JP2010516292A - 乳癌の遠隔転移を予測するための分子予後サインおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2007年1月31日に出願された米国仮特許出願第60/898,963号の利益を主張する。米国仮特許出願第60/898,963号の内容は、本願中にその全体が参考として本明細書により援用される。
Mは14であり、Giは14個の遺伝子の各遺伝子(i)の標準化された発現レベルであり、a0は0.022であり、aiは14個の遺伝子サインにおける遺伝子の各々について表2に示されている値に対応する)
によって転移スコア(MS)に計算される。
(式中、
Mは14であり、Giは14個の遺伝子の各遺伝子(i)の標準化された発現レベルであり、a0は0.022であり、bは−0.251であり、aiは14個の遺伝子サインに含まれる遺伝子の各々について表2に示されている値に対応する)
によって転移スコア(MS)に計算される。標準化された発現レベルは、Δ(ΔCt)において測定される発現レベルからトレーニングセットの遺伝子の平均発現を差し引くことによって得られ、次に、その遺伝子の遺伝子発現の標準偏差によって割られる。トレーニングセットの各遺伝子についての遺伝子発現の平均および標準偏差は表4に示される。等式1は、実施例1、2および3において用いられた。
(式中、
Mは14であり、Giは14個の遺伝子の各遺伝子(i)のΔ(ΔCt)において測定される発現レベルであり、a0が0.8657であり、bが−0.04778であり、aiが全ての遺伝子について1である)
を推定することができる。等式2は、実施例4および5において用いられた。
Δ(ΔCt)=(CtGOI−CtEC)testRNA−(CtGOI−CtEC)refRNA 等式4
(式中、
Ctは指数関数的な標的増幅のPCR閾値サイクルであり、GOIは対象とする遺伝子であり、ECは内在性対照であり、testRNAは患者の試料RNAであり、refRNAは参照RNAである)
によって遺伝子発現値Giに計算される。
配列リスト
添付された配列リストは、全体として参照により本明細書中に援用される。配列リストは、表3に示されるオリゴヌクレオチド(配列番号1〜34)を与える。これらのオリゴヌクレオチドは、表3に列挙された遺伝子のRT−PCR増幅における例示的なプライマーである。
腫瘍組織供給源およびRNA抽出
本発明では、標的ポリヌクレオチド分子は、乳癌に苦しんでいる個体から採取された試料から抽出される。試料は、任意の臨床的に許容される方法で回収されてもよいが、遺伝子特異的なポリヌクレオチド(即ち、転写RNA、またはメッセージ)は保存されるように回収されなければならない。次に、このようにして試料から得られたmRNAまたは核酸は、さらに分析されてもよい。例えば、遺伝子(例えば、表2に示されている遺伝子)に特異的なオリゴヌクレオチド対は、試料に含まれる特異的なmRNA(単数または複数)を増幅させるために用いられてもよい。次に、各メッセージの量が測定されるか、またはプロファイルすることができ、疾患予後と関連付けることができる。あるいは、mRNAまたはそれから誘導される核酸(即ち、cDNA、増幅されたDNAまたは濃縮されたRNA)は、標準または対照のポリヌクレオチド分子から区別されるように標識されてもよく、両者は、上述されるマーカーのいくつかもしくは全部、またはマーカーセットもしくはサブセットを含むマイクロアレイに、同時にまたは個別にハイブリダイズされてもよい。あるいは、mRNAまたはそこから誘導される核酸は、標準または対照のポリヌクレオチド分子と同じ標識で標識されてもよく、ここで、特定のプローブで各々のハイブリダイゼーションの強度が比較される。
遺伝子発現を測定するための試薬
本発明は、遺伝子発現プロファイリング、乳癌転移の予後の測定に用いることができる核酸分子を提供する。本明細書に記載されている14個の遺伝子サインの遺伝子発現プロファイリングにおいて、プライマーとして用いることができる例示的な核酸分子は、表3に示されている。
遺伝子BUB1は逆転写され、上流プライマー(5’)としての配列番号1、下流プライマー(3’)としての配列番号2を用いて増幅される。
遺伝子発現キットおよびシステム
当業者は、本明細書に開示されている遺伝子および配列情報に基づいて、発現プロファイリング試薬が、個別にまたは組み合わせて本発明のいずれかの遺伝子を評価するために作製され、用いることができ、このような検出試薬が、当該技術分野において周知である確立したキットまたはシステムの1つに容易に組み込むことができることを認識する。用語「キット」および「システム」は、遺伝子発現プロファイリング試薬との関連において本明細書中で使用するとき、複数の遺伝子発現プロファイリング試薬の組み合わせ、または1以上のタイプのエレメントもしくは成分(例えば、他のタイプの生化学試薬、容器、包装、例えば市販用に意図された包装、遺伝子プロファイリング試薬が結合する基材、電子機器コンポーネントなど)と組み合わせた1以上の遺伝子発現プロファイリング試薬などのようなものを指すことが意図される。したがって、本発明は、さらに、遺伝子発現プロファイリングキットおよびシステムを提供し、限定されないが、パッケージ化されたプローブおよびプライマーセット(例えば、TaqManプローブ/プライマーセット)、核酸分子のアレイ/マイクロアレイ、1以上のプローブ、プライマー、または本発明の1以上の遺伝子をプロファイルするための他の検出試薬が挙げられる。キット/システムは、場合により、種々の電子機器コンポーネントを含むことができる;例えば、種々の製造業者から提供されるアレイ(「DNAチップ」)および微小流体システム(「lab−on−a−chip」システム)は電子機器コンポーネントを含む。他のキット/システム(例えば、プローブ/プライマーセット)は、電子機器コンポーネントを含まなくてもよいが、例えば、1以上の容器に包装された1以上の遺伝子発現プロファイリング試薬(並びに、場合により、他の生化学試薬)から構成されてもよい。
遺伝子発現プロファイリング試薬の使用
本発明の表3に示される核酸分子は、特に、乳癌転移の予後における種々の用途を有する。例えば、核酸分子は、増幅プライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして、例えば、メッセンジャーRNA、転写RNA、cDNA、ゲノムDNA、増幅されたDNAまたは他の核酸分子を用いた発現プロファイリングのために、並びに、表2に開示されている遺伝子およびそれらの相同体をコードする全長cDNAおよびゲノムクローンを単離するために有用である。
転移スコアの作成
表2に開示されている14個の遺伝子の発現レベルは、転移リスクを予測する転移スコア(MS)を誘導するために用いることができる。発現レベルは、Δ(ΔCt)法によって計算されてもよく、ここで、Ctは、標的増幅のための閾値サイクル;即ち、標的の時間の指数関数的な増幅が始まるPCRにおけるサイクル数である。(KJ Livak and TD Schmittgen,2001,Methods 25:402−408)。14個のプロファイルされた遺伝子の各々のmRNAのレベルは、
Δ(ΔCt)=(CtGOI−CtEC)testRNA−(CtGOI−GtEC)refRNA
として定義されてもよく、ここで、GOIは対象とする遺伝子(14個のサイン遺伝子の各々)であり、testRNAは患者試料から得られたRNAであり、refRNAは校正参照RNAであり、ECは内在性対照である。各サイン遺伝子の発現レベルは、初めに、表2(EC)に列挙されている3個の内在性対照遺伝子に標準化されてもよい。3個の内在性対照(CtEC)の増幅から得られた、Ct(複数)の平均のCtを用いて、ただ1つの対照遺伝子が用いられる場合に発生する標準化バイアスのリスクを最小化することができる。(T.Suzuki,PJ Higginsら,2000,Biotechniques 29:332−337)。内在性対照遺伝子を増幅するために選択的に用いられてもよいプライマーを表3に列挙している;しかし、これらの内在性対照を増幅することができるプライマーは、これらの開示されたオリゴヌクレオチドに限定されない。対象とする遺伝子の調整された発現レベルは、校正参照RNAプール、refRNA(ユニバーサルヒト参照RNA、Stratagene,La Jolla,Calif.)にさらに標準化されてもよい。これは、種々の機械から得られた発現結果を標準化するために用いられてもよい。
Δ(ΔCt)値は、14個のサイン遺伝子の各々についての遺伝子発現プロファイリングにおいて得られ、転移スコア(MS)を作成するための下記の式:
に用いられてもよい。Giの値は、上述される発現プロファイリングにおいて得られるΔ(ΔCt)である。各遺伝子iについての定数aiは、表2に与えられている。定数a0は0.022である;これは、MSを中心にし、それにより、その中央値はゼロとなる。Mは、成分リストにおける遺伝子数である;この場合は14である。このようにして、MSは、表2に開示されている14個の遺伝子についての発現レベルの総和の測定であり、各々は、表2にもある特定の定数aiによって乗じられ、最終的には、この総和は、MSを誘導するために中心の定数0.022に加えられる。
に用いられてもよい。Giの値は、上述される発現プロファイリングにおいて得られるΔ(ΔCt)において測定される元々の発現レベルから平均の遺伝子発現を差し引き、次に、トレーニングセットにおける遺伝子発現の標準偏差によって割ることにより得られる。各遺伝子iに対する定数aiは、表2に与えられている。定数bは、−0.251であった。正しいサインおよびスケーリングを得るには、予測材料として主成分を用いて一変量Coxモデルからであった。定数α0は0.022である;これは、MSを中心にし、それにより、その中央値はゼロとなる。Mは、成分リストにある遺伝子数である;この場合は14である。このようにして、MSは、表2に開示されている14個の遺伝子についての発現レベルの総和の測定であり、各々は、表2にも示されている特定の定数aiによって乗じられる。この総和は、定数bによって乗じられ、次に、中心定数0.022は、MSを誘導するために加えられる。
MSからの遠隔転移可能性の作成
いずれかの個体の患者に関する遠隔転移の可能性は、基礎生存関数としてWeibull分布を用いて、変更可能な時間点でMSから計算され得る。
リスク測定におけるMSスコアの臨床応用
転移に関するリスクの測定にMSスコアを用いるという1つの方法は、MS「カットポイント」としても知られている1以上のMS閾値を作成することである。このようなMS閾値は、このような患者が増加したリスクまたは減少したリスクのいずれかを有するかを決定するために、乳癌患者のMSスコアと比較した場合に、基準として用いることができる。MS閾値は、異なる方法によって測定することができ、転移スコアの異なる定義によって異なっている。実施例1、2および3で用いられる等式1において定義されているMSに関して、MS閾値は、高リスク群対低リスク群のハザード率から決定された。遠隔転移なしの生存についてのカプラン−マイヤー(KM)曲線は、MSカットポイントによって特定された高および低リスクの患者群について作成される。カットポイントとしての中央値MSの選択は、MSの10パーセンタイルからMSの90パーセンタイルの異なるカットポイントを用いた、高リスク群対低リスク群のハザード率の計算に基づいている。中央値のカットポイントは、高および低リスク群において等しい数の個体が存在する場合に、カットポイントとして特定することができ、実施例1に記載されるトレーニング試料において最大に近いハザード率を生み出すことが見出される。中央値MSのカットポイントを用いたハザード率(HR)および95%の信頼区間が計算され、報告され得る。ログランク(log rank)試験が行われ、ハザード率は、異なるカットポイントについて計算される。5年での遠隔転移の予測における14個の遺伝子サインの精度および値は、種々の手段によって評価することができる。(XH Zhou,N.Obuchowskiら,編集,2002,Statistical Methods in Diagnostic Medicine,Wiley−Interscience,New York)。実施例4および5で用いられる等式2において定義されているMSに関して、MS閾値は、実施例2に記載されているガイ病院からの試料における5年以内の遠隔転移を予測するためのMSの感受性および特異性から決定される。2つのカットポイントは、5年以内の遠隔転移を予測するためのMSの感受性が、第1のカットポイントが用いられると90%を超えるように選択される。第2のカットポイントは、5年以内の遠隔転移を予測するためのMSの感受性および特異性がともに70%であるように選択される。等式2において定義されているMSに関して、第1のMS閾値は−0.1186であり、第2のMS閾値は0.3019である。2つのMSカットポイントを用いた場合、高、中、および低MS群がある。ガイ病院からの処置された試料、日本の愛知県がんセンターからの試料では、高MS群は、高リスク群として設計され、中および低MS群は低リスク群として設計される。
(実施例1)
14個の遺伝子予後サインのmRNA発現レベルが142人のリンパ節転移陰性のER陽性乳癌患者の遠隔転移に対するリスクを予測する
下記の実施例は、14個の遺伝子予後サインがどのようにして同定され、日常的な臨床検査室試験においてでさえ、乳癌患者の遠隔転移に関する予後の決定にどのように用いることができるかを例証する。臨床医は、生検、FFPE、凍結組織などの多くの手段から得られたRNAを用いて、本明細書に開示されている14個の遺伝子に基づくmRNA発現プロファイリングを行い、次に、予後転移スコアを測定するために本明細書に与えられたアルゴリズムに発現データを挿入することができる。
患者および試料
初期段階の乳癌を有する、合計142人のリンパ節転移陰性のER陽性患者が選択され、全ては、全身性アジュバント療法で処置されていない患者由来であった(表1のトレーニング試料)。この研究を乳癌症例のサブセットに限定することによって、分子サインは、転移とのより説得力のある関連性を伴って同定され、異なる試料セット全体でより堅固であり、日常的な臨床実施への転換を良好に促進するように少量の遺伝子を含んでいる。患者の平均年齢は、約62歳である(31〜89歳の範囲)。
試料加工
各々のパラフィンブロックから4つの10μm切片をRNA抽出のために用いた。腫瘍領域は、ガイドスライドに基づいて取り出し、そこでは、癌の細胞領域は、病理学者によって標識され、Pinpoint Slide RNA Isolation System II(Zymo Research,Orange CA)を用いてRNAを抽出した。
遺伝子発現プロファイリング
既刊文献の調査およびマイクロアレイに基づく遺伝子発現プロファイリング実験の結果に基づいて、最適な予後サインを決定するために、最初に、200個の候補遺伝子が分析用に選択された。このセットは、van’t Veerら(LJ van’t Veer,H.Daiら,2002,Nature 415:530−536)によって記載された70個の遺伝子の予後パネル、Daiら(H.Dai,LJ van’t Veerら,2005,Cancer Res 15:4059−4066)によって分析された104個の遺伝子、Paikら(SP Paik,S.Shakら,2004,N Engl J Med 351:2817−2826)によって報告されたタモキシフェン処置に対する応答のためのサインを含む16個の遺伝子のパネル、Westら(M.West,C.Blanchetteら,2001,Proc Natl Acad Sci USA 98:11462−11467)によって報告された24個のER関連遺伝子由来の遺伝子を含んでいた。
Δ(ΔCt)=(CtGOI−CtEC)testRNA−(CtGOI−CtEC)refRNA
(式中、GOIは対象とする遺伝子であり、testRNAは試料RNAであり、refRNAは校正参照RNAであり、ECは内在性対照である)
のように特定された。対象とする遺伝子ごとの発現レベルは、初めに、3つの内在性対照遺伝子に標準化された。3つの内在性対照(CtEC)の平均を表すCtを用いて、たった1つの対照遺伝子が用いられた場合に生じるであろう標準化バイアスのリスクを最小限にする。(T.Suzuki,PJ Higginsら,2000,Biotechniques 29:332−337)。内在性対照を増幅するために用いられるプライマーは、表3に列挙されている。対象とする遺伝子の調整された発現レベルは、さらに、校正参照RNAプール、refRNA(ユニバーサルヒト参照RNA、Stratagene,La Jolla Calif.)に対して標準化された。これは、種々の機器から得られる発現結果を標準化するために用いられた。200個の遺伝子の発現プロファイリング実験で得られたΔ(ΔCt)値は、後述する統計学的分析に用いられ、本発明の14個の遺伝子予後サインを決定した。
14個の遺伝子サインの決定
元々の200個の遺伝子の発現プロファイリングからのデータ(即ち、上記で得られたΔ(ΔCt)値)を用いて、遠隔転移に対する生存時間を測定するための半教師あり主成分(supervised principal component:SPC)が、予後サインを含む遺伝子のリストを生じさせるために用いられた。(E.Bair and R.Tibshirani,2004,PloS Biology 2:0511−0522)。SPC計算は、R.Tibshirani,TJ Hastieら,2002,PNAS 99:6567−6742の方法に従って、R.Tibshirani at Standford University,Stanford,Calif.の研究室を経由したオンラインで利用可能であるPAMアプリケーションを用いて行われた。
転移スコア
転移スコア(MS)は下記の形式:
MSからの遠隔転移可能性の発生
いずれかの個体の患者に関する遠隔転移の可能性は、可変時間点でのMSから計算することができ、基準生存関数としてWeibull分布を用いる。
事前検証
この研究では、142個の試験患者が、無作為に10のサブセットに分けられた。1つのサブセットが取り除かれ、全SPC手法が残りの9個のサブセットの統合に対して行われた。遺伝子が選択され、9個のサブセットに構築された予後材料が、残りのサブセットに対して、相互検証転移スコアのMS(CV)を得るように適用された。この相互検証手法は、MS(CV)が全ての患者について記入されるまで、10回行われた。このようにしてMS(CV)を構築することによって、各々10分の1の一片は、直接的には、対応する生存する時間を使用せず、即ち、教師なしと考えることができる。
MSの統計学的分析
遠隔転移なしの生存、並びに全生存についてのカプラン−マイヤー(KM)曲線は、カットポイントとしてMS(CV)の中央値(即ち、MS(CV)の50パーセンタイル)を用いて、高リスクおよび低リスク患者群について作成された。カットポイントとしての中央値MSの選択は、MSの10パーセンタイルからMSの90パーセンタイルまでの異なるカットポイントを用いて、高リスク対低リスク群のハザード率の計算に基づいた。高リスクおよび低リスクの個体の平衡数、並びに最大に近いハザード率は、カットポイントとして中央値を選択するための決定因子であった。
多重遺伝子サイン
研究された200個の候補遺伝子のうち、44個は、一変量のCox比例ハザード抑制において、調整されていないP値<0.05であった。僅かな手に予後を有する患者は、37個の遺伝子のアップレギュレーションを示し、7個の遺伝子はダウンレギュレーションを示した。PAMにおける半教師あり主成分手法(SPC)により38個の予後材料が得られた。この遺伝子リストは、さらに、LARSアルゴリズムを介して、Lasso抑制を用いることによって、14(表2)まで減らされた。表2は、各遺伝子の記述を与える。種々のカットポイントでのハザード率(HR)(パーセンタイルMS(CV))を計算した。MS(CV)の中央値は、患者を低リスク群および高リスク群に分類するために選択された。
結果
低リスク群および高リスク群の遠隔転移なしの生存率並びに全生存率
トレーニングセットにおいて、相互検証した転移スコア、MS(CV)の中央値によって定義されるように、71個の低リスクおよび71個の高リスク患者において7および24個の遠隔転移があった。カプラン−マイヤー推定(図1a)は、ログランクのp値が0.00028である2つの群の間の遠隔転移なしの生存(DMFS)における有意差を指示した。低リスク群の5年および10年のDMFS比(標準誤差)は、それぞれ0.96(0.025)および0.90(0.037)であった。高リスク群については、対応する比は、0.74(0.053)および0.62(0.066)であった。全生存(図1b)については、また、2つの群間に有意差があった(ログランクのp値=0.0048)。低リスク群の5年および10年のOS率(標準誤差)は、0.90(0.036)および0.78(0.059)であり、対応する比は、高リスク群においては0.79(0.049)および0.048(0.070)であった(表5)。
一変量および多変量のCox抑制モデルからのハザード率
DMFSを予測するためのMSによる高リスク群対低リスク群の未調整ハザード率は、一変量のCox抑制分析によって指示されるように、4.23(95%CI=1.82〜9.85)であった。比較すると、腫瘍悪性度(中+高悪性度対低悪性度)による高リスク群対低リスク群は、未調整のハザード率が2.18(1.04〜4.59)であった。腫瘍サイズは、DMFSの予測において有意(p=0.05)であり、直径にして1cm増加あたりハザードにして7%の増加であるが、年齢は、この患者セットでは有意な因子ではなかった。多変量のCox抑制分析では、14個の分子サインのリスク群は、ハザード率が3.26(1.26〜8.38)であり、これは、外科的処置での年齢、腫瘍サイズおよび悪性度によって調整された。それは、多変量分析において、唯一の有意なリスク因子(p=0.014)であった。
診断精度および予測値
5年以内の遠隔転移を予測するための14個の有意なリスク群の診断精度および予測値を表9に要約した。感度は、5年内に遠隔転移があった患者に対しては0.86であり、特異性は、そうでない患者に対しては0.57であった。陰性予測値(NPV)は96%であり、ほんの4%の個体が5年以内に遠隔転移であったことを指示し、その場合、その個体が低リスク群にいたことをその遺伝子サインは指示した。それにもかかわらず、陽性適中率(PPV)はほんの26%であり、ほんの26%の個体が遠隔転移を発症したことを指示し、分子サインは、その個体が高リスクにあることを指示した。高NPVおよび低PPVは、部分的には、5年以内の遠隔転移の低い有病率に起因し、それは、現在の患者セットでは0.15であると推定された。
検討
経路分析は、本明細書に開示されている予後サインにおける14個の遺伝子が、多様な生物学的機能に関与していることを表すが、大多数の遺伝子は、細胞増殖と関連している。14個の遺伝子のうち11個は、不良転帰へと導く腫瘍において、協調的に過剰発現されることが見出されたTP53およびTNFシグナル経路と関連している。BUB1、CCNB1、MYBL2、PKMYT1、PRR11およびORC6Lは、細胞周期に関連した遺伝子である。DIAPHは、アクチン細胞骨格および生物発生に関与する遺伝子である。DC13は、シトクロムオキシダーゼの集合と関連することが期待されている。
(実施例2)
14個の遺伝子サインは280個のFFPE試料を用いた未処理のリンパ節転移陰性のER陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
全身処置を受けていない独立した試料セットにおける、リンパ節転移陰性(N−)、エストロゲン受容体陽性(ER+)の乳癌患者の遠隔転移を予測することができる14個の遺伝子発現サインを確認する努力がなされた。14個の遺伝子サインの有効性を評価するために用いられた、実施例1の実験プロトコールおよび統計学的分析について述べる。
患者&方法
ガイ病院の乳房組織およびデータバンクの遡及検索は、初期の乳癌であると診断され、明確な局所療法(乳房温存療法または乳腺切除)を有しているが、追加のアジュバント全身処置を受けていない患者の集団を特定するためになされた。この研究グループは、1975年〜2001年に、臨床的な腫瘍サイズが3cm以下であり、病理学的に腋窩のリンパ節転移陰性のER陽性腫瘍を有し、5年フォローアップよりも長い女性に制限された。総数412人の患者が特定され、それらは、RNA抽出に使用可能である十分にホルマリン固定された、パラフィン包埋(FFPE)組織を有してもいた。本研究のために患者の資料およびデータの使用は、ガイ研究倫理委員会によって承認された。
転移スコア
実施例1のトレーニング試料において誘導された等式1のMSは、ガイ病院からの未処置患者に適用された。実施例1では、RNAは濃縮されたが、ガイ病院からの未処置患者の場合には、RNA試料は濃縮されなかった。
結果
低リスク群および高リスク群の遠隔転移なしの生存率および全生存率
それぞれ、71人の低リスク患者においては4(5.6%)の遠隔転移があり、209人のMSの高リスク患者においては62(29.7%)の遠隔転移があった。カプラン−マイヤー推定(図3a)は、ログランクのp値が6.02e−5である2つの群の間のDMFSにおける有意差を指示した。低リスク群の5年および10年のDMFS比(標準誤差)は、それぞれ0.99(0.014)および0.96(0.025)であった。高リスク群については、対応する生存率は、0.86(0.025)および0.76(0.031)であった(表12)。
一変量および多変量のCox抑制モデルからのハザード率
遠隔転移までの時間を予測するためのMSによる高リスク群対低リスク群の未調整のハザード率は6.12(95%CI=2.23〜16.83)であった(表10)。MSリスク群に対する未調整のハザード率は、アジュバント!、年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度によって特定される群のハザード率よりも高い。アジュバントは、第2の最大のハザード率が2.63であった(95%CI 1.30〜5.32)。組織学的悪性度および腫瘍サイズによるリスク群は、DMFSの予測に有意であり、年齢群では有意でなかった。
異なる臨床下位群における分子サインの性能
表13は、遺伝子サインが若年および老齢の閉経前および閉経後の女性における遠隔転移を予測することを示す。小さいサイズの腫瘍を有する患者では非常に予後的であるが(HR=14.16、p=0.009)、2cmより大きな腫瘍を有する患者では有意でない。低悪性度の下位群におけるハザード率(HR=7.6)は、高悪性度(HR=4.6)よりも高いが、それは、小さな試料サイズ(60試料中、7イベント)のため、低い悪性度の下位群における有意性(p=0.06)の傾向を示すだけである。
診断精度および予測値
10年以内の遠隔転移を予測するためのMAおよびアジュバント!によるリスク群の診断精度および予測値を表4に示した。MSリスク群は、アジュバント!のリスク群の0.90(0.78〜0.96)よりも感度が0.94(0.84〜0.98)と高いが、特異性は類似している(MSについては0.3(0.24〜0.37)対アジュバント!については0.31(0.26〜0.38))。10年以内の遠隔転移の推測された有病率を用いると、MSリスク群に対するPPVおよびNPVは、それぞれ0.23(0.21〜0.25)および0.97(0.88〜0.99)であった。対応する値は、アジュバント!リスク群に対しては0.23(0.20〜0.25)および0.93(0.85〜0.97)であった。したがって、MSは、アジュバント!よりも10年以内に遠隔転移がないものを僅かに良好に予測することができ、10年以内の遠隔転移を有するものに対する予測値は、分子および臨床予後材料に対して同じであった。
遠隔転移の可能性の連続的予測材料としてのMS
図5は、転移スコアMSを用いて個体の患者についての5および10年での遠隔転移の可能性を示す。5年および10年の遠隔転移の可能性は、中央値(最小〜最大)が8.2%(1.4%〜31.2%)および15.2%(2.7%〜50.9%)であった。リスク群を定義するためのカットポイントであるゼロMSでは、5年および10年遠隔転移可能性は、それぞれ5%および10%であった。
検討
初めに、14個の遺伝子の予後サインは、リンパ節転移陰性の初期段階の未処置乳癌トレーニングセットにおいて、遠隔転移のための定量的RT−PCRを用いて、FFPE切片からのmRNA発現に基づいて開発された。得られたサインは、異なる期間で個体に関するリスクを定量する転移スコア(MS)を生じさせるために用いられ、高リスクおよび低リスクに試料セットを二分するために用いられた。最近の「事前検証」の統計学的な技術を用いたトレーニングセットの初期の内部検証後、本発明者らは、類似の独立した検証集団におけるトレーニングセットの正確に二分された切断を用いて、発現サインを検証した。トレーニングセットおよび検証セットにおけるサインの性能特徴は同じであった。一変量および多変量のハザード率は、DMFSを予測するために、それぞれ、検証セットについては6.12および4.81であり、トレーニングセットについては4.23および3.26であった。多変量分析では、転移スコアだけが、他の臨床病理学的因子の腫瘍サイズのみについて有意である傾向を伴って、有意のままであった。また、14個の遺伝子の予後サインは、全生存を予測することができ、検証セットでは一変量ハザード率は2.49であった。5年および10年以内の遠隔転移を予測し、10年以内の死亡を予測するための連続MSのROC曲線は、AUCがそれぞれ0.73、0.70および0.68であった。サインは、腫瘍悪性度が低い場合にはより有力な予後を提供した(ハザード率は低悪性度では7.58であり、高悪性度の腫瘍では4.59であった)。例えば、Daiらは、患者の連続体の反射ではなく、むしろ患者の別個の群における差異性能であるものとして、分類の予後力の変化を解釈した。
(実施例3)
14個の遺伝子サインは、96個のFFPE試料を用いて、処理および未処理のリンパ節転移陰性およびER陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
処置および未処置の患者を有する独立した試料セットにおける、リンパ節転移陰性(N−)、エストロゲン受容体陽性(ER+)の乳癌患者のおける遠隔転移を予測することができる14個の遺伝子発現サインを確認する努力がなされた。14個の遺伝子サインの有効性を分析および評価するために用いられた、実施例1の実験プロトコールおよび統計学的分析について述べる。
患者&方法
平均年齢が56.7歳である96人のN−、ER+乳癌患者の集団は、検証研究のために選択された(表15)。検証研究における患者は、ミュエンスター大学から選択された。それらのうち、15人は未処置であり、54人はタモキシフェン単独で処置され、6人は化学療法だけで処置され、2人はタモキシフェンと化学療法を用いて処置された。19人の患者は、未知の処置状態であった。サインにおける14個の遺伝子は、定量的RT−PCRを用いてFFPE試料においてプロファイルされた。以前に誘導された転移スコア(MS)は、遺伝子発現レベルからの検証セットのために計算された。患者は、ゼロであった所定のMSカットポイントを用いて、2つの群に層をなしていた。
転移スコアの検証
実施例1の試料を用いて誘導された等式1のMSは、ミュエンスター大学からの患者に適用された。この実施例では、また、腫瘍組織由来のRNAは濃縮されたが、実施例1のものよりは程度が小さかった。この試料にMSを適用するために、濃縮された試料と濃縮されていない試料との間の転換因子が、サインにおける14個の遺伝子の各々について、ミュエンスター大学からの93個の試料から得られた。また、濃縮された試料と濃縮されていない試料との間の転換因子は、実施例1のCPMCからの93個のトレーニング試料から得られた。次に、CPMCとミュエンスター大学の遺伝子発現レベルとの間の転換因子は、転換因子のそれらの2つのセットを用いて計算された。
結果
遠隔転移なしの生存率率
カットポイントとしてMSゼロを用いて、患者は、高リスクと低リスクとして分類された。96人全ての患者のうち、48人の患者は、高リスクとして同定され、5年のDMF生存率(標準誤差)は0.61(0.072)であり、48人の低リスク患者は、対応する生存率が0.88(0.052)であった。62人の処置された患者のうち、32人の高リスクおよび30人の低リスク患者では、5年のDMF生存率は、それぞれ0.66(0.084)および0.89(0.060)であった。タモキシフェン処置単独を受けた54人の患者のうち、26人の高リスク患者および28人の低リスク患者は、5年のDMF生存率は、それぞれ0.65(0.094)および0.88(0.065)であった(表16)。
未調整のハザード率
全集団について、MSは、遠隔転移なしの(DMF)生存と相関した。Cox比例ハザード抑制は、MSの単位増加あたりの2.67(1.28〜5.57)倍に増加したハザードを指示した(p=0.0087)。カットポイントとしてゼロを用いると、全集団における高リスクと低リスク患者のハザード率は、2.65(1.16−6.06,p=0.021)であった。61人の処置された患者については、ハザード率は3.08(0.99〜9.56,p=0.052)であった。タモキシフェン単独で処置された54人の患者については、ハザード率は、2.93(0.92〜9.35,p=0.07)。異なる群の患者についての生存率およびハザード率は、それぞれ、表16および図に要約されている。
(実施例4)
14個の遺伝子サインは、205個のFFPE試料を用いた、タモキシフェン処置のリンパ節転移陰性のER陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
患者
ガイ病院で1975年から2001年に外科的処置を受けたN−、ER+の乳癌を有する205人の女性の集団を選択した。フォローアップの中央値は9.3年である。そのうち、17人(8.9%)が遠隔転移であり、44人(21.5%)が死亡し、17人(8.9%)が局所および遠隔再発であった。
エンドポイント
本発明者らは、初期カットポイントとして、外科的処置から、遠隔転移なしの生存(DMFS)とも呼ばれる、遠隔転移までの時間を選択する。イベントは遠隔転移である。反対側の再発および再発なしの死亡が検査イベントであり、局所再発は、考慮されるべきイベントおよび検査イベントではなかった。DMFSカットポイント、そのイベントおよび検査ルールの定義は、予後分子マーカー研究(Paikら 2004)に関する全米外科アジュバント胸部および腸管プロジェクト(NSABP)によって採用された定義を用いて調整された。DMFSカットポイントは、癌に関連した死亡に最も直接的に連結されている。
遺伝子発現サインおよび転移スコア(MS)
14個の遺伝子サインは、従来、実施例1に記載されるカリフォルニア・パシフィック・メディカル・デンター(CPMC)からのFFPE試料を用いて、RT−PCRによるプロファイリング研究を用いて開発された。インジェニュイティプログラムによる経路分析は、そのサインの14個の遺伝子のうち多数が細胞増殖と関連することを示した。14個の遺伝子のうち10個が、乏しい結果の腫瘍において協調的に過剰発現することが見出されたTP53シグナル経路と関連している。
統計学的分析
遠隔転移なしの生存に関するカプラン−マイヤー(KM)曲線は、高、中および低MS群について作成された。3つの群のDMFS比を調べると、中および低MS群は、高MSを有する高リスク群と比較される低リスク群として組み合わせられた。ログランク試験を行った。
結果
MS低リスクおよび高リスク群における遠隔転移なしの生存率
136人の個体の低MS群において8個の遠隔転移、29人の個体の中MS群において2個の遠隔転移、30人の個体の高MS群において7個の遠隔転移があった。10年のDMFS比(SE)は、低、中、およびMS群について、それぞれ0.921(0.028),0.966(0.034)および0.804(0.068)であった。DMFS比において有意差があり、ログランクのp値は0.04であった。DMFS比は、低および中のMS群において同じであったので、それらを組み合わせて、低リスク群を形成した。低リスク群は、10年のDMFS比が0.928(0.025)であり、高リスク群についての0.804(0.068)の対応する比とは有意に異なっていた(表18)。ログランクのp値は0.011であった。3つのMS群および2つのMSリスク群に対する遠隔転移なしの生存のカプラン−マイヤープロットは、それぞれ図8および図9に示された。
一変量および多変量のCox抑制モデルからのハザード率
遠隔転移までの時間を予測するためのMS高リスク対低リスク群の一変量ハザード率は、3.25(95%CI=1.24または8.54、p値=0.017)であった。年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度によって調整された場合、ハザード率は、表19において5.82(1.71−1.75)であった。MSリスク群は、多変量分析において有意である唯一のリスク因子であった。したがって、遺伝子サインは、伝統的な臨床病理学的なリスク因子と比較したDMFSに対する独立した予後値を有し、これらの因子の情報の一部を捕捉する。
MSリスク群と、他の臨床および病理学的特徴との関連性
MSリスク群は、組織学的悪性度との非常に有意な関連を有する(関連についてのchi−sqに関するCrammer’s V=0.65、p<0.0001)。60個の悪性度1の腫瘍について、MS高リスクはなかった(0%)。対照的に、98個の悪性度2の腫瘍については9(9.2%)、47個の悪性度3の腫瘍については31(66%)であった。
異なる臨床サブグループにおける分子サインの性能
MSリスク群のハザード率は、≦2cmの腫瘍で3.7(1.1−12.6)であり、>2cmの腫瘍で3.0(0.6−14.8)であった。55歳よりも若い女性では、HRは、7.4(1.0−54.7)であり、55歳よりも上の女性では2.8(0.88−8.8)であった。組織学的悪性度1および2の腫瘍については、HRは、12.8(3.8−43.1)であり、悪性度3の腫瘍について、HRは1.53(0.16−14.7)であった(表21)。
診断精度および予測値
5年以内の遠隔転移を予測するためのMSリスク群の感受性、特異性、PPVおよびNPVを表22に示した。MSリスク群の感受性は、0.50(0.50−0.76)であり、特異性は、0.82(0.76−0.87)であった。0.05であると推定された5年の遠隔転移比を用いると、PPVおよびNPVは、それぞれ0.13(0.068−0.23)および0.97(0.94−0.98)と推定された(表22)。MSリスク群の高いNPVは、低リスクである患者の化学療法などのより積極的な処置を除外するために用いられることが重要である。
予後サインの時間依存性
MS高および低リスク群についての年換算したハザード率を図11aに示し、2つの群の間のハザード率の時間依存性を図11bに示した。高リスク群については、年のハザード率は外科的処置から約3年で2.5%のピークに達し、その後、次の数年かけて徐々に減少した。しかしながら、低リスク群の年換算のハザード率は、フォローアップした10年間で、僅かであるが着実な増加を示した。その後、MSリスク群のハザード率は、時間依存的であった。2、5、および10年で、それぞれ4.6、3.6および2.1であった。
(実施例5)
14個の遺伝子サインは234個のFFPE試料を用いたアジュバントホルモン的に処置されたリンパ節転移陰性のER陽性乳癌患者における遠隔転移を予測する
患者
愛知県がんセンターにおいて1995年から2003年に外科的処置を受けたN−、ER+乳癌の234人の日本人女性の集団を選択した。フォローアップの中央値は8.7年であった。それらの中には、31人(13%)が遠隔転移であり、19人(8.1%)が死亡し、46人(19.7%)が局所および遠隔再発であった。
遺伝子発現サインおよび転移スコア(MS)
14個の遺伝子発現サインは前述において作製され、FFE試料を用いたRT−PCRにより米国および欧州におけるプロファイリング研究において評価された。プログラムIngenuityによる経路分析は、サインの14個の遺伝子の大多数が、細胞増殖と関連していることを示した。14個の遺伝子のうち10個は、乏しい結果の腫瘍において協調的に過剰発現することが見出されたTP53シグナル経路と関連している。
統計学的分析
遠隔転移なしの全生存に関するカプラン−マイヤー(KM)曲線は、高、中間および低MS群について作製された。3つの群のDMFS比を調べると、中間および低MS群は、高リスク群と比較される低リスク群として、高MSと比較された。ログランク試験を行った。
結果
MS低リスクおよび高リスク群における遠隔転移なしの生存率
77人の個体の低MS群において6個の遠隔転移、66人の個体の中間MS群において4個の遠隔転移、95人の個体の高MS群において21個の遠隔転移があった。10年のDMFS比(SE)は、低、中、および高MS群について、それぞれ、0.89(0.05)、0.91(0.04)および0.75(0.05)であった。DMFS比において有意差があり、ログランクのp値は0.004であった。DMFS比は、低および中MD群において同じであったので、それらを組み合わせて、低リスク群を形成した。低リスク群は、10年のDMFS比が0.895(0.034)であり、高リスク群についての0.75(0.05)の対応する比とは有意に異なっていた(表24)。ログランクのp値は0.00092であった。3つのMS群に対する遠隔転移なしの生存のカプラン−マイヤープロットは図12に示され、2つのリスク群(高MSおよび中と低MSの組み合わせ)についてのカプラン−マイヤープロットは図13に示された。
一変量および多変量のCox抑制モデルからのハザード率
遠隔転移までの時間を予測するためのMS高リスク対低リスク群の一変量ハザード率は、3.32(95%CI=1.56〜7.06、p値=0.0018)であった。年齢、腫瘍サイズおよび組織学的悪性度によって調整された場合、ハザード率は、3.79(1.42−10.1、p=0.0078)であった。MSに加えて、腫瘍サイズは、多変量分析における唯一の他の有意因子であり、HRは1cmあたり1.4増加した(p=0.007)(表25)。別の多変量分析では、MSリスク群は、閉経状態、処置、腫瘍、腫瘍サイズ、組織学的悪性度およびPgR状態によって調整された。MSリスク群のこの調整されたハザード率は、3.44(1.27−9.34)であった(表27)。さらに、腫瘍サイズは、この多変量分析において唯一の他の有意因子であった(HR=1cmあたり1.45の増加、p=0.0049)。したがって、遺伝子サインは、伝統的な臨床病理学的なリスク因子と比較したDMFSに対する独立した予後値を有し、これらの因子の情報の一部を捕捉する。
MSリスク群と、他の臨床および病理学的特徴との関連性
MSリスク群は、組織学的悪性度との非常に有意な関連を有する(関連についてのchi−sqに関するCrammer’s V=0.54、p<0.0001)。74個の悪性度1の腫瘍について、ほんの4個(5.4%)がMS高リスクであった。対照的に、113個の悪性度2の腫瘍については54(47.8%)、47個の悪性度3の腫瘍については37(78.7%)がMS高リスクであった。
異なる臨床サブグループにおける分子サインの性能
MSリスト群は、≦2cm、低悪性度(悪性度1および2)およびPgR+veである腫瘍を有する若年(年齢≦55歳)、閉経前の女性において遠隔転移を予測することができる。MSリスク群のハザード率は、≦2cmの腫瘍では4.5(1.2−17.3)および>2cmの腫瘍では2.3(0.92−5.6)であった。閉経前の女性では、HRは、6.0(1.6−23.3)であり、閉経後の女性では2.1(0.83−5.1)であった。組織学的悪性度1および2の腫瘍を有する女性については、HRは3.6(1.5−8.4)であり、悪性度3の腫瘍では、HRは2.4(0.29−18.8)であった。MSリスク群のHRは、PgR+ve腫瘍では3.5(1.4−9.0)であり、PgR−ve腫瘍では2.1(0.57−7.49)であった(表28)。
診断精度および予測値
5年以内の遠隔転移を予測するためのMSリスク群の感受性、特異性、PPVおよびNPVを表に示した。MSリスク群の感受性は、0.81(0.60−0.92)であり、特異性は、0.65(0.58−0.71)であった。0.0095であると推定された5年の遠隔転移比を用いると、PPVおよびNPVは、それぞれ0.19(0.15−0.24)および0.97(0.93−0.99)と推定された(表29)。MSリスク群の高いNPVは、低リスクである患者の化学療法などのより積極的な処置を除外するために用いられることが重要であった。5年以内の遠隔転移を予測するための連続MSのROC曲線を図14に示し、AUCは0.73(0.63−0.84)であると推定された。
予後サインの時間依存性
MS高および低リスク群についての年換算したハザード率を図15aに示し、2つの群の間のハザード率の時間依存性を図15bに示した。高リスク群については、年のハザード率は外科的処置から約3年で3.5%のピークに達し、その後、次の数年かけて徐々に減少した。しかしながら、低リスク群の年換算のハザード率は、フォローアップした10年間で、僅かであるが着実な増加を示した。その後、MSリスク群のハザード率は、時間依存的であった。2、5、および10年で、それぞれ4.8、3.4および1.8であった。
Claims (29)
- 乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法であって、
(a)前記乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞における遺伝子CENPA、PKMYT1、MELK、MYBL2、BUB1、RACGAP1、TK1、UBE2S、DC13、RFC4、PRR11、DIAPH3、ORC6LおよびCCNB1の発現レベルを測定し、それによって、前記遺伝子の発現レベルに基づく転移スコア(MS)を得て;
(b)前記転移スコアと所定の転移スコアのカットオフ閾値(MS閾値)とを比較することによって、前記乳癌患者の腫瘍転移のリスクを測定する
ことを含む方法。 - 工程(b)において、前記乳癌患者のMSが所定のMS閾値よりも高い場合に、前記乳癌患者は、腫瘍転移のリスクが増加していると決定される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において、そのMSが所定のMS閾値よりも低い場合に、前記乳癌患者は、腫瘍転移のリスクが減少していると決定される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)において、2以上のMS閾値が、前記乳癌患者について腫瘍転移のリスクの決定に用いられる、請求項1に記載の方法。
- 前記乳癌患者が、リンパ節において検出可能な腫瘍細胞を有さない、請求項1に記載の方法。
- 前記乳癌患者が、腫瘍転移を発症するリスクが増加している、請求項1に記載方法。
- 前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、ホルマリン固定されたパラフィン包埋された切片に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、腫瘍生検由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、凍結腫瘍組織由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子のmRNAが、エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞から得られ、cDNAに逆転写され、前記cDNAのポリメラーゼ連鎖反応増幅によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記mRNAが、逆転写およびPCR増幅前に濃縮される、請求項10に記載の方法。
- 前記遺伝子の各々のmRNAが、逆転写され、表3の配列番号1〜30に示される対応する遺伝子と関連した2つのプライマーによって増幅される、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子の発現レベルが、あるハウスキーピング遺伝子または2以上のハウスキーピング遺伝子の平均の発現レベルに対して標準化される、請求項1に記載の方法。
- 前記ハウスキーピング遺伝子が、NUP214、PPIGおよびSLU7で構成される群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記ハウスキーピング遺伝子のmRNAが、逆転写され、表3に列挙される、配列番号29〜34の前記ハウスキーピング遺伝子と関連した2つのプライマーによって増幅される、請求項13に記載の方法。
- 前記発現レベルが、マイクロアレイによって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記各々の遺伝子(i)の発現レベルが、下記:
Δ(ΔCt)=(CtGOI−CtEC)testRNA−(CtGOI−CtEC)refRNA
(式中、
Ctは指数関数的な標的増幅のPCR閾値サイクルであり、GOIは対象とする遺伝子であり、ECは内在性対照であり、testRNAは患者の試料RNAであり、ref RNAは参照RNAである)
によって遺伝子発現値Giに算定される、請求項17に記載の方法。 - a0が0であり、aiが1である、請求項17に記載の方法。
- 前記転移スコア(MS)が、14個の前記遺伝子の各遺伝子の発現レベルを一緒に加えることによって計算される、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子CENPA、PKMYT1、MELK、MYBL2、BUB1、RACGAP1、TK1、UBE2S、DC13、RFC4、PRR11、DIAPH3、ORC6LおよびCCNB1の発現レベルを検出するための試薬(複数)、および酵素;並びにバッファーを含むキット。
- 1以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルを検出するための試薬(複数)またはその組み合せをさらに含む、請求項24に記載のキット。
- 前記ハウスキーピング遺伝子が、NUP214、PPIGおよびSLU7で構成される群から選択される、請求項25に記載のキット。
- 遺伝子CENPA、PKMYT1、MELK、MYBL2、BUB1、RACGAP1、TK1、UBE2S、DC13、RFC4、PRR11、DIAPH3、ORC6LおよびCCNB1にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ。
- ハウスキーピング遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項27に記載のマイクロアレイ。
- 前記ハウスキーピング遺伝子が、NUP214、PPIGおよびSLU7からなる群から選択される、請求項28に記載のマイクロアレイ。
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