KR102622653B1 - 인산화기를 이용한, 핵산의 전달을 위한 엑소좀 복합체 - Google Patents

인산화기를 이용한, 핵산의 전달을 위한 엑소좀 복합체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인산화기를 이용한 핵산의 세포 내 전달용 엑소좀 복합체에 관련된 것으로서, 전달 대상 핵산의 생리적 활성을 저하시키지 않으면서 안정적으로 목적하는 세포 내에 전달할 수 있는 기술적 효과가 존재한다.

Description

인산화기를 이용한, 핵산의 전달을 위한 엑소좀 복합체{Exosome complex for delivery of nucleic acids using phosphorylation groups}
본 발명은 인산화기를 이용한, 핵산의 전달을 위한 엑소좀 복합체, 이를 이용한 핵산의 세포 내 전달방법 및 이의 제조방법에 관련된 것이다.
엑소좀은 세포로부터 방출되어지는 30-100 nm 크기를 가지는 막 소포체(membrane vesicles)로서 혈액, 소변 등을 포함한 대부분의 체액에 존재하며, 단백질, mRNA, miRNA 등의 생리활성물질을 통해 세포 간의 신호전달을 중 개하는 것으로 알려져 있다. 또한, 엑소좀은 세포막과 함께 융합되면서 분비되어 두 층의 인지질 막으로 구성되어 체내의 혈장과 면역 성분들로부터 엑소좀 내부의 물질을 보호하고, 내포작용(endocytosis)과 융합을 통해 수용세포로의 물질전달을 가능하게 한다. 특히 단백질, 막 수용체 및 핵산 등과 같은 다양한 범위의 생물학적 물질들을 담지할 수 있어, 최근 약물전달시스템을 위한 신개념의 치료용 전달체로 부상하고 있다.
그러나, 엑소좀을 질병모델의 생체 내에 주입할 경우 간, 비장 및 신장에 대부분 축적되고 병변 부위에 대한 표적능이 매우 부족한 것으로 알려져 있다. 이는 인지질, 다당류, 단백질 등으로 구성된 엑소좀의 표면성질로 인한 것이며, 따라서, 생체분포 거동을 제어하기 위해서는 표면을 효과적으로 개질할 수 있는 기술이 요구된다.
최근에 융합(fusion) 또는 유전공학을 이용한 엑소좀 표면개질 기술이 개발된 바 있으나, 공정이 복잡하고, 효율이 낮으며, 안정성이 우수하지 않을 뿐만 아니라 재현성의 문제로 응용이 제한적이다. 따라서 보다 간편하고 안정적인 화학적 도구를 이용하여 엑소좀을 정교하고 다양하게 제어할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.
생물 직교성 부동 클릭화학은 세포 독성을 갖는 구리 촉매를 필요로 하지 않는 생접합 반응으로 매우 신속하고 선택적이며 효율이 높은 특징이 있으며, 바이러스, DNA, 펩티드, 항체, 리포좀, 나노입자와 같은 초분자(supramolecule)들의 표면을 개질하기 위한 도구로 각광을 받고 있으며, 주로 리포좀의 표면을 개질하는 기술이 알려져 있다.
한국등록특허 제2056475호
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 인산화기를 이용한, 핵산의 전달을 위한 엑소좀 복합체, 이를 이용한 핵산의 세포 내 전달방법 및 이의 제조방법을 제공함에 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업계 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 양태로서, 엑소좀 및 이중 가닥 핵산을 포함하고, 상기 이중 가닥 핵산은 5' 말단에 인산화기가 결합된 제1가닥과 이에 상보적인 제2가닥(antisense strand)을 포함하며, 상기 인산화기를 통해 엑소좀의 표면에 연결된, 핵산의 전달을 위한 엑소좀 복합체를 제공한다.
상기 제1가닥은 5' 말단에 인산화기(phosphate group)가 결합된 형태인데, 이는 제1가닥의 5' 말단에 화학적 5' 인산화 제제나 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제와 같은 상용화된 제제를 이용하여 인산화기가 결합된 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 이중 가닥 핵산은 엑소좀의 표면에 안정적으로 연결되는 형태라면 어떠한 형태로든 특별히 제한되지는 않으나, 구체적으로는 엑소좀의 표면에 존재하는 1차 아민(primary amine)과 상기 인산화기가 결합되어 연결되는 형태일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 이중 가닥 핵산은 전달하고자 하는 핵산의 간이하고 효율적인 전달의 측면에서 엑소좀의 외부 표면 1차 아민에 상기 인산화기가 결합되어 연결되는 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1가닥은 10 내지 30, 11 내지 30, 12 내지 30, 13 내지 30, 14 내지 30, 15 내지 30, 10 내지 25, 11 내지 25, 12 내지 25, 13 내지 25, 14 내지 25 또는 15 내지 25개 염기로 이루어진 것일 수 있고, 적정범위의 길이를 유지하여 안정적으로 제2가닥과 상보적으로 결합되도록 하는 측면에서 바람직하게는 15 내지 25개 염기로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제2가닥은 10 내지 30, 11 내지 30, 12 내지 30, 13 내지 30, 14 내지 30, 15 내지 30, 10 내지 25, 11 내지 25, 12 내지 25, 13 내지 25, 14 내지 25 또는 15 내지 25개 염기로 이루어진 것일 수 있고, 적정범위의 길이를 유지하여 안정적으로 제1가닥과 상보적으로 결합되면서, 목적하는 세포 내에 효과적으로 전달되도록 하는 측면에서 바람직하게는 15 내지 25개 염기로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1가닥 또는 제2가닥은, 엑소좀의 표면에 상기 인산화기를 통해 안정적으로 연결되어 전달하고자 하는 제2가닥의 형태에 따라 당업자에 의해 자유로이 변경될 수 있음은 자명한 것이며, 구체적인 예로서는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모포리노(morpholino), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA), 브릿지 핵산(BNA), N3′-P5′포스포르아미데이트(NP) 올리고머, 좁은 홈 결합물질(minor groove binder)이 연결된 올리고뉴클레오티드(MGB-linked oligonulcletide), 포스포로티오에이트(PS) 올리고머, C1-C4 알킬포스포네이트 올리고머, 포스포르아미데이트, β-포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드 및 α-포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 엑소좀은 줄기세포, 수지상 세포, 혈액세포, 동물세포, 미생물 또는 식물세포 등으로부터 유래한 것일 수 있고, 구체적인 일 실시예에 따를 때 배아세포, 구체적으로는 인간의 배아세포 유래인 HEK293 세포주(Human Embryonic Kidney 293, 사람 발생 신장 293 세포주)로부터 유래한 것일 수 있으나, 당업자가 사용하고자 하는 엑소좀 또는 당업자가 핵산을 전달하고자 하는 목적 세포의 종류에 따라 자유로이 선택할 수 있는 것으로서, 특별히 그 종류나 유래에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태로서, 생물학적 시료로부터 엑소좀을 수득하는 단계; 이미다졸(imidazole), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 이중 가닥 핵산을 혼합하여 반응시키는 단계; 및 상기 수득한 엑소좀과 상기 반응물을 혼합하는 단계를 포함하고, 상기 이중 가닥 핵산은 5' 말단에 인산화(phosphorylation)기가 결합된 제1가닥과 이에 상보적인 제2가닥(antisense strand)을 포함하는 것인, 핵산의 전달을 위한 엑소좀 복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 이미다졸 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)는 이중 가닥 핵산을 엑소좀에 효과적으로 결합시키기 위해 혼합시키는 역할을 수행하는 것일 수 있는데, 이러한 역할 수행에 제한이 없는 한 각각의 유도체까지 모두 포함하는 개념으로 해석되어야 한다. 구체적으로, 이미다졸의 경우, 1-메틸이미다졸, 2-메틸이미다졸, 1-에틸이미다졸 및 2-에틸이미다졸 등이 모두 포함될 수 있으며, EDC의 경우, 이의 다양한 치환체들이 모두 포함될 수 있다.
상기 제1가닥, 제2가닥, 인산화기에 관련된 구체적인 설명은 상술한 바를 참조하여 해석될 수 있다.
상기 엑소좀을 수득하는 단계는 줄기세포, 수지상 세포, 혈액세포, 동물세포, 미생물 또는 식물세포 등의 배양액으로부터 엑소좀을 수득하는 단계일 수 있고, 구체적인 일 실시예에 따를 때, 배아세포, 구체적으로는 인간의 배아세포 유래인 HEK293 세포주(Human Embryonic Kidney 293, 사람 발생 신장 293 세포주)의 배양액으로부터 엑소좀을 수득하는 단계일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 엑소좀을 수득하는 단계는, 생물학적 시료에 복수의 연속적인 한외 여과(ultrafiltration)를 수행하는 단계; 및 상기 여과된 시료에 폴리에틸렌글리콜(Poly-(ethylene glycol))을 처리하여 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 한외 여과를 수행하는 단계는 1 내지 10회, 1 내지 9회, 1 내지 8회, 1 내지 7회, 1 내지 6회, 1 내지 5회, 1 내지 4회 또는 1 내지 3회 연속적으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 1 내지 6회 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 한외 여과를 수행하는 단계는 각각 여과 입자의 크기가 상이하도록 필터를 설정하여 복수로 연속적으로 수행할 수 있는데, 큰 크기의 기공으로부터 작은 크기의 기공을 갖는 필터까지 연속적으로 하여 복수회 수행하는 것일 수 있다. 예를 들어, 3회의 연속적인 한외 여과를 수행하는 경우, 큰 크기의 기공을 갖는 필터, 중간 크기의 기공을 갖는 필터 및 작은 크기의 기공을 갖는 필터로 연속적으로 설정할 수 있고, 보다 구체적으로, 첫번째 한외 여과는 50 내지 150 kDa, 두번째 한외 여과는 6 내지 30 kDa, 세번째 한외 여과는 1 내지 5 kDa 필터를 사용하여 연속적으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴레에틸렌글리콜(PEG)은 당업계에 알려진 폴리에틸렌글리콜을 자유로이 사용할 수 있고, 구체적인 예를 들면 PEG200, PEG 300, PEG400, PEG600, PEG1000 PEG1500, PEG2000, PEG3000 PEG3350, PEG4000, PEG6000, PEG8000, PEG10000, PEG20000 및 PEG35000으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 선택할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 정제하는 단계는 폴리에틸렌글리콜을 상기 여과된 시료와 혼합한 후, 원심분리하여 하층액을 수득하는 단계를 포함할 수 있는데, 이는 한외 여과된 여과액 내 포함된 다양한 불순물들을 제거하여, 최종적으로 수득하는 엑소좀의 순도를 높이고, 이를 통해 전체적인 엑소좀의 세포 투과율을 증진하기 위한 목적일 수 있다.
상기 제조방법을 해석함에 있어, 상술한 내용들을 모두 참조하여 해석될 수 있음은 자명할 것이다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 복합체를 목적하는 세포에 접촉시켜 상기 제2가닥(antisense strand)을 세포 내 전달하는 단계를 포함하는, 엑소좀 복합체를 이용한 핵산의 전달방법을 제공한다.
상기 세포에의 접촉은, 엑소좀을 이용하여 엑소좀의 외부 표면에 결합된 물질을 목적하는 세포 내에 전달하고자 처리되는 당업계 주지된 모든 방법을 의미할 수 있고, 구체적인 예로서, 상기 복합체를 목적하는 세포와 함께 배양하는 것을 의미할 수 있다.
상기 전달방법은 상기 복합체에 포함된 제2가닥을 목적하는 세포 내에 전달하는 것으로서, 상기 복합체에 포함된 제1가닥은 제2가닥과 상보적으로 결합하여, 이를 안정적으로 엑소좀의 표면에 연결시키는 지지대의 역할을 수행하는 것일 수 있다.
상기 전달방법을 해석함에 있어, 상술한 내용들을 모두 참조하여 해석될 수 있음은 자명할 것이다.
본 발명은 인산화기를 이용한, 핵산의 전달을 위한 엑소좀 복합체에 관련된 것으로서, 전달 대상 핵산의 생리적 활성을 저하시키지 않으면서 안정적으로 목적하는 세포 내에 전달할 수 있는 기술적 효과가 존재한다.
다만, 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명 복합체를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2, 3은 본 발명 복합체를 이용하여 핵산을 세포 내로 전달에 성공하였음을 보여주는 형광 이미지 분석 결과이다.
도 4는 본 발명 복합체를 이용하여 EGFR 안티센스 DNA를 세포 내에 전달하였고, 세포 내에서 정상적인 기능을 발휘하였음을 보여주는 결과이다.
도 5는 실시예 1에 따라 수득한 엑소좀의 전기영동 결과(좌)와, 엑소좀 표면 단백질인 Alix, CD63에 대한 웨스턴 블롯 결과(우)이다.
도 6은 실시예 1에 따라 수득한 엑소좀의 세포 투과 능력을 형광 이미지 분석으로 나타낸 결과이다.
이하, 보다 구체적으로 설명하기 위해 실시예와 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 하기 실시예와 실험예는 예시적인 것으로, 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 엑소좀의 분리
HEK293 세포 3X106개/플레이트 농도로 배양접시에 부착시켰고, 24시간이 경과되었을 때, 엑소좀이 없는 배양액으로 교체한 후 다시 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포배양액 10mL를 모아 100kDa Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter로 농축하여 1ml를 수득하였고(High MW), 수득한 용액 1mL에 5ml 1X PBS를 넣고 섞은 후 10kDa Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter로 농축하여 500μL를 수득하였으며(Middle MW), 수득한 용액 500μL에 3mL 1X PBS를 넣고 섞은 후 3kDa Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter로 농축하여 300μL를 수득하였다(Small MW).
이후, 50% PEG6000 용액 700μL를 300μL 수득용액에 넣고 섞은 후 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 다음, 13000rpm(4℃ 유지)에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 펠렛을 1X PBS로 녹여 최종 엑소좀을 수득하였다.
2. 복합체의 제조
33.3μL의 1-메틸이미다졸(1-Methylimidazole; 0.1M in 1X PBS; pH 6.0), 10μL EDC(100mg/ml in 1XPBS; pH 6.0), Scramble 또는 EGFR 이중 가닥 DNA를 각각 10μL(50μM Stock; Scramble 안티센스 가닥: 5'-G*A*G*T*T*C*G*C*G*T*C*C*T*T*T*C*T*C*C*A-3' PTO구조 "*"; Scramble 센스 가닥: 5'-TGGAGAAAGGACGCGAACTC-3' 5'에 인산화; EGFR 안티센스 가닥: 5'- C*C*C*C*A*G*C*A*G*C*T*C*C*C*A*T*T*G*G*G-3' PTO구조 "*"; EGFR 센스 가닥: 5'- CCCAATGGG AGCTGCTGGGG -3' 5'에 인산화)을 섞어 상온에서 5분 동안 반응시킨 후 실시예 1의 최종 엑소좀이 100μg이 되게(총 부피 100μL) 첨가하고, 50℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 상기 반응시킨 엑소좀을 1XPBS 350μL에 첨가하여 섞은 후, 10kDa Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter를 이용하여 원심분리기로 13000rpm(4℃ 유지)에서 3분간 원심분리하여 엑소좀과 반응하지 않은 1-메틸이미다졸과 EDC를 제거하였다(총2회반복). 마지막 원심분리 후, 나머지 10kDa Amicon® Ultra-15 Centrifugal Filter에 남아있는 최종 복합체를 수득하였다(도 1).
실험예
1. 분리된 엑소좀의 순도 및 세포투과율 확인
분리된 엑소좀의 순도를 확인하고자, High MW 단계를 적용한 경우, High MW + Middle MW 단계를 적용한 경우, High MW + Middle MW + Small MW 단계를 적용한 경우 및 High MW + Middle MW + Small MW + PEG 단계를 적용한 경우 각각에 대한 엑소좀의 단백질 분석을 위해 각 시료를 BCA 단백질 정량 kit (Thermofisher Scientific, Cat No. 23235)을 이용하여 정량하여 10μg 단백질의 exosome을 5X laemmli sample buffer와 혼합 (exosome + 5X laemmli sample buffer = 15μL 볼륨으로 일정하게 맞춤)한 후 100 ℃에서 10분 끓인 후 시료를 10% SDS-PAGE 젤에 로딩하여 1X SDS-PGAE Running buffer (0.025M Tris-HCl (pH8.3), 0.192M Glycine, 0.1% SDS)에서 100V 고정 전압으로 2시간 동안 SDS-PAGE하였다. SDS-PAGE후 젤 카세트에서 젤을 분리하여 PVDF membrane에 올린 후1X Transfer buffer (전기이동 용액)에서 (10X Transfer buffer 100ml (Tris-base 30.3g + Glysine 144g 1L), DW 700ml, Methanol 200ml) 120V고정 전압으로 1시간 동안 전기 이동을 진행하여 젤 상에 모든 단백질을 PVDF에 이동시켰다. PVDF membrane을 1X TBS-T(1X TBS-T Buffer: 100 mL 10X TBS (Tris-Buffered Saline = Tris 200mM, NaCl = 1.5M in 1L DW) + 1mL Tween® 20 Detergent 100% + 899ml DW)에 5% 탈지분유 (w/v) (5% Skim Milk)를 혼합한 용액에서 상온에서 1시간 동안 블롯팅한다. 이후, Alix (Santcruz, Cat. No. SC-53540)와 CD63 (Santacruz, Cat. No. SC-5275)항체를 5% 탈지분유 용액에 1:1000 (v/v)희석하여 4℃에서 16시간 반응 시킨다. 반응이 끝난 후 1X TBS-T로 5분간 3회 세척 후 anti-mouse 항체를 5% 탈지분유 용액에 1:5000 (v/v)희석하여 상온에서 1시간 반응시킨다. 이후 1X TBS-T로 세척 후 ECL용액 (Merck, Cat. No. S0500)을 반응 시켜 FluorChem E 시스템을 이용하여 단백질 발현 차이를 확인하였다. 또한, 웨스턴 블롯 후, 불순물의 포함여부를 확인하기 위해, PVDF 막을 ponseu-S용액으로 염색하여 전기영동 및 단백질 패턴을 확인하였다.
도 5의 왼쪽 도면에서 확인할 수 있듯, High MW 단계를 적용한 경우, High MW + Middle MW 단계를 적용한 경우에서는 분리한 엑소좀에서 세포 불순물이 대량 포함되어 있음을 확인할 수 있으나, High MW + Middle MW + Small MW 단계를 적용한 경우 및 High MW + Middle MW + Small MW + PEG 단계를 적용한 경우 세포 불순물이 많은 양 제거되었음을 확인할 수 있다.
또한, 도 5의 오른쪽 도면에서 확인할 수 있듯, High MW + Middle MW + Small MW 단계를 적용한 경우 및 High MW + Middle MW + Small MW + PEG 단계를 적용한 경우, 엑소좀 구성 단백질인 Alix와 CD63이 상대적으로 많은 양 포함되어 있음을 확인할 수 있는데, 이는 엑소좀의 순도가 매우 높다는 것을 보여주는 것이다.
이러한 결과는, 복수의 연속적인 필터링 과정을 수행함에 따른 기술적 효과로 판단되고, 특히 필터링 단계를 큰 기공으로부터 작은 기공으로 순차적이고 연속적으로 설계함에 따른 효과인 것으로 판단된다.
또한, 복수의 필터링 단계로 분리한 엑소좀 (High MW + Middle MW + Small MW) 과 이에 최종 PEG (High MW + Middle MW + Small MW+ PEG)를 적용한 엑소좀의 세포 투과율을 확인하고자, 각 두 단계를 적용한 경우의 엑소좀을 단백질 정량하여, 10μg의 엑소좀에 1.5μL DSPE-PEG2000-Biotin(5mg/ml Stock in 50% DMSO)를 넣고 1X PBS로 총 볼륨을 100μL으로 고정시켜 3시간 동안 37℃에서 반응시킨 후, 10μL Streptavidin-Alexa647(1.5mg/ml Stock)을 넣고 30분간 37℃에서 반응시켜 세포에 처리하였다. 이후, 세포 내 엑소좀을 형광 이미징 장비(cytation 5, Bioteck)로 측정하였다.
도 6에서 확인할 수 있듯, 동량의 엑소좀 처리시 High MW + Middle MW + Small MW + PEG 단계를 적용한 경우의 엑소좀의 세포 투과성이 현저히 높은 것을 확인할 수 있다. 즉, Alix/CD63의 발현율은 유사하였으나, 세포 투과 기능을 가지는 엑소좀의 양은 PEG로 추가적 정제단계를 수행한 경우가 현저히 많은 것을 확인할 수 있는데, 이는 상기 High MW + Middle MW + Small MW + PEG 단계를 적용하는 경우, 엑소좀의 순도뿐만 아니라, 엑소좀의 세포 투과성 향상의 영향을 주는 것임을 입증하는 결과이다.
2. 제조된 복합체에 의한 핵산의 세포 내 전달 확인
(1) 형광 이미징 분석
상기 실시예 2에서 제조한 복합체에 있어서, 10μL 형광 이중 가닥 DNA(안티센스 가닥의 5'에 Texas Red 접합)를 적용하였고, 단백질 정량분석 후 5μg의 단백질 양이 되도록 복합체를 A549 세포주 각 웰 (세포수: 6X103/웰)에 처리하였다. 24시간 후, 형광 이미징 장비(Cytation 5, Bioteck)를 이용하여 세포 내 형광을 측정하였다.
도 2, 3에서 확인할 수 있듯, 엑소좀만(Exosome(+)/DNA(-)) 또는 엑소좀 없이 DNA만(Exosome(-)/DNA(+)) 처리한 세포주에서는 붉은색 형광이 나타나지 않음을 확인할 수 있다. 반면, DNA를 상기 제조된 복합체를 이용하여 처리한 세포주(Exosome(+)/DNA(+))의 경우 Texas Red의 붉은색 형광이 선명하게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이는, DNA 자체만으로는 세포 내로 투과될 수 없음을 의미함과 동시에, 상기 제조된 복합체를 이용하여 전달하는 경우 매우 효과적으로 세포 내에 DNA를 전달할 수 있음을 보여주는 결과이다.
(2) 발현량 변화 분석
상기 실시예 2에서 제조한 복합체에 있어서, 이중 가닥 DNA로서 스크램블 DNA를 적용한 복합체를 동일한 조건 하에 제조하였고(EXO+SCR), 단백질 정량분석 후 100μg의 단백질 양이 되도록 대조군, 실시예 2의 복합체(EXO+EGFR) 및 스크램블 DNA를 적용한 복합체(EXO+SCR) 각각을 각 A549 세포주웰 (1X105/웰, 6웰 기준)에 처리하였다. 24시간 후, EGFR mRNA(qPCR) 및 단백질(웨스턴 블롯) 발현을 분석하였다.
1) qPCR 방법
1-1) mRNA 추출
Exosome+DNA 복합체를 A549 세포주에 처리 24시간 후, RNA를 추출하기 위해 세포주를 1X PBS로 2회 세척 후 RNeasy Mini kit (Qiagen, Cat. No. 74106)를 사용하였다. RLT buffer를 각 웰당 350μL (0.35 μL beta-mercaptoethanol 포함)를 70% 에탄올 350μL 추가로 넣고 혼합 한 후, RNA추출 column에 넣고 9000rpm에서 15초간 원심 분리 하부 용액을 제거한다. 이후 RW1 buffer 700μL를 column에 넣고 9000rpm에서 15초간 원심 분리 하부 용액을 제거 후 RPE buffer 500μL를 넣고 9000rpm에서 15초간 원심 분리 하부 용액을 제거한다. 다시 RPE buffer 500μL를 넣고 9000rpm에서 2분간 원심 분리하고 하부 용액 제거 후 13000rpm에서 1분간 추가 원심 분리하여 여분의 용액을 제거한다. 마지막으로 EB buffer 30μL을 column에 넣고 1분 상온에 방치 후 13000rpm에서 1분간 원심 분리하여 RNA를 추출한다.
1-2) cDNA 합성
추출된 RNA양을 Nanoquant(TECAN SPARK)으로 측정하여 500ng RNA를 PrimeScriptTM 1st strand cDNA synthesis kit (Takara, Cat. No. 6110A)의 Random 6mers를 이용한 방법으로 cDNA를 합성하였다. RNA 혼합체 5μL (0.5μL Random 6 mers(50μM Stock), 0.5μL dNTP Mixture (10mM Stock), 500 ng RNA, RNase Free DW)를 65℃에서 5분간 반응 시킨다. 이후, 4℃에서 1분간 방치하고 상기 RNA혼합체에 5μL RTase 혼합체 (2μL 5X PrimeScript Buffer, 0.25μL RNase inhibitor (40U/μL), 0.5 μL PrimerScript RTase (200U/μL), RNase Free DW 3.75ul)와 섞은 후 30℃에서 10분, 42℃에서 1시간, 95℃에서 5분 방치하여 cDNA를 합성한다.
1-3) qPCR 조건
합성된 cDNA중 0.5μL와 β-actin과 EGFR Taqman probe 혼합체 를 9.5μL (5μL 2X Taqman Universal Master Mix (Thermofisher Scientific, Cat. No. 4444556), 0.5μL β-actin taqman probe (Thermofisher Scientific, Cat. No. Hs99999903_m1), 0.5μL EGFR Taqman probe (Thermofisher Scientific, Cat. No. Hs01076090_m1), 3.5ul RNase Free DW)를 혼합하여 PCR tube에 10μL 로딩하였다 (각 2개 중복시료). qTOWER3G를 이용하여 50℃에서 2분, 95℃에서 2분 반응 후 60℃에서 30초, 95℃에서 10초 40회 반복 증폭하여 β-actin과 EGFR mRNA 발현 Ct값을 측정하였다.
1-4) β-actin mRNA를 이용한 EGFR mRNA 의 normalization과 2-ΔΔCt 상대정량
Housekeeping gene인 β-actin mRNA를 이용하여 대조군 세포 (Exosome만 처리, Scramble DNA 처리 세포와 및 EGFR DNA처리 세포에서의 EGFR mRNA를 상대적으로 정량하였다. 상대 정량 공식은 2-ΔΔCt 방법이며, 대조군, Scramble 및 EGFR DNA처리 세포주에서의 각 EGFR mRNA의 Ct값을 β-actin mRNA Ct값으로 뺀값 (EGFR Ct- β-actin Ct)하고 이를 ΔCt 라고 하였다. 대조군의 ΔCt에 EGFR DNA처리군의 ΔCt를 뺀값을 ΔΔCt라 하며, 대조군을 1로 보정하여 EGFR DNA 처리군의 발현을 상대 정량 분석하였다.
2) 웨스턴 블롯 방법
엑소좀과 DNA 복합체 세포에 처리 24시간 후, 1X PBS로 세포주를 2회 세척한 후 1X RIPA (50mM Tris HCl, 150mM NaCl, 1.0% (v/v) MP-40, 0.5% (w/V) Sodium Deoxycholate, 1.0mM EDTA, 0.1% (w/v) SDS and 0.01% (w/v) sodium azide, pH7.4) 100μL를 각 웰에 첨가 한 후 Eppendorf tube에 모아 아이스에서 20분간 방치하였다. 이후, 4℃를 유지하여 13000rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 수득하여 BCA 단백질 정량 kit (Thermofisher Scientific, Cat No. 23235)을 이용하여 정량하였다.
10μg 단백질의 단백질을 5X laemmli sample buffer와 혼합 (exosome + 5X laemmli sample buffer = 15μL 볼륨으로 일정하게 맞춤)한 후 100 ℃에서 10분 끓인 후 시료를 10% SDS-PAGE 젤에 로딩하여 1X SDS-PGAE Running buffer (0.025M Tris-HCl (pH8.3), 0.192M Glycine, 0.1% SDS)에서 100V 고정 전압으로 2시간 동안 SDS-PAGE하였다. SDS-PAGE후 젤 카세트에서 젤을 분리하여 PVDF membrane에 올린 후1X Transfer buffer (전기이동 용액)에서 (10X Transfer buffer 100ml (Tris-base 30.3g + Glysine 144g 1L), DW 700ml, Methanol 200ml) 120V고정 전압으로 1시간 동안 전기 이동을 진행하여 젤 상에 모든 단백질을 PVDF에 이동시켰다. PVDF membrane을 1X TBS-T(1X TBS-T Buffer: 100 mL 10X TBS (Tris-Buffered Saline = Tris 200mM, NaCl = 1.5M in 1L DW) + 1mL Tween® 20 Detergent 100% + 899ml DW)에 5% 탈지분유 (w/v) (5% Skim Milk)를 혼합한 용액에서 상온에서 1시간 동안 블롯킹한다. 이후, EGFR (Cell Signaling Technology, Cat. No. 4267)와 GAPDH (Cell Signaling Technology, Cat. No. 5174)항체를 5% 탈지분유 용액에 1:1000 (v/v)희석하여 4℃에서 16시간 반응 시킨다. 반응이 끝난 후 1X TBS-T로 5분간 3회 세척 후 anti-rabbit 항체를 5% 탈지분유 용액에 1:5000 (v/v)희석하여 상온에서 1시간 반응 시킨다. 이후 1X TBS-T로 세척 후 ECL용액 (Merck, Cat. No. S0500)을 반응 시켜 FluorChem E 시스템을 이용하여 단백질 발현 차이를 확인하였다
도 4에서 확인할 수 있듯, EXO+SCR에 의한 EGFR mRNA 및 단백질의 변화는 대조군(EXO: 엑소좀만 처리) 대비 나타나지 않았으나, 실시예 2의 복합체(EXO+EGFR)는 EGFR mRNA의 발현을 50% 감소시켰고, EGFR 단백질의 발현은 40% 감소시켰다. 이는, 분리된 엑소좀 자체 (대조군,엑소좀만 처리군)는 세포내에서의 표적 mRNA 및 단백질 (EGFR) 발현의 영향을 주지 않는것으로 세포의 독성이나 이상 신호를 유도하지 않는 것을 의미한다. 또한, 대조군 대비 scramble DNA + 엑소좀 복합체(EXO+SCR 또는 SCR)처리군의 표적 단백질 및 mRNA의 변화가 나타나지 않는 것은 엑소좀에 결합되어 세포내의 세포질로 분리된 표적 비특이적 DNA가 세포내에서 표적 유전자에 영향을 주지 않는 것을 의미한다. 반면, scramble DNA + 엑소좀 복합체 처리군 대비 EGFR DNA + 엑소좀 복합체 (EXO+EGFR 또는 EGFR)처리군에 의한 EGFR mRNA및 단백질 감소 효과는 엑소좀에 결합되어 있던 EGFR DNA가 세포내의 세포질로 분리되고 EGFR mRNA에 정확히 결합하여 발현율을 억제함과 동시에 단백질 발현이 억제되는 과정의 결과로 EGFR 안티센스 DNA가 결합되어 있던 제 1가닥 DNA에서의 분리가 잘 되고 변형되거나 손상되지 않음으로써 온전히 세포 내에서 작용하였음을 입증하는 결과이다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 엑소좀 및 이중 가닥 핵산을 포함하고,
    상기 이중 가닥 핵산은 5' 말단에 인산화기가 결합된 제1가닥과 이에 상보적인 제2가닥(antisense strand)을 포함하며, 상기 인산화기를 통해 엑소좀의 외부 표면에 존재하는 1차 아민과의 결합에 의해 엑소좀의 표면에 연결된,
    핵산의 전달을 위한 엑소좀 복합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산은 엑소좀의 외부 표면에 결합된 것인 복합체.
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 제1가닥은 10 내지 30개의 염기로 이루어진 것인 복합체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 제2가닥은 10 내지 30개의 염기로 이루어진 것인 복합체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 제1가닥 또는 제2가닥은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모포리노(morpholino), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA), 브릿지 핵산(BNA), N3′-P5′포스포르아미데이트(NP) 올리고머, 좁은 홈 결합물질(minor groove binder)이 연결된 올리고뉴클레오티드(MGB-linked oligonulcletide), 포스포로티오에이트(PS) 올리고머, C1-C4 알킬포스포네이트 올리고머, 포스포르아미데이트, β-포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드 및 α-포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나인 복합체.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀은 동물 세포, 식물 세포 및 미생물로 이루어진 군에서 선택 하나 이상으로부터 유래한 것인 복합체.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀은 줄기세포, 수지상 세포 및 혈액 세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로부터 유래한 것인 복합체.
  9. 생물학적 시료로부터 엑소좀을 수득하는 단계;
    이미다졸(imidazole), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 이중 가닥 핵산을 혼합하여 반응시키는 단계; 및
    상기 수득한 엑소좀과 상기 반응물을 혼합하는 단계를 포함하고,
    상기 이중 가닥 핵산은 5' 말단에 인산화(phosphorylation)기가 결합된 제1가닥과 이에 상보적인 제2가닥(antisense strand)을 포함하는 것인,
    핵산의 전달을 위한 엑소좀 복합체의 제조방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 제1가닥은 10 내지 30개의 염기로 이루어진 것인 제조방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 제2가닥은 10 내지 30개의 염기로 이루어진 것인 제조방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 제1가닥 또는 제2가닥은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모포리노(morpholino), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA), 브릿지 핵산(BNA), N3′-P5′포스포르아미데이트(NP) 올리고머, 좁은 홈 결합물질(minor groove binder)이 연결된 올리고뉴클레오티드(MGB-linked oligonulcletide), 포스포로티오에이트(PS) 올리고머, C1-C4 알킬포스포네이트 올리고머, 포스포르아미데이트, β-포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드 및 α-포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 것인 제조방법.
  13. 청구항 9에 있어서, 상기 엑소좀을 수득하는 단계는 동물 세포, 식물 세포 및 미생물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 배양액으로부터 엑소좀을 수득하는 단계인 제조방법.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 엑소좀을 수득하는 단계는 줄기세포, 수지상 세포 및 혈액 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 배양액으로부터 엑소좀을 수득하는 단계인 제조방법.
  15. 청구항 1, 2, 4 내지 8 중 어느 한 항의 복합체를 목적하는 세포에 접촉시켜 상기 제2가닥(antisense strand)을 세포 내 전달하는 단계를 포함하는,
    엑소좀 복합체를 이용한 핵산의 전달방법.
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