CN105555950A - 细胞群体、转分化的方法及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了顺序地且时间调控地施用胰腺转录因子以诱导非胰腺细胞沿着胰腺β-细胞谱系转分化和成熟的方法。本发明还提供了鉴别、分离和富集易于转分化的细胞的方法，以及用于治疗退行性胰腺疾病如糖尿病的方法。

Description

细胞群体、转分化的方法及其使用方法

相关申请

本申请要求2013年6月13日提交的临时申请USSN61/834,759以及2013年6月13日提交的临时申请USSN61/834,767的优先权和权益，其内容以整体援引加入本文。

发明领域

本发明整体上涉及易于转分化的细胞群体，以及用于产生具有成熟的胰腺β细胞表型和功能的细胞的方法。

发明背景

胰腺中郎格罕氏岛的β细胞应答因子而分泌胰岛素，所述因子如氨基酸、甘油醛、游离脂肪酸，以及最突出的葡萄糖。正常胰岛β细胞感知血液葡萄糖浓度提升以及通过分泌胰岛素而应答葡萄糖水平升高的能力对于控制血液葡萄糖水平是至关重要的。应答葡萄糖负载而提高的胰岛素分泌在正常个体中通过激发葡萄糖摄取至外周组织(特别是肌肉和脂肪组织)而防止高血糖。

胰岛β细胞功能受损的个体会患有糖尿病。胰岛素依赖性糖尿病、或者IDDM(也已知为青少年发病(Juvenile-onset)或者1型糖尿病)，占所有人类糖尿病的大约10％。IDDM与非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)的不同之处在于只有IDDM才涉及产胰岛素的郎格罕氏岛β细胞的特定破坏。IDDM中β细胞的破坏看起来是特定自身免疫攻击的结果，其中患者自身的免疫系统识别并破坏β细胞，但却并不识别和破坏周围包含胰岛的的α细胞(产胰高血糖素)或者δ细胞(产生长激素抑制素)。

IDDM的治疗选择集中在自我注射胰岛素(一种不便且不精准的治疗方案)，因而非常需要开发新的治疗策略。已有研究使用胰岛或者胰腺片段移植的可能性来作为持久性胰岛素替代的措施(Lacy,1995；Vajkoczy等,1995)。目前的方法使用尸体材料或者猪胰岛作为移植基材(Korbutt等,1997)。然而，需要克服的重要问题是供体组织的低可用性、经解体而获得的胰岛的易变性和低产率、以及由于分离过程而可能发生的酶以及物理损坏(Secchi等,1997；Sutherland等,1998中有综述)。另外的问题还有免疫排斥以及目前对使用猪胰岛异种移植的担忧。

很清楚的是非常需要建立胰岛素自我注射治疗糖尿病的替代方案。虽然干细胞研究在此方面显示出前景，但是目前还未取得大的成功。需要改进的用于糖尿病的治疗的非胰腺细胞的分离、培养和转分化的方法。

发明概述

本发明提供了生产具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体的方法，其中是通过于第一时间段将成年哺乳动物非胰腺细胞与胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽、或编码胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽的核酸接触(在允许摄取所述多肽、或核酸的条件下)；继而在第二时间段将所述细胞与Pax-4多肽、NeuroD1多肽、或编码Pax-4多肽的核酸、或编码NeuroD1多肽的核酸接触(在允许摄取所述多肽或核酸的条件下)；以及继而于第三时间段将所述步骤的细胞与所述MafA多肽或编码MafA多肽的核酸接触(在允许摄取所述多肽或核酸的条件下)。第二时间段为第一时间段之后至少24小时。第三时间段为第二时间段之后至少24小时。在一些实施方案中第一、第二和第三时间段是同时。

另外本发明还提供了生产具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体的方法，其中是通过于第一时间段将成年哺乳动物非胰腺细胞与胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽或编码胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽的核酸以及第二胰腺转录因子接触(在允许摄取所述PDX-1多肽、或核酸以及所述第二胰腺转录因子的条件下)；以及继而于第二时间段将所述细胞与MafA多肽、或编码MafA多肽的核酸接触(在允许摄取所述核酸的条件下)。在一些实施方案中第二时间段是第一时间段之后至少2、3、4、5、6或7天。第二胰腺转录因子例如可以是NeuroD1、Pax-4、或Ngn3.

所述核酸是核糖核酸或者脱氧核糖核酸。

任选地，进一步在允许摄取核酸或多肽的条件下将细胞与编码Sox-9多肽的核酸或Sox-9多肽接触。

所述细胞是骨髓、肌肉、脾、肾、血液、皮肤、胰腺、和肝细胞。所述细胞在体内进行接触。所述细胞在体外进行接触。由本发明的方法所产生的细胞群体包括至少5亿细胞。在一些实施方案中，在与所述多肽或核酸接触前，在培养中将所述细胞进行扩增。

本发明还包括治疗退行性胰腺疾病的方法，其中是通过向有需要的对象施用：包含PDX-1多肽或编码PDX-1多肽的核酸的组合物，于第一时间段；包含Pax-4多肽、NeuroD1多肽、编码Pax-4多肽的核酸、或编码NeuroD1多肽的核酸的组合物，于第二时间段；以及包含MafA多肽或编码MafA多肽的核酸的组合物，于第三时间段。第二时间段为第一时间段之后至少24小时。第三时间段为第二时间段之后至少24小时。在一些实施方案中第一、第二和第三时间段是同时。

本发明还提供了治疗退行性胰腺疾病的方法，其中是通过向有需要的对象施用：包含PDX-1多肽、或编码PDX-1多肽的核酸以及第二胰腺转录因子的组合物，于第一时间段；以及包含MafA多肽或编码MafA多肽的核酸的组合物，于第二时间段。在一些实施方案中第二时间段为第一时间段之后至少2、3、4、5、6或7天。所述第二胰腺转录因子是例如，NeuroD1、Pax-4、或Ngn3。

所述核酸是核糖核酸或脱氧核糖核酸。

任选地，所述对象还施用了编码Sox-9多肽的核酸或Sox-9多肽(在允许摄取所述核酸或多肽的条件下)。

本发明还包括治疗退行性胰腺疾病的方法，其中是通过向有需要的对象施用本发明方法所产生的细胞群体。

所述退行性胰腺疾病是糖尿病，如1型、2型或妊娠期糖尿病。或者，所述退行性胰腺疾病是胰腺癌或胰腺炎。

本发明还提供了包括编码PDX-1多肽的核酸和编码第二转录因子的核酸的表达载体，或者在任何所述方法中用于产生具有成熟胰腺β细胞表型细胞群体的用途，或者用于治疗退行性胰腺疾病的用途。所述第二转录为例如NeuroD1、Pax-4、Ngn3或Sox-9。

本发明还包括能够激活谷氨酰胺合成酶应答元件(GSRE)的富集的人类细胞群体。所述群体中的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或更多的细胞能够激活谷氨酰胺合成酶应答元件(GSRE)。所述细胞是内皮细胞、上皮细胞、间质细胞、成纤维细胞、或肝细胞。在某些方面所述肝细胞源自外周肝。优选地，所述细胞具有有活性的Wnt信号。当所述细胞被处理为异位表达胰腺转录因子如Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或其组合时，所述群体中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或更多的细胞产生胰岛素或者分泌C肽。任选地，细胞群体表达以下的至少一种：Wnt3a；水平降低的DKK1或DKK3；水平降低的APC；水平提高了的激活的β-连环蛋白；或STAT3结合元件(顺式作用因子)。在分离自所述细胞群体的肝细胞的某些方面，所述细胞表达水平提高的HOMER1、LAMP3、或BMPR2；或水平降低的ABCB1、ITGA4、ABCB4、或PRNP。

本发明还提供了分离具有富集的转录因子诱导转分化能力的细胞群体的方法，所述方法是通过：提供混杂的人类细胞群体；引入核酸构建体，所述核酸构建体包含谷氨酰胺合成酶应答元件(GSRE)，或者其能够激活谷氨酰胺合成酶转录的片段(可操作地连接至报道蛋白)，以及分离表达报告蛋白的细胞。任选地，所述核酸构建体还包含启动子/增强子。所述报道蛋白是荧光蛋白。所述报道蛋白提供了对选择压力的抗性。所述细胞是内皮细胞、成纤维细胞，间质细胞或肝细胞。所述肝细胞源自外周肝。

任选地，所述方法还包括培养分离的细胞。

本发明还包括通过本发明的方法所分离的细胞群体。

在另外的方面本发明包括了治疗或减缓胰腺病症的症状的方法，其中是通过将胰腺转录因子引入至本发明的方法所分离的细胞群体，将所述细胞群体施用给有需要的对象。所述胰腺病症是糖尿病或胰腺炎。所述胰腺转录因子是Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1，或其组合。

本发明还包括生产具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体的方法，其中是通过：于第一时间段将本发明的方法所分离的细胞群体与胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽、或编码胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽的核酸接触(在允许摄取所述多肽或核酸的条件下)；继而于第二时间段将所述细胞与Pax-4多肽、NeuroD1多肽、或编码Pax-4多肽的核酸、或编码NeuroD1多肽的核酸接触(在允许摄取所述多肽或核酸的条件下)；以及继而于第三时间段将所述步骤的细胞与MafA多肽或编码MafA多肽的核酸接触(在允许摄取所述多肽或核酸的条件下)。第二时间段为第一时间段之后至少24小时。第三时间段为第二时间段之后至少24小时。在一些实施方案中第一、第二和第三时间段是同时。

另外本发明还提供了生产具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体的方法，其中是通过：于第一时间段将本发明的方法所分离的细胞群体与胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽或编码胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽的核酸以及第二胰腺转录因子接触(在允许与所述PDX-1多肽、或核酸以及所述第二胰腺转录因子接触的条件下)；以及继而于第二时间段将所述细胞与MafA多肽、或编码MafA多肽的核酸接触(在允许摄取所述核酸的条件下)。在一些实施方案中第二时间段为第一时间段之后至少2、3、4、5、6或7天。所述第二胰腺转录因子是例如NeuroD1、Pax-4或Ngn3。

所述核酸是核糖核酸或脱氧核糖核酸。

任选地，所述细胞还与编码Sox-9多肽的核酸或Sox-9多肽接触(在允许摄取所述核酸或多肽的条件下)。

本发明提供了核酸构建体，其包含可操作地连接至启动子和报道蛋白的一个或多个谷氨酰胺合成酶应答元件(GSRE)。所述启动子是弱启动子。所述核酸构建体还含有转录因子。所述转录因子是胰腺转录因子，如Pdx-1、Pax-4、MafA、或NeuroD1。本发明还包括含有本发明核酸构建体的载体。所述载体是腺病毒载体。

除非另有说明，本文所使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。但是与本发明所描述的类似的或者等同的方法或材料也可以用于本发明的实践和测试，适宜的方法和材料在下文中描述。所有出版物、专利申请、专利、和本文提到的其它参考均以其整体援引加入本文。在有冲突的情况下，则以本说明书(包括定义)为准。另外，所述的额材料、方法、和实施例仅用于进行说明而并非是要进行限制。

本发明的其它特征和优势将由下述具体描述以及由权利要求来进行阐明。

附图简述

图1显示人类肝细胞中的Pdx-1的表达在体外诱导了胰腺激素表达的逐渐激活。(A)胰岛素(INS)；(B)胰高血糖素(GCG)；(C)生长激素抑制素(SST)；和(D)其它胰腺-特异性转录因子(NKX6.1、ISL1、PAX4、MAFA、NeuroD1、NeuroG3)。该结果针对同一cDNA样品中的β-肌动蛋白基因表达而进行了归一化，并且表示为对比在同一天对照病毒所处理的细胞，相对表达的平均±SE。两个独立实验中n≥4(*p<0.05，**p<0.01)。

图2显示人类肝细胞胰腺转录因子(pTF)Pdx-1、Pax4、和MafA的异位共表达在体外促进了胰岛素(原)的分泌(与仅由各个所述pTF单独诱导相比)。(A)免疫荧光(IF)染色显示了pTF的表达：Pdx-1(左边组)、Pax4(左中组)、MafA(右中组)以及3种pTF的融合(右边组)，其中剪头标明细胞表达所有三种pTF。(B)荧光素酶测定了胰岛素启动子通过三种所示pTF的激活；使用β-gal作为对照。结果表示为相对光单位(RLU)/mg蛋白。每个数据点代表至少两个独立实验的平均±SE，*p<0.05，**p<0.01对比经对照病毒处理的细胞，(n>4)。(C)免疫荧光染色显示了所示pTF异位表达之后的胰岛素阳性细胞。原始放大率x20。IF染色的定量化在表中(右)。通过从至少两个独立实验中计数至少500个阳性细胞来计算胰岛素阳性细胞的百分比。(D)通过放射免疫测定来检测用所示浓度的葡萄糖诱导之后的胰岛素分泌。*p<0.05，五个独立实验中n≥12。显著性代表了三重感染和所有其它处理之间的差异。

图3显示pTF：Pdx-1、Pax4、和MafA的协同和顺序表达对胰腺β-细胞成熟的作用。(A)示意证明pTF(处理B-E)或对照病毒(Ad-CMV-β-gal，处理A)的感染次序。(B)胰岛素免疫荧光染色：处理B(左边组)、处理C(中间组)、处理D(右边组)。原始放大率为x20。染色的定量(百分比)在每个图下面标出。通过从至少两个独立实验中计数至少1000个阳性细胞来计算胰岛素阳性细胞的百分比。通过放射免疫测定来检测与所示浓度的葡萄糖温育之后的(C)胰岛素和(D)C肽分泌。感染处理在X-轴上示出并在表3A中解释。*p<0.05，**p<0.01，与经对照病毒处理的细胞相比；在五个独立实验中n≥12。(E)通过RT-PCR测量了在所示处理(X-轴)之后所示内源胰腺特异性转录因子的表达水平。CT值针对相同cDNA样品中β-肌动蛋白基因表达而进行了归一化。结果表示为相对表达的平均±SE(对比经对照病毒处理的细胞的相对水平)，*p<0.05n≥8(4个独立实验中)。箭头指出了处理C中Isl-1表达水平的具体降低。

图4显示证明转分化效力的三幅图，表明感染的序位顺序(处理C)是最有效的。(A)在所示的感染处理之后通过荧光素酶测定来测定胰岛素启动子激活。结果表示为相对光单位(RLU)/mg蛋白。每个数据点代表了至少两个独立实验的平均±SE，*p<0.05，**P<0.01，与经对照病毒处理的细胞相比，(n>4)。(B)在所示感染处理之后通过RT-PCR来进行葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)表达水平的分析。CT值针对相同cDNA样品中β-肌动蛋白基因表达而进行了归一化。结果表示为与经对照病毒处理的细胞相比的平均±SE的相对水平。*p<0.05，与经对照病毒处理的细胞相比，在4个独立实验中n≥8。(C)在所示感染处理之后通过RT-PCR来确定激素原转化酶2(PC2；PCSK2)的表达水平。CT值针对相同cDNA样品中β-肌动蛋白基因表达而进行了归一化。结果表示为与经对照病毒处理的细胞相比的平均±SE的相对水平，**P<0.01,n≥8(4个独立实验中)。

图5显示了证明感染的序位顺序(处理C)之后C肽分泌的两幅图。(A)通过在0、5、10、15、20mM的葡萄糖中静态温育15分钟而由放射免疫测定测量了C肽分泌(在经"序位"顺序(处理C)处理的细胞中)，*P<0.05，n≥7(3个独立实验中)。(B)在分析C肽分泌之前，通过在无血清培养基(补加了胰岛素、铁转运蛋白和硒(ITS))中13天或28天的放射免疫测定而测量了C肽分泌。*P<0.05,**P<0.01，n≥5(2个独立实验中)。显著性代表了与标准方案相比的差异(在第6日处理C)。

图6显示所述pTF在转分化过程中各自作用的四幅图，其中使用处理C感染次序以及各个pTF的排除(C-Pdxl、排除Pdxl；C-Pax4，排除Pax4；以及C-Mafa，排除Mafa)。(A)通过荧光素酶测定测量了胰岛素启动子激活。结果表示为平均±SE，*p<0.1，**p<0.05与"序位”顺序感染次序(处理C)相比，n≥6(3个独立实验中)。(B)用所示浓度的葡萄糖温育15分钟之后并用放射免疫测定来测量的C肽分泌。*＝p<0.05，**＝p<0.01与直接"序位”顺序感染次序(C)相比，n≥6(3个独立实验中)。(C)通过RT-PCR测定了胰腺酶的表达水平：葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)；葡萄糖激酶(GCK)；以及激素原转化酶(PCSK2)。(D)通过RT-PCR测量了所示内源胰腺转录因子的表达水平。CT值针对相同cDNA样品中β-肌动蛋白基因表达而进行了归一化。与经"序位顺序感染"处理的肝细胞相比的平均±SE的相对水平。*p<0.05，**p<0.01，n≥6(三个独立实验中)。

图7显示三幅图，其显示Isl1表达对转分化的肝细胞的β-细胞成熟的作用(在经"序位"顺序(处理C)感染之后)。(A)通过RT-PCR测量了胰岛素的表达水平。CT值针对相同cDNA样品中β-肌动蛋白基因表达而进行了归一化。结果表示为与经对照病毒处理的细胞相比的平均±SE的相对水平。*P<0.05，n≥6(3个独立实验中)。(B)通过放射免疫测定测量了胰岛素。**P<0.01，n≥6并与直接"序位”顺序感染次序(C)相比，n≥6(3个独立实验中)。(C)通过RT-PCR测量了葡萄糖转运蛋白2(Glut2)的表达水平。

图8显示pTF在促进细胞分化产生胰高血糖素(a)和生长激素抑制素(δ)中各自的作用(使用感染的序位次序(处理C)以及排除各个pTF)。在所示的感染处理之后，通过RT-PCR测量了胰腺激素胰高血糖素(GCG)(A和B)和生长激素抑制素(SST)(A和D)的表达水平。(C)对于所示感染处理也通过RT-PCR测量了细胞特异性转录因子ARX和BRATN4的表达水平。(E)在额外用Isl1(100MOI)感染之后通过RT-PCR测量了生长激素抑制素(SST)的表达水平。CT值(A、B、C、和D的)针对相同cDNA样品中β-肌动蛋白基因表达而进行了归一化。结果表示为平均±SE的相对水平，其中是与经对照病毒处理的细胞相比(a)或与经"序位顺序感染"处理的肝细胞(b-e)相比。*P<0.05，**P<0.1，n≥6(3个独立实验中)。(F)免疫荧光染色：生长激素抑制素在处理C感染之后(左边组)，以及在处理C感染和额外的Isl1感染之后(右边组)。原始放大率X20。(G)生长激素抑制素和胰岛素的免疫荧光染色显示出，以直接的序位方式顺序施用转录因子导致所述转分化的细胞沿着类β-胰腺谱系提升成熟。

图9显示所提出的胰腺转录因子诱导的从肝转分化成胰腺的机制示意图。所述三种pTF的协同表达导致转分化的肝细胞数目升高(与每个所述因子各自作用相比)(B)。以直接的序位方式顺序施用转录因子导致转分化的细胞沿着类β-胰腺谱系提升成熟。

图10Pdx-l-诱导的在小鼠中的体内IPC激活局限于毗邻中央静脉的细胞(特征在于GS表达)。施用Ad-CMV-PDX-114天之后Pdx-1(A)和胰岛素(B)的免疫组织化学分析。箭头指示阳性细胞，大部分位于中央静脉(cv)附近。(C&D)在人类(C)和小鼠(D)肝脏中GS表达的分析表明在毗邻中央静脉的1-2层细胞层处有GS的表达。原始放大率x400。

图11GSRE含有Wnt信号应答元件-TCF-LEF结合位点。GSRE的示意图表明存在TCF-LEF和STAT5结合位点。

图12GSRE在体外靶向人类肝细胞亚群体。(A&D)Ad-GSRE-TK-Pdx-1或GFP重组腺病毒的示意图。肝细胞经Ad-GSRE-TK-Pdx-l(C)或经Ad-CMV-Pdx-1(B)感染。Pdx-1表达的免疫荧光分析表明有13±2％的被Ad-GSRETK-Pdx-l所感染的人类肝细胞(C)以及70±12％的经Ad-CMV-Pdx-1处理的细胞(B)表达了异位核因子(兔抗-Pdx-1，来自C.Wright的慷慨赠与，粉色；分别为B&C)。使用Ad-GSRE-TK-eGFP获得了类似的结果；～15％的细胞是eGFP阳性的(E&F)。Ad-CMV-eGFP感染在3-4天内导致了大约75-80％的eGFP阳性细胞(数据未给出)。

图13所述GSRE靶向易于转分化的细胞。将肝细胞用Ad-GSRE-TK-Pdx-l(B)或用Ad-CMV-Pdx-1(A)感染5天。(A&B)胰岛素的共染色的免疫荧光分析(豚鼠抗-胰岛素，Dako，绿色)和(Pdx-1兔抗-Pdx-1，来自C.Wright的慷慨赠与，粉色)。(C)在经处理的细胞中胰岛素激活的统计学分析；Ad-GSRE-TK-Pdx-1在50％的Pdx-1-阳性细胞中激活了胰岛素产生，而Ad-CMV-Pdx-1仅在5％的Pdx-1-阳性细胞中激活。蓝色-DAPI，核染色；原始放大率X20。

图14GSRE激活人类细胞的体外谱系追踪。(A)慢病毒载体的示意图。(B)用双慢病毒系统感染了第3-10代的成年人类肝细胞。在感染后10天对肝细胞进行了DsRed2(红)或eGFP(绿)荧光成像。(C)通过荧光-激活细胞分选仪(FACS；Aria细胞分选仪；BectonDickinson,SanJose,CA)对所述细胞进行分选，其中有荧光异硫氰酸素滤器(530/30nm)用于eGFP以及Pe-TexasRed滤器(610/20nm)用于DsRed2。(D&E)将分离的细胞分别培养若干代(原始放大率×10)。

图15eGFP+和DsRed2+细胞在体外有效增殖且具有类似的增值率和类似的感染能力。将分离的细胞群体分别培养～1个月。分析了每个组的增值率(A)。用Ad-CMV-β-gal(B&D)或用Ad-CMV-Pdx-1(C&E)将eGFP+(B&C)和DsRed2+(D&E)细胞感染3天。使用抗-Pdx-1(蓝色)的免疫荧光分析表明几乎80％的eGFP和DsRed2细胞被腺病毒感染。

图16eGFP+细胞与DsRed2+细胞相比对pTF-诱导的转分化的应答更有效率。将所述两组类似地用可溶性因子和pTF处理：用Ad-Pdx-l+Ad-Pax-4+ad-MafA或对照病毒(Ad-β-gal)处理6天，在两个分离的组比较了类β细胞的特征和功能：(A)在分子水平，通过与对照处理的细胞的定量实时比较研究了胰岛素和胰高血糖素基因表达。培养的胰腺人类胰岛细胞(第3代)用作阳性对照。(B&C)在功能水平，通过在低葡萄糖浓度接着高葡萄糖浓度(分别为KRB中2mM和17.5mM葡萄糖)的静态温育来分析了葡萄糖调节的胰岛素分泌。使用胰岛素放射免疫测定试剂盒(DPC；n≥8来自3个不同实验)或人类C肽放射免疫测定试剂盒(Linco；n≥8来自3个不同实验)测量了胰岛素(B)和C肽(C)分泌。*P<0.01相较于DsRed2+细胞，使用Studentt检验分析。

图17在eGFP+群体中随着培养代数的增加较高的转分化效率保持稳定。在分选后两个组分别进行增殖并且在几代之后(分选之后5-7代)或更多代之后(分选之后10-12代)类似地用pTF(Ad-Pdx-l+Ad-Pax-4+ad-MafA和可溶性因子)进行了处理。通过在低葡萄糖浓度接着高葡萄糖浓度(分别为KRB中2mM和17.5mM葡萄糖)的静态温育来分析了调节的胰岛素分泌。使用人类胰岛素放射免疫测定试剂盒(DPC；n≥6来自2个不同的实验)测量胰岛素分泌。在两种细胞群体中的低代数和高代数之间未检测到统计学显著地差异，表明eGFP标记的细胞具有沿着β-细胞谱系和功能进行pTF诱导的转分化的持续倾向。

图18通过微阵列分析对eGFP+和DsRed2+细胞的差异基因表达进行表征，并根据DAVIDBioinformaticsResources6.7进行分析。4％的差异基因属于Wnt信号通路。

图19有活性的Wnt信号促进肝至胰腺的转分化。如前所报道的，用Ad-CMV-Pdx-1和可溶性因子处理成年人类肝细胞，补充了Wnt3A(50ng/mlR&D或DKK3μg/mlR&D)。5天之后，通过在低葡萄糖浓度接着高葡萄糖浓度(分别为KRB中2mM和17.5mM葡萄糖)的静态温育来分析了胰岛素分泌。使用人类胰岛素放射免疫测定试剂盒(DPC；n≥8来自3个不同实验)测量胰岛素分泌并与未经处理的细胞(Cont)进行比较。*p<0.01与仅用Ad-CMV-Pdx-1相比，使用Studentt检验分析。

图20封闭Wnt信号通路废止了eGFP+细胞的转分化。eGFP细胞经Ad-CMV-Pdx-1或对照病毒(Ad-CMV-β-gal)处理5天，补加有DKK3(0.5μg/mlR&D)。通过与对照处理的细胞的定量实时RT-PCR比较研究了胰腺激素基因表达。

图21eGFP+细胞与DsRed2+细胞相比表达较低水平的APC和较高水平的活性β-连环蛋白。(A)APC和DKK1表达在DsRed2+细胞中显著提高。这可以进一步表明这些细胞与eGFP+细胞相比表达更高水平的Wnt信号通路阻抑物。n≥6来自2个不同实验*p<0.01在DsRed2+细胞中(相较于eGFP+细胞)，使用Studentt检验分析。(B)在eGFP和DsRed2阳性细胞提取物中，蛋白印迹分析使用激活的β-连环蛋白的特异性抗体(抗-ABC克隆8E7，Millipore,1:2000)，β-肌动蛋白(SC-1616,SantaCruz,1:1000)被用作归一化蛋白。(C)使用ImageJ1.29x软件对β-连环蛋白的蛋白水平进行定量。

发明详述

已经显示出转录因子(TF)在多种细胞谱系中诱导转分化。如本文中所用，"转分化"是指这样的过程，其中第一种细胞丧失了鉴别特征并将其表型改变成第二种细胞类型。在一些实施方案中，第一种和第二种细胞来自不同的组织或者细胞谱系。优选地，转分化涉及将成熟或已分化细胞转化成不同的成熟或已分化细胞。具体而言，已有建议表明谱系特异性转录因子(TF)在将成年细胞转化为下述细胞中发挥有益作用：内分泌胰腺细胞(Meivar-Levy等,2006；Meivar-Levy等,2010；Yechoor等,2010；Russ等,2011)、神经元(Vierbuchen等,2010；Ambasudhan等,2011；Pang等,2011)、造血细胞(Szabo等,2010)和心肌细胞谱系(Ieda等,2010)，这表明转分化过程广泛存在于多种环境中。在所有转分化方案中，异位TF作为潜在的广泛、功能性和不可逆发展过程的短期诱发物(Ber等,2003；Meivar-Levy等,2003；Meivar-Levy等,2006)。许多研究表明单个TF的异位表达激活所期望的另外的全部潜力与功能(过程中涉及额外的相关沉默TF的激活)。然而，所诱导的TF的时间进程、相对水平和序位、或者次序依然未知。

通过引入单个异位TF来探索内源转录因子(TF)诱导的相对不足，本发明涉及转分化，所述转分化是有序的且时间上受控制的过程，该过程受到TF的序位网络的影响。

本发明是基于这样的发现：TF-诱导的肝至胰腺的转分化是个渐进的且连续的过程。重要的是，仅仅是胰腺TF的顺序施用而非其协同表达选择性地推动内分泌胰腺内的谱系特化程序。已经显示出，胰腺TF以直接的序位模式顺序表达对于转分化的细胞沿着β-细胞谱系成熟是必不可少的。具体而言，胰腺β-细胞特异性转录因子MafA的作用在转分化过程的最后阶段已经得到了鉴定。在此阶段，MafA促进转分化的肝细胞沿着β-细胞谱系成熟(在与Isl1和生长激素抑制素阻抑相关的过程中)。

本文所述的发现表明了转录因子-介导的转分化的时间特征，其可以有助于提高使用TF-诱导的成年细胞重编程治疗退行性疾病包括糖尿病的治疗价值。

胰腺转录因子(pTF)，如Pdx-1、NeuroD1、Ngn-3和Pax4，激活肝的胰腺转分化并各自诱导糖尿病小鼠中高血糖的改善(Ferber等,2000；Ber等,2003；Kojima等,2003；Koizumi等,2004；Kaneto等,2005；Kaneto等,2005)。另外，使用成年人类肝细胞的体外实验体系，我们此前证明了Pdx-1激活多种β-细胞特异性标记物的表达，并诱导经加工的胰岛素受葡萄糖调节的分泌(Sapir等,2005；Meivar-Levy等,2007；Aviv等,2009；Gefen-Halevi等,2010；Meivar-Levy等,2011)。该诱导的过程与多种关键内源pTF的表达相关联，并且在糖尿病小鼠中移植转分化的成年人类肝细胞后证实了高血糖的改善(Sapir等,2005)。然而，许多其他研究表明，与个别TF的异位表达所诱导的相比,使用多个关键TF的组合显著地提高了重编程的效率(Kaneto等,2005；Tang等,2006；Song等,2007；Wang等,2007；Gefen-Halevi等,2010Zhou等,2008；Vierbuchen等,2010；Ambasudhan等,2011；Pang等,2011)。这表明单个异位因子激活内源补充TF至足够(有效转分化过程所需)的水平的能力可能是有限的(Kaneto等,2005；Zhou等,2008；Ambasudhan等,2011；Pang等,2011)。在胰腺器官形成期间胰腺转录因子的靶向破坏或时间错表达会妨碍胰腺发育以及胰岛细胞的分化和功能(Nishimura等,2009)。通过个别异位TF探索内源TF诱导的相对不足，本发明涉及转分化，所述转分化是有序的且时间上受控制的过程，该过程受到TF的序位网络的影响。

胰腺特化由同源框转录因子Pdxl所起始，而其在成年的β-功能中也是需要的(Offield等,1996；Staffers等,1997)。继而由碱性螺旋-环-螺旋因子Ngn3介导内分泌分化(Gradwohl等,2000)。成对的同源框因子Pax4和Arx已经被认为是不同内分泌细胞类型的分离中的关键因子(Collombat等,2003；Brun等,2008)。沿着β-细胞谱系和功能的最终成熟归因于MafA在成年胰腺的β细胞中的选择性表达(Kataoka等,2002)。

本发明部分基于这样的出乎意料的发现：人类肝细胞可以被直接转分化来产生完全不同的细胞类型，产胰腺激素细胞包括β细胞。以时间调控的顺序应用选择的转录因子诱导成年肝细胞转分化为功能上成熟的β细胞。本发明通过提供扩增或转分化成年细胞的方法，解决了生产大群体的产胰岛素细胞、或胰腺β细胞的问题。包含所选择转录因子或所生成的转分化的胰腺细胞群体的组合物可用于本文所述的方法来治疗胰腺病症。

此前尝试将非胰腺细胞转分化成胰腺细胞(如β细胞)仅利用一种转录因子或者协同或同时施用超过一种胰腺转录因子。本文所述的发明提供了这样的方法，其在给定的时间点有序地、先后地施用特定的转录因子。另外，与各个转录因子单独诱导相比，本文所述的方法实质性地提高了转分化的效率。

本发明还提供了具有提高的转分化能力的细胞群体。这些细胞特征在于(1)潜在的细胞膜标记物，(2)具有激活谷氨酰胺合成酶调节元件(GSRE)的能力，和(3)独特地配备有活性的Wnt-信号。群体中至少30％的细胞能够激活GSRE。例如所述细胞是内皮细胞、上皮细胞、间质细胞、成纤维细胞、或肝细胞。优选地，所述细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以沿着胰腺谱系转分化成具有胰腺功能的成熟胰腺细胞。在其它实施方案中，所述细胞可以沿着神经谱系转分化成神经细胞。

因而，本发明还解决了此前转分化或重编程方案常常具有有限效力的问题。例如，虽然关键胰腺转录因子的异位表达导致每个宿主细胞中的表达，仅有至多15％的所述细胞成功转分化为展现出胰腺功能。

本发明还提供了用于分离具有富集的或提高的转分化能力的细胞群体的方法。例如，分离这些细胞的一种方法是通过分选出激活GFP(可操作地连接至谷氨酰胺合成酶调节元件、或其片段)表达的细胞，由此分离出能够激活GSRE的那些细胞。可以通过FACS分选所述细胞并在培养中进行传代，与其它的细胞分离，以快速扩增具有富集的转分化能力的细胞。具有富集的转分化能力的细胞群体在体内仅仅是构成组织的细胞中的一小部分。例如，在给定的组织或细胞群体中，具有富集的转分化能力的细胞群体仅为给定组织中整个细胞群体的大约少于1％、2％、3％、4％、5％、约10％、约15％。因此，本发明还提供了用于从不具有提高的转分化能力的细胞中分离具有提高的转分化能力的细胞的方法。因此，本发明提供了细胞群体的优势为，其中有更高比例的细胞具有提高的转分化能力来提升转分化的效率，以便提供转分化的细胞用于治疗各种疾病或病症。

对于本领域技术人员而言显见的是，在本发明的精神和范围内可以对本文所述的方法进行各种改变和修改。

产生胰腺β细胞的方法

本发明提供了用于产生展现出成熟的胰腺β细胞表型的细胞的方法，其中是通过：在特定的时间点，将成年哺乳动物非胰腺细胞与胰腺转录因子接触，如PDX-1、Pax-4、NeuroD1、和MafA。在一些实施方案中，所述方法包括于第一时间段将成年哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1接触；于第二时间段，将来自第一步的细胞与Pax-4接触；以及于第三时间段，将来自第二步的细胞与MafA接触。在一个实施方案中，所述方法包括于第一时间段将成年哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1接触；于第二时间段，将来自第一步的细胞与NeuroD1接触以及于第三时间段，将来自第二步的细胞与MafA接触。在另一实施方案中，所述方法包括于第一时间段将成年哺乳动物非胰腺细胞与PDX-1和第二转录因子接触，以及于第二时间段将来自第一步的细胞与MafA接触。所述转录因子可以是多肽、编码所述转录因子多肽的核糖核酸或核酸。例如，与PDX-1一起提供的所述转录因子是Pax-4、NeuroD1、Ngn3、或Sox-9。优选地，所述转录因子是NeuroD1。

在一个方面，本文所述的方法还包括在任何上述步骤之中、之前、或之后将所述细胞与转录因子Sox-9接触。

在一个方面，第二时间段为第一时间段之后至少24小时。在一个方面，第三时间段为第二时间段之后至少24小时。在一些实施方案中，所述第二和第三时间段可以分别是第一或第二时间段之后至少24小时、至少48小时、至少72小时、以及至少1周或更多。

用于本发明的转录因子可以是多肽、核糖核酸或核酸。如本文所用，术语"核酸"是要包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如，mRNA，microRNA或其它RNA衍生物)、使用核苷酸类似物所产生的DNA或RNA类似物，以及其衍生物、片段和同系物。所述核酸分子可以是单链的或双链的。优选地，所述核酸是DNA。

用于本文所述方法的优选的转录因子是PDX-1、Pax-4、NeuroD1、和MafA。可以使用的其它转录因子有Ngn3、和Sox9。

同源结构域蛋白PDX-1(胰腺和十二指肠同源框基因-1)，也称作IDX-1、IPF-1、STF-1、或IUF-1，在调节胰岛发育和功能方面发挥中心作用。PDX-1直接或间接地涉及各种基因的胰岛细胞特异性表达，例如胰岛素、胰高血糖素、生长激素抑制素、胰岛素原转化酶1/3(PC1/3)，GLUT-2和葡萄糖激酶。另外，PDX-1介导胰岛素基因转录(应答葡萄糖)。编码PDX-1的核酸的适宜来源包括，例如人类PDX-1核酸(以及编码的蛋白序列)，分别为GenBank登记号U35632和AAA88820。其它来源包括大鼠PDX核酸和蛋白序列，分别显示为GenBank登记号U35632和AAA18355，其以整体援引加入本文。另外的来源包括斑马鱼PDX-1核酸和蛋白序列，分别显示为GenBank登记号AF036325和AAC41260，其以整体援引加入本文。

Pax-4，也已知为匹配框4、匹配框蛋白4、匹配框基因4、MODY9和KPD，是胰腺特异性转录因子，其结合胰高血糖素、胰岛素和生长激素抑制素启动子中的元件，并且被认为在胰岛β细胞的分化和发育中发挥重要的作用。在某些细胞背景中，Pax-4展现出阻抑物活性。编码Pax-4的核酸的适宜来源包括例如人类Pax-4核酸(及编码的蛋白序列)，其在GenBank登记号分别为NM_006193.2和AAD02289.1。

MafA，也已知为V-maf肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同源物A或RIPE3B1，是β细胞特异性以及葡萄糖调节的胰岛素基因表达转录激活剂。MafA可参与β细胞的功能和发育以及糖尿病的发病。编码MafA的核酸的适宜来源包括例如人类MafA核酸(及编码的蛋白序列)，其在GenBank登记号分别为NM_201589.3和P_963883.2。

Neurog3，也已知为神经源素3或Ngn3，是胰腺和肠中内分泌发育所需的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子。编码Neurog3的核酸的适宜来源包括例如人类Neurog3核酸(及编码的蛋白序列)，其在GenBank登记号分别为NM_020999.3和NP_066279.2。

NeuroD1，也已知为神经分化1，和β-2(β-2)，是神经D-型转录因子。其是碱性螺旋-环-螺旋转录因子，与其它bHLH蛋白形成异二聚体并激活含有特定DNA序列(已知为E-盒)的基因。其调节胰岛素基因的表达，并且此基因中的突变会导致2型糖尿病。编码NeuroD1的核酸的适宜来源包括例如人类NeuroD1核酸(及编码的蛋白序列)，其在GenBank登记号分别为NM_002500.4和NP_002491.2。

Sox9是参与胚胎发育的转录因子。已经特别研究了Sox9在骨骼和骨骼发育中的重要性。SOX-9与HMG-盒类DNA-结合蛋白的其它成员一起识别序列CCTTGAG。在本发明的背景中，Sox9的用途可以涉及在诱导转分化之前或之后保持胰腺祖细胞的质量。编码NeuroD1的核酸的适宜来源包括例如人类NeuroD1核酸(及编码的蛋白序列)，其在GenBank登记号分别为NM_000346.3和NP_000337.1。

所述细胞可以是能够产生胰腺激素的任何细胞，例如，骨髓、肌肉、脾、肾、血液、皮肤、胰腺、或肝。在一个实施方案中，所述细胞是非胰腺细胞。在一个实施方案中，经细胞外引发，所述细胞能够发挥胰岛细胞的功能，也即，储存、加工和分泌胰腺激素，优选胰岛素。在另一实施方案中，所述细胞是肝细胞。在另外的实施方案中，所述细胞是全能的或多能的。在另外的实施方案中，所述细胞是造血干细胞，胚胎干细胞或优选为肝干细胞。

暴露(也即接触)于化合物(也即Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1和/或Sox-9多肽或者编码Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1和/或Sox-9多肽的核酸)的细胞群体可以是任何数目的细胞，也即一个或多个细胞，以及可以在体外、体内、或者离体提供。与转录因子接触的细胞群体可以在与转录因子接触前在体外进行扩增。所产生的细胞群体展现出成熟的胰腺β细胞表型。可以在转分化和沿着β-细胞谱系成熟之前，以及在施用或递送给患者或有需要的对象之前，通过本领域已知的方法将这些细胞扩增。

所述对象优选为哺乳动物。所述哺乳动物可以是例如人类、非人类灵长动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马、或牛。

在一些实施方案中，所述转录因子是多肽，如PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9、或其组合，并且其通过本领域已知的方法被递送至细胞。例如，将所述转录因子多肽直接提供给细胞或者通过微颗粒或纳米颗粒进行递送，例如，脂质体载体。

在一些实施方案中，所述转录因子是核酸。例如，所述核酸编码Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9多肽。可以通过本领域已知的任何措施，将编码所述转录因子的核酸、或此类核酸的组合递送至细胞。在一些实施方案中，所述核酸被并入表达载体或病毒载体。优选地，所述病毒载体是腺病毒病毒载体。可以通过任何下述措施而将表达或病毒载体引入细胞：转染、电穿孔、感染、或转导。

易于转分化的细胞群体

本发明提供了源自肝脏的易于转分化的细胞群体。所述细胞群体可用于本文所述的产生胰腺β细胞的方法。本发明的易于转分化的细胞也被称作是具有提高的或富集的转分化能力。对于"提高的转分化能力"其是指当本发明的细胞群体经历分化方案时(也即引入胰腺转录因子)，超过15％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％或超过80％将会分化为另外的细胞类型。例如，具有提高的转分化能力的内皮细胞、上皮细胞、间质细胞、成纤维细胞、或肝细胞的群体可以分化为成熟的胰腺细胞或成熟的神经细胞。

在另一实施方案中，易于转分化的细胞群体具有激活谷氨酰胺合成酶应答元件(GSRE)的能力。例如，在本发明的细胞群体中，至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的细胞能够激活GSRE。优选地，群体中至少30％的细胞能够激活GSRE。谷氨酰胺合成酶是主要在脑、肾和肝中表达的酶，并且在氮代谢中发挥基本作用(通过催化谷氨酸和氨缩合形成谷氨酰胺)。谷氨酰胺合成酶，例如，独特地在外周肝细胞和脑中的星形胶质细胞中表达。本文给出的数据表明，证明了GSRE激活的细胞提供了用于分离易于转分化的细胞的独特的选择参数。

GSRE的激活可以通过本领域技术人员已知的方法来进行测量。例如，可生成重组腺病毒，其含有可操作地连接至启动子和报道蛋白(如荧光蛋白)基因的谷氨酰胺合成酶应答元件。可以将此具有GSRE报道蛋白的重组腺病毒引入到含有一定比例的易于转分化的细胞的混杂细胞混合物中。能够激活GSRE的那些细胞将表达报道蛋白基因，其可以由本领域中已知的方法进行检测，由此鉴别出易于转分化的细胞。

混杂的细胞群体(其中易于转分化的细胞是未知的)可以与含有可操作地连接至最小TK启动子和eGFP的GSRE的腺病毒载体接触。可以激活GSRE的细胞将会表达GFP并且可以通过本领域已知的检测GFP表达的各种方法来进行鉴别。例如，从未易于转分化的细胞中分离GSRE-激活的易于转分化的细胞，可以通过FACs装置、分选仪和本领域技术人员已知的技术来实现(图14)。所分离的易于转分化的细胞继而可以在体外进行繁殖或扩增。本文所描述的结果证明了，将易于转分化的细胞传代5-12代或更多代会保留其转分化能力。例如，所分离的易于转分化的肝细胞即使在培养中传代12次之后，依然以葡萄糖依赖性形式继续产生并分泌胰岛素(图17)。

在另一实施方案中，易于转分化的细胞群体也具有活性的Wnt信号通路。Wnt信号通路在干细胞多能性和发育期间的细胞命运中、以及体轴模式、细胞增殖、和细胞迁移中发挥显著的作用。通过将Wnt-蛋白配体结合至卷曲(Fz)家族受体(G-偶合蛋白受体)而激活Wnt信号通路，任选激活共受体蛋白，以及随后激活称作Dishevelled(Dsh)的细胞质蛋白。在经典的Wnt通路中，共受体LRP-5/6也被激活并且β-连环蛋白在细胞质中聚积并最终位移至核中作为TCF/LEF转录因子的转录共激活剂。无Wnt信号，破坏复合物(包括蛋白腺瘤息肉病蛋白(APC)、轴蛋白、蛋白质磷酸酶2A(PP2A)，糖原合成酶激酶3(GSK3)以及酪蛋白激酶la(CKla))将靶向β-连环蛋白以进行泛素化以及随后通过蛋白酶体的降解。然而，Wnt结合对卷曲的受体的激活破坏复合物的断裂，由此允许β-连环蛋白聚积。

Wnt信号也可通过非经典途径发生，该途径使用不同的共受体蛋白并激活不同的下游效应蛋白，以便例如调节细胞骨架、刺激从内质网的钙释放、激活mTOR通路、和调节肌生成。

本领域技术人员能够容易地使用本领域已知的方法来确定Wnt信号通路的激活。例如，表达Wnt3a的细胞、水平降低的DKK1或DKK3、水平降低的APC、水平提高的激活的β-连环蛋白、或具有有活性的Wnt信号通路的STAT3结合元件。DKK1、DKK3、和APC是已知的Wnt信号通路抑制剂。其它表明有活性Wnt信号通路的信号效应蛋白是本领域已知的。

优选地，所述细胞群体易于转分化成胰腺谱系，其中所述转分化的细胞展现出胰腺表型和功能。例如，所述转分化的细胞展现出成熟的胰腺β细胞表型和功能，包括但不限于，表达、产生、和/或分泌胰腺激素。胰腺激素可包括但不限于，胰岛素、生长激素抑制素、胰高血糖素、或胰岛淀粉样多肽(IAPP)。胰岛素可以是肝脏胰岛素或血清胰岛素。优选所述胰岛素是经完全加工形式的胰岛素，能够促进海藻糖利用、以及碳水化合物、脂肪和蛋白的代谢。例如，易于转分化的细胞可以涵盖混杂的体外初代人类肝细胞培养物中全部细胞的大约15％细胞。当所述细胞异位表达pTF，培养物中超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％的细胞会产生胰岛素或分泌C肽。

在一个实施方案中，易于转分化的细胞群体位于肝脏中央静脉附近、或者是外周肝细胞。如本文所示，虽然超过40-50％的肝细胞异位表达胰腺转录因子如PDX-1，但是仅有一个亚集的细胞在表达pTF时产生胰岛素。这些产胰岛素细胞(IPC)主要位于静脉血管附近，如图1B所示。这些细胞特征还在于表达谷氨酰胺合成酶和有活性的Wnt信号。

在另一优选的实施方案中，本发明的细胞群体易于转分化成神经谱系，其中所述转分化的细胞表达神经标记物、展现神经表型、或展现神经功能。所示转分化的细胞可以是神经元或神经胶质细胞。

在另一实施方案中，可以通过特定细胞表面标记物来鉴别具有提高的转分化倾向的细胞。例如，当与无转分化倾向的细胞相比时，细胞具有水平提高的HOMER1、LAMP3或BMPR2表明细胞具有提高的转分化能力。当与无转分化倾向的细胞相比时，细胞具有水平降低的ABCB1、ITGA4、ABCB4或PRNP表明细胞具有提高的转分化能力。所述细胞表面标记物的任意组合都可用于易于转分化的细胞群体与未易于转分化的细胞群体。针对这些这些细胞表面标记物的抗体是商业可购买的。可以使用本领域已知的免疫测定或免疫亲和技术来区分具有提高的转分化能力的细胞与无转分化能力的那些细胞。

相较于分化混杂的非胰腺细胞群体产生展现胰腺细胞表型的细胞，使用本发明的细胞群体来产生展现出胰腺细胞表型的细胞具有一定的优势。此前的研究描述了混杂的非胰腺细胞群体(也即肝细胞)中表达胰腺转录因子(pTF)如PDX-1，其显示出最好的情况也仅有15％的表达PDX-1的细胞能够产生胰岛素。因此，仅有15％的所述细胞成功地分化成能够产生和分泌胰腺激素的成熟的胰腺β细胞。相反，将pTF引入本发明的细胞群体导致至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的所述细胞分化为成熟的胰腺β细胞表型，例如，产生胰岛素、胰高血糖素，和/或分泌C肽。优选地，当本发明细胞群体的细胞表达胰腺转录因子时，至少30％的所述细胞产生胰岛素或分泌C肽。

转分化的方法

本发明还提供了利用具有提高的转分化能力的细胞群体来产生展现成熟分化细胞类型细胞的方法，其中所述分化细胞具有与起始细胞群体不同的表型。例如，具有提高的转分化能力的细胞群体(也即上皮细胞、成纤维细胞或肝细胞)可以分化为沿着胰腺或神经谱系的细胞以展现出成熟的分化胰腺或神经细胞表型。本领域已知的任何将细胞分化为胰腺或神经谱系的措施都可以使用。

在一个实施方案中，所述易于转分化的细胞群体可以通过神经转录因子的表达而沿着神经谱系分化。适宜的神经转录因子是本领域已知的。在其它实施方案中，本发明的细胞群体可以分化为成熟的神经细胞，其中是通过将所述细胞与各种细胞因子、生长因子、或本领域已知的其它物质接触，以将细胞分化为神经谱系。所述分化的神经细胞可以表达神经标记物、展现神经表型(也即神经基因表达谱)、或展现神经功能。所述分化的细胞可以是神经元或神经胶质细胞。

在另一实施方案中，易于转分化的细胞群体可以通过胰腺转录因子的表达而沿着胰腺谱系分化。所述胰腺转录因子是，例如，PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1，或其组合。用于产生胰腺β细胞的方法在美国专利号6,774,120和美国专利公开号2005/0090465中有描述，其内容以其整体援引加入本文。

在另一实施方案中，易于转分化的细胞群体可以通过本文所述的方法沿着胰腺谱系分化。

胰腺β细胞表型

本文所提供的方法产生具有成熟的胰腺β细胞表型或功能的细胞。对于"胰腺β细胞表型或功能"是指，所述细胞展现出一种或多种典型胰腺β细胞的特征，也即产生胰腺激素、加工、在分泌颗粒中储存、激素分泌、胰腺基因启动子的激活、或特征性的β细胞基因表达谱。激素分泌包括营养和/或激素调节的分泌。优选地，所产生的细胞展现出至少一种如本文所述的胰腺β细胞表型或功能。

所述胰腺激素可以是例如，胰岛素、胰高血糖素、生长激素抑制素或胰岛淀粉样多肽(IAPP)。胰岛素可以是肝脏胰岛素或血清胰岛素。在另一实施方案中，所述胰腺激素是肝脏胰岛素。在另一实施方案中所述胰腺激素是血清胰岛素(也即经完全加工的形式的胰岛素，能够促进例如，葡萄糖利用、碳水化合物、脂肪和蛋白的代谢)。

在一些实施方案中，所述胰腺激素是"激素原"的形式。在其它实施方案中，所述胰腺激素是经过完全加工的具有生物学活性的激素。在其它实施方案中，所述胰腺激素受调节控制，也即该激素的分泌受到营养和激素的控制，与內源产生的胰腺激素类似。例如，在本发明的一个方面，所述激素受到葡萄糖的调节控制。胰岛素分泌也可以通过例如，C肽加工和分泌来进行测量。

可以例如通过测量胰腺激素的产生(也即胰岛素、生长激素抑制素或胰高血糖素蛋白mRNA或蛋白表达)来确定胰腺β细胞表型。可以同本领域已知的方法来确定激素的产生，也即免疫测定、蛋白印迹、受体结合测定或功能性测定(植入糖尿病宿主后改善高血糖的能力)。

在一些实施方案中，可以使用本文所述方法将所述细胞引导为产生和分泌胰岛素。细胞产生胰岛素的能力可以通过本领域技术人员已知的各种方法来进行测定。例如，可以通过RT-PCR检测胰岛素mRNA，或者可以通过针对胰岛素产生的抗体来检测胰岛素。另外，胰腺分化的其它指标包括基因Isl-1、Pdx-1、Pax-4、Pax-6、和Glut-2的表达。鉴别胰岛细胞的其它表型标志在U.S.2003/0138948中有公开，其以整体援引加入本文。

可以通过例如胰腺特异性基因的启动子激活来确定胰腺β细胞表型。特别感兴趣的胰腺特异性启动子包括胰岛素和胰腺转录因子(也即内源PDX-1)的启动子。可以通过本领域已知的方法确定启动子的激活，例如通过荧光素酶测定、EMSA、或者检测下游的基因表达。

在一些实施方案中，也可以通过胰腺基因表达谱的诱导来确定胰腺β细胞表型。对于"胰腺基因表达谱"其是指：包括了在非内分泌组织中通常转录沉默的一个或多个基因的表达，也即胰腺转录因子、胰腺酶或胰腺激素。胰腺酶例如是，PCSK2(PC2或激素原转化酶)、PC1/3(激素原转化酶1/3)、葡萄糖激酶、葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2)。胰腺特异性转录因子包括，例如，Nkx2.2、Nkx6.1、Pax-4、Pax-6、MafA、NeuroD1、NeuroG3、Ngn3、β-2、ARX、BRAIN4和Isl-1。

可以使用本领域技术人员树枝的技术检测胰腺基因表达谱的诱导。例如，可以在例如，RNA印迹杂交分析、基于扩增的检测方法如基于逆转录的聚合酶链反应或者通过微阵列芯片分析的系统性检测中检测胰腺激素RNA序列。或者，也可以在蛋白水平测量表达，也即通过测量基因编码的多肽的水平。在具体的实施方案中，可以通过其在将激素原加工为活性成熟形式中的活性来确定PCl/3基因或蛋白表达。此类方法是本领域熟知的，且包括例如，基于针对基因编码的蛋白的抗体的免疫测定，或者经过加工了激素原的HPLC。

在一些实施方案中，本文所述的方法中产生的展现成熟β细胞表型的细胞可以抑制原始细胞的至少一个基因或基因表达谱。例如，经诱导展现成熟β细胞表型的肝细胞可以抑制至少一种肝脏特异性基因。本领域技术人员能够使用本领域已知的方法容易地确定原始细胞和所产生的细胞的肝脏特异性基因表达，也即测量所述基因编码的mRNA或多肽的水平。经比较，肝脏特异性基因表达的降低会表明已经发生了转分化。

治疗胰腺病症的方法

本发明公开了用于在对象中治疗胰腺病症的方法(也即防止或延缓其发作或者减缓其症状)。例如，所述胰腺病症是退行性胰腺疾病。本文所公开的方法对于这样的胰腺病症特别有用，所述胰腺病症是胰腺细胞的丧失(或胰腺细胞功能丧失)引起的或者胰腺细胞的丧失(或胰腺细胞功能丧失)，例如，胰岛β细胞。

常见的退行性胰腺疾病包括但不限于：糖尿病(例如，1型、2型、或妊娠期)以及胰腺癌。可以使用本发明的方法治疗的其它胰腺病症或胰腺相关病症有，例如，高血糖、胰腺炎、胰腺假囊肿或受伤引起的意向创伤。

糖尿病是代谢病症，已发现有三种形式：1型、2型和妊娠期糖尿病。1型，或IDDM，是自身免疫疾病；免疫系统破坏产胰腺胰岛素的β细胞，降低或消除了胰腺产生胰岛素的能力。1型糖尿病患者必须每日补充胰岛素以维持生命。症状通常发展快速并且包括口渴和排尿增加、慢性饥饿、体重减轻、视力模糊以及疲乏。2型糖尿病是最常见的，占糖尿病患者的90％至95％。其与年龄增长、肥胖、家族病史、此前妊娠期糖尿病、缺乏锻炼和种族相关。妊娠期糖尿病仅在怀孕时发生。发展有妊娠期糖尿病的女性有20％至50％的机会在5-10年内转变为2型糖尿病。

通过本领域已知的方法鉴别患有糖尿病或者有患糖尿病风险的对象，例如通过确定血液葡萄糖水平。例如，禁食整夜后至少两次血液葡萄糖值超过140mg/dL意味着此人患有糖尿病。不患有糖尿病或者不具有患糖尿病风险的人的特征是具有70-110mg/dL的禁食糖水平。

糖尿病的症状包括疲乏、恶心、尿频、过渡口渴、体重减轻、视力模糊、频繁感染以及伤处或痛处愈合缓慢、血压长期处于或高于140/90、HDL胆固醇低于35mg/dL或甘油三酯高于250mg/dL、高血糖、低血糖、胰岛素不足或抗胰岛素。要施用所述化合物的糖尿病或糖尿病前期患者通过本领域已知的诊断方法来鉴别。

高血糖是胰腺相关的病症，其中血浆中循环有过量的葡萄糖。这一般是高于(200mg/dl)的葡萄糖水平。患有高血糖的对象可患有或不患有糖尿病。

胰腺癌在美国是第四常见的癌症，主要在超过60岁的人中发生，并且在所有癌症中具有最低的五年存活率。腺癌是最常见类型的胰腺癌，在胰管的内里发生；囊腺癌腺细胞癌较罕见。然而，在胰腺也会长出良性肿瘤；这些包括胰岛素瘤-分泌胰岛素的肿瘤、促胃液素瘤-其分泌高于正常水平的胃液、以及胰高血糖素瘤-分泌胰高血糖素的肿瘤。

胰腺癌没有已知的诱因，但是有若干患病风险，包括糖尿病、吸烟和慢性胰腺炎。症状可以包括上腹疼痛、胃口差、黄疸、体重减轻、消化不良、恶心或呕吐、腹泻、疲乏、瘙痒或腹部脏器肿大。使用超声波、计算机断层扫描、磁共振成像、ERCP、经皮经肝胆管造影、胰腺活检或血液测试来进行诊断。治疗可包括手术、放疗或化疗、止疼药或止痒药、口服酶制剂或者胰岛素治疗。

胰腺炎是胰腺的炎症和自身消化。在自身消化中，胰腺被其自己的酶所破坏，这引起炎症。急性胰腺炎通常仅涉及一次发病，之后胰腺将恢复正常。然而，慢性胰腺炎则涉及胰腺和胰腺功能的永久损坏并且会导致纤维化。或者，其可以在几次发病之后消退。胰腺炎最常是由阻塞胰管的结石或者酗酒所引起的，这可引起小的胰腺小管阻塞。其它诱因包括腹部创伤或手术、感染、肾衰竭、狼疮、囊性纤维化、肿瘤或蝎子毒刺。

常与胰腺炎相关联的的症状包括腹部疼痛(可放射至背部或胸部)、恶心或呕吐、脉搏快、发烧、上腹部肿胀、腹水、血压较低或轻度黄疸。在鉴别为与胰腺炎相关之前，症状可能会被归因于其它病。

治疗神经病症的方法

本发明还提供了用于治疗患有神经疾病或病症的对象的方法，如神经退行性疾病病症。本文所述的细胞群体可用于治疗患有神经疾病或病症(特征在于神经细胞或神经功能丧失)的对象，其中是通过重新补充已降解的或是去功能的细胞。可以使用本文所述的方法治疗的神经退行性疾病包括但不限于，帕金森症、阿尔茨海默病、亨廷顿病、侧索硬化、Lewy小体病、年龄相关神经退化、神经癌症、和脑肿瘤(由手术、意外、缺血、或中风引起)。本文所述的细胞群体可分化成具有神经功能的神经细胞群体，并且所述分化的神经细胞群体可以施用给患有神经疾病或病症的对象。

治疗物组合物

本文所述的诱导转分化的化合物，或者异位胰腺转录因子(也即Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9多肽，编码Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9多肽的核糖核酸或核酸)，当用于治疗时，在本文称作"治疗物"。施用治疗物的方法包括但不限于，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜、和口服途径。本发明的治疗物可以通过任何常规的途径施用，例如通过灌注或弹丸注射、通过表皮或皮肤粘膜内里吸附(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜等)，并且可以与其他生物学活性物质一起施用。可以是全身施用或者局部施用。另外，通过任何适宜的途径将治疗物施用到中枢神经系统中可能会是有利的，包括心室内和鞘内注射。心室内注射可以借助于与储液器连接的心室内导管(例如，Ommaya储液器)。也可以利用肺部施用，其中是通过吸入器或喷雾器、以及具有雾化剂的制剂。也期望能够将所述治疗物局部施用至需要治疗的区域；这可以通过以下方式实现，例如但不限于，手术期间局部灌注、外用、注射、使用导管手段、使用栓剂手段、或使用植入物的手段。各种递送体系是已知的并且可用于施用本发明的治疗物，包括例如：(i)于脂质体、微颗粒、微囊中包囊；(ii)能够表达所述治疗物的重组细胞；(iii)受体介导的胞吞作用(参见例如，Wu和Wu，1987.JBiolChem262:4429-4432)；(iv)治疗性核酸构建为逆转录病毒、腺病毒或其它载体的一部分，等等。在本发明的一个实施方案中，所述治疗物可以在囊中递送，特别是在脂质体中。在脂质体中，在其它药物可接受的载体之外，将本发明的蛋白与两亲性物质组合，如聚积为微团形式的脂质、不可溶单层、液晶、或者薄片层(在水成溶液中)。用于脂质体制品的适宜脂质包括但不限于，甘油单酯、甘油双酯、硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸，等等。此类脂质体制剂的制备是本领域技术人员能力之内的，如以下文献中所述，例如，U.S.Pat.No.4,837,028；和U.S.Pat.No.4,737,323，全部以其整体援引加入本文。在另外的实施方案中，可以将所述治疗物在控制释放的体系内进行递送，例如包括：递送泵(参见例如，Saudek等，1989.NewEnglJMed321:574)和半透聚合物材料(参见例如，Howard等，1989.JNeurosurg71:105)。另外，可以将所述的控制释放系统放置在治疗靶标的附近(例如脑)，由此仅需要全身剂量的一部分。参见例如，Goodson,In:MedicalApplicationsofControlledRelease1984.(CRCPress,BocaRaton,Fla.)。

在本发明具体的实施方案中，当所述治疗物是编码蛋白的核酸时，所述治疗物核酸可以进行体内施用以促进其所编码的蛋白的表达，其中是通过将其构建为适宜的核酸表达载体的一部分来施用，而由此使其进入细胞内(例如，通过使用逆转录病毒载体、通过直接注射、通过使用微颗粒轰击、通过用脂质或细胞表明受体或转染剂包被、或者通过将其与类同源框肽(已知能进入细胞核)结合施用(参见例如，Joliot等，1991.ProcNatlAcadSciUSA88:1864-1868)，等等。或者，可以通过同源重组或者将核酸治疗物引入细胞内并掺入到宿主DNA之内进行表达，或保持在染色体外。

优选地，将所述治疗物进行静脉内施用。具体而言，可以通过门静脉灌注来递送所述治疗物。

如本文所用，术语"治疗有效量"是指药物组合物或方法中每种活性成分的总量，足以显示对患者有意义的好处，也即治疗、治愈、预防、或缓解相关的医学病征，或者对此类病征治疗、治愈、预防、或缓解率的提升。当针对个体活性物质单独施用时，该术语是指该成分自己。当针对组合时，该术语是指导致治疗效果的活性成分的组合量，无论是否是组合施用、连续施用或同时施用。

在特定病症或病征的治疗中有效的本发明治疗物的量，将取决于病症或病征的性质，并且本领域技术人员可以通过标准临床技术来进行确定。另外，可以任选使用体外测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中要使用的准确剂量还取决于施用的途径、以及疾病或病症的整体严重程度，并且应当根据从业者的判断和每个患者的情形来决定。最终，主治医师将会决定用来治疗每个个体患者时所使用的本发明的蛋白质的量。开始的时候，主治医师会施用低剂量的本发明蛋白并观察患者的反应。可以使用更高剂量的本发明蛋白直至获得针对患者的最佳治疗效果，而在该节点就不再继续提高剂量。然而，本发明治疗物静脉内施用的适宜剂量范围一般为：至少1百万转分化的细胞、至少2百万转分化的细胞、至少5百万转分化的细胞、至少1千万转分化的细胞、至少2千5百万转分化的细胞、至少5千万转分化的细胞、至少1亿转分化的细胞、至少2亿转分化的细胞、至少3亿转分化的细胞、至少4亿转分化的细胞、至少5亿转分化的细胞、至少6亿转分化的细胞、至少7亿转分化的细胞、至少8亿转分化的细胞、至少9亿转分化的细胞、至少10亿转分化的细胞、至少20亿转分化的细胞、至少30亿转分化的细胞、至少40亿转分化的细胞、或至少50亿转分化的细胞。优选地，所述剂量为1-20亿转分化的细胞用于60-75kg的对象。本领域技术人员会理解，可以从得自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线来外推有效剂量。

使用本发明的治疗物进行静脉内治疗的持续时间，会根据要治疗的疾病的严重性以及每个个体患者的状况和潜在特质反应而改变。认为本发明蛋白每次应用的持续时间将会在12-24小时的连续静脉内注射的范围。最终主治医师将会决定使用本发明药物组合物进行治疗的适宜的持续时间。

还可以在本发明的治疗物质、核酸或蛋白的存在下对细胞进行体外培养，以便使此类细胞增殖或者产生期望的效果或活性。继而可以经过本文所述的施用突降将经处理的细胞引入体内以用于治疗目的。

重组表达载体和宿主细胞

本发明的另一方面是关于载体(优选表达载体)，其含有编码PDX、Pax-4、NeuroD1或MafA蛋白的核酸，或者其他胰腺转录因子如Ngn3，或者其衍生物、片段、类似物、同系物或组合。在一些实施方案中，所述表达载体包含编码任意下列转录因子的单个核酸：PDX-1、Pax-4、NeuroD1、Ngn3、MafA、或Sox-9或者其衍生物或片段。在一些实施方案中，所述表达载体包含编码下列转录因子的任意组合的两种核酸：PDX-1、Pax-4、NeuroD1、Ngn3、MafA、或Sox-9或或者其衍生物或片段。在优选的实施方案中，所述表达载体含有编码PDX-1和NeuroD1的核酸。

如本文所用，术语"载体"是指核酸分子，其能够转移其所连接的另外的核酸。一种类型的载体是"质粒"，其是指线形或圆形双链DNA环，其中可以连接有额外的DNA区段。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接至病毒基因组。某些载体能够在其所被引入的宿主细胞内自我复制(例如，具有细菌复制原点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞内后被整合到宿主细胞的基因组，并由此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够引导其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文被称作"表达载体"。一般来说，表达载体在重组DNA技术中的使用的常常是质粒的形式。在本说明书中，"质粒"和"载体"可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明还要包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其发挥等同的功能。另外，一些病毒载体能够特异性地或者非特异性地靶向特定的细胞类型。

本发明的重组表达载体以适宜于在宿主细胞内表达核酸的形式包含本发明的核酸，这意味着所述重组表达载体包括一个或多个调控序列(基于要用于表达的宿主细胞而选择的)，其可操作地连接至要表达的核酸序列。在重组表达载体内，"可操作地连接"是指感兴趣的核苷酸序列连接至调控序列，连接的方式是允许该核苷酸序列的表达(例如，在体外转录/翻译体系中，或者当载体被引入宿主细胞时于宿主细胞中)。术语"调控序列"要包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此类调控序列例如，在Goeddel；GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)中有描述。调控序列包括引导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成性表达的那些调控序列，以及引导核苷酸序列仅在特定类型的宿主细胞中的表达的那些调控序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域技术人员会理解表达载体的设计可取决于这样的因素：要转化的宿主细胞的选择，期望的蛋白表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞，由此产生本文所述核酸所编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽(例如，Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9蛋白，或者其成熟形式或融合形式的蛋白等)。

例如，表达载体包含一种编码转录因子的可操作地连接至启动子的核酸。在包含两种编码转录因子的核酸的表达载体中，每种核酸可以可操作地连接至启动子。可操作地连接至每个核酸的启动子可以是不同的或者相同的。或者，该两种核酸可以可操作地连接至单一启动子。可用于本发明表达载体的启动子可以是本领域已知的任何启动子。本领域技术人员能够容易地确定用于要表达所述核酸的宿主细胞的适宜启动子、期望的蛋白表达水平、或者表达的时间等。所述启动子可以是组成性启动子、可诱导启动子、或细胞类型特异性启动子。

本发明的重组表达载体可以设计为用于PDX-1在原核或真核细胞中的表达。例如，Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、和/或Sox-9可以在细菌细胞中表达如大肠杆菌(E.coli)、昆虫细胞中表达(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。适宜的宿主细胞在Goeddel，GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)中有进一步描述。或者，所述重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。

蛋白在原核细胞内的表达最常见的是在大肠杆菌中进行，其中载体含有组成性或可诱导的启动子引导融合或非融合蛋白的表达。融合载体将几个氨基酸添加至其中所编码的蛋白质，通常添加至重组蛋白的氨基端。此种融合载体通常发挥三种作用：(1)提高重组蛋白的表达；(2)提高重组蛋白的可溶性；和(3)作为亲和纯化中的配体而有助于重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，将蛋白水解切割位点引入到融合部分和重组蛋白的结合处，以使得可以在纯化融合蛋白之后使重组蛋白与结合部分分离。此类酶以及其同源识别序列，包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(PharmaciaBiotechInc；SmithandJohnson(1988)Gene67:31-40)，pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，其分别将谷胱苷肽S-转移酶(GST)，麦芽糖E结合蛋白、或蛋白A融合至目标重组蛋白。

适宜的可诱导的非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann等,(1988)Gene69:301-315)和pET1ld(Studier等，GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185，AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)60-89)。

在大肠杆菌中将重组蛋白表达最大化的一种策略是在蛋白酶切割重组蛋白的能力受损的宿主细菌中表达所述蛋白。参见，Gottesman,GENEEXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODSINENZYMOLOGY185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)119-128。另一策略是改变要插入表达载体中的所述核酸的核酸序列。从而使得每个氨基酸各自的密码子都是大肠杆菌中倾向使用的那些(Wada等，(1992)，NucleicAcidsRes.20:2111-2118)。本发明核酸序列的此种改变可以通过标准的DNA合成技术来完成。

在另一实施方案中，所述Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9表达载体是酵母表达载体。用于在酵母菌酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari等，(1987)EMBOJ6:229-234)、pMFa(KujanandHerskowitz,(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene54:113-123)、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif)、和picZ(InVitrogenCorp,SanDiego,Calif)。

或者，Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。适宜在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中表达的杆状病毒载体包括pAc系列的载体(Smith等(1983)MolCellBiol3:2156-2165)和pVL系列的载体(LucklowandSummers(1989)Virology170:31-39)。

在另外的实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBOJ6:187-195)。当在哺乳动物细胞中使用时，所述表达载体的控制功能常由病毒调节元件来提供。例如，常用的衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和类人猿病毒40的启动子。对于用于原核和真核细胞的其它适宜的表达系统，参见例如，Sambrook等,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.2nded.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,N.Y.,1989中的16章和17章。

在另一实施方案中，所述重组哺乳动物表达载体能够指引核酸优先在特定的细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调节元件来表达所述核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。适宜的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等(1987)GenesDev1:268-277)，淋巴特异性启动子(CalameandEaton(1988)AdvImmunol43:235-275)，特别是T细胞受体的启动子(WinotoandBaltimore(1989)EMBOJ8:729-733)和免疫球蛋白的启动子(Banerji等(1983)Cell33:729-740；QueenandBaltimore(1983)Cell33:741-748)，神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；ByrneandRuddle(1989)PNAS86:5473-5477)，胰腺特异性启动子(Edlund等(1985)Science230:912-916)，以及乳腺特异性启动子(例如，奶乳清启动子；U.S.Pat.No.4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。也涵盖了发育调节的启动子，例如，小鼠Hox启动子(KesselandGruss(1990)Science249:374-379)和α胎蛋白启动子(CampesandTilghman(1989)GenesDev3:537-546)。

本发明还提供了重组表达载体，其包含以反义方向克隆到表达载体中的本发明的DNA分子。也即，所述DNA分子以这样的方式可操作地连接至调控序列，该方式允许与PDXmRNA反义的mRNA分子的表达(通过该DNA分子的转录)。与反义方向克隆的核酸可操作地连接的调控序列可以进行选择，选出引导反义RNA分子在多种细胞类型中连续表达的那种，例如病毒启动子和/或增强子，或者可以选择引导反义RNA的组成性、组织特异性或细胞类型特异性表达的调控序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中在高效调控区的控制下产生反义核酸，其活性可以由所述载体所被引入的细胞类型来确定。对于使用反义基因对基因表达进行调控的讨论，参见Weintraub等，"AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis,"Reviews-TrendsinGeneticsVol.1(1)1986。

本发明的另一方面涉及本发明的重组表达载体所被引入的宿主细胞。术语"宿主细胞"和"重组宿主细胞"在本文可互换使用。应理解的是，此类术语不仅仅是指特定的对象细胞，还是指此种细胞的后代或者潜在的后代。因为在后代中由于突变或者环境影响可能发生某些改变，实际上此类后代可能不会与亲代细胞等同，但是其却依然涵盖在如本文所用的术语的额范围内。另外，宿主细胞一旦表达Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9或者其组合则可以受到调节，并且可能保留或者失去原始的特征。

宿主细胞可以是任意的原核或真核细胞。例如，Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或Sox-9蛋白可以在细菌细胞如大肠杆菌中、在昆虫细胞中、在酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。或者，宿主细胞可以是成熟前的哺乳动物细胞，也即多能干细胞。宿主细胞也可以衍生自其它人类组织。其它适宜的宿主细胞是本领域技术人员已知的。

可以通过常规的转化、转导、感染或转染技术来将载体DNA被引入到原核或真核细胞中。如本文所用，术语"转化"、"转导"、"感染"和"转染"是指多种本领域已知的技术，用于将外源核酸(例如，DNA)引入到宿主细胞内，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂染、或电穿孔。另外，转染可以由转染剂来介导。"转染剂"是包括介导DNA掺入宿主细胞的任意化合物，例如，脂质体。转化或者转染宿主细胞的适宜方法可以参见Sambrook等(MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL.2nded.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989)，以及其它实验室手册。

转染可以是"稳定的"(也即将外源DNA整合到宿主基因组中)或"瞬时的"(也即DNA在宿主细胞中游离表达)。

对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据所使用的表达载体和转染技术，仅有小部分的细胞可以将外源DNA整合到其基因组，其它的DNA保持游离。为了鉴别和选择这些整合体，一般将编码可选择标记(例如，对抗生素的抗性)的基因与感兴趣的基因一起引入到宿主细胞中。各种可选择标记包括赋予药物抗性的那些，如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。编码可选择标记的核酸可以与编码PDX的核酸在同一载体上被引入宿主细胞，或者其可以被引入到分别的载体上。稳定转染有所引入核酸的细胞可以通过药物选择来鉴别(例如，掺入了可选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞死亡)。在另一实施方案中，受PDX调节的细胞或经转染的细胞由内源报道基因表达的诱导来进行鉴别。在具体的实施方案中，所述启动子是推动绿色荧光蛋白(GFP)表达的胰岛素启动子。

在一个实施方案中，Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9核酸存在于病毒载体中。在一个实施方案中，PDX-1和NeuroD1核酸存在于同一病毒载体中。在另一实施方案中，Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9核酸包囊在病毒中。在另一实施方案中，PDX-1和NeuroD1包囊于病毒中(也即编码PDX-1和NeuroD1的核酸被包囊在同一病毒颗粒中)。在一些实施方案中，所述病毒优选感染各种组织类型的多能细胞，例如造血干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞或胚胎干细胞，优选所述病毒是亲肝的。对于“亲肝”，其是指所述病毒具有能力优选特异性地或非特异性地靶向肝脏的细胞。在另外的实施方案中，所述病毒是受调节的肝炎病毒，SV-40，或者Epstein-Bar病毒。在另外的实施方案中，所述病毒是腺病毒。

基因疗法

在本发明的一个方面，通过基因疗法的方式施用编码PDX-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9多肽或者其组合的核酸或多个核酸，或者其功能性衍生物。基因疗法是指通过向对象施用特定核酸来进行的疗法。在本发明的此方面，所述核酸产生其所编码的肽，其继而通过调节前文所述疾病或病症(例如，糖尿病)的功能里发挥治疗作用。与本领域内可用的基因里疗法相关的任意方法均可用于本发明的实践。参见例如，Goldspiel等，1993.ClinPharm12:488-505。

在优选的实施方案中，在适宜的宿主中，所述治疗物包含作为表达载体一部分的核酸，表达前述的Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、和/或Sox-9多肽中的任意一或多个，或者其片段、衍生物或类似物。在具体的实施方案中，此种核酸具有与Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1和Sox-9多肽的编码区可操作地连接的启动子。所述启动子可以是可诱导的或组成性的，并且任选是组织特异性的。所述启动子可以例如是，病毒或哺乳动物来源的。在另一具体的实施方案中，使用这样的核酸分子，其中编码序列(以及任何其它期望的序列)旁侧有促进在基因组内期望位点同源重组的区域，由此提供核酸的染色体内表达。参见例如，Koller和Smithies,1989.ProcNatlAcadSciUSA86:8932-8935。在另外的实施方案中，所递送的核酸保持游离并且诱导内源且原本沉默的基因。

将治疗核酸递送至患者内可以是直接的(也即所述患者直接暴露于所述核酸或者含有核酸的载体)或间接的(也即细胞首先在体外与所述核酸接触，继而再被移植至患者内)。这两种方法分别已知为体内、或离体基因疗法。在本发明具体的实施方案中，直接在体内施用核酸，其在体内表达以产生所编码的产物。这可以通过许多本领域已知的方法来实现，包括但不限于，将所述核酸构建为适宜的核酸表达载体的一部分并以使其进入细胞内的方式将其施用(例如，通过使用缺陷或减毒逆转录病毒或其它病毒载体感染；参见U.S.Pat.No.4,980,286)；直接注射裸DNA；使用微颗粒轰击(例如，"GeneGun.RTM.；Biolistic,DuPont)；以脂质包被所述核酸；使用相关的细胞表面受体/转染剂；包囊于脂质体、微颗粒、或微囊中；与已知会进入核的肽结合进行施用；或者通过将其与易于发生受体介导的胞吞作用的配体一起结合进行施用(参见例如，Wu和Wu，1987.JBiolChem262:4429-4432)，其可用于"靶向"特异性表达感兴趣受体等的细胞类型。

本发明实践中基因疗法另外的方式涉及在体外组织培养中将基因转移至细胞内，其中是通过这样的方法如电穿孔、脂染、磷酸钙介导的转染、病毒感染，等等。一般而言，转移的方法包括可选择标记伴随转移至细胞。所述细胞继而被置于选择压力下(例如，抗生素抗性)，从而促进已经摄取并表达所转移基因的细胞的分离。这些细胞继而被递送至患者。在具体的实施方案中，在所得的重组细胞的体内施用之前，通过本领域已知的方法将核酸引入到细胞内，包括但不限于：转染、电穿孔、显微注射、用含有感兴趣核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球体融合，以及确保受体细胞必需的发育和生理功能不受转移破坏的类似的方法。参见例如，Loeffler和Behr，1993。MethEnzymol217:599-618。所选的技术应当使核酸稳定的转移至细胞，从而使核酸能由该细胞表达。优选地，所述转移的核酸在所述细胞的后代中是可遗传的以及可表达的。在另一实施方案中，所转移的核酸保持游离并诱导原本沉默的内源核酸表达。

在本发明优选的实施方案中，可以通过各种本领域已知的方法将所得的重组细胞递送至患者，包括但不限于，上皮细胞的注射(例如，皮下注射)，将重组皮肤细胞作为皮肤植入物而应用于患者，以及重组血液细胞的静脉内注射(例如，造血干细胞或祖细胞)或肝细胞。设想使用的细胞的总量取决于所期望的效果、患者状态，等等，并且可以由本领域技术人员来确定。

核酸用于基因疗法的目的而可以被引入其中的细胞涵盖认可期望的和可用的细胞类型，并且可以是异种的、异基因的、同基因的、或者自身的。细胞类型包括但不限于，分化的细胞如上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞和血细胞，或者各种肝细胞或祖细胞，特别是胚胎心脏肌肉细胞、肝脏干细胞(国际专利申请WO94/08598)，神经干细胞(Stemple和Anderson，1992，Cell71:973-985)，造血干细胞或祖细胞，例如，得自骨髓、脐带血、外周血液、胎儿肝脏，等等。在优选的实施方案中，基因疗法所使用的细胞是与患者自体同源的。

用于基因疗法的DNA可以不经肠道施用于患者，例如，静脉内、皮下、肌肉内、和腹膜内施用。DNA或诱导剂在药物可接受的载体中施用，也即生物学顺应的载剂(例如生理盐水)，其适宜于施用与动物。治疗有效量是能够产生期望的医疗结果的量，例如，在所治疗的动物中胰腺基因提升。此种量可以由本领域技术人员来确定。如医疗领域内已知的那样，任意给定患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、要施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、整体健康、以及其它同期施用的药物。剂量会变化，但是静脉内施用DNA的优选剂量为大约10⁶至10²²个拷贝数的DNA分子。例如，以每Kg大约2×l0¹²毒粒施用DNA。

药物组合物

本发明的所述化合物，例如Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9多肽，编码Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9多肽的核酸，或者提高编码Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1、或Sox-9多肽的核酸表达的核酸或化合物(本文中也称作"活性化合物")，以及其衍生物、片段、类似物和同系物，可以掺入到适宜于施用的药物组合物中。此种组合物通常包含核酸分子、或蛋白、以及药物可接受的载体。如本文所用，"药物可接受的载体"包括顺应药物施用的任何以及所有的溶剂、分散介质、包被、抗菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸附延缓剂，等等。适宜的载体在最新版本的Remington'sPharmaceuticalSciences中有描述，这是本领域的标准参考文献，援引加入本文。此类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于，水、盐水、Finger溶液、右旋糖溶液、以及5％的人类血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水成载剂如不挥发的油。此类介质和物质对于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除了有与活性化合物不相顺应的任何常规介质或物质外，其在组合物中的用途是经过熟虑的。补充活性化合物也可以掺入组合物中。

本发明的药物组合物被配制为顺应其所要施用的途径。施用途径的实例包括不经肠道途径例如静脉内、皮内、皮下，口服(例如吸入)，经皮(外用)，经粘膜，以及直肠施用。用于不经肠道、皮内、或皮下应用的溶液或悬液可包括下列成分：无菌稀释剂如用于注射的水、盐水溶液、不挥发的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调整张力的物质如氯化钠或右旋糖。可以使用酸或碱来调节pH，如盐酸或氢氧化钠。不经肠道制剂可以封装于安瓿中，一次性注射器中或多剂量玻璃或塑料制成的小管中。

适宜于可注射用途的药物组合物包括无菌水成溶液(当为水可溶时)或扩散剂或无菌粉末用于即时制备无菌可注射溶液或扩散剂。对于静脉内施用，适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorEL.TM。(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况中，所述组合物必须是无菌的并且应当是流体达到容易注射的程度。其在制备和储存的条件下必须是稳定的，并且针对微生物如细菌和真菌的作用能够防腐。载体可以是溶剂或扩散介质，其含有例如，水、乙醇、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇，等等)，以及其任何适宜的混合物。例如，可以通过使用包被如卵磷脂、在扩散剂的情形中通过保持所需的颗粒大小以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。对微生物作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫汞撒，等等。在许多情形中，组合物中将优选包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可以通过在组合物中包括延缓吸附的物质以带来可注射组合物的延长的吸附，例如，单硬脂酸铝和明胶。

无菌可注射溶液的制备可以通过如下方法：将所需量的活性化合物掺入到适宜的溶剂(根据需要具有上文所列举成分的一种或者组合)中，随后进行过滤消毒。一般而言，扩散剂的制备是通过将活性化合物掺入到含有基本扩散介质和所需的其它上述成分的无菌载剂中。对于使用无菌粉末制备无菌可注射溶液的情形，制备方法是真空干燥以及冻干，产生活性成分的粉末外加任何另外的所需成分(来自之前进行了过滤消毒的其溶液)。

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以被封装在明胶胶囊中或压缩成小片。对于口服疗法施用的用途，活性化合物可以与赋形剂搀和并以小片、片剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以用流体载体来制备以用作漱口液，其中所述流体载体中的化合物经口服应用并被吸入和咳出或吞下。可以包括药物顺应结合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。所述小片、药片、胶囊、片剂等等可以含有任何下列成分或具有类似性质的化合物：结合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，分裂剂如褐藻酸、Primogel、或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯、或桔子调味剂。

全身性施用也可以是通过经粘膜或经皮方式来进行。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适宜于所要穿透的屏障的渗透剂。此类渗透剂一般是本领域已知的，并且包括例如，对于经粘膜施用：清洁剂、胆汁盐、和梭链孢酸衍生物。可以通过使用鼻喷雾或栓剂来实现经粘膜施用。对于经皮施用，如本领域一般所知的那样，将所述活性化合物配制到软膏、药膏、凝胶或乳霜中。

在一个实施方案中，所述活性化合物将与这样的载体一起制备，所述载体将会保护所述化合物以防快速从体内消除，如控制释放制剂，包括植入物和微囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物顺应的聚合物，如乙二醇乙二酸酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚正酯、和聚乳酸。制备此类制剂的方法对本领域技术人员而言是清楚的。所述材料也可以商业购自AlzaCorporationandNovaPharmaceuticals，Inc.。脂质体悬液(包括脂质体靶向的经感染细胞，其具有针对病毒抗原的单克隆抗体)也可以被用作药物可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如U.S.Pat.No.4,522,811中所述，援引加入本文。

特别有利的是将口服或不经肠道组合物配制为剂量单位的形式，以利于施用和剂量统一。剂量单位形式如本文所用是指物理上分离的单位，其适宜用作单一剂量用于要进行治疗的对象；每个单位含有预先确定的量的活性化合物(经计算产生期望的疗效)以及所需的药物载体。本发明剂量单位形式的规格取决于(并由其所决定)活性化合物的特征和期望达到的特定疗效。

本发明的核酸分子可以插入到载体中并用作基因疗法的载体。基因疗法载体可以通过许多途径中的任何途径来递送至对象，例如，如U.S.Pat.No.5,703,055中所述的。因而递送可以包括，例如，静脉内注射、局部施用(参见U.S.Pat.No.5,328,470)或立体定向注射(参见例如，Chen等(1994)PNAS91:3054-3057)。基因疗法载体的药物制剂可以在可接受的稀释剂中包括基因疗法载体，或者可以包含缓释基质，其中嵌入了基因递送载剂。或者，当可以从重组细胞中完好地产生完整的基因递送载体时，例如，逆转录病毒载体，所述药物制剂可以包括一个或多个细胞产生基因递送系统。

所述药物组合物可以与施用说明书一起被包含在容器中、包装里、或分配器中。

应理解本发明并不局限于本文所述的特定的方法、方案、试剂和试剂、以及实例。本文所用的术语和实例仅仅是用作描述特定实施方案的目的，用于向技术人员提供指引的目的，而并不是要用于限制本发明的范围。

实施例

实施例1：一般方法

人类肝细胞

成年人类肝脏组织得自3-23岁的或者年纪更大的个体。肝脏组织的使用得到了临床研究委员会的许可(机构审查委员会)。人类肝细胞的分离如(Sapir等，2005；Meivar-Levy等，2007)中所述那样进行。所述细胞在Dulbecco's基本培养基中培养(1g/l的葡萄糖)，其中补加有10％胎牛血清，100单位/ml的青霉素；100ng/ml的链霉素；250ng/ml的两性霉素B(BiologicalIndustries,BeitHaemek,Israel)，并在37℃保存在5％CO₂和95％空气的加湿器氛围中。

病毒感染

本研究中使用的腺病毒如下：Ad-CMV-Pdx-1(Sapir等，2005；Meivar-Levy等，2007)、Ad-RIP-荧光素酶(Seijffers等，1999)、Ad-CMV-β-Gal、Ad-CMV-MafA(来自Newgard,C.B.，DukeUniversity的慷慨赠与)，Ad-CMV-Pax4-IRES-GFP(来自StOnge，L.DeveloGenAG,Germany的慷慨赠与)、和Ad-CMV-Isl1(来自Kieffer，T.UniversityofBritishColumbia,Vancouver,Canada的慷慨赠与)。病毒颗粒是通过标准方案产生的(He等，1998)。

肝细胞用重组腺病毒感染5-6天(表1)，补加有EGF(20ng/ml；Cytolab,Ltd.,Israel)和烟碱(10mM；Sigma)。最佳的感染复数(MOI)根据细胞的存活(<75％)和C肽分泌的诱导来确定。所使用的病毒的MOI为；Ad-CMV-Pdx-1(1000MOI)，Ad-CMV-Pax4-IRES-GFP(100MOI)，Ad-CMV-MAf-A(10MOI)和Ad-CMV-Isl1(100MOI)。

RNA分离，RT和RT-PCR反应

提取了总RNA并制备且扩增了cDNA，如此前所述(Ber等,2003；Sapir等,2005)。使用ABISteponeplus序列检测系统(AppliedBiosystems,CA,USA)进行了定量实时RT-PCR，如此前所述(Sapir等,2005；Meivar-Levy等,2007；Aviv等,2009)。

C肽和胰岛素分泌检测

在初始暴露于病毒处理后，通过成年肝细胞的初代培养物静态温育6天而测量了C肽和胰岛素分泌，如文献所述(Sapir等,2005；Meivar-Levy等,2007；Aviv等,2009)。以2mM和17.5mM的葡萄糖测量了葡萄糖调节的C肽分泌，其由剂量依赖分析所确定以最大化地诱导从转分化的肝细胞的胰岛素分泌，而未对经处理的细胞功能有不利影响(Sapir等,2005；Meivar-Levy等,2007；Aviv等,2009)。C肽分泌通过放射免疫测定来检测，其中使用人类C肽放射免疫测定试剂盒(LincoResearch,St.Charles,MO；<4％的与人类胰岛素原的交叉反应性)。胰岛素分泌通过放射免疫测定检测，其中使用人类胰岛素放射免疫测定试剂盒(DPC,Angeles,CA；32％的与人类胰岛素原的交叉反应性)。所述分泌针对总的细胞蛋白(由Bio-Rad蛋白测定试剂盒测量)而进行了归一化。

荧光素酶测定

人类肝细胞由Ad-RIP-荧光素酶(200moi)和各种腺病毒(如下文所述)共感染。六天后，使用荧光素酶测定系统(Promega)和LKB1250照度计(LKB，Finland)测量了荧光素酶活性。所述结果针对总的细胞蛋白(由Bio-Rad蛋白测定试剂盒测量(Bio-Rad))而进行了归一化。

免疫荧光

将经过所述各种腺病毒处理的人类肝细胞置于12孔培养平板的玻璃盖载玻片上(2X10⁵个细胞/孔)。3-4天之后，如文献所述将细胞固定并染色(Sapir等,2005；Meivar-Levy等,2007；Aviv等,2009)。此研究中所使用的抗体为：抗-兔PDX-1、抗-山羊PDX-1(均为1:1000来自C.V.E.Wright的慷慨赠与)、抗-人类胰岛素、抗-人类生长激素抑制素(均为1:100,Dako,Glostrup,Denmark)、抗-Pax4(1:100；R&DSystems,Minneapolis,MN)、抗-MafA(1:160；SantaCruzBiotechnology，Inc.，SantaCruz，CA)。所使用的第二抗体为：抗-兔IgG菁(cy2)缀合抗体1:250、抗-兔IgG吲哚菁(cy3)缀合抗体1:250，抗-山羊IgG菁(cy2)缀合抗体1:200，抗-山羊IgG吲哚菁(cy3)缀合抗体1:250、和抗-小鼠IgG吲哚菁(cy3)缀合抗体1:250(全部来自JacksonImmunoResearch,PA)。最后，所述细胞用4',6-二脒基-2-苯基-吲哚(DAPI，Sigma)。将所述载玻片成像并使用荧光显微镜进行了分析(Provis，Olympus)。

统计学分析

使用2-样品Studentt检验(假设不等方差)进行了统计学分析。

实施例2：PDX-1-诱导的转分化

此前的研究(Sapir等,2005；Meivar-Levy等,2007；Aviv等,2009；Gefen-Halevi等,2010；Meivar-Levy等,2011)已经表明Pdx-1自己能够在人类肝细胞中诱导类β细胞表型和功能，可能是由于其在肝脏中激活多个原本沉默的內源pTF的能力。胰腺谱系的激活很快而且在5天之内发生(Sapir等,2005，Ber等,2003)。

在此实施例中，检验了介导Pdx-1诱导的肝向胰腺转分化的事件序列。将编码Pdx-1的腺病毒载体引入到成年人类肝细胞中，并且异位Pdx-1表达的作用在感染后被监测连续4天(第2-5天；图1)。每天通过定量RT-PCR分析进行了5天而确定了胰腺激素和胰腺特异性转录因子表达。结果针对相同cDNA样品内的β-肌动蛋白基因表达而进行了归一化，并表示为对比同一天对照病毒(Ad-CMV-β-gal,1000MOI)处理的细胞，相对表达的平均±SE。进行了两次独立的实验，n≥4，*p<0.05且**p<0.01。

胰高血糖素和生长激素抑制素的基因都在Ad-Pdx-1感染后一天之内被立刻激活(图1C和1D)。然而，胰岛素表达仅在感染后的第4至第5天检测到(图1A)。为了提供三种主要胰腺激素在不同时间激活的机理解释，在转分化过程中分析了内源激活的转录因子的表达水平。早期胰腺内分泌转录因子NGN3和NEUROD1立即被激活。然而，β-细胞特异性TF，如NKX6.1和MafA，应对异位Pdx-1表达仅仅逐渐且适度激活，分别在第4和5天达到其峰值表达水平。胰岛素基因表达在第5天的激活不仅与MafA表达的提高相关，还与Isl1表达的降低相关(图1D)。这些数据表明，人类肝细胞沿着胰腺谱系的转分化，虽然很快速，但却依然是一个渐进且连续的过程。胰腺激素基因(如生长激素抑制素和胰高血糖素)表达的不同时间激活可部分归因于內源激活的pTF表达的时间进程和相对水平。

实施例3：PDX-1、PAX4和MAFA的组合表达提高了肝脏至胰腺转分化的效率

此前的研究已表明，与单个pTF诱导相比，若干pTF的协同表达提高了沿着β-细胞谱系以及沿着其它谱系转分化的效率(Kaneto等,2005；Tang等,2006；Song等,2007；Wang等,2007；Gefen-Halevi等,2010)。为了在本文所述的初代成年人类肝细胞培养物的实验体系中分析此观点，研究了三种主要pTF对于肝脏向胰腺转分化个别的以及结合的贡献。Pdx-1、Pax4和MafA(介导胰腺中不同阶段的器官形成)，使用重组腺病毒在成年人类肝细胞的初代培养物中异位共表达。培养的成年人类肝细胞由Ad-CMV-Pdx-1(1000MOI)、Ad-CMV-Pax-4(100MOI)和Ad-CMV-MafA(10MOI)单独或协同感染，或者其由对照病毒(Ad-CMV-β-gal，1000MOI)所感染，并在6天之后检查了胰腺分化标记物。每种因子的感染复数(MOI)进行了滴定以导致最大的重编程效率结合对受感染细胞存活的最小不利影响。Pdx-1在培养物中70％的细胞中表达，而3种pTF的结合共表达在46.8％的Pdx-1阳性细胞中得到证实(图2A)。很少有细胞仅对Pax-4或对MafA有阳性染色。三种pTF阳性染色的细胞由箭头示出(图2A，右边组)。在图2B中，肝细胞由组合的pTF以及由Ad-RIP-LUC(200moi)共感染，并且测量了胰岛素启动子的荧光素酶活性。

三种pTF的组合表达导致了胰岛素启动子激活实质性的提高(图2B)，与每个pTF单独诱导相比，产胰岛素(原)细胞数目有三倍的提高(图2C)，并且葡萄糖调控的胰岛素(原)分泌有30-60％的提高(图2D)。总括言之，这些结果表明3种pTF的组合提高了转分化的效率，并且还表明每种因子其能力是有限的，或者说不足以单独促进最大的转分化(Kaneto等,2005；Tang等,2006；Zhou等,2008)。

实施例4：转分化的细胞成熟并分离成不同的产激素细胞是以序位的方式受到时间性控制

在此实施例中，研究了时间性控制对异位pTF表达的影响，以便确定3种pTF的组合异位表达所提高的转分化效率也是如上文所述那样受时间性控制的(图2)。作为支持时间性控制在胰腺转分化中具有作用的证明，已知所述3种pTFPdx-1、Pax4、和MafA在胰腺器官形成期间展现出不同的时间性表达和功能。

使用重组腺病毒将所述三种pTFPdx-1、Pax4、和MafA顺次或者协同引入到成年人类肝细胞的初代培养物中。腺病毒-介导的异位基因表达在感染后17小时达到峰值(Varda-Bloom等,2001)。因此，在连续的三天中将所述pTF顺次施用(参见实施例1中的病毒感染)，以使得它们的个别作用显现。根据表1中所示的时间表感染细胞。

表1

在三天中每天用一种pTF腺病毒构建体顺次感染细胞(用三种不同的次序)：直接序位次序(处理C＝Pdx-1→Pax4→MafA)，以相反的次序(处理D＝MafA→Pax4→Pdx-l)，以及以随机的次序(处理E＝Pdx-l→MafA→Pax4)。将顺次施用pTF对转分化效率的作用以及对类β细胞成熟的作用，与第一天协同或者同时施用所有三种pTF的作用进行比较(处理B＝Pdx-l+Pax4+MafA)，以及与对照病毒的类似MOI进行比较(处理A＝β-gal)(表1和图3A)。具体而言，用Ad-CMV-Pdx-1(1000MOI)、Ad-CMV-Pax-4(100MOI)和Ad-CMV-MafA(10MOI)一起或以顺次的方式(图3A和表1中所总结的)感染培养的成年人类肝细胞(处理B-E)，或者用对照病毒进行感染(Ad-CMV-β-gal，1000moi，处理A)，并在6天后对它们的胰腺分化进行分析。

胰岛素启动子活性(图4A)、产胰岛素细胞的百分比(图3B)以及葡萄糖调节的胰岛素(原)分泌(图3C)未受到顺次施用pTF的次序的影响。有趣的是，以随机次序顺次施用pTF(处理E＝Pdx-l→MafA→Pax4)导致了胰岛素启动子活性提高，但是却与胰岛素分泌的葡萄糖调控的丧失以及降低的葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2)表达相关联(图3B、3C和4B)。在改变Pax4和MafA的施用次序时，葡萄糖感知能力的丧失表明，所表达的pTF的顺序对类β细胞成熟(而非转分化过程的效率)有潜在的影响。

实施例5：PDX-1、PAX4、和MAFA的序位施用促进转分化的细胞成熟为类β细胞

前面的结果推动了进一步的研究，以便确定在何种程度上以及在何种条件下转分化效率的而提高会与沿着β-细胞谱系成熟的增加相关联。成熟β细胞的标志性特征是加工胰岛素原并将其以葡萄糖调节的方式分泌的能力(Eberhard等,2009；Borowiak，2010)。为了分析pTF表达的时间性改变是否会不同地改变转分化细胞沿着β-细胞谱系的成熟，分析了不同处理A-E(表1和图3A)对胰岛素原加工和葡萄糖调节的C肽分泌的作用。

实际上，只有pTF的直接序位施用(处理C)导致产生了经加工胰岛素的显著产生以及其葡萄糖调节的分泌，其展现出生理葡萄糖剂量应答的特征(图3C和5A)。新获得的表型和功能是稳定的，这可以由在体外以葡萄糖调节的方式分泌C肽达4周的能力所证实(图5A和5B)。

仅在直接序位pTF施用(处理C)时激素原的加工提升，与PCSK2和GLUT2基因表达的显著提高相关联，其在激素原加工和葡萄糖感知能力中分别发挥作用(图3和4)。这些数据表明，pTF顺次和直接的序位表达在促进转分化肝细胞沿着β-细胞谱系成熟和功能中发挥必不可少的作用。协同(处理B)和以非直接序位模式依次(处理D和E)施用TF，都未能产生出展现成熟类β细胞特征的转分化细胞。

为了提供类β细胞成熟状态变化的机制解释，分析了在不同的时间性处理(B-E)中内源激活的pTF的全部能力。所有处理(B-E)都导致了多个内源pTF表达的提升(图3E)，如NEUROG3、NEUROD1、NKX6.1和NKX2.2。然而，"成熟"(处理C)和"不成熟"表型(处理B、E和D)之间最大的差异在内源Isl1基因表达的水平中显现。因而，直接序位pTF施用(处理C)所诱导的沿着β-细胞谱系最强的成熟与内源Isl1表达的显著降低关联(图3E，箭头)。这些数据总结在一起表明，转分化的细胞成熟成β细胞可以受到具体pTF相对和时间性表达水平的影响。

实施例6：PDX-1、PAX4、和MAFA的序位施用促进了转分化的细胞在类β和类δ细胞之间的分离

将MafA从处理C排除(表1)导致了Isl-1(图6D)和生长激素抑制素基因表达(图8D)。为了分析当排除MafA时Isl-1表达的提高是否真的引起生长激素抑制素基因表达的提高，在第3天将Ad-CMV-Isl-1与MafA一起添加(处理C，表1)。实际上，Isl-1提高了生长激素抑制素基因表达(图6E)。异位Isl-1表达(C+Isl-1)也引起生长激素抑制素蛋白产生的提高(图6F)以及其在产胰岛素细胞中的共产生(图9下组)，表明高MafA表达结合低Isl-1表达对于分离产胰岛素细胞和产生长激素抑制素细胞是至关重要的。

实施例7：PDX-1、PAX4、和MAFA对肝转分化为胰腺的各自贡献的分析

通过功能研究的时间性增益鉴定了转分化过程的顺次特征。通过相对和时间性的"减少功能"手段，对每种转录因子Pdx-1、Pax4和MafA对序位发育过程各自贡献进行了进一步分析。通过直接实践性和顺次的重编程方案处理了成年人类肝细胞(处理C)，其中略过了异位pTF中的一个。所略过的pTF被携有β-gal表达的对照腺病毒所代替(以相似的感染复数)。具体而言，将成年人类肝细胞用直接"序位”顺序感染次序来处理(处理C，图3A和表1)。一次略过一个单一的转录因子(pTF)并由相同moi的Ad-CMV-β-gal来替代。略过Pdx-1表示为(C-Pdx-1)，略过Pax4表示为(C-Pax4)，以及略过MafA表示为(C-MafA)。

在分子和功能层面分析了分别略过每个pTF表达的功能性后果(图6)。分别略过Pdx-1和MafA(分别为C-Pdx-1和C-MafA)导致了胰岛素启动子激活的降低(图6A)，经加工胰岛素分泌的葡萄糖应答消除(图6B)和GLUT2和GK表达降低(图6C)。MafA的排除也与激素原转化酶，PCSK2表达的降低相关联(图6C)。另一方面，排除Pax4(C-Pax4)并未显著影响胰岛素启动子激活，也未影响葡萄糖调节的C肽分泌。略过Pax-4也与GLUT2和PCSK2表达的降低相关联(图6C)，可能表明GK的表达足以获得激素分泌的葡萄糖控制能力。

对于时间性和分别排除pTF给内源激活的pTF表达全部潜能带来的后果进行了分析，以便解释这些发育变化。排除Pdx-1和Pax4引起了大部分其它pTF表达的显著下降(包括NeuroG3、NKX2.2、NKX6.2、和Pax6)，表明它们对提高转分化效力的潜在贡献，是与它们激活内源胰腺TF的能力相关的(图6D)。另一方面，排除MafA并未有助于进一步激活内源pTF表达，可能反映了其仅在胰腺β细胞中晚期和有限表达。相反，MafA有助于提高胰岛素启动子活性，激素原加工以及其葡萄糖调控的分泌仅仅与Isl-1表达的降低相关(图6D)。这些数据可表明，MafA不参与进一步促进内源pTF表达以及肝脏至胰腺转分化的效率，但是参与促进转分化的细胞成熟。

实施例8：ISL-1防止转分化的细胞成熟成为β细胞谱系

MafA对类β细胞成熟的作用可能部分与其阻抑Isl1表达的能力相关。为测试此假说，通过腺病毒感染将异位Isl1(Ad-Isl1)引入到转分化的细胞。简言之，在第3天用直接"序位”顺次感染次序处理了成年人类肝细胞(处理C)并补加有Ad-Isl1(l或100MOI)(C+Isl1)。

如上文所示，以直接序位的方式顺序施用三种pTF(处理C)导致了转分化效率和新生成的细胞沿着β-细胞谱系的成熟都得到提高。Isl1在第三天与MafA结合施用(C+Isl1)。实际上，Isl1在第三天的过表达(在异种启动子的控制下)，导致了胰岛素基因表达的实质性降低和葡萄糖调控的胰岛素(原)分泌的去除(图7)。感知葡萄糖能力的丧失与GLUT2表达的减弱相关联(图7C)。这些结果表明，在转分化方案最终阶段里下调Isl1表达会潜在地阻碍沿着β细胞谱系的成熟，并且可部分说明在低MafA表达下成熟的去除。

综合来说，这些数据表明了，pTF的直接序位表达在促进转分化的肝细胞沿着β细胞谱系成熟方面发挥关键的必不可少的作用。另外，有顺序的发育过程与pTF的激活和阻抑都相关，其可促进或者阻碍转分化的细胞沿着胰腺β细胞谱系的成熟。

实施例9：PDX-1、PAX4和MAFA序位施用诱导胰高血糖素和生长激素抑制素表达

沿着内分泌胰腺谱系的转分化导致多种胰腺激素表达的激活。还研究了这些激素表达水平受pTF时间性操控的程度。通过定量实时PCR分析在所示处理之后确定了胰腺激素胰高血糖素(GCG)的基因表达(图8A和8B)、生长激素抑制素(SST)的基因表达(图8A、8D、和8E)、或细胞特异性转录因子的基因表达(图8C)。

胰高血糖素(GCG)和生长激素抑制素(SST)基因的转录由每个单独表达的pTF所诱导，主要由Pdx-1和MafA诱导以及低程度地受Pax4诱导(图8A)。胰高血糖素基因转录的进一步提高仅在pTF的直接序位施用时才发生(图4A，参见处理C)。Pdx-1和MafA发挥其对胰高血糖素表达的作用(在分别与α-细胞特异性转录因子ARX和BRAI4的激活或仅有ARX的激活相关联的过程中)(图8C)。在大部分处理中都不受影响的生长激素抑制素基因表达(图8A和8D)，在当时间性方案由异位Pax4表达来作为结束时得到了提高(E＝Pdx-l→MafA→Pax4)。此顺序方案还展现出对葡萄糖调节的胰岛素(原)分泌的破坏作用，并且与Isll内源表达的降低相关联(图3C和E)。沿着β细胞谱系成熟的消失与生长激素抑制素基因表达的提高和生长激素抑制素阳性细胞数量的增加相关联(图8F)。许多所述细胞展现了生长激素抑制素和胰岛素的共定位(数据未显示)。

如实施例6中讨论的将每种pTF从序位施用中排除(处理C)也被用于进一步研究个体pTF在胰高血糖素和生长激素抑制素表达中的作用(图8B和8D)。Pax4的排除实质性地减少了生长激素抑制素基因表达，表明了其在减少此基因转录方面的潜在作用(图8D)。有趣的是，在发育过程的末尾排除MafA还实质性的提高了生长激素抑制素基因表达，表明了MafA对生长激素抑制素基因表达的潜在抑制作用。此作用可归因于MafA阻抑Isl1表达的能力。为了验证此假设，分析了异位Isl1对生长激素抑制素基因表达的作用。实际上，在第三天将Ad-Isl1与MafA一起施用(C+Isl1)提高了生长激素抑制素基因表达(图8E)，但却降低了胰岛素基因表达、激素产生和分泌(图8A，8B和图7)。在这些实验条件下，40％的产胰岛素细胞染色为生长激素抑制素阳性，其中很少的细胞仅表达生长激素抑制素。

这些结果表明转分化细胞成熟成为β细胞部分归因为在转分化的后期阶段的MafA表达。在此阶段，MafA在与其抑制Isl1表达能力相关联的过程中，限制生长激素抑制素表达。

图9显示了所提议的胰腺转录因子诱导肝脏至胰腺转分化的机制。在有限数量的人类肝细胞中，每种所述pTF能够激活适度的类β细胞表型。pTF的协同表达显著提高了肝脏至内分泌胰腺的转分化。然而新生成的细胞不成熟且共表达胰岛素和生长激素抑制素。仅有以直接序位的方式顺序施用相同的因子提高了转分化效率以及转分化细胞沿着β-细胞谱系的成熟。

实施例10：在体内具有转分化能力的细胞群体的鉴定

在小鼠中对具有转分化能力的细胞群体进行了体内鉴定。在小鼠肝脏里实现了Pdx-1基因的异位表达。虽然异位Pdx-1基因在肝脏的大约40-50％的细胞中均一的表达(图10A)(Ferber等,NatMed.2000,和Ber等,JBC,2003)产胰岛素细胞(IPC)在经Pdx-1处理的小鼠中在体内主要位于中央静脉附近(图10B)，其特征在于有活性的Wnt信号和谷氨酰胺合成酶(GS)的表达(图1C)。由Pdx-1对GS表达和胰岛素激活的共定位也表明，可以激活GSRE的细胞具有提高转分化能力的倾向。因此，易于转分化的细胞群体也可以通过GSRE激活和有活性的Wnt-信号通路来鉴定。

实施例10：使用腺病毒来鉴别易于转分化的人类肝细胞

本实施例证明了使用重组腺病毒来鉴别易于转分化的人类肝细胞。培养物中的人类肝细胞在细胞内Wnt信号通路和GS的表达方面是混杂的。由于GS独特地在外周肝细胞中表达，因而激活GSRE(GS调节元件)的能力可以被用作分离相关细胞的选择参数(Gebhardt等,ProgHistochemCytochem,2007；Gebhardt等,MethodsMolBiol,1998；和Gaunitz等,Hepatology,2005)。

另外由于GSRE还含有STAT3结合元件，细胞转分化的倾向可以由此元件来介导。STAT3通路也可以涉及到赋予细胞重编程或转分化的倾向(图10、11、14和19)。

实施例11：GSRE重复靶向培养物中13-15％的人类肝细胞

GSRE包括TCF/LEF和STAT5结合元件(图11)。产生了两种重组腺病毒，其携有GSRE(可操作地连接至TK启动子(图11))控制下的eGFP基因或Pdx-1基因的表达(图11)。这些腺病毒推动Pdx-1(图12A)或eGFP(图12B)的表达。两种蛋白都在培养中的大约13-15％的人类肝细胞中重复表达，表明对特定肝细胞群体的靶向。

实施例12：GSRE驱动的PDX-1比CMV驱动的PDX-1在激活肝细胞中胰岛素生产方面更有效。

虽然GSRE的重复表达仅在培养物中大约13±2％的细胞中推动PDX-1，其转分化能力与Ad-CMV-Pdx-1诱导相比类似或者更高(Ad-CMV-Pdx-1在培养物中推动60-80％细胞的Pdx-1表达)(图13)。GSRE-激活的细胞可以说明培养物中全体成年人类肝细胞的转分化能力。Ad-GSRE-Pdx-1处理后再25％的Pdx-1阳性细胞中有胰岛素产生，与之相比经Ad-CMV-Pdx-1处理的细胞则有1％。

实施例13：通过EGFP使用慢病毒来持久性标记GSRE+细胞

使用慢病毒构建体进行了长期谱系追踪。使用经修改的双慢病毒系统对GSRE活性进行了体外谱系追踪，所述双慢病毒系统近来被用于追踪肝细胞中的角质形成细胞KRT5(Mauda-Havakuk等,PLoSOne，2011)或白蛋白(Meivar-Levy等,JTransplant，2011)的表达。此慢病毒系统(与来自UniversitePierreetMarieCurieParis的Prof.P.Ravassard的合作，France；图12A)包括CMV-loxP-DsRed2-loxP-eGFP(R/G)报道蛋白(Meivar-Levy等,JTransplan，2011；Mauda-Havakuk等,PLoSOne，2011；和Russ等,糖尿病，2008)和额外的病毒载体携有GSRE和最小TK启动子控制下的Cre重组酶的表达(由Prof.Gaunitz慷慨提供，(Gebhardt等,ProgHistochemCytochem，2007和Gaunitz等,Hepatology，2,005)Germany，图3A)。因而，GSRE激活的细胞不可逆地被eGFP标记(eGFP+)，而其它双感染的细胞被DsRed2标记(DsRed2+)。10-14％的细胞在10天之内成为eGFP+(图14B)。所述细胞通过细胞分选仪分离(图14)并且分开传代(图15A)。eGFP+的培养物(GSRE激活剂)和DsRed2+细胞产生自10个不同的人类供体(年龄3-60)。

实施例14：EGFP+细胞始终展现出优越的转分化能力

根据GSRE活性的谱系追踪所分离的人类肝细胞能有效地传代(图15A)并且同样有效地受重组腺病毒感染。eGFP+细胞始终展现出优越的转分化能力(图16)，展现为胰岛素和胰高血糖素基因的表达，其与培养物中的人类胰岛(图16A)、葡萄糖调控的胰岛素分泌(图16B)和葡萄糖调控的C肽分泌(图16C)相当。这些能力是恒定的而且在细胞大量增殖时并未消失(图17)。

实施例15：具有转分化倾向的细胞的表征

为了鉴别出对人类肝细胞不同的转分化效率有潜在影响的因子，我们使用微阵列芯片分析比较了两个分别的群体的整体基因表达谱。人类肝细胞培养物源自3个不同供体并被分成eGFP+和DsRed2+细胞且传代4代。将所提取的RNA转化为cDNA并使用GeneralHumanArray进行了微阵列芯片分析(GeneChipHumanGenomeU133A2.0Array，Affymetrix)。虽然大部分基因在分离的组中以相当的水平表达，800种探针的表达显著不同(图18)。根据微阵列芯片分析，大约100种编码膜蛋白的基因在易于转分化的(eGFP+)和非应答(DsRed2+)细胞中差异表达。这些标记物的一些在表2中给出。

表2在eGFP+和DsRed2+细胞中差异表达的膜抗原

抗原	高表达	倍数(Log2)	P-值	商业抗体
					ABCB1	DsRed2	-6.363	1.52E-02	BD Biosciences(#557002)
ITGA4	DsRed2	-1.979	2.69E-02	R&D system(FAB1345G)
					ABCB4	DsRed2	-4.42	4.62E-02	Abcam(ab24108)
PRNP	DsRed2	-1.35	4.20E-02	eBioscience(12-9230-73)
					HOMER1	eGFP	1.41	3.25E-02	Biorbyt(orb37754)
LAMP3	eGFP	1.285	1.81E-02	BD Biosciences(#558126)
					BMPR2	eGFP	1.236	3.50E-02	R&D system(AF811)

微阵列数据给出了很多在eGFP+和theDsRed2+细胞之间差异表达的膜蛋白(Fold＝eGFP+与DsRed2+相比差异表达(log2))。所有给出的抗原具有商业可购买的抗体。

实施例16：在易于转分化的细胞中WNT信号是有活性的

已有建议表明肝脏分区受到激活的β-连环蛋白水平的梯度所控制；虽然肝脏中的大部分细胞含有非常低的β-连环蛋白活性，外周肝细胞表达与有活性的Wnt信号相关联的高β-连环蛋白活性(Gebhardt，等,ProgHistochemCytochem，2007)。由于Wnt信号对于感受态β细胞活性是必需的(Liu等,JBiolChem，2008；Liue等,AdvExpMedBiol，2010；Loder等,BiochemSocTrans，2008；和Shu等,糖尿病，2008)，肝脏pTF-诱导的胰腺谱系激活局限在先前展现出有活性的Wnt信号的细胞中。

GSRE利用了分离自GS的5’增强子的TCF调节元件。如果Pdx-1-诱导的肝脏至胰腺的转分化部分由细胞内Wnt信号通路介导，调节信号通路的因子应当也影响转分化效率(图19)。

成年人类肝细胞中的此数据表明，提高的Wnt3a的浓度提升了Pdx-l-诱导的葡萄糖调节的胰岛素分泌，而DKK3(Wnt信号通路的抑制剂)完全消除了Pdx-1对该过程的影响(图19)。DKK3也完全消除了根据激活GSRE能力而分离的eGFP细胞的转分化能力(图20)。

在eGFP+和DsRed+细胞群体中对Wnt信号通路进行了表征。APC表达(参与了β-连环蛋白的破坏，由此消除了Wnt信号)在DsRed2+细胞中比在eGFP+细胞中高700％(图21A，与体内展现的分区部分相同)。相较于DsRed2+细胞中分析的水平，所述eGFP+群体提高了激活的β-连环蛋白的水平(40％)(图2IB和C)。这些数据证明了Wnt信号在能够激活GSRE和具有转分化倾向的细胞中是有活性的。

其它实施方案

虽然本发明已经结合其详细说明书进行了描述，但是前文的描述意在进行说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求来限定。其它的方面、优点、和修改在下述权利要求的范围内。

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Claims (63)

1.产生具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体的方法，其包括；

a.于第一时间段，在允许摄取胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽、或编码胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽的核酸的条件下，将成年哺乳动物非胰腺细胞与所述的胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽、或编码胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽的核酸接触；

b.于第二时间段，在允许摄取Pax-4多肽、NeuroD1多肽、或编码Pax-4多肽的核酸、或编码NeuroD1多肽的核酸的条件下，将步骤(a)的细胞与所述的Pax-4多肽、NeuroD1多肽、或编码Pax-4多肽的核酸、或编码NeuroD1多肽的核酸接触；以及

c.于第三时间段，在允许摄取MafA多肽或编码MafA多肽的核酸的条件下，将步骤(b)的细胞与所述的MafA多肽或编码MafA多肽的核酸接触；

由此产生具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体。

2.生产具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体的方法，其包括:

a.于第一时间段，在允许摄取胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽或编码胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽的核酸以及第二胰腺转录因子的条件下，将成年哺乳动物非胰腺细胞与所述的胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽或编码胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽的核酸以及第二胰腺转录因子接触；以及

b.于第二时间段，在允许摄取编码MafA多肽的核酸的条件下，将步骤(a)的细胞与所述的MafA多肽、或编码MafA多肽的核酸接触；

由此产生具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体。

3.权利要求1或2的方法，其中所述核酸是核糖核酸或脱氧核糖核酸。

4.权利要求2的方法，其中所述第二胰腺转录因子是NeuroD1、Pax-4、或Ngn3。

5.前述权利要求中任一项的方法，还包括在允许摄取Sox-9多肽的核酸或Sox-9多肽的条件下，将步骤(a)、(b)或(c)的细胞与所述的编码Sox-9多肽的核酸或Sox-9多肽接触。

6.权利要求1的方法，其中第二时间段为第一时间段之后至少24小时。

7.权利要求1的方法，其中第三时间段为第二时间段之后至少24小时。

8.权利要求2的方法，其中第二时间段为第一时间段之后至少2、3、4、5、6或7天。

9.权利要求1的方法，其中第一、第二和第三时间段是同时。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞选自以下组成：骨髓、肌肉、脾、肾、血液、皮肤、胰腺、和肝细胞。

11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞在体内进行接触。

12.权利要求1-8的方法，其中所述细胞在体外进行接触。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述群体包含至少5亿细胞。

14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞在步骤(a)之前于培养中进行扩增。

15.治疗退行性胰腺疾病的方法，其包括向有需要的对象：

a.于第一时间段，施用包含PDX-1多肽或编码PDX-1多肽的核酸的组合物；

b.于第二时间段，施用包含Pax-4多肽、NeuroD1多肽、编码Pax-4多肽的核酸、或编码NeuroD1多肽的核酸的组合物；以及

c.于第三时间段，施用包含MafA多肽或编码MafA多肽的核酸的组合物。

16.治疗退行性胰腺疾病的方法，其包括向有需要的对象：

a.于第一时间段，施用包含PDX-1多肽或编码PDX-1多肽的核酸以及第二胰腺转录因子的组合物；和

b.于第二时间段，施用包含MafA多肽或编码MafA多肽的核酸的组合物。

17.权利要求15或16的方法，其中所述核酸是核糖核酸或脱氧核糖核酸。

18.权利要求15的方法，其中所述第二胰腺转录因子是NeuroD1、Pax-4或Ngn3。

19.权利要求15的方法，还包括施用包含Sox-9多肽或编码Sox-9多肽的核酸的组合物。

20.权利要求14中任一项的方法，其中第二时间段为第一时间段之后至少24小时。

21.权利要求14中任一项的方法，其中第三时间段为第二时间段之后至少24小时。

22.权利要求16的方法，其中第二时间段为第一时间段之后至少2、3、4、5、6或7天。

23.治疗退行性胰腺疾病的方法，其包括向有需要的对象施用权利要求1-14中任一项的方法所产生的细胞群体。

24.权利要求15-23中任一项的方法，其中所述退行性胰腺疾病是糖尿病。

25.权利要求24的方法，其中所述糖尿病是1型、2型或妊娠期糖尿病。

26.权利要求15-23中任一项的方法，其中所述退行性胰腺疾病是胰腺癌或胰腺炎。

27.包含编码PDX-1多肽的核酸和编码第二胰腺转录因子的核酸的表达载体，用于权利要求1-2或权利要求15-16中任一项的方法。

28.权利要求27的表达载体，其中所述第二胰腺转录因子是NeuroD1、Pax-4或Ngn3。

29.富集的人类细胞群体，其中所述群体中至少5％的细胞能够激活谷氨酰胺合成酶应答元件(GSRE)。

30.权利要求25的细胞群体，其中所述细胞是内皮细胞、上皮细胞、间质细胞、成纤维细胞或肝细胞。

31.权利要求26的细胞群体，其中所述肝细胞源自外周肝。

32.权利要求25-27任一项中的细胞群体，其中所述细胞具有有活性的Wnt信号。

33.权利要求29-32中任一项的分离的细胞群体，其中当所述细胞被处理以异位表达胰腺转录因子时，至少5％的所述细胞产生胰岛素或者分泌C肽。

34.权利要求33中分离的细胞群体，其中所述胰腺转录因子是Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或其组合。

35.权利要求29-34中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体表达以下的至少一种：

a.Wnt3a；

b.水平降低的DKK1或DKK3；

c.水平降低的APC；

d.水平提高的激活的β-连环蛋白；或

e.STAT3结合元件(顺式作用因子)。

36.从权利要求29-35中任一项的细胞群体所分离的肝细胞群体，其中所述细胞表达：

a.水平提高的HOMER1、LAMP3、或BMPR2；或者

b.水平降低的ABCB1、ITGA4、ABCB4或PRNNP。

37.分离具有富集的转录因子诱导的转分化能力的细胞群体的方法：

a.提供混杂的人类细胞群体；

b.引入核酸构建体，所述核酸构建体包含可操作地连接至报道蛋白的谷氨酰胺合成酶应答元件(GSRE)、或者其能够激活谷氨酰胺合成酶转录的片段；

c.分离表达所述报告蛋白的细胞；

由此分离具有富集的转分化能力的细胞群体。

38.权利要求37的方法，其中在所述核酸构建体中还包含启动子/增强子。

39.权利要求37或38的方法，其中所述报道蛋白是荧光蛋白。

40.权利要求37或38的方法，其中所述报道蛋白提供了对选择压力的抗性。

41.权利要求33-35中任一项的方法，其中所述细胞是内皮细胞、成纤维细胞、间质细胞或肝细胞。

42.权利要求37的方法，其中所述肝细胞源自外周肝。

43.权利要求37至42中任一项的方法，还包括培养所分离的细胞。

44.由权利要求37-43中任一项的方法所分离的细胞群体。

45.治疗或减缓胰腺病症的症状的方法，包括：

a.将胰腺转录因子引入至权利要求44的细胞群体；以及

b.将所述细胞群体施用给有需要的对象。

46.权利要求45的方法，其中所述胰腺病症是糖尿病或胰腺炎。

47.权利要求45的方法，其中所述胰腺转录因子是Pdx-1、Pax-4、MafA、NeuroD1或其组合。

48.产生具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体的方法，其包括：

a.于第一时间段，在允许摄取胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽、或编码胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽的核酸的条件下，将权利要求44的细胞群体与所述的胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽、或编码胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽的核酸接触；

b.于第二时间段，在允许摄取Pax-4多肽、NeuroD1多肽、编码Pax-4多肽的核酸、或编码NeuroD1多肽的核酸的条件下，将步骤(a)的细胞与所述的Pax-4多肽、NeuroD1多肽、编码Pax-4多肽的核酸、或编码NeuroD1多肽的核酸接触；以及

c.于第三时间段，在允许摄取MafA多肽或编码MafA多肽的核酸的条件下，将步骤(b)的细胞与所述的MafA多肽或编码MafA多肽的核酸接触；

由此产生具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体。

49.产生具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体的方法，其包括：

a.于第一时间段，在允许摄取胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽或编码胰腺和十二指肠同源框(PDX-1)多肽的核酸以及第二胰腺转录因子的条件下，将权利要求44的细胞群体与所述的PDX-1多肽或编码PDX-1多肽的核酸以及第二胰腺转录因子接触；以及

b.于第二时间段，在允许摄取编码MafA多肽的核酸的条件下，将步骤(a)的细胞与所述的MafA多肽、或编码MafA多肽的核酸接触；

由此产生具有成熟胰腺β细胞表型和功能的细胞群体。

50.权利要求48或49的方法，其中所述核酸是核糖核酸或脱氧核糖核酸。

51.权利要求49的方法，其中所述第二胰腺转录因子是NeuroD1、Pax-4或Ngn3。

52.权利要求48-51中任一项的方法，还包括在允许摄取编码Sox-9多肽的核酸或Sox-9多肽的条件下，将步骤(a)、(b)或(c)的细胞与所述的编码Sox-9多肽的核酸或Sox-9多肽接触。

53.权利要求48的方法，其中第二时间段为第一时间段之后至少24小时。

54.权利要求48的方法，其中第三时间段为第二时间段之后至少24小时。

55.权利要求49的方法，其中第二时间段是第一时间段之后至少2、3、4、5、6或7天。

56.权利要求48的方法，其中第一、第二和第三时间段是同时。

57.核酸构建体，其包含可操作地连接至启动子和报道蛋白的一个或多个谷氨酰胺合成酶应答元件(GSRE)。

58.权利要求57的核酸构建体，其中所述启动子是弱启动子。

59.权利要求57或58的核酸构建体，还包括转录因子。

60.权利要求59的核酸构建体，其中所述转录因子是胰腺转录因子。

61.权利要求60的核酸构建体，其中所述胰腺转录因子是PDX-1、Pax-4、MafA、或NeuroDl。

62.载体，其包含权利要求58-61中任一项的核酸构建体。

63.权利要求62的载体，其中所述载体是腺病毒载体。