KR20160093046A

KR20160093046A - 로소니아 인트라셀룰라리스 및 돼지 써코바이러스 2에 대한 백신

Info

Publication number: KR20160093046A
Application number: KR1020167017415A
Authority: KR
Inventors: 안토니우스 아놀두스 크리스티안 야콥스; 비키 파힝어; 멜라니 스노; 마르텐 헨드릭 비트블릿
Original assignee: 인터벳 인터내셔널 비.브이.
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2014-12-02
Publication date: 2016-08-05
Also published as: EP3673916A1; MX2016007225A; CA2931136A1; CA2931136C; JP6488304B2; EP3076995A1; CN105848676A; ES2786194T3; WO2015082457A1; US20160303218A1; EP3076995B1; MX370584B; RU2672251C1; KR102547168B1; US10130699B2; JP2016539132A

Abstract

본 발명은 백신의 진피내 투여에 의해 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 및 돼지 써코바이러스 2 (PCV2)에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하는 데 사용하기 위한, 사멸된 전세포 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아 및 PCV2 ORF2 단백질을 조합하여 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아 및 PCV2에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하는 방법에 관한 것이다.

Description

로소니아 인트라셀룰라리스 및 돼지 써코바이러스 2에 대한 백신 {VACCINE AGAINST LAWSONIA INTRACELLULARIS AND PORCINE CIRCOVIRUS 2}

본 발명은 일반적으로 돼지 건강 분야에 관한 것이다. 돼지는 다수의 병원성 미생물에 영향을 받기 쉽다. 감염 관리는 보통 축사 및 사료 관리, 제약, 예컨대, 항바이러스 약물 및 항생제를 이용한 치료, 또는 백신을 이용한 예방적 치료에 의해 수행된다.

본 발명의 목적

돼지 건강 관리를 위한 편리하고, 안전하며, 효과적인 수단이 계속해서 요구되고 있다.

본 발명의 요약

본 발명의 목적을 충족시키기 위해, 사멸된 전세포 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 박테리아 및 돼지 써코바이러스 2 (PCV2) ORF2 단백질을 조합하여 포함하는 백신인, 각종 질환을 유발하는 미생물에 의한 감염으로부터 돼지를 조합적으로 보호하기 위한 신규한 백신을 고안한다. PCV2 및 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아, 둘 모두는 그가 돼지 건강상에 부정적인 영향을 미치기 때문에 상당한 경제적 손실의 원인이 된다. 비록 PCV2 및/또는 로소니아 감염을 치료하는 약물 뿐만 아니라, 백신이 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하기는 하지만, 안전하고 편리한 방식으로 잘 보호할 수 있는 신규한 방법이 계속 요구되고 있다. PCV2 및 로소니아 감염에 대한 조합 백신이 기술된 바 있지만, 상업적으로는 이용가능하지 않다. 실제로, 고려되거나 제안된 항원의 모든 조합이, 특히 각각의 모든 투여 방식으로 안전하고 효과적인 조합 백신을 유도할 수 있는 것은 아니다. 사실상, 특히 투여 방식을 변경하였을 때, 조합 백신의 안전성과 효능과 관련하여 불확실한 면은 어느 정도 항상 존재한다.

유럽 의약품 평가청(EMEA: European Agency for the Evaluation of Medicinal Products)의 수의약품 위원회는 그의 간행물 ["Note for guidance: requirements for combined veterinary products" (EMEA, 2000, CVMP/IWP/52/97-FINAL)]에서 (6페이지 중 2페이지에서) "조합형 백신을 개발하는 것은 간단하지 않다. 각 조합을 품질, 안전성, 및 효능면에서 그를 개별적으로 개발하고 연구하여야 한다"라고 기술하였다. 위원회는 우수한 조합 백신을 위한 연구는 전형적으로 예를 들어, 보존제, 부형제 및 안정제, 불활성화제 및 애주번트를 포함하는 조합형 백신 중에서 개별 성분들 사이의 상용성을 포함한다고 추가로 명시한다. 3페이지 맨 윗 단락에는 "조합형 백신에서는 1개 초과의 성분이 존재할 경우, 이는 흔히 상호작용을 유발할 수 있으며, 이는 특정 성분(들)을 단독으로 투여하는 경우와 비교하였을 때, 개별 성분에 대한 반응을 감소 또는 증가시킬 수 있다..... 상기와 같은 상호작용은 흔히 사실상은 면역학적인 것이지만, 이는 또한 면역계에 더 적은 수준으로 직접적인 영향을 미치는 다른 요인에 의해 유발될 수도 있다," 그리고 또한 "조합형 백신에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 애주번트를 사용하였을 때, 특별한 문제가 나타날 수 있다"라고 기술되어 있다.

미국 보건 사회 복지부(U.S. Department of Health and Human Services) 산하 식품 의약품청(Food and Drug Administration)의 생물 제제 평가 및 연구 센터(Center for Biologics Evaluation and Research)는 1997년 4월 ["Guidance for Industry, for the evaluation of combination vaccines for preventable diseases: Production, Testing and Clinical Studies"]를 발행하였으며, 상기 가이드라인에는 (페이지 3의 "성분의 상용성"이라는 표제하에) "경험상 1가 백신을 조합하면, 원하는 것보다 덜 안전하거나, 덜 효과적인 새로운 조합이 초래될 수 있는 것으로 나타났다. 때때로 , 불활성화된 백신의 성분이 활성 성분들 중 하나 이상의 것에 불리하게 작용할 수 있다"라고 기술되어 있는데, 이는 특히 불활성화된 백신이 생 백신의 효능에 부정적인 영향을 줄 수 있고, 예컨대, 생 백일해 백신 및 불활성화된 폴리오바이러스 백신을 조합하였을 때, 백일해 효능이 감소된 백신이 생성되는 결과가 발생하였다는 것을 나타낸다. 개별 백신과 비교하였을 때, 백신 중의 임의의 추가의 성분이 최종 생성물의 안전성 및 효능을 복잡하게 할 수 있다는 것을 나타낸다.

세계 보건 기구(WHO: World Health Organization)는, 모듈(MODULE) 2로 조합 백신을 고려하는 것인, "Vaccine Safety Basics"으로 불리는 e-러닝 코스를 발표하였다. 상기 모듈은 "허가받은 조합 백신은 제품이 안전하고, 효과적이며, 품질이 허용되는지를 확인하기 위해 정부 당국의 승인 이전에 광범위한 시험을 받게 된다"로 시작된다. "그러므로, 모든 조합의 경우에 제조자는 각 항원 성분의 효능, 면역을 유도하기 위하여 조합되었을 때의 백신 성분들의 효과, 독성으로의 역전될 가능성이 있는 위험, 및 다른 백신과의 반응을 평가하여야 한다"라고도 또한 기술되어 있다.

WHO는 상기 e-러닝 코스 53페이지에 "투여 경로는 백신 (또는 약물)이 신체와 접촉하게 만들어 주는 경로이다. 이는 면역화에 있어 중요한 성공 요인이다. 물질은 신체 유입 부위로부터, 그의 작용이 일어나기를 요망되는 신체 부위로 수송되어야 한다. 그러나, 상기 목적을 위해 신체 수송 기전을 사용하는 것은 사소한 것이 아니다"라고 발표하고 있다.

캘리포니아 건강 복지부(California Department of Health Services) 산하의 면역 분과(Immunization Branch)는 올바른 면역화를 위한 가이드라인을 발표하였다 (http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/ pinkbook/ downloads/appendices/d/vacc_admin.pdf). 7페이지 첫번째 전 단락에는 투여 부위와 관련하여 "각 백신에 대하여 권고되는 경로 및 부위는 임상 시험, 실제 경험 및 이론적 고려 사항에 기초한 것이다. 이러한 정보는 각 백신에 대한 제조사의 제품 정보에 포함되어 있다. 백신 투여에 사용되는 경로에는 5가지가 있다. 권고된 경로로부터 이탈하게 되면, 백신의 효능은 감소될 수 있거나, 국소적 유해 반응이 증가할 수 있다"라고 기술되어 있다. 14페이지에서는 미국에서 허가받은 유일의 진피내 백신만을 기술하고 있다: "진피내 용도의 플루존 ( Fluzone ) 진피내 경로에 의해 투여되는, 미국에서 허가받은 유일의 백신이다. 상기 백신은 오직 18세에서부터 64세까지의 사람에서만 사용할 수 있도록 승인을 받은 것이다. 상기 플루존 제 제는 불활성화된 인플루엔자 백신 ( TIV )의 근육내 제제와 동일한 것이 아니다. 다 른 TIV 제제는 진피내 경로에 의해 투여되서는 안된다."

대체로, 특정 항원 및 투여 경로의 임의 조합은 간단하지 않고, 안전성 및 효능 측정을 위한 실험을 필요로 한다.

본 발명은 또한 상기와 같은 백신 다음으로 상기 백신을 진피내로 투여하는 단계를 포함하는, 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아 및 PCV2에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하는 방법, 및 상기 백신을 구성하는 방법에 관한 것이다.

정의

백신은 병원성 미생물에 의한 (백신접종 이후의) 감염으로부터 보호하는 구성물이다.

병원성 미생물에 의한 감염으로부터의 보호란 전형적으로는 백신접종된 숙주에서 예를 들어, 항체를 통하여 미생물 그 자체를 방해함으로써 미생물 그 자체에 의한 감염을 예방 또는 감소시키거나, 또는 감염으로부터 발생하는 (준)임상적 질환을 예방 또는 감소시키는 것을 의미한다.

항원으로서 사멸된 전세포 박테리아를 포함하는 조성물은 살아있는 전세포 박테리아의 사멸로부터 유래된 항원성 구성물을 포함한다. 본 발명의 의미에서 이는 박테리아 세포가 적어도 부분적으로 사멸 프로세스 동안에 파열된 것이거나, 사멸된 전세포의 추출물 또는 균질액이 실제로 "사멸된 전세포 박테리아를 포함하는 백신" 중의 항원으로서 제공된다는 것을 배제하지 않는다. 사멸된 전세포 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아는 예를 들어, WO2009/144088 및 WO97/20050으로부터 공지된 것이다.

PCV2 ORF2 단백질은 돼지 써코바이러스 2형의 캡시드 단백질이다. PCV 2의 ORF 2는 약 28 kDa의 단백질을 코딩한다. 모든 PCV-2 단리물의 ORF 2는 91-100%의 뉴클레오티드 서열 동일성 및 90-100%의 추정 아미노산 서열 동일성을 공유한다 (Fenaux et al., J.Clin. Micorbiol., 38(7), 2494-2503, 2000). ORF2 단백질은 예컨대, WO2007/028823, WO 2007/094893 또는 WO2008/076915에 기술된 바와 같이 예를 들어, 바큘로바이러스 발현 시스템에서 재조합적으로 발현될 수 있다.

백신의 진피내 투여 ( intradermal administration)란 충분량의 백신을 진피에 놓음으로써 그와 동일한 백신 및 부피로 근육내 투여한 것과 유의적으로 상이한 면역학적 반응을 일으킬 수 있는 것 (특히: 실시예 3에 개략적으로 설명되어 있는 바와 같이 설정된 검정에서 윌콕슨(Wilcoxon) 순위 합계 검정을 사용하였을 때, p 값은 0.10 미만, 바람직하게는, 0.05 미만이어야 한다)을 의미한다. 진피내 백신접종을 위한 것으로 여러 장치가 상업적으로 이용가능하며, 예로는 IDAL® 백신용 주사기 (MSD 애니멀 헬쓰(MSD Animal Health)), 펄스 50 마이크로도스(Pulse 50 MicroDose) (펄스 니들 프리 시스템즈(Pulse Needle Free Systems)), 또는 문헌 [Vaccine, 2012 Jan 11;30(3):523-38] (특히, 525페이지 표 1의 "An overview of different devices for liquid and solid formulation administration" 참조)에 기술된 다른 장치가 있다.

보호하는 데 사용하기 위한 백신의 단일 샷 투여란 보호 면역을 얻기 위해 백신접종이 2차 투여로 부스팅될 필요가 없다는 것을 의미한다. 2회 샷 요법에서, 1차 (프라임) 백신접종은 전형적으로 1차 투여로부터 6주 이내에 부스팅되고, 보통은 1차 투여로부터 3주 또는 심지어는 2주 이내에 이루어지고, 보호 면역은 오직 2차 (부스트) 투여 이후에만 얻어지는 것으로 이해된다.

제약상 허용되는 담체는, 백신 투여 후 숙주 동물의 면역계에 항원을 제시할 수 있으며, 생체적합성 매질, 즉, 투여 후 대상 동물에서 유의적인 유해 반응을 유도하지 않는 매질이다. 상기와 같은 담체는 물 및/또는 임의의 다른 생체적합성 용매를 함유하는 액체일 수 있지만, 이는 또한 예컨대, 보통은 (당 및/또는 단백질 기반의) 동결 건조된 백신을 수득하는 데 사용되는 고체일 수 있다.

본 발명의 실시양태

한 실시양태에서, 백신은 단일 샷 투여 후 돼지를 보호하기 위한 것이다. 이롭게도 돼지는 심지어 백신의 단일 샷 투여 후에도 두 병원체 모두로부터 보호된다는 것이 밝혀졌다. 본 실시양태는 보호 수준을 회복시키기 위해 1차 백신접종 후, 예를 들어, 6 내지 12개월 경과하였을 때 후속 백신접종하는 것을 배제하지 않는다. 이러한 후속 백신접종은, 보호가 오직 부스트 백신접종 이후에만 이루어지는 것으로 간주되는 프라임-부스트 백신접종 방식의 부스트 백신접종과는 다르다. 프라임-부스트 방식에서, 두 백신접종은 전형적으로 2-3주 간격을 두고 이루어진다.

한 실시양태에서, 백신은 애주번트를 포함한다. WHO가 그의 (Vaccine Safety Basics) 코스 (상기 참조) 중 상기 코스의 1페이지 마지막 두줄 (섹션 "조합 백신")에서 이러한 유형의 간섭 및 반응성에 대해 명백하게 경고하였음에도 불구하고, 전형적으로는 불활성화된 항원의 면역 반응을 개선시키는 데 사용되는 것인 애주번트는 백신을 (그의 유해 반응에 대해 공지된 부위인) 진피 내로 투여하였을 때, 로소니아 또는 PCV2 항원을 부정적으로 간섭하지도 않고, 다른 항원에 대한 반응성을 과도하게 증가시키지도 않는 것으로 밝혀졌다. 추가의 실시양태에서, 애주번트는 비생체분해성 오일, 예컨대, 엑손모빌(ExxonMobil)®로부터 입수할 수 있는 포화된 탄화수소 오일 (마르콜(Marcol)® 52)을 포함한다.

한 실시양태에서, 백신은 불활성화된 마이코플라스마 히오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae) (Mhyo) 항원, 바람직하게, Mhyo 박테리아를 추가로 포함한다. 이는 3대 주요 돼지 병원체에 대한 편리하고, 안전하며, 효과적인 백신으로 이어지는 것으로 입증되었다.

추가의 또 다른 실시양태에서, 백신은 1회 용량당 1x10⁹개의 사멸된로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아를 포함한다. 즉, 불활성화된 로소니아 인트라셀룰라리스 항원은, 백신이 1회 용량당 1x10⁹개의 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아에 상응하는 로소니아 인트라셀룰라리스 항원을 포함하도록 하는 부하량으로 존재한다. 본 실시양태에서 배제되지 않는 더 높은 부하량은 보호 수준 및 면역 지속 기간에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다.

한 실시양태에서, 조성물에, 예를 들어, PCV2 ORF2 포함 수성 조성물 또는 에멀젼에 로소니아 박테리아를 첨가하여 백신을 구성하기 이전에 상기 박테리아를 동결 건조시킨다.

사멸된 전세포 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아 및 돼지 써코바이러스 2 (PCV2) ORF2 단백질을 제약상 허용되는 담체와 조합하는 단계를 포함하는 방법인, 진피내 투여용 백신을 구성하는 방법에서 동일한 방식으로, 사멸된 전세포 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아는 동결 건조된 형태일 수 있고, 전형적으로, 투여 전 1시간 이내에 담체 및 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 액체 제제에 첨가될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예 및 도면을 사용하여 추가로 설명될 것이다.

실시예

실시예 1은 단일 용량의 진피내 백신접종이 돼지 써코바이러스 2형에 의한 감염으로부터 23주간 면역을 제공할 수 있다는 것을 보여주는 실험이다.

실시예 2는 백신접종이 안전하며, 보호 역가를 유도한다는 것을 보여주는 PCV2 ID 1회 백신접종 접근법을 이용한 또 다른 실험이다.

실시예 3은 진피내 백신접종과 근육내 백신접종 사이를 직접 비교한 것이다.

실시예 4는 조합형 진피내 백신접종을 이용한 실험을 기술한 것이다.

실시예 5는 조합 백신, 다양한 항원 투여량 및 다양한 애주번트를 이용한 실험을 기술한 것이다.

실시예 6은 조합 백신을 이용한 추가의 실험을 기술한 것이다.

도 1 DOI 연구에서의 혈청 반응 테스트.
도 2 혈청, 대변 및 기관 중 바이러스 부하량.
도 3 평균 체온.
도 4 평균 총 PCV2 Ig Ab 결과.
도 5 평균 PCV2 IgM Ab 결과.
도 6 지속 기간 연구에서의 항체 역가.
도 7 기관 중 바이러스 부하량.
도 8 기관 중 바이러스 부하량.

실시예 1

실험 디자인

본 연구를 위해 PCV2에 대한 항체를 가진 암퇘지 10마리의 자손을 사용하였다. 새끼 돼지를 한배의 새끼 간에 15마리의 동물로 이루어진 2개의 동물군으로 나누었다. 3주령째, 1군의 새끼 돼지는 상업적으로 이용가능한 진피내 백신접종 장치 IDAL® (MSD 애니멀 헬쓰 (네덜란드 박스미어)로부터 이용가능)을 이용하여 돼지 써코바이러스 2형의 재조합적으로 발현된 ORF2 단백질 (상기 단백질 제공을 위해 WO 2007/028823 참조)을 포함하는, 0.2 ml의 백신을 사용하여 목 우측 진피내로 백신접종하였고, 2군은 백신접종하지 않은 채로 그냥 남겨 두었고, 대조군으로서의 역할을 하였다. 연구 동물 모두 임상적 징후에 대해 매일 관찰하였다. 모든 동물의 혈액 샘플을 백신접종 시점, 그 후 9, 17, 19 및 21주 경과하였을 때 채취하였다. 백신접종 후 23주째 각 동물을 비내로 적용되는 야생형 PCV2 시험감염 바이러스 균주를 이용하여 시험감염으로 감염시켰다.

혈청 샘플 및 대변 스왑을 시험감염 하루 전, 및 시험감염 후 1, 2, 및 3주 경과하였을 때 채취하고, 정량적 PCR에 의해 PCV2 바이러스 핵산에 대해 조사하였다. 추가로, 혈청 샘플을 PCV2 항체에 대하여 조사하였다.

시험감염 후 3주 경과하였을 때, 모든 동물을 부검하였고, PCV2 바이러스 항원 및 핵산 측정을 위해 서혜부 림프절, 편도선 및 폐를 샘플링하였다.

사용 백신은 5% v/v의 미네랄 오일 마르콜® 52 (엑손), 0.30% w/v 비타민 E 아세테이트 및 0.32% 폴리소르베이트 80 (트윈(Tween) 80; 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)), 주사용수 및 0.2 ml당 2,000 AU의 PCV2 단백질을 포함하는 수중유 에멀젼으로서 제공하였다. AU 단위는 펄킨엘머(PerkinElmer)의 알파LISA(AlphaLISA) 시험에 기초하여 계산하였다. 본 시험을 위해, 참조 표준물의 연속 희석액과 함께, PCV2 ORF2 항원을 함유하는 시험 샘플의 연속 희석액을 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트의 웰에 충전시켰다. 상기 희석액을 (PCV2 ORF2에 대한 모노클로날 항체로 코팅된) 억셉터-비드, 및 또한 PCV2 ORF2에 대한 비오틴 표지된 2차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 스트렙타비딘 코팅된 도너-비드와의 인큐베이션, 및 화학발광 검출에 의해 결합된 2차 항체의 양을 정량하였다. 참조 표준물은 1회 용량 (2 ml)당 5,000 AU를 함유하도록 상업적으로 이용가능한 백신 포실리스(Porcilis)® PCV가 설정된 것이었다.

실험 방법

매일 관찰

모든 돼지를 질환의 임상적 징후에 대해 매일 관찰하였다. 관찰은 식욕 상실, 누워 있으려는 경향, 무기력 또는 졸림, 오한, 털 곤두섬, 부종 (특히 눈 주변), 구토, 설사 및 호흡 곤란을 비롯한 전신 반응으로 이루어졌다.

혈액 샘플링

백신접종 전, 그 이후 9, 17, 19 및 21주 경과하였을 때 혈액 샘플을 수집하였다. 시험감염 하루 전, 및 시험감염 후 7, 13 및 19일 경과하였을 때 혈액 샘플을 수집하였다. 이는 모든 돼지로부터 개별적으로 수행하였다.

대변 스와빙

시험감염 하루 전, 시험감염 후 7, 13 및 18일 경과하였을 때 동물 1마리당 1개의 건조 스왑을 사용하여 모든 동물로부터 대변 스왑을 채취하였다. 표준 방법을 사용하여 스왑을 채취하여 항생제를 함유하는 배지에 넣었다. 배지 중의 스와빙된 물질로 이루어진 현탁액을 원심분리하여 정화시키고, 분취하고, 추가 사용시까지 ≤ -18℃에서 보관하였다.

혈청 반응 테스트

표준 ELISA 방법을 사용하여 모든 혈청 샘플을 PCV2에 대한 항체에 대하여 조사하였다. 간략하면, 바큘로바이러스 발현 PCV2 ORF2 항원으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트 상에서 연속 희석된 혈청 샘플을 인큐베이션시켰다. 혈청을 제거한 후, 모든 웰을 고정량의 비오틴 표지된 PCV2 특이적 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 결합된 MoAb를 퍼옥시다제 접합된 스트렙타비딘과 인큐베이션시킨 후, 발색단 검출을 수행하였다. 역가는 log2 역가로 표시하였다.

검시

실험 종료시 모든 동물을 기절시킨 후 출혈시킴으로써 안락사시켰다. 부검하는 동안 동물을 절개하고, 특히 하기 기관: 폐, 서혜부 및 장간막 림프절, 편도선, 흉선, 비장, 간 및 신장을 집중적으로 하여 내장을 동소에서 검사하였다. 이후, 급냉 및 정량적 PCR (qPCR)에 의한 추후 분석을 위해 편도선, 폐 (부엽), 및 서혜부 림프절로부터 샘플을 떼어냈다.

정량적 PCR

모든 혈청 및 대변 스왑에 대해, 및 편도선, 폐 및 서혜부 림프절의 10% 조직 균질액에 대해 정량적 PCR (qPCR)을 수행하였다. 간략하면, 시판용 키트를 이용하여 샘플로부터 DNA를 추출하였다. PCV2에 특이적인 이중 표지된 가수분해 프로브 및 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 각 샘플 중의 PCV2 게놈 DNA를 정량하였다. 특이적 형광이 역치를 초과한 사이클 수는 기지의 양의 PCV2 함유 플라스미드를 함유하는 샘플 세트에 대한 사이클 수와 상호 연관되었다. 결과는 log10 카피수/㎕의 반응 혼합물 (log10 c/㎕)로 표시하였다.

결과

실험 시작시, 모든 동물은 건강한 것으로 관찰되었다. 대조군에서는 동물 1마리가 백신접종 후 6주째 (wpv: weeks post vaccination)에 사망한 것으로 관찰되었다. 백신접종된 동물 2마리가 국소적으로 약간의 문제, 즉, 경미한 운동상의 기능 장애 (한쪽 다리 경직)를 보였다. 문제가 작다면, 상기 동물을 처리하지 않았다. 백신접종된 동물 중 어느 동물도 질환 또는 전신 반응에 관한 어떤 징후, 예컨대, 예컨대, 고열, 사료 섭취량 감소, 아나필락시스 쇼크 또는 구토를 보이지 않았다.

혈청 반응 테스트의 결과는 도 1에 제시되어 있다. 백신접종된 동물은 평균하여 약 4.0 log2로 보이는 항-PCV2 역가를 유지한 반면, 대조군 동물에서 역가는 검출 한계 아래로 감소된 것으로 뚜렷이 나타났다. 시험감염 후 (23 wpv, 26주령째), 백신접종된 군에서 역가는 약간 상승하였다. 대조군에서, 역가는 동일 수준으로까지 상승하였다.

qPCR 결과는 도 2a, 2b 및 2c에 제시되어 있다 ("dpc" = 시험감염 후 경과일수). 백신접종 후 23주째인 백신접종된 동물은 혈청, 림프계 기관 및 폐 중 PCV2 핵산이 유의적으로 감소된 것으로 나타난 바와 같이, PCV2에 의한 감염인 시험감염으로부터 보호된 것으로 나타났다. 추가로, 백신은 적어도 23주째 PCV2에 대하여 대변 스왑 중 바이러스 부하량을 유의적으로 감소시킨 것으로 입증된 바와 같이, 바이러스 방출(shedding)을 감소시킬 수 있었다. 이는 중간 정도 수준인 것으로 간주되는 대략 7 log2의 PCV2에 대한 순환 항체 역가를 가지는 야외 동물에게서 수행되었다.

실시예 2

실험 디자인

하나의 분만 배치로부터의 총 46마리의 새끼 돼지를 4개의 처리군: 각각 13마리의 새끼 돼지로 이루어진 2개의 백신접종된 군, 및 10마리의 새끼 돼지로 이루어진 2개의 대조군으로 할당하였다. 1군은 새끼 돼지가 대략 2주령째가 되었을 때, 상기 실시예 1하에 명시된 바와 같이 백신접종하였고, 2군은 새끼 돼지가 대략 3주령째가 되었을 때, 백신접종하였다. 새끼 돼지를 단일 용량의 백신을 사용하여 목 우측 진피내로 백신접종하였다. 3군 (대조군 2주령된 동물) 및 4군 (대조군 3주령된 동물)은 백신접종하지 않았다. 백신접종 당일, 백신접종 후 2, 3, 및 4주 경과하였을 때 모든 동물로부터 혈청 샘플을 수집하였다. 백신접종 하루 전, 백신접종 당일 및 그 후 4시간 경과 시점 및 백신접종 후 1, 2, 3, 4일째 체온을 측정하였다.

실험 방법

백신접종하기 전, 새끼 돼지를 일반 건강 상태에 대하여 관찰하였다. T= -1일째, 백신접종 후 T=0일째 0 및 4시간 경과 시점, 및 백신접종 후 T=1, 2, 3, 4일째 모든 새끼 돼지의 체온을 측정하였다.

백신접종 당일 및 그 후 2, 3, 및 4주 경과하였을 때 혈액 샘플을 수집하였다. 표준 방법에 따라 모든 돼지로부터 개별적으로 수행하였다. 항응고제를 첨가하지 않고 혈액 샘플을 수집하였다. 응고된 혈액 샘플로부터 혈청을 준비하고, 분취물을 충전시키고, 분석할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

총 PCV2 Ig 항체 및 PCV2 IgM 항체 ELISA를 상기 실시예 1 ("혈청 반응 테스트") 하에 명시된 바와 같이 시험하되, 단, 예외적으로, IgM 항체 ELISA의 경우에는 플레이트를 IgM 항체로 코팅하였고, 이후, PCV2 ORF2 항원과 함께 인큐베이션시킨 후, 고정량의 비오틴 표지된 PCV2 특이적 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션시켰다.

결과

실험 시작시, 모든 동물은 건강한 것으로 관찰되었다. 체온에 대한 평균 결과는 도 3에 제시되어 있다. 2주령된 동물과 3주령된 동물 사이에서는 체온 평균 증가분에 있어 어떤 차이도 관찰할 수 없었다 (최대 평균 증가분은 0.0 - 0.3℃였다). 또한, 1군 및 2군 중의 개별 동물의 체온의 최대 증가분은 두 대조군 중의 개별 동물의 체온의 최대 증가분과 유사하였다.

총 PCV2 Ig 항체 ELISA

총 PCV2 Ig 항체의 평균 결과는 도 4에 요약되어 있다. 백신접종 시점에, 2주령째에 백신접종된 새끼 돼지의 PCV2 항체 역가 (대개 모체로부터 유래)는 3주령째에 백신접종된 새끼 돼지의 것보다 더 높았다. 백신접종된 동물은 대조군 동물보다 현저히 더 높은 역가 증가를 보였다.

PCV2 IgM 항체 ELISA

PCV2 IgM 항체의 평균 결과는 도 5에 제시되어 있다. 백신접종 시점에, 모든 동물은 IgM 항체에 대하여 음성이었다. 백신접종 후, 3주령된 동물은 2주령된 동물보다 상당히 더 빠르고, 높은 IgM 항체 반응을 보였다. 대조군 동물은 연구 전 기간 동안 계속해서 음성을 유지하였다.

상기 결과에 기초하면, 2 및 3주령된 새끼 돼지를 1회 용량의 진피내 백신접종함으로써 허용되는 안전성 프로파일 및 우수한 혈청학적 반응을 얻을 수 있을 것으로 결론지을 수 있다. 또 다른 실험을 통해서도 유사한 결과를 얻었는데 (데이터는 나타내지 않음), 여기서, 순환 항체 역가의 출발 수준은 훨씬 더 높았고, 즉, 최대 9.4 log2였다 (이는 중간 범위의 상위에 존재하는 것으로 간주된다).

실시예 3

실험 디자인

총 30마리의 새끼 돼지를 각각 30마리의 새끼 돼지로 이루어진 3개의 처리군으로 할당하였다. 1군으로부터의 새끼 돼지는 본원 상기 실시예 1에 명시되어 있는 바와 같이 단일 용량의 백신을 사용하여 진피내로 백신접종하였다. 2군으로부터의 새끼 돼지는 단일 용량의 동일한 백신을 사용하여 동일한 양으로 같은 위치에 (목에) 근육내로 백신접종하였고, 3군으로부터의 새끼 돼지는 처리하지 않고 그대로 남겨 두었다. 백신접종 당일, 백신접종 후 3주 및 5주 경과하였을 때, 모든 동물로부터 혈청 샘플을 수집하였다.

실험 방법

백신접종하기 전, 새끼 돼지를 표준 방법에 따라 일반 건강 상태에 대하여 관찰하였다. 본원 상기 실시예 2에 명시된 방법에 따라 혈액 샘플링, 및 총 항-PCV2 항체 및 PCV2 ORF2 특이적 IgM 항체에 대한 혈청 반응 테스트를 수행하였다.

결과

연구 시작시, 모든 동물은 건강한 것으로 관찰되었다. 혈청 반응 테스트 결과는 하기 표 1에 요약되어 있다 (역가는 log2로 표시). 백신접종 시점에, 평균 항체 역가는 비교적 높았다. 백신접종 후, 어느 동물도 PCV2 Ab 역가 증가를 보이지 않았다. 백신접종 후 3 및 5주째, ID 군의 평균 PCV2 항체 역가가 IM 군보다 더 높은 것을 관찰할 수 있었다.

항-PCV2 IgM 혈청 반응 테스트 결과는 하기 표 2에 요약되어 있다 (역가는 log2로 표시). 백신접종 후 3주째, ID 군의 항-PCV2 IgM 항체 역가가 IM 군 및 대조군의 역가보다 현저히 더 높았다.

<표 1>

<표 2>

윌콕슨 순위 합계 검정을 적용시켰을 때, ID 군 대 IM 군에 대한 IgM 반응차에 관한 p 값은 0.0001이었다.

실시예 4

본 연구를 위해 PCV2에 대한 항체를 가진 암퇘지 여러 마리의 자손이 이용가능하였다. 새끼 돼지를 한배의 새끼 간에 18마리의 동물로 이루어진 3개의 군으로 나누었다. 3주령째, 1군 및 2군의 새끼 돼지는 본원 상기 실시예 1에 명시된 바와 같이 진피내로 백신접종하였다. 2군의 동물은 제조사의 설명서에 따라 (Mhyo 박테리아를 함유하는) 상업적으로 이용가능한 불활성화된 Mhyo 백신 포실리스® M Hyo ID 원스(Porcilis® M Hyo ID Once)를 이용하여 동시에 목 나머지 다른 쪽 진피내로 백신접종하였다. 3군 (대조군)의 동물은 처리하지 않고 그대로 남겨 두었다. 모든 연구 동물을 매일 관찰하였다. 백신접종 시점에, 및 동물을 도축장에 보낼 때까지 (23-25주령이 될 때까지) 격주로 혈청 샘플을 채취하였다. 상기 샘플을 PCV2 항체에 대하여 조사하였다.

실험 방법은 본원 상기 실시예 1에 명시된 바와 같았다. 혈청 반응 테스트에 따른 생성된 결과는 도 6에 제시되어 있다. 실시예 1하에 기술된 것과 같은 실험으로 확립된 바와 같이 항-PCV2 역가는 4 log2 수준을 훨씬 초과하는 수준으로 유지되었으며, 이는 보호적인 것으로 나타났다는 것이 상기 도면으로부터 명백해졌다. 백신 사이의 부정적인 간섭은 나타나지 않았다.

본 실험을 반복하여 병독성 마이코플라스마 히오뉴모니아에에 대한 보호를 체크하였다. 상기 반복 실험을 위해, 새끼 돼지 60마리를 사용하였다. 동물 40마리는 18-24일째 되었을 때, Mhyo 백신으로 백신접종하고, 상기 동물 중 20마리는 또한 PCV 백신으로 백신접종하였다. 동물 20마리는 백신접종하지 않았고, 시험감염 대조군으로서의 역할을 하였다. 백신접종 후 3주 경과하였을 때, 모든 동물을 병독성 M.히오뉴모니아에(M. hyopneumoniae) 균주로 감염시키고, 시험감염 후 3주 경과하였을 때, 모든 동물을 폐 병변에 대해 사후 분석 조사하였다. 군들 간의 폐 병변 점수 (LLS)를 비교하였다.

포실리스® M Hyo ID 원스로 백신접종된 군의 LLS는 대조군의 것보다 유의적으로 더 낮았다 (p<0.05, 던 검정(Dunn's test)). 포실리스® M Hyo ID 원스 단독으로 백신접종된 군 또는 PCV 백신과 함께 포실리스® M Hyo ID 원스로 백신접종된 군 사이에 유의적인 차이는 없었다. 따라서, 조합형 백신접종이 포실리스® M Hyo ID 원스로 얻은 면역에 대해 부정적인 영향을 미치지는 않는다고 결론지을 수 있다.

실시예 5

PCV2 ORF2 단백질 (250 내지 6,000 AU/0.2 ml), Mhyo (포실리스® Mhyo ID 원스 중의 수준과 동일 수준) 및 로소니아 항원 (WO 20089/127684의 사멸된 전세포 항원에 대한 실시예 2를 참조: 0.2 ml당 대략 1x10⁹개의 세포인 수준)을 함유하는, 총 8개의 백신을 제제화하였다. 백신은 상이한 애주번트를 함유하였다. 일부 백신은 현행 생체분해성 오일을 함유하는 애주번트인 디루박 포르테(Diluvac Forte) (MSD 애니멀 헬쓰 (네덜란드 박스미어); "DF"로 명명됨)를 사용하였다. 나머지는 본원 상기 실시예 1에 기술된 애주번트 제제 ("X-솔브(X-solve) 12"로 명명됨), 또는 X-솔브 12와 같은 성분으로 제제화되었지만, 농도는 그 절반인 애주번트 ("X-솔브 6"으로 명명됨), 또는 X-솔브 12 농도의 2½배 농도인 애주번트 ("X-솔브 30"으로 명명됨)를 사용하였다. 생성된 백신은 하기와 같았다 (Mhyo 및 로소니아 항원은 언급하지 않음: 1회 용량당 함량):

1군: 2,000 AU PCV2/X-솔브 30

2군: 250 AU PCV2/X-솔브 12

3군: 500 AU PCV2/X-솔브 12

4군: 2,000 AU PCV2/X-솔브 12

5군: 2,000 AU PCV2/X-솔브 6

6군: 500 AU PCV2/DF

7군: 2,000 AU PCV2/DF

8군: 6,000 AU PCV2/DF

본 연구를 위해 암퇘지 8마리의 자손을 사용하였다. 새끼 돼지는 중간 정도의 (중간 수준의), PCV2에 대한 모체로부터 유래된 항체 (MDA) (평균: 6.7 log2)를 가졌다. 3/4주령째, 1군부터 8군까지의 군으로부터의 새끼 돼지를 IDAL® 백신용 주사기를 이용하여 단일 용량으로 진피내로 백신접종하였다. 9군으로부터의 새끼 돼지는 백신접종하지 않은 채로 그냥 남겨 두었다. 백신접종 후 7주째, 모든 동물을 시험감염 시설로 보냈다. 1일 경과 후, 모든 동물을 PCV2의 시험감염 균주를 이용하여 시험감염으로 감염시켰다. 모든 새끼 돼지를 임상적 징후에 대해 매일 관찰하였다.

백신접종 당일을 시작으로하여 백신접종 후 20일째까지 백신접종 후 매 2일마다 촉진에 의해 국소 반응을 모니터링하였다.

백신접종 당일, 3주 후, 시험감염 하루 전, 1 및 2주 후, 및 부검시에 모든 동물로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 각 동물로부터 채취된 혈청 샘플을 PCV2 및 Mhyo에 대한 항체에 대하여 시험하였다. PCV2 핵산 정량화를 위해, 부검하는 동안 장간막 및 서혜부 림프절, 편도선 및 폐를 샘플링하였다.

실험 방법은 본원 상기 실시예 2에 기술된 것과 동일하였다. 모든 군에서 백신접종 시점의 PCV2 IgM 항체 반응은 검출 수준 미만 (2.0 log2 미만)이었다. 백신접종 후 3주째, PVC 항체 역가는 2000AU PCV2/X-솔브 30 백신의 경우에 가장 높았다 (즉, 20 log2). 1회 용량당 250-, 500- 및 2,000 AU PCV2 항원을 포함하는 X-솔브 12 군의 역가는 각각 9, 16 및 19 log2였다. 2,000 AU/X-솔브 6 백신을 받은 군의 역가는 15 log2였다. 1회 용량당 500-, 2000- 및 6,000 AU의 PCV2 항원을 포함하는 DF 군의 역가는 각각 8, 14 및 16 log2였다. 대조군의 역가는 검출 수준 미만이었다.

본 연구에서, 전신 및 국소 반응을 평가하였다. 백신접종에 기인하는 전신 반응은 어느 것도 관찰되지 않았다. 국소적인 영향에 관한 한, (1회 용량당 각각 X-솔브 12 500 및 2,000 AU, 또는 DF 6,000 AU PCV2의 백신을 받은) 3마리 이하의 백신접종된 동물은 경미하게 운동성에 문제가 있었고, 상기 수치는 대조군 동물에서와 동일한 수치이다. 그러므로, 상기 반응은 당연히 백신접종과는 관련이 없는 것으로 간주될 수 있다. 다른 국소 반응과 관련하여, X-솔브로 백신접종된 많은 동물들이 (약 60-100%) 국소 반응을 보였으며, 평균 팽윤 크기는 3 cm 미만, 즉, 1-2 cm였고, 팽윤은 2-6일 이내에 사라졌다. DF 사용시, 동물 중 약 30%의 동물만이 국소 팽윤을 보였고, 그 평균 크기는 0.5 cm 미만이었으며, 이는 하루만에 사라졌다.

도 7 및 8에는 다양한 백신에 대한 기관 중의 바이러스 부하량 (평균값)이 도시되어 있다. 모든 백신이 관련 기관 중에서 바이러스 부하량을 실질적으로 (이 경우 적어도 3 log) 감소시킬 수 있는 것으로 보인다.

본 연구에서, 사용된 애주번트 모두 안전하였고, 항-PCV2 IgM 반응을 유도하였으며, 병원성 돼지 써코바이러스 2에 의한 감염으로부터 동물을 치료할 수 있는 것으로 나타났다. 상이한 항원 사이의 부정적인 간섭은 관찰되지 않았다. 로소니아 혈청 반응 테스트 (나타내지 않음)는 우수한 항체 반응을 보였으며, 이에 기초하여 로소니아 인트라셀룰라리스에 의한 감염으로부터 보호가 이루어진 것으로 간주된다. 이를 확인하기 위해, 병원성 로소니아 인트라셀룰라리스를 이용한 시험감염을 포함하는 다음 실험을 수행하였다 (실시예 6 참조).

실시예 6

동물이 로소니아 인트라셀룰라리스를 이용한 시험감염으로부터 보호되는지 확인하기 위해, 실시예 5에 기술된 바와 같이, 상이한 양의 애주번트 X-솔브를 포함하는 백신 제제를 다양한 시험감염 실험을 위해 새로 제제화하였다. 상기 백신에 대한 기초는 PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 PCV2 백신이었다. 제1 백신은 실시예 5에 명시된 바와 같이 X-솔브 30에서 제제화하였다. 제2 백신은 X-솔브 12에서 제제화하였으며, 여기서, 로소니아 항원은 투여 전 30분 이내에 즉석 PCV2 백신에 동결 건조된 사멸된 로소니아 세포 (실시예 5에 사용된 것과 동일)를 첨가함으로써 도입하였다. 상기 두 백신 모두에서 PCV2 ORF2 단백질의 최종 농도는 2,000 AU/0.2 ml였다. 로소니아 항원의 농도는 실시예 5에 기술된 실험을 위해 사용된 것과 동일하였다 (0.2 ml당 약 1x10⁹개의 세포). 생성된 백신은 하기와 같았다:

1: 2,000 AU PCV2/로소니아/X-솔브 30

2: 2,000 AU PCV2/로소니아/X-솔브 12

1번 백신 (X-솔브 30)을 사용하여 제1 연구를 수행하였다. 39마리의 돼지를 사용하였으며, 이를 각각 19마리 및 20마리의 돼지로 이루어진 2개의 군으로 할당하였다. 2개의 군 모두 3주령째에 실시예 1에 명시된 바와 같이 0.2 ml의 백신을 사용하여 목에 진피내 백신접종에 의하여 백신접종하였다. 제1군은 본원 상기에 명시된 바와 같이 1번 백신으로 백신접종하고, 제2군은 동일하되, 로소니아 항원을 함유하지 않는 백신으로 백신접종하였다. 상기 군은 로소니아 시험감염에 대한 대조군으로서의 역할을 하였다. 22주령째에 모든 동물을 시험감염하였다. 허용되지 않는 안전성에 관한 문제는 관찰되지 않았다. 평균 1일 체중 증가 (시험감염 후 14-21일 동안), 회장 점수 (시험감염 후 3주째; 상기 점수는 로소니아 감염 존재에 기인하는 회장 병변의 존재에 비례한다), 및 PPE 발생률에 관한 결과는 하기 표 3에 제시되어 있다. 통계학상 상이한 값 (양측 검정, p< 0.05; ADWG의 경우, ANCOVA 검정, 회장 점수의 경우, 누적 로짓 모형 및 PPE 발생률의 경우, 피셔 정확 검정(Fischer's exact test))은 별표로 표시되어 있다.

<표 3>

2번 백신 (X-솔브 12)을 사용하여 제2 연구를 수행하였다. 50마리의 돼지를 사용하였으며, 이를 각각 돼지 25마리씩으로 이루어진 2개의 군으로 할당하였다. 제1군을 3주령째에 본원 상기에 명시된 바와 같은 2번 백신으로 0.2 ml의 상기 백신을 사용하여 실시예 1에 명시된 바와 같이 목에 진피내 백신접종에 의하여 백신접종하였다. 제2군은 백신접종하지 않았고, 이는 대조군으로서의 역할을 하였다. 24주령째에 모든 동물을 시험감염하였다. 평균 1일 체중 증가 (시험감염 후 13-20일 동안), 회장 점수 (시험감염 후 3주째; 상기 점수는 로소니아 감염 존재에 기인하는 회장 병변의 존재에 비례한다), 및 PPE 발생률에 관한 결과는 하기 표 4에 제시되어 있다. 통계학상 상이한 값 (양측 검정, p< 0.05; ADWG의 경우, ANCOVA 검정, 회장 점수의 경우, 누적 로짓 모형 및 PPE 발생률의 경우, 피셔 정확 검정)은 별표로 표시되어 있다. 시험하는 동안 각 군 중 동물 1마리는 특이적인, 백신과 관련이 없는 문제로 안락사시켜야 했다.

<표 4>

본 결과, PCV2 ORF2 단백질 및 사멸된 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아를 포함하는 조합형 백신으로 동물을 진피내 백신접종하면 병원성 로소니아 인트라셀룰라리스에 의한 감염으로부터 보호할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 제제화하기 이전에 로소니아 항원 동결 건조시키는 것이 효능에 대하여 어떠한 부정적인 영향도 미치지 않는 것으로 보였다.

Claims

백신의 진피내 투여에 의해 로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) 및 돼지 써코바이러스 2 (PCV2)에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하는 데 사용하기 위한, 사멸된 전세포 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아 및 PCV2 ORF2 단백질을 조합하여 포함하는 백신.
제1항에 있어서, 사용이 단일 샷 투여 후 돼지를 보호하기 위한 것임을 특징으로 하는 백신.
제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 애주번트를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제3항에 있어서, 애주번트가 비-생체분해성 오일을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화된 마이코플라스마 히오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae) (Mhyo) 항원을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제5항에 있어서, 불활성화된 마이코플라스마 히오뉴모니아에 항원이 Mhyo 박테리아를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1회 용량당 1x10⁹개의사멸된로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 로소니아 박테리아가, 상기 박테리아를 조성물에 첨가하여 백신을 구성하기 이전에 동결 건조되는 것을 특징으로 하는 백신.
동물 진피 내로 사멸된 전세포 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아 및 돼지 써코바이러스 2 (PCV2) ORF2 단백질을 조합하여 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아 및 PCV2에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하는 방법.
제9항에 있어서, 백신의 단일 샷 투여 이후에 보호를 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
사멸된 전세포 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아 및 돼지 써코바이러스 2 (PCV2) ORF2 단백질을 제약상 허용되는 담체와 함께 조합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진피내 투여용 백신을 구성하는 방법.
제11항에 있어서, 사멸된 전세포 로소니아 인트라셀룰라리스 박테리아가 동결 건조된 형태이고, 담체 및 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 액체 제제에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.