JP2016515835A - 移植のための臓器の改良 - Google Patents

Abstract

本発明は、臓器移植の成功を改善する方法および組成物を提供する。本方法および組成物は、移植前、移植中、および／または移植後に所望の臓器を幹細胞に曝露することを対象とする。一実施形態では、幹細胞は、移植のために摘出されることが指定された、または移植のために摘出された臓器に対する虚血の有害な効果を低減する。移植を指定された臓器がｅｘ ｖｉｖｏで灌流される別の実施形態では、本方法は、幹細胞を含有する培地で臓器を灌流することによって虚血性再灌流傷害を低減することを伴う。

Description

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１４年４月８日に作成され、ＡＴＨ−０２２２３４ＵＳＯＲＤ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名されており、サイズが７，５１７バイトである。

本発明の分野は、臓器移植、ならびに臓器移植の成功を改善する方法および組成物を提供することである。本方法および組成物は、所望の臓器を移植の前、または移植中に幹細胞に曝露することを対象とする。一実施形態では、幹細胞は、移植のために摘出するように指定された、または移植のために摘出された臓器に対する虚血という有害な効果を低減する。別の実施形態では、臓器は、肺である。移植のために指定された臓器がｅｘ ｖｉｖｏで灌流されるさらなる実施形態では、本方法は、幹細胞を含有する培地で臓器を灌流することによって虚血性再灌流傷害を低減することを伴う。

臓器移植は、ドナーまたはドナー部位（ドナーとレシピエントが同じである場合）からの臓器の準備および摘出、ならびに供与臓器のレシピエント中への、またはレシピエントによる臓器の着床、維持、および／または使用を表す。主要な健康管理市場（例えば、米国、欧州、および日本）において１年当たり５０，０００超の臓器移植が実施され、臓器移植の順番待ちリストに１７０，０００超の患者がいると推定されている。健康な臓器の需要は、供給を著しく上回る。

臓器移植における主要な課題は、臓器機能における重大な合併症または移植障害に至り得る移植拒絶であった。一般に、これは、高度に同様の血清型を有するドナーとレシピエントの整合によって、かつ移植拒絶に内在する免疫応答を管理するための免疫抑制薬の使用によって対処されていた。

別の主要な課題は、着床手順の前および着床手順中の臓器生存能の保存である。臓器の取り出し、貯蔵、および移植は、臓器の内部構造および機能に大いに影響を及ぼす場合があり、移植が完了した後の正常な臓器機能の復帰が遅延され、または妨げられる程度を著しく左右し得る。このような臓器傷害は、虚血および低体温の結果として主に起こるが、ｅｘ ｖｉｖｏでの、または着床中の臓器の再灌流にも関連し得る。ｅｘ ｖｉｖｏ灌流を含めた臓器保存の技法は、この損傷を最小限にする機能を果たして、最適な移植片生着および機能を促進する。しかし、これらの技法を用いても、臓器の健康は、多くの場合で低下し、移植の転帰に影響を及ぼし、一部の場合では、低下が非常に重大で、供与臓器が実行可能でないとして移植の前に不合格にされる。

臓器移植におけるこれらの重要な課題に対処する技術は、患者の生活の質および生存に対して、かつ移植に付随した合併症の処置に対して相当なインパクトを有するはずである。

本発明は、移植前、移植中、および／または移植後に外来性幹細胞に曝露された臓器を移植するステップを含む方法を提供する。幹細胞への曝露は、順調な臓器移植の確率を改善し得る。したがって、本発明は、以下の実施形態を対象とする。

一実施形態では、本方法は、移植前、移植中、および／または移植後に臓器を外来性幹細胞に接触させることによって臓器を寛容化することを伴うことができる。臓器を寛容化することによって、その臓器は、著しい免疫学的干渉を伴うことなくレシピエントによって受け入れられるようにより良好に準備される。寛容化は、例えば、臓器内のＴ制御性細胞の誘導によって実現され得る（例えば、Eggenhoferら、Stem Cells Translation Medicine、２０１３年；２巻：０００〜０００頁を参照）。

一実施形態では、本発明は、移植前、移植中、および／または移植後に臓器を外来性幹細胞を含有する培地と接触させることによって、ｅｘ ｖｉｖｏで臓器の傷害を低減する方法を対象とする。

一実施形態では、傷害は、虚血性再灌流傷害の結果として起こる。

一実施形態では、本方法は、移植される臓器の一般的な組織または細胞の劣化を低減することを対象とする。これは、それだけに限らないが、虚血、低体温、および再灌流を含めた要因から生じ得る。したがって、一実施形態では、本発明は、これらのイベントの１つまたは複数の結果としての傷害を低減することを対象とする。このようなイベントは、以下のうちの１つまたは組合せによって少なくとも部分的に引き起こされ得る：（１）ＴＨ２ Ｔ細胞に対するＴＨ１ Ｔ細胞の免疫調節；（２）Ｍ２マクロファージに対するＭ１マクロファージの免疫調節（例えば、炎症促進性応答から抗炎症応答へのシフトを引き起こす）；（３）好中球の浸潤の阻害（例えば、細胞表面受容体を低減することによる）；（４）炎症促進性から抗炎症性への好中球のシフト；および（５）外来性幹細胞によって生じる細胞保護作用または抗アポトーシス効果。

本明細書に記載のイベントは、炎症、他の免疫応答、サイトカイン産生、細胞アポトーシス、ならびに臓器の生存能および移植の適性に影響を及ぼす他のイベントをもたらし得る。したがって、一実施形態では、本発明は、これらのイベントを受けやすい、またはこれらのイベントが既に起こっている臓器に外来性幹細胞を投与することによって、これらのイベントの有害な効果を低減することを対象とする。

炎症、他の免疫応答、サイトカイン産生、細胞アポトーシス、ならびに臓器の生存能および移植の適性に影響を及ぼす他のイベントをもたらし得るイベントの例として、それだけに限らないが、内皮応答、活性酸素種、相補体、および白血球に関連したものを挙げることができる。内皮応答と関連したイベントとして、それだけに限らないが、ある特定の炎症促進性遺伝子産物（例えば、白血球接着分子、サイトカイン）および／もしくは生物活性剤（例えば、エンドセリン、トロンボキサンＡ_２）の発現、ならびに／または他の「保護的な」遺伝子産物（例えば、構成一酸化窒素合成酵素、トロンボモジュリン）および／もしくは生物活性剤（例えば、プロスタサイクリン、一酸化窒素）の抑制を挙げることができる。活性酸素種（例えば、（Ｏ_２−）、（ＯＨ−）、（ＨＯＣｌ）、（Ｈ_２Ｏ_２）、および一酸化窒素由来ペルオキシナイトライト）と関連したイベントとして、それだけに限らないが、脂質過酸化による細胞膜の直接損傷、形質膜ホスホリパーゼＡ２を活性化してアラキドン酸（トロンボキサンＡ２およびロイコトリエンＢ４）を形成することによる白血球活性化および走化性の刺激、ならびに／または虚血性再灌流後の白血球活性化、走化性、および白血球−内皮接着の増大を挙げることができる。補体活性化、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ５ｂ９（Ｃ５ａが最も強力である）などと関連したイベントとして、それだけに限らないが、例えば、血管の恒常性を変更し、白血球−内皮接着を増大させることにより虚血性臓器への血流を損なうことによって血管の恒常性を変更するいくつかの炎症促進性メディエーターの形成を挙げることができる。白血球と関連したイベントとして、それだけに限らないが、白血球活性化、走化性、白血球−内皮細胞接着および遊出を挙げることができ、これらは、白血球が有毒なＲＯＳ、プロテアーゼ、およびエラスターゼを放出するので機械的閉塞にさらに至り、微小血管透過性の増大、浮腫、血栓症、および実質細胞死をもたらし得る。

一実施形態では、臓器は、それだけに限らないが、肺、腎臓、心臓、肝臓、膵臓、胸腺、胃腸管、および複合同種移植片、例えば、肢、顔など、ならびにそれだけに限らないが、角膜、皮膚、静脈、動脈、骨、腱、および心臓弁などの弁を含めた組織を含む群から選択される。

一実施形態では、幹細胞は、臓器内の炎症を低減する。例えば、臓器は、臓器内の炎症を低減するのに十分な時間および用量で幹細胞に曝露され得る。

一実施形態では、幹細胞は、臓器内の炎症細胞の出現を低減する。例えば、臓器は、臓器内の炎症細胞の出現を低減するのに十分な時間にわたって、および用量で幹細胞に曝露され得る。

一実施形態では、幹細胞は、臓器内の炎症性サイトカインを低減する。例えば、臓器は、臓器内の炎症性サイトカインを低減するのに十分な時間にわたって、および用量で幹細胞に曝露され得る。

一実施形態では、幹細胞は、肺水腫の出現を低減する。例えば、臓器は、肺水腫の出現を低減するのに十分な時間にわたって、および用量で幹細胞に曝露され得る。

一実施形態では、幹細胞は、肺組織内のＩＬ−１０発現（タンパク質および／またはｍＲＮＡ）の出現を増大させる。例えば、臓器は、肺組織内のＩＬ−１０発現の出現を増大させるのに十分な時間にわたって、および用量で幹細胞に曝露され得る。

一実施形態では、傷害は、臓器内の低酸素から生じる。

一実施形態では、幹細胞は、臓器内の低酸素の効果を低減する。

一実施形態では、幹細胞は、ドナーからの臓器の取り出しとレシピエントへの移植との間の任意の時間に投与される。

一実施形態では、幹細胞は、移植手順中に臓器に曝露される。

一実施形態では、臓器は、臓器がドナー内で依然としてインタクトであるが、ドナーから臓器を取り出す前に幹細胞に曝露される。

一実施形態では、臓器は、ある時間にわたって幹細胞に曝露され得る。時間は、特定の臓器に依存し得る。例えば、時間は、約１〜２時間、約２〜３時間、約３〜４時間、約４〜５時間、約５〜６時間、約７〜８時間、約８〜９時間、約９〜１０時間、もしくは約１０時間、またはそれ超であり得る。適当な時間の一例は、静脈内ｅｘ ｖｉｖｏ細胞プロセスのための適当な時間を含む、ｅｘ ｖｉｖｏ手順の教示について本明細書に参照により組み込まれている、Zhaoら、BMC Medicine、２０１２年、１０巻：３頁に記載されている。

一実施形態では、臓器に曝露される幹細胞の濃度は、特定の臓器に依存し得る。例えば、臓器に曝露される細胞の濃度は、約０．０１〜約５×１０^７細胞／ｍｌ、約１×１０^５細胞／ｍｌ〜約５×１０^７細胞／ｍｌ、または約１０×１０^６細胞／ｍｌであり得る。

別の実施形態では、臓器に曝露される幹細胞の濃度は、約１×１０^５細胞／臓器１ｋｇ〜約５×１０^５細胞／臓器１ｋｇ、約５×１０^５細胞／臓器１ｋｇ〜１×１０^６細胞／臓器１ｋｇ〜５×１０^６細胞／臓器１ｋｇ、約５×１０^６細胞／臓器１ｋｇ〜１×１０^７細胞／臓器１ｋｇ、約１×１０^７細胞／臓器１ｋｇ〜１．５×１０^７細胞／臓器１ｋｇ、または約１×１０^７細胞／臓器１ｋｇ〜２×１０^８細胞／臓器１ｋｇであり得る。

他の実施形態では、幹細胞は、臓器内への灌流用流体中、または臓器内（気管支内など）投与のための担体中に含有される。

別の実施形態では、幹細胞は、臓器が移植の前に接触させられる培地、例えば、臓器が灌流されるのではなく浸される培地中に含有される。

本発明者らは、本発明の方法における任意の所望の幹細胞を使用することを企図する。これらとしては、それだけに限らないが、胚性幹細胞、非胚性多分化能幹細胞、間葉幹細胞、神経幹細胞、人工多能性幹細胞などがある。一実施形態では、幹細胞は、非ＨＬＡマッチ同種異系細胞であり得る。

細胞としては、それだけに限らないが、胚性幹細胞のいくつかの特性を有するが、非胚組織に由来し、本願に記載の効果をもたらす、胚性幹細胞でなく、生殖細胞でない細胞がある。細胞は、これらの効果を天然に実現し得る（すなわち、遺伝的または薬学的に改変されていない）。しかし、天然の発現体は、効力を増大させるために遺伝的または薬学的に改変され得る。

細胞は、ｏｃｔ４などの多能性マーカーを発現し得る。これらは、テロメラーゼなどの拡張された複製能と関連したマーカーも発現し得る。多能性の他の特性として、１種を超える胚葉、例えば、外胚葉性胚葉、内胚葉性胚葉、および中胚葉性胚葉のうちの２種または３種などの細胞型に分化する能力を挙げることができる。このような細胞は、培養液中で不死化または形質転換されていても、されていなくてもよい。細胞は、形質転換されることなく高度に展開され得、また正常核型を維持することもできる。一実施形態では、非胚性幹非生殖細胞は、培養液中で所望の回数の細胞倍加を起こしている場合がある。例えば、非胚性幹非生殖細胞は、３０〜３５回の細胞倍加など、培養液中で少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を起こしている場合があり、ここで細胞は、形質転換されておらず、正常核型を有する。細胞は、内胚葉、外胚葉、および中胚葉胚系列（embryonic lineage）のうちの２種のそれぞれの少なくとも１つの細胞型に分化することができ、３種すべてへの分化を含み得る。さらに、細胞は、奇形腫を生成しないなど、腫瘍形成性でない場合がある。細胞が形質転換されており、または腫瘍形成性であり、注入のためにこれらを使用することが望ましい場合、このような細胞は、腫瘍への細胞増殖を防止する処置などによって、これらがｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍を形成することができないように無能にされ得る。このような処置は、当技術分野で周知である。

細胞としては、それだけに限らないが、以下の番号が付いた実施形態がある。

１．単離された展開された非胚性幹非生殖細胞であって、培養液中で少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を起こしており、ｏｃｔ４を発現し、形質転換されておらず、正常核型を有する、非胚性幹非生殖細胞。

２．テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種または複数をさらに発現する、上記１に記載の非胚性幹非生殖細胞。

３．内胚葉、外胚葉、および中胚葉胚系列のうちの少なくとも２種の少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記１に記載の非胚性幹非生殖細胞。

４．テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種または複数をさらに発現する、上記３に記載の非胚性幹非生殖細胞。

５．内胚葉、外胚葉、および中胚葉胚系列のそれぞれの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記３に記載の非胚性幹非生殖細胞。

６．テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種または複数をさらに発現する、上記５に記載の非胚性幹非生殖細胞。

７．非胚性非生殖組織の培養によって得られる単離された、展開された非胚性幹非生殖細胞であって、培養液中で少なくとも４０回の細胞倍加を起こしており、形質転換されておらず、正常核型を有する、非胚性幹非生殖細胞。

８．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種または複数を発現する、上記７に記載の非胚性幹非生殖細胞。

９．内胚葉、外胚葉、および中胚葉胚系列のうちの少なくとも２種の少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記７に記載の非胚性幹非生殖細胞。

１０．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種または複数を発現する、上記９に記載の非胚性幹非生殖細胞。

１１．内胚葉、外胚葉、および中胚葉胚系列のそれぞれの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記９に記載の非胚性幹非生殖細胞。

１２．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種または複数を発現する、上記１１に記載の非胚性幹非生殖細胞。

１３．単離された、展開された非胚性幹非生殖細胞であって、培養液中で少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を起こしており、テロメラーゼを発現し、形質転換されておらず、正常核型を有する、非胚性幹非生殖細胞。

１４．ｏｃｔ４、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種または複数をさらに発現する、上記１３に記載の非胚性幹非生殖細胞。

１５．内胚葉、外胚葉、および中胚葉胚系列のうちの少なくとも２種の少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記１３に記載の非胚性幹非生殖細胞。

１６．ｏｃｔ４、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種または複数をさらに発現する、上記１５に記載の非胚性幹非生殖細胞。

１７．内胚葉、外胚葉、および中胚葉胚系列のそれぞれの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記１５に記載の非胚性幹非生殖細胞。

１８．ｏｃｔ４、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種または複数をさらに発現する、上記１７に記載の非胚性幹非生殖細胞。

１９．内胚葉、外胚葉、および中胚葉胚系列のうちの少なくとも２種の少なくとも１つの細胞型に分化し得る単離された、展開された非胚性幹非生殖細胞であって、培養液中で少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を起こしている、非胚性幹非生殖細胞。

２０．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種または複数を発現する、上記１９に記載の非胚性幹非生殖細胞。

２１．内胚葉、外胚葉、および中胚葉胚系列のそれぞれの少なくとも１つの細胞型に分化し得る、上記１９に記載の非胚性幹非生殖細胞。

２２．ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、またはｓｏｘ−２のうちの１種または複数を発現する、上記２１に記載の非胚性幹非生殖細胞。

一実施形態では、馴化培地が幹細胞の代わりに使用される。

一実施形態では、臓器は、ヒトに由来する。

所望の効果を実現する細胞の性質を考慮して、その効果を実現する所望の効力（能力のレベル）を有することについて選択された細胞を含有する細胞バンクを確立することができる。したがって、本発明は、能力について細胞をアッセイすることを包含する。バンクは、臓器に投与するための医薬組成物を作製するための源を提供することができる。細胞は、バンクから直接使用し、または使用する前に展開することができる。特に、細胞がさらなる展開に付される場合では、展開後に、細胞が所望の効力を依然として有することをバリデートすることが望ましい。バンクは、臓器ドナーおよびレシピエントにとって同種間である細胞の「在庫」使用を可能にする。

したがって、本発明は、臓器に幹細胞を曝露する前に行われる診断手順も対象とする。この手順は、本願に記載の効果を実現する細胞の効力を評価することを含む。細胞は、細胞バンクから採用され、直接使用され、または投与の前に展開され得る。いずれの場合でも、細胞は、所望の効力について評価することができる。特に、細胞がさらなる展開に付される場合では、展開後に、細胞が所望の効力を依然として有することをバリデートすることが望ましい。

効果について選択される細胞は、選択手順中に必ずアッセイされるが、処置のために対象に投与する前に細胞を再びアッセイして、細胞が所望のレベルで効果を依然として実現することを確認することが好ましく、賢明である場合がある。これは、細胞が、細胞バンク内などで任意の長さの時間にわたって貯蔵されている場合、特に好ましく、細胞バンクでは、細胞は、貯蔵中凍結されている可能性が最も高い。

細胞の最初の単離と臓器への投与との間に、効果についての複数の（すなわち、逐次の）アッセイが存在し得る。これは、細胞が、この時間枠内で行われる操作後に、所望のレベルで効果を依然として実現し得ることを確認するためである。例えば、アッセイは、細胞の各展開後に実施され得る。細胞が細胞バンク内で貯蔵される場合、これらは、貯蔵から解放された後にアッセイされ得る。これらが凍結されている場合、これらは、解凍後にアッセイされ得る。細胞バンクからの細胞が展開される場合、これらは、展開後にアッセイされ得る。好ましくは、最終的な細胞産物（臓器に物理的に投与される）の一部がアッセイされ得る。

幹細胞は、分泌分子によって本明細書に記載の効果をもたらし得るので、幹細胞を投与するための本明細書に記載の様々な実施形態は、馴化培地中に存在し得るものなどの分泌分子の１種または複数の投与によって行われ得る。

本発明は、所望の効果を実現する所望の効力を有する細胞の集団を含む組成物も対象とする。このような集団は、臓器への投与に適した医薬組成物として、かつ／または細胞を投与のために直接使用し、または投与の前に展開することができる細胞バンク内で見つけることができる。一実施形態では、細胞は、先の（親）細胞集団と比較して増強された（増大した）効力を有する。親細胞は、本明細書に定義した通りである。増強は、天然発現体の選択によるもの、または細胞に作用する外部要因によるものであり得る。

細胞は、本明細書に記載の単離および培養条件によって調製され得る。具体的な実施形態では、これらは、「ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）」と命名された細胞を調製するのに使用されるものなどの、より高い血清と組み合わせたより低い酸素濃度を伴う本明細書に記載されている培養条件によって調製される。

図１は、試験設計の概略図である。

図２は、再灌流後の肺２の右下肺葉（ＲＬＬ）および左下肺葉（ＬＬＬ）の代表的な肉眼像である。ＭＳＣ処置ＬＬＬは、正常に見える一方、ビヒクル処置ＲＬＬは、浮腫状および炎症性に見える。

図３は、半定量的なスコアリングが、５つの肺のうち４つで、かつ全体でビヒクル処置ＲＬＬと比較してＭＳＣ処置ＬＬＬで全体的な炎症の有意な減少を実証する図である。３人の盲検化された観察者からのプールされた観察結果の平均±標準偏差が表されている。

図４Ａ〜Ｂは、肺１からの代表的な顕微鏡写真が、肺胞中隔の肥厚、浮腫、ならびに血管周囲（図４Ａ）および気管支周囲炎症細胞浸潤（図４Ｂ）に対するＭＳＣ処置ＬＬＬにおける最小限の炎症〜著しい炎症無しを実証することを示す図である。最初の拡大率２００×。

図５Ａ〜Ｃは、肺３〜５におけるＭＳＣ処置ＬＬＬ内の合計ＢＡＬ液細胞数の減少を示す図である（図５Ａ）。合計細胞数は、肺１または２において評価しなかった。ＭＳＣ滴注も、５つすべての肺におけるＢＡＬ液合計好中球および好酸球の数の上昇の有意な減少をもたらした（図５Ｂ〜Ｃ）。データは、３人の盲検化された観察者からのプールされた観察結果の平均±標準誤差を表す。 図５Ａ〜Ｃは、肺３〜５におけるＭＳＣ処置ＬＬＬ内の合計ＢＡＬ液細胞数の減少を示す図である（図５Ａ）。合計細胞数は、肺１または２において評価しなかった。ＭＳＣ滴注も、５つすべての肺におけるＢＡＬ液合計好中球および好酸球の数の上昇の有意な減少をもたらした（図５Ｂ〜Ｃ）。データは、３人の盲検化された観察者からのプールされた観察結果の平均±標準誤差を表す。 図５Ａ〜Ｃは、肺３〜５におけるＭＳＣ処置ＬＬＬ内の合計ＢＡＬ液細胞数の減少を示す図である（図５Ａ）。合計細胞数は、肺１または２において評価しなかった。ＭＳＣ滴注も、５つすべての肺におけるＢＡＬ液合計好中球および好酸球の数の上昇の有意な減少をもたらした（図５Ｂ〜Ｃ）。データは、３人の盲検化された観察者からのプールされた観察結果の平均±標準誤差を表す。

図６は、肺４からの代表的なＢＡＬ液サイトカイン分析が、ＭＳＣ処置ＬＬＬ内でＩＬ−１０の有意な増加を実証するが、ｉＮＯＳ、ＳＴＣ−１、またはＴＳＧ−６の有意な変化を実証しないことを示す図である。データは、各ＬＬＬまたはＲＬＬ試料の三つ組判定からの平均＋標準偏差を表す。

図７は、肺組織のサイトカイン分析を示す図である。ｔ＝０、２、および／または４時間で肺２〜５のＬＬＬおよびＲＬＬから収集した肺組織試料に対してｑＰＣＲ分析を実施した。倍表記は、ｔ＝０の値と比較した標的遺伝子のレベルを表す。すべてのデータをハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。データは、肺２〜５に由来するＬＬＬおよびＲＬＬ試料からの平均＋標準偏差を表す。

本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬などに限定されず、したがって、様々となり得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、特許請求の範囲によってもっぱら定義される、開示される本発明の射程を限定するように意図されていない。

セクションの表題は、編成の目的のためだけに本明細書で使用され、記載される主題を限定すると決して解釈されるべきでない。

本願の方法および技法は一般に、当技術分野で周知であり、別段の指定のない限り本明細書全体にわたって引用され、論じられている様々な一般的なおよびより具体的な参考文献に記載されている従来法によって実施される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（２００１年）、ならびにAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates（１９９２年）、ならびにHarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（１９９０年）を参照。

定義
「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは１つを超える；少なくとも１つを本明細書で意味する。複数形が本明細書で使用される場合、これは一般に、単数形を含む。

「細胞バンク」は、将来の使用のために成長および貯蔵された細胞についての業界の命名法である。細胞は、アリコートで貯蔵され得る。これらは、貯蔵から直接使用することができ、または貯蔵後に展開されてもよい。これは、投与のために入手可能な「在庫のある」細胞が存在するように好都合である。細胞は、これらが直接投与され得るように薬学的に許容される賦形剤中で既に貯蔵されている場合があり、またはこれらは、これらが貯蔵から解放されるとき適切な賦形剤と混合されてもよい。細胞は、凍結され、または生存能を保存する形態で別段に貯蔵され得る。本発明の一実施形態では、本願に記載の効果を実現する効力の増強のために細胞が選択された細胞バンクが作られる。貯蔵から解放された後、かつ投与の前に、効力について細胞を再びアッセイすることが好ましい場合がある。これは、本願に記載の、またはさもなければ当技術分野で公知の直接または間接のアッセイのいずれかを使用して行うことができる。次いで、所望の効力を有する細胞を投与することができる。バンクは、自己細胞（臓器のドナーまたはレシピエントに由来する）を使用して作製され得る。またはバンクは、同種間の使用のための細胞を含有し得る。

「同時投与する」は、２種またはそれ超の作用物質の同時または逐次投与を含めて、互いに併せて、一緒に、協調的に投与することを意味する。

「含む（comprising）」は、他の限定を伴うことなく、他に含まれ得るものに対するいずれの資格付与または除外を伴わずに、必然的に指示対象を含むことを意味する。例えば、「ｘおよびｙを含む組成物」は、たとえ他のコンポーネントが組成物中に存在する場合があっても、ｘおよびｙを含有する任意の組成物を包含する。同様に、「ｘのステップを含む方法」は、ｘがその方法の唯一のステップであるか、またはこれが、どんなに多くの他のステップが存在する場合があっても、かつｘがこれらと比較してどんなに単純もしくは複雑であっても、ステップの１つであるだけであるかにかかわらず、ｘが実施される任意の方法を包含する。語源「含む（comprise）」の単語を使用する「から構成される（comprised of）」および同様の語句は、「含む（comprising）」の同義語として本明細書で使用され、同じ意味を有する。

「から構成される」は、「含む」の同義語である（上記を参照）。

用語「接触する」は、幹細胞および移植される臓器に関して使用される場合、臓器に曝露されると、幹細胞が臓器に物理的に触れることを意味し得る。このような事例では、幹細胞は、臓器と直接接触している。他の場合では、１種または複数の構造体（例えば、別の細胞）および／または流体（例えば、血液）が幹細胞と臓器との間に物理的に介在する場合、幹細胞は、臓器と間接的に接触し得る。

「ＥＣ細胞」は、奇形癌と呼ばれるがんのタイプの分析から発見された。１９６４年に、研究者らは、奇形癌中の単細胞が単離され得、培養液中で未分化なままであり得ることに気付いた。このタイプの幹細胞は、胚性癌腫細胞（ＥＣ細胞）として公知になった。

「有効量」は一般に、例えば、本願に記載の具体的な所望の効果を実現すること含めて、炎症の望ましくない効果を寛解させるのに有効な所望の局所的または全身的効果をもたらす量を意味する。例えば、有効量は、有益な、または所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、単一の投与ですべて一度に、またはいくつかの投与で有効量をもたらす分画量で提供され得る。何が有効量と見なされるかの正確な判定は、臓器のタイプを含めた各臓器に独自の要因、処置されている疾患または傷害、臓器が処理される方法、収集からの時間の長さなどに基づき得る。当業者は、当技術分野で慣例的であるこれらの考慮事項に基づいて所与の臓器について有効量を判定することができる。本明細書において、「有効用量」は、「有効量」と同じことを意味する。

「有効経路」は一般に、所望のコンパートメント、系、または位置に作用物質を送達する経路を意味する。例えば、有効経路は、作用物質が、有益な、または所望の臨床結果（本事例では、有効な移植）をもたらすのに十分な量の作用物質を作用の所望の部位で提供するように投与され得るものである。

「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」は、当技術分野で周知であり、多くの異なる哺乳動物種から調製されている。胚性幹細胞は、胚盤胞として公知の初期胚の内部細胞塊に由来する幹細胞である。これらは、３種の一次胚葉：外胚葉、内胚葉、および中胚葉のすべての誘導体に分化することができる。これらとしては、成体の体内の２２０超の細胞型のそれぞれがある。ＥＳ細胞は、胎盤を除いて、体内の任意の組織になることができる。桑実胚細胞のみが全能性であり、すべての組織および胎盤になることができる。ＥＳＣと同様のいくつかの細胞は、除核受精卵内への体細胞核の核移行によって生成され得る。

用語「外来性」は、幹細胞に関して使用される場合、一般に、臓器の外側にあり、有効経路による移植を意図された臓器に曝露された（例えば、接触した）幹細胞を指す。外来性幹細胞は、同じ対象に由来しても、異なる対象に由来してもよい。一実施形態では、外来性幹細胞として、対象から摘出され、単離され、ｅｘ ｖｉｖｏで展開され、次いで有効経路による移植を意図された臓器に曝露された幹細胞を挙げることができる。

用語「曝露する」は、移植を意図された臓器に１個または複数の幹細胞を投与する行為を含み得る。臓器への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、対象内への灌流によって）行うことができる。

用語「含む（include）」の使用は、限定的であるように意図されていない。

「増大させる（increase）」または「増大させる（increasing）」は、生物学的イベントを完全に誘導すること、またはイベントの程度を増大させることを意味する。

「人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣまたはＩＰＳ細胞）」は、例えば、体細胞に低分化表現型を付与する外来遺伝子を導入することによって再プログラムされた体細胞である。次いでこれらの細胞は、誘導されて分化して低分化子孫になることができる。ＩＰＳ細胞は、２００６年に最初に発見された手法の改変を使用して得られた（Yamanaka, S.ら、Cell Stem Cell、１巻：３９〜４９頁（２００７年））。例えば、一例では、ＩＰＳ細胞を創出するために、科学者らは、皮膚細胞から出発し、次いでこれらは、細胞ＤＮＡ内に遺伝子を挿入するためにレトロウイルスを使用して、標準的な実験室技法によって改変された。一例では、挿入遺伝子は、胚性幹細胞様状態で細胞を保つように天然制御因子として一緒に作用することが公知である、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｆ４、およびｃ−ｍｙｃであった。これらの細胞は、文献に記載されている。例えば、Wernigら、PNAS、１０５巻：５８５６〜５８６１頁（２００８年）；Jaenischら、Cell、１３２巻：５６７〜５８２頁（２００８年）；Hannaら、Cell、１３３巻：２５０〜２６４頁（２００８年）；およびBrambrinkら、Cell Stem Cell、２巻：１５１〜１５９頁（２００８年）を参照。これらの参考文献は、ＩＰＳＣおよびＩＰＳＣを生成するための方法を教示するために参照により組み込まれている。このような細胞が特定の培養条件（特定の作用物質への曝露）によって創出され得ることも予想される。

用語「虚血性再灌流傷害」は、産業において理解されており、例えば、http://emedicine.medscape.com/article/431140-overview#aw2aab6b3（臓器保存について）、およびde Groot, H.ら、Transplant Proc.、３９巻（２号）：４８１〜４頁（２００７年３月）に記載されており、これらは、虚血性再灌流傷害およびその機構の詳細の教示について参照により本明細書に組み込まれている。

「虚血」は、２つのフェーズで起こる。第１のフェーズは、温虚血フェーズと呼ばれ、ドナー臓器が取り出され、循環が中断される時間から臓器が低体温保存溶液とともに投与される時間を含む。冷虚血フェーズは、臓器が移植およびレシピエントにおける正常な再循環の前に低体温状態で保存されるとき起こる。

用語「単離された」は、ｉｎ ｖｉｖｏで１種または複数の細胞と付随している１種もしくは複数の細胞または１種もしくは複数の細胞成分と付随していない１種または複数の細胞を指す。「富化された集団」は、ｉｎ ｖｉｖｏまたは初代培養における１つまたは複数の他の細胞型と比べた所望の細胞の数の相対的な増加を意味する。

しかし、本明細書において、用語「単離された」は、本発明の細胞のみの存在を示すわけではない。むしろ、用語「単離された」は、本発明の細胞がこれらの天然の組織環境から取り出され、正常組織環境と比較してより高い濃度で存在することを示す。したがって、「単離された」細胞集団は、本発明の細胞に加えて緒細胞型をさらに含み得、追加の組織成分を含み得る。これはまた、例えば、細胞倍加の観点から表現することができる。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで１０回、２０回、３０回、４０回、またはそれ超の倍加を起こしている場合があり、その結果これは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはその最初の組織環境（例えば、骨髄、末梢血、胎盤、臍帯、臍帯血、脂肪組織など）でのその最初の数と比較して富化されている。

「ＭＡＰＣ」は、「多分化能成体前駆細胞」の頭字語である。これは、胚性幹細胞または生殖細胞でないが、これらのいくつかの特性を有する細胞を指す。ＭＡＰＣは、そのそれぞれが細胞にこれらが発見されたとき新規性を付与したいくつかの代替の記述で特徴付けることができる。したがって、これらは、こうした記述の１つまたは複数によって特徴付けることができる。第１に、これらは、形質転換（腫瘍形成性）されることなく、正常核型を伴って培養液中で拡張された複製能を有する。第２に、これらは、分化すると２種または３種すべての胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉、および外胚葉）などの１種を超える胚葉の細胞子孫を生じさせることができる。第３に、これらは、胚性幹細胞または生殖細胞ではないが、これらの原始細胞型のマーカーを発現することができ、その結果ＭＡＰＣは、Ｏｃｔ３／４（すなわち、Ｏｃｔ３Ａ）、ｒｅｘ−１、およびｒｏｘ−１の１種または複数を発現することができる。これらは、ｓｏｘ−２およびＳＳＥＡ−４の１種または複数も発現し得る。第４に、幹細胞のように、これらは、自己再生する、すなわち、形質転換されることなく拡張された複製能を有し得る。これは、これらの細胞がテロメラーゼを発現する（すなわち、テロメラーゼ活性を有する）ことを意味する。したがって、「ＭＡＰＣ」と命名された細胞型は、その新規の性質のいくつかを介して細胞を記述する代替の基本特性によって特徴付けられ得る。

ＭＡＰＣにおける用語「成体」は、非限定的である。これは、非胚性体細胞を指す。ＭＡＰＣは、核型が正常であり、ｉｎ ｖｉｖｏで奇形腫を形成しない。この頭字語は、骨髄から単離された多能性細胞を記述するのに米国特許第７，０１５，０３７号で最初に使用された。しかし、多能性マーカーおよび／または分化能を有する細胞は、引き続いて発見されており、本発明の目的に関しては、「ＭＡＰＣ」と最初に命名された細胞と均等であり得る。ＭＡＰＣタイプの細胞の本質的な記述は、上記発明の概要に提供されている。

ＭＡＰＣは、ＭＳＣより原始的な前駆細胞集団を代表する（Verfaillie, C.M.、Trends Cell Biol、１２巻：５０２〜８頁（２００２年）、Jahagirdar, B.N.ら、Exp Hematol、２９巻：５４３〜５６頁（２００１年）；Reyes, M.およびC.M. Verfaillie、Ann N Y Acad Sci、９３８巻：２３１〜２３３頁（２００１年）；Jiang, Y.ら、Exp Hematol、３０８９６〜９０４頁（２００２年）；およびJiang, Y.ら、Nature、４１８巻：４１〜９頁（２００２年））。

用語「ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）」は、米国特許第７，０１５，０３７号のＭＡＰＣに基づく細胞調製物、すなわち、上述した非胚性幹非生殖細胞の商標名である。ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）は、本特許出願に開示の細胞培養法、特に、より低い酸素およびより高い血清によって調製される。ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）は、高度に展開可能な、核型が正常なものであり、ｉｎ ｖｉｖｏで奇形腫を形成しない。これは、１種を超える胚葉の細胞系統に分化することができ、テロメラーゼ、ｏｃｔ３／４、ｒｅｘ−１、ｒｏｘ−１、ｓｏｘ−２、およびＳＳＥＡ４の１種または複数を発現することができる。

用語「臓器」は、移植のためにドナーから取り出された、またはレシピエントへの移植のためにドナーから取り出されることが意図されているインタクトな臓器全体として産業においてその慣例的なかつ理解されている意味によって使用され得る。用語「臓器」が本願で強調されているが、本方法は、臓器全体を構成しない場合がある組織に適用する。すなわち、本願で他の箇所で開示されるものなどの臓器の一部に適用する。したがって、適切な場合、用語「組織」は、用語「臓器」と適切に代替され得る。

「薬学的に許容される担体」は、本発明で使用される細胞のための任意の薬学的に許容される培地である。このような培地は、等張性、細胞代謝、ｐＨなどを保ち得る。これは、臓器への投与に適合しており、したがって、細胞送達および処置に使用することができる。

用語「効力」は、本願に記載の効果を実現する細胞の能力を指す。したがって、効力は、様々なレベルの効果を指し、この効果としては、それだけに限らないが、順調な移植の確率の増大、移植前臓器の劣化の遅延、臓器内の炎症活性の低減、臓器に対する免疫学的寛容の提供、臓器内の抗炎症性サイトカインの産生の増大、臓器内の神経保護Ｔ細胞の存在の増大、臓器内の反応性Ｔ細胞の存在の減少、臓器内の炎症促進性サイトカインのレベルの低減、臓器内の低酸素の効果の低減、臓器内の浮腫のレベルの逆転、および臓器内の低体温の効果の低減がある。回収、保存、および移植中に被る傷害は、虚血および低体温から主に起こる。これらは、様々な様式で臓器に影響を及ぼし得る。これらは、上記で引用したMedscapeの参考文献に記載されており、そのリンクが本願に示されている。その参考文献によれば、組織傷害の機構としては、細胞構造の完全性の喪失、細胞のイオン組成の混乱、ＡＴＰ生成の混乱があり、再灌流の結果として、損傷は、酸素フリーラジカルの有毒な蓄積によって再灌流中に起こり得る。

細胞構造の完全性に関して、完全性は、細胞膜中の構造的完全性の喪失によって妨げられ得る。細胞膜の完全性の維持は、温度、ｐＨ、モル浸透圧濃度のコントロールに依存する。臓器の虚血および保存は、これらのパラメータのすべてを乱す。

「始原胚性生殖細胞」（ＰＧまたはＥＧ細胞）は、培養および刺激されて多くの低分化細胞型を産生することができる。

「前駆細胞」は、これらの最終分化した子孫の特性のすべてではないがいくつかを有する幹細胞の分化中に産生される細胞である。「心臓前駆細胞」などの規定された前駆細胞は、一系列に関係付けられるが、特定の、または最終分化した細胞型に関係付けられない。頭字語「ＭＡＰＣ」中に使用される用語「前駆細胞」は、これらの細胞を特定の系列に限定しない。前駆細胞は、前駆細胞より高度に分化した子孫細胞を形成し得る。

用語「低減する」は、本明細書において、防止すること、および減少させることを意味する。臓器処置との関連で、「低減する」ことは、臓器拒絶反応を防止することまたは寛解させることである。これは、臓器拒絶反応の原因または症状を含む。これは、例えば、炎症の有害な効果を寛解させることなどの拒絶反応の根本的な生物学的原因に適用する。

所望のレベルの効力を有する細胞を「選択すること」は、細胞を同定（アッセイによってなど）、単離、および展開することを意味し得る。これは、細胞が単離された親細胞集団より高い効力を有する集団を創出することができる。「親」細胞集団は、選択された細胞が分裂した親細胞を指す。「親」は、実際のＰ１→Ｆ１関係（すなわち、子孫細胞）を指す。したがって、細胞Ｘが、Ｘが発現体であり、Ｙが発現体でない細胞ＸおよびＹの混合集団から単離される場合、Ｘの単なる単離体は、発現が増強されたものとして分類されない。しかし、Ｘの子孫細胞がより高い発現体である場合、子孫細胞は、発現が増強されたものとして分類される。

所望の効果を実現する細胞を選択することは、細胞が所望の効果を実現するか否かを判定するためのアッセイも含み、これらの細胞を得ることも含む。細胞は、効果が外来性導入遺伝子／ＤＮＡによって実現されないという点で所望の効果を天然に実現し得る。しかし、有効な細胞は、効果を増大させる作用物質とともにインキュベートされ、またはこの作用物質に曝露されることによって改善され得る。有効な細胞が選択される細胞集団は、アッセイを行う前に効力を有することが分かっていない場合がある。細胞は、アッセイを行う前に所望の効果を実現することが分かっていない場合がある。効果は、遺伝子発現および／または分泌に依存し得るので、その効果を引き起こす遺伝子の１種または複数に基づいて選択することもできる。

選択は、組織中の細胞からのものであり得る。例えば、この場合、細胞は、所望の組織から単離され、培養液中で展開され、所望の効果を実現することについて選択され、選択された細胞がさらに展開される。

選択は、培養液中の細胞などのｅｘ ｖｉｖｏでの細胞からのものでもあり得る。この場合、培養液中の細胞の１種または複数が、所望の効果を実現することについてアッセイされ、所望の効果を実現する得られた細胞がさらに展開され得る。

細胞は、所望の効果を実現する能力の増強についても選択され得る。この場合、増強された細胞が得られる細胞集団は、既に所望の効果を有する。増強された効果は、親集団におけるより細胞１個当たりの高い平均量を意味する。

増強された細胞が選択される親集団は、実質的に均質（同じ細胞型）であり得る。この集団からこのような増強された細胞を得る一方法は、単細胞または細胞プールを創出し、これらの細胞または細胞プールをアッセイして増強された（より大きい）効果を天然に有するクローンを得（効果を誘導または増大させるモジュレーターで細胞を処置することとは対照的に）、次いで、天然に増強されたこれらの細胞を展開することである。

しかし、細胞は、効果を誘導し、または増大させる１種または複数の作用物質で処置してもよい。したがって、実質的に均質な集団は、処置されて効果を増強する場合がある。

集団が実質的に均質でない場合、処置される親細胞集団は、効果の増強が求められる所望の細胞型のうちの少なくとも１００、より好ましくは細胞のうちの少なくとも１，０００、さらにより好ましくは、細胞のうちの少なくとも１０，０００を含有することが好ましい。処置した後、この亜集団を、公知の細胞選択技法によって不均質集団から回収し、必要に応じてさらに展開することができる。

したがって、効果の所望のレベルは、所与の先の集団におけるレベルより高いものであり得る。例えば、組織から初代培養に入れられ、効果を生じるように特別に設計されていない培養条件によって展開および単離される細胞は、親集団をもたらし得る。このような親集団を、意図的な処置無しでより大きい程度の効果を発現する集団内で細胞１個当たりの平均効果を増強するように処置し、または１種もしくは複数の細胞をスクリーニングすることができる。次いで、このような細胞は、展開されてより高い（所望の）発現を有する集団をもたらすことができる。

幹細胞の「自己複製」は、複製娘幹細胞であって、これらが発生したものと同一の分化能を有する複製娘幹細胞を生じさせる能力を指す。この脈絡で使用される同様の用語は、「増殖」である。

「幹細胞」は、自己複製（すなわち、同じ分化能を有する子孫）を起こし、分化能がより制限された子孫細胞も生じさせることができる細胞を意味する。本発明の脈絡内で、幹細胞は、例えば、核移行によって、より原始的な幹細胞との融合によって、特異的転写因子の導入によって、または特定の条件下での培養によって脱分化したより分化した細胞も包含する。例えば、Wilmutら、Nature、３８５巻：８１０〜８１３頁（１９９７年）；Yingら、Nature、４１６巻：５４５〜５４８頁（２００２年）；Guanら、Nature、４４０巻：１１９９〜１２０３頁（２００６年）；Takahashiら、Cell、１２６巻：６６３〜６７６頁（２００６年）；Okitaら、Nature、４４８巻：３１３〜３１７頁（２００７年）；およびTakahashiら、Cell、１３１巻：８６１〜８７２頁（２００７年）を参照。

脱分化は、ある特定の化合物の投与、または脱分化を引き起こすｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの物理的環境への曝露によっても引き起こされ得る。幹細胞はまた、奇形癌などの異常組織、および胚様体（これらは、内部細胞塊に直接由来しないが胚組織に由来するという点で胚性幹細胞と見なされ得るが）などのいくつかの他の源に由来し得る。幹細胞は、人工多能性幹細胞など、非幹細胞内に幹細胞機能と関連した遺伝子を導入することによっても生成され得る。

「対象」は、ヒトなどの哺乳動物などの脊椎動物を意味する。哺乳動物としては、それだけに限らないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、およびブタがある。

用語「治療有効量」は、哺乳動物において任意の治療応答を生じさせると判定される作用物質の量を指す。例えば、有効な抗炎症治療剤は、患者の生存性を延長し、かつ／または明白な臨床症状を阻害することができる。本明細書で使用する用語の意味の中で治療上有効である処置には、これらがそれ自体で疾患の転帰を改善しなくても、対象の生活の質を改善する処置が含まれる。このような治療有効量は、当業者によって容易に確定される。したがって、「処置する」ことは、このような量を送達することを意味する。したがって、処置することにより、任意の病的症状を防止し、または寛解させることができる。

用語「寛容化」または「寛容化する」は、移植片の免疫原性を低減してレシピエントによる臓器の寛容性の発生を可能にし、または容易にするための幹細胞を用いた移植前臓器（移植片）の処置を指す。この用語は、レシピエントによる寛容性発生を可能にし、または容易にする移植臓器の免疫原性の低減の概念を広く指す。したがって、臓器を寛容化すると、レシピエントによって寛容される臓器が生じる。言い換えれば、この用語は、免疫応答を正常に誘発する細胞または組織に対する免疫応答を免疫系が誘発することができないようにすることを指すことができる。これの一例は、Ｔ制御性細胞が活性化Ｔ細胞を抑制する因子を分泌し、その結果、活性化Ｔ細胞が炎症促進性サイトカインをもはや分泌することができないときである。

これは、移植前のｅｘ ｖｉｖｏ処置、またはさらには摘出前の局所投与を介して達成され得る。

「処置する（treat）」、「処置する（treating）」、または「処置」は、本発明に関して広く使用され、それぞれのこのような用語は、とりわけ、療法を邪魔する、かつ／または療法から生じるものを含めた欠損、機能不全、疾患、または他の有害なプロセスを防止し、寛解させ、阻害し、または治癒させることを包含する。

「バリデートする」は、確認することを意味する。本発明との関連で、細胞は、所望の効力を有する発現体であることが確認される。これは、そのときその細胞（処置、バンキング、薬物スクリーニングなどにおける）を、有効性について合理的な期待を伴って使用することができるようなものである。したがって、バリデートすることは、所望の活性を有すると最初に見出された／有すると確立された細胞が、実際にその活性を保つことを確認することを意味する。したがって、バリデーションは、元の判定およびフォローアップ判定を伴う２イベントプロセスにおける検証イベントである。第２のイベントは、「バリデーション」と本明細書で呼ばれる。

幹細胞
本発明は、好ましくは、脊椎動物種、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、家庭動物、家畜、および他の非ヒト哺乳動物などの幹細胞を使用して実行され得る。これらには、それだけに限らないが、以下に記載される細胞が含まれる。

胚性幹細胞
最もよく研究されている幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）であり、理由は、これが無制限の自己複製および多分化の潜在性を有するためである。これらの細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し、または着床後胚の始原生殖細胞（胚性生殖細胞またはＥＧ細胞）に由来し得る。ＥＳおよびＥＧ細胞は、最初にマウスから、後に多くの異なる動物から、より最近では、非ヒト霊長類およびヒトからも得られている。マウス胚盤胞または他の動物の胚盤胞中に導入されるとき、ＥＳＣは、動物のすべての組織に寄与し得る。ＥＳおよびＥＧ細胞は、ＳＳＥＡ１（マウス）およびＳＳＥＡ４（ヒト）に対する抗体を用いた陽性染色によって同定することができる。例えば、米国特許第５，４５３，３５７号；同第５，６５６，４７９号；同第５，６７０，３７２号；同第５，８４３，７８０号；同第５，８７４，３０１号；同第５，９１４，２６８号；同第６，１１０，７３９号；同第６，１９０，９１０号；同第６，２００，８０６号；同第６，４３２，７１１号；同第６，４３６，７０１号、同第６，５００，６６８号；同第６，７０３，２７９号；同第６，８７５，６０７号；同第７，０２９，９１３号；同第７，１１２，４３７号；同第７，１４５，０５７号；同第７，１５３，６８４号；および同第７，２９４，５０８号を参照。これらのそれぞれは、胚性幹細胞、ならびにこれらを作製および展開する方法を教示することについて参照により組み込まれている。したがって、ＥＳＣ、ならびにこれらを単離および展開するための方法は、当技術分野で周知である。

ｉｎ ｖｉｖｏでの胚性幹細胞の効力状態を左右するいくつかの転写因子および外因性サイトカインが同定されている。幹細胞多能性に関与する記載されるべき第１の転写因子は、Ｏｃｔ４である。Ｏｃｔ４は、転写因子のＰＯＵ（Ｐｉｔ−Ｏｃｔ−Ｕｎｃ）ファミリーに属し、プロモーターまたはエンハンサー領域内に「八量体モチーフ」と呼ばれる八量体配列を含有する遺伝子の転写を活性化することができるＤＮＡ結合タンパク質である。Ｏｃｔ４は、卵筒が形成されるまで受精接合体の卵割段階の瞬間で発現される。Ｏｃｔ３／４の機能は、分化誘導遺伝子（すなわち、ＦｏｘａＤ３、ｈＣＧ）を抑圧すること、および多能性を促進する遺伝子（ＦＧＦ４、Ｕｔｆ１、Ｒｅｘ１）を活性化することである。Ｓｏｘ２、高移動度群（ＨＭＧ）ｂｏｘ転写因子のメンバーは、Ｏｃｔ４と協調して内部細胞塊内で発現される遺伝子の転写を活性化する。胚性幹細胞内のＯｃｔ３／４発現がある特定のレベル間で維持されることが不可欠である。Ｏｃｔ４発現レベルの５０％超の過剰発現または下方制御は、胚性幹細胞の運命を変更し、それぞれ原始的な内胚葉／中胚葉または栄養外胚葉を形成する。ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｏｃｔ４欠損胚は、胚盤胞段階に発達するが、内部細胞塊細胞は、多能性でない。代わりにこれらは、胚外栄養膜系列に沿って分化する。Ｓａｌｌ４、哺乳動物Ｓｐａｌｔ転写因子は、Ｏｃｔ４の上流制御因子であり、したがって、胚発生の初期段階中にＯｃｔ４の適切なレベルを維持するのに重要である。Ｓａｌｌ４レベルがある特定の閾値未満に下がると、栄養外胚葉細胞は、異所性に展開して内部細胞塊になる。多能性に要求される別の転写因子は、ケルト族の「ティル・ナ・ノーグ（Tir Nan Og）」：常若の国にちなんで名付けられたＮａｎｏｇである。ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｎａｎｏｇは、圧縮桑実胚の段階から発現され、内部細胞塊まで引き続いて規定され、着床期によって下方制御される。Ｎａｎｏｇの下方制御は、多能性細胞のコントロールされない展開を回避し、嚢胚形成中に多系列分化を可能にするのに重要であり得る。５．５日目に単離されるＮａｎｏｇヌル胚は、胚外内胚葉を主に含有し、認識可能な原外胚葉をまったく含有しない無秩序な胚盤胞からなる。

非胚性幹細胞
幹細胞は、ほとんどの組織内で同定されている。おそらく、最良に特徴付けられているのは、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、細胞表面マーカーおよび機能特性を使用して精製され得る中胚葉由来細胞である。これらは、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児肝臓、および卵黄嚢から単離されている。これらは、造血を開始し、複数の造血系列を生成する。致死的に照射された動物中に移植されると、これらは、赤血球系好中球−マクロファージ、巨核球、およびリンパ造血細胞プールを再生息させることができる。これらは、誘導されていくつかの自己複製細胞分裂を起こすこともできる。例えば、米国特許第５，６３５，３８７号；同第５，４６０，９６４号；同第５，６７７，１３６号；同第５，７５０，３９７号；同第５，６８１，５９９号；および同第５，７１６，８２７号を参照。米国特許第５，１９２，５５３号には、ヒト新生児または胎児造血幹細胞または前駆細胞を単離するための方法が報告されている。米国特許第５，７１６，８２７号には、Ｔｈｙ−１＋前駆細胞であるヒト造血細胞、およびこれらをｉｎ ｖｉｔｒｏで再生するための適切な成長培地が報告されている。米国特許第５，６３５，３８７号には、ヒト造血細胞およびこれらの前駆体を培養するための方法およびデバイスが報告されている。米国特許第６，０１５，５５４号には、ヒトリンパ系および樹状細胞を再構成する方法が記載されている。したがって、ＨＳＣ、ならびにこれらを単離および展開するための方法は、当技術分野で周知である。

当技術分野で周知である別の幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。これらの細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖し、少なくともいくつかのニューロン細胞を連続的に再生することができる。ｅｘ ｖｉｖｏで培養されるとき、神経幹細胞は、誘導されて増殖および分化して異なるタイプのニューロンおよびグリア細胞になることができる。脳内に移植されると、神経幹細胞は、生着し、神経およびグリア細胞を生成することができる。例えば、Gage F.H.、Science、２８７巻：１４３３〜１４３８頁（２０００年）、Svendsen S.N.ら、Brain Pathology、９巻：４９９〜５１３頁（１９９９年）、およびOkabe S.ら、Mech Development、５９巻：８９〜１０２頁（１９９６年）を参照。米国特許第５，８５１，８３２号には、脳組織から得られる多分化能神経幹細胞が報告されている。米国特許第５，７６６，９４８号には、新生仔大脳半球から神経芽細胞を生成することが報告されている。米国特許第５，５６４，１８３号および同第５，８４９，５５３号には、哺乳動物神経堤幹細胞の使用が報告されている。米国特許第６，０４０，１８０号には、哺乳動物多分化能ＣＮＳ幹細胞の培養からの分化したニューロンのｉｎ ｖｉｔｒｏ生成が報告されている。ＷＯ９８／５０５２６およびＷＯ９９／０１１５９には、神経上皮幹細胞、乏突起膠細胞−星状細胞前駆体、および系列制限神経細胞前駆体の生成および単離が報告されている。米国特許第５，９６８，８２９号には、胚前脳から得られる神経幹細胞が報告されている。したがって、神経幹細胞、ならびにこれらを作製および展開するための方法は、当技術分野で周知である。

当技術分野で広範に研究されてきた別の幹細胞は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）である。ＭＳＣは、胚中胚葉に由来し、とりわけ成体の骨髄、末梢血、脂肪、胎盤、および臍帯血を含めた多くの源から単離され得る。ＭＳＣは、筋肉、骨、軟骨、脂肪、および腱を含めた多くの中胚葉組織に分化することができる。これらの細胞についてのかなりの文献がある。例えば、米国特許第５，４８６，３８９号；同第５，８２７，７３５号；同第５，８１１，０９４号；同第５，７３６，３９６号；同第５，８３７，５３９号；同第５，８３７，６７０号；および同第５，８２７，７４０号を参照。Pittenger, M.ら、Science、２８４巻：１４３〜１４７頁（１９９９年）も参照。

成体幹細胞の別の例は、脂肪由来成体幹細胞（ＡＤＳＣ）であり、これらは、典型的には脂肪吸引、その後のコラゲナーゼを使用するＡＤＳＣの放出によって脂肪から単離された。ＡＤＳＣは、これが脂肪からはるかに多くの細胞を単離することが可能であることを除いて、骨髄に由来するＭＳＣと多くの様式で同様である。これらの細胞は、骨、脂肪、筋肉、軟骨、および神経細胞に分化することが報告されている。単離の方法は、米国特許公開第２００５／０１５３４４２Ａ１号に記載されている。

当技術分野で公知である他の幹細胞としては、胃腸幹細胞、表皮幹細胞、および肝幹細胞があり、これらは、「卵形細胞」とも呼ばれる（Potten, C．ら、Trans R Soc Lond B Biol Sci、３５３巻：８２１〜８３０頁（１９９８年）、Watt, F.、Trans R Soc Lond B Biol Sci、３５３巻：８３１頁（１９９７年）；Alisonら、Hepatology、２９巻：６７８〜６８３頁（１９９８年）。

１つを超える胚性胚葉の細胞型に分化することができると報告されている他の非胚細胞としては、それだけに限らないが、臍帯血（米国公開第２００２／０１６４７９４号を参照）、胎盤（米国公開第２００３／０１８１２６９号）、臍帯マトリックス（Mitchell, K.E.ら、Stem Cells、２１巻：５０〜６０頁（２００３年））、小胚様幹細胞（Kucia, M.ら、J Physiol Pharmacol、５７巻、補遺５：５〜１８頁（２００６年））、羊水幹細胞（Atala, A.、J Tissue Regen Med、１巻：８３〜９６頁（２００７年））、皮膚由来前駆体（Tomaら、Nat Cell Biol、３巻：７７８〜７８４頁（２００１年））、骨髄（米国特許公開第２００３／００５９４１４号および同第２００６／０１４７２４６号を参照）、骨髄から単離した成人の多系統誘導性（ＭＩＡＭＩ）細胞（ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００２５８０を参照）、ならびに子宮内膜細胞（米国公開第２０１３／０１５６７２６号を参照）に由来する細胞がある。これらの文献のそれぞれは、これらの細胞を教示するために参照により組み込まれている。

体細胞を再プログラムするストラテジー
いくつかの異なるストラテジー、例えば、核移植、細胞融合、および培養誘導再プログラミングなどが、分化細胞の胚の状態への変換を誘導するのに使用されている。核移行は、体細胞核を除核卵母細胞内に注射することを伴い、これは、代理母内に移されると、クローンを生じさせることができ（「生殖型クローニング」）、または培養液中で外植されると、遺伝的にマッチした胚性幹（ＥＳ）細胞を生じさせることができる（「体細胞核移行」、ＳＣＮＴ）。体細胞をＥＳ細胞と細胞融合すると、多能性ＥＳ細胞のすべての特徴を示すハイブリッドが生成される。培養液中で体細胞を外殖すると、多能性または多分化能であり得る不死細胞株が選択される。現在のところ、精原幹細胞が出生後の動物から得ることができる多能性細胞の唯一の源である。規定された因子で体細胞をトランスダクトすると、多能性状態への再プログラムを開始することができる。これらの実験的手法は、広範に総説されている（HochedlingerおよびJaenisch、Nature、４４１巻：１０６１〜１０６７頁（２００６年）、ならびにYamanaka, S.、Cell Stem Cell、１巻：３９〜４９頁（２００７年））。

核移行
核移植（ＮＴ）は、体細胞核移行（ＳＣＮＴ）とも呼ばれ、ヒツジのＤｏｌｌｙなどのクローン動物を生産するためのドナー体細胞に由来する核の除核卵母細胞（ogocyte）への導入を表す（Wilmutら、Nature、３８５巻：８１０〜８１３頁（１９９７年）。ＮＴによる生きた動物の生産により、最終分化した細胞のものを含めた体細胞の後成的な状態は、安定である一方、非可逆的に固定されておらず、しかし、新しい生物の発生を指示することができる胚の状態に再プログラムされ得ることが実証された。胚発生および疾患に関与する基本の後成的機構を解明するためのエキサイティングな実験手法を提供することに加えて、核クローニング技術は、患者特異的な移植医学の潜在的な目的のものである。

体細胞および胚性幹細胞の融合
体細胞核の未分化状態への後成的な再プログラミングは、胚細胞を体細胞と融合することによって生成されたマウスハイブリッドにおいて実証された。様々な体細胞と胚性癌腫細胞（Solter, D.、Nat Rev Genet、７巻：３１９〜３２７頁（２００６年））、胚性生殖（ＥＧ）、またはＥＳ細胞（ZwakaおよびThomson、Development、１３２巻：２２７〜２３３頁（２００５年））との間のハイブリッドは、親胚細胞と多くの特徴を共有し、多能性表現型がこのような融合生成物中で支配的であることを示す。マウスと同様に（Tadaら、Curr Biol、１１巻：１５５３〜１５５８頁（２００１年））、ヒトＥＳ細胞は、融合後に体細胞核を再プログラムする潜在性を有する（Cowanら、Science、３０９巻：１３６９〜１３７３頁（２００５年））；Yuら、Science、３１８巻：１９１７〜１９２０頁（２００６年））。Ｏｃｔ４などのサイレント多能性マーカーを活性化し、または不活性な体細胞Ｘ染色体を再活性化すると、ハイブリッド細胞内の体細胞ゲノムの再プログラミングについての分子的証拠がもたらされた。融合して２日後に最初に観察されるＤＮＡ複製が多能性マーカーの活性化にとって本質的であり（DoおよびScholer、Stem Cells、２２巻：９４１〜９４９頁（２００４年））、ＥＳ細胞内でＮａｎｏｇが強制的に過剰発現されると、神経幹細胞と融合されるときに多能性が促進されることが示唆された（Silvaら、Nature、４４１巻：９９７〜１００１頁（２００６年））。

培養誘導再プログラミング
多能性細胞は、割球などの胚源、ならびに胚盤胞（ＥＳ細胞）、原外胚葉（ＥｐｉＳＣ細胞）、始原生殖細胞（ＥＧ細胞）、および出生後精原幹細胞（「ｍａＧＳＣｓｍ」、「ＥＳ様」細胞）の内部細胞塊（ＩＣＭ）から得られている。以下の多能性細胞は、これらのドナー細胞／組織とともに、以下の通りである：マウス卵母細胞から得られる単為生殖（parthogenetic）ＥＳ細胞（Narasimhaら、Curr Biol、７巻：８８１〜８８４頁（１９９７年））；割球から得られている胚性幹細胞（Wakayamaら、Stem Cells、２５巻：９８６〜９９３頁（２００７年））；内部細胞塊細胞（源は適用可能でない）（Egganら、Nature、４２８巻：４４〜４９頁（２００４年））；始原生殖細胞から得られている胚性生殖および胚性癌細胞（Matsuiら、Cell、７０巻：８４１〜８４７頁（１９９２年））；精原幹細胞から得られているＧＭＣＳ、ｍａＳＳＣ、およびＭＡＳＣ（Guanら、Nature、４４０巻：１１９９〜１２０３頁（２００６年）；Kanatsu-Shinoharaら、Cell、１１９巻：１００１〜１０１２頁（２００４年）；およびSeandelら、Nature、４４９巻：３４６〜３５０頁（２００７年））；原外胚葉から得られるＥｐｉＳＣ細胞（Bronsら、Nature、４４８巻：１９１〜１９５頁（２００７年）；Tesarら、Nature、４４８巻：１９６〜１９９頁（２００７年））；ヒト卵母細胞から得られている単為生殖ＥＳ細胞（Cibelliら、Science、２９５巻：８１９頁（２００２年）；Revazovaら、Cloning Stem Cells、９巻：４３２〜４４９頁（２００７年））；ヒト胚盤胞から得られているヒトＥＳ細胞（Thomsonら、Science、２８２巻：１１４５〜１１４７頁（１９９８年））；骨髄から得られているＭＡＰＣ（Jiangら、Nature、４１８巻：４１〜４９頁（２００２年）；PhinneyおよびProckop、Stem Cells、２５巻：２８９６〜２９０２頁（２００７年））；臍帯血細胞（臍帯血に由来）（van de Venら、Exp Hematol、３５巻：１７５３〜１７６５頁（２００７年））；神経細胞に由来するニューロスフェア（Clarkeら、Science、２８８巻：１６６０〜１６６３頁（２０００年））。ＰＧＣまたは精原幹細胞などの生殖細胞系列に由来するドナー細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでユニポテントであることが公知であるが、多能性ＥＳ様細胞（Kanatsu-Shinoharaら、Cell、１１９巻：１００１〜１０１２頁（２００４年）またはｍａＧＳＣ（Guanら、Nature、４４０巻：１１９９〜１２０３頁（２００６年））は、長期のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後に単離され得ることが示された。これらの多能性細胞型のほとんどは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化および奇形腫形成をすることができたが、ＥＳ、ＥＧ、ＥＣ、および精原幹細胞由来ｍａＧＣＳ、またはＥＳ様細胞のみが、よりストリンジェントな基準によって多能性であった。理由は、これらが出生後キメラを形成し、生殖系列に寄与することができたためである。最近、多分化能成体精原幹細胞（ＭＡＳＣ）が成体マウスの精巣精原幹細胞から得られ、これらの細胞は、ＥＳ細胞のものと異なる（Seandelら、Nature、４４９巻：３４６〜３５０頁（２００７年））が、着床後マウス胚の原外胚葉に由来したＥｐｉＳＣ細胞と同様の発現プロファイルを有していた（Bronsら、Nature、４４８巻：１９１〜１９５頁（２００７年）；Tesarら、Nature、４４８巻：１９６〜１９９頁（２００７年））。

規定された転写因子による再プログラミング
TakahashiおよびYamanakaは、体細胞をＥＳ様状態に戻す再プログラミングを報告した（TakahashiおよびYamanaka、Cell、１２６巻：６６３〜６７６頁（２００６年））。彼らは、４つの転写因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、およびＫｌｆ４のウイルス媒介トランスダクション、その後のＯｃｔ４標的遺伝子Ｆｂｘ１５を活性化するための選択後に、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）および成体線維芽細胞を多能性ＥＳ様細胞に再プログラムすることに成功した。活性化Ｆｂｘ１５を有していた細胞は、ｉＰＳ（人工多能性幹）細胞という新語を案出され、奇形腫を形成するその能力によって多能性であることが示されたが、これらは、生きたキメラを産生することができなかった。この多能性状態は、トランスダクトされたＯｃｔ４およびＳｏｘ２遺伝子の連続的なウイルス発現に依存した一方、内因性Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ遺伝子は、発現されないか、またはＥＳ細胞におけるものより低いレベルで発現され、これらのそれぞれのプロモーターは、大部分はメチル化されていることが判明した。これは、Ｆｂｘ１５−ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞に対応しなかったが、再プログラミングの不完全な状態を表していた可能性があるという結論と一致する。一方、遺伝子実験により、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２が多能性にとって本質的であり（ChambersおよびSmith、Oncogene、２３巻：７１５０〜７１６０頁（２００４年）；Ivanonaら、Nature、４４２巻：５３３０５３８頁（２００６年）；Masuiら、Nat Cell Biol、９巻：６２５〜６３５頁（２００７年））、再プログラミングにおける２種の発癌遺伝子ｃ−ｍｙｃおよびＫｌｆ４の役割は、あまり明確でないことが確立された。これらの発癌遺伝子のいくつかは、実際には再プログラミングにとって必須でない場合があり、理由は、マウスおよびヒトｉＰＳ細胞がともに、有効性は低いが、ｃ−ｍｙｃトランスダクションの非存在下で得られたためである（Nakagawaら、Nat Biotechnol、２６巻：１９１〜１０６頁（２００８年）；Werningら、Nature、４４８巻：３１８〜３２４頁（２００８年）；Yuら、Science、３１８巻：１９１７〜１９２０頁（２００７年））。

ＭＡＰＣ
ヒトＭＡＰＣは、米国特許第７，０１５，０３７号に記載されている。ＭＡＰＣは、他の哺乳動物でも同定されている。例えば、マウスのＭＡＰＣも米国特許第７，０１５，０３７号に記載されている。ラットＭＡＰＣも、米国特許第７，８３８，２８９号に記載されている。

これらの参考文献は、Catherine Verfaillieによって最初に単離されたＭＡＰＣを記載するために参照により組み込まれている。

ＭＡＰＣの単離および成長
ＭＡＰＣ単離の方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第７，０１５，０３７号を参照。これらの方法は、ＭＡＰＣの特徴付け（表現型）とともに、参照により本明細書に組み込まれている。ＭＡＰＣは、それだけに限らないが、骨髄、胎盤、臍帯および臍帯血、筋肉、脳、肝臓、脊髄、血液、または皮膚を含めた複数の源から単離され得る。したがって、骨髄穿刺液、脳または肝臓生検、ならびに他の臓器を得、これらの細胞内で発現される（または発現されない）遺伝子を利用して、当業者に利用可能な正または負の選択技法を使用して（例えば、参照により本明細書に組み込まれている上記に参照した出願に開示されたものなどの機能的または形態学的アッセイによって）、細胞を単離することが可能である。

ＭＡＰＣは、Breyerら、Experimental Hematology、３４巻：１５９６〜１６０１頁（２００６年）、およびSubramanianら、Cellular Programming and Reprogramming: Methods and Protocols；S. Ding（編）、Methods in Molecular Biology、６３６巻：５５〜７８頁（２０１０年）に記載された改良法によっても得られており、これらの文献は、これらの方法について参照により組み込まれている。

米国特許第７，０１５，０３７号に記載のヒト骨髄由来ＭＡＰＣ
ＭＡＰＣは、一般的な白血球抗原ＣＤ４５または赤芽球特異的グリコホリン−Ａ（Ｇｌｙ−Ａ）を発現しない。細胞の混合集団が、フィコール−ハイパック分離に付された。次いで細胞は、抗ＣＤ４５および抗Ｇｌｙ−Ａ抗体を使用し、ＣＤ４５＋およびＧｌｙ−Ａ＋細胞の集団を枯渇させる負の選択に付され、次いで骨髄単核細胞の残っているおよそ０．１％が回収された。細胞をフィブロネクチン被覆ウェル中に蒔き、２〜４週間、以下に記載するように培養して、ＣＤ４５＋の細胞およびＧｌｙ−Ａ＋細胞を枯渇させることもできる。接着性骨髄細胞の培養では、多くの接着性間質細胞は、細胞倍加３０回付近で複製老化を起こし、細胞のより均質な集団が展開し続け、長いテロメアを維持する。

代わりに、正の選択を、細胞特異的マーカーの組合せを介して細胞を単離するのに使用することができる。正および負の選択技法はともに、当業者に利用可能であり、負の選択目的に適した多数のモノクローナルおよびポリクローナル抗体も、当技術分野で利用可能であり（例えば、Leukocyte Typing、V, Schlossmanら編、（１９９５年）、Oxford University Pressを参照）、いくつかの源から市販されている。

細胞集団の混合物から哺乳動物細胞を分離するための技法は、米国特許第５，７５９，７９３号のSchwartzら（磁気分離）、Baschら、１９８３年（免疫親和性クロマトグラフィー）、ならびにWysockiおよびSato、１９７８年（蛍光活性化細胞分類）にも記載されている。

細胞は、低血清または無血清培地中で培養され得る。ＭＡＰＣを培養するのに使用される無血清培地は、米国特許第７，０１５，０３７号に記載されている。一般に使用される増殖因子としては、それだけに限らないが、血小板由来増殖因子および上皮増殖因子がある。例えば、米国特許第７，１６９，６１０号；同第７，１０９，０３２号；同第７，０３７，７２１号；同第６，６１７，１６１号；同第６，６１７，１５９号；同第６，３７２，２１０号；同第６，２２４，８６０号；同第６，０３７，１７４号；同第５，９０８，７８２号；同第５，７６６，９５１号；同第５，３９７，７０６号；および同第４，６５７，８６６号を参照。すべてが無血清培地中での細胞の成長を教示するために参照により組み込まれている。

追加の培養法
追加の実験では、ＭＡＰＣが培養される密度は、約２００細胞／ｃｍ^２〜約１５００細胞／ｃｍ^２〜約２０００細胞／ｃｍ^２を含めて、約１００細胞／ｃｍ^２または約１５０細胞／ｃｍ^２〜約１０，０００細胞／ｃｍ^２まで様々であり得る。密度は、種間で様々となり得る。さらに、最適な密度は、培養条件および細胞源に応じて様々となり得る。培養条件および細胞の所与のセットについて最適な密度を判定することは、当業者の技術の範囲内である。

また、約１〜５％、特に、３〜５％を含めた約１０％未満の有効大気酸素濃度を、培養中のＭＡＰＣの単離、成長、および分化中の任意の時間に使用することができる。

細胞は、様々な血清濃度、例えば、約２〜２０％の下で培養され得る。ウシ胎児血清を使用してもよい。より高い血清を、より低い酸素圧、例えば、約１５〜２０％と組み合わせて使用してもよい。細胞は、培養皿に接着させる前に選択される必要はない。例えば、フィコール勾配後に、細胞を、例えば、２５０，０００〜５００，０００／ｃｍ^２で直接蒔くことができる。接着性コロニーを選定し、場合によりプールし、展開することができる。

実施例の実験手順で使用した一実施形態では、高い血清（約１５〜２０％）および低酸素（約３〜５％）の条件を細胞培養に使用した。具体的には、コロニーからの接着細胞を蒔き、１８％血清および３％酸素（ＰＤＧＦおよびＥＧＦを含む）中、約１７００〜２３００細胞／ｃｍ^２の密度で継代させた。

ＭＡＰＣに特有の実施形態では、サプリメントは、ＭＡＰＣに３つすべての系列などの１つを超える胚系列の細胞型に分化する能力を保たせる細胞因子またはコンポーネントである。これは、Ｏｃｔ３／４（Ｏｃｔ３Ａ）などの未分化状態の特異的マーカー、および／またはテロメラーゼなどの高い展開能力のマーカーの発現によって示され得る。

細胞培養
以下に列挙したすべてのコンポーネントについては、これらのコンポーネントを教示するために参照により組み込まれている米国特許第７，０１５，０３７号を参照。

一般に、本発明に有用な細胞は、入手可能であり、当技術分野で周知である培地中で維持および展開され得る。細胞培養培地に哺乳動物血清を補充することも企図されている。追加のサプリメントも、最適な成長および展開のために必要な微量元素を細胞に供給するために、有利には使用することができる。ホルモンも、有利には細胞培養液中で使用され得る。脂質および脂質担体も、細胞のタイプおよび分化細胞の運命に応じて細胞培地を補充するのに使用することができる。支持細胞層の使用も企図されている。

培養液中の細胞は、懸濁液中で維持され、または細胞外マトリックスコンポーネントなどの固体支持体に付着されている場合がある。幹細胞は、固体支持体にこれらが付着するのを促す追加の因子、例えば、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」、ならびにフィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ポリ−Ｄおよびポリ−Ｌ−リシン、トロンボスポンジン、ならびにビトロネクチンなどを必要とすることが多い。本発明の一実施形態は、フィブロネクチンを利用する。例えば、Ohashiら、Nature Medicine、１３巻：８８０〜８８５頁（２００７年）；Matsumotoら、J Bioscience and Bioengineering、１０５巻：３５０〜３５４頁（２００８年）；Kirouacら、Cell Stem Cell、３巻：３６９〜３８１頁（２００８年）；Chuaら、Biomaterials、２６巻：２５３７〜２５４７頁（２００５年）；Drobinskayaら、Stem Cells、２６巻：２２４５〜２２５６頁（２００８年）；Dvir-Ginzbergら、FASEB J、２２巻：１４４０〜１４４９頁（２００８年）；Turnerら、J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater、８２Ｂ巻：１５６〜１６８頁（２００７年）；およびMiyazawaら、Journal of Gastroenterology and Hepatology、２２巻：１９５９〜１９６４頁（２００７年））を参照。

細胞は、「３Ｄ」（凝集した）培養液中でも成長し得る。一例は、２００９年１月２１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００９／３１５２８である。

培養液中で確立された後、例えば、４０％ ＦＣＳおよび１０％ ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭを使用して、フレッシュな、または凍結在庫として凍結および貯蔵された細胞を使用することができる。培養細胞用に凍結在庫を調製するための他の方法も、当業者に利用可能である。

医薬製剤
米国特許第７，０１５，０３７号は、医薬製剤を教示するために参照により組み込まれている。ある特定の実施形態では、細胞集団は、送達に適応し、適した、すなわち、生理学的に適合性の組成物内に存在する。

製剤は、所望の効果、例えば、炎症の低減、アポトーシス、浮腫などの低減、ある特定の因子の上方制御などの程度に順応される。

一部の実施形態では、臓器に投与するための細胞の純度は、約１００％（実質的に均質）である。他の実施形態では、これは、９５％〜１００％である。一部の実施形態では、これは、８５％〜９５％である。特に、他の細胞との混ぜ物の場合では、パーセンテージは、約１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜９５％であり得る。または単離／純度は、細胞倍加の観点から表現することができ、この場合細胞は、例えば、１０〜２０回、２０〜３０、３０〜４０回、４０〜５０回、またはそれ超の細胞倍加を起こしている。

細胞を投与するための製剤の選択は、様々な要因に依存することになる。これらの中で顕著なものは、ドナー／レシピエントの種、処置されている臓器の特質、投与されている他の療法および作用物質の特質、投与の最適経路、有効経路を介した生存性、投薬レジメン、ならびに当業者に明らかとなる他の要因となる。例えば、適当な担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路および特定の剤形の特質に依存することになる。

細胞／培地の水性懸濁液の最終的な製剤は、典型的には、懸濁液のイオン強度を等張性（すなわち、約０．１〜０．２）および生理的ｐＨ（すなわち、約ｐＨ６．８〜７．５）に調整することを伴う。最終的な製剤は、典型的には流体滑剤も含有することになる。

当業者は、本発明の方法で投与される組成物中の細胞、ならびに任意選択の添加剤、ビヒクル、および／または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、任意の添加剤（細胞に加えて）が、リン酸緩衝生理食塩水などの溶液中に０．００１〜５０ｗｔ％の量で存在する。活性成分は、マイクログラム〜ミリグラムの程度、例えば、約０．０００１〜約５ｗｔ％、好ましくは約０．０００１〜約１ｗｔ％、最も好ましくは約０．０００１〜約０．０５ｗｔ％または約０．００１〜約２０ｗｔ％、好ましくは約０．０１〜約１０ｗｔ％、最も好ましくは約０．０５〜約５ｗｔ％などで存在する。

一部の実施形態では、細胞は、特にカプセル化が有効性を増強し、または取り扱いおよび／もしくは保存可能期間において利点をもたらす場合、投与のためにカプセル化される。細胞は、膜およびカプセルによってカプセル化され得る。利用可能な細胞カプセル化の多くの方法のいずれも使用され得ることが企図されている。

多種多様な材料が、細胞のマイクロカプセル化のために様々な実施形態で使用され得る。このような材料としては、例えば、ポリマーカプセル、アルギネート−ポリ−Ｌ−リシン−アルギネートマイクロカプセル、バリウムポリ−Ｌ−リシンアルギネートカプセル、アルギン酸バリウムカプセル、ポリアクリロニトリル／ポリ塩化ビニル（ＰＡＮ／ＰＶＣ）中空糸、およびポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空糸がある。

細胞を投与するのに使用され得る細胞のマイクロカプセル化のための技法は、当業者に公知であり、例えば、Chang, P.ら、１９９９年；Matthew, H.W.ら、１９９１年；Yanagi, K.ら、１９８９年；Cai Z.H.ら、１９８８年；Chang, T.M.、１９９２年、および米国特許第５，６３９，２７５号（これには、例えば、生物活性分子を安定に発現する細胞を長時間維持するための生体適合性カプセルが記載されている）に記載されている。カプセル化の追加の方法は、欧州特許公開第３０１，７７７号、ならびに米国特許第４，３５３，８８８号；同第４，７４４，９３３号；同第４，７４９，６２０号；同第４，８１４，２７４号；同第５，０８４，３５０号；同第５，０８９，２７２号；同第５，５７８，４４２号；同第５，６３９，２７５号；および同第５，６７６，９４３号にある。上記のすべては、細胞のカプセル化に関係する部分において参照により本明細書に組み込まれている。

ある特定の実施形態では、バイオポリマーまたは合成ポリマーなどのポリマー中に細胞を組み込む。バイオポリマーの例としては、それだけに限らないが、フィブロネクチン、フィブリン、フィブリノーゲン、トロンビン、コラーゲン、およびプロテオグリカンがある。上記に論じたサイトカインなどの他の因子も、ポリマー中に組み込むことができる。本発明の他の実施形態では、細胞は、３次元ゲルの間隙に組み込まれ得る。大きいポリマーまたはゲルは、典型的には、外科的にインプラントされることになる。十分小さい粒子または繊維中に製剤化され得るポリマーまたはゲルは、他の一般的な、より好都合な、非外科的な経路によって投与され得る。

細胞の投与量は、広い制限内で様々となり、各特定の場合における個々の必要量に合わされることになる。細胞の数は、臓器のタイプ、重量、および条件、投与の数または頻度、ならびに当業者に公知の他の変数に応じて様々となる。細胞は、組織または臓器に適した経路によって投与され得る。適当な送達経路の例として、気管内送達（例えば、肺について）、静脈内送達、動脈内送達（例えば、冠血管内）、臓器中への直接注射、およびリンパ系内送達を挙げることができる。

細胞は、約０．０１〜１×１０^５細胞／ｍｌ、約１×１０^５細胞／ｍｌ〜１０×１０^６細胞／ｍｌ、または約１０×１０^６細胞／ｍｌ〜５×１０^７細胞／ｍｌの濃度で適切な賦形剤中に懸濁され得る。適当な賦形剤は、細胞およびレシピエント臓器に生物学的かつ生理学的に適合するもの、例えば、緩衝生理食塩水溶液または他の適当な賦形剤などである。投与のための組成物は、適切な滅菌性および安定性に準拠した標準方法によって製剤化、生成、および貯蔵することができる。

投薬
ヒトまたは他の哺乳動物についての用量（すなわち、細胞の数）は、本開示、本明細書に引用した文書、および当技術分野における知識から当業者によって、過度の実験を用いることなく判定され得る。本発明の様々な実施形態によって使用される最適な用量は、以下を含む多数の要因に依存することになる：処置されている疾患およびその段階；ドナーの種、これらの健康、性別、年齢、体重、および代謝率；ドナーの免疫適格性；投与されている他の療法；ならびにドナーの履歴または遺伝子型から予期される潜在的な合併症。パラメータとして、細胞が同系、自己、同種間、または異種間であるか否か；これらの効力；標的にされなければならない部位および／または分布；ならびに細胞へのアクセシビリティなどの部位の特性も挙げることができる。追加のパラメータには、他の因子（増殖因子およびサイトカインなど）との同時投与が含まれる。所与の状況における最適な用量は、細胞が製剤化される方法、これらが投与される方法（例えば、灌流、臓器内など）、および細胞が投与後に標的部位に局在化される程度も考慮に入れることになる。

最終的に、用量レベル、タイミング、および頻度は、有効性によって判定される。これは、臓器の健康および生存能によって、かつ場合により移植後の臓器機能および臨床対策によって測定されることになる。このような対策は、臓器によって様々となる。一実施形態では、これらは、臓器機能の対策を含むことができる。臨床文献を介して移植についての臓器生存能の対策にアクセスすることができる。別の実施形態では、ある特定のマーカーのレベル（複数可）またはパターン（複数可）（例えば、組織ｍＲＮＡレベル、サイトカインレベル、および炎症細胞数）をアッセイして（例えば、ｑＰＣＲを使用して）、有効性を判定することができる。例えば、肺組織由来のＩＬ−１０ ｍＲＮＡのレベルをｑＰＣＲによってアッセイして有効性を判定することができる。別の例では、サイトカインレベル；流体中の他の炎症マーカー（例えば、気管支肺胞洗浄によって得られる）；浮腫レベル；血行動態および人工呼吸器の対策；ならびにｅｘ ｖｉｖｏで（再）灌流された肺におけるガス交換の判断に対するインパクトによって、肺における用量を判断してもよい。

様々な実施形態では、細胞／培地は、初期用量で投与され、その後、さらなる投与によって維持される場合がある。細胞は、最初に一方法によって投与され、その後、同じ方法または１つもしくは複数の異なる方法によって投与される場合がある。レベルは、細胞／培地の進行している投与によって維持され得る。様々な実施形態は、静脈内注射により、最初にもしくは対象におけるそのレベルを維持するために、またはその両方のいずれかで細胞を投与する。様々な実施形態では、他の形態の投与が、臓器のタイプおよび条件、ならびに本明細書の他の箇所で論じられる他の因子に応じて使用される。

細胞／培地は、広範囲の時間にわたって多くの頻度で投与され得る。一般に、処置の長さは、収集および取り扱いプロセスの長さ、適用されている療法の有効性、ならびに処置されている臓器の条件および応答に比例する。

他の実施形態では、細胞は、臓器摘出の前にドナー対象に投与され得る（例えば、静脈内、動脈内、気管内、直接注射などによって）。投与経路に応じて、細胞は、適当な時間（例えば、数分〜約１〜４時間、約４〜８時間、約８〜１２時間、約１２〜１６時間、約１６〜２０時間、約２０〜２４時間）にわたって投与され得る。臓器は、慣例的な外科的技法（複数可）によって、その時間後に摘出することができる。摘出後、細胞は、細胞を臓器全体にわたって分布させるのに十分な時間（例えば、約１時間未満、約１〜２時間、約２〜３時間、約３〜４時間）にわたって臓器と接触させられる（例えば、直ちに接触させられる）。細胞は、注入および／または細胞を含有する浴中への臓器の液浸によって臓器と接触させることができる。次に、臓器を氷上で貯蔵し、かつ／または再灌流システムに取り付けることができ、その後、臓器は、移植部位に送達される。

移植現場に到着した後、臓器を、細胞を含有する再灌流システム上に配置することができる（これが既にそのように行われていない場合）。次いで臓器に、臓器および再灌流システムに応じてある時間（例えば、約１時間未満、約１〜２時間、約２〜３時間、約３〜４時間）にわたって細胞を注入することができる。移植中、レシピエントへの注入（例えば、静脈内）、臓器内への直接注射、および／または臓器の表面への直接塗布によって、細胞を臓器と接触させることができる。注入は、例えば、臓器を出入りする血管（複数可）を閉鎖する前に行われ得る。例えば、肝移植中、移植される肝臓に静脈を取り付ける前に、細胞を肝門静脈中に注入してもよい。追加的にまたは代替として、移植後（例えば、臓器を出入りする血管（複数可）を閉鎖した後）、送達システムおよび臓器に応じて適当な時間（例えば、数分〜約１〜４時間、約４〜８時間、約８〜１２時間、約１２〜１６時間、約１６〜２０時間、約２０〜２４時間）にわたって、細胞を臓器に送達することができる。

組成物
本発明は、本明細書に記載の効果のいずれかを実現する特定の効力を有する細胞集団も対象とする。上述したように、これらの集団は、所望の効力を有する細胞を選択することによって確立される。これらの集団は、他の組成物、例えば、特定の所望の効力を有する集団を含む細胞バンク、および特定の所望の効力を有する細胞集団を含有する医薬組成物を作製するのに使用される。

方法
肺の摘出およびｅｘ ｖｉｖｏ灌流
地元の臓器調達機関、ＬｉｆｅＧｉｆｔによって得られた研究の同意の後、Ｈｏｕｓｔｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｉｓｔの確立されたＩＲＢプロトコール（ＩＲＢ（２）１１１１−０２０５）の下で、処分された寄贈された肺を本試験のために調達した。５人の患者のそれぞれからの肺を、肺静脈を通じた順行性Ｐｅｒｆａｄｅｘ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ ＡＢ、Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ、スウェーデン）６０ｍｌ／Ｋｇフラッシュと逆行性Ｐｅｒｆａｄｅｘ灌流を用いた標準的な様式で調達した。次いで肺を、Ｐｅｒｆａｄｅｘ １リットルを含有するビニール袋中で貯蔵し、輸送中、氷上で保持した。肺がＨｏｕｓｔｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｉｓｔに到着した後、次いでこれらを、冷虚血性傷害を誘導するために４℃の冷蔵庫内で合計８時間にわたって低温静的貯蔵で貯蔵した。

ｅｘ ｖｉｖｏ肺灌流（ＥＶＬＰ）を、ＣＥマーク付きＶｉｖｏｌｉｎｅ ＬＳ１（Ｖｉｖｏｌｉｎｅ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＢ、Ｌｕｎｄ、スウェーデン）を用いて実施した（図１）（Wierup, P.ら、Ann Thorac Surg、２００６年；８１巻（２号）：４６０〜６頁；Ingemansson, R.ら、Ann Thorac Surg、２００９年；８７巻（１号）：２５５〜６０頁；およびCypel, M.ら、N Engl J Med、２０１１年；３６４巻（１５号）：１４３１〜４０頁）。システムにＳｔｅｅｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＸＶＩＶＯ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）２．５Ｌを入れた。実現可能性調査における変数の数を減らすために、洗浄された赤血球または血液の使用を回避した。メロペネム１００ｍｇ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ＡＢ、Ｓｏｄｅｒｔａｌｊｅ、スウェーデン）およびヘパリン（ＬＥＯ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）１０，０００Ｕを灌流液に添加した。肺をＥＶＬＰユニットに接続する前に、溶液のｐＨを、トロメタモール（Ａｄｄｅｘ−ＴＨＡＭ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用して７．３５から７．４５の間に補正した。心臓も同様に調達した１つの場合では、肺動脈（ＰＡ）の完全性を再構成し、肺のＥＶＬＰサーキットへの接続を容易にするために、ダクロングラフトを分かれた肺動脈枝に縫合した。気管を、気管の直径にサイズ整合しているシリコーンチューブを介して人工呼吸器に接続した。温度プローブを左心房内部に置いた。最初に、サーキットを脱気するために、肺を０．５Ｌ／分の流量で灌流した。流入カニューレ上の脱気用シャントを、臓器が３２℃に到達するまで開いて保持し、次いでセッションの残りについて閉じた。次いで、特定のセットの肺について推定心拍出量の１００％まで流れを増大させた。次いで肺を、３６℃の目標まで３０分にわたって加温し、肺血液の流入と流出との間の温度差が８℃を超えないようにした。次いで流量を、ドナー体重１キログラム当たり７０ｍＬ／分の目標レベルまで徐々に増大させ、その間、ＰＡ圧力を連続的に測定し、１５ｍｍＨｇに制限した。再加温は、２０〜３０分以内に実現された。灌流液温が３２℃に到達したとき、人工呼吸を、５ｃｍ Ｈ_２Ｏの呼吸終末陽圧（ＰＥＥＰ）レベル、７〜１０呼吸／分の速度、および０．５のＦｉＯ_２とともに、ドナー体重１キログラム当たり３ｍｌの初期一回呼吸量で、体積コントロールモードでスタートさせた。次いで一回呼吸量を、最大でドナー体重１キログラム当たり７ｍＬまで徐々に増大させた。血液ガス分析用の灌流液試料を、システムの専用ポートから抜き取った。

細胞
ヒト骨髄由来ＭＡＰＣ（Ｈｕｍａｎ ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ（登録商標）、Ａｔｈｅｒｓｙｓ Ｉｎｃ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）を、健康なドナーから同意を得た単一の骨髄穿刺液から単離し、以前に記載された方法（Penn, MSら、Circ Res、２０１２年；１１０巻（２号）：３０４〜１１頁；Maziarz, RTら、Biology of Blood and Marrow Transplantation、２０１２年；１８巻（補遺２）：Ｓ２６４〜Ｓ２６５頁；ならびにｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＃ＮＣＴ０１４３６４８７、＃ＮＣＴ０１２４０９１５、および＃ＮＣＴ０１８４１６３２）によって処理した。簡単に説明すると、ＭＡＰＣを、５％ＣＯ_２の加湿した大気中低酸素圧下で、フィブロネクチン被覆プラスチック組織培養フラスコ内で培養した。ＭＡＰＣ培地（ＦＢＳ（Ａｔｌａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）、ＩＴＳ液体培地サプリメント［Ｓｉｇｍａ］、ＭＣＤＢ［Ｓｉｇｍａ］、血小板由来増殖因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、上皮増殖因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、デキサメタゾン［Ｓｉｇｍａ］、ペニシリン／ストレプトマイシン［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］、２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、およびリノール酸−アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を補充した低グルコースＤＭＥＭ［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）中で細胞を培養した。細胞を３〜４日毎に継代させ、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して摘出した。細胞は、ＣＤ４９ｃおよびＣＤ９０に対して陽性であり、ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ４５に対して陰性であった（すべてのＡｂは、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ製であった）。細胞を、１ｍｌ中１〜１０×１０^６の濃度で（ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、５％ ＨＳＡおよび１０％ ＤＭＳＯ）、液体窒素の気相中で、クライオバイアル内で３０〜３５の集団倍加時に、引き続いて凍結させた。これらを使用する直前に、ＭＡＰＣを解凍し、直接使用した。

細胞接種、肺インキュベーション、ならびに気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液および組織分析
心房内プローブによって測定される温度がおよそ３２℃に到達したとき、ＭｕｌｔｉＳｔｅｍ １ｍｌバイアルを解凍し、滅菌生理食塩水１９ｍｌ中に希釈し、ＬＬＬ気管支の近位部分中に気管支鏡によって投与した。同様の体積のビヒクル（滅菌生理食塩水２０ｍｌ）をＲＬＬ気管支の近位部分中に同様に接種した。ＭｕｌｔｉＳｔｅｍを送達して５分後に、肺をＨａｍｉｌｔｏｎ−Ｃ２人工呼吸器に接続した。Ｖｉｖｏｌｉｎｅシステムで灌流して２または４時間後に、実験を停止した。灌流を停止する５分前に、細胞またはビヒクルを以前に接種されたＲＬＬおよびＬＬＬの同じサブセグメントを生理食塩水６０ｍＬで洗浄した。次いで、回収したＢＡＬ液を、合計細胞数および細胞分画（cell differential）を評価するために生のＢＡＬ液のアリコートに分離し、または遠心分離し（４℃で１２００ｇ×１０分）、上清を別個のチューブ中に収集し、スナップ凍結させ、−７０℃で貯蔵した（Lathrop, MJら、Stem Cells Translational Medicine（近刊）；およびGoodwin, M.ら、Stem Cells、２０１１年：２９巻（７号）：１１３７〜４８頁）。１つの肺については、ＢＡＬ液試料を、呼吸をスタートする前、ＭＳＣまたはビヒクルを送達する直前の再加温フェーズ中にも得た。

合計ＢＡＬ液細胞数を、ＡＤＶＩＡ（登録商標）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｉｔｙ、ＴＮ）を使用して判定した。予め浄化し、予め処置されたガラススライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）上で、８００ｒｐｍで８分間遠心分離し、一晩乾燥させ、ＤｉｆｆＱｕｉｃｋ（Ｈｅｍａ３ Ｓｔａｉｎ Ｓｅｔ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して染色した５×１０^４個の細胞を使用してサイトスピンを行った。３人の別個の個体によって実施された２００細胞の盲検手動計数によって細胞集団を判定した（Lathrop, MJら、Stem Cells Translational Medicine（近刊）；およびGoodwin, M.ら、Stem Cells、２０１１年：２９巻（７頁）：１１３７〜４８頁）。不希釈ＢＡＬ液中のタンパク質含量は、ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって評価した。Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｒｒａｙ Ｋｉｔ， Ｐａｎｅｌ Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して、可溶性サイトカイン、ケモカイン、およびＣ５／Ｃａ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５４、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇｒｏ−１α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１６、ＩＬ−２３、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＭＣＰ−１、ＭＩＦ、ＰＡＩ−１、ＲＡＮＥＳ、セルピンＥ１、ｓＩＣＡＭ、ｓＴＲＥＭ−１、ＴＮＦαを含めた他の物質についてＢＡＬ液上清を検査し、サイトカインの相対量をＵＶＰ Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ）で判定した内部対照と比較した。他の特定のサイトカインのＥｌｉｓａを、製造者の指示、ＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ番号：Ｄ１０００Ｂ）、ならびにＳＴＣ１、ＴＳＧ−６、およびｉＮＯＳ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号：ＭＢＳ９４６２５５、ＭＢＳ９２６７９３、ＭＢＳ７２３６１７）によって実施した。

組織学的評価
灌流期間の最後のＢＡＬの後、１０％ホルマリンを用いて室温で１時間、肺を引き続いて重力固定した。固定された肺を解剖し、細胞が滴下注入された範囲を、パラフィン固定の前に１０％ホルマリン中で貯蔵した。次いで、マウントした５μｍ切片を組織学的外観について判断した。以前に記載されたように０〜３の範囲および０．５のスケール増分を使用する確立された半定量的スコアシステムを使用して、公知の陽性および陰性対照と比較した気管支周囲細胞浸潤の存在および強度に基づいて、３人の個体によって盲検様式で動物１匹当たり１０個の気道に対して肺炎症をスコア付けした（Lathrop, MJら、Stem Cells Translational Medicine（近刊）；およびGoodwin, M.ら、Stem Cells、２０１１年：２９巻（７号）：１１３７〜４８頁）。

組織炎症マーカーのｑＰＣＲ分析
肺２〜５からの肺生検試料を、細胞またはビヒクルを注入する直前に、細胞またはビヒクルを注入して２および４時間後に、かつ実験の最後に、ＬＬＬおよびＲＬＬの周辺から自動ステープラー（Ｃｏｖｉｄｉｅｎ ＧＩＡ（商標）ＤＳＴ Ｓｅｒｉｅｓ（商標）８０ｍｍ）を使用して得た。試料をスナップ凍結させ、引き続いてホモジナイズし、炎症性サイトカインｍＲＮＡの発現レベルをｑＰＣＲによって判定した（以下の詳細を参照）。

試料をＲＮＡ溶解緩衝液中でホモジナイズし、製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を使用してＲＮＡを抽出した。追加のＤＮａｓｅ処置を、ＤＮＡフリーキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して実施した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって測定し、ＲＮＡ １μｇをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して逆転写し、その後、ＲＮａｃｅ−ｉｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用してＲＮＡｓｅ処置した。逆転写酵素陰性試料および水を、対照としてランさせた。ｃＤＮＡ ５μｌをＳＹＢＲグリーン（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびプライマー（ＩＤＴ）と混合し、ＡＢＩ ７５００ ＦＡＳＴシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）でランさせた。試料をＧＡＰＤＨに対して正規化し、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）のパーセント＋／−標準偏差として表現した。

プライマー配列は、以下の通りであった。

ＶＥＧＦＡ−Ｆ１（配列番号１）；

ＶＥＧＦＡ−Ｒ１（配列番号２）；

ＩＧＦ１−Ｆ４（配列番号３）；

ＩＧＦ１−Ｒ４（配列番号４）；

ＥＧＦ−Ｆ１（配列番号５）；

ＥＧＦ−Ｒ１（配列番号６）；

ＩＬ−１０−Ｆ２（配列番号７）；

ＩＬ−１０−Ｒ２（配列番号８）；

ＦＧＦ２−Ｆ１（配列番号９）；

ＦＧＦ２−Ｒ１（配列番号１０）；

ＨＧＦ−Ｆ１（配列番号１１）；

ＨＧＦ−Ｒ１（配列番号１２）；

ＣＣＬ５−Ｆ１（配列番号１３）；

ＣＣＬ５−Ｒ１（配列番号１４）；

ＴＧＦＢ１−Ｆ１（配列番号１５）；

ＴＧＦＢ１−Ｒ１（配列番号１６）

ＣＸＣＬ１０−Ｆ１（配列番号１７）；

ＣＸＣＬ１０−Ｒ１（配列番号１８）；

ＮＯＳ３−Ｆ２（配列番号１９）；

ＮＯＳ３−Ｒ２（配列番号２０）；

ＳＴＣ１−Ｆ１（配列番号２１）；

ＳＴＣ１−Ｒ１（配列番号２２）；

ＧＡＰＤＨ−Ｆ１（配列番号２３）；

ＧＡＰＤＨ−Ｒ１（配列番号２４）；

ＡＮＧＰＴ１−Ｆ２（配列番号２５）；

ＡＮＧＰＴ１−Ｒ２（配列番号２６）；

ＮＯＳ２−Ｆ１（配列番号２７）；

ＮＯＳ２−Ｒ１（配列番号２８）；

ＴＮＦＡＩＰ６−Ｆ１（配列番号２９）；

ＴＮＦＡＩＰ６−Ｒ１（配列番号３０）；

ＦＧＦ７−Ｆ１（配列番号３１）；および

ＦＧＦ７−Ｒ１（配列番号３２）。

統計分析
Ｆｉｓｈｅｒｓ ＬＳＤポストテストを用いて一元もしくは二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、または必要に応じて不等分散についてのウェルチ補正を使用して、スチューデントＴ検定によって２つの群間で直接分析することによって群を比較した（Lathrop, MJら、Stem Cells Translational Medicine（近刊）；およびGoodwin, M.ら、Stem Cells、２０１１年：２９巻（７号）：１１３７〜４８頁）。

結果
ドナー肺の該当する臨床的特徴を表１に要約する。

ドナー年齢は、４４〜６６歳の範囲であり、５つのドナー肺のうち３つは、壊滅的な神経学的イベントを有する患者から得、１つは窒息から得、１つは自動車事故から得た。５つの肺のうち４つは、１０ｍｍＨｇの±ＰＥＥＰで、１００％ ＦｉＯ_２で１８４．７５ｍｍＨｇの平均を伴った低ＰａＯ_２値を含む芳しくない機能状態のために移植に適していないと見なされた。これらの肺は、挫傷、著しい気腫、または手術室での動員操作に応答しなかった大葉の崩壊を様々に含む、放射線透過写真術による異常も有していた。これらの肺のそれぞれは、放射線透過写真術による肺水腫の徴候も有し、外科的取り出し後に、２つが胸水も有し、すべてが様々に浮腫状であると認められた。肺＃５は、ＣＸＲでＲＬＬ崩壊を有していたが、取り出しおよび粘液栓の気管支鏡除去の後に拡張した。１つの肺（肺＃４）は、正常な外観、明確なＣＸＲ、および５ｍｍＨｇ ＰＥＥＰに対して良好な酸素供給を伴って、寄贈するのに生理学的に適していたが、小さい表面結節の存在に起因して利用されず、これらの結節は生検で良性であることが引き続いて判明した。

各肺に利用したプロトコールの概要を、表２に、かつまた図１に概略的形態で提示する。

全体的に、肺は、同様の低温貯蔵（８時間）および再加温（２５＋２．２分）時間、ならびに引き続いて、細胞またはビヒクルの気管支鏡投与後に同様の再灌流時間（３．７±０．６時間）を有していた。再灌流期間の最後に、各肺中に発生していたある程度のさらなる浮腫があり、肺番号４は、新しく発生したある程度の浮腫も有していた。しかし、全体的に、肺＃４でより少ない用量のＭＡＰＣを利用しても、ビヒクル処置（ＲＬＬ）葉に対してＭＳＣ処理（ＬＬＬ）葉において目に見える浮腫および炎症はより少なかった。代表的な画像を図２に示す。

再灌流期間の最後における肺の組織学的評価は、炎症範囲のパッチをＭＡＰＣ処置ＬＬＬのいくつかで見出すことができたが、気管支周囲、血管周囲、および肺胞中隔浮腫の半定量的スコアリング、および炎症細胞浸潤の存在によって評価した場合、５つの肺のうち４つで、かつ５つすべてを平均しても、全体的な炎症は有意により少なかったことを実証した（図３）。代表的な顕微鏡写真を図４に表す。

合計ＢＡＬ液細胞数を、より高い細胞用量を受けている、４つの肺のうち２つ（肺３および５）で得た。両方の場合において、ビヒクル処置ＲＬＬと比較してＭＳＣ処置ＬＬＬにおいて有意な減少があった（図５Ａ）。合計ＢＡＬ液細胞数の減少に向かう傾向は、より少ないＭＳＣ用量を受けている肺においても観察された（肺４、図５Ａ）。５つすべての肺からのＢＡＬ液試料で得られた細胞分画は、ビヒクル処置ＲＬＬにおいて好中球および好酸球の一貫した増大を実証し、これは、ＭＳＣ処置ＬＬＬにおいて寛解された（図５Ｂ）。ＢＡＬ液総タンパク質レベルの測定値は、肺同士間で多様であったが、ビヒクル処置ＲＬＬに対してＭＳＣ処置ＬＬＬにおける総タンパク質の一貫した減少が、５つすべての肺において観察された（図５Ｃ）。

ビヒクル処置ＲＬＬと比較してＭＳＣ処置ＬＬＬにおけるＩＬ−１０のレベルの増大が観察された（図６）。しかし、肺傷害におけるＭＳＣ作用の前臨床モデルおよび他のモデルで関係した他の可溶性抗炎症性メディエーター、例えば、ＩＬ−１ＲＡ、ＳＴＣ、ＴＧＳ−６、およびｉＮＯＳなどは、５つの肺のうちいずれにおいてもＭＳＣ処置ＬＬＬにおいて確実に増大しなかった（図６）。細胞またはビヒクル投与の前、および次いで再灌流期間の２または４時間後に得た生検試料のｑＰＣＲ分析によって、５つの肺のうち４つ（肺２〜５）において組織ｍＲＮＡレベルを評価した。全体的に、組織ｍＲＮＡレベルのパターンは、４つの肺の間でより一貫していた。ＩＬ−１０タンパク質のＢＡＬ液レベルに匹敵して、２時間において評価した場合、ビヒクル処置ＲＬＬにおけるわずか１．６倍の増大と比較して、ＭＳＣ処置ＬＬＬにおいて組織ＩＬ−１０ ｍＲＮＡのレベルの３．５倍の増大があった（図７）。ＲＬＬに対するＬＬＬの同様の増大はまた、Ａｎｇｐｔ１およびＳＴＣ１のｍＲＮＡレベルにおいて、２時間の時点で観察された。興味深いことに、ＬＬＬおよびＲＬＬの両方について、２〜４時間でＴＳＧ６の発現倍率の大きな増大があった。

考察
ドナー肺の生存能を改善し、温または冷虚血性炎症性傷害を減少させるためにいくつかの異なる方法を試験してきた。これらには、順行性および逆行性様式の両方で送達される細胞外特性を伴ったフラッシング溶液、およびドナー肺の輸送で使用するために現在臨床調査下にあるポータブルｅｘ ｖｉｖｏ保存システムの使用が含まれる（Machuca, TNら、Surg Clin North Am、２０１３年；９３巻（６号）：１３７３〜９４頁）。治療的介入の研究の異なる分野は、虚血および再灌流によって誘導される応答を調節することを目的とする。例えば、実験動物モデルは、ＩＬ−１０の遺伝子療法送達（Cypel, M.ら、Sci Transl Med.、２００９年；１巻（４号）：４〜９頁）、ならびにアデノシン受容体活性化（Fernandez, LGら、J Thorac Cardiovasc Surg、２０１３年；１４５巻（６号）：１６５４〜９頁；およびMulloy, DPら、Ann Thorac Surg、２０１３年；９５巻（５号）：１７６２〜７頁）からの有益な効果を示した。しかし、実験データは有望である一方、多くの炎症経路のうちの１つを調節することにより、先天性免疫および適応免疫、補体カスケードの活性化、内皮機能不全、ならびに細胞死の誘因のような、関与するいくつかの細胞機構を変更する現象を制御することができるという見込みはない。対照的に、骨髄由来ＭＳＣおよびＭＡＰＣは、虚血／再灌流傷害に関与する複数の炎症経路に作用するユニークな潜在性を有する。

ｅｘ ｖｉｖｏ肺灌流（ＥＶＬＰ）は、心臓死後の寄贈（ＤＣＤ）および他の許容されないドナー肺からの肺の品質を評価する方法として最初に設計された（Wierup, P.ら、Ann Thorac Surg、２００６年；８１巻（２号）：４６０〜６頁；およびIngemansson, R.ら、Ann Thorac Surg、２００９年；８７巻（１号）：２５５〜６０頁）。この技法は、現在の基準下で移植に適していると見なされない潜在的なドナー肺の評価および再コンディショニングのために現在臨床試験下にある（Cypel, M.ら、N Engl J Med、２０１１年；３６４巻（１５号）：１４３１〜４０頁）。ＥＶＬＰは、着床前に気管内または血管内経路によってドナー肺中に直接ＭＳＣまたはＭＡＰＣを投与する機会をさらに提供する。この手法を使用して、本発明者らは、各個体の肺内の効果を直接評価するために比較として反対側の肺を用いた単一の葉内への直接の気道ＭＡＰＣ投与を最初に評価することを選択した。低温虚血性貯蔵（８時間の合計低温貯蔵）を、肺について一般に許容される実際の時間を越えて延長して、発生し得る任意のＩＲＩを強化し、したがってＭＳＣの潜在的な抗炎症作用を最大化した。本発明者らは、実現可能性の証明として「在庫のある」非ＨＬＡマッチＭＡＰＣを使用することも選択した。さらに、本発明者らは、ＭＡＰＣの一貫した、かつ強力な抗炎症作用を実証する。とりわけ、サイトカインプロファイルの変化、特にＩＬ−１０の増大は、ＩＲＩにとって特に有益であり得る。

本発明の上記記載から、当業者は、改善、変更、および改変を認識することになる。このような改善、変更、および改変は、当業者の技術の範囲内であり、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図されている。本明細書に引用したすべての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により組み込まれている。

Claims (19)

1. 外来性幹細胞に曝露された臓器を移植するステップを含む方法。
2. 前記臓器が、レシピエントに移植される前に前記幹細胞に曝露される、請求項１に記載の方法。
3. 前記臓器が、レシピエントへの移植中に前記幹細胞に曝露される、請求項１に記載の方法。
4. 前記臓器が、レシピエントに移植された後に前記幹細胞に曝露される、請求項１に記載の方法。
5. 前記幹細胞が、ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、もしくはｒｏｘ−１の１種もしくは複数を発現し、かつ／または内胚葉性胚葉、外胚葉性胚葉、および中胚葉性胚葉の少なくとも２種の細胞型に分化し得る非胚非生殖細胞である、請求項１に記載の方法。
6. 前記幹細胞が、ｏｃｔ４、テロメラーゼ、ｒｅｘ−１、もしくはｒｏｘ−１の１種もしくは複数を発現し、かつ／または内胚葉性胚葉、外胚葉性胚葉、および中胚葉性胚葉の細胞型に分化し得る非胚非生殖細胞である、請求項１に記載の方法。
7. 前記幹細胞が、非ＨＬＡマッチ同種異系細胞である、請求項５または６に記載の方法。
8. 前記幹細胞が、間葉系間質（幹）細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、始原胚性生殖細胞、規定された前駆細胞、造血幹細胞、脂肪由来成体幹細胞、卵形細胞、臍帯血幹細胞、胎盤幹細胞、小胚様幹細胞、羊水幹細胞、皮膚由来前駆体幹細胞、および骨髄由来幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
9. 前記幹細胞が、少なくとも１０〜４０回の細胞倍加を起こしている、請求項１に記載の方法。
10. 前記幹細胞が、少なくとも３０〜３５回の細胞倍加を起こしている、請求項９に記載の方法。
11. 前記臓器に曝露される幹細胞の濃度が、約１×１０^６細胞／ｍｌ〜約１０×１０^６細胞／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
12. 前記幹細胞が、約２〜４時間にわたって前記臓器に曝露される、請求項１に記載の方法。
13. 前記幹細胞が、前記臓器中への灌流用流体中、または臓器内投与用担体中に含有されている、請求項１に記載の方法。
14. 前記幹細胞が、前記臓器が移植前に浸される培地中に含有されている、請求項１に記載の方法。
15. 前記臓器が、肺、腎臓、心臓、肝臓、膵臓、胸腺、胃腸管、および複合同種移植片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
16. 前記幹細胞への曝露により、前記臓器の炎症が低減される、請求項１に記載の方法。
17. 前記幹細胞への曝露により、前記臓器内の炎症細胞の出現が低減される、請求項１に記載の方法。
18. 前記幹細胞への曝露により、前記臓器内の炎症性サイトカインが低減される、請求項１に記載の方法。
19. 前記幹細胞への曝露により、虚血性再灌流傷害が低減される、請求項１に記載の方法。