JP2016521559A - 細胞の集団、分化転換の方法及びその使用方法 - Google Patents

細胞の集団、分化転換の方法及びその使用方法 Download PDF

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Abstract

【課題】非膵臓細胞の集団の分化転換し、膵β細胞系統に沿って成熟させる方法を提供する。【解決手段】本発明は、連続的及び一時的に調節された膵臓転写因子の投与により、非膵臓細胞を誘導して、分化転換し、膵β細胞系統に沿って成熟させる方法を提供する。本発明はまた、分化転換の遺伝的傾向がある細胞を特定し、単離し、増強する方法、及び糖尿病等の変性膵臓疾患を治療する方法も提供する。【選択図】図９

Description

［関連出願］
本出願は、２０１３年６月１３日出願の米国特許仮出願第６１／８３４７５９号及び２０１３年６月１３日出願の米国特許仮出願第６１／８３４７６７号を基礎とする優先権を主張するものであり、引用によりこれらの出願の全内容を本明細書の一部とする。
本発明は、概して、分化転換する傾向を有する細胞の集団及び成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の製造のための方法に関する。
膵臓のランゲルハンス島のβ細胞は、アミノ酸、グリセルアルデヒド、遊離脂肪酸、とりわけグルコース（ブドウ糖）等の因子に応じてインスリンを分泌する。血中グルコース濃度の上昇を検知し、インスリンを分泌することによって上昇したグルコースレベルに応答する通常の膵島β細胞の能力は、血中グルコースレベルの調節に重要である。グルコース負荷に応答したインスリン分泌の増加により、正常な個体においては、周辺組織、特に筋肉や脂肪組織へのグルコース取り込みを刺激することによって高血糖が防止される。
膵島β細胞の機能が損なわれた個体は、糖尿病を患う。インスリン依存性糖尿病、即ちＩＤＤＭ（若年性または１型糖尿病とも称される）は、全てのヒト糖尿病の約１０％を占める。ＩＤＤＭは、ＩＤＤＭの場合にはランゲルハンス島のインスリンを産生するβ細胞に対する特定の破壊が生じている点のみによって、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）から区別される。ＩＤＤＭでのβ細胞の破壊は、患者自身の免疫系がβ細胞を認識して破壊するが、その膵島を含む周囲のα細胞（グルカゴン産生性）またはδ細胞（ソマトスタチン産生性）は破壊しない、特定の自己免疫的な攻撃の結果であるとみられる。
ＩＤＤＭのための治療の選択肢は、インスリンの自己注射を中心としているが、これは不便で正確性に欠ける解決手段であって、新たな治療ストラテジーの開発が非常に望まれている。永久的なインスリンの代用手段として、膵島または膵臓断片の移植の可能性が、研究されてきた（非特許文献１；非特許文献２）。現在の手法では、死者の材料またはブタの膵島を移植用代替物として使用する（非特許文献３）。しかし、克服すべき重要な問題としては、ドナー組織の利用率が低いこと、可変性、分離によって得られる膵島の収率が低いこと、単離プロセスの結果として生じ得る酵素による及び物理的な損傷が挙げられる（非特許文献４；非特許文献５参照）。加えて、免疫系及びブタの膵島を用いた異種移植に対する現状の懸念がある。
インスリンの自己注射による糖尿病の治療に対する代替手段の確立について、依然として重要な必要性が存在することは明らかである。幹細胞の研究はこの点について有望であることが分かっているが、大きな成功は収められていない。糖尿病の治療で使用される非膵臓細胞の単離、培養、及び分化転換のための改善された手順の必要性が存在する。
米国特許第６７７４１２０号明細書 米国特許出願公開第２００５／００９０４６５号明細書 米国特許出願公開第２００３／０１３８９４８号明細書 米国特許第４８３７０２８号明細書 米国特許第４７３７３２３号明細書 米国特許第４８７３３１６号明細書 欧州特許出願公開第２６４１６６号明細書 米国特許第４９８０２８６号明細書 国際公開第９４／０８５９８号 米国特許第４５２２８１１号明細書 米国特許第５７０３０５５号明細書 米国特許第５３２８４７０号明細書
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本発明は、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法であって、成体哺乳動物の非膵臓細胞を、膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチド、または膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸に、第１の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させ、その細胞を更に、Ｐａｘ−４ポリペプチド、ニューロＤ１（ＮｅｕｒｏＤ１）ポリペプチド、またはＰａｘ−４ポリペプチドをコードする核酸、またはニューロＤ１ポリペプチドをコードする核酸に、第２の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させ、その細胞を更に、ＭａｆＡポリペプチドまたはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸に、第３の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させることによって、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法を提供する。前記第２の期間は、前記第１の期間の後の少なくとも２４時間である。前記第３の期間は、前記第２の期間の後の少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態では、前記第１の期間、前記第２の期間、及び前記第３の期間が、同じ時間である。
代替的形態として、本発明は、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法であって、成体哺乳動物の非膵臓細胞を、膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチド、または膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸及び第２の膵臓転写因子に、第１の期間において該ポリペプチド、または該核酸及び前記第２の膵臓転写因子の取り込みを可能にする条件の下で接触させ、その細胞を更に、ＭａｆＡポリペプチド、またはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸に、第２の期間において、該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させることによって、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記第２の期間は、前記第１の期間の後の、少なくとも２、３、４、５、６、または７日間である。前記第２の膵臓転写因子は、例えばニューロＤ１、Ｐａｘ−４、またはＮｇｎ３である。
前記核酸は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸である。
任意選択で、前記細胞を更に、Ｓｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸、またはＳｏｘ−９ポリペプチドに、該核酸またはポリペプチドの取り込みを可能にする条件の下で接触させる。
前記細胞は、骨髄細胞、筋細胞、脾臓細胞、腎細胞、血液細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、及び肝細胞である。前記細胞はインビボで接触される。前記細胞はインビトロで接触される。本発明の方法によって製造される細胞の集団は、少なくとも５億個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドまたは核酸に接触させる前に、前記細胞が培地において増殖される。
また、本発明には、変性膵臓疾患の治療のための方法であって、治療が必要な患者に対して、ＤＸ−１ポリペプチドまたはＰＤＸ−１ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、第１の期間投与し、Ｐａｘ−４ポリペプチド、ニューロＤ１ポリペプチド、またはＰａｘ−４ポリペプチドをコードする核酸、またはニューロＤ１ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、第２の期間投与し、かつＭａｆＡポリペプチドまたはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、第３の期間投与することによる、変性膵臓疾患の治療のための方法も含まれる。前記第２の期間は、前記第１の期間の後の少なくとも２４時間である。前記第３の期間は、前記第２の期間の後の少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態では、前記第１の期間、前記第２の期間、及び前記第３の期間が、同じ時間である。
更に本発明によれば、変性膵臓疾患の治療のための方法であって、治療が必要な患者に対して、ＰＤＸ−１ポリペプチド、またはＰＤＸ−１ポリペプチドをコードする核酸及び第２の膵臓転写因子を含む組成物を、第１の期間投与し、かつＭａｆＡポリペプチド、またはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、第２の期間投与することによる、変性膵臓疾患の治療のための方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記第２の期間が、前記第１の期間の後の、少なくとも２、３、４、５、６、または７日間である。前記第２の膵臓転写因子は、例えばニューロＤ１、Ｐａｘ−４、またはＮｇｎ３である。
前記核酸は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸である。
任意選択で、患者には更に、Ｓｏｘ−９ポリペプチド、またはＳｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸を、該核酸またはポリペプチドの取り込みを可能にする条件の下で投与する。
また、本発明には、変性膵臓疾患の治療のための方法であって、治療が必要な患者に対して、本発明の方法により製造された細胞の集団を投与することによる、変性膵臓疾患の治療のための方法も含まれる。
前記変性膵臓疾患は、１型糖尿病、２型糖尿病、または妊娠糖尿病などの糖尿病である。或いは、前記変性膵臓疾患は、膵臓癌または膵炎である。
本発明は更に、ＰＤＸ−１ポリペプチドをコードする核酸及び第２の膵臓転写因子をコードする核酸を含む発現ベクター、或いは成熟膵β細胞の表現型を有する細胞の集団を製造する方法または変性膵臓疾患の治療のための方法のいずれかにおけるその使用を提供する。前記第２の膵臓転写因子は、例えば、ニューロＤ１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ３、またはＳｏｘ−９である。
更に本発明に含まれるものは、グルタミンシンセターゼ応答要素（ＧＳＲＥ）を活性化できる増強された（enriched）ヒト細胞の集団である。前記細胞の集団における細胞の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％またはそれ以上が、グルタミンシンセターゼ応答要素（ＧＳＲＥ）を活性化できる。前記細胞は、内皮細胞、上皮細胞、間葉細胞、線維芽細胞、または肝細胞である。いくつかの態様では、前記肝細胞は、中心周辺肝に由来する。好ましくは、前記細胞が、活性Ｗｎｔシグナル伝達を有する。前記細胞の集団における前記細胞が、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはそれらの組み合わせ等の膵臓転写因子（ｐＴＦ）を異所的に発現するように処理されたとき、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％またはそれ以上の細胞が、インスリンを産生するか、ｃ−ペプチドを分泌する。任意選択で、前記細胞の集団は、Ｗｎｔ３ａ、低レベルのＤＫＫ１またはＤＫＫ３、低レベルのＡＰＣ、高レベルの活性化されたβカテニン、またはＳＴＡＴ３結合要素（ｃｉｓ作用因子）の少なくとも１つを発現する。いくつかの態様では、前記細胞の集団から単離された肝細胞の集団において、前記細胞は、低レベルのＨＯＭＥＲ１、ＬＡＭＰ３、またはＢＭＰＲ２か、或いは低レベルのＡＢＣＢ１、ＩＴＧＡ４、ＡＢＣＢ４、またはＰＲＮＰを発現する。
また、本発明によって提供されるのは、転写因子誘導型分化転換のための増強された能力を有する細胞の集団を単離する方法であって、異種ヒト細胞の集団を提供し、レポータータンパク質に機能可能的にリンクされた、グルタミンシンターゼ転写の活性化が可能なグルタミンシンセターゼ応答要素（ＧＳＲＥ）またはその断片を含む核酸作製物を導入し、前記レポータータンパク質を発現する細胞を単離することにより、転写因子誘導型分化転換のための増強された能力を有する細胞の集団を単離する方法である。任意選択で、前記核酸作製物は、プロモーター／エンハンサーを更に含む。前記レポータータンパク質が、蛍光タンパク質である。前記レポータータンパク質が、選択圧に対する耐性を提供する。前記細胞は、内皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞または肝細胞である。前記肝細胞は、中心周辺肝に由来する。
任意選択で、前記方法は更に、単離された前記細胞を培養することを含む。
また本発明には、本発明の方法によって単離された細胞の集団も含まれる。
他の態様では、本発明は、膵臓疾患の症状を治療または軽減する方法であって、本発明の方法によって単離された細胞の集団に膵臓転写因子を導入し、治療が必要な患者に対して前記細胞の集団を投与することによる、膵臓疾患の症状を治療または軽減する方法を含む。前記膵臓疾患は、糖尿病または膵炎である。前記膵臓転写因子は、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはそれらの組み合わせである。
更に本発明に含まれるのは、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法であって、本発明による単離された細胞の集団を、膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチド、または膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸に、第１の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させ、その細胞を更に、Ｐａｘ−４ポリペプチド、ニューロＤ１ポリペプチド、またはＰａｘ−４ポリペプチドをコードする核酸、またはニューロＤ１ポリペプチドをコードする核酸に、第２の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させ、その細胞を更に、ＭａｆＡポリペプチドまたはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸に、第３の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させることによる、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法である。前記第２の期間は、前記第１の期間の後の少なくとも２４時間である。前記第３の期間は、前記第２の期間の後の少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態では、前記第１の期間、前記第２の期間、及び前記第３の期間が、同じ時間である。
代替的形態として、本発明は、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法であって、本発明による単離された細胞の集団を、膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチド、または膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸及び第２の膵臓転写因子に、第１の期間において該ポリペプチド、または該核酸及び前記第２の膵臓転写因子の取り込みを可能にする条件の下で接触させ、その細胞を更に、ＭａｆＡポリペプチド、またはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸に、第２の期間において、該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させることによる、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記第２の期間が、前記第１の期間の後の、少なくとも２、３、４、５、６、または７日間である。前記第２の膵臓転写因子は、例えばニューロＤ１、Ｐａｘ−４、またはＮｇｎ３である。
前記核酸は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸である。
任意選択で、前記細胞を更に、Ｓｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸、またはＳｏｘ−９ポリペプチドに、該核酸またはポリペプチドの取り込みを可能にする条件の下で接触させる。
本発明は、プロモーター及びレポータータンパク質に機能可能的にリンクされた、グルタミンシンセターゼ応答要素（ＧＳＲＥ）を１または複数含む核酸作製物を提供する。前記プロモーターは、弱いプロモーターである。前記核酸作製物は、転写因子を更に含む。前記転写因子は、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、ＮａｆＡ、またはニューロＤ１などの膵臓転写因子（ｐＴＦ）である。本発明の核酸作製物を含むベクターも本発明に含まれる。前記ベクターは、アデノウイルスベクターである。
本明細書で用いられる全ての科学技術用語は、特に別の意味であると定義しない限り、本発明の属する技術分野における当業者によって一般的理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似のまたは均等な方法及び材料は、本発明の実施または試験的実施において用いることができ、適切な方法及び材料については後述する。本明細書中に引用された全ての文献、特許出願明細書、特許明細書の内容は、引用により本明細書に組み入れられる。内容に矛盾が生じた場合には、定義を含めて本明細書の内容が基準となる。更に、開示される材料、方法、及び実施例は例示に過ぎず、本発明の範囲の限定を意図したものではない。
本発明の他の特徴及び効果は、以下の発明の実施形態の記載及び特許請求の範囲の記載等から明らかとなろう。
図１Ａ〜図１Ｄよりなり、インビトロでのヒト肝細胞におけるＰｄｘ−１の発現が膵臓ホルモンの発現の順次進行する活性化を誘導することを示す。図１Ａはインスリン（ＩＮＳ）、図１Ｂはグルカゴン（ＧＣＧ）、図１Ｃはソマトスタチン（ＳＳＴ）、図１Ｄは他の膵臓特異的転写因子（ＮＫＸ６．１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ４、ＭＡＦＡ、ニューロＤ１（ＮｅｕｒｏＤ１）、ニューロＧ３（ＮｅｕｒｏＧ３））の発現を示す。この結果は、同じｃＤＮＡサンプル内のβアクチン遺伝子発現に対して正規化されたものであり、同日に対照ウイルスで処置された細胞に対する相対的発現の平均値±ＳＥ（標準誤差）として提示されている。２つの独立した実験においてｎ≧４（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）。 図２Ａ〜図２Ｄよりなり、インビトロでのヒト肝細胞における膵臓転写因子（ｐＴＦ）Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの異所的な同時発現が、ｐＴＦの各々単独によって誘導された場合と比較して、（プロ）インスリン分泌を促進することを示す。図２Ａでは、免疫蛍光（ＩＦ）染色が、ｐＴＦ：Ｐｄｘ−１（左パネル）、Ｐａｘ４（中央左パネル）、ＭａｆＡ（中央右パネル）、及び３種のｐＴＦの混合（右パネル）の発現を示し、矢印は全ての３種のｐＴＦを発現する細胞を示す。図２Ｂは、示されたｐＴＦによるインスリンプロモーターの活性化のルシフェラーゼアッセイの結果を示す。β−ｇａｌが対照として使用された。結果は、相対発光強度単位（ＲＬＵ）／ｍｇタンパク質として表されている。各データ点は、対照のウイルス処理した細胞と比較した、少なくとも２つの独立した実験（ｎ＞４）（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）での平均±ＳＥを表す。図２Ｃでは、免疫蛍光染色が、示されたｐＴＦの異所的な発現の後のインスリン陽性細胞を示す。元の大きさ×２０とされている。表（右側）がＩＦ染色の量を示す。インスリン陽性細胞のパーセンテージは、少なくとも２つの独立した実験から少なくとも５００の陽性細胞をカウントすることによって計算した。図２Ｄでは、示された濃度のグルコースとともにインキュベートした後のインスリン分泌を、ラジオイムノアッセイによって検出した。これは５つの独立した実験においてｎ≧１２（＊ｐ＜０．０５）。有意性は、３種感染と他の全ての処置との間の差で表されている。 図３Ａ〜図３Ｅよりなり、ＴＦ、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの同時の及び連続した発現の膵β細胞の成熟に対する効果を示す。図３Ａは、ｐＴＦの感染の順序（処置Ｂ−Ｅ）または対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ；処置Ａ）の概略を示す。図３Ｂは、インスリンについての免疫蛍光染色、処置Ｂ（左パネル）、処置Ｃ（中央パネル）、処置Ｄ（右パネル）を示す。元の大きさに対する倍率は×２０である。染色の量（％）は、各イメージの下に表示されている。インスリン陽性細胞のパーセンテージは、少なくとも２つの独立した実験から少なくとも１０００の陽性細胞をカウントすることによって計算した。図３Ｃ及び図３Ｄは、それぞれ示された濃度のグルコースとともにインキュベートした後のインスリン分泌（図３Ｃ）及びＣ−ペプチド分泌を、ラジオイムノアッセイにより測定した結果を示す。感染処置は各図のＸ軸上に示され、処置内容は図３Ａの表に説明されている。これは、対照のウイルス処置した細胞と比較で、５つの独立した実験においてｎ≧１２（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）。図３Ｅは、示された処置（Ｘ軸）の後の、示された内因性膵臓特異的転写因子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定した結果を示す。ＣＴ値は、同じｃＤＮＡサンプル内のβアクチン遺伝子の発現に対して正規化されている。結果は、対照ウイルス処置済み細胞に対する相対発現の平均値±ＳＥの相対レベルとして提示されており、なお、４つの独立した実験においてｎ≧５（＊ｐ＜０．０５）である。矢印は、処置Ｃの下でのＩｓ１−１発現レベルの明確な低下を指している。 図４Ａ〜図４Ｃよりなり、分化転換効率を示す３つのグラフを示しており、階層的な連続した順序での感染（処置Ｃ）が最も効率的であることが示されている。図４Ａは、インスリンプロモーターの活性化を、示された感染処置の後のルシフェラーゼアッセイによって測定した結果を示している。結果は、相対発光強度単位（ＲＬＵ）／ｍｇタンパク質として表されている。各データ点は、対照のウイルス処理した細胞と比較した少なくとも２つの独立した実験（ｎ＞４）（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）の平均±ＳＥを表す。図４Ｂは、示された感染処置の後のグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）のＲＴ−ＰＣＲによる発現レベルの解析を行った結果を示す。ＣＴ値は、同一のｃＤＮＡサンプル内のβアクチン遺伝子発現に対して正規化されている。結果は、対照ウイルス処置済み細胞に対する相対発現の平均値±ＳＥの相対レベルとして提示され、なお４つの独立した実験においてｎ≧８（＊ｐ＜０．０５）である。図４Ｃは、プロホルモン転換酵素２（ＰＣ２；ＰＣＳＫ２）の発現レベルを、示された感染処置の後のＲＴ−ＰＣＲによって決定した結果を示している。ＣＴ値は、同一のｃＤＮＡサンプル内のβアクチン遺伝子発現に対して正規化されている。結果は、対照ウイルス処置済み細胞に対する相対発現の平均値±ＳＥの相対レベルとして提示され、なお４つの独立した実験においてｎ≧８（＊ｐ＜０．０５）である。 図５Ａ及び図５Ｂよりなり、階層的な連続した順序の感染（処置Ｃ）の後のＣペプチド分泌を表す２つのグラフを示す。図５Ａは、直接的で「階層的な」連続した順序の感染（処置Ｃ）によって処置された細胞を、グルコース濃度０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭにおける、１５分間の静的なインキュベートをしたときのＣペプチド分泌をラジオイムノアッセイで測定した結果を示す（なお３つの独立した実験においてｎ≧７、＊ｐ＜０．０５）。図５Ｂは、Ｃペプチド分泌が解析される前にインスリン、トランスフェリン、及びセレン（ＩＴＳ）を加えた血清のない培地に１３日間または２８日間おいたときのラジオイムノアッセイによるＣペプチド分泌を測定した結果を示す。なお、２つの独立した実験においてｎ≧５（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）。有意性は、標準プロトコル（６日目に処置Ｃ）と比較したときの差で表されている。 図６Ａ〜図６Ｄよりなり、各ｐＴＦの処置Ｃの感染順序及び除外（Ｃ−Ｐｄｘ１、Ｐｄｘ１除外；Ｃ−Ｐａｘ４、Ｐａｘ４除外；及びＣ−Ｍａｆａ、Ｍａｆａ除外）を用いて、分化転換プロセスにおけるｐＴＦの個々の役割を示す４つのグラフを示す。図６Ａは、インスリンプロモーター活性化をルシフェラーゼアッセイによって測定した結果である。結果は、示された直接的で「階層的な」連続した感染順序（処置Ｃ）と比較した平均値±ＳＥとして提示されており、なお３つの独立した実験においてｎ≧６（＊ｐ＜０．１，＊＊ｐ＜０．０５）である。図６Ｂは、示された濃度のグルコースとともに１５分間インキュベートした後のＣペプチドをラジオイムノアッセイによって測定した結果である。直接的で「階層的で」連続した感染順序（処置Ｃ）の場合と比較したものであり、なお、３つの独立した実験においてｎ≧６（＊＝ｐ＜０．１，＊＊＝ｐ＜０．０５）である。図６Ｃは、膵臓酵素、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、及びプロホルモン転換酵素（ＰＣＳＫ２）の発現レベルについてＲＴ−ＰＣＲにより測定した結果である。図６Ｄは、示された内因性膵臓転写因子の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲにより測定した結果である。ＣＴ値は、同じｃＤＮＡサンプル内のβアクチン遺伝子の発現に対して正規化されている。結果は、「階層的な連続した感染」処置済みの肝細胞と比較した平均±ＳＥの相対レベルとして提示される。なお３つの独立した実験においてｎ≧６（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）。 図７Ａ〜図７Ｃよりなり、「階層的に」連続した順序（処置Ｃ）によって感染させた後の分化転換肝細胞のβ変異に対するＩｓｌ１発現の効果を表す３つのグラフを示す。図７Ａは、インスリンの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲにより測定した結果を示す。ＣＴ値は、同じｃＤＮＡサンプル内のβアクチン遺伝子の発現に対して正規化されている。結果は、対照のウイルス処置済み細胞と比較した平均±ＳＥの相対レベルとして提示される。なお、３つの独立した実験においてｎ≧６（＊ｐ＜０．０５）である。図７Ｂは、インスリン分泌をラジオイムノアッセイによって測定した結果である。＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎ≧６で、直接的で「階層的な」連続した感染順序（処置Ｃ）と比較したものであり、なお、３つの独立した実験においてｎ≧６である。図７Ｃは、グルコーストランスポーター２（Ｇｌｕｔ２）の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲにより測定した結果である。 図８Ａ〜図８Ｆよりなり、階層的な順序付けた感染（処置Ｃ）及び各ｐＴＦの排除を用いて、グルカゴン（α）及びソマトスタチン（δ）を産生する細胞の分化の促進におけるｐＴＦ群の個々の役割を示す。図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｄは、示された感染処置の後のＲＴ−ＰＣＲにより膵臓ホルモングルカゴン（ＧＣＧ）の発現レベル（図８Ａ及び図８Ｂ）とソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現レベル（図８Ａ及び図８Ｄ）を決定した結果を示す。図８Ｃは、示された感染処置についてのＲＴ−ＰＣＲにより、細胞特異的転写因子ＡＲＸ及びＢＲＡＩＮ４の発現レベルを測定した結果を示す。図８Ｅは、Ｉｓｌ１（１００ＭＯＩ）とともに追加の感染処置をした後にＲＴ−ＰＣＲにより、ソマトスタチン（ＳＳＴ）の発現レベルを決定した結果を示す。ＣＴ値（図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、及び図８Ｄについて）は、同じｃＤＮＡサンプル内のβアクチン遺伝子の発現に対して正規化されている。結果は、対照のウイルス処置済み細胞（ａ）と比較した、または「階層的な連続した感染」処置済みの肝細胞（ｂ−ｅ）と比較した、平均±ＳＥの相対レベルとして提示されている。なお、３つの独立した実験においてｎ≧６、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．１である。図８Ｆは、処置Ｃ感染後（左パネル）及び処置Ｃ感染とともに追加のＩｓｌ１感染（右パネル）を行った後のソマトストチンに対する免疫蛍光染色の結果を示す。倍率は元の大きさ×２０とされている。 図８Ｇは、図８Ａ〜図８Ｆの続きとして、ソマトストチン及びインスリンについての免疫蛍光染色を示しており、直接的で階層的な方式で転写因子を連続投与した結果、β様膵系列に沿った分化転換細胞の成熟が増加することが示されている。 図９は、膵臓転写因子に誘導された肝臓から膵臓への分化転換の提示されたメカニズムの概略的な表現を示す。３種のｐＴＦの同時発現の結果、各因子の個別の効果と比較して分化転換された肝細胞の数が増加する（Ｂ）。直接的で階層的な方式で転写因子を連続して投与すると、β様膵臓系列に沿って分化転換され細胞の成熟が向上する。 図１０は、マウスのインビボでのＰｄｘ−１誘導ＩＰＣの活性化が、ＧＳ発現によって特性化される中心静脈に隣接する細胞に限定されることを示す。（Ａ）及び（Ｂ）は、Ａｄ−ＣＭＶ−ＰＤＸ−１投与後１４日のＰｄｘ−１（Ａ）及びインスリン（Ｂ）の免疫組織化学的解析である。矢印は、大半は中心静脈（ｃｖ）の近傍に位置する陽性細胞を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）は、中心静脈に隣接する１〜２細胞層におけるＧＳの発現を示す、ヒト（Ｃ）及びマウス（Ｄ）におけるＧＳ発現の解析である。倍率は元の大きさ×４０とされている。 図１１では、ＧＳＲＥが、Ｗｎｔシグナル伝達応答要素−ＴＣＦ−ＬＥＦ結合部位を含むことを示す。ＴＣＦ−ＬＥＦ及びＳＴＡＴ５結合部位の存在を示すＧＳＲＥを概略的に提示している。 図１２は、ＧＳＲＥが、インビトロでヒト肝細胞の亜集団を標的とすることを示す。（Ａ及びＤ）Ａｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−Ｐｄｘ−１またはＧＦＰ組換えアデノウイルスの概略的な表現である。肝細胞に、Ａｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−Ｐｄｘ−１（Ｃ）またはＡｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（Ｂ）を感染させた。Ｐｄｘ−１発現の免疫蛍光解析はＡｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−Ｐｄｘ−１で感染されたヒト肝細胞の１３±２％（Ｃ）、及びＡｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１で処置された細胞の７０±１２％（Ｂ）が、異所的核因子を発現したことを示した（Ｂ及びＣはそれぞれ、ウサギ抗Ｐｄｘ−１、C. Wrightからの無償提供，ピンク）。Ａｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−ｅＧＦＰを用いても類似の結果が得られた。即ち約１５％の細胞が、ｅＧＦＰに対して陽性であった（Ｅ及びＦ）。Ａｄ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ感染の結果、３〜４日以内に約７５〜８５％のｅＧＦＰ陽性細胞が得られた（データは示していない）。 図１３は、ＧＳＲＥが、分化転換傾向の細胞を標的としていることを示す。肝細胞を、５日間でＡｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−Ｐｄｘ−１（Ｂ）、またはＡｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（Ａ）に感染させた。（Ａ及びＢ）インスリン（モルモット抗インスリン、Ｄａｋｏ、緑）及びＰｄｘ−１（ウサギ抗Ｐｄｘ−１、C. Wrightからの無償提供、ピンク）の同時染色の免疫蛍光解析である。（Ｃ）処置済み細胞におけるインスリンの活性化の統計学的解析である。即ち、５０％におけるＡｄ−ＧＳＲＥ−ＴＫ−Ｐｄｘ−１活性化インスリン産生、及び５％＞だけのＰｄｘ−１陽性細胞。Ｂｌｕｅ−ＤＡＰＩ、核染色；元の大きさ×２０。 図１４は、インビトロでのＧＳＲＥ活性化ヒト細胞に対する系列追跡を示す。（Ａ）レンチウイルスベクターの概略的な表現である。（Ｂ）３〜１０代継代にある成人ヒト肝細胞に、二重レンチウイルス系を感染させた。肝細胞は、感染後１０日目に、ＤｓＲｅｄ２（赤）またはｅＧＦＰ（緑）蛍光体についてイメージングした。（Ｃ）細胞を、ｅＧＦＰに対してはフルオレセインイソチオシアネートフィルタ（５３０／３０ｎｍ）を用いて、ＤｓＲｅｄ２に対してはＰｅ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄフィルタを用いて、蛍光体活性化セルソーター（ＦＡＣＳ；Ａｒｉａセルソーター；Becton Dickinson, San Jose, CA）によって選別した。（Ｄ及びＥ）。分離された細胞を、いくつかの継代について別々に培養した（元の大きさ×１０）。 図１５は、ｅＧＦＰ＋及びＤｓＲｅｄ２＋細胞が、インビトロで類似の増殖速度及び感染能力をもって効率的に増殖することを示す。細胞の別々の集団を、約１ヶ月間別々に培養した。各グループの増殖速度を解析した（Ａ）。ｅＧＦＰ＋細胞（Ｂ及びＣ）及びＤｓＲｅｄ２＋細胞（Ｄ及びＥ）に、３日間、Ａｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ（Ｂ及びＤ）またはＡｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１を感染させた。抗Ｐｄｘ−１（青）を用いた免疫蛍光解析は、ｅＧＦＰ細胞及びＤｓＲｅｄ２＋細胞ともに概ね８０％にアデノウイルスが感染したことを示した。 図１６は、ｅＧＦＰ＋細胞が、ｐＴＦ誘導分化転換に対してＤｓＲｅｄ２＋細胞より効果的に応答することを示す。２つのグループを可溶性因子及びｐＴＦ、即ちＡｄ−Ｐｄｘ−１＋Ａｄ−Ｐａｘ−４＋ａｄ−ＭａｆＡまたは対照のウイルス（Ａｄ−β−ｇａｌ）とともに、６日間同様に処置した。β細胞様特性及び機能を、別々に分けたグループにおいて比較した。（Ａ）分子レベルで、インスリン及びグルカゴン遺伝子発現を、対照の処置細胞と比較してリアルタイム定量によって調べた。陽性対照として培養したヒト島細胞（継代３）を用いた。（Ｂ及びＣ）機能レベルで、グルコース調節されるインスリン分泌を、低濃度グルコースで、次に高濃度グルコースで静的にインキュベートすることによって、解析した（それぞれＫＲＢにおける２ｍＭ及び１７．５ｍＭグルコース）。インスリン分布（Ｂ）及びＣペプチド分泌（Ｃ）を、ヒトインスリンラジオイムノアッセイキット（ＤＰＣ：３つの異なる実験、ｎ≧８）またはヒトＣペプチドラジオイムノアッセイキット（Ｌｉｎｃｏ；３つの異なる実験からｎ≧８）を用いて測定した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定解析を利用し、ＤｓＲｅｄ２＋細胞と比較した（＊Ｐ＜０．０１）。 図１７は、ｅＧＦＰ＋集団においてより高い分化転換効率が、培地中で継代を重ねても安定して維持されることを示す。２つのグループを選別の後に別々に増殖させ、２〜３継代の後（５〜７継代後選別）、またはより多い継代数の後（１０〜１２継代後選別）ｐＴＦ（Ａｄ−Ｐｄｘ−１＋Ａｄ−Ｐａｘ−４＋ａｄ−ＭａｆＡ及び可溶性因子）で同様に処置した。調節されたインスリン分泌を、低濃度グルコースでの、その後の高濃度グルコースでのインキュベート（それぞれＫＲＢにおえる２ｍＭ及び１７．５ｍＭグルコース）によって解析した。インスリン分泌を、ヒトインスリンラジオイムノアッセイキットで測定した（ＤＰＣ；２つの異なる実験から、ｎ≧６）。両方の細胞の集団において少ない継代数と多い継代数の間で統計的に有意な差は検出されなかったが、このことは、ｅＧＦＰのタグを付された細胞が、β細胞系列及び機能に沿ったｐＴＦ誘導性分化転換を受ける持続的な傾向があることを示唆している。 図１８は、ｅＧＦＰ＋及びＤｓＲｅｄ２＋細胞の分化遺伝子発現のプロファイルを示す。これは、マイクロアレイ解析によって行い、DAVID Bioinformatics Resources 6.7に従って解析した。分化遺伝子の４％が、Ｗｎｔシグナル伝達経路に属している。 図１９は、活性Ｗｎｔシグナル伝達が、肝臓の膵臓への分化転換を促進することを示す。成人ヒト肝細胞を、前述したように、Ｗｎｔ３Ａを添加して（５０ｎｇ／ｍｌ Ｒ＆ＤまたはＤＫＫ３（３μｇ／ｍｌ Ｒ＆Ｄ）、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１及び可溶性因子で処置した。５日後、インスリン分泌を、低濃度グルコースで、次に高濃度グルコースで静的にインキュベートすることによって、解析した（それぞれＫＲＢにおける２ｍＭ及び１７．５ｍＭグルコース）。インスリン分泌は、ヒトインスリンラジオイムノアッセイキット（ＤＰＣ；３つの異なる実験から、ｎ≧８）を用いて測定し、未処置の細胞（対照：Ｃｏｎｔ）と比較する。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定解析を利用し、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１のみの場合と比較した（＊Ｐ＜０．０１）。 図２０は、Ｗｎｔシグナル伝達経路をブロックすると、ｅＧＦＰ＋細胞の分化転換が止まることを示す。ｅＧＦＰ細胞に、ＤＫＫ３（０．５μｇ／ｍｌ Ｒ＆Ｄ）を添加して、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１または対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ）で処置した。膵臓ホルモン遺伝子の発現を、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって調べ、対照の処置済み細胞と比較した。 図２１は、ｅＧＦＰ＋細胞が、ＤｓＲｅｄ２＋細胞より低いレベルのＡＰＣ及びより高いレベルの活性化βカテニンを発現することを示す。（Ａ）ＡＰＣ及びＤＫＫ１発現は、ＤｓＲｅｄ２＋細胞において顕著に高くなっている。このことから更に、これらの細胞が、ｅＧＦＰ＋細胞と比較してより高いレベルのＷｎｔシグナル伝達経路リプレッサーを発現することを示唆していると言える。２つの異なる実験（ｎ≧６）から、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定解析を利用し、ｅＧＦＰ＋細胞と比較したＤｓＲｅｄ２＋細胞において＊Ｐ＜０．０１とした。（Ｂ）ｅＧＦＰ及びＤｓＲｅｄ２陽性細胞抽出物における、活性化βカテニンに対する特異的抗体（抗ＡＢＣクローン８Ｅ７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：２０００）を用いたウェスタンブロット解析を示す。βアクチン（ＳＣ−１６１６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，１：１０００）を、正規化タンパク質として使用した。（Ｃ）βカテニンタンパク質レベルの定量を、ＩｍａｇｅＪ １．２９ｘソフトウェアを用いて行った。
転写因子（ＴＦ）は、数多くの細胞系列において分化転換を誘導することを示してきた。本明細書において、「分化転換」とは、第１の細胞タイプがその特徴的な特性を失い、その表現型が第２の細胞タイプの表現型に変化するプロセスをいう。いくつかの実施形態において、第１及び第２の細胞は、異なる組織または細胞系列に由来する。好ましくは、分化転換は、成熟した即ち分化した細胞を異なる成熟した即ち分化した細胞に変換することを含む。具体的には、転写因子（ＴＦ）が、成人の細胞の内分泌性膵臓細胞への変換（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）、神経細胞への変換（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）、造血細胞への変換（非特許文献１３）及び心筋細胞系列への変換（非特許文献１４）において指導的や役割を示すことが示唆されてきており、これは分化転換プロセスが、幅広い環境のスペクトラムにおいて生ずることを示唆している。全ての分化転換プロトコルにおいて、異所のＴＦは、潜在的な幅広い機能的で不可逆な発達プロセスに対する短期間のトリガとしての役割を果たす（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献６）。多数の研究が、個々のＴＦの異所的な発現が、他の場合には活性化しない追加の適切なＴＦの活性化を伴うプロセスにおいて、所望の代替的な能力の範囲（レパートリー）及び機能を活性化することを示唆していた。しかし、誘導されるＴＦの経時変化、相対レベル及び階層または順序は、依然として未知である。
個々の異所的なＴＦの導入による内因性転写因子（ＴＦ）の相対的な欠乏／機能不全を利用することによって、本発明は、ＴＦの階層的ネットワークによって影響を受ける連続的な時間的に制御されたプロセスとして分化転換を関連付けている。
本発明は、ＴＦに誘導された肝臓から膵臓への分化転換が、順次進行する連続的なプロセスであるという発見に基づいている。重要な点として、膵臓ＴＦの一斉同時発現ではなく、膵臓ＴＦの連続投与のみが、選択的に内分泌性膵臓内での系列特定化プログラム（lineage specification program）を動かす。直接的で階層的な方式での膵臓ＴＦの連続的発現が、β細胞系列に沿った分化転換された細胞の成熟のために必須であることが示された。具体的には、膵β細胞特異的転写因子ＭａｆＡの役割は、分化転換プロセスの最終段階において特定された。この段階では、ＭａｆＡは、Ｉｓｌ１及びソマトスタチン抑制に関連するプロセスにおいて、β細胞系列に沿って分化変換された肝細胞の成熟を促進する。
本明細書に記載した知見は、糖尿病を含む変性疾患の治療のためのＴＦ誘導成人細胞再プログラム化を用いる治療的メリットの向上に寄与し得る、転写因子媒介分化転換の基本的な経時的特性を示唆している。
Ｐｄｘ−１、ニューロＤ１、Ｎｇｎ−３、及びＰａｘ４等の膵臓転写因子（ｐＴＦ）は、肝臓から膵臓への分化転換を活性化し、各々が糖尿病のマウスにおける高血糖の改善を誘導する（非特許文献１７、非特許文献１５、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１）。更に、インビトロの成人ヒト肝細胞の実験系を用いて、本発明者は、以前に、Ｐｄｘ−１が多数のβ細胞特異的マーカーの発現を活性化し、プロセシングされたインスリンのグルコースで調節される分泌を誘導することを立証した（非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献１６）。誘導されたプロセスは、多数の重要な内因性ｐＴＦの発現に関連しており、また分化転換された成人ヒト肝細胞の糖尿病のマウスへの移植の後における、高血糖の改善が立証された（非特許文献２２）。しかし、多数の他の研究により、いくつかの重要なＴＦの組み合わせを用いると、再プログラム化効率が、個々のＴＦの異所的な発現によって誘導される場合と比較して上昇することが示された（非特許文献２１、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２５、非特許文献２９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。このことは、効率的な分化転換プロセスのために必要とされる十分なレベルまで内因性の補完的ＴＦを活性化させる、個々の異所的因子の潜在的な制限された能力を示唆している（非特許文献２１、非特許文献２９、非特許文献１１、非特許文献１２）。膵臓器官形成中の膵臓転写因子の標的化された（targeted）破壊または経時的な誤発現は、島細胞の分化及び機能とともに膵臓の発達を妨げる（非特許文献３０）。個々の異所のＴＦによる内因性ＴＦ群誘導の相対的な欠乏を利用することにより、本発明は、ＴＦ群の階層的なネットワークによって影響を受ける連続的な時間的に制御されたプロセスとしての分化転換に関連付けられている。
膵臓の特定化は、ホメオボックス転写因子Ｐｄｘ１によって開始され、Ｐｄｘ１は、成人におけるβ細胞の機能のためにも必要である（非特許文献３１、非特許文献３０）。次いで、内分泌分化が、塩基性へリックス・ループ・へリックス構造の因子Ｎｇｎ３によって媒介される（非特許文献３２）。対をなすホメオボックス構造の因子Ｐａｘ４及びＡｒｘは、分化内分泌細胞タイプの分離において重要な因子として関連している（非特許文献３３、非特許文献３４）。β細胞系列及び機能に沿った最終的な成熟は、成人の膵臓におけるβ細胞にあるＭａｆＡの選択的発現に起因する（非特許文献３５）。
本発明は、ヒト肝細胞を直接的に分化転換して、全く異なる細胞タイプ、β細胞を含む膵臓ホルモン産生細胞を生成することができるという驚くべき発見に部分的に基づくものである。時間的に制御された順序で選択転写因子を投与すると、成人肝細胞から機能的な成熟β細胞への分化転換が誘導された。本発明は、成人の細胞を増殖し分化転換するための方法を提供することによって、インスリン産生細胞即ち膵β細胞の大集団を生成するという課題を解決する。その選択転写因子または生成された分化転換された膵細胞を含む組成物は、本明細書に記載の方法を用いて膵臓疾患の治療のために用いることができる。
非膵臓細胞から膵臓細胞、例えばβ細胞へ分化転換する従来の試みでは、ただ１種類の転写因子または、複数の膵臓転写因子の一斉即ち同時投与を利用している。本明細書に記載の本発明は、各時点で定められた特定の転写因子の順序付けられた連続的な投与の為の方法を提供する。更に、本明細書に記載の方法は、個々の転写因子単独で誘導される場合と比較して分化転換効率を実質的に向上させる。
本発明は更に、向上した分化転換効率を有する細胞の集団を提供する。これらの細胞は、（１）潜在的細胞膜マーカー、（２）グルタミンシンセターゼ応答要素（ＧＳＲＥ）を活性化する能力を有すること、及び（３）活性Ｗｎｔシグナル伝達を独特に備えていることによって特性化される。細胞の集団の少なくとも３０％の細胞が、ＧＳＲＥを活性化できる。例えば、その細胞は内皮細胞、上皮細胞、間葉細胞、線維芽細胞、または肝細胞である。好ましくは、その細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、膵臓系列に沿って膵臓の機能を有する成熟膵臓細胞に分化転換され得る。他の実施形態では、その細胞は、神経系列に沿って神経細胞に分化転換され得る。
従って、本発明は、限られた効率しか有していないことが多かった従来の分化転換即ち再プログラム化プロトコルの問題も解決する。例えば、重要な膵臓転写因子の異所的な発現は、各ホスト細胞における発現を生じさせるが、最大１５％の細胞しか、うまく分化転換されて膵臓機能を示すようにならない。
本発明は、増強された、または向上された分化転換能力を有する細胞の集団を単離するための方法も提供する。例えば、これらの細胞を単離するための一方法は、グルタミンシンセターゼ調節エレメントまたはその断片に機能可能的にリンクされたＧＦＰ発現を活性化する細胞を選別することによって、ＧＳＲＥを活性化できる細胞を単離することにより実施される。細胞はＦＡＣＳによって選別されてもよく、増強された分化転換能力を有する細胞の高速発現のために、残りの細胞とは分けて、培地で増殖させることができる。増強された分化転換能力を有する細胞の集団は、インビボの組織を構成する細胞のなかに小さい比率でしか存在しない。例えば、ある一定の組織または細胞の集団において、増強された分化転換の能力を有する細胞の集団は、ある一定の組織の全細胞集団のなかの約１％、２％、３％、４％、５％、約１０％、約１５％未満にすぎない。従って、本発明は、増強された分化転換の能力を有していない細胞から向上した分化転換の能力を有する前記細胞を単離するための方法も提供する。このように、本発明は、種々の病気や疾患の治療のための分化転換された細胞を提供するために分化転換の効率を向上させる、向上した分化転換能力を有する細胞をより大きい比率で有する細胞の集団の有利な効果を提供する。
本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、本明細書に記載した方法に対して種々の変更や改変を加え得ることは当業者には明らかであろう。
膵β細胞を製造する方法
本発明は、成体哺乳動物非膵臓細胞を、特定の時点で、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ニューロＤ１、及びＭａｆＡ等の膵臓転写因子に接触させることによって、成熟膵β細胞の表現型を示す細胞を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、成体哺乳動物の非膵臓細胞を、第１の期間においてＰＤＸ−１に接触させるステップと、その細胞を、第２の期間においてＰａｘ−４に接触させるステップと、第２のステップからの細胞を、第３の期間においてＭａｆＡに接触させるステップとを含む。一実施形態では、前記方法は、成体哺乳動物の非膵臓細胞を、第１の期間においてＰＤＸ−１に接触させるステップと、その細胞を、第２の期間においてニューロＤ１に接触させるステップと、第２のステップからの細胞を、第３の期間においてＭａｆＡに接触させるステップとを含む。別の実施形態では、前記方法は、成体哺乳動物の非膵臓細胞を、第１の期間においてＰＤＸ−１及び第２の転写因子に接触させるステップと、その細胞を、第２の期間においてＭａｆＡに接触させるステップとを含む。転写因子は、ポリペプチド、転写因子ポリペプチドをコードするリボ核酸または核酸であり得る。例えば、ＰＤＸ−１と一緒に提供される転写因子は、Ｐａｘ−４、ニューロＤ１、Ｎｇｎ３、またはＳｏｘ−９である。好ましくは、転写因子はニューロＤ１である。
一態様では、本明細書に記載の方法は、上記のいずれかのステップの後または前に細胞を転写因子Ｓｏｘ−９に接触させるステップを更に含む。
一態様では、第２の期間は、第１の期間の後少なくとも２４時間である。一態様では、第３の期間は、第２の期間の後少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態では、第２の期間及び第３の期間は、それぞれ第１の期間、第２の期間の後の少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、及び少なくとも１週間か、またはそれ以上の期間であり得る。
本発明において使用するための転写因子は、ポリペプチド、リボ核酸、または核酸であり得る。本明細書において、用語「核酸」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、または他のＲＮＡ誘導体）、ヌクレオチド類似体を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、誘導体、及びその断片及びホモログを含む意味で用いられる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。好ましくは、核酸はＤＮＡである。
本発明の方法で用いるための好ましい転写因子は、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ニューロＤ１、及びＭａｆＡである。使用され得る他の転写因子はＮｇｎ３、及びＳｏｘ９である。
ホメオドメインタンパク質ＰＤＸ−１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子−１）は、ＩＤＸ−１、ＩＰＦ−１、ＳＴＦ−１、またはＩＵＦ−１としても知られ、膵島の発達と機能の調節において中心的な役割を果たす。ＰＤＸ−１は、例えばインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、プロインスリン転換酵素ｌ／３（ＰＣｌ／３）、ＧＬＵＴ−２、及びグルコキナーゼ等の種々の遺伝子の膵島細胞特異的発現に対し直接的かまたは間接的かのいずれかの形で関与する。更に、ＰＤＸ−１は、グルコースに応答したインスリン遺伝子転写を媒介する。ＰＤＸ−１をコードする核酸の適切なソースとしては、例えば、ヒトＰＤＸ−１核酸（及びコードされたタンパク質配列）が挙げられ、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ３５６３２及びＡＡＡ８８８２０として入手可能である。他のソースとしては、ラットＰＤＸ核酸及びタンパク質配列が挙げられ、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ３５６３２及びＡＡＡ１８３５５として入手可能であり、引用により、これらの核酸及びタンパク質配列の内容は本明細書の一部とする。更に別のソースとしては、ゼブラフィッシュＰＤＸ−１核酸及びタンパク質配列が挙げられ、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ０３６３２５及びＡＡＣ４１２６０として入手可能であり、引用により、これらの核酸及びタンパク質配列の内容は本明細書の一部とする。
Ｐａｘ−４は、ペアードボックス４、ペアードボックスタンパク質４、ペアードボックス遺伝子４、ＭＯＤＹ９、及びＫＰＤとしても知られ、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチンプロモーターのなかのエレメントに結合する膵臓特異的転写因子であり、膵島β細胞の分化と発達において重要な役割を果たすと考えられる。いくつかの細胞に関連して、Ｐａｘ−４は、リプレッサー活性を示す。Ｐａｘ−４をコードする核酸の適切なソースとしては、例えば、ヒトＰａｘ−４核酸（及びコードされたタンパク質配列）が挙げられ、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００６１９３．２及びＡＡＤ０２２８９．１として入手可能である。
ＭａｆＡは、Ｖ−ｍａｆ筋腱膜線維肉腫がん遺伝子ホモログＡまたはＲＩＰＥ３Ｂ１としても知られ、β細胞特異的でグルコースで調節されるインスリン遺伝子発現の転写活性化因子である。ＭａｆＡは、β細胞の機能及び発達並びに糖尿病の発症に関与し得る。ＭａｆＡをコードする適切なソースとしては、例えばヒトＭａｆＡ核酸（及びコードされたタンパク質配列）が挙げられ、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿２０１５８９．３及びＮＰ＿９６３８８３．２として入手可能である。
ニューロｇ３は、ニューロゲニン３またはＮｇｎ３としても知られ、膵臓及び腸における内分泌発達のために必要な塩基性へリックス・ループ・へリックス（ｂＨＬＨ）転写因子である。ニューロｇ３をコードする核酸の適切なソースとしては、例えばヒトニューロｇ３核酸（及びコードされたタンパク質配列）が挙げられ、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０２０９９９．３及びＮＰ＿０６６２７９．２として入手可能である。
ニューロＤ１は、Ｎｅｕｒｏ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １としても知られ、β２（β）は、ニューロＤタイプ転写因子である。それは、他のｂＨＬＨタンパク質とヘテロダイマーを形成し、Ｅ−ｂｏｘとしても知られる特定のＤＮＡ配列を含む遺伝子の転写を活性化する塩基性へリックス・ループ・へリックス転写因子である。これは、インスリン遺伝子の発現を調節し、この遺伝子の変異により２型糖尿病になる。ニューロＤ１をコードする核酸の適切なソースとしては、例えばヒトニューロＤ１核酸（及びコードされたタンパク質配列）が挙げられ、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００２５００．４及びＮＰ＿００２４９１．２として入手可能である。
Ｓｏｘ９は、胚発生に関与する転写因子である。Ｓｏｘ９は、特に、骨及び骨格の発達におけるその重要性について研究されてきた。ＳＯＸ−９は、ＨＭＧボックスクラスＤＮＡ結合タンパク質の他のメンバーとともに配列ＣＣＴＴＧＡＧを認識する。本発明の関連では、Ｓｏｘ−９の使用は、分化転換の前または後のいずれかにおいて、膵臓前駆細胞塊の維持に関与し得る。ニューロＤ１をコードする核酸の適切なソースとしては、例えばヒトニューロＤ１核酸（及びコードされるタンパク質配列）が挙げられ、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００３４６．３及びＮＰ＿０００３３７．１として入手可能である。
細胞は、膵臓ホルモンを産生し得るあらゆる細胞、例えば骨髄、筋肉、脾臓、腎臓、血液、皮膚、膵臓、または肝臓の細胞であり得る。一実施形態では、細胞は非膵臓細胞である。一実施形態では、細胞が、膵島細胞として機能することができ、即ち細胞外トリガを受けて、膵臓ホルモン、好ましくはインスリンの貯蔵、プロセシング、及び分泌が可能である。別の実施形態では、細胞は肝細胞である。更に別の実施形態では、細胞は分化全能性または多能性である。代替的実施形態では、細胞は、造血幹細胞、胚幹細胞、または好ましくは肝幹細胞である。
化合物（即ち、ＰＤＸ１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１及び／またはＳｏｘ−９ポリペプチド、またはＰＤＸ１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１及び／またはＳｏｘ−９をコードする核酸）に曝される、即ち接触される細胞の集団は、任意の数の細胞、即ち１つまたはそれ以上の細胞であり得、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで提供され得る。転写因子に接触される細胞の集団は、転写因子に接触される前にインビトロで増殖され得る。成熟膵β細胞表現型を示す細胞の集団が製造される。これらの細胞は、β細胞系列に沿った分化転換及び成熟の前で、かつそれを必要とする患者または対象に投与または供給される前に、既知の方法によってインビトロで増殖され得る。
対象は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒトの霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得る。
いくつかの実施形態では、転写因子は、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９、或いはその組み合わせ等のポリペプチドであり、当分野で公知の方法により細胞に供給される。例えば、転写因子ポリペプチドは直接細胞に供給されるか、または微小粒子またはナノ粒子、例えばリポソーム型担体を介して供給される。
いくつかの実施形態では、転写因子は核酸である。例えば、その核酸は、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９ポリペプチドをコードする。転写因子をコードする核酸またはそのような核酸の組み合わせは、当分野で公知の任意の手段によって細胞に供給され得る。いくつかの実施形態では、核酸は、発現ベクターまたはウイルスベクターに組み込まれる。好ましくは、ウイルスベクターは、アデノウイルスのウイルスベクターである。発現ベクターまたはウイルスベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染、または形質導入のいずれかによって細胞に導入され得る。
［分化転換する傾向を有する細胞の集団］
本発明は、分化転換する傾向を有する（predisposed for transdifferentiation）肝臓由来の細胞の集団を提供する。その細胞の集団は、本願の膵β細胞を製造する方法において有用である。本発明の分化転換する傾向を有する細胞は、向上したまたは増強された分化転換能力を有するものとも表現される。「向上した分化転換能力」という表現は、本発明の細胞の集団が分化プロトコルを施された（即ち、膵臓転写因子の導入）とき、１５％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、または８０％超が、別の細胞タイプに分化することを意味する。例えば、向上した分化転換能力を有する内皮細胞、上皮細胞、間葉細胞、線維芽細胞、または肝細胞の集団は、成熟膵臓細胞または成熟神経細胞に分化され得る。
別の実施形態では、分化転換する傾向を有する細胞の集団は、グルタミンシンセターゼ応答要素（ＧＳＲＥ）を活性化する能力を有する。例えば、本発明の細胞の集団において、その集団の細胞の少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＧＳＲＥを活性化することができる。好ましくは、集団における細胞の少なくとも３０％が、ＧＳＲＥを活性化する能力を有する。グルタミンシンセターゼは、主に脳、腎臓、肝臓において発現される酵素であり、グルタミンを形成するためのグルタミン酸塩及びアンモニアの縮合を触媒することによる窒素の代謝において必須の役割を果たす。グルタミンシンセターゼは、例えば、中心周辺肝細胞及び脳の星状膠細胞において独特に発現される。本明細書に提示するデータは、ＧＳＲＥの活性化を示す細胞は、分化転換する傾向を有する細胞の単離のための独特の選択パラメータを提供する。
ＧＳＲＥの活性化は、当業者に周知の方法によって測定することができる。例えば、プロモーターに機能可能的にリンクしたグルタミンシンセターゼ応答エレメントと、蛍光タンパク質等のリポーター遺伝子を含む組換えアデノウイルスを生成することができる。このＧＳＲＥリポーターを有する組換えアデノウイルスを、いくつかの分化転換する傾向を有する細胞の集団を含む異種細胞の混合物に導入することができる。ＧＳＲＥの活性化についてコンピテントなこれらの細胞は、リポーター遺伝子を発現することになり、これは当分野で公知の方法によって検出することができ、それによって分化転換する傾向を有する細胞を特定することができる。
異種細胞の集団であって、分化転換する傾向を有する細胞が未知であるものを、最小ＴＫプロモーター及びｅＧＦＰに機能可能的にリンクしたＧＳＲＥを含むアデノウイルスベクターに接触させることができる。ＧＳＲＥを活性化し得る細胞は、ＧＦＰを発現することになり、ＧＦＰ発現を検出するための当分野で公知の種々の方法によって特定することができる。例えば、分化転換する傾向のない細胞からの分化転換する傾向を有するＧＳＲＥ活性化細胞の分離は、ＦＡＣ装置、ソーター、及び当業者に周知の技術によって達成することができる（図１４）。次いで、分離された分化転換する傾向を有する細胞をインビトロで繁殖または増殖させることができる。本明細書に開示した実験結果は、５〜１２継代またはそれ以上にわたって分化転換する傾向を有する細胞を継代させたものが、それらの分化転換能力を保持していることを立証している。例えば、単離された分化転換する傾向を有する肝細胞は、培地で１２継代させた後でさえグルコース応答性のインスリンの産生と分泌を継続している（図１７）。
別の実施形態では、分化転換する傾向を有する細胞の集団が、活性Ｗｎｔシグナル伝達経路も有する。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、体軸パターン形成、細胞増殖、及び細胞移動において、並びに発達中の細胞の運命及び幹細胞の多能性において重要な役割を果たす。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔタンパク質リガンドの、フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）（Ｆｚ）ファミリーリポーター（Ｇ結合タンパク質レセプター）への結合によって、また選択に応じてコレセプタータンパク質を活性化し、その後のディシブルド（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）（Ｄｓｈ）と呼ばれる細胞質タンパク質の活性化によって活性化される。標準的なＷｎｔシグナル伝達経路において、コレセプターＬＲＰ−５／６も活性化され、βカテニンは細胞質に蓄積し、結局は細胞核に移行されて、ＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子の転写個アクチベーター（補助活性化）因子として作用する。Ｗｎｔシグナル伝達経路がないと、タンパク質のアデノマトシス・ポリポシス・コリ（ＡＰＣ）、アキシン、プロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）、及びカゼインキナーゼ１α（ＣＫ１α）を含む破壊的複合体が、ユビキチン化、及びその後のそのプロテアソームによる分解のためにβカテニンを標的とする。しかしＷｎｔ結合によるフリズルド・レセプターの活性化が、破壊的複合体の破壊を引き起こし、それによってβカテニンが蓄積できるようにする。
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、異なるコレセプタータンパク質を利用し、異なるダウンストリームエフェクターを活性化して、例えば細胞骨格の調節、小胞体からのカルシウム放出の刺激、ｍＴＯＲ経路の活性化、及び筋形成の調節を行う非標準的経路を介しても発生し得る。
当業者であれば、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化を決定するために当分野で公知の方法を用いることができるであろう。例えば、Ｗｎｔ３ａを発現する細胞、ＤＫＫ１またはＤＫＫ３のレベルの低下、ＡＰＣのレベルの低下、活性化βカテニンレベルの上昇、またはＳＴＡＴ３結合エレメントは、活性Ｗｎｔシグナル伝達経路を有する。ＤＫＫ１、ＤＫＫ３、及びＡＰＣは、既知のＷｎｔシグナル伝達経路のインヒビターである。活性Ｗｎｔシグナル伝達経路を示す他のシグナリングエフェクターも、当分野ではよく知られている。
好ましくは、前記細胞の集団は、膵臓系列に分化転換する傾向を有し、分化転換された細胞が膵臓の表現型と機能を示すものである。例えば、分化転換された細胞は成熟β細胞の機能及び表現型を示し、それは、限定しないが、膵臓ホルモンの発現、産生、及び／または分泌を含む、膵臓ホルモンは、限定しないが、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、または膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）を含み得る。インスリンは、肝臓インスリンまたは血清インスリンであり得る。好ましくは、インスリンは、グルコース利用の促進、及び炭水化物、脂肪及びタンパク質代謝を促進する能力を有する完全プロセシングされた形態のインスリンである。例えば、分化転換する傾向を有する細胞は、異種インビトロ主要ヒト肝臓細胞の培地における全細胞の約１５％を含み得る。細胞がｐＴＦを異所的に発現する場合、培地の細胞の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％超がインスリンを産生するか、ｃ−ペプチドを分泌する。
一実施形態では、分化転換する傾向を有する細胞の集団は、肝臓の中心静脈に近接して位置する、或いは中心周辺肝細胞である。本明細書に示すように、ＰＤＸ−１等の膵臓転写因子を異所的に発現する肝細胞の４０〜５０％以上は、ｐＴＦ発現の後に細胞群の一部のみがインスリンを産生した。これらのインスリン産生細胞（ＩＰＣ）は、図１Ｂに示すように、主として腹部静脈に近接した位置に存在した。これらの細胞は、グルタミン合成酵素の発現及び活性Ｗｎｔシグナル伝達によっても特徴付けられる。
別の好ましい実施形態では、本発明の細胞の集団は、神経系列に分化転換する傾向を有するものであって、分化転換された細胞は神経マーカーを発現し、神経の表現型を示し、または神経の機能を示す。分化転換された細胞は、神経細胞またはグリア細胞であり得る。
別の実施形態では、向上した分化転換する傾向を有する細胞が、特定の細胞表面マーカーによって特定され得る。例えば、高いレベルのＨＯＭＥＲ１、ＬＡＭＰ３、またはＢＭＰＲ２を有する細胞は、分化転換する傾向を有さない細胞と比較して向上した分化転換能力を有する細胞であることを示す。低いレベルのＡＢＣＢ１、ＩＴＧＡ４、ＡＢＣＢ４、またはＰＲＮＰを有する細胞は、分化転換する傾向を有さない細胞と比較して向上した分化転換能力を有する細胞であることを示す。本明細書に記載した細胞表面マーカーの任意の組み合わせを用いて、分化転換する傾向を有さない細胞の集団から分化転換する傾向を有する細胞の集団を識別することができる。これらの細胞表面に対する抗体は市販されている。分化転換能力を有さない細胞から向上した分化転換能力を有する細胞を識別するために、当分野で公知のイムノアッセイまたは免疫アフィニティ技術を利用することができる。
膵臓細胞表現型を示す細胞を産生する本発明の細胞の集団を使用することにより、膵臓細胞表現型を示す細胞を産生する異種非膵臓細胞の集団を分化させることについて、一定の有利さが得られる。以前の研究では、異種非膵臓細胞の集団（即ち肝細胞の集団）においてＰＤＸ−１等の膵臓転写因子（ｐＴＦ）を発現させることで、最大でＰＤＸ１−１発現細胞の１５％しか、インスリンの産生についてコンピテントでないことが判明したことが記載されている。従って、細胞の集団中の１５％しか、膵臓ホルモンを産生、分泌する能力を有する成熟膵β細胞に分化させることに成功できなかった。対照的に、本発明の細胞の集団にｐＴＦを導入すると、細胞の集団中の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％が、成熟膵β細胞表現型に分化し、インスリン、グルカゴンを産生し、及び／またはｃ−ペプチドを分泌する。好ましくは、本発明の細胞の集団の細胞が膵臓転写因子を発現するとき、細胞の少なくとも３０％がインスリンを産生するか、ｃ−ペプチドを分泌する。
［分化転換の方法］
本発明は、開始細胞の集団とは異なる表現型を有する、成熟した分化した細胞タイプを示す細胞を生成するための向上した分化転換能力を有する細胞の集団を利用する方法も提供する。例えば、向上した分化転換能力を有する細胞の集団（即ち、上皮細胞、線維芽細胞または肝細胞）は、膵臓または神経系列に沿った細胞に分化されて、成熟した分化された膵臓または神経細胞表現型を示すことができる。任意の、当分野で既知の、膵臓または神経系列に細胞を分化させるための手段を利用することができる。
一実施形態では、分化転換する傾向を有する細胞の集団は、神経転写因子の発現を介して神経系列に沿って分化され得る。適切な神経転写因子は、当分野で公知である。他の実施形態では、本発明の細胞の集団が、細胞を、種々のサイトカイン、成長因子、または当分野で公知の他の薬剤に接触させて細胞を神経系列に分化させることによって、成熟神経細胞に分化され得る。分化された神経細胞は神経マーカーを発現し、神経の表現型（即ち神経遺伝子発現プロファイル）を示し、神経の機能を示す。分化された細胞は、神経細胞またはグリア細胞であり得る。
別の実施形態では、分化転換する傾向を有する細胞の集団は、膵臓転写因子の発現を介して膵臓系列に沿って分化され得る。膵臓転写因子は、例えばＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはその組み合わせである。膵β細胞の製造方法は、米国特許第６７７４１２０号明細書（特許文献１）及び米国特許出願公開第２００５／００９０４６５号明細書（特許文献２）に記載されており、これらの特許文献の内容は、引用により本明細書の一部とする。
別の実施形態では、分化転換する傾向を有する細胞の集団は、本明細書に記載の方法によって膵臓系列に沿って分化され得る。
［膵β細胞表現型］
本明細書で提示される方法は、成熟膵β細胞の表現型または機能を有する細胞を作り出す。「膵β細胞の表現型または機能」という表現は、その細胞が細胞β細胞に典型的な１つまたは複数の特性、即ち膵臓ホルモンの産生、プロセシング、分泌顆粒における貯蔵、ホルモン分泌、膵臓遺伝子プロモーターの活性化、または特徴的なβ細胞遺伝子発現プロファイルを示すことを意味する。ホルモン分泌は、栄養的に及び／またはホルモン的に調節される分泌を含む。好ましくは、製造される細胞は、本明細書に記載されたような膵β細胞表現型または機能を少なくとも１つ示す。
膵臓ホルモンは、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）であり得る。インスリンは、肝臓インスリンまたは血清インスリンであり得る。別の実施形態では、膵臓ホルモンは肝臓インスリンである。代替的実施形態では、膵臓ホルモンは、血清インスリン（即ち、例えば、グルコースの利用、炭水化物、脂肪、及びタンパク質の代謝を促進する能力を有する完全にプロセシングされた形態のインスリン）である。
いくつかの実施形態では、膵臓ホルモンは「プロホルモン」形態である。他の実施形態では、膵臓ホルモンは、完全にプロセシングされた生物学的に活性な形態のホルモンである。他の実施形態では、膵臓ホルモンは、調節管理下にあり、即ちホルモンの分泌が、内生膵臓ホルモンと同様に栄養的及びホルモン的な制御の下にある。例えば、本発明の一態様では、ホルモンはグルコースの調節管理下にある。インスリン分泌は、例えばＣペプチドのプロセシング及び分泌によって測定することもできる。
膵β細胞表現型は、例えば、膵臓ホルモン産生、即ちインスリン、ソマトスタチン、またはグルカゴンタンパク質ｍＲＮＡまたはタンパク質発現を測定することによって決定することができる。ホルモンの産生は、当分野で公知の方法、即ち、イムノアッセイ、ウェスタンブロット、レセプター結合アッセイによって決定することができ、または糖尿病のホストに移植したときの高血糖を改善する能力によって機能的に決定することができる。
いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に特定された方法を用いてインスリンを産生、分泌するように誘導され得る。細胞のインスリンを産生する能力は、当業者に公知の種々の方法によってアッセイすることができる。例えば、インスリンｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって検出でき、或いはインスリンを、インスリンに対して産生される抗体によって検出することもできる。加えて、膵臓分化の他のインジケータとして、遺伝子Ｉｓｌ−１、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、及びＧｌｕｔ−２の発現が挙げられる。他の膵島細胞の特定のための表現型マーカーは、米国特許出願公開第２００３／０１３８９４８号明細書（特許文献３）に開示されており、当該特許文献の内容は、引用により本明細書の一部とする。
膵β細胞表現型は、例えば、膵臓特異的遺伝子のプロモーター活性化によって決定することができる。特定の興味の対象の膵臓特異的プロモーターは、インスリン及び膵臓転写因子、即ち内因性ＰＤＸ−１のためのプロモーターを含む。プロモーターの活性化は、当分野で公知の方法、例えばルシフェラーゼアッセイ、ＥＭＳＡ、ダウンストリーム遺伝子発現の検出により決定できる。
いくつかの実施形態では、膵β細胞表現型は、膵臓遺伝子発現プロファイルの誘導によって決定することもできる。「膵臓遺伝子発現プロファイル」という表現は、非内分泌組織では通常転写されない１つまたは複数の遺伝子の発現、即ち膵臓転写因子、膵臓酵素、または膵臓ホルモンの発現を含むことを意味する。膵臓酵素は、例えば、ＰＣＳＫ２（ＰＣ２即ちプロホルモン転換酵素）、ＰＣｌ／３（プロホルモン転換酵素ｌ／３）、グルコキナーゼ、グルコース輸送タンパク質２（ＧＬＵＴ−２）である。膵臓特異的転写因子は、例えば、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｐａｘ−４、Ｐａｘ−６、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、 ニューロＧ３、Ｎｇｎ３、β−２、ＡＲＸ、ＢＲＡＩＮ４及びＩｓｌ−１である。
膵臓遺伝子発現プロファイルの誘導は、当業者によく知られた技術を用いて検出できる。例えば、膵臓ホルモンＲＮＡ配列は、ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析、増幅をベースにした検出方法（例えば、逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応法またはマイクロアレイチップによるシステム的検出）において検出できる。代替的に、発現は、タンパク質レベルで、即ちその遺伝子でコードされるポリペプチドのレベルを測定することによって測定することもできる。特定の実施形態では、ＰＣｌ／３遺伝子またはタンパク質発現が、プロホルモンの活性成熟形態へのプロセシングにおけるその活性によって決定できる。そのような方法は当分野で公知であり、例えば、遺伝子によってコードされたタンパク質に対する抗体をベースにしたイムノアッセイ、またはプロセシングされたプロホルモンのＨＰＬＣが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成された成熟β細胞表現型を示す細胞が、元の細胞の少なくとも１つの遺伝子または遺伝子発現プロファイルを抑制し得る。例えば、成熟β細胞表現型を示すように誘導された肝細胞は、少なくとも１つの肝臓特異的遺伝子を抑制する。当業者は、当分野で公知の方法を用いて、即ちｍＲＮＡのレベルまたは遺伝子によってコードされるポリペプチドを測定することによって、元の細胞及び製造された細胞の肝臓特異的遺伝子発現を容易に決定することもできる。比較を行うと、肝臓特異的遺伝子発現の減少は、分化転換が生じたことを示すことになる。
［膵臓疾患の治療方法］
本発明は、対象における膵臓疾患の治療方法、即ち発症の予防または遅延、或いは症状の軽減における使用方法を開示する。例えば、膵臓疾患は変性膵臓疾患である。本明細書に開示される方法は、膵臓細胞（例えば、膵島β細胞）の消失、または膵臓細胞の機能の消失によって引き起こされる、またはそれらの消失をもたらす膵臓疾患のために特に有用である。
一般的な変性膵臓疾患としては、限定しないが、糖尿病（例えば、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病）及び膵臓癌等が挙げられる。本発明の方法を用いて治療され得る他の膵臓疾患または膵臓関連疾患には、例えば高血糖症、膵炎、膵臓偽嚢胞、または外傷によって生ずる膵臓の損傷がある。
糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病の３つの形態が見いだされている代謝異常である。１型糖尿病（またはＩＤＤＭ）は自己免疫疾患であり、免疫系が膵臓のインスリン産生β細胞を破壊し、膵臓のインスリンを産生する能力を低減または除去してしまう。１型糖尿病の患者は、生命を維持するためにインスリンサプリメントを毎日取らなければならない。症状は、典型的には急速に発現し、のどの渇きの及び排尿頻度の増加、慢性の空腹感、体重減少、かすみ目、及び疲労等が挙げられる。２型糖尿病は、糖尿病患者の９０〜９５％を占める、最も一般的な糖尿病である。２型糖尿病は、高齢化、肥満、家族歴、妊娠糖尿病の既往、運動不足、及び民族性に関連している。妊娠糖尿病は、妊娠時のみに起こる。妊娠糖尿病を発症する女性は、２０〜５０％の確率で５〜１０年以内に２型糖尿病を発症する。
糖尿病を患うまたは糖尿病を発症するリスクのある対象は、血中グルコースレベルの血糖等の当分野で公知の方法により特定される。例えば、一晩絶食後に少なくとも２回の採血で血中グルコース値が１４０ｍｇ／ｄＬを超えることはその人間が糖尿病であることを意味する。糖尿病を患っていないまたは糖尿病を発症するリスクのない対象は、絶食後血糖値として７０〜１１０ｍｇ／ｄＬを有することで特徴付けられる。
糖尿病の症状としては、疲労、吐き気、頻尿、過剰なのどの渇き、体重減少、かすみ目、頻発する感染症、創傷または痛みの治癒の遅れ、常に１４０／９０以上の血圧、３５ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬコレステロール値、２５０ｍｇ／ｄＬ超のトリグリセリド値、低血糖、インスリン欠乏またはインスリン抵抗性等が挙げられる。化合物が投与される糖尿病のまたは前糖尿病状態の患者は、当分野で公知の診断方法を用いて特定される。
高血糖症は、過剰な量のグルコースが血漿中に循環する膵臓関連疾患である。これは、一般的には（２００ｍｇ／ｄＬ）より高いグルコースレベルである。高血糖症の患者は、糖尿病を有する場合もあれば、有さない場合もある。
膵臓癌は米国では４番目に多い癌であり、主として６０才以上の人達に起こり、あらゆる癌のなかで５年生存率が最も低いものである。膵臓癌の最も一般的なタイプである腺癌は、膵管の内側で起こり、嚢胞腺癌及び腺房細胞癌は比較的まれである。しかし、良性腫瘍も膵臓内で増殖し、これには、インスリノーマ（即ちインスリンを分泌する腫瘍）、ガストリノーマ（通常より高いレベルのガスとリンを分泌する）、及びグルカゴノーマ（グルカゴンを分泌する腫瘍）等が挙げられる。
膵臓癌は、原因が分かっていないが、糖尿病、喫煙、及び慢性膵炎を含むいくつかのリスク要素がある。症状としては、上腹部疼痛、食欲減退、黄疸、体重減少、消化不良、吐き気または嘔吐、下痢、疲労、掻痒、または腹部器官の肥大等を挙げることができる。診断は、超音波、コンピューター断層撮影、磁気共鳴イメージング、ＥＲＣＰ、経皮経肝的胆管造影、膵生検、または血液検査によってなされる。治療には、外科手術、放射線療法または化学療法、痛みや掻痒のための投薬、経口酵素製剤またはインスリン処置等が含まれ得る。
膵炎は、膵臓の炎症及び自己消化である。自己消化では、膵臓はそれ自身の酵素によって破壊され、これが炎症を起こす。急性膵炎は、一般的にはただ一回だけ発症し、その後膵臓は正常に戻る。しかし、慢性膵炎は、膵臓及び膵臓の機能に永久的な損傷を与え、線維症をもたらし得る。或いは、それは数回の発症の後に消散することもある。膵炎は、最も多くの場合、胆石が膵管を塞ぐことによって、または小膵管を閉塞させ得るアルコール乱用によって起こる。他の原因としては、腹部外傷または外科手術、感染症、腎不全、紅斑性狼瘡、嚢胞性線維症、腫瘍またはサソリの有毒針が挙げられる。
膵炎に高頻度で関連する症状としては、腹痛、背部または胸部への放散痛、吐き気または嘔吐、頻脈、発熱、上腹部膨満、腹水、血圧低下、または軽度の黄疸等が挙げられる。症状は、膵炎に関連するものとして特定される前に他の疾病に起因するとされることもある。
［神経疾患の治療方法］
本発明は、神経変性疾患等の神経障害または神経疾患を患う対象の治療方法も提供する。本明細書に開示する細胞の集団は、神経細胞の消失または神経の機能の消失によって特徴付けられる神経障害または神経疾患の対象を、変性または非機能性細胞を補充することによって治療するために有用である。本明細書に開示する方法を用いて治療され得る神経変性疾患としては、限定しないが、パーキンソン病、パーキンソン障害、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、レビー小体病、加齢に関連する神経変性、神経癌、及び手術、事故、虚血、または脳卒中に起因する脳損傷等が挙げられる。本明細書に開示する細胞の集団は、神経機能を有する神経細胞の集団に分化させることが可能で、分化された神経細胞の集団を、神経障害または神経疾患の対象に投与することができる。
［治療用組成物］
本明細書に記載の分化転換誘導化合物、即ち異所性膵臓転写因子（即ち、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９ポリペプチド、またはＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９ポリペプチドをコードするリボ核酸、または核酸）が、治療的に用いられる場合、「治療薬物」と称する。治療薬物の投与方法としては、限定しないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口の経路の投与が挙げられる。本発明の治療薬物は、例えば、注射またはボーラス注射による、上皮または粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を介しての吸収による等のいずれかの便利な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と同時投与することも可能である。投与は全身投与または局所投与であり得る。加えて、治療薬物を、脳室内注射及び髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって中枢神経系に投与することが有益であり得る。脳室内注射は、リザーバ（例えばオマヤ槽）に取り付けられた脳室内カテーテルによって容易になり得る。経肺投与も、吸入器またはネブライザー、及びエアロゾル化剤を有する製剤を用いることにより利用することができる。治療を必要とする領域への局所的な治療薬物の投与が望ましいこともあり得、この局所的投与は、限定しないが、外科手術中の局所注入により、局所適用により、注射により、カテーテルによって、坐薬によって、またはインプラントによって達成され得る。種々の送達システムが知られており、本発明の治療薬物を投与するために用いることができ、例えば、（ｉ）リポソーム、微小粒子、マイクロカプセルへの封入、（ｉｉ）治療薬物を発現し得る組換え細胞、（ｉｉｉ）レセプター媒介エンドサイトーシス（例えば、非特許文献３６を参照）、（ｉｖ）レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または他のベクターの一部としての治療薬物核酸の作製等が挙げられる。本発明の一実施形態では、治療薬物は、ベシクル、特にリポソームに入れて供給され得る。リポソームでは、本発明のタンパク質が、他の薬学的に許容される担体に加えて、両親媒性薬剤（例えば、水溶液中にミセルとして凝集して存在する脂質、不溶性単分子層、液晶、またはラメラ層等）と結合される。適切なリポソーム製剤用の脂質としては、限定しないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が挙げられる。そのようなリポソーム製剤の調製は、当業者の知識の範囲内であり、例えば、米国特許第４８３７０２８号明細書（特許文献４）及び米国特許第４７３７３２３号明細書（特許文献５）にも開示されており、これらの特許文献の内容は、引用により本明細書の一部とする。更に別の実施形態では、治療薬物は、制御型放出システムにおいて供給され得、そのような制御型放出システムとしては、例えば、供給ポンプ（非特許文献３７参照）、及び半透性ポリマー材料（非特許文献３８参照）等が挙げられる。加えて、制御型放出システムを、治療の標的（例えば脳）の近傍に配置し、従って全身投与量の一部のみしか必要としないようにすることができる。例えば、非特許文献３９を参照されたい。
治療薬物がタンパク質をコードする核酸である本発明の特定の実施形態では、治療薬物核酸は、そのコードされたタンパク質の発現を促進するべくインビボで投与されてもよく、このインビボ投与では、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、それを細胞内に存在するように投与する。（これは例えば、レトロウイルスベクターの使用により、直接の注入により、微小粒子ボンバードメントにより、脂質または細胞表面レセプターまたはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に移入することが知られているホメオボックス様ペプチドにリンクした状態で投与することにより（例えば、非特許文献４０参照）、その他の方法によって行われる。）治療薬物は、細胞内に導入することができ、これは発現のために相同組換えによりホスト細胞ＤＮＡ内に組み込まれるか、エピソームのままの状態となる。
好ましくは、治療薬物は、静脈内投与される。特に、治療薬物は門脈内投与を介して供給され得る。
本明細書において、用語「治療的に有効な量」は、患者にとっての意味のある利益、即ち、対象とする医学上の状態の治療、治癒、予防、または改善、或いはそのような状態の治療、治癒、予防、または改善の割合の向上を示すために十分な医薬組成物または方法の各有効成分の総量を意味する。個々の有効成分が適用される場合、即ち単独投与の場合、この用語は、その単独成分の量を指す。組み合わせて適用される場合であって、連続的にまたは同時に組み合わせて投与されるいずれの場合も、この用語は、治療効果をもたらす複数の有効成分を組み合わせられた総量を指す。
特定の疾病または状態の治療に有効な本発明の治療薬物の量は、疾病または状態の性質に応じて変化し、当業者の標準的な臨床技術によって決定され得る。加えて、最適な投与量範囲を特定するのを助けるために、任意選択でインビトロアッセイを用いてもよい。製剤において使用される正確な用量は、投与経路、障害または疾患の全体的な重篤性に応じても変化し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されるべきである。最終的には、担当する外科医が、個々の患者を治療するための本発明のタンパク質の量を決定することになる。初めに、担当外科医は、本発明のタンパク質を低い用量で投与し、患者の反応を観察する。本発明のタンパク質の投与量を、その患者にとって最適な治療効果が得られるまで増やしてゆき、最適な治療効果が得られた時点で、更に投与量を増やすのをやめる。しかし、本発明の治療薬物の静脈内投与のための適切な投与量の範囲は、一般的には、少なくとも１００万個の分化転換された細胞、少なくとも２００万個の分化転換された細胞、少なくとも５００万個の分化転換された細胞、少なくとも１０００万個の分化転換された細胞、少なくとも２５００万個の分化転換された細胞、少なくとも５０００万個の分化転換された細胞、少なくとも１億個の分化転換された細胞、少なくとも２億個の分化転換された細胞、少なくとも３億個の分化転換された細胞、少なくとも４億個の分化転換された細胞、少なくとも５億個の分化転換された細胞、少なくとも６億個の分化転換された細胞、少なくとも７億個の分化転換された細胞、少なくとも８億個の分化転換された細胞、少なくとも９億個の分化転換された細胞、少なくとも１０億個の分化転換された細胞、少なくとも２０億個の分化転換された細胞、少なくとも３０億個の分化転換された細胞、少なくとも４０億個の分化転換された細胞、または少なくとも５０億個の分化転換された細胞である。好ましくは、投与量は、１０〜２０億個の分化転換された細胞を、体重６０〜７０ｋｇの対象に導入する。当業者であれば、効果的な投与量がインビトロまたは動物モデル試験システムから得られた投与量−反応曲線から推定され得ることを理解されよう。
本発明の治療薬物を用いる静脈内治療の期間は、治療されるべき病気の重症度及び個々の患者各々の条件及び可能性のある特異免疫反応に応じて変化することになる。本発明のタンパク質の投与の各々の期間は、１２〜２４時間の範囲内の連続的静脈内投与であることも想定されている。最終的には、担当する外科医が、本発明のタンパク質を使用する治療の適切な期間を決定することになる。
細胞を、増殖させるため、またはそのような細胞に対する所望の効果またはそのような細胞における活性を生み出すために、本発明の治療薬、核酸、またはタンパク質の存在下でエクスビボ（細胞外）で培養してもよい。次いで、処置された脂肪を、治療のために本明細書に記載の投与経路を介してインビボで導入することができる。
［組換え発現ベクター及びホスト細胞］
本発明の別の態様はベクター、好ましくは、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ニューロＤ１、またはＭａｆＡタンパク質、若しくはＮｇｎ３等の他の膵臓転写因子、またはその誘導体、断片、類似体、ホモログ、或いはそれらの組み合わせをコードする核酸を含む発現ベクターに関する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、転写因子である、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ニューロＤ１、Ｎｇｎ３、ＭａｆＡ、またはＳｏｘ−９若しくはその誘導体または断片のいずれかをコードする１つの核酸を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、転写因子である、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ニューロＤ１、Ｎｇｎ３、ＭａｆＡ、またはＳｏｘ−９若しくはその誘導体または断片の組み合わせの何れかをコードする２つの核酸を含む。好ましい実施形態では、発現ベクターは、ＰＤＸ−１及びニューロＤ１をコードする核酸を含む。
本明細書において、用語「ベクター」は、結合された他の核酸を輸送する能力を有する核酸分子を指す。ベクターの一種に「プラスミド」があり、これは、内部に追加のＤＮＡセグメントが結合され得る線状または環状の二本鎖ＤＮＡループをさす。別の種類のベクターに、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに結合することができるウイルスベクターがある。ある一定のベクターは、それが導入されるホスト脂肪において自己複製可能である（例えば、複製の細菌起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター等）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、ホスト細胞への導入後にホスト細胞のゲノムに組み入れられ、それによってホストゲノムとともに複製される。更に、ある一定のベクターは、それが機能可能的にリンクされる遺伝子の発現を誘導する能力を有する。そのようなベクターを、本明細書では、「発現ベクター」と称する。一般的に、組換えＤＮＡ技術おいて有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態をとる。プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であることから、本明細書において、用語「プラスミド」及び「ベクター」は互換的に用いることが可能である。しかし、本発明は、ウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス）等の発現ベクターの他の形態であって、均等な機能を発揮するものも含むものとする。更に、ウイルスベクターのなかには、特異的にまたは非特異的に特定の細胞タイプを標的する能力を有するものもある。
本発明の組換え発現ベクターは、ホスト細胞における核酸発現のために適切な形態にある本発明の核酸を含むが、このことは、その組換え発現ベクターが、発現される核酸に機能可能的にリンクされ、発現のために使用されるホスト細胞に基づいて選択された１つまたは複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「機能可能的にリンク（結合）された」とは、目的の核酸配列が、調節配列に、その核酸配列の発現を（例えば、ベクターがホスト細胞に導入されたときにインビトロの転写／翻訳系またはホスト細胞において）可能にするような形でリンクされる意味で用いられている。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことを意味している。そのような調節配列は、例えば、非特許文献４１に記載されている。調節配列は、多くのタイプのホスト細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの、及びある一定のホスト細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を誘導するものを含む。発現ベクターのデザインは、形質転換されるホスト細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の因子に応じて変化し得ることを当業者は理解されよう。本発明の発現ベクターは、ホスト細胞に導入することができ、それによって、本明細書に記載のような核酸によってコードされた融合タンパク質またはペプチド（例えば、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９タンパク質、またはそれらの変異形態やそれらの融合タンパク質等）を産生させることができる。
例えば、発現ベクターは、プロモーターに機能可能的にリンクされた転写因子をコードする１つの核酸を含む。２つの転写因子をコードする核酸を含む発現ベクターでは、核酸の各々がプロモーターに機能可能的にリンクされ得る。各核酸に機能可能的にリンクされるプロモーターは、異なるものでも、同種のものでもよい。代替的に、２つの核酸が、１つのプロモーターに機能可能的にリンクされてもよい。本発明の発現ベクターのために有用なプロモーターは、既知のあらゆるプロモーターであり得る。当業者であれば、核酸が発現されるホスト細胞、所望のタンパク質の発現レベル、または発現のタイミング等のために適切なプロモーターを容易に決定できるであろう。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、または細胞タイプ特異的プロモーターであり得る。
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるＰＤＸ−１の発現のためにデザインされ得る。例えば、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、及び／またはＳｏｘ−９は、大腸菌等の細菌細胞で、（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）昆虫細胞で、酵母菌で、または哺乳動物細胞で発現され得る。適切なホスト細胞は、非特許文献４１に更に記載されている。或いは、当該組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写、発現され得る。
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も多くの場合では大腸菌において、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を誘導する構成的または誘導的プロモーターを含むベクターを用いて行われる。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、そのなかにコードされたタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に加える。そのような融合ベクターは、一般的には３つの目的を達成し、即ち（１）組換えタンパク質の発現を増加させ、（２）組換えタンパク質の溶解度を高め、及び（３）親和性精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助ける役目を果たす。多くの場合、融合発現ベクターにおいては、原核細胞の切断部位を、融合部分と組換え部分との接合部に導入して、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離することを可能としている。そのような酵素、及びそれらの同種認識配列には、Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc；非特許文献４２）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, Mass.）、及びｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, N.J）が挙げられ、これらはそれぞれ標的組換えタンパク質にグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、及びはプロテインＡを融合したものである。
適切な誘導可能な非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（非特許文献４３）及びｐＥＴ１１ｄ（非特許文献４４）が挙げられる。
大腸菌における組換えタンパク質発現を最大化する方法の１つは、タンパク質分解的に組換えタンパク質を切断する能力が阻害されたホスト細菌においてタンパク質を発現することである（非特許文献４５を参照）。別の方法は、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌において優先的に利用されるものとなるように発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（非特許文献４６）。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって行うことができる。
別の実施形態では、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９発現ベクターが、酵母菌発現ベクターである。酵母菌Ｓセレビシエにおける発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（非特許文献４７）、ｐＭＦａ（非特許文献４８）、ｐＪＲＹ８８（非特許文献４９）、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif）及びｐｉｃＺ（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif）等が挙げられる。
或いは、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞において発現させることができる。培養された昆虫細胞（例えばＳＦ９細胞）においてタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルス発現ベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（非特許文献５０）、及びｐＶＬシリーズ（非特許文献５１）等が挙げられる。
更に別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（非特許文献５２）及びｐＭＴ２ＰＣ（非特許文献５３）等が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、多くの場合は、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマ由来のもの、アデノウイルス２由来のもの、サイトメガロウイルス由来のもの、及びシミアンウイルス４０由来ものである。原核細胞及び真核細胞の両方に適した発現系については、非特許文献５４のチャプター１６及び１７を参照されたい。
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて優先的にその核酸の発現を誘導することができる（例えば、組織特異的直接エレメントが、その核酸の発現のために使用される）。組織特異的直接エレメントは、当分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的：非特許文献５５）、リンパ球特異的プロモーター（非特許文献５６）、特にＴ細胞レセプターのプロモーター（非特許文献５７）及び免疫グロブリンのプロモーター（非特許文献５８）、神経細胞特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；非特許文献５９）、膵臓特異的プロモーター（非特許文献６０）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば乳清プロモーター；特許文献６、特許文献７）等が挙げられる。発達的に調節されるプロモーターも含められ、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（非特許文献６１）、及びα−フェトタンパク質プロモーター（非特許文献６２）等が挙げられる。
本発明は更に、アンチセンス方向に発現ベクターにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＰＤＸのｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能にするように調節配列に機能可能的にリンクされる。アンチセンス方向に発現ベクターにクローン化された核酸に機能可能的にリンクされた調節配列は、種々の細胞タイプにおけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を誘導するものを選択することができ、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的で、かつ組織特異的まあは細胞タイプ特異的な発現を誘導するウイルスプロモーター及び／またはエンハンサー、または調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、そのなかで高効率の調節領域の制御の下でアンチセンス核酸が生成される組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態であり得、その活性は、そのベクターが導入される細胞タイプによって決定され得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の議論については、非特許文献６３を参照されたい。
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターがそのなかに導入されたホスト細胞に関する。用語「ホスト細胞」及び「組換えホスト細胞」は、本明細書において互換的に用いられる。そのような用語は、特定の対象の細胞のみを表すのではなく、そのような細胞の子孫、子孫の可能性があるものも表すことは理解されよう。後の世代において変異または環境的な影響のために一定の変化が生じ得るので、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でないものであり得るが、依然として本明細書で使用される用語が表現する範囲内に含まれる。更に、ホスト細胞は、一旦ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９またはそれらの組み合わせを発現すると改変されることもあり、元の特性を維持する場合もあれば、しない場合もある。
ホスト細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれかであり得る。例えば、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９タンパク質は、大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞、酵母菌、または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。或いは、ホスト細胞は、未成熟哺乳動物細胞、即ち多能性幹細胞であり得る。ホスト細胞は、他のヒト組織に由来するものでもよい。他の適当なホスト細胞は、当業者に周知である。
ベクターＤＮＡは、従来型の形質転換、形質導入、感染またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書において、用語「形質転換」、「形質導入」、「感染」または「トランスフェクション」は、外来の核酸（例えばＤＮＡ）をホスト細胞に導入する当分野で公知の種々の技術をさし、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む。加えて、トランスフェクションは、トランスフェクション剤によって媒介され得る。「トランスフェクション剤」は、ＤＮＡのホスト細胞への組み込みを媒介するあらゆる化合物、例えばリポソームを含む意味で用いられる。ホスト細胞を形質転換またはホスト細胞に対してトランスフェクションを施す適切な方法は、非特許文献５４、及び他の研究所マニュアルに記載されている。
トランスフェクションは、「安定的」（即ち、外来ＤＮＡのホストのゲノムへの組み入れ）または「一時的」（即ち、ＤＮＡが、ホスト細胞においてエピソームとして発現される）であり得る。
哺乳動物細胞の安定的トランスフェクションの場合には、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術に応じて、細胞のごく僅かな一部が、外来ＤＮＡをそれらのゲノムに組み入れられ得、ＤＮＡの残りの部分はエピソームに保持されることが知られている。これらの必須要素を特定するために、通常は、選択マーカー（例えば、抗体に対する耐性）をコードする遺伝子を、目的の遺伝子とともにホスト細胞内に導入する。種々の選択マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びメトトレキサート等の薬剤に対する耐性を与えるものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸を、ＰＤＸをコードするものと同じベクター上に入れてホスト細胞に導入でき、またはそれらを別々のベクターで導入することもできる。導入された核酸を安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬物耐性によって特定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、他の細胞が死滅する）。他の実施形態では、ＰＤＸによって改変された細胞またはトランスフェクトされた細胞が、内因性レポーター遺伝子の発現の誘導によって特定される。ある特定の実施形態では、プロモーターが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を誘導するインスリンプロモーターである。
一実施形態では、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９核酸が、ウイルスベクターに存在する。一実施形態では、ＰＤＸ−１及びニューロＤ１核酸が、同じウイルスベクターに存在する。別の実施形態では、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９核酸が、ウイルス内に封入される。別の実施形態では、ＰＤＸ−１及びニューロＤ１がウイルス内に封入される（即ちＰＤＸ−１及びニューロＤ１をコードする核酸が同じウイルス粒子内に封入される）。いくつかの実施形態では、ウイルスが、種々の組織タイプの多能性細胞、例えば造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、または胚幹細胞に感染し、好ましくは、ウイルスは肝臓指向性である。「肝臓指向性」という用語は、ウイルスが、特異的にまたは非特異的に肝臓の細胞を選好して標的にする能力を有することを意味する。更に別の実施形態では、ウイルスは、改変された肝炎ウイルス、ＳＶ４０、またはエプスタイン−バーウイルスである。更に別の実施形態では、ウイルスはアデノウイルスである。
［遺伝子治療］
本発明の一態様では、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９ポリペプチドまたはその組み合わせ、またはその機能的誘導体をコードする１つまたは複数の核酸が、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、特定の核酸を対象に投与することによって行われる治療をいう。本発明のこの態様では、核酸が、コードされたペプチドを作りだし、そのペプチドが、上述の障害または疾患（例えば、糖尿病）の機能を改変することによって治療効果をもたらすように作用する。当分野において利用可能な遺伝子治療に関するあらゆる方法を、本発明の実施において用いることができる。例えば、非特許文献６４を参照されたい。
好ましい実施形態では、治療薬物が、適切なホスト内に、上述のＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、及び／またはＳｏｘ−９ポリペプチド、またはその断片、誘導体、または類似体のなかの１つまたはそれ以上を発現する発現ベクターの一部である核酸を含む。特定の実施形態では、そのような核酸が、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、及びＳｏｘ−９ポリペプチドのコード領域に機能可能的にリンクされたプロモーターを有する。そのプロモーターは、誘導的または構成的であり得、かつ任意選択で組織特異的であり得る。プロモーターは、例えばウイルスまたは哺乳動物を起源とするものであり得る。別の特定の実施形態では、コード配列（及び任意の他の所望の配列）に、ゲノム内の所望の部位における相同な組換えを促進する領域が隣接し、それによって核酸の染色体内発現を可能にする。非特許文献６５を参照されたい。更に別の実施形態では、供給される核酸がエピソームに保持され、それがなければサイレントな内因性の遺伝子を誘導する。
治療用核酸の患者への送達は、直接的（即ち、患者が核酸または核酸を含むベクターに直接さらされる）か、または間接的（即ち細胞を、初めにインビトロで核酸に接触させ、次いでそれを患者に移送する）である。これらの２つのアプローチは、それぞれインビボ（生体内）遺伝子治療またはエクスビボ（生体外）遺伝子治療として知られている。本発明の特定の実施形態では、核酸を直接的に生体に投与し、インビボで発現されてコードされたタンパク質が産生される。これは、当分野で公知の多くの方法のいずれかによって達成され得るが、そのような方法としては、限定しないが、前記核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、それを、細胞内に入るような形で（例えば、欠損または弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いて感染させることによって（特許文献８参照））投与する方法、微小粒子ボンバードメント（例えば、Gene Gun.RTM.; Biolistic, DuPont）を利用して、裸のＤＮＡを直接注射する方法、前記核酸を脂質でコーティングする方法、関連する細胞表面レセプター／トランスフェクト剤を用いる方法、リポソーム、微小粒子、またはマイクロカプセルに封入する方法、核内に入ることが知られているポリペプチドに結合された状態で投与する方法、または、レセプター媒介エンドサイトーシスを起こす傾向を有するリガンドに結合した状態で投与する（これは、目的のレセプターを特異的に発現する細胞タイプを「標的化」するため利用することができる）方法（非特許文献３６）等が挙げられる。
本発明の実施における遺伝子治療のための別の方法では、インビトロの組織培地における細胞に、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ウイルス感染党の方法によって遺伝子をトランスフェクトする。通常は、移送の方法は、細胞への選択マーカーの同時移送を含む。次に、細胞を、取り上げられるこれらの細胞の単離を促進し、移送された遺伝子を発現するような選択圧力（例えば、抗生物質耐性）の下に置く。次にこれらの細胞を患者に供給する。特定の実施形態では、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸を、当分野で公知のいずれかの方法によって細胞内に導入するが、そのような方法としては、限定しないが、トファンスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、目的の核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移送、マイクロセル媒介遺伝子移送、スフェロプラスト融合、及びレシピエント細胞の必要な発達及び生理的機能が移送によって破壊されないことを確実にする類似の方法が挙げられる。例えば、非特許文献６６を参照されたい。選択された技術は、核酸が細胞によって発現可能となるような核酸の細胞への安定的な移送を提供するものでなければならない。好ましくは、前移送された核酸は、遺伝性であり、細胞の子孫によって発現可能である。代替的な実施形態では、移送された核酸はエピソームのままの状態で、それがなければサイレントな内因性核酸の発現を誘導する。
本発明の好ましい実施形態では、得られた組換え細胞は、当分野で公知の種々の方法によって患者に供給することができ、そのような方法としては、限定しないが、上皮細胞の注射（例えば、皮下に）、組換え皮膚細胞の植皮片としての患者への投与、及び組換え血液細胞（例えば造血幹細胞、血液前駆細胞）または肝細胞の静脈注射等が挙げられる。使用が想定される細胞の総量は、所望の効果、患者の状態等に応じて変化し、当業者によって決定することができる。
遺伝子治療の目的で核酸を導入できる細胞は、任意の所望の利用可能な細胞タイプが含まれ、異種の、異質の、同系の、自原性のものであり得る。細胞のタイプとしては、限定しないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞及び血球、または種々の幹細胞または前駆細胞等が挙げられ、特に胚期の心筋細胞、肝幹細胞（特許文献９）、神経幹細胞（非特許文献６７）、造血幹細胞または前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓等から得られるもの）が挙げられる。好ましい実施形態では、遺伝子治療に利用される細胞は、患者の自己細胞である。
遺伝子治療のためのＤＮＡは、患者に対し非経口的に、例えば静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内に投与することができる。ＤＮＡ及び誘導剤は、薬学的に許容される担体、即ち動物への投与に適した生物学的に適合した賦形剤（例えば、生理食塩水）に入れて投与される。治療的に有効な量は、医学的に望ましい結果（例えば、治療される動物の膵臓遺伝子の増加）をもたらし得る量である。そのような量は、当業者が決定できる。医療分野で公知のように、ある患者に対する投与量は、多くの因子によって変化し、そのような因子には、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、身体全体の健康、及び同時に投与される他の薬剤が含まれる。投与量は変えることができるが、ＤＮＡの静脈内投与のために好ましい投与量は、概ね１０６〜１０２２コピーのＤＮＡ分子である。例えば、ＤＮＡは、１Ｋｇ当たり２×１０１２ウイルス粒子（ビリオン）で投与される。
［医薬組成物］
化合物、例えばＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９ポリペプチド、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸、または本発明のＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはＳｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸の発現を増加させる化合物、及びその誘導体、断片、類似体、ホモログは、投与に適した医薬組成物に組み入れることができる。そのような組成物は、典型的には、核酸分子、またはタンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書において「薬学的に許容される担体」とは、薬剤としての投与に適合する、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を含む意味である。適切な担体は、当分野で標準的な参照文献である最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences（非特許文献６８）に記載されており、同文献の内容は引用により本明細書の一部とする。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、限定しないが、水、生理食塩水、フィンガーの溶液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミン等が挙げられる。リポソーム及び固形油等の非水性担体を用いることもできる。そのような薬学的に活性な物質のための媒体及び薬剤の使用は当分野で公知である。活性化合物と適合しないあらゆる従来の培地または薬剤を除き、それらの組成物における使用が想定される。補助的な活性化合物も組成物に組み入れることができる。
本発明の医薬組成物は、その意図した投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮（局所）投与、経粘膜投与、及び直腸投与が挙げられる。経口、皮内、または皮下投与のために用いられる溶液としては、次のもの、即ち注射用水、生理食塩水、固形油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化物質；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、硝酸塩またはリン酸塩等のバッファー、及び塩化ナトリウム及びデキストロース等の張度調製のための薬剤を挙げることができる。ｐＨは、塩酸や水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調節することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアルに含めることができる。
注射用に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）、または分散液及び滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末等が挙げられる。静脈内投与のためには、適切な担体としては、生理食塩水、静菌性水であるＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ．ＴＭ．（BASF, Parsippany, N.J.）、またはリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌状態でなければならず、注射針通過容易性が存在する程度の流体であるべきである。組成物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、及び細菌及び菌類等の微生物の汚染作用を受けないように保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及び適当なそれらの混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散の場合において必要な粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用に対する予防は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の抗菌剤及び抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム等のポリアルコールを組成物に含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることにより達成することができる。
滅菌注射液は、必要な量の活性化合物を適切な溶媒のなかに、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに入れ、次にろ過滅菌することによって調製できる。一般的には、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒及び上に列挙した必要な他の成分を含む滅菌担体に組み入れることによって調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分プラス前もって滅菌ろ過された溶液から得られた他の所望の成分粉末を作り出す真空乾燥及び凍結乾燥である。
経口投与用組成物は、通常は不活性の希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに含めるか、または圧縮して錠剤にすることができる。治療のための経口投与の場合には、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれて、錠剤、トローチ剤、またはカプセルの剤形で使用される。経口投与用組成物は、流体の担体中の化合物が口内で適用され、口内ですすぐように回され、吐き出されるかまたは飲み込まれるマウスウォッシュとして使用するための流体担体を用いて調製することもできる。薬学的に適合する結合剤及び／またはアジュバント材料を、組成物の一部に含めることもできる。錠剤、ピル、カプセル、トローチ剤等は、次の成分、即ち微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン等の結合剤；デンプンまたはラクトース等の賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、またはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロースまたはサッカリン等の甘味料；ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料等の香味剤、または類似の性質の化合物のいずれかを含むことができる。
全身投与は、経粘膜または経皮手段によって行うこともできる。経粘膜または経皮投与のためには、通過されるべきバリアに適した浸透剤が製剤に用いられる。そのような浸透剤は当分野では一般的に知られており、例えば、経粘膜投与用に、洗浄剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体等が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤によって達成することができる。経皮投与のためには、活性化合物が、当分野で一般的に知られているような軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤される。
一実施形態では、化合物は、その化合物を体内からの迅速排除に対向する担体とともに調製され、例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む徐放製剤等とされる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料は、Alza Corporation及びNova Pharmaceuticals, Inc.から購入することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染された細胞を標的にしたリポソームを含む）を、薬学的に許容される担体として用いることもできる。これは、例えば米国特許第４５２２８１１号明細書（特許文献１０）に記載のような、当業者に公知の方法に従って調製することができ、この特許文献は、引用によりその全内容を本明細書の一部とする。
経口用または非経口組成物を、投与の容易性または投与量の均一性のために用量単位フォームに製剤することが特に有利である。本明細書において、用量単位フォームとは、処置を受ける対象のための単位投与量として適切である物理的に別個の単位物を表し、各単位物は、必要な薬学的担体とともに所望の治療上の効果をもたらすべく計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の用量単位フォームのための仕様は、活性化合物特有の特性及び達成される特定の治療上の効果によって直接的に左右され、決定される。
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入することができ、遺伝子治療用ベクターとして用いることができる。遺伝子治療用ベクターは、例えば、米国特許第５７０３０５５号明細書（特許文献１１）に記載のように多数の経路のいずれかによって対象に供給することができる。従って、送達方法としては、例えば、静脈注射、局所投与（特許文献１２参照）、または定位注射（例えば、非特許文献６９参照）等を挙げることができる。遺伝子治療用ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤に入れられた遺伝子治療用ベクターを含むことができ、或いは遺伝子送達用担体が埋め込まれた徐放マトリックスを含むことができる。或いは、完全な遺伝子治療用ベクターを、例えばレトロウイルスベクターのように、組換え細胞から完全なままの形で作製することができる場合、薬剤調製物は、遺伝子送達システムを作り出す１つまたは複数の細胞を含み得る。
医薬組成物は、投与方法の指示書と一緒に容器、パッケージ、またはディスペンサ内に含めることができる。
本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、及び試薬、並びに実施例の内容に限定されないこと理解されたい。本明細書中の用語及び実施例は、特定の実施形態を説明することを目的としたものに過ぎず、当業者に対してのガイダンスを提供することを意図し目的としたものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：一般的方法
［ヒト肝細胞］
成体ヒト肝臓組織を、年齢３〜２３歳の個人から取得した。肝臓組織は、臨床調査委員会（施設内治験審査委員会）から承認を得て使用した。ヒト肝細胞の単離は、上記したように行った（非特許文献２２，非特許文献２３参照）。その細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｎｇ／ｍｌストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ（Biological Industries, Beit Haemek, Israel）を添加したダルベッコ最小必須培地において培養し、５％のＣＯ２及び９５％の空気の加湿環境において３７℃に維持した。
［ウイルス感染］
この研究で使用されるアデノウイルスは次のもの、即ち、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１ （非特許文献２２、非特許文献２３）、Ａｄ−ＲＩＰ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（非特許文献７０）、Ａｄ−ＣＭＶ−β−βαΙ、Ａｄ−ＣＭＶ−ＭａｆＡ（Newgard, C.B., Duke Universityからの無償提供）、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐａｘ４−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（St Onge, L. DeveloGen AG, Gottingen, Germanyからの無償提供）、及びＡｄ−ＣＭＶ−Ｉｓｌｌ（Kieffer, T. University of British Columbia, Vancouver, Canadaからの無償提供）であった。ウイルス粒子は、標準的なプロトコル（非特許文献７１参照）によって生成した。
肝細胞に、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ；Cytolab, Ltd., Israel）及びニコチンアミド（１０ｍＭ；Sigma）を添加して、５〜６日かけて組換えアデノウイルスを感染させた（表１）。最適な細胞一個当たりウイルス数（ＭＯＩ）は、細胞生存（＜７５％）及びｃ−ペプチド分泌の誘導に基づいて決定した。使用されたウイルスのＭＯＩは、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（１０００ＭＯＩ）、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐａｘ４−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（１００ＭＯＩ）、Ａｄ−ＣＭＶ−ＭＡｆ−Ａ（１０ＭＯＩ）、及びＡｄ−ＣＭＶ−Ｉｓｌｌ（１００ＭＯＩ）であった。
［ＲＮＡ単離、ＲＴ及びＲＴ−ＰＣＲ反応］
全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを調製し、増幅したが、これは前に説明したように行った（非特許文献１５、非特許文献２２）。前に説明したように（非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４）、ＡＢＩ ＳＴＥＰｏｎｅ配列決定システム（Applied Biosystems, CA, USA）を用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した。
［Ｃ−ペプチド及びインスリン分泌の検出］
Ｃ−ペプチド及びインスリン分泌を、前述のように（非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４）、初期ウイルス処置を施した後６日間の成人肝細胞の初代培養の静的インキュベーションにより測定した。グルコース調節ｃ−ペプチド分泌を、２ｍＭ及び１７．５ｍＭグルコースで測定したが、これは、処置された細胞の機能に悪影響を及ぼすことなく分化転換された肝細胞からのインスリン分泌を最大限に誘導するべく投与量依存的解析によって決定した（非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４）。Ｃ−ペプチド分泌は、ヒトＣペプチド用ラジオイムノアッセイキット（Linco Research, St. Charles, MO；＜４％のヒトプロインスリンとの交差反応）を用いたラジオイムノアッセイによって検出した。インスリン分泌は、ヒトインスリン用ラジオイムノアッセイキット（DPC, Angeles, CA；３２％のヒトプロインスリンとの交差反応）を用いたラジオイムノアッセイによって検出した。分泌量は、Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイキットによって測定された全細胞タンパク質に対して正規化した。
［ルシフェラーゼアッセイ］
ヒト肝細胞に、Ａｄ−ＲＩＰ−ルシフェラーゼ（２００ｍｏｉ）及び各種アデノウイルス（後述する）を同時感染させた。６日後、ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）及びＬＫＢ１２５０ルミノメータ（LKB, Finland）を用いて測定した。測定結果は、Ｂｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイキットによって測定された全細胞タンパク質に対して正規化した。
［免疫蛍光］
各種アデノウイルスで処置したヒト肝細胞を、１２ウェル培養プレートにおいてガラスカバースライド上に置いた（２×１０５細胞／ウェル）。３〜４日後、以前に説明したように（非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４）、細胞を固定し、染色した。この試験で使用した抗体は、抗ウサギＰＤＸ−１、抗ヤギＰＤＸ−１（両者ともに１：１０００、C.V. E. Wrightからの無償提供）、抗ヒトインスリン、抗ヒトソマトスタチン（両方とも１：１００、Dako, Glostrup, Denmark）、抗Ｐａｘ４（１：１００；R&D Systems, Minneapolis, MN）、抗ＭａｆＡ（１：１６０；Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）であった。使用した二次抗体は、抗体１：２５０とコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧシアニン（ｃｙ２）、抗体１：２５０とコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧインドカルボシアニン（ｃｙ３）、抗体１：２００とコンジュゲートした抗ヤギＩｇＧシアニン（ｃｙ２）、抗体１：２５０とコンジュゲートした抗ヤギＩｇＧインドカルボシアニン（ｃｙ３）、抗体１：２５０とコンジュゲートした抗マウスＩｇＧインドカルボシアニン（ｃｙ３）（全て入手元はJackson ImmunoResearch, PA）であった。最後に、細胞を、４'，６−ジアミジノ−２−フェニル−インドール（DAPI, Sigma）で染色した。スライドを、蛍光顕微鏡（Provis, Olympus）を用いてイメージ化し、解析した。
［統計的解析］
統計的解析は、不等分散を仮定して２サンプルＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で行った。
実施例２：ＰＤＸ−１誘導分化転換
以前の研究結果（非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献７２）は、Ｐｄｘ−１単体が、おそらくは肝臓内のそれがなければサイレントな内因性ｐＴＦを活性化するその能力のために、ヒト肝細胞においてβ細胞用表現型及び機能を誘導する能力を有することを示唆していた。膵臓系列の活性化は速やかであり、５日以内に生じた（非特許文献２２、非特許文献１５）。
この実施例では、Ｐｄｘ−１に誘導された肝臓から膵臓への分化転換を媒介する事象の系列を調べる。Ｐｄｘ−１をコードするアデノウイルスベクターを成人ヒト肝細胞に導入し、そして異所Ｐｄｘ−１発現の効果を、感染後４日連続でモニタリングした（２〜５日：図１）。膵臓ホルモン及び膵臓特異的転写因子の発現を、５日毎の定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析によって決定した。結果は、同じｃＤＮＡサンプル内でのβアクチン遺伝子発現に対して正規化され、同日に対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ、１０００ＭＯＩ）で処置した細胞に対する相対的発現の平均±ＳＥ（標準偏差））として提示されている。尚、２つの独立した実験を行った（ｎ≧４、＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜ ０．０１）。
Ａｄ−Ｐｄｘ−１感染の１日後に、グルカゴン遺伝子とソマトスタチン遺伝子の両方が速やかに活性化された（図１Ｃ及び図１Ｄ）。しかし、インスリン発現は、感染後４〜５日目にのみ検出された。３種の主たる膵臓ホルモンの個々の一時的な活性化に対するメカニズムの説明を提供するために、内因性に活性化された転写因子の発現レベルを、分化転換プロセス中に解析した。初期の膵臓内分泌転写因子、ＮＧＮ３及びニューロＤ１は速やかに活性化された。しかし、ＮＫＸ６．１及びＭａｆＡ等のβ細胞特異的ＴＦは、異所Ｐｄｘ−１発現に応答して徐々に少量活性化されたに過ぎず、それらのピーク発現にはそれぞれ４日目及び５日目に達した。５日目のインスリン遺伝子発現の活性化は、ＭａｆＡ発現の増加のみでなく、Ｉｓｌｌ発現の低下にも関連していた（図１Ｄ）。これらのデータは、ヒト肝細胞の膵臓系列に沿った分化転換は、速やかに進行するが、順次進行する連続したプロセスであることを示唆している。膵臓ホルモン遺伝子発現（例えば、ソマトスタチンやグルカゴン）の個別の一時的活性化は、経時変化及び内因性に活性化されたｐＴＦ発現の相対レベルに部分的に起因するものであり得る。
実施例３：ＰＤＸ−１、ＰＡＸ４、及びＭＡＦＡによる肝臓から膵臓への分化転換効率の上昇
以前の研究は、いくつかのｐＴＦの同時発現が、個々のｐＴＦに誘導される場合と比較して、他の系列に沿った分化転換効率並びにβ細胞系列に沿った分化転換の効率を上昇させることを示唆していた（非特許文献２１、非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２５）。本発明者は、初代成人ヒト肝細胞培地における実験系でのこの見解を解析するために、３種の主要のｐＴＦの肝臓から膵臓への分化転換に対する個別の寄与及び共同の寄与を調べた。膵臓器官形成における異なる段階を媒介するＰｄｘ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡを、組換えアデノウイルスを用いて成人ヒト肝細胞の初代培地で異所的に同時発現させた。培養された成人ヒト肝細胞に、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（１０００ＭＯＩ）、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐａｘ−４（１００ＭＯＩ）、及びＡｄ−ＣＭＶ−ＭａｆＡ（１０ＭＯＩ）を単体で、または同時に感染させ、或いは対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌ、１０００ＭＯＩ）を感染させて、６日後に膵臓分化マーカーを調べた。各因子の細胞１個に対する感染数（ＭＯＩ）を、感染細胞の生存能力に対する悪影響を最小にすることに関連する再プログラム化効率が最大となるように漸増させた。Ｐｄｘ−１は、培地中の細胞の７０％で発現され、全３種類のｐＴＦの同時発現は、Ｐｄｘ−１陽性細胞の４６．８％にあることが明らかとなった（図２Ａ）。Ｐａｘ−４またはＭａｆＡのみに対して染色陽性となった細胞は殆どなかった。全３種類のｐＴＦについて陽性に染色された細胞は矢印によって示されている（図２Ａ、右パネル）。図２Ｂでは、肝細胞に混合ｐＴＦ、及びＡｄ−ＲＩＰ−ＬＵＣ（２００ｍｏｉ）を同時感染させ、インスリンプロモーターのルシフェラーゼ活性を測定した。
３種ｐＴＦの混和発現の結果、個々のｐＴＦ単体によって誘導される場合と比較して、インスリンプロモーターの活性化の実質的な増加（図２Ｂ）、（プロ）インスリン産生細胞数の３倍の増加（図２Ｃ）、グルコースに調節される（プロ）インスリン分泌の３０〜６０％の増加（図２Ｄ）が生じた。総合すると、これらの結果は、３種のｐＴＦの組み合わせが、分化転換効率を上昇させることを示唆しているとともに、各因子の分化転換促進能力は限定的であり、分化転換を最大限に促進するには不十分であることも示している（非特許文献２１、非特許文献２６、非特許文献２９）。
実施例４：分化転換された細胞の異なるホルモン産生細胞への成熟及び分離に対する階層的な方式の時間的な制御
この実施例では、異所ｐＴＦ発現の時間的に制御の影響を調べ、３種のｐＴＦの組み合わせの異所発現による分化転換効率の上昇が、上述のように時間的にも制御されるか否かを判定した（図２）。膵臓分化転換においてある役割を有する時間的な制御の裏付けとして、３種のｐＴＦ、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡが、膵臓器官形成中に個別の一時的な発現及び機能を示すことが知られている。
３種のｐＴＦ、Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡを、組換えアデノウイルスを用いて成人ヒト肝細胞の初代培地に連続的にまたは同時に導入した。アデノウイルス媒介異所遺伝子発現は、感染後１７時間でピークに達する（非特許文献７３）。従って、連続する３日間にｐＴＦを連続的に投与し（実施例１の「ウイルス感染」参照）、それらの個々の効果を明らかにすることができた。
細胞に対して、表１に示すようなスケジュールに従って感染させた。
Figure 2016521559
細胞に、３日間にわたって１種類のｐＴＦアデウイルス構成物を連続的に感染させた。即ち、直接的で階層的な順序（処置Ｃ＝Ｐｄｘ−１→Ｐａｘ４→ＭａｆＡ）、逆の順序（処置Ｄ＝ＭａｆＡ→Ｐａｘ４→Ｐｄｘ−ｌ）、及びランダムな順序（処置Ｅ＝Ｐｄｘ−ｌ→ＭａｆＡ→Ｐａｘ４）で感染させた。連続的ｐＴＦ投与の、分化転換効率及びβ細胞様成熟への効果を、第１日目に全３種のｐＴＦを一斉に即ち同時に投与した場合（処置Ｂ＝Ｐｄｘ−ｌ＋Ｐａｘ４＋ＭａｆＡ）並びに類似のＭＯＩの対照ウイルスの場合（処置Ａ＝β−ｇａｌ）と比較した（表１及び図３Ａ）。具体的には、培養された成人ヒト肝細胞に、図３Ａ及び表１に概略が示されているように、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１（１０００ＭＯＩ）、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐａｘ−４（１００ＭＯＩ）、及びＡｄ−ＣＭＶ−ＭａｆＡ（１０ＭＯＩ）に同時にまたは連続的に感染させ（処置Ｂ〜Ｅ）、または対照ウイルス（Ａｄ−ＣＭＶ−ｆｉ−ｇａｌ，１０００ｍｏｉ、処置Ａ）に感染させ、６日後にそれらの膵臓分化について解析した。
インスリンプロモーター活性（図４Ａ）、インスリン産生細胞のパーセンテージ（図３Ｂ）、及びグルコース調節（プロ）インスリン分泌（図３Ｃ）は、連続的に投与されたｐＴＦの順序に影響を受けなかった。興味深いことに、ランダムな順序の連続的ｐＴＦ投与（処置Ｅ＝Ｐｄｘ−ｌ→ＭａｆＡ→Ｐａｘ４）の結果、インスリンプロモーター活性は上昇したが、インスリン分泌のグルコース調節の消失及びグルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ−２）発現の低下がもたらされた（図３Ｂ、図３Ｃ、及び図４Ｂ）。Ｐａｘ４及びＭａｆＡ投与の順序を変えた場合のグルコース感知能力の消失は、発現されるｐＴＦの順序がβ細胞様成熟に対して影響を及ぼしている可能性はあるが、分化転換プロセス効率には影響を与えていないことを示唆している。
実施例５：ＰＤＸ−１、ＰＡＸ４、及びＭＡＦＡの階層的投与によるβ様細胞に分化転換された細胞の成熟の促進
前の結果により、上昇した分化転換効率がどの程度、どの条件下でβ細胞系列に沿った成熟の向上に関連付けられるかを決定するための更なる試験をすることになった。
成熟β細胞の特徴的な特性は、グルコース調節式にプロインスリンをプロセシングし分泌する能力である（非特許文献７４、非特許文献７５）。ｐＴＦ発現の時間的変化が、分化転換された細胞のβ細胞系列に沿った成熟に明確な影響を与えているか否かを解析するため、異なる処置Ａ〜Ｅ（表１及び図３Ａ）のプロインスリンのプロセシング及びグルコース調節ｃ−ペプチド分泌への影響を解析した。
実際、ｐＴＦの直接的な階層的投与（処置Ｃ）の結果のみが、プロセシングされたインスリンの明確な産生及びそのグルコース調節分泌をもたらしたが、これは生理学的なグルコース用量応答特性を示していた（図３Ｃ及び図５Ａ）。インビトロでの最大４週間のグルコース調節型のｃ−ペプチド分泌の能力によって立証されるように、この新たに得られた表現型及び機能は安定的である。
直接的で階層的なｐＴＦ投与（処置Ｃ）の後のみにプロホルモンのプロセシングが上昇することは、ＰＣＳＫ２及びＧＬＵＴ２遺伝子発現の明らかな増加に関連があったが、このＰＣＳＫ２及びＧＬＵＴ２遺伝子発現は、プロホルモンのプロセシング及びグルコースの感知能力のそれぞれにおいて一定の役割を果たすものである（図３及び図４）。これらのデータは、β細胞系列に沿って分化転換された肝細胞の成熟及び機能発揮の促進における、ｐＴＦの連続的で直接的な階層的発現の絶対的な役割を示唆している。同時ｐＴＦ投与（処置Ｂ）及び間接的な階層的モードでの連続的ｐＴＦ投与（処置Ｄ及びＥ）の両方では、成熟β細胞様特性を示す分化転換された細胞が生成されなかった。
成熟のβ細胞様状態における変化のメカニズムの説明を得るために、個々の時間的な処置（処置Ｂ〜Ｅ）の下で内因性に活性化されたｐＴＦの能力の範囲（レパートリー）を解析した。全ての処置（処置Ｂ〜Ｅ）の結果、ニューロＧ３、ニューロＤ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＫＸ２．２等の多数の内因性ｐＴＦの発現の上昇がもたらされた（図３Ｅ）。しかし、「成熟」表現型（処置Ｃ）と「未成熟」表現型（処置Ｂ、Ｅ、及びＤ）との間の最も確実な差は、内因性Ｉｓｌｌ遺伝子発現のレベルで示された。従って、直接的で階層的なｐＴＦ投与（処置Ｃ）によって誘導されたβ細胞系列に沿った最も向上された成熟は、内因性Ｉｓｌｌ発現の劇的な低下と相関している（図３Ｅ、矢印）。総合すると、これらのデータは、分化転換された細胞のβ細胞への成熟は、特定のｐＴＦの相対的及び時間的な発現レベルによって影響を受けることもあり得ることを示唆している。
実施例６：ＰＤＸ−１、ＰＡＸ４、及びＭＡＦＡの階層的な投与による、分化転換された細胞のβ様細胞とδ様細胞との間の分離の促進
処置Ｃ（表１）からのＭａｆＡの排除は、Ｉｓｌ−１遺伝子発現（図６Ｄ）及びソマトスタチン遺伝子発現（図８Ｄ）の両方を誘導した。ＭａｆＡ排除の後のＩｓｌ−１の発現の上昇が実際にソマトスタチン遺伝子発現の増加を引き起こしているか否かを解析するために、３日目にＭａｆＡ（表１の処置Ｃ）と一緒にＡｄ−ＣＭＶ−Ｉｓｌ−１を加えた。実際、Ｉｓｌ−１は、ソマトスタチン遺伝子発現を増加させた（図６Ｅ）。異所Ｉｓｌ−１発現（Ｃ＋Ｉｓｌ−１）は、ソマトスタチンタンパク質生成の増大（図６Ｆ）及びインスリン産生細胞におけるその同時生成（図９、下側パネル）ももたらし、このことは、低いＩｓｌ−１発現に関連する高いＭａｆＡ発現が、インスリン産生細胞とソマトスタチン産生細胞の分離について重要であることを示唆している。
実施例７：肝臓から膵臓への分化転換に対するＰＤＸ−１、ＰＡＸ４、及びＭＡＦＡの個々の寄与の解析
分化転換プロセスの連続的な特性を、機能試験で経時的に得られる情報によって特定した。階層的な発達プロセスに対する転写因子Ｐｄｘ−１、Ｐａｘ４、及びＭａｆＡの各々の個別の寄与の更なる解析を、相対的及び時間的「機能低下」アプローチによって行った。成人ヒト肝細胞を、直接的で経時的で連続的な再プログラム化プロトコル（処置Ｃ）において、そこから異所ｐＴＦの１つを除いて処置した。除かれたｐＴＦの代わりに、類似の感染多様性でβ−ｇａｌを発現する遺伝子を有する対照アデノウイルスを用いた。具体的には、成人ヒト肝細胞を、直接的で「階層的で」連続的な感染順序（処置Ｃ、図３Ａ及び表１）で処置した。一度に１つの転写因子（ｐＴＦ）を除いて、同一のＭＯＩのＡｄ−ＣＭＶ−β−ｇａｌに置き換えた。Ｐｄｘ−１を除いたものは、（Ｃ−Ｐｄｘ−１）として示し、Ｐａｘ４を除いたものは（Ｃ−Ｐａｘ４）として示し、ＭａｆＡを除いたものは、（Ｃ−ＭａｆＡ）として示されている。
個々のｐＴＦの各々の発現の除去の機能的な結果を、分子レベル及び機能レベルで解析した（図６）。別々に行ったＰｄｘ−１及びＭａｆＡの除去（それぞれＣ−Ｐｄｘ−１及びＣ−ＭａｆＡ）の結果、インスリンプロモーターの活性化が低下し（図６Ａ）、プロセシングされたインスリン分泌のグルコース応答が低下し（図６Ｂ）、またＧＬＵＴ２及びＧＫ発現が低下した（図６Ｃ）。ＭａｆＡの除去は、プロホルモン転換酵素ＰＣＳＫ２の発現の低下にも関連していた（図６Ｃ）。一方、Ｐａｘ４の排除（Ｃ−Ｐａｘ４）は、インスリンプロモーターの活性化に有意な影響を与えず、グルコース調節ｃ−ペプチド分泌にも影響を与えなかった。Ｐａｘ４の排除は、ＧＬＵＴ２及びＰＣＳＫ２発現の低下と関連があったが（図６Ｃ）、このことはＧＫの発現がホルモン分泌のグルコース制御能力の獲得のために十分であることを示唆するものであり得る。
これらの発達上の変化を説明するために、内因性に活性化されたｐＴＦ発現の能力の範囲（レパートリー）に対する時間的でかつ個別のｐＴＦ排除の結果の解析を行った。Ｐｄｘ−１及びＰａｘ４の排除は、大半の他のｐＴＦ（ニューロＧ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．２、及びＰａｘ６を含む）の発現の顕著な低下を引き起こしたが、これは、それらの因子が分化転換効率の向上に寄与している可能性が、それらの内因性膵臓ＴＦを活性化する能力と関連があることを示唆している（図６Ｄ）。一方、ＭａｆＡの排除は、内因性ｐＴＦ発現の更なる活性化に寄与していなかったが、このことは、その因子は、膵β細胞のみにおいて発現が遅延しかつ制限されることを反映しているとみられる。対照的に、インスリンプロモーター活性の上昇、プロホルモンのプロセシング、及びそのグルコース調節分泌に対するＭａｆＡの寄与は、Ｉｓｌ−１発現の低下のみと関連があった（図６Ｄ）。これらのデータは、ＭａｆＡは、内因性ｐＴＦの発現及び肝臓から膵臓への分化転換の効率の更なる向上には関与していないが、分化転換された細胞の成熟の促進には関与していることを示唆し得る。
実施例８：ＩＳＬ−１による分化転換された細胞のβ細胞系列への成熟の防止
ＭａｆＡのβ細胞様成熟に対する影響は、そのＩｓｌ−１発現を抑制する能力と部分的に関連し得る。この仮説を検定するために、異所Ｉｓｌ１を、アデノウイルス感染（Ａｄ−Ｉｓｌ１）によって分化転換された細胞に導入した。概略を述べれば、成人ヒト肝細胞を、直接的な「階層的な」連続的感染順序（処置Ｃ）によって処置し、３日目にＡｄ−Ｉｓｌ１（１または１００ＭＯＩ）を添加した（Ｃ＋Ｉｓｌ１）。
上述のように、直接的で階層的な方式での３種のｐＴＦの連続的投与（処置Ｃ）の結果、分化転換効率の向上と、新規に生成された細胞のβ細胞系列に沿った成熟の両方がもたらされた。Ｉｓｌ１を、３日目にＭａｆＡと一緒に投与した（Ｃ＋Ｉｓｌ１）。実際、異種プロモーターの制御の下での３日目のＩｓｌ１の過剰発現の結果、インスリン遺伝子発現のかなりの低下と、グルコース調節（プロ）インスリン分泌の低下がもたされた（図７）。グルコース検出能力の喪失は、ＧＬＵＴ２発現の減少と関連していた（図７Ｃ）。これらの結果は、分化転換プロトコルの第１段階でのＩｓｌ１発現の下方調節は、β細胞系列に沿った成熟を妨げる可能性があり、ＭａｆＡ発現が低い条件下での成熟の減少を部分的に説明し得ることを示唆している。
総合すると、これらのデータは、分化転換された肝細胞のβ細胞系列に沿った成熟の促進におけるｐＴＦの直接的で階層的な発現が果たす重要かつ絶対的な役割を示唆している。更に、連続的な発達のプロセスは、分化転換された細胞のβ細胞系列に沿った成熟を促進または阻止し得るｐＴＦの活性化及び抑制の両方と関連している。
実施例９：ＰＤＸ−１、ＰＡＸ４及びＭＡＦＡの階層的投与によるグルカゴン及びソマトスタチンの発現の誘導
内分泌腺膵臓系列に沿った分化転換の結果、多種の膵臓ホルモンの発現の活性化が生ずる。これらのホルモンの発現レベルがｐＴＦの経時的操作によって影響を受ける程度も調べた。膵臓ホルモングルカゴン（ＧＣＧ）（図８Ａ及び図８Ｂ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）（図８Ａ、図８Ｄ、及び図８Ｅ）、またはα細胞特異的転写因子（図８Ｃ）の遺伝子発現を、示した処置の後の定量的リアルタイムＰＣＲ解析によって決定した。
グルカゴン（ＧＣＧ）及びソマトスタチン（ＳＳＴ）遺伝子の転写を、個々に発現されたｐＴＦの各々、主としてＰｄｘ−１及びＭａｆＡにより誘導し、またＰａｘ４によって低い程度まで誘導した（図８Ａ）。グルカゴン遺伝子転写の更なる増加は、ｐＴＦの直接的で階層的な投与の後にのみ生じた（図４Ａ、処置Ｃ参照）。Ｐｄｘ−１及びＭａｆＡは、α細胞特異的転写因子ＡＲＸ及びＢＲＡＩ４またはＡＲＸ単体のそれぞれの活性化と関連するプロセスにおけるグルカゴン発現に影響を与えた（図８Ｃ）。大半の処置によって影響を受けずにいたソマトスタチン遺伝子の発現（図８Ａ及びず８Ｄ）は、経時的プロトコルを、異所Ｐａｘ４発現によって終了させた場合（処理Ｅ＝Ｐｄｘ−１→ＭａｆＡ→Ｐａｘ４）に上昇した。この連続的プロトコルは、グルコース調節（プロ）インスリン分泌を低下させる影響も示し、またＩｓｌ１の内因性発現の増加にも関連していた（図３Ｃ及び図３Ｅ）。β細胞系列に沿った成熟の低下は、ソマトスタチン遺伝子発現の上昇及びソマトスタチン陽性細胞の数の増加に関連していた（図８Ｆ）。細胞の多くが、ソマトスタチン及びインスリンの共局在化を示した（ここにはデータ示さず）。
実施例６で述べたような階層的投与（処置Ｃ）からの各ｐＴＦの排除は、グルカゴン及びソマトスタチン発現における個々のｐＴＦの役割を更に調べるためにも利用できた（図８Ｂ及び図８Ｄ）。Ｐａｘ４排除は、実質的にソマトスタチン遺伝子発現を低下させたが、これはこの因子がこの遺伝子の転写を誘導する役割を果たす可能性を示唆している。興味深いことに、発達プロセスの最後におけるＭａｆＡの排除はまた、実質的にソマトスタチン遺伝子発現を増加させたが、これはＭａｆＡのソマトスタチン遺伝子発現に対する阻害効果の可能性を示唆している。この効果は、ＭａｆＡのＩｓｌ１発現を抑制する能力のためであるとも考えられる。この仮説を検討するため、異所Ｉｓｌ１のソマトスタチン遺伝子発現に対する効果を解析した。実際、３日目にＭａｆＡと一緒にＡｄ−Ｉｓｌ１投与を行うと（Ｃ＋Ｉｓｌ１）、ソマトスタチン遺伝子発現が増加し（図８Ｅ）、一方インスリン遺伝子発現、ホルモンの産生及び分泌は低下した（図８Ａ、図８Ｂ、及び図７）。これらの実験条件の下で、インスリン産生細胞の４０％がソマトスタチンについて陽性に染色され、ソマトスタチンだけを発現する細胞はほとんどなかった。
これらの結果は、分化転換された細胞のβ細胞への成熟の一部が、分化転換プロセスの遅い段階におけるＭａｆＡ発現に起因していることを示唆している。この段階では、ＭａｆＡが、そのＩｓｌ１発現を阻害する能力に関連するプロセスにおいてソマトスタチン発現を制限する。
図９は、膵臓転写因子に誘導された肝臓から膵臓への分化転換の、提案されたメカニズムを示す。ｐＴＦの各々は、限られた数のヒト肝細胞において、少量のβ細胞様表現型を活性化する能力を有する。ｐＴＦの一斉同時発現は、肝臓から内分泌膵臓への分化転換をめざましく上昇させる。しかし、新たに生成された細胞は未成熟で、かつインスリンとソマトスタチンを同時発現する。同じ因子群の直接的で階層的な形での連続的な投与のみが、分化転換効率と、分化転換された細胞のβ細胞系列に沿った成熟の両方を増加させる。
実施例１０（１）：インビボでの分化転換能力を有する細胞の集団の特定
分化転換能力を有する細胞の集団を、マウスにおいてインビボで特定した。Ｐｄｘ−１遺伝子の異所発現を、マウスの肝臓で達成した。肝臓の細胞の約４０〜５０％における異所Ｐｄｘ−１の一様な発現（図１０の（Ａ））（非特許文献１７、及び非特許文献１５）にも関わらず、インビボでＰｄｘ−１処置したマウスのインスリン産生細胞（ＩＰＣ）は、主として中心静脈に近い位置にしか存在していなかったが、これは活性Ｗｎｔシグナル伝達及びグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）の発現によって特性化される（図１Ｃ）。Ｐｄｘ−１によるＧＳ発現及びインスリン活性化の共局在化は、ＧＳＲＥを活性化し得るそれらの細胞が、高い分化転換能力を有する傾向を有することも示していた。従って、ＧＳＲＥ活性化及び活性Ｗｎｔシグナル伝達経路によって、分化転換する傾向を有する細胞の集団を特定することが可能である。
実施例１０（２）：アデノウイルスを用いた分化転換する傾向を有するヒト肝細胞の特定
この実施例は、分化転換する傾向を有するヒト肝細胞を特定するための組換えアデノウイルスの使用を具体的に示す。培地におけるヒト肝細胞は、細胞内Ｗｎｔシグナル伝達経路及びＧＳの発現の活性化に関して不均一である。ＧＳは中心周辺肝で独特に発現されるので、ＧＳＲＥ（ＧＳ調節エレメント）を活性化する能力を、適切な細胞の単離の選択パラメータとして用いることができる（非特許文献７６、非特許文献７７、非特許文献７８）。
加えて、ＧＳＲＥがＳＴＡＴ３結合エレメントも含むので、細胞の分化転換傾向は、このエレメントによっても媒介され得る。ＳＴＡＴ３経路も、細胞への再プログラム化または分化転換する傾向の付与に関与し得る。
実施例１１：培地におけるヒト肝細胞の１３〜１５％に対するＧＳＲＥの反復的な標的化
ＧＳＲＥは、ＴＣＦ／ＬＥＦ及びＳＴＡＴ５結合エレメント（図１１）を含む。最小ＴＫプロモーター（図１１）に機能可能的にリンクしたＧＳＲＥ（図１１）の制御下でのｅＧＦＰ遺伝子またはＰｄｘ−１遺伝子の発現を有する２つの組換えアデノウイルスを生成した。これらのアデノウイルスは、Ｐｄｘ−１（図１２の（Ａ））またはｅＧＦＰ（図１２の（Ｂ））のいずれかの発現を作動させた。両タンパク質は、培地におけるヒト肝細胞の１３〜１５％において反復的に発現されたが、このことは、特定の肝細胞の集団の標的化（ターゲティング）を示唆している。
実施例１２：ＣＭＶに作動させられたＰＤＸ１より高い、ＧＳＲＥに作動させられたＰＤＸ１の肝細胞におけるインスリン産生の活性化における効率
ＧＳＲＥに作動させられたＰＤＸ−１は培地の細胞の約１３±２％でのみ反復的に発現されたが、その分化転換能力は、培地における細胞の６０〜８０％においてＰｄｘ−１発現を作動させるＡｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１によって誘導された場合と同程度であるか、それより高かった（図１３）。ＧＳＲＥ活性化細胞は、培地における成人ヒト肝細胞の全体の分化転換能力の大半をそれが占めるものであり得る。インスリンの産生は、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｐｄｘ−１で処置したＰｄｘ−１陽性細胞の１％で生じたのに対して、Ａｄ−ＧＳＲＥ−Ｐｄｘ−１処置の後にＰｄｘ−１陽性細胞の２５％で生じた。
実施例１３：レンチウイルスを用いたＧＳＲＥ＋細胞のＥＧＦＰによる永久的標識付け
永久的系列追跡（lineage tracing）を、レンチウイルス構築物を用いて行った。インビトロでのＧＳＲＥ活性についての系統追跡を、ケラチノサイトにおけるＫＲＴ５の追跡（非特許文献７９）、または肝細胞におけるアルブミン発現の追跡（非特許文献７２）のために最近使用されている改変された二重レンチウイルス系によって行った。このレンチウイルス系（Universite Pierre et Marie Curie Paris, FranceのProf. P. Ravassardの協力；図１２の（Ａ））は、ＣＭＶ−ｌｏｘＰ−ＤｓＲｅｄ２−ｌｏｘＰ−ｅＧＦＰ（Ｒ／Ｇ）リポーター（非特許文献７２、非特許文献７９、非特許文献８０）、及びＧＳＲＥ及び最小ＴＫプロモーターの制御の下でＣｒｅリコンビナーゼを有する追加のレンチウイルスベクターを含む（Prof. Gaunitz, Germanyからの無償提供（非特許文献７６、非特許文献７８参照）、図３Ａ）。従って、ＧＳＲＥ活性化細胞はｅＧＦＰによって不可逆的に標識され（ｅＧＦＰ＋）、感染疑いのある細胞の残余はＤｓＲｅｄ２によって標識される（ＤｓＲｅｄ２＋）。１０日目までに細胞の１０〜１４％がｅＧＦＰ＋となった（図１４の（Ｂ））。その細胞は、細胞ソーターによって分離して（図１４）、別々に増殖させた（図１５の（Ａ））。ｅＧＦＰ＋（ＧＳＲＥアクチベーター）細胞の培地及びＤｓＲｅｄ２＋細胞の培地は、１０名の異なるヒトのドナー（年齢３〜６０歳）から生成した。
実施例１４：持続的に優れた分化転換能力を示すＥＧＦＰ＋
ＧＳＲＥ活性に従って系統追跡することによって分離されたヒト肝細胞を効率的に増殖し（図１５の（Ａ））、同様に効率的に組換えアデノウイルスに感染させた。ｅＧＦＰ＋細胞は持続的に優れた分化転換能力を示した（図１６）が、これは、培地におけるヒト膵島の場合に匹敵するインスリン及びグルカゴン遺伝子発現（図１６の（Ａ））、グルコース調節新インスリン分泌（図１６の（Ｂ））及びグルコース調節Ｃ−ペプチド分泌（図１６の（Ｃ））によって裏付けられた。これらの能力は持続的であり、過剰細胞増殖時に低減することはなかった（図１７）。
実施例１５：分化転換する傾向を有する細胞の特性化
ヒト肝細胞の明確に異なる分化転換効率に影響を与える可能性のある因子を特定するために、本発明者は、マイクロアレイチップ解析を用いて２つの分離された細胞の集団のグローバルな遺伝子発現プロフィールを比較した。３名の異なるドナーに由来するヒト肝細胞を培養し、ｅＧＦＰ＋及びＤｓＲｅｄ２＋細胞に分離し、４継代にわたって増殖させた。抽出したＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｕｍａｎ Ａｒｒａｙ （GeneChip Human Genome U133A 2.0 Array, Affymetrix）を用いてマイクロアレイ解析にかけた。遺伝子の大半は、分離された群において同程度のレベルで発現されたが、約８００プローブの発現は有意に異なっていた（図１８）マイクロアレイチップ解析によれば、膜タンパク質をコードする約１００の遺伝子が、分化転換傾向のあるもの（ｅＧＦＰ＋）と非応答性のもの（ＤｓＲｅｄ２＋）との間で異なって発現される。これらのマーカーのいくつかを、表２に示す。
Figure 2016521559
マイクロアレイデータは、ｅＧＦＰ＋細胞とＤｓＲｅｄ２＋細胞との間で異なって発現される多数の膜タンパク質を示唆している（倍率＝ＤｓＲｅｄ２＋と比較したｅＧＦＰ＋の異なる発現（ｌｏｇ２））。提示された抗原は全て市販の抗体である。
実施例１６：分化転換する傾向を有する細胞における活性のＷＮＴシグナル伝達
肝臓の分帯（zonation）は、活性化されたβカテニンレベルの勾配によって調節されることが示唆されてきたが、肝臓における細胞の大半は非常に低いβカテニン活性しか有しておらず、中心周辺肝細胞が、活性のＷｎｔシグナル伝達に関連する高いβカテニン活性を示す（非特許文献７６）。Ｗｎｔシグナル伝達は、コンピテントなβ細胞活性に必須であることから（非特許文献８１、非特許文献８２、非特許文献８３、非特許文献８４）、肝臓におけるｐＴＦで誘導された膵臓系列の活性化は、アプリオリに活性のＷｎｔシグナル伝達を示す細胞に制限される。
ＧＳＲＥは、ＧＳの５'エンハンサーから単離されたＴＣＦ調節エレメントを利用していた。Ｐｄｘ−１に誘導された肝臓から膵臓への分化転換が、部分的に細胞内Ｗｎｔシグナル伝達経路によって媒介されている場合には、Ｗｎｔシグナル伝達系を変化させる因子も分化転換効率に影響を与えるはずである（図１９）。
成人ヒト肝細胞におけるこのデータは、Ｗｎｔ３ａの濃度が上昇するとＰｄｘ−１に誘導されたグルコース調節インスリン分泌が増加したこと、一方ＤＫＫ３（Ｗｎｔシグナル伝達経路のインヒビター）がこのプロセスにおけるＰｄｘ−１の影響を完全に無くしたことを示唆している。
ＤＫＫ３は、ＧＳＲＥを活性化するその能力によって単離されたｅＧＦＰ細胞の分化転換能力を完全に失わせた（図２０）。
ｅＧＦＰ＋及びＤｓＲｅｄ＋細胞の集団におけるＷｎｔシグナル伝達経路活性の特性化を行った。ＡＰＣ発現は、βカテニンの不安定化に関与し、従ってＷｎｔシグナル伝達を減少させるが、このＡＰＣ発現はＤｓＲｅｄ２＋細胞における発現がｅＧＦＰ＋細胞の場合より７００％高かった（図２１の（Ａ）、インビボで示される分帯（zonation）と相対的に一致）。ｅＧＦＰ＋細胞の集団は、ＤｓＲｅｄ２＋細胞で解析されたレベルと比較して活性化されたβカテニンレベルが（４０％）高かった（図２１の（Ｂ）及び（Ｃ））。これらのデータは、Ｗｎｔシグナル伝達は、ＧＳＲＥ活性化についてコンピテントで、分化転換する傾向を有する細胞において活性であることを立証している。
［他の実施形態］
本発明を、その詳細な説明において説明してきたが、上述の記載内容は、本発明の例示であって、限定を意図するものではなく、本発明の範囲は特許請求の範囲の請求項の記載によって定められる。他の態様、利点、及び改変も、特許請求の範囲の請求項の記載の範囲に含まれる。
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Claims (63)

  1. 成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法であって、
    （ａ）成体哺乳動物の非膵臓細胞を、膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチド、または膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸に、第１の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、Ｐａｘ−４ポリペプチド、ニューロＤ１ポリペプチド、またはＰａｘ−４ポリペプチドをコードする核酸、またはニューロＤ１ポリペプチドをコードする核酸に、第２の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を、ＭａｆＡポリペプチドまたはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸に、第３の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップとを含み、
    それによって、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造することを特徴とする方法。
  2. 成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法であって、
    （ａ）成体哺乳動物の非膵臓細胞を、膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチド、または膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸及び第２の膵臓転写因子に、第１の期間において該ポリペプチド、または該核酸及び前記第２の膵臓転写因子の取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、ＭａｆＡポリペプチド、またはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸に、第２の期間において、該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップとを含み、
    それによって、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造することを特徴とする方法。
  3. 請求項１または２に記載の方法であって、
    前記核酸は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸であることを特徴とする方法。
  4. 請求項２に記載の方法であって、
    前記第２の膵臓転写因子が、ニューロＤ１、Ｐａｘ−４、またはＮｇｎ３であることを特徴とする方法。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、
    ステップ（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の細胞を、Ｓｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸、またはＳｏｘ−９ポリペプチドに、該核酸またはポリペプチドの取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップを更に含むことを特徴とする方法。
  6. 請求項１に記載の方法であって、
    前記第２の期間が、前記第１の期間の後の少なくとも２４時間であることを特徴とする方法。
  7. 請求項１に記載の方法であって、
    前記第３の期間が、前記第２の期間の後の少なくとも２４時間であることを特徴とする方法。
  8. 請求項２に記載の方法であって、
    前記第２の期間が、前記第１の期間の後の、少なくとも２、３、４、５、６、または７日間であることを特徴とする方法。
  9. 請求項１に記載の方法であって、
    前記第１の期間、前記第２の期間、及び前記第３の期間が、同じ時間であることを特徴とする方法。
  10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記細胞が、骨髄細胞、筋細胞、脾臓細胞、腎細胞、血液細胞、皮膚細胞、膵臓細胞、及び肝細胞からなる群から選択されることを特徴とする方法。
  11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記細胞が、インビボで接触されることを特徴とする方法。
  12. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記細胞が、インビトロで接触されることを特徴とする方法。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項の記載の方法であって、
    前記細胞の集団が、少なくとも５億個の細胞を含むことを特徴とする方法。
  14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、
    ステップ（ａ）の前に、前記細胞が培地において増殖されることを特徴とする方法。
  15. 変性膵臓疾患の治療のための方法であって、治療が必要な患者に対して、
    （ａ）ＰＤＸ−１ポリペプチドまたはＰＤＸ−１ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、第１の期間投与するステップと、
    （ｂ）Ｐａｘ−４ポリペプチド、ニューロＤ１ポリペプチド、またはＰａｘ−４ポリペプチドをコードする核酸、またはニューロＤ１ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、第２の期間投与するステップと、
    （ｃ）ＭａｆＡポリペプチドまたはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、第３の期間投与するステップとを含む方法。
  16. 変性膵臓疾患の治療のための方法であって、治療が必要な患者に対して、
    （ａ）ＰＤＸ−１ポリペプチド、またはＰＤＸ−１ポリペプチドをコードする核酸及び第２の膵臓転写因子を含む組成物を、第１の期間投与するステップと、
    （ｂ）ＭａｆＡポリペプチド、またはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、第２の期間投与するステップとを含む方法。
  17. 請求項１５または１６に記載の方法であって、
    前記核酸は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸であることを特徴とする方法。
  18. 請求項１５に記載の方法であって、
    前記第２の膵臓転写因子が、ニューロＤ１、Ｐａｘ−４、またはＮｇｎ３であることを特徴とする方法。
  19. 請求項１５に記載の方法であって、
    Ｓｏｘ−９ポリペプチド、またはＳｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を投与するステップを更に含むことを特徴とする方法。
  20. 請求項１５に記載の方法であって、
    前記第２の期間が、前記第１の期間の後の少なくとも２４時間であることを特徴とする方法。
  21. 請求項１５に記載の方法であって、
    前記第３の期間が、前記第２の期間の後の少なくとも２４時間であることを特徴とする方法。
  22. 請求項１６に記載の方法であって、
    前記第２の期間が、前記第１の期間の後の、少なくとも２、３、４、５、６、または７日間であることを特徴とする方法。
  23. 変性膵臓疾患の治療のための方法であって、治療が必要な患者に対して、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法で製造された細胞の集団を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
  24. 請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記変性膵臓疾患が、糖尿病であることを特徴とする方法。
  25. 請求項２４に記載の方法であって、
    前記糖尿病が、１型糖尿病、２型糖尿病、または妊娠糖尿病であることを特徴とする方法。
  26. 請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記変性膵臓疾患が、膵臓癌または膵炎であることを特徴とする方法。
  27. 請求項１、２、１５、及び１６のいずれか一項に記載の方法において使用するための、ＰＤＸ−１ポリペプチドをコードする核酸及び第２の膵臓転写因子をコードする核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
  28. 請求項２７に記載の発現ベクターであって、
    前記第２の膵臓転写因子が、ニューロＤ１、Ｐａｘ−４、またはＮｇｎ３であることを特徴とする発現ベクター。
  29. 増強されたヒト細胞の集団であって、
    前記集団における細胞の少なくとも５％が、グルタミンシンセターゼ応答要素（ＧＳＲＥ）を活性化できることを特徴とする細胞の集団。
  30. 請求項２５に記載の細胞の集団であって、
    前記細胞が、内皮細胞、上皮細胞、間葉細胞、線維芽細胞、または肝細胞であることを特徴とする細胞の集団。
  31. 請求項２６に記載の細胞の集団であって、
    前記肝細胞は、中心周辺肝に由来することを特徴とする細胞の集団。
  32. 請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の細胞の集団であって、
    前記細胞が、活性Ｗｎｔシグナル伝達を有することを特徴とする細胞の集団。
  33. 請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の細胞の集団の単離されたものであって、
    前記細胞が、膵臓転写因子を異所的に発現するように処理されたとき、少なくとも５％の細胞が、インスリンを産生するか、ｃ−ペプチドを分泌することを特徴とする細胞の集団。
  34. 請求項３３に記載の細胞の集団の単離されたものであって、
    前記膵臓転写因子が、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする細胞の集団。
  35. 請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の細胞の集団であって、
    前記細胞の集団が、
    （ａ）Ｗｎｔ３ａ、
    （ｂ）低レベルのＤＫＫ１またはＤＫＫ３、
    （ｃ）低レベルのＡＰＣ、
    （ｄ）高レベルの活性化されたβカテニン、または
    （ｅ）ＳＴＡＴ３結合要素（ｃｉｓ作用因子）
    の少なくとも１つを発現することを特徴とする細胞の集団。
  36. 請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の細胞の集団の単離されたものであって、
    前記細胞が、
    （ａ）低レベルのＨＯＭＥＲ１、ＬＡＭＰ３、またはＢＭＰＲ２か、または
    （ｂ）低レベルのＡＢＣＢ１、ＩＴＧＡ４、ＡＢＣＢ４、またはＰＲＮＰを発現することを特徴とする細胞の集団。
  37. 転写因子誘導型分化転換のための増強された能力を有する細胞の集団を単離する方法であって、
    （ａ）異種のヒト細胞の集団を提供するステップと、
    （ｂ）レポータータンパク質に機能可能的にリンクされた、グルタミンシンターゼ転写の活性化が可能なグルタミンシンセターゼ応答要素（ＧＳＲＥ）またはその断片を含む核酸作製物を導入するステップと、
    （ｃ）前記レポータータンパク質を発現する細胞を単離するステップとを含み、
    それによって増強された分化転換能力を有する細胞の集団を単離することを特徴とする方法。
  38. 請求項３７に記載の方法であって、
    前記核酸作製物が、プロモーター／エンハンサーを更に含むことを特徴とする方法。
  39. 請求項３７または３８に記載の方法であって、
    前記レポータータンパク質が、蛍光タンパク質であることを特徴とする方法。
  40. 請求項３７または３８に記載の方法であって、
    前記レポータータンパク質が、選択圧に対する耐性を提供することを特徴とする方法。
  41. 請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法であって、
    前記細胞が、内皮細胞、線維芽細胞、間葉細胞または肝細胞であることを特徴とする方法。
  42. 請求項３７に記載の方法であって、
    前記肝細胞が、中心周辺肝に由来することを特徴とする方法。
  43. 請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法であって、
    単離された前記細胞を培養するステップを更に含むことを特徴とする方法。
  44. 請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の方法によって単離された細胞の集団。
  45. 膵臓疾患の症状を治療または軽減する方法であって、
    （ａ）請求項４４に記載の細胞の集団に膵臓転写因子を導入するステップと、
    （ｂ）治療が必要な患者に対して前記細胞の集団を投与するステップとを含むことを特徴とする方法。
  46. 請求項４５に記載の方法であって、
    前記膵臓疾患が、糖尿病または膵炎であることを特徴とする方法。
  47. 請求項４５に記載の方法であって、
    前記膵臓転写因子がＰｄｘ−１、Ｐａｘ−４、ＭａｆＡ、ニューロＤ１、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする方法。
  48. 成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法であって、
    （ａ）請求項４４の細胞の集団を、膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチド、または膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸に、第１の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、Ｐａｘ−４ポリペプチド、ニューロＤ１ポリペプチド、またはＰａｘ−４ポリペプチドをコードする核酸、またはニューロＤ１ポリペプチドをコードする核酸に、第２の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）の細胞を、ＭａｆＡポリペプチドまたはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸に、第３の期間において該ポリペプチドまたは該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップとを含み、
    それによって、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造することを特徴とする方法。
  49. 成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造する方法であって、
    （ａ）請求項４４の細胞の集団を、膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチド、または膵臓及び十二指腸のホメオボックス（ＰＤＸ−１）ポリペプチドをコードする核酸及び第２の膵臓転写因子に、第１の期間において該ポリペプチド、または該核酸及び前記第２の膵臓転写因子の取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の細胞を、ＭａｆＡポリペプチド、またはＭａｆＡポリペプチドをコードする核酸に、第２の期間において、該核酸の取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップとを含み、
    それによって、成熟膵β細胞の表現型及び機能を有する細胞の集団を製造することを特徴とする方法。
  50. 請求項４８または４９に記載の方法であって、
    前記核酸は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸であることを特徴とする方法。
  51. 請求項４９に記載の方法であって、
    前記第２の膵臓転写因子が、ニューロＤ１、Ｐａｘ−４、またはＮｇｎ３であることを特徴とする方法。
  52. 請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法であって、
    ステップ（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の細胞を、Ｓｏｘ−９ポリペプチドをコードする核酸、またはＳｏｘ−９ポリペプチドに、該核酸またはポリペプチドの取り込みを可能にする条件の下で接触させるステップを更に含むことを特徴とする方法。
  53. 請求項４８に記載の方法であって、
    前記第２の期間が、前記第１の期間の後の少なくとも２４時間であることを特徴とする方法。
  54. 請求項４８に記載の方法であって、
    前記第３の期間が、前記第２の期間の後の少なくとも２４時間であることを特徴とする方法。
  55. 請求項４９に記載の方法であって、
    前記第２の期間が、前記第１の期間の後の、少なくとも２、３、４、５、６、または７日間であることを特徴とする方法。
  56. 請求項４８に記載の方法であって、
    前記第１の期間、前記第２の期間、及び前記第３の期間が、同じ時間であることを特徴とする方法。
  57. プロモーター及びレポータータンパク質に機能可能的にリンクされた、グルタミンシンセターゼ応答要素（ＧＳＲＥ）を１または複数含む核酸作製物。
  58. 請求項５７に記載の核酸作製物であって、
    前記プロモーターが、弱いプロモーターであることを特徴とする核酸作製物。
  59. 請求項５７または５８に記載の核酸作製物であって、
    転写因子を更に含むことを特徴とする核酸作製物。
  60. 請求項５９に記載の核酸作製物であって、
    前記転写因子が、膵臓転写因子であることを特徴とする核酸作製物。
  61. 請求項６０に記載の核酸作製物であって、
    前記膵臓転写因子が、ＰＤＸ−１、Ｐａｘ４、ＮａｆＡ、またはニューロＤ１であることを特徴とする核酸作製物。
  62. 請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の核酸作製物を含むベクター。
  63. 請求項６２のベクターであって、
    前記ベクターが、アデノウイルスベクターであることを特徴とするベクター。
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