子のゲル電気泳動を図１３に示した。

実施例４−リポソーム粒子の細胞取り込みの可視化
ＬＳＮＡの細胞取り込みを視覚化するために、ＨｅＬａ細胞を一晩Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）；ＩＩ Ｃｈａｍｂｅｒ ＃１．５ Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で培養し、及びＣｙ５−標識したＬＳＮＡ（ＤＮＡ濃度の０．１μＭ）と共にインキュベートした。１６時間のインキュベーションの後、培地を新鮮な培地で置き換えて、生細胞を、製造業者の説明書に従ってヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。全ての画像は、Ｍａｉ Ｔａｉ ３３０８レーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）を使用して４０ｘ倍率にてＺｅｉｓｓ ５１０ ＬＳＭで得た。蛍光発光は、３９０−４６５ｎｍ及び６５０−７１０ｎｍにて、それぞれ７２９及び６３３ｎｍでの励起（図５）で収集した。図５の左パネルは、ＨｅＬａ細胞へのリポソームフルオレセインの侵入を示し、その一方で、図５の右パネルは、フルオレセインの共局在性を示し、及びＣｙ５は、細胞内への全てのリポソームの送達を示唆する。

実施例４−細胞生存度
リポソーム粒子の細胞毒性は、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（登録商標）Ａｓｓａｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で評価した。簡潔には、ＨｅＬａ細胞を２００μＬの培地中の９６ウェルプレートに播種して、２４時間インキュベートした。次いで、細胞をＦＩＴＣカプセル化されたそのままのＳＵＶ及びＬＳＮＡ機能化ＤＮＡで種々の濃度のリン脂質濃度（０、３２．５、６５、１６２．５μＭ）にて処理した。１６時間後、培地を除去し、細胞を３回ＰＢＳで洗浄して、次いで９０μＬの新鮮な培養培地を１０μＬのアラマーブルー試薬を加えて４時間インキュベートした。次いで、５６０ｎｍにて励起及び５９０ｎｍにて発光を確認することによってこれらを解析した。

実施例５−ＳＵＶの作成
材料
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン脂質単量体（ＤＯＰＣ）は、乾燥粉末形態で、またはクロロホルム溶液中のいずれかでＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ， Ｉｎｃ．から購入し、さらに精製することなく使用した。ホスホラミダイト及びその他のＤＮＡ合成試薬は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃから最高の純粋にて購入し、及び製造業者から受けとったときに使用した。

計測手段
凍結乾燥は、Ｆｒｅｅｚｏｎｅ Ｌｙｏｈｉｌｉｚｅｒ（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）を使用して実施した。音波処理は、パルスにすることなく２０ｋＨｚの４０％強度にてチタン−合金固体プローブ超音波処理器（５００ワットのＶｉｂｒａ−Ｃｅｌｌ（商標）ＶＣ ５０５、Ｓｏｎｉｃｓ ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＴ）セットを使用して行った。超遠心分離は、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ−３０Ｉ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して実施した。透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）は、日立−２３００ ＳＴＥＭ電子顕微鏡を使用して行った。動的光散乱法（ＤＬＳ）は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用して収集した。ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ解析は、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ ＳｍａｒｔＢｅａｎ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して行った。蛍光測定は、Ｆｌｕｏｒｌｏｇ−３システム（ＨＯＲＩＢＡ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ Ｉｎｃ、ＮＪ、ＵＳＡ）で実施した。ＵＶ−Ｖｉ分光法は、Ｃａｒｙ ５０００ ＵＶ−Ｖｉ分光光度計を使用して収集した。（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ．， ＣＡ， ＵＳＡ）。

オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドは、自動化固体支持体ホスホラミダイト合成を使用してＥｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＭ４８ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）で活性化因子としてＤＣＩを使用して合成した。トコフェロールホスホラミダイトは、延長した１５分の結合時間を使用して自動化されたプロトコルによって結合した。固相合成の完了後、オリゴヌクレオチド鎖を水性水酸化アンモニウム（２８−３０％の水溶液、Ａｌｄｒｉｃｈ）での一晩の処理を使用して固体支持体から切断し、その後に窒素ガス（貯蔵窒素を使用した）の穏やかな流れを使用して、過剰アンモニアを除去した。オリゴヌクレオチドを、ＴＥＡＡ（トリエチルアンモニウムアセテート）緩衝液及びアセトニトリルの勾配（勾配：３０分にわたって１０％ｖ／ｖから１００％ｖ／ｖアセトニトリル）を使用する逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ｖａｒｉａｎ）でＭｉｃｒｏｓｏｒｂ Ｃ１８カラムを使用して精製した。生成物を含む収集した画分を凍結乾燥器で濃縮した。得られたオリゴヌクレオチドをナノピュア水に再懸濁して、純度を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及び変性アクリルアミドゲル電気泳動技術を使用して解析した。

小単層小胞の合成
脂質単量体保存液の量（２５−５０ｍｇ）を２０ｍＬバイアルに添加して、２５ｍＬガラスバイアルに置き、及び溶媒を、窒素気流を使用して慎重に蒸発した。得られた脂質単量体は、残留するクロロホルムを除去するために真空下でさらに一晩乾燥させた。次いで、生じる脂質フィルムを２０ｍＭ ＨＢＳ（５．０ｍＬ）で水化し、続いてバイアルをボルテックスしてリポソーム懸濁液を形成した。この懸濁液を１０℃より下（氷水浴で冷却）に混合脂質の温度を保持して、さらに３０分間プローブ音波破砕した。音波処理の後、懸濁液を１２℃にて９０分間１００，０００ｘｇにて超遠心分離に供した。遠心分離の後、所望の小単層小胞（ＳＵＶ）を含む透明な上清を収集して、ペレットを捨てた（図１）。より狭いサイズ分布で粒子を得るために、得られたＳＵＶ粒子をポリカーボネート膜（３０ｎｍ孔径）を通してさらに押し出した。

得られたＳＵＶを、動的光散乱法（ＤＬＳ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）技術（図１１）を使用してさらに解析した。所与の試料における最終的なリン脂質濃度は、誘導結合プラズマ質量分光法（ＩＣＰ−ＭＳ）を介して決定した。溶液におけるリポソームの数及びリポソームの表面上のオリゴヌクレオチドの数は、図１２において示した方程式に従って算出することができる。

ＤＮＡ機能性リポソームＳＮＡの作成
リポソームＳＮＡを調製するために、１５μＭの所望の３’−トコフェロール修飾オリゴヌクレオチドをＳＵＶ溶液に添加し（１．３ｍＭの［リン脂質］）、及び一晩振盪させた。次いで、生じる溶液を架橋されたセファロースカラム（Ｓｅｐａｒｏｓｅ ＣＬ ４Ｂ、Ａｌｄｒｉｃｈ）でのゲル濾過クロマトグラフィーを介して精製した。粒径分布は、ＤＬＳを使用して解析した。ＴＥＭを使用してリポソームＳＮＡを観察するために、試料をプラズマ洗浄炭素ＴＥＭグリッド上に置き、及び酢酸ウラニル（２％ｗ／ｖ）の溶液でさらに染色した（２分間染色し、次いで水で洗浄し、及び乾燥）。次いで、乾燥したグリッドを日立−２３００ ＳＴＥＭ電子顕微鏡下で撮像した。

リポソームＳＮＡのゲル電気泳動
全てのゲル電気泳動実験は、１×ＴＢＥ（トリスボラート、ＥＤＴＡ）緩衝液中で１％のアガロースゲルにおいて行った。試料は、充填薬剤としてグリセロール（３０％ｖ／ｖ、５μＬ）を用いて、ウェルに充填した。ゲルチャンバーを１×ＴＢＥで満たして、氷で予冷した。ゲルを１０℃にて１時間７０Ｖにて泳動して、ゲルの画像をＣｙ５フィルタでＦｌｕｏｒｃｈｅｍ Ｑで記録した。

リポソーム表面上のＤＮＡ密度の定量化
リポソームの表面上のＤＮＡの充填を決定するために、Ｃｙ５標識した３’トコフェロール修飾ＤＮＡの濃度を増大して固定された濃度のＳＵＶと共に一晩インキュベートした（１．３ｍＭ［Ｐ］）。次いで、リポソームＳＮＡをゲル電気泳動を使用して解析した。ＳＵＶで機能化したＤＮＡ密度を定量化するために、構築物を１％のＳＤＳ溶液に溶解して、吸光度を２６０ｎｍにて収集して、それぞれのＤＮＡ鎖の吸光係数を使用して算出した。対応する溶液におけるリポソームの数は、リポソームのリン脂質濃度が機能付与の後一定のままであるという仮定で理論方程式を使用して算出した。

溶融アッセイ
２ナノ粒子成分系は、表１に記載されているようにリンカー鎖に相補的な鎖で機能化したリポソームＳＮＡを使用して形成した。凝集体は、２つのＤＮＡ機能性リポソームＳＮＡの添加及び１：１の比（総ＤＮＡ濃度１．５μＭ、容積１ｍＬ）でリンカー鎖にこれらをハイブリダイズすることによって形成した。リンカーをもつリポソームＳＮＡについての吸光度スペクトルをＣａｒｙ ５０００ ＵＶ−Ｖｉ分光計を使用して収集して、リンカーのないリポソームＳＮＡの吸光度スペクトルと比較した。次いで、凝集体を０．２５℃／分の割合にて２０から６５℃までの温度の緩やかな増大に供して、吸光度を凝集体について２６０ｎｍにてモニターした。

ローダミンカプセル化
乾燥ＤＯＰＣ単量体（２５ｍｇ）をＨＢＳ（５ｍＬ）中の２０ｍＭスルホローダミンＢ溶液に再懸濁した。生じる懸濁液を１００ｎｍ、８０ｎｍ、５０ｎｍ、３０ｎｍサイズの一連のポリカーボネート膜を通して徐々に押し出した。ローダミン含有リポソームを架橋されたセファロース（セファロースＣＬ−４Ｂ、Ａｌｄｒｉｃｈ）でのゲル濾過クロマトグラフィーを介して遊離ローダミンから分離した。得られた粒子を、上で記述した手順を使用してＤＮＡ−トコフェロール抱合体で機能化した。構築物の血清安定度を解析するために、ローダミン含有リポソーム及びリポソーム−ＳＮＡを、ＨＢＳ中の１０％のウシ胎児血清溶液に懸濁して、４２０ｎｍにて試料を励起し、及び４８０ｎｍにて強度を測定して、色素の放出をＦｌｕｏｒｌｏｇ−３システムでモニターした。

細胞培養研究
ＳＫＯＶ−３細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入して、１０％の熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕペニシリン及び５０μｇストレプトマイシンを伴うＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地中で培養し、及びＡＴＣＣ説明書に従って５％のＣＯ２で３７℃にて維持した。細胞研究のためには、細胞を５０％の集密度にて処理の２４時間前にプレートにまいた。

リポソームＳＮＡの共焦点顕微鏡法
リポソームＳＮＡの細胞内部移行の視覚化のためには、ＳＫＯＶ３細胞を５０％の集密度にて３５ｍｍのＦｌｕｏｒｏＤｉｓｈ（商標）チャンバーにまいた。細胞を２０時間培地においてＣｙ５標識されたリポソームＳＮＡ（０．１μＭのＤＮＡ濃度）と共にインキュベートし、続いて０．０１％（容積によって）のトゥイーン−２０を含む１×ＰＢＳで３回洗浄し、次いで新鮮な培地で置換した。核を、製造業者のプロトコルに従ってヘキスト３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。次いで、生細胞をＭａｉ Ｔａｉ ３３０８レーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）でのＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ 倒立レーザー走査共焦点顕微鏡で４０×拡大にて撮像した。ヘキストを７８０ｎｍにて励起して、３９０−４９５ｎｍにて収集して、６４０ｎｍにて励起し、及び６５０−７１０ｎｍにて発光。

フローサイトメトリー実験
リポソームＳＮＡの細胞の取り込みを遊離ＤＮＡ鎖と比較するために、細胞を、１００μＬの培地中の９６ウェルにまき、及び０．１μＭ濃度の遊離ＤＮＡまたはリポソームＳＮＡと共に、及び２４時間インキュベートした。未処理細胞を実験のための負の対照として使用した。インキュベーション期間の後、細胞を０．０１％（容積の）のＴｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳで３回洗浄して、次いでトリプシン処理して懸濁液を形成した。フローサイトメトリーは、背景強度に関して未処理細胞からのシグナルを使用して、Ｇｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， ＵＳＡ）でＣｙ５強度チャンネルを使用して細胞の懸濁液で行った。エラー値は、単一の試料を表する異なるウェルからの中央シグナルの平均値の標準誤差を使用して算出した。

細胞毒性研究（ＭＴＴアッセイ）：
リポソームＳＮＡの細胞毒性を評価するために、ＳＫＯＶ−３細胞を実験の２４時間前に９６ウェルにまいた。細胞をＤＮＡの種々の濃度のリポソームＳＮＡで２４時間処理した。リポソームＳＮＡの細胞毒性をＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）１（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（市販のトランスフェクション薬剤）と比較した。細胞には、製造業者のトランスフェクションプロトコルに従ってＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）１でトランスフェクトした種々の濃度のＤＮＡをトランスフェクトした。処理を受けなかった細胞は、負の対照として使用した。２４時間のインキュベーション期間の後、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄して、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）と共にインキュベートして、４時間５％のＣＯ２中で３７℃にてインキュベートした。５９０ｎｍにおける蛍光発光を、ＢｉｏＴｅｋ， Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ４ Ｈｙｂｒｉｄ Ｒｅａｄｅｒを使用して記録した。

ＨＥＲ２タンパク質ノックダウンを定量化するためのウェスタンブロッティング
ＳＫＯＶ−３細胞を６穴プレートにまき、及び５％のＣＯ２中で３７℃にて一晩インキュベートした。細胞を抗ＨＥＲ２アンチセンスリポソームＳＮＡ及びスクランブル化リポソームＳＮＡと共にインキュベートした。２４時間の処理の後、培地を新鮮な培地で置換して、細胞をさらなる４８時間増殖させた。ＨＥＲ２タンパク質ノックダウンを解析するために、細胞を収集して、プロテアーゼ及び脱リン酸化酵素阻害薬を含む１００μＬの哺乳動物細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＭＡ、ＵＳＡ）に再懸濁した。（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＩＬ， ＵＳＡ）。細胞可溶化液中のタンパク質濃度は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して決定した。同量（２０μｇ）のタンパク質を４−２０％のＰｒｅｃａｓｔ勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって分画して、ニトロセルロース膜（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＩＬ、ＵＳＡ）へ転写した。膜をトリス−緩衝食塩水（ＴＢＳ）中の５％の乾燥脱脂乳溶液（ｗ／ｖ）を使用してブロックした。タンパク質をＨＥＲ２（１：１０００）に対する一次ウサギ抗体及びＧＡＰＤＨ（１：５００）続いて抗ウサギ二次抗体（１：１０，０００）（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＥ、ＵＳＡ）で検出した。蛍光シグナルは、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＥ、ＵＳＡ）を使用して記録した。

合成
典型的なリポソームＳＮＡは、２工程で合成した（図７）。第１の工程は、脂質単量体から３０ｎｍ直径単層小胞の調製を含む。このサイズ粒子は、ＳＮＡトランスフェクションの見地から理想的であり、及びより高い血液循環を最大にするために、及び腎臓を介したクリアランスを最小限にするために、適切な範囲にある。残念なことに、このサイズ状況のリポソームは、たいてい不安定であり、及び融合してより大きな構造を形成する。したがって、この研究の目標は、このような構造を合成し、及びこのような粒子成長経路を回避する方法を決定することであった。

小単層小胞（ＳＵＶ）を調製するために、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ホスフェート部分から伸長し、及び四級アンモニウム頭基で終結される２つのオレイン酸誘導体を含む不飽和脂質、を選択した。典型的な実験において、２０ｍＭ ＨＢＳ中のＤＯＰＣ単量体の懸濁液を音波破砕して平均３０ｎｍ ＳＵＶ粒子を生じた。粒子を遠心分離（１００，０００×ｇ）によって単離した。３０ｎｍ孔をもつポリカーボネート膜を通すこの材料のさらなる押出により、７０％の全収率で０．１１の多分散性指数（ＰＤＩ）をもつ粒子を得た。次いで、粒子を生理食塩水に再分散して、ＤＬＳを使用してこれらの３０±３ｎｍ直径を確認し、及びこれをまた、その後にネガティブ染色を使用するＴＥＭ解析によって確認した。

合成の第２の工程は、疎水性トコフェロール部分を有する核酸誘導体でのリポソームの表面機能付与を含み、これはＳＵＶを定義する脂質二重層に効率的に挿入する。様々な疎水性の頭基が適切かもしれないが［Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２６：１０２２４（２００４）； Ｂａｎｃｈｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｂ １１２：１０９４２（２００８）； Ｄａｖｅ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｎａｎｏ ５：１３０４（２０１１）； Ｊａｋｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２４：１４８５（２０１３）］、その生体適合性及び低コストのため、α−トコフェロール（ビタミンＥの形態）を選択した。α−トコフェロールは、市販のトコフェロールホスホラミダイト誘導体（Ｇｌｅｎｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を利用して、従来のオリゴヌクレオチド合成を経て核酸鎖（ＤＮＡ）上に配置した。リポソームＳＮＡは、８：１の脂質対核酸比を使用して室温にて１２時間核酸−トコフェロール抱合体（１６ｍＭ）と共にＳＵＶの懸濁液（１．３ｍＭまでの脂質）をインキュベートすることによって合成した。次いで、リポソームのないトコフェロール−核酸を、セファロースカラム（セファロース４ＬＢ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって試料から除去した。ＤＮＡの場合において、−１から−２３へのゼータ電位の有意な低下がこの工程の後に生じ、負に荷電した核酸でのリポソーム表面機能付与を示す。加えて、最終ナノ粒子試料の動的光散乱法（ＤＬＳ）解析は、３０から４６ｎｍまでの粒径の増大を示し、長さ８−９ｎｍ二重鎖構造の装填に一致する。リポソームの表面上に装填された核の鎖の平均数を定量的に決定するために、リポソーム−ＳＮＡをＴｒｉｔｏｎ Ｘの存在下において溶解し、これらを放出した。最終的な核酸濃度は、標準的な較正されたオリゴヌクレオチドに相対的に２６０ｎｍにて吸光度を測定することによって決定した。ＤＮＡで被覆されているリポソームＳＮＡは、粒子あたり７０の平均で鎖を有した（図１７）。この密度は、典型的な金に基づいたＳＮＡ構造より低いが［Ｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７８：８３１３（２００６）］、このような構造の協同的な特性の多くを示すためには十分である。リポソームＳＮＡの図表を図１６に提供した。

これらのリポソームＳＮＡ構造は、いくつかの興味深い特性を有する。最初に、これらは、これらが由来した天然の３０ｎｍリポソーム構築物と比較して著しく安定である（図２、図８）。たとえば、オリゴヌクレオチド表面層のないＳＵＶが３７℃（生理的温度）にて４日間貯蔵される場合、これらはより大きな多分散構造を融合し、及び形成する（数ミクロンサイズとなった実体をもつ平均１００ｎｍ構造で）。対照的に、リポソームＳＮＡは、ほとんど同一の条件下で同じ時間にわたって粒子分解または融合の証拠を示さない。リポソーム−ＳＮＡシステムに関する安定度におけるこの増大は、おそらくリポソーム−ＳＮＡ表面を含む負に荷電した核酸鎖間の斥力の結果であり、これは、個体粒子及び抑制粒子−粒子融合相互作用の両方を安定させる［Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２４：１７９０（２０１３）］。その上、リポソーム−ＳＮＡ上の負に荷電されたＤＮＡコロナは、血清タンパク質の存在下でその分解を予防するリポソームコアのための保護層として役立つ［Ｓｅｎｉｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ３０：２１２３（１９８２）； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃａｌ Ｒｅｓ． １４：３３６（１９９１）； Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ７４４−７４７：７３７（２００５）］。たとえば、リポソーム−ＳＮＡシステムの血清安定度を、２０ｍＭ（コア濃度）の自己消光濃度にてリポソーム−ＳＮＡのコア内に物理的に取り込んだスルホローダミン色素の放出を測定することによって調査した。この実験において、リポソームコア破壊により、粒子の内部からスルホローダミン色素の放出及びその後の自己消光の消失を生じ、したがって蛍光の増大を生じる［Ｖｅｒｓｌｕｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３５：８０５７（２０１３）］。典型的な実験では、ローダミン含有リポソームナノ粒子を３７℃にて１０％のウシ胎児血清中でインキュベートして、蛍光スペクトルを３時間連続的に記録した。同じ安定度研究を非機能性粒子について行った。熱安定性研究と同様に、ＤＮＡ機能性粒子は、実験の期間の間に血清中で安定なままであった。色素の放出は、３時間のインキュベーションの間に観察されなかった。対照的に、裸のＤＯＰＣリポソームのインキュベーションでは、ローダミン蛍光体の有意な放出に至り、血清中のリポソーム構造の迅速な分解を示す（図８）。

リポソームＳＮＡの第２の特性は、これらが協同的に相補的な核酸を結合する能力である。これは、全てのＳＮＡの顕著な特徴であり、及び表面に結合した核酸の高密度に圧縮され、かつ高度に配向された配置に由来する。リポソーム−ＳＮＡ構築物の結合及びその後の溶融特性を探索するために、それぞれが異なるＤＮＡ配列で作製されたリポソーム−ＳＮＡナノ粒子の２つのセット：粒子Ａ及び粒子Ｂを合成した。リポソーム−ＳＮＡのオリゴヌクレオチド配列に相補的であるＤＮＡリンカー配列を、ハイブリダイゼーションを介した重合を容易にするために使用した。２つのリポソームＳＮＡ粒子の等モル混合物に対するリンカー配列の付加により、ＤＬＳによって証明される凝集が生じ、及び最終的には、鱗状の沈殿物が形成された［Ｄａｖｅ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｎａｎｏ ５：１３０４（２０１１）］。これらの凝集体を２０ｍＭ ＨＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁して、溶融解析を、２６０ｎｍにて吸光度をモニターすることによって行った。重要なことに、著しく狭い融解転移が４７．５℃にて観察され（最初の誘導体の最大半減における全幅は、およそ２℃である）、これは高表面密度の核酸をもつＳＮＡ構造で高度に特徴的である（図９）。

ＳＮＡの重要な特性は、補助的トランスフェクション薬剤を伴わずにこれらが細胞に入る能力に関係する［Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３４：１３７６（２０１２）］。リポソームＳＮＡがこの挙動を示すかどうかを決定するために、卵巣癌腹水（ＳＫＯＶ３、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を、５’−Ｃｙ５標識ＤＮＡで合成したリポソームＳＮＡの存在下において異なるＤＮＡ濃度にて任意のトランスフェクション薬剤非存在下でインキュベートした。ＳＫＯＶ３細胞におけるリポソーム−ＳＮＡの取り込みは、共焦点顕微鏡法及びフローサイトメトリー技術を使用して解析した。注目すべきことに、リポソームＳＮＡは、１時間のインキュベーションの後でさえ大量に細胞に容易に入り、これは細胞内プローブ及び標的調節薬としてのこれらの有用性を証明する。加えて、ＳＫＯＶ３細胞における遊離ＤＮＡ鎖（５’−Ｃｙ５標識）の有意な取り込みは、同じ条件下で３６時間のインキュベーションの後でさえも検出されなかった。Ａｕ−ＳＮＡと同様に、ＳＫＯＶ３細胞におけるリポソーム−ＳＮＡの高い取り込みは、高濃度でさえ何らの毒性を生じさせなかった（図１０）。逆に、リポソーム−ＳＮＡによって送達される同等のＤＮＡを送達する試みにおけるＤｈａｒｍａＦＥＣＴの使用は、有意な細胞毒性を生じ、これはインキュベーションの２４時間の期間にわたって３５％まで細胞生存度を減少させた。

リポソーム−ＳＮＡは細胞毒性がないことを確立した後に、ヒト上皮細胞成長因子受容体２（ＨＥＲ２）−ＳＫＯＶ３細胞において過剰発現される癌遺伝子をノックダウンすることができるリポソーム−ＳＮＡを合成した［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １３４：１６４８８（２０１２）］。リポソーム−ＳＮＡのアンチセンス活性の有効性を従来のトランスフェクションシステムのものと比較するために、ＳＫＯＶ３細胞を抗ＨＥＲ２リポソーム−ＳＮＡ及び対照リポソーム−ＳＮＡ（それぞれ１μＭの総ＤＮＡ濃度にて）の存在下においてインキュベートした。７２時間のインキュベーションの後、細胞を収集して、ウェスタンブロッティングによってタンパク質含有量について解析した。重要なことに、ＨＥＲ２タンパク質レベルは、内部参照遺伝子グリセルアルデヒド３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（図１０）と比較して、抗ＨＥＲ２リポソーム−ＳＮＡの存在下で８５％まで減少された。ひとまとめにして、これらの結果は、細胞トランスフェクション及び遺伝子制御の両方に影響を及ぼすためのリポソーム−ＳＮＡの使用の潜在性を示す。

要約すると、新規の金属を含まないリポソームＳＮＡのための拡張性のある合成経路が開発された。このような構造は、すぐに利用できる、無毒性出発材料から迅速に構築される。核酸構築物は、これらの小さいリポソーム構造を安定させるだけでなく、ＳＫＯＶ３細胞によるこれらの内部移行も容易にする。結果的に、このような構造は、より慣習的な金ナノ粒子に基づいたＳＮＡの魅力的な特性の多くを示す新たな生体適合性遺伝子制御構築物としての有用性を示す。

実施例６−Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞においてリポソーム粒子を試験する
Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞は、ＮＦ−κＢ／ＡＰ−１リポーターＢリンパ球細胞である。Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅは、ＮＦ−κＢ／ＡＰ−１−誘導性ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリ性ホスファターゼ）リポーター遺伝子を安定して発現するＢリンパ球株化細胞である。刺激したときに、これらは、上清にＳＥＡＰを産生し、これはＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅアッセイを使用して容易にモニターすることができる。ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅは、ＳＥＡＰの存在下において青くなるＳＥＡＰ検出媒体である（図１４）。

ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドと接触したときに、Ｒａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞の活性化が検出された（図１５）。代表化合物は、ＴＬＲ ９アゴナイズオリゴヌクレオチドＣｐＧ ７９０９（５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３’（配列番号：８））に基づいて合成した。これらは、１３ｎｍ金ナノ粒子（ＣｐＧ ７９０９−ｐｏ ＳＮＡ（Ａｕ））上に高密度に機能化されたホスホジエステル骨格をもつＣｐＧ ７９０９、完全なホスホロチオアートバックボーンをもつＣｐＧ ７９０９（ＣｐＧ ７９０９−ｐｓ）、ホスホジエステルＣｐＧ ７９０９をもつリポソームＳＮＡ（７９０９ターゲティング（粒子））、全てのホスホジエステル骨格オリゴヌクレオチドのＣ及びのＧがＴＬＲ ９結合部位を排除するように反転したリポソームＳＮＡ（７９０９対照（粒子））、リポソームＳＮＡに製剤化されることなくホスホジエステル骨格及び３’−トコフェロール脂質をもつＣｐＧ ７９０９（７９０９ターゲティング（トコフェロール））並びに制御配列はリポソームＳＮＡにまた製剤化されていな反転したＣ及びＧをもつ（７９０９対照（トコフェロール））を含む。次いで、これらの化合物を連続的に希釈して、次いでＲａｍｏｓ−Ｂｌｕｅ細胞、炎症誘発性転写因子ＮＦ−κＢの活性化に応じて分泌されるアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を発現する株化細胞と共に一晩インキュベートして、ＱｕａｎｔｉＢｌｕｅキット（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ）を介して細胞培地中のＳＥＡＰレベルをプローブした。活性化は、６５０ｎｍにおける光の吸収によって測定した。

実施例７−ＨＩＦ１−αを調節するリポソーム粒子の使用
本開示の組成物の有効性をさらに証明するために、リポソーム粒子を、ＨＩＦ１−α及びＢＡＸを個々にターゲットするようにデザインした。実験には、成長の早いマウス神経芽腫株化細胞であるＮｅｕｒｏ−２ａ（Ｎ２Ａ）株化細胞を利用した。ＨＩＦ１−α（図１８）及びＢＡＸ（図１９）をターゲットするリポソーム粒子とＮ２Ａ細胞を接触すると、標的遺伝子産物の量における有意な減少を示した。それぞれの実験において、ｍＲＮＡ発現の相対量は、６穴プレートにおけるＮ２Ａ細胞の処理を開始した７２時間後の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定した−細胞は、リポソーム粒子の除去及びＭＥＭ及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）との培地の置換の前に、ＯｐｔｉＭＥＭ中で２４時間リポソーム粒子で処理した。

ＨＩＦ１−αがターゲットされた実験については、Ｎ２Ａ細胞をＣｏｃｌ２刺激した低酸素に最初に供し、これは約５０％までＨＩＦ１−αｍＲＮＡ発現を増加させた。次に、Ｎ２Ａ細胞を、ＨＩＦ１−αに向けたｓｉＲＮＡで機能化したリポソーム粒子と接触した。接触により、約５０％のＨＩＦ１−αのノックダウンを生じた（図１８）。

ＢＡＸがターゲットされた実験については、Ｎ２Ａ細胞の処理では、リポソーム粒子によるＢＡＸ ｍＲＮＡのほぼ６５％のノックダウン及び脂質ミセルＳＮＡによるＢＡＸ ｍＲＮＡの５０％を上回るノックダウンを生じた（対照リポソームＳＮＡに対して測定したとき）（図１９）。

これらの実験は、哺乳動物細胞における標的遺伝子発現を阻害することにて本開示のリポソーム粒子が極めて効率が高いことを示した。

本発明は、前述の図解の実施例に限定されないこと、及びその必須の属性を逸脱しない範囲でその他の具体的形態において実施することができることが当業者には明らかだろう。したがって、実施例は、全ての点において例示的であり限定的でないとみなされ、及び前述の実施例よりはむしろ添付の特許請求の範囲及び特許請求の範囲の均等の意味及び範囲内に入る全ての変化に対して参照がなされ、及びしたがって、その中に包含されることが意図されることが望まれる。

Claims (48)

1. 実質的に球状形状を有するリポソーム粒子であって、前記リポソーム粒子は：
   複数の脂質基を含む脂質二重層；及び
   オリゴヌクレオチド、
   を含む、前記リポソーム粒子。
2. 請求項１の前記リポソーム粒子であって、前記複数の脂質基は、脂質のホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール及びホスファチジルエタノールアミンファミリーからなる群より選択される脂質を含む、前記リポソーム粒子。
3. 請求項２の前記リポソーム粒子であって、前記脂質は、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）及び１，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）からなる群より選択される、前記リポソーム粒子。
4. 請求項１−３のいずれか１項の前記リポソーム粒子であって、前記オリゴヌクレオチドは、親油性連結基を含むオリゴヌクレオチド−脂質抱合体であり、前記親油性連結基は、脂質二重層の中に吸着される、前記リポソーム粒子。
5. 請求項４の前記リポソーム粒子であって、前記親油性連結基は、トコフェロールまたはコレステロールを含む、前記リポソーム粒子。
6. 請求項５の前記リポソーム粒子であって、トコフェロールは、トコフェロール誘導体、アルファ−トコフェロール、ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール及びデルタ−トコフェロールからなる群より選択される、前記リポソーム粒子。
7. 請求項１−６のいずれか１項の前記リポソーム粒子であって、前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、前記リポソーム粒子。
8. 請求項７の前記リポソーム粒子であって、前記ＲＮＡは、非コードＲＮＡである、前記リポソーム粒子。
9. 請求項８の前記リポソーム粒子であって、前記非コードＲＮＡは、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である、前記リポソーム粒子。
10. 請求項８または請求項９の前記リポソーム粒子であって、前記ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡと三本鎖を形成する一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及びリボザイムからなる群より選択される、前記リポソーム粒子。
11. 請求項８または請求項９の前記リポソーム粒子であって、ＲＮＡは、マイクロＲＮＡである、前記リポソーム粒子。
12. 請求項７の前記リポソーム粒子であって、前記ＤＮＡは、アンチセンスＤＮＡである、前記リポソーム粒子。
13. 請求項１−１２のいずれか１項の前記リポソーム粒子であって、前記リポソーム粒子の直径は、約５０ナノメートル以下である、前記リポソーム粒子。
14. 請求項１−１３のいずれか１項の前記リポソーム粒子であって、前記粒子は、約１０〜約８０オリゴヌクレオチドを含む、前記リポソーム粒子。
15. 請求項１４の前記リポソーム粒子であって、前記粒子は、７０オリゴヌクレオチドを含む、前記リポソーム粒子。
16. 請求項１−１５のいずれか１項の前記リポソーム粒子であって、前記オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドである、前記リポソーム粒子。
17. リポソーム粒子を作製する方法であって：
    溶媒にリン脂質を添加して第１の混合物を形成することであって、前記第１の混合物は、複数のリポソームを含むこと；
    前記複数のリポソームを破壊して第２の混合物を作り出すことであって、前記第２の混合物は、リポソーム及び小単層小胞（ＳＵＶ）を含むこと；
    前記第２の混合物から前記ＳＵＶを単離することであって、前記ＳＵＶは、約２０ナノメートルと５０ナノメートルとの間の粒径を有すること；
    単離されたＳＵＶにオリゴヌクレオチドを添加してリポソーム粒子を作製すること、
    を含む、方法。
18. 請求項１７の方法であって、前記第１の混合物中の複数のリポソームの粒径は、約１００ナノメートル〜１５０ナノメートルの間にある、前記方法。
19. 請求項１７または請求項１８の方法であって、前記第２の混合物中の前記リポソーム及び前記ＳＵＶの粒径は、約２０ナノメートル〜約１５０ナノメートルの間にある、前記方法。
20. 請求項１７の方法であって、前記リポソーム粒子は、約５０ナノメートル以下の粒径を有する、前記方法。
21. 請求項１７−２０のいずれか１項の前記リポソーム粒子であって、前記オリゴヌクレオチドは、親油性連結基を含むオリゴヌクレオチド−脂質抱合体であり、前記親油性連結基は、脂質二重層中に吸着した、前記リポソーム粒子。
22. 請求項２１の方法であって、前記親油性連結基は、トコフェロールまたはコレステロールを含む、前記方法。
23. 請求項２２の方法であって、トコフェロールは、トコフェロール誘導体、アルファ−トコフェロール、ベータ−トコフェロール、ガンマ−トコフェロール及びデルタ−トコフェロールからなる群より選択される、前記方法。
24. 請求項１７−２３のいずれか１項の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、前記方法。
25. 請求項２４の方法であって、前記ＲＮＡは、非コードＲＮＡである、前記方法。
26. 請求項２５の方法であって、前記非コードＲＮＡは、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である、前記方法。
27. 請求項２６の方法であって、前記ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡと三本鎖を形成する一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及びリボザイムからなる群より選択される、前記方法。
28. 請求項２４の方法であって、前記ＲＮＡは、マイクロＲＮＡである、前記方法。
29. 請求項２４の方法であって、前記ＤＮＡは、アンチセンスＤＮＡである、前記方法。
30. 請求項１７−２９のいずれか１項の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドである、前記方法。
31. ポリヌクレオチドの全体または一部に相補的な１つまたは複数のオリゴヌクレオチドで前記遺伝子産物をコードする前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする工程を含む遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、請求項１−１６のいずれか１項のリポソーム粒子に付着されており、前記ポリヌクレオチドと前記オリゴヌクレオチドとの間でハイブリダイズすることは、前記遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な相補性の程度で前記ポリヌクレオチドの長さにわたって起こる、前記方法。
32. 請求項２９の方法であって、前記遺伝子産物の発現は、インビボで阻害される、前記方法。
33. 請求項２９の方法であって、前記遺伝子産物の発現は、インビトロで阻害される、前記方法。
34. 請求項３１−３３のいずれか１項の方法であって、前記リポソーム粒子は、約５０ナノメートル以下の直径を有する、前記方法。
35. 請求項３１−３４のいずれか１項の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、前記方法。
36. 請求項３５の方法であって、前記ＲＮＡは、非コードＲＮＡである、前記方法。
37. 請求項３６のいずれか１項の方法であって、前記非コードＲＮＡは、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である、前記方法。
38. 請求項３７の方法であって、前記ＲＮＡｉは、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡと三本鎖を形成する一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及びリボザイムからなる群より選択される、前記方法。
39. 請求項３５の方法であって、前記ＲＮＡは、マイクロＲＮＡである、前記方法。
40. 請求項３５の方法であって、前記ＤＮＡは、アンチセンスＤＮＡである、前記方法。
41. トール様受容体（ＴＬＲ）の活性をアップレギュレートするための方法であって、前記トール様受容体を有する細胞を請求項１−１６のいずれか１項のリポソーム粒子と接触させることを含む、前記方法。
42. 請求項４１の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲアゴニストである、前記方法。
43. 請求項４１または請求項４２の方法であって、前記トール様受容体は、トール様受容体１、トール様受容体２、トール様受容体３、トール様受容体４、トール様受容体５、トール様受容体６、トール様受容体７、トール様受容体８、トール様受容体９、トール様受容体１０、トール様受容体１１、トール様受容体１２及びトール様受容体１３からなる群より選択される、前記方法。
44. トール様受容体（ＴＬＲ）の活性をダウンレギュレートするための方法であって、トール様受容体を有する細胞を請求項１−１６のいずれか１項のリポソーム粒子と接触させることを含む、前記方法。
45. 請求項４４の方法であって、前記オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲアンタゴニストである、前記方法。
46. 請求項４４または請求項４５の方法であって、前記トール様受容体は、トール様受容体１、トール様受容体２、トール様受容体３、トール様受容体４、トール様受容体５トール様受容体６、トール様受容体７、トール様受容体８、トール様受容体９、トール様受容体１０、トール様受容体１１、トール様受容体１２及びトール様受容体１３からなる群より選択される、前記方法。
47. インビトロで行われる請求項４１−４６のいずれか１項の前記方法。
48. インビボで行われる請求項４１−４６のいずれか１項の前記方法。