JP2016539132A - ローソニア・イントラセルラリス（ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）及びブタサーコウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）２に対するワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、死滅全細胞ローソニア・イントラセルラリス細菌及びブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）ＯＲＦ２タンパク質を組み合わせて含み、皮内投与による、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶ２による感染症に対してブタを防御する使用のためのワクチンに関する。本発明はさらに、ローソニア・イントラセルラリス細菌及びＰＣＶ２による感染症に対してブタを防御する方法に関する。【選択図】図１

Description

本発明は全体にブタの健康の分野に関する。

ブタは、多数の病原性微生物にかかりやすい。感染症の制御は、家畜小屋及び食餌の管理、抗ウイルス薬及び抗生物質などの医薬品による処置又はワクチンを使用する予防処置により実施される。

発明の目的
ブタの健康管理のための簡便で安全及び有効な手段に対する継続的な必要性が存在する。

本発明の目的を達成するために、さまざまな疾患を引き起こす微生物による感染症に対してブタを組み合わせにより防御する新しいワクチンが考案され、このワクチンは死滅全細胞ローソニア・イントラセルラリス細菌及びブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）ＯＲＦ２タンパク質を組み合わせて含む。ＰＣＶ２及びローソニア・イントラセルラリス細菌は、ブタの健康に対するこれらの負の影響のため、実質的な経済的損失の原因となる。ＰＣＶ２及び／又はローソニア感染症の処置のための薬物及びワクチンは公知であり、市販されているが、安全で簡便な方法で優れた防御を提供する新規な方法が継続的に必要とされている。ＰＣＶ２及びローソニア感染症に対する混合ワクチンは記載されてきているが、市販はされていない。実際に、検討又は提唱される抗原のすべての組み合わせが、特に、いずれの投与方法でもすべて、安全かつ有効な混合ワクチンをもたらし得るとは限らない。事実、特に投与計画が変更された場合、混合ワクチンの安全性及び有効性に関して一定レベルの不確実性が常に存在する。

欧州医薬品審査庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ＥＭＥＡ）の動物用医薬品委員会は、その公報「ガイダンスノート：動物用混合医薬品の必要条件」（ＥＭＥＡ、２０００、ＣＶＭＰ／ＩＷＰ／５２／９７−ＦＩＮＡＬ）（２／６頁）において「混合ワクチンの開発は容易ではない。各組み合わせは、品質、安全性及び有効性に関して個別に開発及び研究されるべきである」と述べた。委員会はさらに、優れた混合ワクチンの探求は通常、混合ワクチン中の個別の成分、例えば、保存料、賦形剤及び安定剤、不活性材及びアジュバントの間の適合性を含むことを示している。３頁の上段の段落において、「混合ワクチンにおいて、複数成分の存在は多くの場合相互作用を引き起こし、個別の成分に対する応答を、（１又は複数の）特定の成分を単独で投与した場合と比較して減退させるか、又は増強させるかのいずれかにつながる。（中略）このような相互作用は多くの場合免疫学的に自然なことであるが、免疫系に直接作用することは少ない他の因子によって引き起こされることもある」及びさらに「アジュバントが、混合ワクチンに対する免疫応答を増大させるために使用される場合、特殊な問題が起こり得る」と述べられている。

米国保険福祉省（Ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、生物製剤評価研究センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）は、１９９７年４月発行の「予防可能な疾患用混合ワクチンの評価のための産業界のためのガイダンス：生産、試験及び臨床研究」（３頁、「成分の適合性」）において、「経験により、単価ワクチンの組み合わせは、所望より安全性が低い、もしくは有効性が低い新たな組み合わせをもたらし得ることが示されている。不活化ワクチンの成分は、活性成分１つ又はそれを超える成分に対して時として悪い方に作用する」と述べており、特に不活化ワクチンは生ワクチンの有効性に負の影響を与え得る、例えば、生百日咳ワクチンと不活化ポリオウイルスワクチンとを組み合わせた場合、百日咳の力価が低下したワクチンがもたらされることを示している。ワクチン中の任意の追加の成分は、個別のワクチンと比較した場合、最終製品の安全性及び力価を複雑にすることがある。

世界保健機構（Ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＨＯ）は、「ワクチン安全性の基礎」と呼ばれるｅラーニングコースを公開し、モジュール２において混合ワクチンについて検討している。このモジュールは、「認可されている混合ワクチンは広範囲の試験を受け、その後、この医薬品が安全、有効であり、合格品質であることを国内当局により承認される」で始まる。さらに、「したがって、すべての組み合わせにおいて、製造業者は、各抗原成分の力価、組み合わせた場合のワクチン成分の免疫誘導に対する有効性、毒性への復帰可能性のリスク及び他のワクチン成分との反応を評価しなければならない。」と述べている。

このｅラーニングコースの５３頁において、ＷＨＯは、「投与経路は、ワクチン（又は薬物）を身体と接触させる通路である。

これは免疫化を成功させる重要な因子である。物質は、進入部位から、その作用が起こることが望ましい体内の部分へと輸送される必要がある。しかし、この目的のために身体の輸送機序を使用することは簡単ではない。」と報告している。

カリフォルニア州保健サービス局の免疫化部門は、正確な免疫化に関するガイドライン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｐｕｂｓ／ｐｉｎｋｂｏｏｋ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ／ｄ／ｖａｃｃ＿ａｄｍｉｎ．ｐｄｆ）を公開している。投与部位に関しては、７頁において第１段落全体で、「各ワクチンに関する推奨される経路及び部位は、臨床試験、実践経験及び理論的考察に基づく。この情報は、各ワクチンに対する製造業者の製品情報に含まれる。ワクチン投与に使用される経路は５つある。推奨される経路からの逸脱は、ワクチンの有効性を減退させるか、又は局所有害反応を増大させ得る。」と述べられている。１４頁において、唯一のＵＳ認可皮内ワクチンが扱われている：「Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌは、皮内経路により投与される、唯一米国で認可されたワクチンである。Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌは、１８歳から６４歳のヒトだけに使用が承認されている。このＦｌｕｚｏｎｅ製剤は、不活化インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）の筋肉内製剤と同じではない。他のＴＩＶ製剤は、決して皮内経路により投与してはならない。」
全体として、特定の抗原と投与部位との任意の組み合わせは単純ではなく、安全性及び有効性を決定する経験が要求される。

本発明は、ワクチンの次に、前記ワクチンを皮内投与するステップを含む、ローソニア・イントラセルラリス細菌及びＰＣＶ２による感染からブタを防御する方法及びこのようなワクチンを構成する方法にさらに関する。

定義
ワクチンは、（ワクチン接種後）病原性微生物による感染症から防御する構成体である。

病原性微生物による感染症からの防御は、微生物それ自体による感染症の予防もしくは低減、又は通常微生物それ自体に干渉することによる、例えば抗体による、ワクチン接種された宿主において感染症からもたらされる（無症候性）臨床疾患の予防もしくは低減を表す。

死滅全細胞細菌を抗原として含む組成物は、生きた全細胞、細菌の死滅に由来する抗原構成体を含む。これには、死滅過程の間に細菌細胞が少なくとも部分的に破裂されること、又は死滅全細胞の抽出物もしくはホモジネートが「死滅全細胞細菌を含むワクチン」中に抗原として実際に提供されることは、本発明の概念において除外されない。死滅全細胞ローソニア・イントラセルラリス細菌は、例えば、国際公開第２００９／１４４０８８号及び国際公開第９７／２００５０号により知られている。

ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質は、ブタサーコウイルス２型のカプシドタンパク質である。ＰＣＶ２のＯＲＦ２は約２８ｋＤａのタンパク質をコードする。すべてのＰＣＶ−２分離株のＯＲＦ２は、９１−１００％ヌクレオチド配列同一性及び９０−１００％の推定アミノ酸配列同一性を共有する（Ｆｅｎａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，３８（７），２４９４−２５０３，２０００）。ＯＲＦ２タンパク質は、国際公開第２００７／０２８８２３号、国際公開第２００７／０９４８９３号又は国際公開第２００８／０７６９１５号に記載のように、例えばバキュロウイルス発現系において、例えば組換え的に発現させることができる。

ワクチンの皮内投与は、十分量のワクチンが真皮に沈着されることを意味し、これらと同じワクチンの同じ量の筋肉内投与とは有意に異なる免疫応答をもたらす（特に、実施例３に概説されるように設定された検定においてウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）順位和検定を使用する場合、ｐ値は０．１０未満、好ましくは０．０５未満のはずである）。いくつかのデバイス、例えばＩＤＡＬ（登録商標）ワクチン接種器（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）、Ｐｕｌｓｅ ５０ ＭｉｃｒｏＤｏｓｅ（Ｐｕｌｓｅ Ｎｅｅｄｌｅ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はＶａｃｃｉｎｅ，２０１２ Ｊａｎ １１；３０（３）：５２３−３８（特に５２５頁の表１、「液体又は固体製剤の投与のためのさまざまなデバイスの概要」を参照されたい）に記載の他のデバイスが、皮内ワクチン接種のために市販されている。

防御における使用のためのワクチンの単回ショット投与は、防御免疫を得るために、ワクチン接種が２回目の投与によりブーストされる必要が無いことを意味している。ツーショット計画において、初回（プライム）ワクチン接種は、初回投与から通常６週間以内、一般的には初回投与から３又は２週間以内にブーストされ、２回目の（ブースト）投与後にだけ、防御免疫が得られたことが認識される。

医薬として許容される担体は生体適合性媒体、すなわち、投与後に対象動物において有意な有害反応を誘導せず、ワクチンの投与後に宿主動物の免疫系に対する抗原を提示できる媒体である。このような担体は、水及び／又は任意の他の生体適合性溶媒を含有する液体であり得るが、フリーズドライされたワクチンを得るために一般的に使用されるような固体（糖及び／又はタンパク質に基づく）であってもよい。

ＤＯＩ研究における血清学を示す図である。 血清、排泄物及び臓器中のウイルス負荷を示す図である。 平均体温を示す図である。 平均全ＰＣＶ２ Ｉｇ Ａｂの結果を示す図である。 平均ＰＣＶ２ ＩｇＭ Ａｂの結果を示す図である。 持続期間研究における抗体価を示す図である。 臓器中のウイルス負荷を示す図である。 臓器中のウイルス負荷を示す図である。

一実施形態において、ワクチンは単回ショット投与後のブタの防御用である。ブタが両方の病原体に対して防御されることが、ワクチンの単回ショット投与後であっても有利に見出された。この実施形態は、例えば、初回ワクチン接種後６から１２ヶ月に追跡ワクチン接種を行い、防御のレベルを更新することを除外するものではない。この追跡ワクチン接種は、プライム−ブーストワクチン接種スキームのブーストワクチン接種とは異なり、防御は、ブーストワクチン接種後得られるとだけ考えられる。プライム−ブーストスキームにおいて、２回のワクチン接種は通常２−３週間離れている。

一実施形態において、ワクチンはアジュバントを含む。通常は不活化抗原の免疫応答を改良するために使用されるアジュバントが、このワクチンが（その有害反応が公知の部位である）真皮に投与された場合、ローソニア又はＰＣＶ２抗原に負に干渉しないことも、他の抗原に対する反応性を過剰に増大させないことも見出された。ＷＨＯがそのワクチン安全性の基礎コース（上記を参照されたい）のコースの１頁、最後の２行（「混合ワクチン」の項）においてこのタイプの干渉及び反応性に関して明確に警告しているにもかかわらずである。さらなる実施形態において、アジュバントは非生分解性油、例えば、ＥｘｘｏｎＭｏｂｉｌ（登録商標）（Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）５２）から得ることができる飽和炭化水素油などを含む。

一実施形態において、ワクチンは不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍｈｙｏ）抗原、好ましくはＭｈｙｏバクテリンをさらに含む。これは、３種の主要なブタ病原体に対する、簡便で安全かつ有効なワクチンをもたらすことが証明されている。

さらに別の実施形態において、ワクチンは用量当たり１×１０^９の死滅ローソニア・イントラセルラリス細菌を含み、すなわち、不活化ローソニア・イントラセルラリス抗原は、このワクチンが１×１０^９ローソニア・イントラセルラリス細菌／用量に相当するローソニア・イントラセルラリス抗原を含むように負荷される。より高い抗原負荷をこの実施形態において除外するものではなく、より高い抗原負荷は防御レベル及び免疫の持続期間に正の影響を与え得る。

一実施形態において、ローソニア細菌は、この細菌を組成物、例えば、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２含有水性組成物又はエマルジョンに添加してワクチンを構成する前にフリーズドライされる。

同様に、皮内投与用ワクチンを構成する方法において、該方法は死滅全細胞ローソニア・イントラセルラリス細菌とブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）ＯＲＦ２タンパク質とを医薬として許容される担体と一緒に組み合わせ、死滅全細胞ローソニア・イントラセルラリス細菌はフリーズドライ形態であってよく、担体及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含む液体製剤に通常投与前１時間以内に添加されるステップを含む。

本発明を、以下の実施例及び図面を使用してさらに説明するものである。

［実施例］
実施例１は、単回用量の皮内ワクチン接種が、ブタサーコウイルス２型による感染症に対する２３週の免疫を提供できることを示す実験である。

実施例２は、ＰＣＶ２ ＩＤの１回のワクチン接種法が、ワクチン接種が安全であり、防御力価をもたらすことを示す別の実験である。

実施例３は、皮内と筋肉内とのワクチン接種の間の直接比較である。

実施例４は、皮内ワクチン接種の組み合わせによる実験の説明である。

実施例５は、混合ワクチン、さまざまな抗原投与量及びさまざまなアジュバントによる実験の説明である。

実施例６は、混合ワクチンによるさらなる実験の説明である。

［実施例１］
実験計画
ＰＣＶ２に対する抗体を有する１０匹の雌ブタの子孫をこの研究に使用した。子豚を、同腹仔にわたって１５匹の動物の２群に分けた。３週齢の時点で、１群の子豚に、組換え的に発現させたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を含む０．２ｍｌのワクチン（タンパク質の供給に関しては国際公開第２００７／０２８８２３号を参照されたい）を、市販の皮内ワクチン接種デバイスＩＤＡＬ（登録商標）（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）を使用して、首の右側に皮内ワクチン接種し、一方、２群はワクチン接種せずにおき、対照群として機能させた。すべての研究動物を、臨床兆候に関して毎日観察した。すべての動物の血液試料を、ワクチン接種時、ワクチン接種の９、１７、１９及び２１週後に採取した。ワクチン接種の２３週後、各動物を、鼻腔内に塗布された野生型ＰＣＶ２チャレンジウイルス株を使用してチャレンジ感染させた。

血清試料及びフィーカルスワブ（ｆｅｃａｌ ｓｗａｂｓ）をチャレンジの１日前及びチャレンジの１、２及び３週間後に採取し、定量的ＰＣＲによりＰＣＶ２ウイルスの核酸に関して検査した。さらに、血清試料はＰＣＶ２抗体に関しても検査した。

チャレンジ３週後、すべての動物を剖検し、鼠径リンパ節、扁桃腺及び肺を、ＰＣＶ２ウイルスの抗原及び核酸の決定のためにサンプリングした。

使用したワクチンは、５ｖ／ｖ％の鉱物油Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）５２（Ｅｘｘｏｎ）、０．３０ｗ／ｖ％のビタミンＥ酢酸塩及び０．３２％のポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、注射用水ならびに２０００ＡＵのＰＣＶ２タンパク質／０．２ｍｌを含む水中油エマルジョンとして与えた。ＡＵ単位は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＡｌｐｈａＬＩＳＡ試験に基づき計算した。この試験のために、ポリスチレンマイクロタイタ―プレートのウェルを、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原を含有する試験試料の段階希釈液ならびに標準試料の段階希釈液で満たした。これらの希釈液を、（ＰＣＶ２ ＯＲＦ２に対するモノクローナル抗体でコーティングされた）アクセプタービーズ及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２を対象とするビオチン標識二次抗体と一緒にインキュベートした。その後、結合された二次抗体の量をストレプトアビジンコーティングドナービーズと一緒にインキュベートして、化学発光を検出することによって定量化した。標準試料は、５０００ＡＵ／（２ｍｌ）用量を含有するように設定された市販のワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶである。

実験手順
毎日の観察
すべてのブタを、疾患の臨床兆候に関して毎日観察した。観察は、食欲喪失、寝ころび傾向、気力低下又は眠気、震え、毛の逆立ち、浮腫（特に眼の周り）、嘔吐、下痢及び呼吸困難を含む全身反応から成った。

血液のサンプリング
血液試料をワクチン接種の前、ワクチン接種の９、１７、１９及び２１週後に収集した。血液試料を、チャレンジの１日前及びチャレンジの７、１３及び１９日後に収集した。これをすべてのブタから個別に行った。

フィーカルスワブの実施
フィーカルスワブを、１乾燥スワブ／動物を使用して、チャレンジ１日前、チャレンジ後７、１３及び１８日に採取した。スワブは標準手順を使用して、抗生物質を含有する媒体中に採取した。媒体中のスワブにより採取された検体の懸濁液を遠心分離により清澄化し、アリコートを取り、≦−１８℃においてさらなる使用まで保存した。

血清学
すべての血清試料を、ＰＣＶ２に対する抗体に関して、標準ＥＬＩＳＡ手順を使用して検査した。簡潔には、段階的に希釈された血清試料を、バキュロウイルス発現ＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原でコーティングされたマイクロタイタ―プレートにおいてインキュベートした。血清の除去後、すべてのウェルを、固定量のビオチン標識ＰＣＶ２特異的モノクローナル抗体と一緒にインキュベートした。その後、結合されたＭｏＡｂをペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンと一緒にインキュベートし、その後発色により検出した。力価はｌｏｇ２力価として表した。

検死
実験終了時に、すべての動物を気絶させた後出血させることによって安楽死させた。剖検の間に、動物を切開し、内臓をその場で視診して、下記の臓器：肺、鼠径及び腸間膜のリンパ節、扁桃腺、胸腺、脾臓、肝臓及び腎臓に特に注意を注いだ。この後、扁桃腺、肺（附属葉）及び鼠径リンパ節由来の試料を急速凍結及びその後の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による分析用に摘出した。

定量的ＰＣＲ
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、すべての血清及びフィーカルスワブならびに扁桃腺、肺及び鼠径リンパ節の１０％組織ホモジネートに対して実施した。簡潔には、ＤＮＡを、市販のキットを使用して試料から抽出した。各試料中のＰＣＶ２ゲノムＤＮＡを、ＰＣＶ２に特異的なプライマー及び二重標識加水分解プローブを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により定量した。特異的蛍光が閾値を超えたサイクル数を、既知の量のＰＣＶ２含有プラスミドを含有する一連の試料のサイクル数に対応させた。結果を、ｌｏｇ１０コピー／μｌ反応混合物（ｌｏｇ１０ｃ／μｌ）として表した。

結果
実験開始時に、すべての動物が健康であることを見出した。対照群において、ワクチン接種後（ｗｐｖ）６週において１匹の動物の死亡が見出された。２匹のワクチン接種された動物がわずかな局所問題、すなわちわずかな運動機能障害（片足の硬直）を有した。あまり問題ではないと考えて、これらの動物を処置しなかった。ワクチン接種された動物のうち、疾患の兆候又は全身反応、例えば異常高熱、食餌摂取の低下、アナフィラキシーショック又は嘔吐などを示した動物は全くいなかった。

血清学の結果は図１に示す。ワクチン接種された動物が、約４．０ｌｏｇ２で安定化されたと思われる抗ＰＣＶ２力価を維持し、一方、対照動物において力価は検出限界未満に低下したことが明らかである。チャレンジ後（２３ｗｐｖ、２６週齢）、力価はワクチン接種群においてわずかに上昇する。対照群において、力価は同じレベルに上昇している。

ｑＰＣＲの結果は、図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃに示す（「ｄｐｃ」＝チャレンジ後の日数）。ワクチン接種動物は、ワクチン接種の２３週後に血清、リンパ器官及び肺においてＰＣＶ２核酸が有意に減少することにより示されるように、ＰＣＶ２によるチャレンジ感染から防御されたと思われる。さらに、少なくとも２３週においてＰＣＶ２に対するフィーカルスワブでウイルス負荷が有意に減少することにより実証されるように、ワクチンはウイルス排出を減少させることができた。これは、中程度のレベルと考えられるおよそ７ｌｏｇ２の、ＰＣＶ２に対する循環抗体価を有する範囲の動物において実施された。

［実施例２］
実験計画
一腹子の群由来の合計４６匹の子豚を４種の処置群：各１３匹の子豚の２つのワクチン接種群及び１０匹の子豚の２つの対照群に分配した。１群は、子豚がおよそ２週齢の時に上記の実施例１に示したようにワクチン接種し、２群は、子豚がおよそ３週齢の時にワクチン接種した。子豚に、ワクチンの単回用量を首の右側に皮内ワクチン接種した。３群（対照群、２週齢の動物）及び４群（対照群、３週齢の動物）は処置しなかった。血清試料を、ワクチン接種当日、ワクチン接種の２、３及び４週後に、すべての動物から採取した。体温を、ワクチン接種の１日前、ワクチン接種当日及びワクチン接種の４時間後及び１、２、３、４日後に測定した。

実験手順
ワクチン接種前に、子豚の全体的健康を観察した。体温を、Ｔ＝−１日、Ｔ＝０日、ワクチン接種後０及び４時間ならびにワクチン接種後Ｔ＝１、２、３、４日目にすべての子豚で測定した。

血液試料を、ワクチン接種当日ならびにワクチン接種の２、３及び４週後に収集した。これは、標準手順に従って個別にすべてのブタから実施した。血液試料は、抗凝血剤を添加せずに収集した。血清を、血餅試料から調製し、アリコートを取り、分析まで−２０℃において保存した。

全ＰＣＶ２ Ｉｇ抗体及びＰＣＶ２ ＩｇＭ抗体のＥＬＩＳＡを、ＩｇＭ抗体のＥＬＩＳＡの場合は、プレートをＩｇＭ抗体でコーティングして、次いでＰＣＶ２ ＯＲＦ２抗原と一緒にインキュベートし、その後、固定量のビオチン標識ＰＣＶ２特異的モノクローナル抗体と一緒にインキュベートしたことを除き、上記の実施例１（「血清学」）に示すように検査した。

結果
実験開始時に、すべての動物が健康であることを見出した。体温の平均結果を図３に示す。体温の平均上昇に、２週齢と３週齢の動物の間のいずれにおいても差は見られなかった（最大の平均上昇は、０．０−０．３℃の間である）。さらに、１群及び２群における個別の動物の体温の最大上昇は、２つの対照群における個別の動物の最大体温上昇と同等である。

全ＰＣＶ２ Ｉｇ抗体のＥＬＩＳＡ
全ＰＣＶ２ Ｉｇ抗体の応答の平均結果を図４に要約する。

ワクチン接種時に、２週齢でワクチン接種された子豚は、３週齢でワクチン接種された子豚より高い（母性由来の可能性が高い）ＰＣＶ２抗体価を有した。 ワクチン接種動物は、対照動物より著しく高い力価上昇を示した。

ＰＣＶ２ ＩｇＭ抗体のＥＬＩＳＡ
ＰＣＶ２ ＩｇＭ抗体の応答の平均結果を図５に要約する。ワクチン接種時に、すべての動物はＩｇＭ抗体陰性であった。ワクチン接種後、３週齢の動物は、２週齢動物より著しく速く、高いＩｇＭ抗体応答を有した。対照動物は、本研究の間中陰性のままであった。

これらの結果に基づき、２及び３週齢の子豚の、単回用量皮内ワクチン接種は、許容される安全性プロファイル及び優れた血清学的応答をもたらしたと結論付けることができる。循環抗体価の開始レベルがさらにより高い、すなわち中程度範囲の上限であると考えられる９．４ｌｏｇ２まであった別の実験（データ未掲載）によっても同等の結果が得られた。

［実施例３］
実験計画
合計３０匹の子豚を、各３０匹の子豚の３つの処置群に分配した。１群の子豚は、上記の実施例１に示すように、単回用量のワクチンを皮内ワクチン接種した。２群の子豚は、単回用量の同じワクチンを、同じ量で同じ場所（首）に筋肉内ワクチン接種し、３群の子豚は未処置のままにした。血清試料をワクチン接種当日、ワクチン接種の３及び５週後にすべての動物から収集した。

実験手順
ワクチン接種前に、子豚の全体的健康を標準的手順に従って観察した。血液のサンプリングならびに全抗ＰＣＶ２抗体及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２特異的ＩｇＭ抗体の血清学を、上記の実施例２に示す手順に従って実施した。

結果
研究開始時に、すべての動物が健康であることを見出した。血清学の結果を表１に要約する（力価はｌｏｇ２として表した）。ワクチン接種時において、平均抗体価は比較的高かった。ワクチン接種後、ＰＣＶ２ Ａｂ力価の上昇を示した動物は全くいなかった。ワクチン接種後３及び５週において、ＩＤ群の平均ＰＣＶ２抗体価は、ＩＭ群のそれより高いことが観察できた。

抗ＰＣＶ２ ＩｇＭの血清学の結果を、表２に要約する（力価はｌｏｇ２として表した）。ワクチン接種後３週において、ＩＤ群の抗ＰＣＶ２ ＩｇＭ抗体価は、ＩＭ群及び対照群のそれより著しく高かった。

ウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）順位和検定を適用した場合、ＩＤ群対ＩＭ群のＩｇＭ応答の差に関するｐ値は０．０００１であった。

［実施例４］
ＰＣＶ２に対する抗体を有する数匹の雌ブタの子孫をこの研究に使用した。子豚を、同腹仔にわたって１８匹の動物の３群に分けた。３週齢において、１群及び２群の子豚に、上記の実施例１に示すように皮内ワクチン接種した。２群の動物に、市販の不活化ＭｈｙｏワクチンであるＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ ＨｙｏＩＤ Ｏｎｃｅ（Ｍｈｙｏバクテリンを含有）を製造業者の取扱説明書に従って、首の反対側に同時に皮内ワクチン接種した。３群（対照群）の動物は未処置のままにした。すべての研究動物を、毎日観察した。血清試料を、ワクチン接種時及び動物を屠殺するまで（２３−２５週齢）隔週で採取した。これらの試料を、ＰＣＶ２抗体に関して検査した。

実験手順は、上記の実施例１に示した通りであった。得られた血清学を図６に示す。この図から、抗ＰＣＶ２力価が上記の実施例１に記載の実験により確立された４ｌｏｇ２のレベルを十分上回ったままであり、防御的であることを見出せることが明らかになっている。ワクチン間の負の干渉の兆候は存在しない。

この実験を反復し、悪性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する防御をチェックした。この反復実験のために６０匹の子豚を使用した。４０匹の動物にＭｈｙｏワクチンを１８−２４日齢においてワクチン接種し、これらの動物のうちの２０匹にさらにＰＣＶワクチンをワクチン接種した。２０匹の動物はワクチン接種せずに、チャレンジ対照として機能させた。ワクチン接種の３週後、すべての動物に悪性Ｍ．ハイオニューモニエ株を感染させ、チャレンジ後３週にすべての動物を、肺病変に関して検死した。肺病変スコア（ＬＬＳ）を各群の間で比較した。

Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ Ｈｙｏ ＩＤ Ｏｎｃｅをワクチン接種した群に関するＬＬＳは、対照群のそれらより有意に低かった（ｐ＜０．０５、ダンの検定（Ｄｕｎｎ’ｓ ｔｅｓｔ））。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ Ｈｙｏ ＩＤ Ｏｎｃｅ単独をワクチン接種した群と、ＰＣＶワクチンと併せてワクチン接種した群との間に有意差は無かった。したがって、組み合わせワクチン接種はＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ Ｈｙｏ ＩＤ Ｏｎｃｅにより得られた免疫に負の影響を与えなかったと結論付けることができる。

［実施例５］
ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質（２５０から６０００ＡＵ／０．２ｍｌ）、Ｍ ｈｙｏ（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍｈｙｏ ＩＤ Ｏｎｃｅと同レベル）及びローソニア抗原（ＷＯ２００８９／１２７６８４、死滅全細胞抗原に関する実施例２を参照されたい：およそ１×１０^９細胞／０．２ｍｌのレベル）を含有する、合計で８種のワクチンを製剤化した。これらのワクチンは異なるアジュバントを含有した。いくつかのワクチンは既存の生分解性油含有アジュバントのＤｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；「ＤＦ」と呼ばれる）を使用した。他のワクチンは、上記の実施例１に記載のアジュバント製剤（「Ｘ−ｓｏｌｖｅ１２」と呼ばれる）又はＸ−ｓｏｌｖｅ１２と同じ構成を有するが、半分の濃度（「Ｘ−ｓｏｌｖｅ６」）又はＸ−ｓｏｌｖｅ１２の２．５倍濃度（「Ｘ−ｓｏｌｖｅ３０」と呼ばれる）で製剤化されたアジュバントを使用した。得られたワクチンは以下の通りであった（Ｍｈｙｏ及びローソニア抗原は列挙していない；含有量／用量）：
１群：２０００ＡＵ ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ３０
２群：２５０ＡＵ ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ１２
３群：５００ＡＵ ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ１２
４群：２０００ＡＵ ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ１２
５群：２０００ＡＵ ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ６
６群：５００ＡＵ ＰＣＶ２／ＤＦ
７群：２０００ＡＵ ＰＣＶ２／ＤＦ
８群：６０００ＡＵ ＰＣＶ２／ＤＦ
８匹の雌ブタの子孫を本研究に使用した。子豚は、中程度（中レベル）の、ＰＣＶ２に対する母性由来移行抗体（ＭＤＡ）を有した（平均：６．７ｌｏｇ２）。３／４週齢において、１群から８群の子豚に、ＩＤＡＬ（登録商標）ワクチン接種器を使用して単回用量で皮内ワクチン接種した。９群の子豚はワクチン接種しないままであった。ワクチン接種後７週において、すべての動物をチャレンジ施設に移動させた。１日後、すべての動物を、ＰＣＶ２のチャレンジ株によりチャレンジ感染させた。すべての子豚を、臨床兆候に関して毎日観察した。

局所反応を触診により、ワクチン接種当日に開始して、ワクチン接種後２日おきにワクチン接種後２０日までモニターした。

血液試料を、ワクチン接種当日及び３週間後、チャレンジの前日、１及び２週間後ならびに剖検時にすべての動物から収集した。各動物から採取した血清試料を、ＰＣＶ２及びＭ ｈｙｏに対する抗体に関して試験した。剖検の間、腸間膜及び鼠径のリンパ節、扁桃腺及び肺を、ＰＣＶ２核酸の定量化のためにサンプリングした。

実験手順は、上記の実施例２の記載と同じである。ワクチン接種時のＰＣＶ２ ＩｇＭ抗体応答は、すべての群において検出レベル未満であった（２．０ｌｏｇ２未満）。ワクチン接種後３週において、ＰＶＣ抗体価は２０００ＡＵ ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ３０ワクチンに関して最も高く、２０ｌｏｇ２であった。２５０−、５００−及び２０００のＡＵ ＰＣＶ２抗原／用量を含むＸ−ｓｏｌｖｅ１２群は、それぞれ、９、１６及び１９ｌｏｇ２の力価を有した。２０００ＡＵ／Ｘ−ｓｏｌｖｅ６ワクチンを与えられた群は、１５ｌｏｇ２の力価を有した。５００−、２０００−及び６０００ＡＵのＰＣＶ２抗原／用量を含むＤＦ群は、それぞれ、８、１４及び１６ｌｏｇ２の力価を有した。対照は、検出レベル未満の力価を有した。

この研究において、全身及び局所反応を評価した。ワクチン接種に起因する全身反応は全く観察されなかった。局所効果に関しては、（それぞれＸ−ｓｏｌｖｅ１２の５００及び２０００ＡＵ又はＤＦ６０００ＡＵ ＰＣＶ２／用量のワクチンを与えられた）ワクチン接種された動物は３匹以下がわずかな運動性問題を有したが、これは対照群と同じ数である。したがって、これらの反応はワクチン接種とは無関係であるとみなすことが合理的と思われる。他の局所反応に関しては、Ｘ−ｓｏｌｖｅをワクチン接種された多数の動物（約６０−１００％の間）が局所反応を示し、腫れの平均サイズは３ｃｍ未満、すなわち１−２ｃｍの間であり、腫れは２−６日以内に消失した。ＤＦを使用すると、局所の腫れを示した動物はわずか約３０％であり、平均サイズは０．５ｃｍ未満であり、腫れは１日以内に消失した。

図７及び８において、臓器の（平均）ウイルス負荷をさまざまなワクチンに関して表す。すべてのワクチンは、関連臓器におけるウイルス負荷を実質的に低下させ得る（これらの場合少なくとも３ｌｏｇ）と思われる。

この研究において、使用したすべてのアジュバントは安全であり、抗ＰＣＶ２ ＩｇＭ応答を誘導し、病原性ブタサーコウイルス２型による感染症に対して動物を処置できたと思われる。異なる抗原の間に負の干渉は全く見出されなかった。ローソニアの血清学（未掲載）は、良好な抗体応答を示し、これに基づき、ローソニア・イントラセルラリスによる感染症に対する防御が得られたと考えられる。このことを確認するために、病原性ローソニア・イントラセルラリスによるチャレンジを含む次の実験を実施した（実施例６を参照されたい）。

［実施例６］
動物が、ローソニア・イントラセルラリスによるチャレンジに対して防御されることを確認するために、実施例５に記載の、異なる量のアジュバントＸ−ｓｏｌｖｅを含むワクチン製剤を、さまざまなチャレンジ実験のために新たに製剤化した。これらのベースは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含有するＰＣＶ２ワクチンであった。第１のワクチンは、実施例５に示したようにＸ−ｓｏｌｖｅ３０で製剤化した。第２のワクチンは、Ｘ−ｓｏｌｖｅ１２で製剤化し、ローソニア抗原は、フリーズドライ死滅ローソニア細胞（実施例５において使用したものと同じ抗原）を投与前３０分以内に即時使用ＰＣＶ２ワクチンに添加することによって導入した。ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の最終濃度は、両方のワクチンにおいて２０００ＡＵ／０．２ｍｌであった。ローソニア抗原の濃度は、実施例５に記載の実験に使用された濃度と同じであった（約１×１０^９細胞／０．２ｍｌ）。得られたワクチンは下記の通りであった：
１：２０００ＡＵ ＰＣＶ２／ローソニア／Ｘ−ｓｏｌｖｅ３０
２：２０００ＡＵ ＰＣＶ２／ローソニア／Ｘ−ｓｏｌｖｅ１２
第１の研究は、ワクチン番号１（Ｘ−ｓｏｌｖｅ３０）を使用して実施した。３９匹のブタを使用し、それぞれ１９及び２０匹のブタの２群に分配した。両方の群に、実施例１に示すように首への皮内ワクチン接種により、０．２ｍｌのワクチンを３週齢においてワクチン接種した。１群に、上記のようにワクチン番号１をワクチン接種し、２群にローソニア抗原を含まない同じワクチンをワクチン接種した。この群は、ローソニアチャレンジの対照として機能した。すべての動物に、２２週齢においてチャレンジした。許容できない安全性問題は見られなかった。毎日の平均体重増加（チャレンジ後１４−２１日）、回腸スコア（チャレンジ後３週；このスコアはローソニア感染症の存在による回腸病変の存在に比例する）及びＰＰＥ発生率に関する結果を表３に示す。統計的に差のある値（両側検定、ｐ＜０．０５；ＡＤＷＧのためのＡＮＣＯＶＡ検定、回腸スコアのための累積ロジットモデル及びＰＰＥ発生率のためのフィッシャーの直接確率検定）を星印で示す。

第２の研究を、ワクチン番号２（Ｘ−ｓｏｌｖｅ１２）を使用して実施した。５０匹のブタを使用し、各２５匹のブタの２群に分配した。一方の群に、実施例１に示すように首への皮内ワクチン接種により、上で番号２として示したワクチンの０．２ｍｌを３週齢においてワクチン接種した。２群は、ワクチン接種をせずに、対照として機能した。すべての動物に、２４週齢においてチャレンジした。毎日の平均体重増加（チャレンジ後１３−２０日）、回腸スコア（チャレンジ後３週；このスコアはローソニア感染症の存在による回腸病変の存在に比例する）及びＰＰＥ発生率に関する結果を表４に示す。統計的に差のある値（両側検定、ｐ＜０．０５；ＡＤＷＧのためのＡＮＣＯＶＡ検定、回腸スコアのための累積ロジットモデル及びＰＰＥ発生率のためのフィッシャーの直接確率検定）を星印で示す。各検定の間、各群において１匹の動物を、ワクチンとは関係の無い個別の問題のために安楽死させる必要があった。

結果はＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質及び死滅ローソニア・イントラセルラリス細菌を含む混合ワクチンを動物に皮内ワクチン接種することが、病原性ローソニア・イントラセルラリスによる感染症に対する防御を提供することを示す。さらに、製剤化前にローソニア抗原をフリーズドライすることは、有効性に対して負の効果を有さないと思われる。

Claims (12)

1. 死滅全細胞ローソニア・イントラセルラリス細菌及びブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）ＯＲＦ２タンパク質を組み合わせて含むワクチンであって、前記ワクチンの皮内投与による、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶ２による感染症に対するブタの防御における使用のためのワクチン。
2. 前記使用が、単回ショット投与後にブタを防御するためであることを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのワクチン。
3. 前記ワクチンがアジュバントを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用のためのワクチン。
4. 前記アジュバントが非生分解性油を含むことを特徴とする、請求項３に記載の使用のためのワクチン。
5. 前記ワクチンが、不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍｈｙｏ）抗原をさらに含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の使用のためのワクチン。
6. 前記不活化マイコプラズマ・ハイオニューモニエ抗原がＭｈｙｏバクテリンを含むことを特徴とする、請求項５に記載の使用のためのワクチン。
7. 前記ワクチンが、用量当たり１×１０^９の死滅ローソニア・イントラセルラリス細菌を含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の使用のためのワクチン。
8. 前記ローソニア細菌が、前記細菌を組成物に添加してワクチンを構成する前にフリーズドライされることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の使用のためのワクチン。
9. ローソニア・イントラセルラリス細菌及びＰＣＶ２による感染症に対してブタを防御する方法であって、死滅全細胞ローソニア・イントラセルラリス細菌及びブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）ＯＲＦ２タンパク質を組み合わせて含むワクチンを動物の真皮に投与するステップを含む方法。
10. 前記方法が、前記ワクチンの単回ショット投与後に防御をもたらすことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 皮内投与用ワクチンを構成する方法であって、前記方法は、死滅全細胞ローソニア・イントラセルラリス細菌及びブタサーコウイルス２（ＰＣＶ２）ＯＲＦ２タンパク質を、医薬として許容される担体と一緒に組み合わせるステップを含むことを特徴とする方法。
12. 死滅全細胞ローソニア・イントラセルラリス細菌がフリーズドライ形態であり、担体及びＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質を含む液体製剤に添加されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。

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