JP2016518367A - 虚血性損傷の治療及び予防用の組成物 - Google Patents

Abstract

虚血性損傷の治療及び予防用の組成物に係り、さらに具体的には、テロメラーゼに由来したペプチドを含む組成物であって、虚血性損傷の治療及び予防に効果的な組成物に関するものであり、当該配列番号の配列を有するペプチド、または該配列と８０％の配列相同性を有するペプチドまたは断片であるペプチドは、虚血性損傷の治療及び予防に優秀な効果を有する。これにより、該ペプチドを含む組成物は、虚血性損傷、特に、虚血再灌流損傷に効果的に適用される。

Description

本発明は、虚血性損傷の治療及び予防用の組成物に係り、さらに具体的には、テロメラーゼに由来したペプチッドを含む組成物であって、虚血性損傷の治療及び予防に効果的な組成物に関する。

虚血性損傷は、心臓、脳、腎臓のように、血流供給を必要とする臓器に、血液循環が遮断される場合（心筋梗塞、脳梗塞、腎梗塞）に発生する損傷であって、臓器の機能を低下させるだけではなく、死亡率を高める組織損傷であるといえる。虚血性損傷は、心臓、脳、腎臓などに致命的な合併症を引き起こし、臓器移植時に移植臓器の回復遅延、急性拒絶反応の増加、及び長期的な移植臓器の生存率を低下させる。

虚血による酸素伝達の実質的な減少は、低酸素症と知られた病態を誘導する。虚血と低酸素症とが持続すれば、組織の機能喪失、及び甚だしくは細胞死をもたらす。虚血及び低酸素症を誘発する、自然性及び医原性である多数の病態が存在し、非制限的な例としては、閉塞性血管疾病、冠状動脈血栓症、脳血管血栓症、動脈瘤破裂、全身出血、圧潰損傷、敗血症、深刻な皮膚火傷、血管閉塞性手術方法（例：胸腹動脈瘤手術過程での脊髄虚血）、心肺迂路方法、臓器移植、心肺虚脱（急性心臓死）及び窒息などがある。

虚血、及びそれによる低酸素症に対する一般的な治療は、全身酸素供給を増加させたり、あるいは血管詰まりの原因を除去し、血流及び酸素伝達を正常レベルに復旧したりすることである。虚血または低酸素症が長期間維持される状況と比較するならば、血流を復旧すれば、改善された結果を得ることができる。しかしながら、血流及び酸素伝達が復旧されながら、虚血または低酸素症によって誘発される損傷とかかわりなく、追加して細胞死または機能喪失がもたらされるという問題がある。

血流及び酸素伝達が復旧されながら誘発されるさらなる損傷は、再灌流損傷として知られている。再灌流損傷によって誘発される逆説的組織損傷は、炎症性細胞の再灌流された組織への付着、それら炎症性細胞の活性化、及び後続する自由ラジカルの形成から生ずる急性炎症状態と類似しているように見られる［Ｇｒａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，５７、３１１−３３２，（１９９５）］。再灌流された組織内に、自由ラジカル及びその他細胞毒性生体分子の生成は、壊死またはアポトーシスの経路活性化による細胞死を誘発する。

臓器移植過程で起こる虚血再灌流（ＩＲ：ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）による虚血性組織損傷は、臓器移植後の臓器機能回復を遅延させる結果を生み、それは、炎症性組織反応として、移植された臓器の長期的な機能維持に、好ましくない予後因子として作用する場合が多い。臓器、特に、腎臓の移植過程において付随的に発生する初期虚血再灌流損傷は、後続的な臓器機能悪化及び移植失敗につながることにもなる。

最近、腎臓損傷（ＩＲＩ：ｒｅｎａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）は、先天免疫系と獲得免疫系との炎症細胞がいずれも関与する１つの急性炎症反応として新たに究明されている。

一方、皮弁（ｆｌａｐ）とは、移動される組織が生存可能な血管茎、及びそれに準ずる組織を付着させ、身体の一部分から他の部分に移される皮膚や組織を意味する。皮弁術は、皮膚移植術などでは解決することができない軟部組織の欠損や慢性創傷などに利用され、成形外科の領域で最も広く施行される手術方法であり、外見上だけではなく、消失した機能の復元に有用な方法であり、特に、骨、腱、筋肉、神経などさまざまな組織の複合的な移植によって一次的な再建が可能であり、迅速な回復の可能であるという長所がある。かような皮弁術において、皮弁の生存率は、虚血再灌流損傷治療と密接な関係がある。そのために、虚血再灌流損傷治療方法を介して、皮弁の生存率を安定して向上させることができる方法があるならば、非常に有用であると予想される。

前述のように、発生頻度が高い重要疾患である虚血再灌流損傷に対する効果的な治療法が十分ではない実情である。従って、それに対する効果的な予防法及び治療法が見い出されるならば、その波及効果は非常に大きいであろう。

そのために、本発明者らは、効果が優秀な虚血再灌流損傷の治療及び予防用の組成物を開発すべく、鋭意努力した結果、本発明の完成に至った。

本発明者らは、テロメラーゼに由来するペプチドが、虚血再灌流損傷の治療及び予防に卓越した効果を有するということを発見し、発明を完成することになった。

本発明の目的は、虚血再灌流損傷の治療及び予防に効果を有する組成物を提供するところにある。

本発明の一側面によれば、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを含む虚血性損傷の治療及び予防用の組成物が提供される。

本発明の一側面による組成物において、前記断片は、３個以上のアミノ酸から構成された断片でもある。

本発明の一側面による組成物において、前記虚血性損傷は、血管疾病、冠状動脈血栓症、脳血管血栓症、動脈瘤破裂、全身出血、圧潰損傷、敗血症、皮膚火傷、血管閉塞性手術法、心肺迂路法、臓器移植、心肺虚脱（急性心臓死）及び窒息からなる群から選択される１以上の原因によるものでもある。

本発明の一側面による組成物において、前記虚血性損傷は、虚血再灌流損傷によるものでもある。

本発明の一側面による組成物において、前記虚血再灌流損傷は、脳血管虚血再灌流損傷、腎臓虚血再灌流損傷、肝臓虚血再灌流損傷、虚血再灌流心筋病症、皮膚虚血再灌流損傷、腸管虚血再灌流損傷、腸虚血再灌流損傷、胃虚血再灌流損傷、肺虚血再灌流損傷、膵臓虚血再灌流損傷、骨格筋虚血再灌流損傷、腹筋虚血再灌流損傷、四肢虚血再灌流損傷、虚血再灌流結腸炎、腸間膜虚血再灌流損傷及び無症侯性虚血再灌流損傷からなる群から選択されるものでもある。

本発明の一側面による組成物において、前記虚血再灌流損傷は、臓器移植によるものでもある。

本発明の一側面による組成物において、前記虚血再灌流損傷は、腎臓で起こるものでもある。

本発明の一側面による組成物において、前記虚血再灌流損傷は、皮弁で起こるものでもある。

本発明の一側面による組成物において、前記ペプチドは、ヒトテロメラーゼに由来したものでもある。

本発明の一側面による組成物において、前記組成物は、薬学組成物でもある。

本発明の一側面による組成物において、前記組成物は、食品組成物でもある。

本発明の他の一側面によれば、前述の組成物を治療を必要とする対象に投与することを特徴とする虚血性損傷の治療法及び予防法が提供される。

本発明による配列番号の配列を有するペプチド、または前記配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドは、虚血性損傷の治療及び予防に優秀な効果を有する。従って、本発明のペプチドを含む組成物は、虚血性損傷、特に、臓器移植などによる虚血再灌流損傷に効果的に適用される。

虚血再灌流２４時間後に採取した血液内尿素窒素（ＢＵＮ）及びクレアチンの数値を測定したグラフである。 虚血再灌流２４時間後、腎臓組織をＰＡＳ（過ヨウ素酸染色）染色した結果を示した写真である。 虚血再灌流２４時間後、腎臓組織に対して腎臓組織損傷スコアリングを実施した結果を示したグラフである。 虚血再灌流２４時間後、腎臓組織をＴＵＮＥＬ染色で評価した結果の写真である。 虚血再灌流２４時間後、腎臓組織をＴＵＮＥＬ染色で評価したＴＵＮＥＬ陽性細胞測定の結果である。 虚血再灌流２４時間後、腎臓組織において、Ｆ４／８０（マクロファージマーカー）及びＧｒ−１（好中球マーカー）の免疫組織染色で先天免疫細胞浸潤を評価した結果である。 虚血再灌流２４時間後、腎臓組織において、Ｆ４／８０（マクロファージマーカー）及びＧｒ−１（好中球マーカー）の陽性細胞測定結果を示したグラフである。 虚血再灌流２４時間後、腎臓組織で炎症性サイトカインの分泌抑制効果を示したグラフである。 虚血再灌流２４時間後、腎臓組織で炎症性サイトカインの分泌抑制効果を示したグラフである。 虚血再灌流２４時間後、腎臓組織で炎症性サイトカインの分泌抑制効果を示したグラフである。 皮弁生存率を評価するための虚血再灌流損傷誘導過程を示す図面である。 虚血再灌流誘導後、７日後のＰＥＰ１処理群と生理食塩水処理群との皮弁生存率測定結果を示したグラフである。 図１２に係わるＩｍａｇｅＪプログラムを介したデジタル写真である。

本発明は、多様な変換を加えることができ、さまざまな実施例を有することができるが、以下、本発明についてさらに具体的に説明する。しかし、それは、本発明を特定の実施形態について限定するものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むものであると理解されなければならない。本発明の説明において、関連公知技術に係わる具体的な説明が、本発明の要旨を不明確にすると判断される場合、その詳細な説明を省略する。

テロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）は、染色体の末端に反復的に存在する遺伝物質であって、当該染色体の損傷や、他の染色体との結合を防止すると知られている。細胞が分裂するたびに、テロメアの長さは少しずつ短くなるが、一定回数以上の細胞分裂があれば、テロメアは非常に短くなり、その細胞は、分裂を止めて死ぬ。一方、テロメアを長くすれば、細胞の寿命が延長されると知られており、その例として、癌細胞では、テロメラーゼ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）という酵素が分泌され、テロメアが短くなることを防ぐために、癌細胞が死なずに、続けて増殖すると知られている。

本発明の一側面は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドを利用して、ペプチドを量産することができる。例えば、ペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に入れて培養することによって、ペプチドを量産することができる。

本明細書に開示されたペプチドは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列相同性を有するペプチドも含む。また、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１を含むペプチドまたはその断片と、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸または７個以上のアミノ酸が変化したペプチドと、を含んでもよい。

本発明の一側面において、アミノ酸変化は、ペプチドの物理化学的特性を変更させる性質に属する。例えば、ペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を変更させ、最適のｐＨを変化させるようなアミノ酸変化が行われる。

本発明の一側面において、配列番号１の配列を含むペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼ、具体的には、ヒトテロメラーゼに由来したペプチドを含む。

本明細書において「アミノ酸」というのは、自然にペプチドに統合される２２個の標準アミノ酸だけではなく、Ｄ−アイソマー及び変形されたアミノ酸を含む。それにより、本発明の一側面においてペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドでもある。一方、本発明の他の側面においてペプチドは、翻訳後の修飾が行われた非標準アミノ酸なども含む。翻訳後の修飾の例は、リン酸化、糖化、アシル化（例えば、アセチル化、ミリストイル化及びパルミトイル化を含む）、アルキル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、糖化反応、ビオチニル化、ユビキチニル化、化学的性質の変化（例えば、ベータ除去脱イミド化、脱アミド化）及び構造的変化（例えば、二硫化物ブリッジの形成）を含む。また、ペプチドコンジュゲートを形成するための架橋剤との結合過程で起こる化学反応によって生ずるアミノ酸の変化、例えば、アミノ基、カルボン酸基、または側鎖での変化のようなアミノ酸の変化を含む。

本明細書に開示されたペプチドは、自然そのままの供給源から同定されて分離された野生型ペプチドでもある。一方、本明細書に開示されたペプチドは、配列番号１の断片であるペプチドと比較し、一つ以上のアミノ酸が置換、欠失及び／または挿入されたアミノ酸配列を含む、人工変異体でもある。人工変異体だけではなく、野生型ポリペプチドでのアミノ酸変化は、タンパク質のフォールディング及び／または活性に、有意の影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換を含む。保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ルシン、イソロイシン及びメチオニン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）の群の範囲内にある。一般的に、特異的活性を変更させないアミノ酸置換が、本分野に公知されている。最も一般的に発生する交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡｓｐ／Ｇｌｙ、並びにそれらと反対のものである。保存的置換の他の例は、次の表１の通りである。

ペプチドの生物学的特性における実在的な変形は、（ａ）置換領域内のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたは螺旋立体構造の維持におけるそれらの効果、（ｂ）標的部位での前記分子の電荷または疎水性の維持におけるそれらの効果、または（ｃ）側鎖のバルク維持におけるそれらの効果がかなり異なる置換部を選択することによって行われる。天然残基は、通常の側鎖特性に基づいて、次のグループに区分される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

非保存的置換は、それら部類のうち１つの構成員を他の部類に交換することによって行われる。ペプチドの適切な立体構造の維持と関連性のないいかなるシステイン残基も、一般的にセリンで置換され、前記分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋結合を防止することができる。逆に言えば、システイン結合を前記ペプチドに加え、その安定性を向上させることができる。

ペプチドの他類型のアミノ酸変異体は、抗体のグリコシル化パターンが変化したものである。変化という意味は、ペプチドで発見された一つ以上の炭水化物残基の欠失、及び（または）ペプチド内に存在しない一つ以上のグリコシル化部位の付加を示す。

ペプチドのグリコシル化は、典型的にＮ連結されるか、あるいはＯ連結されたものである。Ｎ連結されているということは、炭水化物残基が、アスパラギン残基の側鎖に付着したことをいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除いた任意のアミノ酸）は、炭水化物残基をアスパラギン側鎖に酵素的に付着させるための認識配列である。従って、それらトリペプチド配列のうち一つがポリペプチドに存在することによって、潜在的なグリコシル化部位が生成される。Ｏ連結されたグリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち一つを、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニンに付着させることを意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用することもできる。

ペプチドへのグリコシル化部位の付加は、一つ以上の前述のトリペプチド配列を含むように、アミノ酸配列を変化させることによって便利に行われる（Ｎ連結されたグリコシル化部位の場合）。そのような変化は、一つ以上のセリン残基またはトレオニン残基を、最初の抗体の配列に付加するか、それら残基で置換することによって行われる（Ｏ連結されたグリコシル化部位の場合）。

本発明において、「虚血性損傷」というのは、心臓、脳、腎臓など血流供給を必要とする臓器において、血液循環が遮断されながら酸素伝達が減少して発生する損傷を意味し、組織の機能損傷及び細胞死をもたらす致命的損傷を含む。虚血性損傷を起こす原因としては、血管疾病、冠状動脈血栓症、脳血管血栓症、動脈瘤破裂、全身出血、圧潰損傷、敗血症、深刻な皮膚火傷、血管閉塞性手術方法（例えば、胸腹動脈瘤手術過程での脊髄虚血）、心肺迂路方法、臓器移植、心肺虚脱（急性心臓死）及び窒息などがあるが、それらに限定されるものではない。

また、本発明による「虚血性損傷」は、一般的に生じうる虚血性損傷以外に、臓器移植などによって生じうる虚血再灌流損傷を含む。前記虚血再灌流損傷には、脳血管虚血再灌流損傷、腎臓虚血再灌流損傷、肝臓虚血再灌流損傷、虚血再灌流心筋病症、皮膚虚血再灌流損傷、腸管虚血再灌流損傷、腸虚血再灌流損傷、胃虚血再灌流損傷、肺虚血再灌流損傷、膵臓虚血再灌流損傷、骨格筋虚血再灌流損傷、腹筋虚血再灌流損傷、四肢虚血再灌流損傷、虚血再灌流結腸炎、腸間膜虚血再灌流損傷及び無症侯性虚血再灌流損傷などがあるが、それらに限定されるものではない。

虚血再灌流損傷は、臓器移植手術過程でしばしば発生し、いわば、腎臓移植を行う場合、移植腎臓の漸進的機能喪失及び機能不全に、虚血再灌流損傷が関連しており、それは、虚血再灌流組織損傷による先天免疫系の活性化が重要な発病メカニズムのうち１つであると知られている。

また、本発明の一側面による配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列の断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、細胞内毒性が低くて生体内安定性が高いという長所を有する。本発明での配列番号１は、テロメラーゼ由来ペプチドであって、下記のように、１６個のアミノ酸からなるペプチドである。

配列番号１に記載されたペプチドは、下記表２の通りである。下記表２の「名称」は、ペプチドを区別するために命名したものである。本発明の一側面において、配列番号１に記載されたペプチドは、ヒトテロメラーゼの全体ペプチドを示す。本発明の他の一側面において、配列番号１の配列を有するペプチド、配列番号１の配列の断片であるペプチド、または前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチドは、テロメラーゼに含まれたペプチドのうち、当該位置のペプチドを選別して合成した「合成ペプチド」を含む。配列番号２は、全体テロメラーゼのアミノ酸配列を示したものである。

本発明の一側面においては、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む虚血性損傷の治療及び予防用の組成物を提供する。

本発明の一側面による虚血性損傷の治療及び予防用の組成物は、一側面においては、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを、０．１μｇ／ｍｇないし１ｍｇ／ｍｇ、具体的には、１μｇ／ｍｇないし０．５ｍｇ／ｍｇ、さらに具体的には、１０μｇ／ｍｇないし０．１ｍｇ／ｍｇの含量で含む。前記範囲で含む場合、本発明が意図した効果を示すのに適切なだけではなく、組成物の安定性及び安全性をいずれも満足することができ、費用対比効果の側面でも、前記範囲で含むことが適切である。

本発明の一側面による組成物は、ヒト、犬、ニワトリ、豚、牛、羊、ギニアピッグまたは猿を含む全ての動物に適用される。

本発明の一側面において組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む虚血再灌流損傷の治療及び予防用の薬学組成物を提供する。

本発明の一側面による薬学組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内または皮下などに投与される。

経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質または硬質のカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤または乳濁剤でもあるが、それらに制限されるものではない。非経口投与のための剤形は、注射剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁液剤、乳剤、坐剤、パッチまたは噴霧剤でもあるが、それらに制限されるものではない。

本発明の一側面による薬学組成物は、必要によっては、希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料または甘味剤などの添加剤も含む。本発明の一側面による薬学組成物は、当業界の一般的な方法によって製造される。

本発明の一側面による薬学組成物の有効成分は、投与される対象の年齢、性別、体重、病理状態及びその深刻度、投与経路または処方者の判断によって異なる。かような因子に基づいた適用量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、０．１μｇ／ｋｇ／日ないし１ｇ／ｋｇ／日、具体的には、１μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には、１０μｇ／ｋｇ／日ないし１ｍｇ／ｋｇ／日、一層具体的には、５０μｇ／ｋｇ／日ないし１００μｇ／ｋｇ／日にもなるが、それらに制限されるものではない。本発明の一側面による薬学組成物は、１日１回ないし３回投与されるが、それらに制限されるものではない。

本発明の一側面において組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを有効成分として含む虚血再灌流損傷の治療及び予防の食品組成物を提供する。

本発明の一側面による食品組成物の剤形は、特別に限定されるものではないが、例えば、錠剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、固形製剤などに剤形化される。各剤形は、有効成分以外に、当該分野で一般的に使用される成分を、剤形目的または使用目的によって、当業者が困難さなしに、適宜選定して配合することができ、他の原料と同時に適用する場合、相乗効果が起こることが可能である。

前記有効成分の投与量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、具体的には、１μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には、１０μｇ／ｋｇ／日ないし１ｍｇ／ｋｇ／日、一層具体的には、５０μｇ／ｋｇ／日ないし１００μｇ／ｋｇ／日にもなるが、それらに制限されるものではなく、投与する対象の年齢、健康状態、合併症など多様な要因によって異なる。

本明細書において使用された用語は、特定具体例について説明するための目的だけに意図されたものであり、本発明を限定する意図ではない。名詞の前に個数が省略された用語は、数量を制限するものではなく、言及された名詞物品が一つ以上存在するということを示すのである。用語「含む」、「有する」及び「含有する」というのは、開かれた用語として解釈される（すなわち、「含むが、それに限定されるものではない」という意味）。

数値範囲の言及は、単にその範囲内に属するそれぞれの別個の数値を個別的に言及することの代わりをする容易な方法であるために、そうではないということが明示されていない限り、各別個の数値は、まさしく個別的に明細書に言及されているように、本明細書に統合される。全範囲の終値は、その範囲内に含まれ、独立して組み合わせ可能である。

本明細書に言及された全ての方法は、取り立てて明示されているか、あるいは文脈によって明白に矛盾しない限り、適切な手順によって遂行される。ある一実施例及び全ての実施例、または例示的言語（例えば、「〜のような」）の使用は、特許請求の範囲に含まれていない限り、単に本発明をさらに良好に記述するためものであり、本発明の範囲を制限するものではない。明細書のいかなる言語も、いかなる非請求構成要素を、本発明の実施に必須なものであると解釈されることがあってはならない。取り立てての定義がない限り、本明細書に使用される技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野で当業者によって、一般的に理解されるような意味を有する。

本発明の望ましい具体例は、本発明を実施するために発明者に知られた最適のモードを含む。望ましい具体例の変動は、先行する記載に触れれば、当業者に明白になるであろう。本発明者らは、当業者がかような変動を適切に利用するということを期待し、本発明者らは、本明細書の記載と異なる方式で本発明が実施されるということを期待する。従って、本発明は、特許法によって許容されているように、特許請求の範囲で言及された発明の要旨の均等物及び全ての変形を含む。さらに、全ての可能な変動内で、前述の構成要素のいかなる組み合わせも、ここで異なって明示されるか、あるいは文脈上明白に矛盾しない限り、本発明に含まれるものである。本発明は、例示的な具体例を参照して具体的に示されて記述されたが、当業者は、特許請求の範囲によって定義される発明の精神及び範囲を外れずとも、形態及びディテールにおいて、多様な変化が行われるということを十分に理解するであろう。

下記の実施例では、腎臓と腹直筋皮膚弁の虚血再灌流損傷において、配列番号１に記載された配列を有するペプチド（ＰＥＰ１）を投与することにより、腎臓損傷抑制及び皮弁生存率の向上効果を確認し、虚血性損傷の予防及び治療の効果を確認するものである。

以下、実施例及び実験例を挙げ、本発明の構成及び効果についてさらに具体的に説明する。しかし、下記の実施例及び実験例は、本発明に係わる理解の一助とするために、例示の目的にのみ提供されたものであり、本発明の範疇及び範囲は、それらによって制限されるものではない。

実施例１：ペプチドの合成
配列番号１のペプチド（以下「ＰＥＰ １」とする）を従来に知られた固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ：ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって製造した。具体的には、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Ｐｅｐｔｒｏｎ、Ｉｎｃ．，大韓民国・大田）を利用して、Ｆｍｏｃ固相合成法を介して、Ｃ末端からアミノ酸一つずつカップリングすることによって合成した。次のように、ペプチドのＣ末端の最初のアミノ酸が樹脂に付着されたものを使用した。例えば、次の通りである：
ＮＨ_２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジン
ＮＨ_２−Ａｌａ−２−クロロ−トリチルレジン
ＮＨ_２−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−２−クロロ−トリチルレジン

ペプチド合成に使用した全てのアミノ酸原料は、Ｎ末端がＦｍｏｃで保護され、残基はいずれも酸で除去される、Ｔｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｕ（ｔ−ブチルエステル）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロ−ベンゾフラン−５−スルホニル）などで保護されたものを使用した。例えば、次の通りである：
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ、Ｔｒｔ−メルカプト酢酸。

カップリング試薬としては、ＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−ベンゾチアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート］／ＨＯＢｔ［Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール］／ＮＭＭ［４−メチルモルホリン］を使用した。Ｆｍｏｃ除去は、２０％のＤＭＦ内で、ピペリジン（ＤＭＦ中）を利用した。合成されたペプチドをレジンから分離し、残基の保護基除去には、切断カクテル［ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）／ＥＤＴ（エタンジチオール）／Ｈ_２Ｏ＝９２．５／２．５／２．５／２．５］を使用した。

アミノ酸保護基が結合された出発アミノ酸が固相支持体に結合されている状態を利用して、ここに当該アミノ酸をそれぞれ反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護する過程を反復することにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを樹脂から切り取った後、ＨＰＬＣで精製し、合成いかんをＭＳで確認して凍結乾燥させた。

本実施例に使用されたペプチドに対して、高性能液体クロマトグラフィ結果、全てのペプチドの純度は、９５％以上であった。

ＰＥＰ１製造に係わる具体的な過程について説明すれば、次の通りである。
１）カップリング
ＮＨ_２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジンで保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解させて添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。
２）Ｆｍｏｃ脱保護
２０％のＤＭＦ中のピペリジン（ＤＭＦ中）を加え、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。
３）１及び２の反応を反復して行い、ペプチド基本骨格ＮＨ_２−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−クロロ−トリチルレジン）を作った。
４）切断：合成が完了したペプチドＲｅｓｉｎに、切断カクテルを加え、ペプチドをＲｅｓｉｎから分離した。
５）得られた混合物に、冷却したジエチルエーテルを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈澱させる。
６）Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認して凍結させ、パウダーに製造した。

実施例２：腎臓虚血再灌流損傷でのＰＥＰ１の腎臓損傷抑制効果の確認
試験例１：虚血再灌流の誘導
腎臓虚血再灌流損傷のあるマウスモデルは、腎臓肉茎に３０分間、両側クランピング（ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｃｌａｍｐｉｎｇ）を行い、３０分後にクランプを除去して血液の流れを復元させる方法で虚血再灌流を誘導して得た。実験群は、投与群（ＰＥＰ１）、対照群（ＰＢＳ：ＰＥＰ１投与せず）、そしてＳｈａｍ（両側クランピングなし）の３グループに分類した。ＰＥＰ１は、１，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ濃度で、虚血再灌流誘導の３０分前及び１２時間後に皮下注射した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、チャールスリバー研究所（ウィルミントン、ＭＡ））を使用し、虚血再灌流腎臓損傷を誘導して実験を進めた。虚血再灌流腎臓損傷モデルは、腎臓の足頚（ｐｅｄｉｃｌｅ）を血管鉗子（ｆｏｒｃｅｐｓ）で取って血流を阻み、２８分間虚血を誘導した後で再灌流した。

ペプチドＰＥＰ１は、１，０００ｎｍｏｌ／ｋｇ濃度にＰＢＳで希釈し、虚血再灌流の３０分前及び１２時間後の２回、腹腔内投与（ｉ．ｐ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を行った。実験群は、それぞれ投与群（ＰＥＰ１）、対照群（ＰＢＳ）、Ｓｈａｍ群（虚血再灌流損傷を起こしていない群であって、腎臓損傷のない群）に分けて実験を進めた。

試験例２：ＰＥＰ１のＩＲＩ−ｉｎｄｕｃｅｄ腎機能損傷の保護効果
虚血再灌流２４時間後に血液を採取し、腎臓毒性指標である血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチンを測定し、腎臓組織は摘出し、パラフィンブロックを製作し、免疫組織化学検査及び組織学的検査を進め、タンパク質を抽出してサイトカインレベルを測定した。クレアチン濃度とＢＵＮは、自動分析機（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ ＲＡ−１０００；Ｂａｙｅｒ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）を利用して測定した。

測定の結果、ＰＥＰ１投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、ＢＵＮ、クレアチンの値が有意的に減少した（図１）。

試験例３：ＰＥＰ１の腎臓組織損傷の保護効果
虚血再灌流２４時間後、腎臓組織をＰＡＳ（過ヨウ素酸−シッフ）染色（製造社：Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ株式会社（ウォリントン、ＰＡ、米国））プロトコルによって、ＰＡＳキットでＰＡＳ染色）を行った。染色を行った後、腎臓組織損傷スコアリングで腎組織損傷を評価した。ＰＥＰ１の投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、腎臓組織の損傷が著しく緩和された様相を示した（図２及び図３）。

試験例４：腎臓細胞死滅（アポトーシス）抑制効果
虚血再灌流２４時間後、腎臓組織に対して、ＴＵＮＥＬ染色で腎臓組織細胞死滅を評価した。ロシュ応用科学（インディアナポリス、ＩＮ、米国）で作ったＴＵＮＥＬ染色キットを介して、パラフィン腎臓セクションにＴＵＮＥＬ染色を行った。

確認の結果、ＰＥＰ１の投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、ＴＵＮＥＬ陽性細胞が著しく減少するので、腎組織細胞死滅を抑制するということを確認することができた（図４及び図５）。

試験例５：腎臓組織での先天免疫細胞浸潤の抑制効果
虚血再灌流２４時間後、腎臓組織に対して、Ｆ４／８０（マクロファージマーカー）、Ｇｒ−１（好中球マーカー）の免疫組織染色で、先天免疫細胞浸潤を評価した。具体的には、大食細胞に特異的な抗体（Ｆ４／８０、ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して、パラフィン含有セクション上の免疫化学的な方法で、大食細胞及び好中球細胞の浸透染色を行った。

ＰＥＰ１投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、腎臓組織において、マクロファージと好中球との腎臓組織への浸透が著しく低減したということを確認することができた（図６及び図７）。

試験例６：炎症性サイトカイン分泌抑制効果
虚血再灌流２４時間後、腎臓組織からタンパク質を抽出し、サイトメトリックビードアレイ方法で、ＩＬ−６，ＭＣＰ−１，ＴＮＦ−αのレベルを測定した。マウスＩＬ６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦａ ＥｌＩＳＡキットは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、製造社のプロトコルによって実験を行った。

測定の結果、ＰＥＰ１投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１レベルを有意的に低下させたが、ＴＮＦ−αでは、有意な変化が観察されなかった（図８ないし図１０）。

以上のように、ＰＥＰ１の虚血再灌流腎臓損傷に対する保護効果は、腎臓機能（ＢＵＮ、クレアチン）、尿細管損傷、腎臓細胞死滅（ｒｅｎａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、腎臓組織炎症細胞浸潤及び腎臓組織サイトカイン分泌抑制で評価した。

虚血再灌流ＰＢＳ対照群では、Ｓｈａｍ群に比べ、血清ＢＵＮとクレアチンとの値が上昇し、腎臓組織損傷も増大した。しかし、ＰＥＰ１投与群では、対照群に比べ、ＢＵＮとクレアチンとの値が有意的に低下し、腎尿細管損傷だけではなく、腎臓細胞死滅も減少した。また、ＰＥＰ１投与群は、ＰＢＳ対照群に比べ、腎臓において、虚血再灌流による炎症細胞（好中球及びマクロファージ）浸潤を抑制し、炎症性サイトカイン（インターロイキン−６、単球走化性タンパク質−１）分泌も有意的に抑制された。

実施例３：腹直筋皮膚弁の虚血再灌流損傷でのＰＥＰ１の皮弁生存率向上効果の確認
試験例１：虚血再灌流の誘導
虚血再灌流損傷のあるラットモデルは、白マウス（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ Ｒａｔ、１８０ｇから２３０ｇ）の腹の皮膚に５ｃｍ×５ｃｍサイズで皮弁を採取した後、ＰＥＰ１または生理食塩水を投与し、クランピングを行い、虚血を起こさせ、７時間後にクランプを除去し、血液の流れを復元させる方法で虚血再灌流損傷を誘導して得た（図１１参照）。

実験群は、投与群（ＰＥＰ１処理群）、対照群（生理食塩水処理群：ＰＥＰ１投与せず）、そしてＳｈａｍ群（虚血再灌流損傷を起こしていない群）の３グループに分類した。ＰＥＰ１は、１０ｍｇ／５００μｌ濃度で、生理食塩水は、５００μｌを、虚血再灌流誘導の３０分前及びそれぞれ１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、７日後に、筋肉内に注射した。

試験例２：ＰＥＰ１の皮弁生存率向上効果の確認
虚血再灌流を誘導した後７日後に、皮弁生存率（ｆｌａｐ ｓｕｒｖｉｖａｂｉｌｉｔｙ）を測定した。皮弁生存率の測定は、ＩｍａｇｅＪプログラムを介したデジタル写真分析を介して行った。

７日後の皮弁生存率の測定結果、生理食塩水処理群の場合、３４．６９％±１６．４４％と評価され、相対的にＰＥＰ１を処理した群の皮弁生存率は、５８．８８％±１１．４４％と、生理食塩水処理群に比べて向上しているということを確認することができた（図１２参照）。各グループ間には、統計的有意性（ｐ＜０．０５）が示された。

Claims (13)

1. 配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチド、前記アミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはその断片であるペプチドを含む虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
2. 前記断片は、３個以上のアミノ酸から構成された断片であることを特徴とする請求項１に記載の虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
3. 前記虚血性損傷は、虚血再灌流損傷、血管疾病、冠状動脈血栓症、脳血管血栓症、動脈瘤破裂、全身出血、圧潰損傷、敗血症、皮膚火傷、血管閉塞性手術法、心肺迂路法、臓器移植、心肺虚脱（急性心臓死）及び窒息からなる群から選択される１以上の原因によることを特徴とする請求項１に記載の虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
4. 前記虚血性損傷は、虚血再灌流損傷によることを特徴とする請求項３に記載の虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
5. 前記虚血再灌流損傷は、脳血管虚血再灌流損傷、腎臓虚血再灌流損傷、肝臓虚血再灌流損傷、虚血再灌流心筋病症、皮膚虚血再灌流損傷、腸管虚血再灌流損傷、腸虚血再灌流損傷、胃虚血再灌流損傷、肺虚血再灌流損傷、膵臓虚血再灌流損傷、骨格筋虚血再灌流損傷、腹筋虚血再灌流損傷、四肢虚血再灌流損傷、虚血再灌流結腸炎、腸間膜虚血再灌流損傷及び無症侯性虚血再灌流損傷からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
6. 前記虚血再灌流損傷は、臓器移植によることを特徴とする請求項４に記載の虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
7. 前記虚血再灌流損傷は、腎臓で起こることを特徴とする請求項４に記載の虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
8. 前記虚血再灌流損傷は、皮弁で起こることを特徴とする請求項４に記載の虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
9. 前記組成物は、皮弁生存率向上のためのものであることを特徴とする請求項８に記載の虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
10. 前記ペプチドは、ヒトテロメラーゼに由来したことを特徴とする請求項１に記載の虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
11. 前記組成物は、薬学組成物であることを特徴とする請求項１に記載の虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
12. 前記組成物は、食品組成物であることを特徴とする請求項１に記載の虚血性損傷の治療及び予防用の組成物。
13. 請求項１ないし１２のうちいずれか１項に記載の組成物を、治療を必要とする対象に投与することを特徴とする虚血性損傷を治療及び予防する方法。