JP2016516426A - 早期乳癌の予後予測診断用遺伝子マーカーおよびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
(a) 試料からmRNAを分離する段階、
(b) TRBC1,BTN3A2およびHLA-DPA1からなる群より選別された一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c) 上記遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階および
(d) 標準化された数値を予め定められた計算式に代入して数値を計算する段階、
(e) 上記数値のレベルにより乳癌予後が良いまたは悪いと算出する段階
早期乳癌組織の発現プロファイルの収集
早期乳癌患者の冷凍癌組織を利用して得た発現プロファイルと臨床情報を公開データベースであるGEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)から収集した。総9個の独立した発現プロファイルセットらは各々100個以上のサンプルで構成された比較的大きいデータセットであり、全て早期乳癌患者の予後と関連した研究を行うために作られた(2,4,9,10,13,25,32,33)。その内8個のデータセットはAffymetrix U133Aマイクロアレイプラットフォームで作られ、残りの一つのみAgilent Hu25Kで製作された。多くの場合、患者の重要臨床情報(年齢、性別、癌の大きさ、転移状態および分化程度)と生存情報が共に収集されている。8個のAffymetrix U133Aで製作されたデータセットの内、6個のデータセットは生存情報が外部組織への転移(distant metastasis free survival)に対するものであり、残りの2個は生存期間(overall survival)である。Agilentデータは外部組織転移に対する生存情報を有している。外部組織の転移が予後決定において最も決定的な事件であること、外部組織転移は癌の固有の特性により決定されること、また収集されたデータに最も多い患者が外部組織転移に対する情報を有していることから、外部組織の転移の可否を基にし生存分析をすることにした。収集された全ての患者の情報を比較して重複した186名の患者の発現プロファイルを取除き、総1,861名のユニークな患者に対し研究を行った。同一のプラットホーム(Affymetrix U133A)で製作された7個のデータセットに対して該当する全ての患者の発現プロファイルの原本フアィル(.CEL)を集め、標準化を行った。標準化方法はrma (background correction: rma, normalization: quantile,summarization: medianpolish)方法で行い、標準化遂行時Manhong Daiらが開発したcostom CDF(http://brainarray.mbni.med.umich.edu/Brainarray/) ENTREZG verion13を利用した(34)。標準化後、各プローブの発現量はディスカバリーデータセット内のプローブ別平均値を差引くことで、1-色(color)発現量を2-色発現量と同じ形態に変換させた。総8個の標準化されたデータセットの内5個のデータセットは一つにまとめてディスカバリーデータセットとして使用し、2個は別にまとめて検証データセット1とし、残りの一つは検証データセット2として使用した。Agilentデータセットも検証データセット3として使用した。
患者の予後と関連した遺伝子を発掘するために、収集された患者を予後が良い集団と予後が悪い集団に分類した。一般的に、臨床では5年生存あるいは転移情報を利用して分類する。つまり、5年内に転移が発生したり死亡する場合、予後が悪いと言い、5年以上転移がなかったり生存した場合、予後が良いという。ディスカバリーデータセットの患者情報を利用して転移が発生した患者らの生存時間の分布を調べた。転移が発生した患者の73%以上が5年以内に転移が発生し、10年以後に転移が観察された場合は7%未満であった。これを基にディスカバリーデータセットの患者の内5年以内に転移が発生した217名の患者を“予後が悪い集団”に、10年以上転移が発生しない281名の患者を“予後が良い集団”に分類した。分類結果、予後が悪い集団の生存時間中央値は2.4年で、予後が良い集団の生存時間中央値は12.9年であった。予後が悪い集団と良い集団を明確に分類することで、不確実な生存情報による誤謬を最小限に減らすことができた。エストロゲン受容体(Estrogen receptor, ER)の発現可否は乳癌患者をサブタイプに分類する際、最も普遍的に使用する基準である。普通、臨床では病理学者によるER IHC(immunohistochemistry)判読結果により、ER+あるいはER-に分ける。収集されたディスカバリーデータセットで約200名の患者がER IHC情報がなく、ディスカバリーデータセットを構成する5個のデータセットが独立的にER IHCの決定がなされたことを考慮し、患者別発現プロファイル内のESR1遺伝子のmRNA発現量を利用してER状態を決定した。ER IHC情報がある患者に対して、ER IHC情報とESR1 mRNA発現量を利用してROC(region of convergence)分析を行った。ER IHC結果とESR1 mRNA発現量を比較して最も正確度(0.88)が高い発現量地点をカットオフし、カットオフ以上の発現量を示す場合はER+、カットオフ以下の発現量を示す場合はER-に分類した。ディスカバリーデータセットで864名をER+に240名をER-に配置した。
ディスカバリーデータセットで予後が良い集団と悪い集団をER+、ER-の場合に分類した。予後が良い患者は総275名、予後が悪い患者は218名であった。SAM(Significant Analysis of Microarray)分析を通して予後集団間の発現量に差が生じる遺伝子を調べた。SAM分析結果のq-値を利用し予後が良い集団で過発現された遺伝子、悪い集団で過発現された遺伝子を選択した。選択された遺伝子を一つにまとめた結果、総302個の重複していない遺伝子セットが作られ、これら遺伝子の発現パターンを調べるための群集分析を主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)方法を利用して行った。二つの主成分を選択して各主成分に対して関連した生物学的機能を調べるため、群集別にGO機能分析を行った。
母数型生存モデルの内、加速化故障時間モデル(accelerated failure time model, AFT)を利用してp-geneとi-geneの発現量を共変数とする回帰分析を行った。4個のp-geneは患者別に平均値を求めてp.meanに変換し、5個のi-geneも患者別に平均値を求めてi.meanに変換し適用した。加速化故障時間モデルは
Ti =T0exp(β1x1+β2x2+・・・+βqxq)εi (1)
であり、ここでTiはi番目個体の生存時間、T0は基底線生存時間、xjは共変数のベクター(j=1.2、・・q)、βは対応する共変数の係数であり、εは誤差である。このモデルでは共変数が基底線生存時間に上昇的影響を及ぼすため、これを頻繁に利用する産業界で加速化故障時間モデルと呼んでいる。生存時間に上昇的に作用する効果Φ=β1x1+β2x2+・・・+βqxqを加速要因と称する。
logTi=logT0+β1x1+β2x2+・・・+βqxq+ε* (2)
になりAFTモデルは一般線型回帰モデルと同一な形態をとる。しかし従属変数logTは正規分布を示さず、また生存分析試料には線型回帰モデルにおいて受入られない中途切断例が存在し易いので式(2)を線型回帰モデルのように処理することができない。式(2)のε*は一般線型回帰モデルから正規分布を仮定するのとは異なり、データセットによって分布が異なり得るので実際的な統計処理が煩わしい。これを克服するために、logT0とε*を変形して下記のように表現する。
選択されたモデルに対する検証は“矯正(calibration)”と“判別(discrimination)”に対して行った。“矯正”とは作られた予後予測モデルを利用し、予測された生存確率と実際観察された生存確率がどれ程一致するかを調べるもので、“判別”は予後予測モデルにより与えられた患者集団を予後集団に分類したときの分離性を調べるものである。ここで述べる実際観察される生存確率はKaplan-Meier法により求められた値を意味する。AFT基盤の予後予測モデルは患者別生存確率を全ての時間帯に対して求めることができる。モデルにより予測された生存確率とKaplan-Meier法による生存確率を比較した。Kaplan-Meier (KM)のように全時間による予測生存確率を得るために、全患者の生存確率曲線は0yr-25yrsまで0.1単位で求め各時間別平均生存確率を計算して求めた。全生存時間に対する生存確率比較と共に、5年生存確率も比較した。与えられたデータセットで患者らの5年生存確率を予後予測モデルを利用して予測した生存確率を、ハザード回帰分析のHareを利用して計算される5年生存確率を予測値にして比較した。
affy: .CELファイルに対してrmaアルゴリズムを利用した前処理(pre-processing)。
samr: 予後集団間発現量に差がある遺伝子発掘。
GOstats: 選択された遺伝子セットと関連した機能の調査
KMsurv: ディスカバリーデータセットの生存試料を利用して生命表を製作
rma: AFTモデルを利用し予後予測モデルの計数を測定・モデルに対する矯正
FFPE(formalin-fixed paraffin embedded)組織、試料から抽出したRNAは組織または試料の処理過程で組織間のcross-linkingを引起こす固定などRNAの安定性を阻害する多くの過程により発現分析に適合したものとは受け入れられなかった。本発明では実際乳癌治療過程に基づいてFFPEサンプルに適合した乳癌予後予測方法を開発するため、上記主成分分析および主成分分析に対する機能分析(GO機能分析またはGO分析)によって得た増殖の発現パターンを代表するp-gene(増殖関連遺伝子セット)、免疫反応の発現パターンを表すi-gene(免疫反応関連遺伝子セット)において、各々最も寄与度の高い遺伝子順にIQR(interquartile range)が高く、さらに平均発現量が高い優先順位を設けて遺伝子セットを選別した。
同じ患者から採取したFFPE試料と凍結試料を27種確保し、各々に対してFFPEまたは凍結試料におけるRNA抽出方法によりRNAを抽出した。抽出されたRNAを鋳型にし、選別された32種の遺伝子に対して発現量を測定した。
予後予測モデルのための予後遺伝子の選択
早期乳癌組織の発現プロファイルからなる5個のデータセットを全てまとめ、1,104個のサンプルのディスカバリーデータセットを構成した。全ての患者らは化学治療を受けず、大半が腋窩リンパ節転移が全くないか(N0 or N-)、乳癌早期(1期または2期)である。その内、外部組織転移に対する生存情報を有する1,072名を対象に統計的分析を行った。予後と関連した遺伝子を探すために予後が良い集団(10年以上転移がない場合)と予後が悪い集団(5年以内に転移がある場合)の発現プロファイルで別けて比較した。予後が良い集団で高い発現量を示した182個の遺伝子と、予後が悪い集団で高い発現量を示した120個の遺伝子を選択した(結果未図示。FDR<0.001)。
エストロゲン受容体の発現有無は乳癌の発生および発達と密接な関連があると知られている。予後と関連して選ばれた遺伝子らが示す二つの機能、つまり増殖と免疫反応は癌のメカニズムにおいて興味深い機能である。選ばれた16個の遺伝子を利用しER-乳癌とER+乳癌を比較した。各機能の強度を示すために、p-genesとi-genesは平均発現量によって3段階(p1,p2,p3またはi1,i2,i3)に層化した。p1はp-geneの発現量が最も低い集団で、増殖が最も遅いものと仮定した。p3はp-genesの発現量が最も高い集団で、増殖が最も活発に起こり得ると仮定した。p2は中間発現量を示し、中間程度の増殖を仮定した。i1はi-genesが最も少なく発現する集団で、弱い免疫反応があると仮定した。i3はi-genesが最も多く発現する集団で、極めて強い免疫反応があると見られた。i2は中間程度の発現量と活動を示すと見做した。
ディスカバリーデータセットの生存情報と選別されたp-geneとi-geneを利用して早期乳癌患者の転移に対するAFT予後予測モデルを製作した。ディスカバリーデータセットの生存情報を利用し1年単位の世代生命表を製作して概略的な危険度を計算した。
ディスカバリーデータセットの1,072名の早期乳癌患者の発現プロファイルを利用して作った予後予測モデルの検証は“矯正”と“判別”について行われた。“矯正”とは、モデルを通して予測された生存確率が実際観察された生存確率とどれほど一致しているかを調べるもので、この際、実際観察された生存確率はKaplan-Meier法を利用して得た生存確率を意味する。“判別”はモデルを利用して患者を予後集団にいかに良く分類するかである。二つの性能についての検証はモデルを開発したディスカバリーデータセットと三つの独立した検証データセットで行った。
1,104個のディスカバリーデータセットの内、予後が良い集団で高い発現量を示した182個の遺伝子と、予後が悪い集団で高い発現量を示した120個の遺伝子に対し、各々最も寄与度が高い遺伝子順にIQR(interquartile range)が高く、また平均発現量が高い遺伝子に優先順位をおいて32種の遺伝子を選別した。
FFPE試料/凍結試料間の関連性を測定するため、患者または癌組織からFFPE試料と凍結試料が全て確保されたサンプルが必要である。このように確保された27対のFFPE試料および凍結試料に対して選別された32種の遺伝子それぞれの発現量およびFFPE試料/凍結試料間の関連性を測定した。その結果の内、関連性値が高くサンプル間遺伝子発現分布が多様な遺伝子をp-geneから12種、i-geneから15種を早期乳癌予後予測に信頼性が高い遺伝子として選別した。
(a) 試料からmRNAを分離する段階、
(b) TRBC1,BTN3A2およびHLA-DPA1からなる群より選別された一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c) 上記遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階および
(d) 標準化された数値を予め定められた計算式に代入して数値を計算する段階、
(e) 上記数値のレベルにより乳癌予後が良いまたは悪いと算出する段階
また、本発明は乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するために、患者の試料から下記段階を含む乳癌予後予測値を算出する方法を提供する。
(a) 試料からmRNAを分離する段階、
(b) TRBC1(T cell receptor beta constant 1)、BTN3A2(butyrophilin、subfamily 3,member A2)およびHLA-DPA1 (major histocompatibility complex,class II, DP alpha 1)からなるi-gene群より選ばれた一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベル及びAURKA (Aurora kinase A)、CCNB2 (Cycln B2)、FOXM1(Forkhead box M1)、MMP11(Matrix metallo peptidase 11)、PTTG1(Pituitary tumor-transforming 1)、RACGAP1(Rac GTPase activating protein 1)、RRM2(Ribonucleotide reductase M2)、TOP2A(Topoisomerase II alpha)および UBE2C(Ubiquitin-conjugating enzyme E2C)からなるp-gene群より選ばれた一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c) 前記選ばれた遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階および
(d) 前記遺伝子の組合わせを通じて乳癌予後予測値を算出する段階
Claims (13)
- 下記段階を含む乳癌予後予測方法:
(a) 試料からmRNAを分離する段階、
(b) TRBC1(T cell receptor beta constant 1), BTN3A2(butyrophlin, subfamily 3, member A2)、およびHLA-DPA1(major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1)からなる群より選別された一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c) 上記遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階および
(d) 上記遺伝子の過剰発現は乳癌予後が良いものと判別する段階。 - 上記発現レベルの測定は対象遺伝子に対するPCR増幅を通して行われることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 上記試料は患者の癌細胞を含む組織のホルマリン固定パラフィン包埋(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)試料であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 上記標準化はCTBP1(C-terminal-binding protein 1)、TBP(TATA-binding protein)、HMBS(hydroxymethylbilane synthase)、CUL1(cullin 1)、およびUBQLN1(Ubiquilin-1)からなる群より選別された一つ以上の標準遺伝子の平均発現量に対する比率を算出することにより行なわれることを特徴とする請求項1記載の方法。
- TRBC1 (T cell receptor beta constant 1), BTN3A2(butyrophlin, subfamily 3, member A2)、およびHLA-DPA1 (major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1)からなる群より選別された一つ以上の遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅により対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対を有効成分として含む乳癌予後予測診断用組成物。
- 請求項5の組成物を含む乳癌予後予測診断キット。
- 乳癌患者の予後予測診断に必要な情報を提供するため、患者の試料から下記段階を含む乳癌予後予測値を算出する方法:
(a) 試料からmRNAを分離する段階、
(b) TRBC1 (T cell receptor beta constant 1), BTN3A2(butyrophlin, subfamily 3, member A2)、およびHLA-DPA1(major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1)からなる群より選別された一つ以上の遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階、
(c) 上記遺伝子のmRNA発現レベルを標準化する段階、
(d) 標準化された数値を予め定められた計算式に代入して数値を計算する段階、
(e) 上記数値によって乳癌予後が良いもの、または乳癌予後が悪いものに算出する段階。 - 上記発現レベルの測定は対象遺伝子に対するPCR増副を通して行なわれることを特徴とする請求項7項記載の方法。
- 上記試料は患者の癌細胞を含む組織のホルマリン固定パラフィン包埋試料であることを特徴とする請求項7記載の方法。
- 上記標準化はCTBP1(C-terminal-binding protein 1)、TBP(TATA-binding protein)、HMBS(hydroxymethylbilane synthase)、CUL1(cullin 1)、およびUBQLN1(Ubiquilin-1)からなる群より選別された一つ以上の標準遺伝子の平均発現量に対する比率を算出することにより行なわれることを特徴とする請求項7記載の方法。
- TRBC1(T cell receptor beta constant 1)、BTN3A2(butyrophlin, subfamily 3, member A2)、およびHLA-DPA1(major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1)からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅によって対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対を利用し乳癌患者の試料から上記選別された遺伝子のmRNA発現レベルを測定する段階を含む乳癌予後予測診断方法。
- TRBC1(T cell receptor beta constant 1)、BTN3A2(butyrophilin, subfamily 3, member A2)、およびHLA-DPA1(major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1)からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅によって対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対。
- TRBC1(T cell receptor beta constant 1)、BTN3A2(butyrophilin, subfamily 3, member A2)、およびHLA-DPA1(major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1)からなる群より選別されたいずれか一つの遺伝子に対するプライマー対であり、上記プライマー対はPCR増幅によって対象遺伝子を増幅することができるものであることを特徴とするプライマー対の乳癌予後予測用製剤の製造のための使用。
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