JP2016514704A - 持続する局所麻酔のためのネオサキシトキシン併用製剤 - Google Patents

Abstract

サイトＩナトリウムチャネルブロッカーの各々は、特有の活性を有し、別のサイトＩナトリウムチャネルブロッカーの同じ有効投与量を外挿するために使用され得ないので、ネオサキシトキシン（「ＮｅｏＳＴＸ」）およびブピバカインの投与量を、単独で、またはエピネフリンとの併用で同定して、ヒトにおける疼痛緩和を２〜３日提供するために研究を行った。ブピバカイン−ＮｅｏＳＴＸ併用は、ＮｅｏＳＴＸのみと比較して、より信頼性の高いブロックおよびより長い持続ブロックを生じる。ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリンの３成分併用は、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインの２成分併用より長い局所麻酔を生じる。このＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用にエピネフリンを追加すると、機械的刺激に対する完全なブロックの持続時間が劇的に長くなる。これら結果は、特定の併用投与製剤の開発をもたらした。

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｎｅｏｓａｘｉｔｏｘｉｎ ｗｉｔｈ Ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ ａｎｄ Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｒｖｅ Ｂｌｏｃｋ ａｎｄ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｌｏｃａｌ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ａｎｄ Ａｎａｌｇｅｓｉａ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ」という名称の米国特許第６１／７８９，０５４号（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｂｅｒｄｅ）の優先権を主張し、当該出願の教示は本明細書に参考として援用される。

（発明の分野）
これは、一般に、毒性の増大がない、改善された神経ブロックおよび局所浸潤麻酔ならびに痛覚脱失、具体的には、特定の全投与量および濃度投与量において、単独で、またはエピネフリンとの併用におけるネオサキシトキシンとブピバカインとの併用にある。

（発明の背景）
６〜１２時間の手術グレードの神経ブロック、続いて、最大約４８時間までのレーザーブロックおよびさらなる処置なしの疼痛緩和を信頼性高く与える非徐放性薬剤は、望ましい。前者の期間は、術中に、同様に手術直後期間にも有用である；後者は、減少しつつある痛覚脱失を提供し、治癒プロセスとして、関わった身体部分の使用の増大を可能にする。Ｅｘｐａｒｅｌ^ＴＭ（市場に出ている唯一の長時間持続局所麻酔薬）は、注射後２４時間でピークに達する、ヒトにおける予測外の神経ブロックを提供し、その麻酔効果は、用量に逆比例する。さらに、それは、徐放系の使用を必然的に伴い、局所組織傷害および炎症を引き起こす。

類似の懸念は、ブピバカイン＋デキサメタゾン微粒子に関し、これは、徐放系および非常に重篤な組織傷害を伴うにも拘わらず、長時間持続局所麻酔を提供し得る。四級リドカイン誘導体ＱＸ−３１４は、長時間持続局所麻酔（約２４時間の持続時間）を提供し得るが、非常に重症の局所組織傷害および全身毒性を伴う。

アミノ−アミドおよびアミノ−エステル局所麻酔薬が過剰用量でもしくは不注意の血管内注射によって与えられる場合、それらは、悪評判があるように、蘇生しがたい心血管毒性を生じる（Ｐｏｌａｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｅｄ Ａｎｅｓ ２０１１；２１：７３７−７４２； Ｆｉｓｈｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎ． Ｊ． Ａｎａｅｓｔｈ．， １９９７； ４４： ５９２−５９８； Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ， Ｒｅｇ． Ａｎｅｓｔｈ． Ｐａｉｎ Ｍｅｄ．， ２０１０；３５：１６７−７６）。ブピバカインの心血管毒性は、おそらく、サイト１ナトリウムチャネルブロッカーによる結合および不活性化に比較的よく抵抗する心臓ナトリウムチャネルＮａｖ１．５によって媒介される（Ｃｌａｒｋｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， １９８５；６２：３９６−４０５）。

藻類毒素であるネオサキシトキシン、サキシトキシンおよびゴニオトキシン（ｇｏｎｙａｕｌａｔｏｘｉｎ）は、属Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｉｒｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．、およびＧｉｍｎｏｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．の有害藻類異常発生によって生じる活性化合物である（Ｌａｇｏｓ， Ｎ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ．， ３１： ３７５−３８６ １９９８））。この１５年で、これら藻類毒素はまた、海洋性渦鞭毛藻によって生成されるものの他に、光合成藍藻類のような淡水性シアノバクテリアによって生成され得ることが実証された。

麻痺性の藻類毒素を生成し得るシアノバクテリアのわずか４属が同定され、各々は、生成される藻類毒素の量およびタイプの両方において、藻類毒素の種々の混合物を生成する。すなわち、それらは、麻痺性の藻類毒素の種々のプロフィールを生じる（Ｌａｇｏｓ， ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＴＯＸＩＣＯＮ， ３７： １３５９ − １３７３ （１９９９）． Ｐｅｒｅｉｒａ， ｅｔ ａｌ．， ＴＯＸＩＣＯＮ， ３８： １６８９ − １７０２ （２０００）。

これら藻類毒素の化学構造は、一般構造（Ｉ）を有し、その特定の構造は、以下の表に従って置換基Ｒ１〜Ｒ５によって規定される：

これら麻痺性の藻類毒素は、興奮性細胞に存在する電位依存性ナトリウムチャネルの特異的ブロッカーとして作用する（Ｋａｏ， Ｃ．Ｙ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｖ．， １８： ９９７−１０４９ （１９６６））。ナトリウムチャネルの阻害に起因して、神経インパルスの伝達がブロックされ、神経伝達物質の放出が神経筋接合部（ｎｅｕｒｏｍｏｔｏｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）のレベルで妨げられ、よって筋収縮を妨げる。これら生理学的効果に起因して、これら化合物は、注射用形態で局所適用される場合に、筋肉の過活動（例えば、筋痙攣および限局性ジストニア）と関連する病状において筋活動インヒビターとして使用される場合、薬理学において潜在的に有用である。さらに、伝達レベルでの神経インパルスのブロックは、これら化合物が局所浸潤として適用される場合に生成されるので、それらは、遠心性神経伝達経路をブロックし得るのみならず、求心性経路をブロックし得、感覚経路の阻害を引き起こし得、これら化合物が局所注射される場合に麻酔効果をも生じ得る。これは、驚くべき効果である。なぜなら米国特許第４，００１，４１３号に記載されるように、両方の効果が同時であるからである。

Ｋｏｈａｎｅ， ｅｔ ａｌ．による米国特許第６，３２６，０２０号に記載されるように、天然に存在するサイト１ナトリウムチャネルブロッカー（例えば、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、サキシトキシン（ＳＴＸ）、デカルバモイルサキシトキシン、およびネオサキシトキシン）と他の薬剤との併用は、安全性および特異性を含め、改善された特徴を有する長時間持続ブロックを与えるために開発された。一実施形態において、ブロックの持続は、トキシンと、局所麻酔薬、血管収縮薬、グルココルチコイド、および／もしくはアドレナリン作動薬（αアゴニスト（エピネフリン、フェニレフリン）、および中枢−末梢混合性α−２アゴニスト（ｍｉｘｅｄ ｃｅｎｔｒａｌ−ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｌｐｈａ−２ ａｇｏｎｉｓｔ）（クロニジン）の両方）、または他の薬剤とを併用することによって大いに長期化される。長期間神経ブロックは、トキシンとバニロイドとの併用を使用して得られ得る。テトロドトキシンおよびサキシトキシンでの研究に基づいた投与量範囲が提供された。しかし、有効投与量を推定するために、各トキシンで研究を行われなければならないことは、いまや知られている。なぜならトキシンのあるタイプの投与量は、トキシンの別のタイプでの効力の推定にはならないからである。以下の実施例で実証されるように、ラットもしくはヒツジからヒトに外挿して、これら毒素に関する安全性および効果的な投与量を決定できないこともまた、発見された。

従来の局所麻酔薬は、臨床用量での局所神経毒性および過剰用量での顕著な心血管毒性と関連づけられる。全体的な発生率は低いものの、アミド麻酔薬での局所および局部麻酔の合併症として、長期の無感覚および感覚異常もまた、研究で明らかになった。これは、化学的神経傷害の組織学的徴候と関連づけられた（Ｍｙｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， １９８６；６４：２９−３５； Ｋａｌｉｃｈｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｅｘｐｅｒ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １９８９； ２５０（１）：４０６−４１３）。局所神経毒性のこれらリスクは、おそらく、長期の疼痛緩和が放出制御送達（Ｐａｄｅｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， ２００８； １０８： ９２１−８； Ｋｏｈａｎｅ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， ２０１０； １： ４４１−４４６）もしくは局所的な末梢注入（特に、より高濃度もしくは高用量がより長期間にわたって使用される場合）による従来の局所麻酔薬の投与を介して試みられる状況でさらに増大することになる。等しい効力をもった鞘内注射された用量では、サイト１ナトリウムチャネルブロッカーは、ブピバカインと比較して、神経毒性の組織学的証拠が少ないより長時間持続の麻酔を引き起こす（Ｓａｋｕｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈ． Ａｎａｌｇ．， １９９５；８１：３３８−４６）。全体として、サイト１ナトリウムチャネルブロッカーを伴う長期間の局所麻酔へのアプローチは、従来のアミノ−アミドもしくはアミノ−エステルの長期投与もしくは反復投与を伴うアプローチと比較して、神経傷害のリスクを減らす。

従って、本発明の目的は、ネオサキシトキシンとブピバカインとの、必要に応じて、エピネフリンとの特定の併用を提供して、１回の注射後に最大２〜３日の間、ヒトにおいて安全かつ有効な疼痛緩和を提供することである。

本発明のさらなる目的は、小児患者において安全かつ有効な局所麻酔および痛覚脱失を提供するための製剤を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、高体積、中間体積および低体積の局所麻酔を要する適応症を処置するための製剤を提供することである。

本発明のさらなる目的は、局所麻酔に起因する感覚ブロックもしくは運動ブロックからの種々の速度での回復を要する適応症を処置するための製剤を提供することである。

米国特許第４，００１，４１３号明細書 米国特許第６，３２６，０２０号明細書

Ｐｏｌａｎｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｅｄ Ａｎｅｓ ２０１１；２１：７３７−７４２ Ｆｉｓｈｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎ． Ｊ． Ａｎａｅｓｔｈ．， １９９７；４４：５９２−５９８ Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ， Ｒｅｇ． Ａｎｅｓｔｈ． Ｐａｉｎ Ｍｅｄ．， ２０１０；３５：１６７−７６ Ｃｌａｒｋｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， １９８５；６２：３９６−４０５ Ｌａｇｏｓ， Ｎ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ．， ３１： ３７５−３８６ １９９８ Ｌａｇｏｓ， ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＴＯＸＩＣＯＮ， ３７： １３５９ − １３７３ （１９９９） Ｐｅｒｅｉｒａ， ｅｔ ａｌ．， ＴＯＸＩＣＯＮ， ３８： １６８９ − １７０２ （２０００） Ｋａｏ， Ｃ．Ｙ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｖ．， １８： ９９７−１０４９ （１９６６） Ｍｙｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， １９８６；６４：２９−３５ Ｋａｌｉｃｈｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｅｘｐｅｒ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １９８９； ２５０（１）：４０６−４１３ Ｐａｄｅｒａ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， ２００８； １０８： ９２１−８ Ｋｏｈａｎｅ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， ２０１０； １： ４４１−４４６ Ｋｏｈａｎｅ ａｎｄ Ｌａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， ２０１０； １： ４４１−４４６

（発明の要旨）
ネオサキシトキシン（「ＮｅｏＳＴＸ」）およびブピバカインの投与量を、単独で、またはエピネフリンとの併用において同定して、最大２〜３日の間の疼痛緩和を提供するために研究を行った。ラットにおける坐骨神経の経皮的ブロックを使用する研究は、１）ブピバカイン−ＮｅｏＳＴＸ併用は、ＮｅｏＳＴＸ単独と比較して、全身毒性を増大させない；２）ブピバカイン−ＮｅｏＳＴＸ併用は、ＮｅｏＳＴＸ単独と比較して、より信頼性の高いブロックおよびより長時間持続のブロックを生じる；および３）ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリンの３成分併用は、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインの２成分併用より長期間の局所麻酔を生じることを実証した。エピネフリンをこのＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用に追加すると、機械的刺激に対する完全なブロックの持続が劇的に長期化される。

ラットおよびヒツジの両方における研究から、ＮｅｏＳＴＸは静脈内注射した場合すら心臓毒性を生じないことが示された。しかし、ヒト（成人もしくは小児、覚醒もしくは覚醒していない）における有効投与量を、ヒトおよび大部分の（ｎｏｓｔ）動物において決定可能な副作用を制限することに起因する動物研究を使用して決定することは不可能である。

これら２成分併用および３成分併用は、相加的相互作用もしくは相乗的相互作用を使用して、効力を増強する一方で、上記併用の毒性効果は、相加的相互作用未満であり、従って、安全性および効力の全体的限界（ｍａｒｇｉｎ）を改善する。効力に対するこれら予測外の効果に基づいて、ラットおよびヒトでの研究において、選択されたブピバカインの濃度０．２％は、標準的な市販のブピバカイン濃度０．２５％、０．５％もしくは０．７５％より低い。

ヒト フェーズ１研究を、ＦＤＡ承認およびＩＲＢ承認をもって医師主導（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ）ＩＮＤの下で行った。上記研究は、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインの併用（単独で、またはエピネフリンとの併用において）は、種々の臨床的適応症に関して種々の比で、標準であるブピバカインと比較して、臨床的に重要な、効力の改善、疼痛緩和の持続および局所麻酔の安全性を提供することを実証した。実証された結果は、以下のとおり：

１．ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン ０．２％併用は、５〜１０ｍｃｇ（濃度０．５〜１ｍｃｇ／ｍｌ）程度の低さのＮｅｏＳＴＸ用量ですら、そしてエピネフリンなしですら、標準であるブピバカインと比較してブロックをおよそ４倍長期化する（図７および図８）。

２．ＮｅｏＳＴＸ単独（すなわち、通常生理食塩水中に溶解）は、耐用量において無効でありかつ矛盾するので、ヒトデータは、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用の必要条件を強く裏付ける（図７および図８）

３．エピネフリンは、全身症状を低下させ、よって、安全性の限界を拡げ、覚めにくいブロック（手術時麻酔に適している）の持続を長期化し、麻酔持続をさらに長期化する（例えば、４８時間〜７２時間）（図８）。これは、股関節および膝関節手術（１００ｍｌ超が慣用的である）および大きな腹部手術の創部浸潤に非常に広く使用されるようになってきた高体積適用での投与を可能にする。

４．副作用（刺痛、嘔吐、悪心）は、覚醒した患者においてＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインの耐用量を４０ｍｃｇ未満のＮｅｏＳＴＸへと制限するが、全身麻酔下の患者ではより高用量が安全なはずである。これら制限する副作用がＮｅｏＳＴＸ−生理食塩水およびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインで認められるが、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリンでは認められないことに注意すること。

特定の臨床状況において安全性、寛容性および効力を改善する成分の具体的体積および濃度は、いまは同定されている。これら発見から、以下の併用投与量製剤を開発する研究が行われた：

成人では３５〜１２０ｍｌおよび小児では０．５〜１．８ｍｌ／ｋｇの高体積使用のための投与量製剤は、活性薬剤として、０．１％（１ｍｇ／ｍｌ）〜０．２５％（２．５ｍｇ／ｍｌ）の間の濃度範囲にあり、成人では２２５ｍｇ以下もしくは小児では２．５ｍｇ／ｋｇ以下の全身ブピバカイン用量を与えるブピバカイン；０．１ｍｃｇ／ｍｌ〜１ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、成人では３．５〜１００ｍｃｇもしくは小児では０．０５〜１．５ｍｃｇ／ｋｇの全身用量を与えるＮｅｏＳＴＸ、および２ｍｃｇ／ｍｌ（共通用語で１：５００，０００）〜１０ｍｃｇ／ｍｌ（１：１００，０００）の間の濃度範囲にあるエピネフリンの３成分併用を含む。この製剤の一般的用途は、全開腹術、胸腹部切開、もしくは側腹部切開のための大きな手術創の３層もしくは４層の浸潤のためである。これら手術のうちのいくつかとしては、以下が挙げられる：帝王切開、腹式子宮摘出、食道胃切除、腎摘出、または結腸切除術のような大きな腹部癌手術。全股関節置換（股関節形成）および全膝関節置換（膝関節形成）のための創部浸潤もまた、これら製剤の理想的な用途である。

１５〜５０ｍｌの中間体積使用のための投与量製剤は、活性成分として、０．１２５％〜０．３％（１．２５〜３ｍｇ／ｍｌ）の濃度範囲にあり、成人では１００ｍｇ以下（小児では２ｍｇ／ｋｇ以下）の全身用量を与えるブピバカイン、０．２〜２ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、成人では７〜１５０ｍｃｇ（小児では０．１〜１．５ｍｃｇ／ｋｇ）の全身用量を与えるＮｅｏＳＴＸ、および０〜１０ｍｃｇ／ｍｌ（＜１：１００，０００）の濃度範囲にあるエピネフリンの併用を含む。

中間体積製剤の意図された用途のうちの多くは、末梢神経ブロックもしくは神経叢ブロック（神経周囲注入）、ならびに浸潤（手術創の層に沿った注入）の両方を含む。この製剤の用途は、肩、腕、もしくは手の手術、鼠径ヘルニア修復のための浸潤もしくは腸骨鼠径神経／腸骨下腹神経ブロック、尿道下裂修復のための陰茎ブロック、全膝関節置換もしくは前十字靱帯修復のための大腿神経ブロック、開胸手術のための肋間神経ブロック、または下肢切断のための大腿神経ブロックおよび坐骨神経ブロックを含む。股関節手術に関しては、これは、腰神経叢ブロックおよび低体積坐骨神経ブロックを含み得る。この製剤はまた、関節置換手術用の股関節もしくは膝関節のための神経ブロック（大腿神経および坐骨神経ブロック、腰神経叢および坐骨神経ブロック）のために使用され得る。

これら中間体積用途のうちのいくつか、特に、末梢神経ブロックおよび神経叢ブロックでの用途については、優先順位の高いことは、３つの特徴を提供することである：
ｉ．３〜１２時間の期間の手術の間の麻酔（ほぼ完全な無感覚）
ｉｉ．以下を確保しながら、少なくとも２４時間の期間の術後の痛覚脱失（長期の疼痛緩和）
ｉｉｉ．２４〜４８時間の時間枠で四肢の運動においてある程度の強度を許容するための運動ブロックからの回復

２４〜４８時間の運動ブロックからの回復のための必要条件に基づいて、腕および脚に対して運動効果を有する末梢神経ブロックおよび神経叢ブロックに関しては、エピネフリンなしでＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインを有する製剤は、以下の表に詳述されるように、おそらく理想的である。

低体積、長時間持続のための投与量製剤は、活性成分として、０．２５％〜０．５％（２．５〜５ｍｇ／ｍｌ）の濃度にあり、５〜１５ｍｌ投与が成人では７５ｍｇ以下の全身ブピバカイン用量を与えるブピバカイン、０．５〜５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、５〜１５ｍｌ投与が成人では５〜７５ｍｃｇの全身用量を与えるＮｅｏＳＴＸ、および２．５〜１０ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲（１：５００，０００〜１：１００，０００）にあるエピネフリンの併用を含む。例は、複合性局所疼痛症候群／反射性交感神経性ジストロフィーもしくは脚の血管不全のための腰部交感神経節ブロックまたは膵炎もしくは膵臓癌のための腹腔神経叢ブロックである。

このタイプのブロックを可能な限り長く続かせることは望ましい。なぜなら小体積でＸ線透視ガイダンスを使用して行った場合、感覚ブロックもしくは運動ブロックはほとんどないからである。従って、３成分全ての比較的高濃度は、交感神経ブロックの持続および少なくとも３〜４日間、およびおそらくより長く増大した局所血流を達成するためにこの適用に使用されるべきである。この低体積、長時間持続用途を要し得る他の適用は、下肢切断に関して迅速な運動回復が問題ではない長時間持続の坐骨神経ブロックを含む。

図１Ａ〜１Ｆは、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸおよびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインを用いた１５分間（ピーク効果）での坐骨神経ブロック強度に関するラット用量応答を示す。図１Ａ〜１Ｆは、脚引っ込め潜時（ｌｉｍｂ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｌａｔｅｎｃｙ）（秒）（１Ａ、１Ｄ）；姿勢性伸筋突伸反応（ｇ）（１Ｂ、１Ｅ）、および四肢引っ込めの力（ｇ）（１Ｃ、１Ｆ）を比較する、注射した後肢（図１Ａ〜１Ｃ）および反対側後肢（図１Ｄ〜１Ｆ）におけるホットプレート、ＥＰＴ、およびＶｏｎ Ｆｒｅｙ試験に関して１５分で実施例１に記載されるようにラットでの坐骨神経注射後のブロックの強度のグラフである。 図１Ａ〜１Ｆは、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸおよびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインを用いた１５分間（ピーク効果）での坐骨神経ブロック強度に関するラット用量応答を示す。図１Ａ〜１Ｆは、脚引っ込め潜時（ｌｉｍｂ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｌａｔｅｎｃｙ）（秒）（１Ａ、１Ｄ）；姿勢性伸筋突伸反応（ｇ）（１Ｂ、１Ｅ）、および四肢引っ込めの力（ｇ）（１Ｃ、１Ｆ）を比較する、注射した後肢（図１Ａ〜１Ｃ）および反対側後肢（図１Ｄ〜１Ｆ）におけるホットプレート、ＥＰＴ、およびＶｏｎ Ｆｒｅｙ試験に関して１５分で実施例１に記載されるようにラットでの坐骨神経注射後のブロックの強度のグラフである。

図２Ａ〜２Ｆは、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸおよびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインに関するラット坐骨神経ブロックの持続を示す。図２Ａ〜２Ｆは、注射した後肢（２Ａ〜２Ｃ）および反対側の後肢（２Ｄ〜２Ｆ）においてホットプレート回復試験（時間）（２Ａ、２Ｄ）、ＥＰＴ回復試験（時間）（２Ｂ、２Ｅ）、およびＶｏｎ Ｆｒｅｙ回復試験（時間）（２Ｃ、２Ｅ）に関して実施例１に記載されるように、ラットにおける坐骨神経注射後のブロックの持続を示すグラフである。 図２Ａ〜２Ｆは、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸおよびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインに関するラット坐骨神経ブロックの持続を示す。図２Ａ〜２Ｆは、注射した後肢（２Ａ〜２Ｃ）および反対側の後肢（２Ｄ〜２Ｆ）においてホットプレート回復試験（時間）（２Ａ、２Ｄ）、ＥＰＴ回復試験（時間）（２Ｂ、２Ｅ）、およびＶｏｎ Ｆｒｅｙ回復試験（時間）（２Ｃ、２Ｅ）に関して実施例１に記載されるように、ラットにおける坐骨神経注射後のブロックの持続を示すグラフである。

図３は、ブピバカインの追加がＮｅｏＳＴＸの全心毒性を低下させる（ＬＤ５０を上昇させる）ことを示す。ＮｅｏＳＴＸ ４およびＮｅｏＳＴＸ ５は、１年間隔を空けて、種々の製造施設において調製した２種の異なる製剤をいう。図３は、ラットデータに基づいて、ブピバカインありおよびなしのＮｅｏＳＴＸの２種の製剤、Ｎｅｏ ４（グラフの左にある線）およびＮｅｏ ５（グラフの右側のある線）のＬＤ５０（マイクログラム単位）曲線のグラフである。

図４Ａ〜４Ｃは、ブロック持続が、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリンで最長、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインで中間、ブピバカイン単独で最短であることを示す。図４Ａ〜４Ｃは、０．２％ ブピバカイン（図４Ａ）、０．２％ ブピバカイン＋３μｇ ＮｅｏＳＴＸ／ｋｇ（図４Ｂ）、および０．２％ ブピバカイン＋３μｇ ＮｅｏＳＴＸ／ｋｇ＋５μｇ エピネフリン／ｋｇ（図４Ｃ）に関して、経時的なラットにおけるＶｏｎ Ｆｒｅｙ試験のグラフである。 図４Ａ〜４Ｃは、ブロック持続が、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリンで最長、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインで中間、ブピバカイン単独で最短であることを示す。図４Ａ〜４Ｃは、０．２％ ブピバカイン（図４Ａ）、０．２％ ブピバカイン＋３μｇ ＮｅｏＳＴＸ／ｋｇ（図４Ｂ）、および０．２％ ブピバカイン＋３μｇ ＮｅｏＳＴＸ／ｋｇ＋５μｇ エピネフリン／ｋｇ（図４Ｃ）に関して、経時的なラットにおけるＶｏｎ Ｆｒｅｙ試験のグラフである。

図５Ａおよび図５Ｂは、ＮｅｏＳＴＸへのブピバカインの追加が、ＮｅｏＳＴＸ−生理食塩水と比較して、ラット坐骨神経ブロックによって測定してブロック信頼性および持続を改善することを示す。ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインへのエピネフリンの追加は、ブロックのさらなる長期化を生じる。その結果は、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸが矛盾しかつ遅れた機械的間隔ブロックの開始を生じ、ブロックは、図５Ｂで使用されるもの（３ｍｃｇ／ｋｇ）より僅かに高いＮｅｏＳＴＸ用量（３．５ｍｃｇ／ｋｇ）ですら、１２時間で完全に回復することを示す。図５Ａおよび５Ｂは、３．５ｍｃｇ ＮｅｏＳＴＸ（三角） コントロール（丸）と比較した場合（図５Ａ）、ならびに０．２％ ブピバカイン（ｃｉｒｃｌｅ）、０．２％ ブピバカインおよび３ｍｃｇ ＮｅｏＳＴＸ（四角）もしくは０．２％ ブピバカイン ３ｍｃｇ ＮｅｏＳＴＸ ５ｍｃｇ エピネフリン／ｍｌ（三角）の関数として（図５Ｂ）、処置した脚に時間単位で経時的にＶｏｎ Ｆｒｅｙ試験での機械的値からの適用（ｇ）のグラフである。３種全ての製剤は、覚めにくい機械的感覚ブロックの迅速な開始を生じる。グラフは、ブピバカイン ０．２％へのＮｅｏＳＴＸ ３ｍｃｇ／ｋｇの追加が、完全ブロックの４倍の長期化（４時間 対 １時間）および最大半量のブロックの６倍の長期化（１２時間 対 ２時間）を生じることを示す。上記結果は、ブピバカイン ０．２％＋ＮｅｏＳＴＸ ３ｍｃｇ／ｋｇへのエピネフリン ５ｍｃｇ／ｋｇの追加が、ブピバカイン ０．２％＋ＮｅｏＳＴＸ ３ｍｃｇ／ｋｇと比較して、完全ブロックのさらに６倍の長期化（２４時間 対 ４時間）および最大半量のブロックのさらに２．５倍の長期化（３０時間 対 １２時間）を生じることを示した。現在の標準であるブピバカインと比較すると、ブピバカイン−ＮｅｏＳＴＸ−エピネフリンの上記３成分併用は、完全ブロックの２４倍の長期化および最大半量のブロックの１５倍の長期化を生じる。

図６Ａおよび６Ｂは、フェーズＩヒト治験での全身症状が、ＮｅｏＳＴＸ用量で変化し、症状がエピネフリンを含めることによって大いに抑制されたことを示す。ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用へのエピネフリンの追加は、フェーズ１治験において、成人において１０ｍｃｇおよび３０ｍｃｇのＮｅｏＳＴＸ用量での全身症状の発生率および臨床的重要性を劇的に低下させる。図６Ａは、０、５、１０、１５、２０、３０もしくは４０ｍｃｇ ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリンの投与後のいずれかの時点で、任意の全身症状：刺痛、無感覚、目眩、悪心もしくは嘔吐を有する被験体のパーセンテージのグラフである。悪心は、４０ｍｃｇ ＮｅｏＳＴＸの被験体のうちの８０％で認められた。上記グラフは、１０ｍｃｇもしくは３０ｍｃｔのＮｅｏＳＴＸ用量でＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリン併用に関して任意の時点スコアでの全身症状の発生が、プラセボより上昇しなかったことを示す。図６Ｂは、臨床的に有意な全身症状（すなわち、３０分以上にわたって０〜１０スケールで３より大きなスコア）を有する被験体のパーセンテージのグラフである。図６Ｂは、１０ｍｃｇもしくは３０ｍｃｇの用量を受けているＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリン被験体に関しては０を上回るスコアはなかったことを示す。

図７Ａおよび図７Ｂは、ＮｅｏＳＴＸ １０ｍｃｇを使用するフェーズ１ヒト治験でのブロック強度および持続に対するＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインおよびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリン併用の効果を示す。図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃは、エピネフリンの追加が、ＮｅｏＳＴＸ ブピバカイン併用に由来するブロックを強化しかつ長期化することを示すフェーズ１ヒト治験からのものである。図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃは、プラセボおよびコントロール（ＮｅｏＳＴＸなし）と比較して、ＮｅｏＳＴＸ、ＮｅｏＳＴＸ＋ブピバカイン、ＮｅｏＳＴＸ＋ブピバカイン＋エピネフリンに関して、時間単位で経時的な覚めにくいおよび部分的ブロック、機械的検出（図７Ａ）、機械的疼痛（図７Ｂ）および寒冷検出（ｃｏｏｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（図７Ｃ）の閾値測定のグラフである。その結果は、ブピバカイン ０．２％が、６時間以下にわたって覚めにくいブロックおよび６〜１２時間の間の部分的痛覚脱失を与えることを示す。生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸ １０ｍｃｇは、非常に変動性の短時間持続ブロックを与える。ブピバカイン ０．２％中のＮｅｏＳＴＸ １０ｍｃｇは、約１２時間の覚めにくいブロックおよび２４〜７２時間にわたる痛覚脱失の程度を与える。ブピバカイン ０．２％中のＮｅｏＳＴＸ １０ｍｃｇとエピネフリン ５ｍｃｇ／ｍｌは、２４時間にわたる覚めにくいブロックおよび４８〜７２時間にわたる痛覚脱失の程度を与える。 図７Ａおよび図７Ｂは、ＮｅｏＳＴＸ １０ｍｃｇを使用するフェーズ１ヒト治験でのブロック強度および持続に対するＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインおよびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリン併用の効果を示す。図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃは、エピネフリンの追加が、ＮｅｏＳＴＸ ブピバカイン併用に由来するブロックを強化しかつ長期化することを示すフェーズ１ヒト治験からのものである。図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃは、プラセボおよびコントロール（ＮｅｏＳＴＸなし）と比較して、ＮｅｏＳＴＸ、ＮｅｏＳＴＸ＋ブピバカイン、ＮｅｏＳＴＸ＋ブピバカイン＋エピネフリンに関して、時間単位で経時的な覚めにくいおよび部分的ブロック、機械的検出（図７Ａ）、機械的疼痛（図７Ｂ）および寒冷検出（ｃｏｏｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（図７Ｃ）の閾値測定のグラフである。その結果は、ブピバカイン ０．２％が、６時間以下にわたって覚めにくいブロックおよび６〜１２時間の間の部分的痛覚脱失を与えることを示す。生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸ １０ｍｃｇは、非常に変動性の短時間持続ブロックを与える。ブピバカイン ０．２％中のＮｅｏＳＴＸ １０ｍｃｇは、約１２時間の覚めにくいブロックおよび２４〜７２時間にわたる痛覚脱失の程度を与える。ブピバカイン ０．２％中のＮｅｏＳＴＸ １０ｍｃｇとエピネフリン ５ｍｃｇ／ｍｌは、２４時間にわたる覚めにくいブロックおよび４８〜７２時間にわたる痛覚脱失の程度を与える。

図８Ａ〜８Ｃは、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン ０．２％併用においてＮｅｏＳＴＸ用量を増大させる効果を示す。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用が５ｍｃｇ程度の低さの用量において、ブピバカイン単独と比較してブロックを長期化することを示すフェーズ１ヒト治験からのものである。図８Ａ〜Ｃは、１０ｍｃｇのＮｅｏＳＴＸ用量において、ブピバカイン、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン、およびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリンに関して、機械的検出（図８Ａ）および熱的検出（図８Ｂ、図８Ｃ）の覚めにくいおよび部分的ブロックの測定のグラフを示す。その結果は、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン ０．２％併用は、５ｍｃｇ〜４０ｍｃｇの範囲に及ぶ全てのＮｅｏＳＴＸ用量において、腕および脚で運動機能に影響を及ぼす神経の末梢ブロックにおける使用に必要とされる場合、少なくとも１２時間にわたる複数の感覚の種類の覚めにくいブロック、２４〜７２時間の期間にわたる痛覚脱失、および覚めにくい機械的ブロックから４８時間での信頼性の高い回復を生じることを示す。 図８Ａ〜８Ｃは、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン ０．２％併用においてＮｅｏＳＴＸ用量を増大させる効果を示す。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用が５ｍｃｇ程度の低さの用量において、ブピバカイン単独と比較してブロックを長期化することを示すフェーズ１ヒト治験からのものである。図８Ａ〜Ｃは、１０ｍｃｇのＮｅｏＳＴＸ用量において、ブピバカイン、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン、およびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリンに関して、機械的検出（図８Ａ）および熱的検出（図８Ｂ、図８Ｃ）の覚めにくいおよび部分的ブロックの測定のグラフを示す。その結果は、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン ０．２％併用は、５ｍｃｇ〜４０ｍｃｇの範囲に及ぶ全てのＮｅｏＳＴＸ用量において、腕および脚で運動機能に影響を及ぼす神経の末梢ブロックにおける使用に必要とされる場合、少なくとも１２時間にわたる複数の感覚の種類の覚めにくいブロック、２４〜７２時間の期間にわたる痛覚脱失、および覚めにくい機械的ブロックから４８時間での信頼性の高い回復を生じることを示す。

（発明の詳細な説明）
ＮｅｏＳＴＸとのブピバカイン投与を低減するという安全性の利点は、全ての年齢の患者にとって重要であるが、小児にとっては特に重量である。前向きレジストリからの疫学データは、より若年の小児が、局所麻酔薬全身反応に関して成人と比較すると、増大したリスクにあることを示す。局所麻酔薬および局部麻酔は、幼児および小児において手術後に疼痛緩和を提供するためにまずます使用されつつある。これら併用によって提供されるより大きな安全性限界によって、小児科学における特有の用途がある。小児患者にとって、種々の適応症に関して最適な、好ましいおよび広範囲の用量、体積および濃度は、ＮｅｏＳＴＸの物理化学的特性に関する懸念および身体区画のサイズならびに小児および年齢の高い方の幼児の体重での分布規模の大きさがどの程度かに基づいて導出した。

定義：
痛覚脱失とは、意識喪失なしの疼痛への無感覚をいう。

麻酔とは、感覚の喪失（局所；意識喪失を引き起こさない；全身，意識喪失あり）および通常は、生命機能の喪失なしの意識の喪失をいう。

血管収縮薬は、特に血管運動作用の結果として、血管の内腔を狭くする薬剤である。

浸潤とは、組織の複数の層もしくは領域への注入をいう。

注射（注入）とは、組織もしくは内腔における単一の点への注射（注入）をいう。

神経ブロックとは、神経幹に沿ったインパルスの流れを遮ることによって生じる局所麻酔をいう。

最小有効濃度（「ＭＥＣ」）は、疼痛緩和を提供するために十分な所定の位置における１種以上の薬物の最低局所濃度である。

ＩＩ．組成物

Ａ．サイト１ナトリウムチャネルブロッカー
サイト１ブロッカーは、電位開口型ナトリウムチャネルのそれらの強力かつ特異的なブロックについて認識された分子長のファミリーである。サイトＩナトリウムチャネルブロッカーとしては、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、サキシトキシン（ＳＴＸ）、デカルバモイルサキシトキシン、ネオサキシトキシン、およびゴニオトキシン（本明細書ではまとめて「トキシン」といわれる）が挙げられる。テトロドトキシンは、フグのうちのいくつかの種およびカリフォルニアイモリの中のある種の卵巣および卵から得られる。化学的には、それは、アミノペルヒドロキノリン（ａｍｉｎｏ ｐｅｒｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｏｌｉｎｅ）である。Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｖｏｌ． １８ Ｎｏ． ２， ｐｐ． ９９７−１０４９を参照のこと。テトロドトキシン単独は毒性が強すぎて、麻酔としては使用できない。テトロドトキシンとブピバカインとの併用は、テトロドトキシン単独と比較して、増大した全心毒性なしにラットにおいて長時間持続坐骨神経ブロックを生じた（Ｋｏｈａｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， １９９８：１１９−１３１）。最も広く知られているサイト１トキシンであるテトロドトキシンは、麻酔として有効であるものの、それは、フグ由来であることから、臨床使用には高価である；ＴＴＸを作り出す内共生細菌がエキソビボで増殖される場合には、そのＴＴＸの生成は減少する。

サキシトキシンは、アラスカバタークラム（Ａｌａｓｋａ ｂｕｔｔｅｒｃｌａｍ）、Ｓａｘｉｄｏｍｕｓ ｇｉｇａｎｔｃｕｓから最初に抽出され、ここではＧｏｎｙａｕｌａｘ属の藻類に存在する。報告された化学式は、Ｃ_１０Ｈ_１５Ｎ_７Ｏ_３．２ＨＣｌである。上記トキシンは、２個のグアニジニウム部分が組み込まれているペルヒドロプリン核を有すると考えられる。サキシトキシンはまた、毒性が強すぎて、局所麻酔薬として単独で使用できない。

サキシトキシンおよびその誘導体は、藻類からバイオリアクター中で生成され得る。その２つの誘導体であるネオサキシトキシン（ＮｅｏＳＴＸ）およびデカルバモイルサキシトキシンは、その生成プロセスおよび効能の点から利点を有する。ある研究は、サキシトキシンシリーズのうちのいくつかのメンバー（ＮｅｏＳＴＸを含む）でラット坐骨神経ブロックを試験した（Ｋｏｈａｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇ． Ａｎｅｓｔｈ． Ｐａｉｎ Ｍｅｄ．， ２０００；２５：５２−９）。サキシトキシンおよびこれらの２種の誘導体は全て、ブピバカインもしくはエピネフリンと併用した場合、顕著な相乗効果的ブロックおよび長期間のブロック（インビボでラット坐骨神経において１〜２日）を与える。

ネオサキシトキシンおよびデカルバモイルサキシトキシンは、潜在的により強力であり、製剤中ではサキシトキシンを超える利点を有し得る。ネオサキシトキシン（ＮｅｏＳＴＸ）は、長時間持続局所麻酔薬として臨床開発中である（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， ２００７；１０６：３３９−４５； Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｔｏｘ． Ｒｅｓ．， ２００９；１６：４０８−１５； Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇ． Ａｎｅｓｔｈ． Ｐａｉｎ Ｍｅｄ．， ２０１１；３６：１０３−９）。ヒトボランティアでの皮下浸潤のフェーズ１治験は、ＮｅｏＳＴＸが有効な皮膚鈍麻を引き起こすことを示し（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， ２００７； １０６：３３９−４５）、第２のフェーズ１治験は、ＮｅｏＳＴＸもしくはブピバカイン単独と比較して、ブピバカインとの併用が、より長期間の痛覚脱失を生じることを示した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｔｏｘ． Ｒｅｓ．， ２００９； １６：４０８−１５）。

サイトＩナトリウムチャネルブロッカーの好ましい供給源は、チリのホライモリによって生成されるネオサキシトキシンである。

Ｂ．局所麻酔薬
本明細書で使用される場合、用語「局所麻酔薬」とは、局所的な無感覚もしくは疼痛緩和を提供する薬物を意味する。利用され得る局所麻酔薬のクラスとしては、以下が挙げられる：アミノアシルアニリド化合物（例えば、リドカイン、プリロカイン、ブピバカイン、メピバカインおよび環系もしくはアミン窒素上に種々の置換基を有する関連局所麻酔薬化合物）；アミノアルキルベンゾエート化合物（例えば、プロカイン、クロロプロカイン、プロポキシカイン、ヘキシルカイン、テトラカイン、シクロメチカイン、ベノキシネート、ブタカイン、プロパラカイン、および関連局所麻酔薬化合物）；コカインおよび関連局所麻酔薬化合物；アミノカーボネート化合物（例えば、ジペロドンおよび関連局所麻酔薬化合物）；Ｎ−フェニルアミジン化合物（例えば、フェナカインおよび関連麻酔化合物）；Ｎ−アミノアルキルアミド化合物（例えば、ジブカインおよび関連局所麻酔薬化合物）；アミノケトン化合物（例えば、ファリカイン（ｆａｌｉｃａｉｎｅ）、ジクロニンおよび関連局所麻酔薬化合物）；ならびにアミノエーテル化合物（例えば、プラモキシン、ジメチソキン（ｄｉｍｅｔｈｉｓｏｑｕｉｅｎ）、および関連局所麻酔薬化合物）。好ましい局所麻酔薬は、アミノ−アミドおよびアミノエステルであり、最も好ましいのは、ブピバカイン（ブピバカインの左旋性鏡像異性体が好ましく、ここで上記局所麻酔薬の血管収縮薬活性は、望ましい）、テトラカイン、およびロピバカイン（これは、僅かにより感覚選択性である）である。

これら薬物は、種々の部位においておよび種々のタイプの手術に対して与えられる場合に、疼痛緩和が平均６〜１０時間である。多くのタイプの手術に関しては、２日もしくは３日間続く疼痛緩和の持続があることは好ましい。ＮｅｏＳＴＸと併用して使用するために好ましい局所麻酔薬は、ブピバカイン、ロピバカイン、テトラカインおよびレボブピバカインである。ブピバカインは、特に長時間作用性で極力な局所麻酔薬である。その他の利点としては、部分的運動ブロックのみがない十分な感覚麻酔、および広い利用可能性が挙げられる。

Ｃ．血管収縮薬
有用な血管収縮薬は、局所的に作用して血流を制限し、そしてそれによって、上記薬物が投与される領域に上記薬物を保持するするものである。これは、全身毒性を実質的に低減するという効果を有する。好ましい血管収縮薬は、αアドレナリン作動性レセプター（例えば、エピネフリンおよびフェニルエピネフリン）に対して作用するものである。他の薬物および色素は、副作用として血管収縮させる（例えば、ブピバカインおよびレボブピバカイン）。

Ｄ．賦形剤および保存剤
上記製剤はまた、保存剤、ｐＨ調節剤、抗酸化剤、および等張剤を含み得る。

好ましい実施形態において、上記麻酔薬は、生理食塩水または酸性緩衝化溶液（必要に応じて、保存剤を含む）中に製剤化される。局所的もしくは徐放性のキャリアが利用され得るが、好ましくはない。

Ｅ．投与ユニット
好ましい実施形態において、上記ＮｅｏＳＴＸ、ブピバカインおよび必要に応じてエピネフリンは、水性溶液中でバイアルの中で提供される。製剤のタイプに依存して、以前におよび以下で概説されるように、上記バイアルサイズは、１５〜４０ｍｌの範囲に及び得、１〜３本のバイアルが種々の状況において単一の患者のために使用され得る。別の実施形態において、上記ＮｅｏＳＴＸ、局所麻酔薬、および必要に応じて血管収縮薬は、１本以上のバイアルの中に提供され、必要に応じて、凍結乾燥され、次いで、使用前に再水和および組み合わされる。この第２の実施形態に関しては、好ましいバイアルサイズは、５〜４０ｍｌの範囲に及び得る。

ＩＩＩ．製剤および投与量
動物およびヒトでの研究は、有効投与量およびヒトの処置のための体積を決定するために必要である。例えば、インビトロ生理学実験からのサイト１ナトリウムチャネルブロッカーの効能の順位からは、インビボでのそれら化合物の効能の順位は推定されない（Ｋｏｈａｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇ． Ａｎｅｓｔｈ． Ｐａｉｎ Ｍｅｄ．， ２０００； ２５： ５２−９）。

以下の原理から、局所麻酔薬用量、体積および濃度には制限がある。

種々の臨床状況によって、局所麻酔薬の安全性および効力に対して種々の要求が提起される。

全身の安全性は、ブピバカイン、ＮｅｏＳＴＸ、もしくは他の局所麻酔薬の総用量（ｍｇもしくはｍｇ／ｋｇ）に対する上限を決定する。取り込みの過程、血管分布などに基づいて、合計の許容可能な用量には小さな差異があるが、全体として、各局所麻酔薬は、最大の許容可能な総用量を有する。本明細書で記載されるように、ＮｅｏＳＴＸおよびブピバカインとともにエピネフリンを含めることは、効力および全身の安全性を増大させ、より大きな用量およびより大きな体積を許容し、疼痛緩和のより長時間持続を提供する。しかし、エピネフリンが過剰な血管収縮に起因して回避されなければならない身体の部位がいくつかある。これらとしては、指および足趾の周りの注射、および陰茎の周りの注射が挙げられる。従って、種々の臨床使用のために、エピネフリンありおよびなしの両方で、製剤を開発することは重要である。

身体の任意の局所領域において、局所麻酔薬の十分な局所組織濃度が求心性伝達をブロックするために必要とされる。疼痛緩和を提供するために十分な所定の位置での１種以上の薬物の最低局所濃度は、「最小有効濃度」もしくはＭＥＣといわれる。

従って、大きな組織体積への浸潤を要する臨床状況は、より小さな組織体積に伴う臨床状況より、ＭＥＣ以上の局所麻酔薬のより大きな全体積を要する。ＭＥＣが種々の位置において類似であれば、より大きな組織体積が、より小さな組織体積より大きな全容量を要する。

フェーズ１ヒト治験において生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸおよびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用に関しては、全身症状（軽度の刺痛および／もしくは指、口唇および舌の無感覚が挙げられる）が、合計で１０ｍｃｇ程度の小さなＮｅｏＳＴＸ用量で起こることは、予測外であった。これら症状は、１０〜１５ｍｃｇの用量で軽度であったが、重症度が増大し、用量が４０ｍｃｇへと増大すると、一過性の悪心が伴った。これら症状は予測外であった。なぜなら刺痛および悪心は、非ヒトデータからは知りようがなかったからである。これらヒト研究はまた、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインへのエピネフリンの追加が、１０〜３０ｍｃｇのＮｅｏＳＴＸ用量範囲においてこれら症状の発生率を劇的に減少させることを示した（図６を参照のこと）。従って、エピネフリンが刺痛および悪心を防止するためにそれら濃度で必要とされるということは、以前のデータから知る方法は決してない。上記ヒトフェーズ１治験において、エピネフリンはまた、ＮｅｏＳＴＸ＋ＢＰＶからブロックの持続を劇的に増大させる。

いくつかの臨床状況において、無感覚もしくは虚弱が、これら効果が望ましくないかもしくは危険ですらある身体の他の位置に拡がるのを防止するために、大体積（すなわち、２０ｍｌより大きい）の局所麻酔薬を与えないことは重要である。例えば、肩の手術のために使用される場合、斜角筋間腕神経叢ブロックのための２０ｍｌより大きな体積の注射は、喉頭を神経支配している頸部の神経付近に溢出するリスクを増大させ、嗄声および気管への液体の吸引のリスクを引き起こす。同様に、腰部交感神経節ブロックのための２０ｍｌより大きな体積は、体性神経への漏出のリスクを増大させ、脚の大きな筋肉に至る神経を麻痺させることに起因して、一時的な脚の虚弱というリスクと関連する。他の状況において、非常に大体積が使用されなければ、いくつかの組織は、網羅されず、その結果は、不適切な疼痛緩和になる。これらの例は、以下で引用される。

ヒト治験からは、サイト１ナトリウムチャネルブロッカーに関して以前から公知であったことに基づいて推定できなかった特定の投与懸念事項は明らかにならなかった。これらのうちのいくつかは、現在の従来からの知識および局所／局部麻酔における臨床実務に矛盾している。これら懸念事項は、ヒトにおいて安全に使用され得る特定の製剤に、理解されなかった様式で強い影響をさらに及ぼす。

ラットでは、検出可能な神経ブロックは、０．１ｍＬの注入物中で、３５０ｇのラットでは約１μｇの用量に相当し、７０ｋｇのヒトでは約２７０μｇの用量である３０μＭ超で始まる（Ｋｏｈａｎｅ， ｅｔ ａｌ．， ＲＡＰＭ， ２５（１）：１−１０７ （２０００））。実施例１およびさらなる研究で記載されるように、その用量応答を、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸ、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン、およびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリンを使用する局所麻酔に関してラットで決定した（図１、図２、図４、および図５を参照のこと）。０．２％のブピバカイン濃度は、ラットおよびヒト両方の研究に関して同じであった。ラットでは、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用は、２ｍｃｇ／ｋｇのＮｅｏＳＴＸ用量においてブピバカイン単独と比較して、ブロックの矛盾するかまたは統計的に有意でない長期化を与え、信頼性の高いかつ強い長期化は、少なくとも３ｍｃｇ／ｋｇのＮｅｏＳＴＸ用量でのみ達成された。これら研究は、注射体積０．３ｍｌを使用して行った。ラットの体重（約２５０ｇｍ）に基づくと、これら注射については、３ｍｃｇ／ｋｇのＮｅｏＳＴＸ用量は、２．５ｍｃｇ／ｍｌの注射物中のＮｅｏＳＴＸ濃度に相当する。

対照的に、ヒトフェーズ１治験では、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用を使用して、５ｍｃｇ程度の低さ（これら成人に関しては約０．０７ｍｃｇ／ｋｇ）のＮｅｏＳＴＸ用量が、ブピバカイン単独と比較して優れていた、すなわち４倍のブロックの長期化を与えたことを見出した（図７）。注射体積１０ｍｌに関しては、これは、ＮｅｏＳＴＸ濃度５ｍｃｇ／１０ｍｌ（すなわち、０．５ｍｃｇ／ｍｌ）を使用するヒトでのＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用におけるＮｅｏＳＴＸの非常に強いブロック長期化効果を示す。

従って、ヒトにおけるＮｅｏＳＴＸは、ラットで見出された、その相当する有効なＮｅｏＳＴＸの体重に合わせた用量および濃度より、体重に合わせたＮｅｏＳＴＸ用量において少なくとも１／４０倍でおよびＮｅｏＳＴＸ濃度において少なくとも１／５倍で、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用において信頼性の高いブロック長期化を生じる。薬物投与のスケジュールおよび結果的には、具体的な手術タイプに要求される濃度の具体的範囲は、先行技術から導出できなかった。なぜなら動物は、全く有意な毒性を誘発しない症状に関してはインターロゲートできないからである。具体的には、全身症状（刺痛、口唇、指および舌の無感覚を含む）、および最終的に悪心が、ラット研究で使用されるもの（２〜５ｍｃｇ／ｋｇ）より遙かに低い体重に合わせた投与量（１５〜４０ｍｃｇ、もしくは約０．２〜０．６ｍｃｇ／ｋｇ）で起こることがＮｅｏＳＴＸのヒト研究で見出され（図１〜５を参照のこと）、刺痛、無感覚および悪心は、既存の局所麻酔薬からおよび麻痺性の貝類中毒からの毒性の両方に迫ることが見出される。

まとめると：

これら低用量でのこれら症状の発生は、ＮｅｏＳＴＸを使用する以前のラットもしくはヒトでの研究によって予想されなかった。

ＮｅｏＳＴＸに関して、症状は、測定可能な生理学的効果（例えば、虚弱もしくは呼吸測定値の障害）を生じる用量の遙か下で起こる。これら症状は、麻酔を掛けた被験体より覚醒したヒトにおいてＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインの最大用量を制限する。

ＮｅｏＳＴＸの症状は、類似の症状がブピバカインの過剰投与で起こる場合よりリスクが低いことを暗示する。ブピバカインが刺痛を感じさせる場合、奇妙なのは、発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）、不整脈もしくは心停止のいずれかをすぐに有することである。これは、ＮｅｏＳＴＸの場合には当てはまらない。

エピネフリンは、これら症状の重症度を劇的に低減し、２成分併用と比較して、これら３成分併用においてより高いＮｅｏＳＴＸ用量の寛容性を可能にする。

薬物投与のスケジュールおよび結果的に、特定の手術タイプに関して要求される濃度の特定の範囲は、局所麻酔薬の投与において全世界で実施されていることとは矛盾している。全心毒性は、従来の局所麻酔薬を使用するにあたって希に制限となる特徴であるので、濃度を調節して注射物の体積を考慮することは、不要である。ＮｅｏＳＴＸおよび類似化合物の使用は、薬物溶液の組成の変更自体が必要とされる異なるアプローチを必要とする。

種々の臨床状況タイプに最適化された製剤が、開発されてきた。

「高体積浸潤痛覚脱失」

成人に関して３５〜１２０ｍｌおよび小児に関して０．５〜１．８ｍｌ／ｋｇの高体積使用のための投与量製剤は、活性薬剤として、０．１％（１ｍｇ／ｍｌ）〜０．２５％（２．５ｍｇ／ｍｌ）の間の濃度範囲にあり、成人では２２５ｍｇ以下もしくは小児では２．５ｍｇ／ｋｇ以下の全身ブピバカイン用量を与えるブピバカイン；０．１ｍｃｇ／ｍｌ〜１ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、成人では３．５〜１００ｍｃｇもしくは小児では０．０５〜１．５ｍｃｇ／ｋｇの全身用量を与えるＮｅｏＳＴＸ、および２ｍｃｇ／ｍｌ（共通用語で１：５００，０００）〜１０ｍｃｇ／ｍｌ（１：１００，０００）の間の濃度範囲にあるエピネフリンの３成分併用を含む。この製剤の一般的用途は、全開腹術、胸腹部切開、もしくは側腹部切開のための大きな手術創の３層もしくは４層の浸潤である。これら手術のうちのいくつかとしては、以下が挙げられる：帝王切開、腹式子宮摘出、食道胃切除、腎摘出、または結腸切除のような大きな腹部癌手術。全股関節置換（股関節形成）および全膝関節置換（膝関節形成）の創部浸潤もまた、これら製剤の理想的な用途である。この製剤の一般的用途は、全開腹術、胸腹部切開、もしくは側腹部切開の手術創の３層もしくは４層の浸潤である。

「中間体積、中間時間持続」

これら用途は、成人では約１５〜４０ｍｌもしくは小児では０．２〜０．６ｍｌ／ｋｇの全体積を要する。これら適用において、体積は、望ましくない標的への漏出を妨げるために比較的低いまま保持されなければならない。例えば、肩の手術に関しては、斜角筋間腕神経叢ブロックが、一般に使用される。超音波ガイダンスが、正確な鍼の配置のために使用され、全体積は、望ましくない標的（例えば、反回神経（これは喉頭の機能に影響を及ぼす））への漏出を防止するために制限される。現在利用可能なブロックは、代表的には、１０時間持続し、および希に最大１５〜１８時間まで持続する。これはしばしば、ブロックが夜間まで持続することを意味し、患者は、術後の最初の夜に重症の疼痛を有する。

このレジメンにおいて、少なくとも２４時間（すなわち、最初の夜中ずっと）、および最大４８〜７２時間までの間、ブロックが疼痛緩和を信頼性高く引き起こすようにすることは望ましいが、覚めにくい運動ブロックおよび上記ブロックの軽い触覚要素（ｌｉｇｈｔ−ｔｏｕｃｈ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）は、約２４時間で消失するはずであり、その結果、上記患者は、術後の昼には、腕および手（腕神経叢ブロックに関しては）または脚（大腿神経ブロック、腰神経叢ブロック、もしくは坐骨神経ブロックに関しては）のより大きな運動性を有する。

１５〜５０ｍｌの中間体積使用のための投与量製剤は、活性薬剤として、０．１２５％〜０．３％（１．２５〜３ｍｇ／ｍｌ）の濃度範囲にあり、成人では１５０ｍｇ以下（小児では２ｍｇ／ｋｇ以下）の全身用量を与えるブピバカイン、０．２〜２ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、成人では７〜１００ｍｃｇ（小児では０．１〜１．５ｍｃｇ／ｋｇ）の全身用量を与えるＮｅｏＳＴＸ、および０〜１０ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲（＜１：１００，０００）にあるエピネフリンの併用を含む。

中間体積製剤の意図された用途のうちの多くは、末梢神経ブロックもしくは神経叢ブロック（神経周囲注入）、および浸潤（手術創の層に沿った注入）の両方を含む。この製剤の用途としては、肩、手もしくは腕の手術、鼠径ヘルニア修復のための浸潤もしくは腸骨鼠径神経／腸骨下腹神経ブロック、尿道下裂修復のための陰茎ブロック、全膝関節置換もしくは前十字靱帯修復のための大腿神経ブロック、開胸手術のための肋間神経ブロック、または下肢切断もしくは足部および足関節手術のための大腿神経ブロックおよび坐骨神経ブロックが挙げられる。股関節手術については、これは、腰神経叢ブロックおよび低体積坐骨神経ブロックを含み得る。この製剤はまた、関節置換手術のための股関節もしくは膝関節用の神経ブロック（大腿神経ブロックおよび坐骨神経ブロック、腰神経叢ブロックおよび坐骨神経ブロック）に使用され得る。

これら中間体積用途のうちのいくつかに関しては、特に、末梢神経ブロックおよび神経叢ブロックでは、優先順位の高いことは、３つの特徴を提供することである：
３〜１２時間の期間の手術の間の麻酔（ほぼ完全な無感覚）、２４〜４８時間の時間枠で四肢の運動においてある程度の強度を許容するための運動ブロックからの回復を確保しながら、少なくとも２４時間の期間の術後の痛覚脱失（長期の疼痛緩和）。

腕および脚に対する運動効果を有する末梢神経ブロックおよび神経叢ブロックに関しては、２４〜４８時間までの運動ブロックからの回復の必要条件に基づいて、エピネフリンなしでＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインを有する製剤は、以下の表に詳述されるように、おそらく理想的である。

「低体積長時間持続」

この製剤は、非常に長時間の効果が設計され、その体積が他の部位への漏出を回避するために少ないまま維持される位置のためである。例は、複合性局所疼痛症候群／反射性交感神経性ジストロフィーもしくは脚の血管不全のための腰部交感神経節ブロック、または膵炎もしくは膵臓癌のための腹腔神経叢ブロックである。

腰部交感神経節ブロックに関しては、注射は、脚において血管収縮を生じる神経の群をブロックするために行われる。これら神経がブロックされる場合、その結果は、脚の血流の増大および特定の疾患に由来する疼痛の低減である。この神経ブロックに関しては、体積は、腰神経叢の体性神経への漏出（これは、脚を虚弱にする）を回避するために比較的低くなければならない（好ましくは、８〜２０ｍｌ）。しかし、中間体積中間時間持続とは異なって、このブロックタイプが可能な限り続くようにすることは望ましい。なぜならＸ線透視ガイダンスを使用して小体積で行われる場合、感覚神経ブロックもしくは運動ブロックがほとんどないからである。従って、３種全ての成分の比較的高濃度が交感神経ブロックの持続および少なくとも４日間にわたる局所血流の増大を達成するためにこの適用に使用されるべきである。

低体積長時間持続のための投与量製剤は、活性薬剤として、０．２５％〜０．５％（２．５〜５ｍｇ／ｍｌ）の濃度にあり、５〜１５ｍｌ投与が成人では７５ｍｇ以下の全身ブピバカイン用量を与えるブピバカイン、０．５〜５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、５〜１５ｍｌ投与が成人では５〜７５ｍｃｇの全身用量を与えるＮｅｏＳＴＸ、および２．５〜１０ｍｃｇ／ｍｌ（１：５００，０００〜１：１００，０００）の濃度範囲にあるエピネフリンの併用を含む。例は、複合性局所疼痛症候群／反射性交感神経性ジストロフィーもしくは脚の血管不全のための腰部交感神経節ブロック、または膵炎もしくは膵臓癌のための腹腔神経叢ブロックである。

このブロックタイプを可能な限り長く続くようにすることは望ましい。なぜならＸ線透視ガイダンスを使用して小体積で行われる場合、感覚神経ブロックもしくは運動ブロックがほとんどないからである。従って、３種全ての成分の比較的高濃度が交感神経ブロックの持続および少なくとも３〜４日間にわたって、およびおそらくより長く局所血流の増大を達成するためにこの適用に使用されるべきである。この低体積長時間持続用途を要し得る他の適用としては、下肢切断に関するような迅速な運動回復が問題ではない長時間持続の坐骨神経ブロックが挙げられる。

ＮｅｏＳＴＸ＋ＢＰＶの２種薬物併用

６〜１２時間の手術グレードの神経ブロック、続いて、さらなる処置なしに最大約４８時間までのレーザーブロックを信頼性高く与える非徐放性薬剤が望ましい。前者の期間は、手術中に、および術後直ぐの期間に有効である；後者は、痛覚脱失の低下を提供し、治癒が進行するにつれて関わった身体部分の使用の増大を可能にする。ＮｅｏＳＴＸ＋ＢＰＶは、このブロックの持続を生じる。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することでさらに理解される。

実施例１：ネオサキシトキシン（ＮｅｏＳＴＸ）とブピバカインは、毒性の増大なしに治験において長時間持続局所痛覚脱失を提供する

皮下注射を使用するヒツジでのＮｅｏＳＴＸの近年の研究から、ブピバカインは、ＮｅｏＳＴＸからの呼吸器系毒性および神経筋毒性の代替測定値を悪化させないことが示された。別個のモデルでは、ＮｅｏＳＴＸの故意の静脈内注入から、ブピバカインの匹敵する以前の研究におけるより遙かに低い、顕著に軽微な心血管毒性が示された。本研究は、ラット坐骨神経ブロックの神経行動測定に対する、ならびにこれら併用の局所毒性および全心毒性に対するＮｅｏＳＴＸおよびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用の用量応答をさらに調査する。これら実験を、計画されたフェーズ１治験における臨床用途のために製造されたＮｅｏＳＴＸ製剤を使用して、臨床試験実施申請資料のための前臨床試験として行った。

仮定は、以下であった： １）固定したＮｅｏＳＴＸ用量において、ブピバカインの追加は、ラット坐骨神経ブロックの強度および持続を増大させる； ２）ブピバカインの存在下もしくは非存在下で、ブロックの強度および持続は、ＮｅｏＳＴＸ用量とともに増大する； ３）ラット坐骨神経に対するＮｅｏＳＴＸ（生理食塩水中もしくはブピバカインとの併用で）の組織学的効果は、意図された用量範囲にわたって良好であり、ビヒクルもしくは処置されていない神経のものとは統計学的に差異はない； ４）迅速な偶発的静脈内注入のモデルにおいて、ＮｅｏＳＴＸおよびブピバカインは、別個の過程で、呼吸エンドポイントおよび心電計エンドポイントを別個に生じる。ＮｅｏＳＴＸおよびブピバカインの両方の全濃度を使用する併用は、全身毒性をより迅速に（すなわち、より短い注入時間およびより低い蓄積容量で）発生させた一方で、各成分の１／２濃度併用は、毒性をよりゆっくりと（すなわち、より大きな蓄積用量で）発生させた。

材料および方法

方法： ＮｅｏＳＴＸ、０．２５％ ブピバカイン、もしくは併用を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの坐骨神経注射で与えた。感覚−侵害防御機能を、ホットプレートおよびＶｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験によって評価した。運動−侵害防御機能を、姿勢性伸筋突伸反応によって評価した。７日後、坐骨神経を切断し、毒性について組織学検査した。ＬＤ５０もまた、坐骨神経注射後に、ＮｅｏＳＴＸおよびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用後に計算した。偶発的静脈内過剰投与を摸倣するために、イソフルラン麻酔し、自発呼吸しているラットに、それらが呼吸エンドポイントおよび心電計エンドポイントに達するまで、ＮｅｏＳＴＸ単独、ブピバカイン単独、もしくはＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用のいずれかの注入を与えた。

薬物

坐骨神経注射モデルでは、薬物を実験日に調製し、注射物体積を０．３ｍＬで固定した。ＮｅｏＳＴＸ（Ｐｒｏｔｅｕｓ ＳＡ， Ｃｈｉｌｅ）を輸送し、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂｏｓｔｏｎ安全性基準に従って、Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙに従って貯蔵した。ＮｅｏＳＴＸストックは、ｐＨ ４．５において２０ｍｃｇ／ｍＬのネオサキシトキシンを含む。

ＮｅｏＳＴＸを、０．９％生理食塩水もしくはブピバカインヒドロクロリド（ＳＥＮＳＯＲＣＡＩＮＥ（登録商標）， ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ， ＩＬ）中で希釈した。Ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ その意図された最終ＮｅｏＳＴＸ濃度に依存して、市販のブピバカインのバイアル（ブピバカイン５ｍｇ／ｍｌ（０．５％）もしくはブピバカイン２．５ｍｇ／ｍｌ（０．２５％）のいずれかとして）を、最終注射物中で２ｍｇ／ｍｌ（０．２％）の最終ブピバカイン濃度を達成するために使用した。ＩＶ過剰用量モデルにおいて、注入濃度は以下のとおりであった：ブピバカイン ２ｍｇ／ｍｌ、ＮｅｏＳＴＸ １．８８ｍｃｇ／ｍｌ、全濃度併用：ブピバカイン ２ｍｇ／ｍｌおよびＮｅｏＳＴＸ １．８８ｍｃｇ／ｍｌ、１／２濃度併用：ブピバカイン １ｍｇ／ｍｌおよびＮｅｏＳＴＸ ０．９４ｍｃｇ／ｍｌ。注入速度は、動物の体重に従って調節して、一定の体重に合わせた薬物送達速度の送達を確実にした。従って、単一薬物として、ブピバカインを３．２ｍｇ／ｋｇ／分で、および３ｍｃｇ／ｋｇ／分としてＮｅｏＳＴＸを投与した。全用量併用動物には、ブピバカイン ３．２ｍｇ／ｋｇ／分、および３ｍｃｇ／ｋｇ／分としてＮｅｏＳＴＸの両方を与えた一方で、１／２用量併用動物には、１．６ｍｇ／ｋｇ／分でブピバカインをおよびＮｅｏＳＴＸ １．５ｍｃｇ／ｋｇ／分を与え、全ての動物に、１．６ｍｌ／ｋｇ／分の一定の体重に合わせた流体投与速度を与えた。

動物ケア

雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）から得た：体重２００〜２５０ｇの若い成体を坐骨神経注射モデルのために使用し、ＩＶ過剰用量モデルのために３２５〜４００ｇの動物を使用した。動物を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ＨｏｓｐｉｔａｌのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコルに従って、ケアおよび屠殺した。取り扱い手順を、試験パラダイムに動物をならし、ストレス誘発性の痛覚脱失を最小限にするために開発した。

坐骨神経注射

ラットに、ノーズコーンによってイソフルランで短時間麻酔をかけた。針を、大転子に対して後内側から入れ、前内側方向に刺した。いったん骨に触れたら、０．３ｍＬの溶液を注入した。ブロックのために左脚を常に使用した；右脚をコントロールおよび全心毒性の尺度として供した（Ｋｏｈａｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， １９９８：１１９−１３１）．

神経行動試験

感覚−侵害防御および運動−侵害防御の障害の尺度を使用して、坐骨神経周囲注入後のブロックの持続および強度を評価するＴｈａｌｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈａｌｈａｍｍｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， １９９５；８２：１０１３−１０２５）から改変された神経行動評価バッテリーを、使用した。調査者を、用量および処置割り当てに対して盲検状態にした。まず、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（ＶＦ）試験（Ｔｏｕｃｈ−Ｔｅｓｔ Ｓｅｎｓｏｒｙ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ， Ｎｏｒｔｈ Ｃｏａｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ．， ＣＡ）を使用して感覚を評価した。ワイヤメッシュケージに短期間慣らした後、上行性の力のＶｏｎ Ｆｒｅｙ毛状物を、足引っ込めが観察されるまで適用した。坐骨神経によって確実な神経支配を受けている外側足底表面にのみフィラメントを適用するように注意を払った。引っ込めが観察されるまで、もしくは最大３００ｇに達するまで（Ｙａｈａｌｏｍ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， ２０１１；１１４（６）：１３２５−１３３５）、フィラメントを、徐々に増大させて適用した。平衡を保つのに働かせた姿勢性伸筋突伸反応（ＥＰＴ）の強度（グラム単位）および５６℃に設定したホットプレートから引っ込めるまでの時間を、Ｋｏｈａｎｅ， ｅｔ ａｌ． （Ｋｏｈａｎｅ ２０００）に記載されるように測定した。

神経行動測定を、１日目に注射前ベースライン、１５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、および１２時間、次いで、２日目に４時間ごとに運動が回復するまで行った。各時点で、ＥＰＴ力およびホットプレート潜時の３回の測定値をとり、平均した。このパラダイムを使用するサイト１ナトリウムブロッカーの以前の研究は、より高用量が神経行動測定の一過性の反対側障害を引き起こし、全身痛覚脱失および／もしくは全身虚弱を示すことが示された（Ｋｏｈａｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇ． Ａｎｅｓｔｈ． Ｐａｉｎ Ｍｅｄ．， ２００１；２６（３）２３９−４５）。

以前の研究では、０．３ｍｌのブピバカイン ２．５ｍｇ／ｍｌでの注射は、動物のうちの＞９８％に対して完全ブロック（この段落で後に定義されるカットオフに基づいて）生じた。分析では、試験製剤での不完全ブロックが、技術的な注射失敗ではなく、その用量の真の薬理学的効果を示すという仮説を立てた。以前の研究は、感覚ブロックもしくは運動ブロックを達成する場合に、動物に資格を与えるためにカットオフを使用した：熱的潜時については７秒、姿勢性伸筋突伸反応については４０ｇ。５０％回復を、７秒として定義し、カットオフが達成されなければ、ブロック持続をゼロとみなした。これらカットオフの使用は、潜在的臨床的意義の感覚障害および運動障害の程度を減少させ得ることを見出した。これらカットオフに関して改善するために。ベースラインからのビヒクル注射の１５分後までの最大の変化を計算し、これら値を、ホットプレートおよびＥＰＴブロックに関する閾値（それぞれ、０．８秒および８ｇ）として使用した。ブロック閾値は、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に関しては６０ｇであるとみなした。回復は、同じ値まで戻ったとして定義した。

組織学的手順

坐骨神経注射の７日後、ラットに、ペントバルビタール（１５０ｍｇ／ｋｇ）の過剰用量を与え、２段階の経心臓灌流によって固定した：１００ｍＬの０．９％ 生理食塩水を注入し、続いて、２００ｍＬの改変Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ固定液（０．１Ｍ リン酸緩衝液中に２．５％ グルタルアルデヒドおよび１．２５％ パラホルムアルデヒドを含む）。左右の坐骨神経を切断し、４℃で希釈固定液中に貯蔵した。坐骨神経組織を、標準的な四酸化オスミウム電子顕微鏡プロトコルを使用してプラスチック包埋し、半薄切片（ｓｅｍｉ−ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ）に切り出し、トルイジンブルーで染色した。切片を、Ｅｓｔｅｂｅ ＆ Ｍｙｅｒｓのスコア付けシステムを使用して経験を積んだ神経科学者（Ｇ．Ｃ．）が分析した；この神経科学者は、全体を通じた群割り当てに対して盲検状態のままであった（Ｅｓｔｅｂｅ， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， ２００４； １００：１５１９−２５）。

坐骨神経周囲注入での全身毒性

致死未満の全身毒性を、上記の「神経行動試験」段落に記載されるとおりの左後肢坐骨神経注射の後に、右後肢の感覚−侵害防御および運動防御障害の測定によって評価した。ＮｅｏＳＴＸ（単独またはブピバカインと併用して）のより高用量で、無呼吸もしくはあえぎ呼吸を発生した動物の数は増大した。覚醒した動物が関わるこのパラダイムにおける苦痛を最小限にするために、無呼吸もしくはあえぎを発生している任意の動物は、腹腔内ペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ）で直ぐに安楽死させ、これは、致死事象として扱った。ＬＤ５０計算は、以下の統計的手順の節に記載される。

静脈内注入での全身毒性

偶発的なＩＶ注射を摸倣するために、イソフルラン麻酔した、自発呼吸しているラットに、不全収縮のエンドポイントまで、薬物含有溶液を尾静脈カニューレによって注入した。２６匹のラットを、上記の「薬物」という標題の節に詳述される薬物濃度および注入速度を使用して、４群に無作為に割り当てた：ＮｅｏＳＴＸのみ（ｎ＝６）；ブピバカイン（ｎ＝７）；全濃度ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用（ｎ＝７）；および１／２濃度ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用（ｎ＝６）。酸素中イソフルラン ３〜５％の吸入によって麻酔誘導し、ノーズコーンでイソフルラン １％によって維持した。カテーテルを、尾静脈に入れ、２ｍＬの０．９％ 生理食塩水を流し、Ｍｅｄｆｕｓｉｏｎシリンジポンプ（Ｓｍｉｔｈｓ Ｍｅｄｉｃａｌ， Ｓｔ Ｐａｕｌ， ＭＮ）に繋いだ。バイタルサインをモニターし、生理学的データを、Ｐｏｗｅｒｌａｂ装置およびＬａｂＣｈａｒｔソフトウェア（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｓｙｄｎｅｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して連続取得した。いったん全てのモニタリング装置を較正および接続し（ＥＣＧ、温度、パルスオキシメーター、脳循環圧変換器（Ｂａｉｎ ｃｉｒｃｕｉｔ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）、および尾静脈プレスチモグラフ）、尾静脈にアクセスした後に、ベースライン測定を行い（その後のオフライン分析）、ラットを、少なくとも５分間にわたって酸素中１％ 吸入イソフルランでの麻酔の安定な水準で維持した。上記の「薬物」という標題の段落に記載される通りの注入を、短期間のベースライン記録の直後に開始し、不全収縮が達成されるまで続けた。分析の一次エンドポイントは、以下のとおりであった：（１）無呼吸（脳循環における検出不能な圧力変化）、および（２）不全収縮。二次エンドポイントは、以下であった：徐脈（心拍数＜２７０）、心電図波形の有害変化（心臓ブロック、広いＱＲＳ群、異常心房収縮もしくは心室収縮（ｅｃｔｏｐｉｃ ａｔｒｉａｌ ｏｒ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｂｅａｔｓ）、またはＱＴ延長（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ＱＴｃ ｉｎｔｅｒｖａｌ）のいずれかが挙げられる）、およびプレチスモグラフィーによる尾動脈脈動性の喪失（ｃａｕｄａｌ ａｒｔｅｒｙ ｐｕｌｓａｔｉｌｉｔｙ）。

統計的手順

全ての測定を、四分位数範囲もしくは平均±平均の標準偏差とともにメジアンとしてまとめる。神経行動機能試験の変化を、固定因子として処置およびＮｅｏＳＴＸ用量とともにノンパラメトリックＦｒｉｅｄｍａｎモデルと、多重比較においてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ調整Ｐ値で評価した（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ， Ｄ．， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ５^ｔｈ Ｅｄ． ２００１， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）。１もしくは２ｍｃｇ／ｋｇの臨床的に関連する用量の併用を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定でさらに調査した。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓモデルで神経組織学を分析した。最尤法を使用するプロビット分析を適用して、対数尤度法（ｌｏｇ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｍｅｔｈｏｄ）のプロフィールによって得られル尤度比９５％信頼区間で各薬物処置に関してメジアン致死用量（ＬＤ_５０）を計算した。ＩＶ過剰用量モデルにおいて、事象までの時間データを、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を使用してまとめた。ブピバカイン単独に対する生存曲線の複数ペアワイズ比較を行い、０．０１７未満のＰ値を、統計的に有意とみなした（Ｆｉｎｎｅｙ， Ａｒｃｈ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， １９８５； ５６：２１５−２１８； Ｆａｒａｇｇｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｔｉｓｔ． Ｍｅｄ．， ２００３； ２２：１９７７−１９８８）。統計分析を、ＳＰＳＳ統計パッケージ（バージョン１９．０， ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．／ＩＢＭ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）を使用して行った。

結果：

用量範囲にわたって、ＮｅｏＳＴＸへのブピバカインの追加は、ＮｅｏＳＴＸ単独と比較して、侵害防御のより強くかつより長期のブロック、および運動−固有受容（ｐｒｏｐｒｉｃｅｐｔｉｖｅ）機能を引き起こした。表７を参照のこと。組織学的傷害スコア全体は、メジアンおよびＥｓｔｅｂｅ−Ｍｙｅｒｓスケールで０というＩＱＲ値で、全ての群で非常に低かった。皮下注射では、ＮｅｏＳＴＸへのブピバカインの添加は、ＮｅｏＳＴＸ単独と比較して、全身毒性（ＬＤ５０）で増大を生じなかった。静脈内注射では、ＮｅｏＳＴＸ、ブピバカイン、および併用は、心電図エンドポイントに対して呼吸エンドポイントに達するときに種々の過程を示した。表８を参照のこと。

神経行動測定

ブロック強度
図１Ａ〜１Ｆは、ブピバカインの存在下もしくは非存在下で投与したＮｅｏＳＴＸの用量に関して、１５分でブロック強度の発生を示す。全てのブピバカイン含有製剤は、その時点で３つ全ての行動測定の完全なブロックと関連した。ブピバカインの非存在下では、３ｍｃｇ／ｋｇ以下のＮｅｏＳＴＸ単独の用量は、動物のうちの大部分に関して不完全なブロックを生じた。

ブロックの持続
生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸの注射を受けている動物と比較すると、ブピバカインの追加は、熱的および機械的感覚−侵害防御および運動−固有受容ブロックからの１００％回復までの時間において実質的増大を生じた（Ｐ＜０．００１）。結果を図２Ａ〜２Ｆに示す。ブピバカインありおよびなしでＮｅｏＳＴＸの漸増用量を受けている群のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ較正ペアワイズ分析は、１ｍｃｇ／ｋｇより高い全ての用量で有意により長いブロック持続を有することを実証した（図２Ａ）。

０．２５％ ブピバカイン単独の注射後の１００％回復までのメジアン時間は、ホットプレート試験に関しては２．２時間（１．９〜２．９）、ＥＰＴ試験に関しては２．２時間（１．８〜２．６）、およびＶＦ試験に関しては１．９時間（１．７〜２．７）であった。１ｍｃｇ／ｋｇのＮｅｏＳＴＸと併用した０．２５％ ブピバカインの注射は、Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験（２．８時間， ２．２〜３．５， Ｐ＝０．０５）およびＥＰＴ試験（３．１時間， ２．８〜３．９， Ｐ＜０．００１）において１００％回復までの時間が有意に増大したが、ホットプレート侵害防御行動の１００％回復までの時間を増大させなかった（２．５時間， ２．０〜３．５， Ｐ＝０．４）。５０％回復までの時間（時間単位）を、全ての試験および用量について計算し、表７に示す。５０％ Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ回復までの時間は、ブピバカイン単独と比較して１ｍｃｇ／ｋｇ ＮｅｏＳＴＸおよびブピバカイン後の動物において有意に増大した（１．５時間、１．５〜２．１と比較して、２．５時間， １．７〜２．９， Ｐ＝０．０３）のに対して、ＥＰＴおよびホットプレートは、有意差がなかった。しかし、２ｍｃｇ／ｋｇのＮｅｏＳＴＸとブピバカインとを併用すると、ホットプレート応答（１０．８時間， ９．１〜１７．８， Ｐ＜０．００１）、ＥＰＴ応答（２２時間， １５〜２８， Ｐ＜０．００１）、およびＶｏｎ Ｆｒｅｙ応答（４．７時間， ３〜１１， Ｐ＜０．００１）の１００％回復までの時間において有意なかつ実質的に大きな増大を引き起こした。

全身毒性
坐骨神経注射後の全身薬物分布のマーカーとして、神経行動測定を注射していない右脚から得た。ブピバカイン単独と比較すると、ＮｅｏＳＴＸとブピバカインとの注射は、１５分でのＥＰＴブロックの増大した強度と関連した（Ｐ＝０．００１）が、ホットプレートもしくはＶｏｎ Ｆｒｅｙ応答における変化とは有意に関連しなかった（図２Ｃ， ２Ｅ）。変数としてＮｅｏＳＴＸ用量およびブピバカインの存在を使用するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ較正モデルにおいて、ＮｅｏＳＴＸとブピバカインとの併用は、３ｍｃｇ／ｋｇ（それぞれ、Ｐ＝０．０１１およびＰ＝０．０３８）および３．５ｍｃｇ／ｋｇ（それぞれ、Ｐ＜０．００１およびＰ＝０．０３６）の用量で反対側の脚でのブピバカイン単独より有意に大きいホットプレート（２Ａ， ２Ｄ）およびＥＰＴ（２Ｂ， ２Ｅ）ブロックを生じた。観察された比較的小さな反対側に起こるブロックに関しては、ＡＮＯＶＡから、ＮｅｏＳＴＸ用量が３ｍｃｇ／ｋｇ未満である場合に、ＮｅｏＳＴＸ動物とＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用動物との間の反対側の肢において、１００％回復までの時間に有意差はないことが明らかになった（図２Ｅ）。

ＬＤ５０試験
３ｍｃｇ／ｋｇ ＮｅｏＳＴＸ群において死亡がないとすると、その投与量を、最大８ｍｃｇ／ｋｇまで上昇させた。この最大用量は、ＮｅｏＳＴＸ単独およびブピバカインとの併用の両方に関して、投与の３０分以内に１００％死亡率を生じた。全ての動物において、死亡は、末期の無呼吸に起因した。ＬＤ_５０を、ＮｅｏＳＴＸ単独に関しては４．９ｍｃｇ／ｋｇ（９５％ ＣＩ＝４．２〜６．２）、およびＮｅｏＳＴＸとブピバカインに関しては５．７ｍｃｇ／ｋｇ（９５％ ＣＩ＝４．９〜７．９）で計算した（図４）。測定された範囲にわたってＮｅｏＳＴＸを上昇させると、致死率の増大と有意に関連し（Ｚ＝５．８２， Ｐ＜０．００１）、ブピバカインの追加による死亡率の低下の効果は、有意に近づいた（Ｚ＝１．８６， Ｐ＝０．０６）。ここで強調される点は、ブピバカインの共投与が、ＮｅｏＳＴＸの全身毒性を増大ではなくむしろ低下させたことである。

神経組織学
神経傷害のＥｓｔｅｂｅ−Ｍｙｅｒｓスコア付けから、坐骨神経注射後の非常に良好な組織学的プロフィールが明らかになった。全ての処置条件に関して、メジアンＥｓｔｅｂｅ−Ｍｙｅｒｓ神経傷害スコアは、０（ＩＱＲ ０−０）であった。３もしくは４というスコア付けされた神経はなかった。いずれの処置群と、非注射コントロール（右）坐骨神経との間にも統計的差異はなかった。試験した神経の総数は、以下を含んだ：ビヒクル １９、ブピバカイン ０．２５％のみ １９、反対側（注射していない右側） １６、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸ １ｍｃｇ／ｋｇ ４、ブピバカイン中のＮｅｏＳＴＸ １ｍｃｇ／ｋｇ ８、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸ ２ｍｃｇ／ｋｇ ４、ブピバカイン中のＮｅｏＳＴＸ ２ｍｃｇ／ｋｇ ７、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸ ３ｍｃｇ／ｋｇ １９、ブピバカイン中のＮｅｏＳＴＸ ３ｍｃｇ／ｋｇ ２７、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸ ３．５ｍｃｇ／ｋｇ １２、ブピバカイン中のＮｅｏＳＴＸ ３．５ｍｃｇ／ｋｇ １３、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸ ４ｍｃｇ／ｋｇ １、ブピバカイン中のＮｅｏＳＴＸ ４ ｍｃｇ／ｋｇ ６。盲検した組織学者の解釈に対する検証チェックとして、スライドを、故意の神経傷害（緩い結紮モデル）を受けた動物から採取した陽性コントロール神経の切片から得、同じプロトコル下で加工処理した。これら陽性コントロール神経には全て、高い傷害順位が与えられ、Ｅｓｔｅｂｅ−Ｍｙｅｒｓスコアは、３もしくは４であった。

このことは、ＮｅｏＳＴＸとブピバカインとの併用が、皮下注射後に神経毒性の増大も、全身毒性の増大もなく（ＬＤ_５０の低下）、坐骨神経ブロックの持続および信頼性を増大することを実証する。

上記研究は、ラットにおいて、０．２５％ ブピバカインとＮｅｏＳＴＸとの坐骨神経共投与が、神経毒性においても致死率においても増大させることなく、熱適刺激に対する侵害防御ブロックの強度および持続を増大させたことを実証する。ブピバカインが、３ｍｃｇ／ｋｇ ＮｅｏＳＴＸ（ヒトにおいて以前に使用されたものより約２倍高い、重量に合わせた用量）に追加される場合、有効にブロックした動物のパーセンテージは、５０から１００％へと増大した。ＮｅｏＳＴＸとブピバカインとを併用する臨床的に関連のある用量（１ｍｃｇ／ｋｇおよび２ｍｃｇ／ｋｇ）は、感覚−侵害防御ブロックの強度および持続において有意な増大をもたらした。

図４Ａ〜Ｃにおいて、ブピバカイン ０．２％のみ（図４Ａ）、ブピバカイン ０．２％とＮｅｏＳＴＸ ３ｍｃｇ／ｋｇ（図４Ｂ）、およびブピバカイン ０．２％とＮｅｏＳＴＸ ３ｍｃｇ／ｋｇおよびエピネフリン ５ｍｃｇ／ｍｌ（図４Ｃ）のいずれかを受けているラットの群の感覚ブロックの強度および持続。上記３成分併用が、上記２成分併用と比較してより強くかつ長期のブロックを与えることは、明らかである。このことは、上記３成分併用が、上記２成分併用より強くかつ長期の疼痛緩和を提供し、上記の「高体積」および「中間体積」臨床状況において特に重要であることを推定する。

全身毒性の研究のモデルを使用した。筋肉内（坐骨神経周囲）注射モデルを使用して、臨床用途における神経ブロックもしくは浸潤について意図されたように、血管外部位の全身毒性を摸倣した。このモデルにおいて、ＮｅｏＳＴＸとともにブピバカインを共接種すると、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸの同じ容量を受けている動物と比較して、全身毒性が僅かに減少する。このモデルにおいて、上記ブピバカイン用量は、心臓毒性を生じる範囲より下である。推定される死亡様式は、ＮｅｏＳＴＸに起因する呼吸筋虚弱およびいくらかの血管拡張に由来し、ブピバカインは、注射部位における局所的血管収縮によるＮｅｏＳＴＸ由来の全身毒性を低減し得、それによって、ＮｅｏＳＴＸの全身取り込みを遅くする。この推測は、ブピバカインの公知の局所的血管収縮効果および別のサイト−１ナトリウムチャネルブロッカーであるテトロドトキシンの坐骨神経周囲注入後のラットにおける以前の限局的血流実験に基づく。

ブピバカインの共注射は、その全身毒性を僅かに低減すると同時に、ＮｅｏＳＴＸに由来する神経ブロックの強度および持続を増大させるので、上記ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン併用は、ＮｅｏＳＴＸ単独と比較して、治療指数における有意な改善を提供する。治験用に開発されたＮｅｏＳＴＸの製剤は、ラットにおいてブピバカインより長時間持続の坐骨神経ブロックを提供する。ブピバカインとの共注射は、ＮｅｏＳＴＸ単独と比較して、ブロックの信頼性の高さおよび持続を改善する。

実施例２：成人におけるフェーズ１治験

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｌｅ， Ｓａｎｔｉａｇｏおよび小さなバイオテクノロジー会社Ｐｒｏｔｅｕｓ Ｓ．Ａの治験者は、優れた純度、安定性、無菌性および非発熱物質性を有する臨床グレードのＮｅｏＳＴＸを効率的に生成するためのバイオリアクタープロセスを開発した。マウス、ラット、およびヒツジにおける一連の前臨床安全性および毒性学的研究を、ＣＨＢおよびＴｏｘｉｋｏｎ， Ｉｎｃ．で行った。ＩＲＢ支部およびＣｈｉｌｅａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ ｄｅ Ｓａｌｕｄ Ｐｕｂｌｉｃａ（ＩＳＰ）（チリ国の薬物承認および監督の主な監督官庁）の承認監督とともに、Ｄｒ． Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏおよび共同研究者らは、２回のフェーズ１ボランティア治験（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ， １０６： ３３９−３４５， ２００９； Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｔｏｘ． Ｒｅｓ．， ２００９； １６： ４０８−１５）、および腹腔鏡下胆嚢切除を受けている患者のための長時間持続局所麻酔薬としてＮｅｏＳＴＸの２回のフェーズ２治験を行った（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇ． Ａｎｅｓｔｈ． Ｐａｉｎ Ｍｅｄ．， ２０１１， ３６：１０３−１０９； Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ −ａｂｓｔｒａｃｔ ｆｏｒ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｔ ＥＳＲＡ ｍｅｅｔｉｎｇ， Ｓｅｐｔ． ２０１０）。

フェーズ１ボランティア治験において、１０ｍｃｇもしくは５０ｍｃｇの用量は、皮膚無感覚を、優れた局所安全性および全身安全性とともに生じた。ＮｅｏＳＴＸと、ブピバカインもしくはエピネフリンのいずれかとの併用は、ＮｅｏＳＴＸ単独と比較して、皮膚無感覚の持続を劇的に強化かつ長期化し、次に、ブピバカインより長期間の皮膚無感覚を与えた（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｔｏｘ． Ｒｅｓ．， ２００９； １６： ４０８−１５）。エピネフリンの追加は、全身毒性を低減し、感覚ブロックの強い長期化を生じる。

ポートサイトの浸潤のために１００ｍｃｇ ＮｅｏＳＴＸとブピバカインとを比較する、全身麻酔下で腹腔鏡下胆嚢切除を受けている患者の２回のフェーズ２治験二重盲検下優越性治験（ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ ｔｒｉａｌｓ）において、ＮｅｏＳＴＸは、ブピバカインより長期間の痛覚脱失を与え、患者は、より迅速な術後回復を示す全般的評価を自己報告した。これまでのところ、チリ国の１８１名の患者が、いかなる重症の有害事象もなく、治験でＮｅｏＳＴＸを受けた。

近年のヒト研究から、覚醒したボランティアでのフェーズ１治験において１０ｍｃｇもしくは５０ｍｃｇいずれかでの皮膚浸潤を使用することによって、および気管内全身麻酔下で腹腔鏡下胆嚢切除を受けている患者でのフェーズ２治験において１００ｍｃｇでの創傷層浸潤を使用することによって、ＮｅｏＳＴＸの効能、安全性および長期間の鎮痛効果が実証された。

覚醒したボランティアでは、虚弱の報告はなく、呼吸異常もしくは血流異常の所見はなかったが、前臨床的全身効果の詳細な代替測定を行わなかった。

ブピバカインとの二重盲検比較を行った腹腔鏡下胆嚢切除治験の患者において、注射を、呼吸を制御した全身気管内麻酔下で行った。従って、症状に対する迅速な効果および呼吸筋強度を評価できなかった。しかし、全ての被験体は、手術の最後に優れた呼吸努力を示し、上記患者のいずれも、抜管の遅れがなく（種々の継続時間は、約１時間であった）、麻酔後回復室（ＰＡＣＵ）で長く観察した際に、虚弱の低換気の徴候も示さなかった。

にもかかわらず、手術患者におけるこれらフェーズ２治験が、麻酔した機械的換気の被験体において１００ｍｃｇ用量のＮｅｏＳＴＸの全身安全性をたとえ示唆するとしても、より小さな容量で始めて、前臨床的全身効果のより正確な代理測定を使用して、覚醒した若年の成人男性被験体において安全な用量（と最小有害事象閾値）を選択する、さらなるフェーズ１治験用量上昇研究を行うことは必須であった。

材料および方法

このフェーズ１治験の第１の目的は、一般に使用される局所麻酔薬であるブピバカイン、およびエピネフリンと併用して皮下注射によって与えられるネオサキシトキシン（ＮｅｏＳＴＸ）の全身安全性を評価することであった。このフェーズ１治験の第２の目的は、ブピバカインおよびエピネフリンとの併用でのＮｅｏＳＴＸと比較して、生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸの皮膚感覚ブロック（熱的および機械的刺激に対する無感覚）の強度および持続の用量依存性を確立して、皮下注射によって与えられる場合にＮｅｏＳＴＸの局所的安全性および許容性を確立すること、および皮下注射後のＮｅｏＳＴＸの薬物動態を測定することであった。フェーズＩ治験は、健康な若年の成人男性ボランティア被験体における皮下浸潤を介してＮｅｏＳＴＸの皮膚感覚ブロックのための全身的および局所的安全性および薬物応答をさらに確立するために、医師主導ＦＤＡ ＩＮＤの下で行われた。

以下に詳述されるように、口唇、舌および指への刺痛は、生理学的に非常に安全と思われる用量で起こる。このプロトコル修正は、ＮｅｏＳＴＸは、その後のフェーズ２治験において２つの用量範囲を使用されるという予測を示した：第１は、覚醒した被験体において最小限の全身症状を生じるもの、および第２は、手術室の状況で鎮静もしくは麻酔した被験体における使用について意図された幾分高い用量範囲。この修正は、手術室の状況における被験体の投与コホートを含み、刺痛が強いかまたは非常にやっかいであると認められる場合に、ミダゾラムでの低用量不安緩解を患者が受けることを可能にする。従って、上記薬物が手術室の状況において使用される用量範囲において安全性を定義することは、重要である。続いて起こる用量上昇設計は、各用量工程において９名の被験体の群で使用される。二重盲検様式で、各被験体は、無作為化ブロック設計で、下肢（ウシ）の後ろ側の皮膚の３ｃｍ×３ｃｍ平方領域に同時に２回の注射（各側の一方に）を受けた。各被験体は、ブピバカイン ０．２％単独での１回の注射を一方の側に受けた。反対側には、彼らは、２つの体積溶液のうちの一方を受けた：（１）生理食塩水プラセボ、もしくは（２）ブピバカインおよびエピネフリンとの併用でのＮｅｏＳＴＸ。各用量群において、注射のうちの一方のみが、プラセボを含む。

試験被験体は、若年の成人男性であった。皮下浸潤を、２５ゲージ １と１／２インチニードルを使用して行った。１０ｍｌ 体積を、２ｍｌが３×３ｃｍ^２の側面の各々に対して皮下注射され、２ｍｌが対角に与えられるように分配した。

個々に、５ｍｃｇ、１０ｍｃｇ、１５ｍｃｇ、２０ｍｃｇ、３０ｍｃｇもしくは４０ｍｃｇの用量のＮｅｏＳＴＸ。０．２％ ブピバカインおよび５ｍｃｇ エピネフリン／ｍｌを与えた。エピネフリンは、２つの理由で局所麻酔薬注射に慣用的に追加される：（１）全身取り込みを遅らせ、全身血中濃度を下げ、それによって、全身毒性のリスクを低減するため、ならびに（２）局所麻酔の持続を長期化するため。

ブピバカインを一方の側面に、および生理食塩水中のＮｅｏＳＴＸもしくはブピバカイン中のＮｅｏＳＴＸのいずれかを他方の側面に行った被験体内対化投与設計の使用は、現在使用される標準であるブピバカイン ０．２％と比較して、ブピバカイン ０．２％の固定濃度ありもしくはなしでＮｅｏＳＴＸの用量を上昇させて、皮膚痛覚脱失の強度および持続の被験体内比較を可能にする。

このフェーズＩ治験の主な転帰測定は、ブピバカインありもしくはなしで与えられる、各用量工程でのＮｅｏＳＴＸの関数として２１ ＣＦＲ ３１２．３２によって定義されるように、ＡＥの非存在もしくは存在、その頻度およびそのグレードである。これら有害事象は、ＮｅｏＳＴＸに起因する全身効果を測定する。

その設計は、有害事象および重症の有害事象の可能性を低減すると同時に、全身効果の閾値を定義すると企図される。

有害事象（ＡＥ）とは、薬物関連とみなされようがそうでなかろうが、２１ ＣＦＲ ３１２．３２に記載されるように、ヒトにおけるネオサキシトキシンの使用と関連する何らかの望ましくない医学的なできごとをいう。各ＡＥの強度（グレード）を、以下のスケールを使用して評価した：
グレード１（軽度）：通常は一過性であり、特別な処置を要さず、被験体の毎日の活動を妨害しない体験。
グレード２（中程度）：あるレベルの不便さもしくは懸念を被験体にもたらし、毎日の活動を幾分妨害し得るが、通常は簡単な治療的手段（薬物治療を含み得る）によって改善され得る体験。
グレード３（重度）：許容できないもしくは耐えられない、被験体の通常の毎日の活動を顕著に妨害し、そして全身薬物治療もしくは他の処置を要する体験
グレード４（生命を脅かす）：差し迫った死の危険を被験体に引き起こす経験。
グレード５（死亡）：被験体の死亡

ブピバカインおよびエピネフリンとの併用でのＮｅｏＳＴＸの結果

５ｍｃｇ、１０ｍｃｇ、１５ｍｃｇ、２０ｍｃｇおよび３０ｍｃｇのレベルでの用量コホートの完全評価を終了したところ、４０ｍｃｇコホート（ｎ＝１０， まだ登録中）が、ほぼ終了した。４０ｍｃｇ 用量では、覚醒した被験体において高率の全身効果を観察した。以前のように、これら効果は、全身症状（刺痛および無感覚、ならびに今では悪心）を含むが、切迫した生理学的リスクの徴候がない。注射後短期間（１時間）の間に悪心および嘔吐があることもまた８／１０名の患者で認められた。これまでのところ、上記患者は、軽度にやっかいであるとしてこれを評価した。酸素化もしくは換気の障害はなく、吸気力もしくは肺活量（呼吸筋の強度）の障害はなく、握力の障害はなく、心調律の変化もなく、低血圧もなかった。

浸潤の将来的な臨床用途において、より高い注射体積（例えば、３０ｍｌ）が使用される可能性はある。原則として、固定濃度で使用される場合、３倍程度大きな手術野をブロックする場合、局所麻酔薬の注射体積の約３倍、従って、局所麻酔薬用量の３倍を要する。全身安全性は、全用量とともに変動する一方で、局所効力および持続は、局所薬物濃度とともに変動する。上記研究は、ＮｅｏＳＴＸ ３０ｍｃｇがこれらボランティアで安全な用量であることを示した。

１０ｍｌ 注射物中の１０ｍｃｇの全用量では、局所的ＮｅｏＳＴＸ濃度は、３０ｍｌの体積において創部浸潤に使用される場合の予測濃度に等しい。

高用量ＮｅｏＳＴＸ（３０ｍｃｇ）群は、将来的な浸潤痛覚脱失に提唱された３０ｍｌバイアルの最大全用量を与える。

図５Ａおよび図５Ｂは、感覚ブロックの程度を示す。Ｙ軸は、Ｆｒｅｙフィラメントを使用する機械的検出閾値を示す。Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ数値は、適用された力のグラムに対数的に関連する。数値＞１６は、かなり覚めにくい感覚ブロックを表す。数値１０〜１４は、部分的ブロックを表し、おそらく術後痛覚脱失の程度を与える。Ｘ軸は、注射後の時間である。エラーバーは、ＳＤを示す。

図６は、０ｍｃｇ、５ｍｃｇ、１０ｍｃｇ、１５ｍｃｇ、２０ｍｃｇ、３０ｍｃｇもしくは４０ｍｃｇ ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリンの投与後の任意の時点において全身症状：刺痛、無感覚、目眩、悪心もしくは嘔吐を有する被験体のパーセンテージのグラフである。悪心を、４０ｍｃｇ ＮｅｏＳＴＸの患者のうちの８０％において認めた。医学的介入もしくは酸素補充が必要な患者はいなかった。Ｏ_２飽和度、ＢＰ、ＮＩＦ、ＶＣ、握力、ＥＣＧ全て非常に安心。Ｆｏｒ ＮｅｏＳＴＸ−生理食塩水およびＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインに関して、一過性の口唇、舌および指の軽度の刺痛が、１０ｍｃｇで始まり、４０ｍｃｇへと上昇するにつれて刺痛が増大し、４０ｍｃｇで一過性の悪心および嘔吐が始まった。症状は、１時間以内で徐々に消散した。局所的もしくは全身の続発症は示されなかった。

図７Ａおよび７Ｂは、プラセボおよびコントロール（ＮｅｏＳＴＸなし）と比較して、経時的な（時間単位での）ＮｅｏＳＴＸ、ＮｅｏＳＴＸ＋ブピバカイン、ＮｅｏＳＴＸ＋ブピバカイン＋エピネフリンに関する覚めにくいかつ部分的なブロックの閾値測定値、機械的検出（図７Ａ）および冷却検出（図７Ｂ）のグラフである。

ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインは、ＮｅｏＳＴＸのみもしくはブピバカインのみより長期間の機械的および熱的ブロックを生じる。ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインは、１２時間にわたる信頼性の高い手術での麻酔、＞２４時間にわたる信頼性の高い強い痛覚脱失を与える。

部分的機械的ブロックの回復に基づいて、本発明者らは、これら製剤が、末梢神経ブロックのために使用される場合、運動ブロックは、＞２４時間持続しない（これは、望ましい）と推定する。部分的熱的検出ブロック（これは、疼痛感知と相関する）からの回復前の部分的機械的ブロックの回復に基づいて、２４〜４８時間の範囲の、もしくはより長期間の長期間の痛覚脱失と、部分的触覚機能および運動機能の２４時間までの回復とが推定される。

ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン−エピネフリンは、ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカイン、Ｎｅｏ−ＳＴＸのみもしくはブピバカインのみより長時間の機械的および熱的ブロックを生じる。ＮｅｏＳＴＸ−ブピバカインは、信頼性の高い手術時麻酔／非常に覚めにくい痛覚脱失を少なくとも２４時間にわたって与える。部分的熱検出ブロック（これは疼痛感知と相関する）に基づいて、４８〜７２時間もしくはより長い範囲のより長期間の術後痛覚脱失が推定される。

Claims (20)

1. 覚醒しているヒト、鎮静させたヒトもしくは麻酔をかけたヒトにおける疼痛の処置もしくは防止のための投与ユニットであって、有効な量の５〜４０ｍｃｇの間のネオサキシトキシンと、ブピバカイン、レボブピバカイン、テトラカイン、およびロピバカインからなる群より選択される０．１％（１ｍｇ／ｍｌ）〜０．５％（５ｍｇ／ｍｌ）の間の濃度範囲にある局所麻酔薬と、ならびに２ｍｃｇ／ｍｌ（共通用語で１：５００，０００）〜１０ｍｃｇ／ｍｌ（１：１００，０００）の間の濃度範囲にあるエピネフリンとを含み、０．１〜１ｍｃｇ ＮｅｏＳＴＸ／ｍｌの間の最小有効濃度を投与の部位において生じさせる、投与ユニット。
2. ０．１％（１ｍｇ／ｍｌ）〜０．２５％（２．５ｍｇ／ｍｌ）の間の濃度範囲にあり、成人では２２５ｍｇ以下もしくは小児では２．５ｍｇ／ｋｇ以下の総全身ブピバカイン用量を与えるブピバカイン；
   ０．１ｍｃｇ／ｍｌ〜１ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、成人では３．５〜１００ｍｃｇもしくは小児では０．０５〜１．５ｍｃｇ／ｋｇの総全身用量を与えるＮｅｏＳＴＸ、および
   ２ｍｃｇ／ｍｌ（共通用語において１：５００，０００）〜１０ｍｃｇ／ｍｌ（１：１００，０００）の間の濃度範囲にあるエピネフリン、
   を含む、成人では３５〜１２０ｍｌおよび小児では０．５〜１．８ｍｌ／ｋｇの高体積使用のための請求項１に記載の投与ユニット。
3. 全開腹術、胸腹部切開、もしくは側腹部切開の大きな外科的創傷の多層の浸潤に有効な量にある、請求項２に記載の投与ユニット。
4. 帝王切開、腹式子宮摘出、食道胃切除、腎摘出、もしくは大きな腹部癌手術（例えば、結腸切除）に有効な量にある、請求項３に記載の投与ユニット。
5. 全股関節置換（股関節形成）もしくは全膝関節置換（膝関節形成）の創部浸潤に有効な量にある、請求項３に記載の投与ユニット。
6. ０．１２５％〜０．３％（１．２５〜３ｍｇ／ｍｌ）の濃度範囲にあり、成人では１５０ｍｇ以下（小児では２ｍｇ／ｋｇ以下）の全身用量を与えるブピバカイン、
   ０．２〜２ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、成人では７〜１００ｍｃｇ（小児では０．１〜１．５ｍｃｇ／ｋｇ）の全身用量を与えるＮｅｏＳＴＸ、および
   ０〜１０ｍｃｇ／ｍｌ（＜１：１００，０００）の濃度範囲にあるエピネフリン
   を含む、１５〜５０ｍｌの中間体積使用のための、請求項１に記載の投与ユニット。
7. 末梢神経ブロックもしくは神経叢ブロック（神経周囲注入）に有効な量にある、請求項６に記載の投与ユニット。
8. 浸潤（創傷の層に沿った注入）に有効な量にある、請求項６に記載の投与ユニット。
9. 肩、手もしくは腕の手術、鼠径ヘルニア修復のための浸潤もしくは腸骨鼠径神経／腸骨下腹神経ブロック、尿道下裂修復のための陰茎ブロック、全膝関節置換もしくは前十字靱帯修復のための大腿神経ブロック、開胸手術のための肋間神経ブロック、または下肢切断もしくは足部および足関節手術のための大腿神経および坐骨神経ブロックに有効な量にある、請求項６に記載の投与ユニット。股関節手術のために、これは、腰神経叢ブロックおよび低体積坐骨神経ブロックを含み得る。
10. 関節置換手術のための股関節もしくは膝関節についての神経ブロック（大腿神経および坐骨神経、腰神経叢および坐骨神経）に有効な量にある、請求項６に記載の投与ユニット。
11. ３〜１２時間の間の期間の手術のための麻酔（ほぼ完全な無感覚）と、少なくとも２４時間の手術後の痛覚脱失（長期の疼痛緩和）と、ならびに投与後２４〜４８時間以内にいくらかの強度の四肢の運動を許容するための運動ブロックからの回復とを提供するために有効な量にある、中間体積使用のための請求項１に記載の投与ユニット。
12. ０．２５％〜０．５％（２．５〜５ｍｇ／ｍｌ）の濃度にあり、ここで５〜１５ｍｌ投与が成人において７５ｍｇ以下の全身ブピバカイン用量を与える、ブピバカイン、
    ０．５〜５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、ここで５〜１５ｍｌ投与が成人において５〜７５ｍｃｇの全身用量を与える、ＮｅｏＳＴＸ、および
    ２．５〜１０ｍｃｇ／ｍｌ（１：５００，０００〜１：１００，０００）の濃度範囲にある、エピネフリン
    を含む、低体積長時間持続用途の請求項１に記載の投与ユニット。
13. 複合性局所疼痛症候群／反射性交感神経性ジストロフィーもしくは脚の血管不全のための腰部交感神経節ブロック、または膵炎もしくは膵臓癌のための腹腔神経叢ブロックを提供するために有効な量にある、請求項１２に記載の投与ユニット。
14. 下肢切断に関して迅速な運動回復が問題ではない長時間持続の坐骨神経ブロックを提供するために有効な量にある、請求項１２に記載の投与ユニット。
15. 有効な量の５〜４０ｍｃｇの間のネオサキシトキシン、ならびにブピバカイン、レボブピバカインおよびロピバカインからなる群より選択される局所麻酔薬を含み、投与部位において０．５〜１ｍｃｇ ＮｅｏＳＴＸ／ｍｌの間の最小有効濃度を生成する、覚醒したヒトにおける疼痛の処置もしくは防止のための投与ユニット。
16. 投与後２４〜４８時間以内に運動ブロックからの回復を可能にする、腕および脚に対する運動効果を有する末梢神経ブロックおよび神経叢ブロックに有効な量にある、請求項１５に記載の投与ユニット。
17. 請求項１〜１６のいずれかに記載の投与ユニットの有効な量を必要性のあるヒトに投与する工程を含む使用の方法。
18. 前記ヒトは成人である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ヒトは小児である、請求項１７に記載の方法。
20. 前記ヒトは覚醒している、請求項１７に記載の方法。

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