JP2016510318A - 果実細胞の大規模生産プロセス及び果実細胞による疾患の治療 - Google Patents
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Abstract
Description
製造−産業レベルの大規模化
生産プロセスには、5つのステージを有する漸進的プロセスにおけるブドウ細胞の増殖が含まれる。振盪三角フラスコ内でのブドウ細胞の増殖から始めて、小規模及び大規模使い捨てバイオリアクタでさらに増殖させる。重要な鍵となる因子は、異なる規模のバイオリアクタでの増殖中に、細胞に含まれる高レベルの二次代謝産物であるレスベラトロールを維持することである。増殖の最後の大規模ステージの最後に、所要のバイオマスで、ブドウ細胞を収穫して乾燥させることにより、種々の医療用途に用いられる乾燥細胞(RGC)のバイオマスをもたらすピンクがかった紫の微粉末が生成される。
オービタルシェーカー上の1リットルの三角フラスコ内で、蛍光灯連続照明下(1000lx)で温度25±5℃で懸濁液中において赤ブドウ細胞を増殖させる。増殖培地には、ガンボーグB5培地及びビタミン培地が含まれ、250mg/lのカゼイン加水分解物、2〜4%のスクロース、100mg/lのミオイノシトール、0.2mg/lのカイネチン及び0.1mg/lのNAA(1−ナフタレン酢酸)、25〜45mMのKNO3、1〜15mMのMgSO4または5〜35mMのMgNO3及び1mMのNaH2PO4(pH5.8)が補足されている。6〜11日毎に細胞を継代培養する。
小規模バイオリアクタ培養は、ステージ1の三角フラスコで増殖させた7〜16日齢の細胞懸濁液を、温度25±5℃で、4〜8リットルの使い捨てバイオリアクタに植菌することによって行う。強化ガンボーグB5塩及びビタミン培地を含みかつ、250mg/lのカゼイン加水分解物、2〜4%のスクロース、100mg/lのミオイノシトール、25〜45mMのKNO3、1〜15mMのMgSO4または5〜35mMのMgNO3及び1mMのNaH2PO4、0.2mg/lのカイネチン及び0.1mg/lのNAA(1−ナフタレン酢酸)(pH5.4〜5.8)が補足されている増殖培地で、蛍光灯連続照明下(1000lx)で、細胞懸濁液中において細胞を増殖させる。9〜16日毎に細胞を継代培養する。
小規模バイオリアクタで増殖させた細胞懸濁液を、30〜50リットルの使い捨てバイオリアクタに植菌する。蛍光灯連続照明下(1000lx)で温度25±5℃で細胞懸濁液中において細胞を増殖させる。増殖培地には、強化ガンボーグB5塩及びビタミン培地が含まれ、かつ250mg/lのカゼイン加水分解物、2〜4%のスクロース、100mg/lのミオイノシトール、25〜45mMのKNO3、1〜15mMのMgSO4または5〜35mMのMgNO3及び1mMのNaH2PO4、0.2mg/lのカイネチン及び0.1mg/lのNAA(1−ナフタレン酢酸)(pH5.4〜5.8)が補足されている。12〜30日毎に細胞を継代培養する。
小規模または大規模バイオリアクタで増殖させた細胞懸濁液を300〜1000リットルの使い捨てバイオリアクタに植菌する。蛍光灯連続照明下(1000lx)で温度25±5℃で細胞懸濁液中において細胞を増殖させる。増殖培地には、強化ガンボーグB5塩及びビタミン培地が含まれ、かつ250mg/lのカゼイン加水分解物、2〜4%のスクロース、100mg/lのミオイノシトール、25〜45mMのKNO3、1〜15mMのMgSO4または5〜35mMのMgNO3及び1mMのNaH2PO4、0.2mg/lのカイネチン及び0.1mg/lのNAA(1−ナフタレン酢酸)(pH5.4〜5.8)が補足されている。
細胞が10%〜70%(w/v)の細胞バイオマスに到達した時点で細胞を収穫する。収穫した細胞を乾燥させて、典型的な組成物、味及び匂いを有するピンクがかった紫の微粉末を生成する。
大規模バイオリアクタで増殖させた赤ブドウ細胞におけるレスベラトロールのレベルに対する培地組成及びバイオリアクタデザインの効果
組成物:
インビボでカラギーナンによって誘発される足浮腫ラットモデルにおける培養ブドウ細胞の効果
1.足体積の測定
2.自由に動き回るラットの炎症性痛覚
例1に従って作製した赤ブドウ細胞(RGC)。
カラギーナン注射の2時間前に、RGCを、滅菌飲料水中に懸濁させた懸濁液として体重1kg当たり400mg(400mg/kg)(2ml/40mg)の用量で経口投与した。
RGC組成物:各ラットに注射したポリフェノール及びレスベラトロールの量は、それぞれ14mg及び4.8mgであった(RGC100mg当たりポリフェノール3.5mg、及びRGC100mg当たりレスベラトロール1.2mg)。
カラギーナンはラットの足浮腫を誘発した:ラットを8匹ずつ3つの群に分けた。全ての群のラットに対し、各ラットの左後足の足底下組織に1%のカラギーナン(0.1mg/足)または滅菌食塩水(0.9%NaCl)を注射した。
・カラギーナン注射の直前、注射の0、1、2、4時間後の時点で、1時間毎にキャリパを用いてカラギーナン注射した足体積を測定した。
・2つの軸線で足寸法を測定し、足体積を計算した。このモデルの足浮腫体積は、炎症の重症度を示すものであった。
・各時点に対して、ベースライン足体積を減算することによって、またはベースライン足体積の%として、足体積の変化を計算した。
ホットプレート法を用いて、自由に動き回るラットの炎症性痛覚を測定した。浮腫を誘発し、かつ溶媒、インドメタシンまたはRGC製剤のいずれかで処理した後、ラットを55±0.5℃の温度に維持したホットプレート上に置いた。ベースラインに比べて、後足を動かしたり舐めたりするまでの潜時、あるいはホットプレートからジャンプするまでの潜時を反応時間と考えた。注射の1、2及び4時間後に反応時間を書き留めた。反応がない場合は、組織損傷を防ぐために、カットオフ時間を30秒とした。
溶媒投与対照(1M)群:対照ラットには、カラギーナン注射の2時間前に、滅菌飲料水(溶媒)を投与した。
陽性対照群(「2M」):陽性対照群のラットには、カラギーナン注射の2時間前に、体重1kg当たり2mgのインドメタシンを投与した。
実験群(「3M」):ラットには、カラギーナン注射の2時間前に、RGCを、滅菌飲料水中に懸濁させた懸濁液として体重1kg当たり400mgの用量(1ml/40mgのRGC)で経口投与した。
図1は、RGC製剤、インドメタシン及び対照として水でそれぞれ処理したラットにおける足浮腫の結果(体積パーセント)を示している。反復測定のための二元配置分散分析法を用いて統計分析を行い、次にボンフェローニ・ポストホックテスト(ボンフェローニ法)を用いた。対照群(1M)と陽性対照群(2M)との比較は、2時間後及び4時間後に統計的に有意な差(p<0.001)を示した。対照群とRGC製剤(3M)群との比較は、2時間後及び4時間後に統計的に有意な差(p<0.001)を示した。
図2は、RGC製剤、インドメタシン及び対照として水でそれぞれ処理した後の、各群の痛覚過敏作用を示している。反復測定のための二元配置分散分析法を用いて統計分析を行い、次にボンフェローニ法を用いた。対照群(1M)と陽性対照群(2M)との比較は、2時間後及び4時間後に統計的に有意な差(p<0.05−0.01)を示した。対照群とRGC(3M)との比較は、4時間に統計的に有意な差(p<0.01)を示した。
動物実験
電気血圧計及び空気振動トランスデューサ(58500 BP Recorder, UGO BASILE, Varese, Italy)を用いて、非観血的テールカフ(tail cuff)法によって収縮期血圧(BP)を測定した。測定を行う間、ラットは温度調整されたラットホルダに保持した。5つの連続した測定値の平均を用いて収縮期BPを決定した。
指示された時点で、絶食の5時間後に、全てのラットから、イソフルランでの浅麻酔下で、後眼窩静脈叢穿刺から血液サンプルを採取した(第1及び第2の測定をRGC添加の前に行い、第3の測定を開始時点から5週間後に(すなわち、RGC添加期間の2週間後に)行った)。
他の源から得られるRESと比較してのRGC−RESの化学的特性、及びRGC−RESのヒトのバイオアベイラビリティ特性
例1に従って赤ブドウ細胞(RGC)を作製した。RGCのレスベラトロール(RES)含有量を、合成RES較正曲線を用いて306nmでHPLC分析によって測定した。
RGC粉末を80%メタノールに溶解させた。試料の液体クロマトグラフィー質量分析(LC−MS)を、Accela LCシステム/エレクトロスプレーイオン化源を備えた四重極トラップ(LTQ)型Orbitrap DiscoveryハイブリッドFT質量分析計(サーモフィッシャーサイエンティフィック社(Thermo Fisher Scientific Inc.)製)を用いて行った。質量分析計を負イオン化モードで作動させ、m/z150〜2000の範囲で質量スペクトルを得た。
RGC、合成レスベラトロール(S−RES;シグマアルドリッチ社)及び植物イタドリからのレスベラトロール抽出物(植物−RES)を80%メタノールに溶解させることにより100%の溶解を達成した。その後、全てのRES源をpH2及びpH7の水に溶解させ、水への溶解度のパーセンテージをメタノールへの溶解度と比較した。全ての試料中のRESをその特性吸収プロフィールに基づいて306nmで測定し、レスベラトロール分析標準の較正曲線によって濃度を決定した。
RGC粉末のための負イオンモード及び代表的LC/MSクロマトグラムでの質量スペクトルを図6A及び図6Bに示す。LC−MS分析によって、RGCにおいてレスベラトロールの4つの誘導体が検出され(m/z−227.0701−227.0737)、これらは全て306nmでのUV吸光度を示している。これらの誘導体のうち3つは、4.6分、5.3分及び6.1分の保持時間に検出されたトランス型RES異性体のヘキソース配糖体であった。第4の誘導体は、6.9分の保持時間に検出されたトランス型RESのものであった(表12)。ESIマススペクトル(図7)に示すように、4つの誘導体の同一性を確認した。
RGC−RESの溶解度を2つのトランス型RES生成物、すなわち合成−RES及び植物イタドリ−RESの溶解度と比較した。検査した3つの生成物は全て、80%メタノール溶液に完全に溶解した。しかし、3つのRES生成物を、胃のpH状態を再現する酸性化した水(pH=2)及びpH7.0の水に溶解させたとき、RGC−RESの溶解度は、RGC−RESに関しては6倍以上高い44%であり、他の2つのRES源に関しては7%であった(図8)。
本研究は、単回用量無作為化クロスオーバ比較薬物動態研究であった。15人の成人の健常な絶食男性被験者に対して、少なくとも7日間のウォッシュアウト期間を隔てて、治験中の生成物RGC(50mgまたは150mgのトランス−RESに相当する経口用量)を投与した。投与の4時間後に標準食を与えた。本研究は、イスラエル国保健省(MOH)の全ての規則及び規制に準拠して、かつICH GCPガイダンスに従って行った。このプロトコールは、ソロカ大学医療センターIRBによって承認されたものであり、各患者に対する50または150mgの単回用量の投与と、その後の7日間のウォッシュアウトと、1回目の用量とは異なる(最初に50mgを投与された患者は2回目の投与で150mgを投与され、逆の場合も同様であるように投与される)2回目の単回用量とが含まれる。本研究へは15人の健常な非喫煙男性ボランティアを募集した。ボランティア適格条件は、年齢18〜55歳;BMI>19及び<30であった。被験者は、1回目の投与の7日前から、及び本研究期間全体を通して、RES含有食品、栄養サプリメントまたはドリンクを控え、かつ一般用医薬品を含む全ての薬物を控えるように依頼された。
投与の前(t0)及び投与の0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10及び12時間後に、K2EDTA含有チューブに様々な血液試料を採取した。血液試料を氷浴中に保持し、黄色光の下で直ちに処理した。
試料作製及び血漿試料中の遊離RES(free RES)及び全RES(total RES)のLC−MS分析は、PRACSインスティテュート(Toronto, Canada)が行った。血漿試料を液液抽出し、の分析のためにLC−MS/MSシステムに用いた。定量下限値(LLOQ)は、遊離RES及び全RESに関してそれぞれ0.5及び20ng/mLであった。全RESの分析のために、LC−MS/MS分析に先立って、酵素加水分解及びタンパク質沈殿抽出を行った。
ノンコンパートメントモデル薬物動態手法を用いて遊離RES及び全RES(遊離及び共役)に関する以下の薬物動態変数、すなわち、最大血漿濃度(Cmax)及び最大血漿濃度時間(Tmax)、全収集期間の平均濃度、台形法による時間(0)から最後の定量化可能な濃度(Clast,LOQを超えている)までの血漿濃度−時間曲線下面積(AUC)を計算した。
LDLの作製:不連続密度勾配超遠心法によって、健康で血中脂質が正常なボランティアの血漿からLDLを分離した。
臨床研究−高血圧前症または軽度(中程度)高血圧症を患う人々の血圧、血管機能及び血漿酸化パラメータに対するRGC粉末の効果
55人中46人の被験者(92%)が研究を完了した。ベースライン基準は、全処置群にわたって比較可能であった。200mgのRGCで処置した群は、他の2つの処置群と比較して高いBMIを有していた。研究対象母集団の平均年齢は57.5±7.2歳(範囲:41.7〜70.0歳)であった。
RGCでの処置は、安全でかつ良好な耐容性を示していた。1つの重篤な有害事象(SAE)である胸焼けは胸痛に変わったが、翌日同時に解消され、研究成果に関連していそうにない中程度のSAEであると考えられた。他の全ての有害事象は軽度または中等度であり、研究成果に関連しているとは考えられなかった。研究中にバイタルサインや実験室での値の臨床的に有意な変化は生じなかった。
拡張期BPは、200mgのRGCで処置した群において−4.18±8.96mmHg低下した。異なる群間の比較は、この変化がプラセボとは統計的に有意に異なることを示した(表17,p=0.0320)。200mgのRGCで処置した群においては、ベースライン時と処理終了時との間で収縮期BPの僅かな変化が見られた(表17)。
表17に示したように、400mgのRGCで処置した群では、ベースライン時と処理終了時との間で過酸化脂質値が著しく31.4±56.0低下した。200mgのRGCで処置した群でも、30.0±48.2の過酸化脂質値の低下が観察された。
健康で適度に訓練されたサイクリスト(自転車乗り)の測定に対する赤ブドウ細胞(RGC)粉末摂取の効果の二重盲検ランダム化プラセボ対照研究
例1に従ってRGC細胞培養物の粉末を作製した。
表17に示したように、400mgのRGCで処置した群では、ベースライン時と処理終了時との間で過酸化脂質値が著しく31.4±56.0nmol/ml低下した。200mgのRGCで処置した群でも、30.0±48.2nmol/mlの過酸化脂質値の低下が観察された。
Claims (29)
- メタボリックシンドロームまたは代謝疾患を治療、軽減、緩和または予防する方法であって、
インビトロで増殖した果実細胞の細胞株カルス培養物を含む組成物を投与するステップを含むことを特徴とする方法。 - 前記果実細胞がブドウ果実細胞であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- メタボリックシンドロームである対象者において、冠状動脈性疾患(アテローム性動脈硬化)、血圧、虚血、心不全、アテローム性動脈硬化、慢性腎臓病(CKD)及び腎臓病全身性硬化症、慢性心不全、高血圧、糖尿病、高脂血症、耐糖能異常、肝臓脂肪症、高血糖症、前糖尿病状態、新規発症糖尿病、インスリン抵抗性、真性糖尿病、空腹時血糖異常、高トリグリセリド血症、抗炎症(アディポネクチン)、高コレステロール血症、低HDLレベル、脂肪肝及び肥満からなる群から選択される1若しくは複数の病気を治療する方法であって、
前記対象者に対して、インビトロで増殖した果実細胞の細胞株カルス培養物を含む組成物を投与するステップを含むことを特徴とする方法。 - 対象者において、冠状動脈性疾患(アテローム性動脈硬化)、血圧、虚血、心不全、アテローム性動脈硬化、慢性腎臓病(CKD)及び腎臓病、全身性硬化症、慢性心不全、高血圧、糖尿病、高脂血症、耐糖能異常、肝臓脂肪症、高血糖症、前糖尿病状態、新規発症糖尿病、ンスリン抵抗性、真性糖尿病、空腹時血糖異常、高トリグリセリド血症、抗炎症(アディポネクチン)、高コレステロール血症、低HDLレベル、脂肪肝及び肥満からなる群から選択される1若しくは複数の病気を治療または予防する方法であって、
前記対象者に対して、インビトロで増殖した果実細胞の細胞株カルス培養物を含む組成物を投与するステップを含むことを特徴とする方法。 - 前記1若しくは複数の病気が、高血圧、高トリグリセリド血症及び糖尿病であることを特徴とする請求項3または請求項4に記載の方法。
- 前記果実細胞の細胞株カルス培養物が、ブドウ果実横断切片、ブドウ果皮、ブドウ果実果肉、ブドウ種子、有核または無核の品種のブドウ胚、あるいはブドウ種皮のうちの1つ若しくは複数に由来することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が栄養補助食品組成物であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記栄養補助食品組成物が、洗口液、粉末、細長片、泡、チューインガム、経口噴霧剤、ロゼンジ、カプセル、歯磨き粉、食品成分添加物(栄養補助食品)、食品成分、食品及び飲料からなる群から選択される形態をとることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 栄養補助食品組成物または、前記インビトロで増殖した果実細胞の細胞株カルス培養物を乾燥させたものが、無味であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記果実細胞の細胞株カルス培養物が、大規模プロセスにより作製され、
前記大規模プロセスが、
フラスコ内で果実細胞を増殖させるステップと、
前記果実細胞を前記フラスコから最初のバイオリアクタに植菌するステップと、
前記果実細胞を前記最初のバイオリアクタから別のバイオリアクタに植菌するステップと、
前記最後のバイオリアクタから前記果実細胞を収穫するステップとを含み、
前記別のバイオリアクタが最後のバイオリアクタまたは中間のバイオリアクタであり、かつ前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタのうちの少なくとも一方が使い捨てであり、
前記最後のバイオリアクタから収穫された前記果実細胞が乾燥されることを特徴とする請求項1ないし請求項9のいずれか1項に記載の方法。 - 当該プロセスにおいて用いられる各バイオリアクタの大きさが、その前に前記果実細胞を増殖させたバイオリアクタよりも大きいことを特徴とする請求項10に記載の大規模プロセス。
- 前記別のバイオリアクタが中間のバイオリアクタである場合には、前記果実細胞を別の中間のバイオリアクタまたは前記最後のバイオリアクタに植菌する追加ステップを行うことを特徴とする請求項10に記載の大規模プロセス。
- 前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタが、4〜10リットルのバイオリアクタであることを特徴とする請求項10に記載の大規模プロセス。
- 前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタが、10〜50リットルのバイオリアクタであることを特徴とする請求項10に記載の大規模プロセス。
- 前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタが、50〜200リットルのバイオリアクタであることを特徴とする請求項10に記載の大規模プロセス。
- 前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタが、200〜500リットルのバイオリアクタであることを特徴とする請求項10に記載の大規模プロセス。
- 前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタが、200〜1000リットルのバイオリアクタであることを特徴とする請求項10に記載の大規模プロセス。
- 前記果実細胞をガンボーグB5培地で増殖させることを特徴とする請求項10に記載の大規模プロセス。
- 前記ガンボーグB5培地が、マグネシウム塩、リン酸塩及び硝酸塩、またはそれらの組合せで強化されたものであることを特徴とする請求項18に記載の大規模プロセス。
- 前記ガンボーグB5培地が、KNO3、MgSO4、MgNO3またはNaH2PO4、あるいはそれらの組合せで強化されたものであることを特徴とする請求項18に記載の大規模プロセス。
- 前記使い捨てバイオリアクタが、1若しくは複数のポリエチレン層から作られたものであることを特徴とする請求項10に記載の大規模プロセス。
- 前記使い捨てバイオリアクタが、ポリエチレンの内層及び外層並びにナイロンの中間層から作られたものであることを特徴とする請求項21に記載の大規模プロセス。
- 前記ガンボーグB5培地が、植物ホルモンを含まないことを特徴とする請求項18に記載の大規模プロセス。
- メタボリックシンドロームまたは代謝疾患を治療、軽減、緩和または予防する方法であって、
大規模プロセスにより作製された果実細胞の細胞株カルス培養物を含む組成物を投与するステップを含み、
前記大規模プロセスが、
フラスコ内で果実細胞を増殖させるステップと、
前記果実細胞を前記フラスコから最初のバイオリアクタに植菌するステップと、
前記果実細胞を前記最初のバイオリアクタから別のバイオリアクタに植菌するステップと、
前記最後のバイオリアクタから前記果実細胞を収穫するステップとを含み、
前記別のバイオリアクタが最後のバイオリアクタまたは中間のバイオリアクタであり、かつ前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタのうちの少なくとも一方が使い捨てであり、
前記最後のバイオリアクタから収穫された前記果実細胞が乾燥されることを特徴とする方法。 - 炎症を治療、軽減、緩和または予防する方法であって、
大規模プロセスにより作製された果実細胞の細胞株カルス培養物を含む組成物を投与するステップを含み、
前記大規模プロセスが、
フラスコ内で果実細胞を増殖させるステップと、
前記果実細胞を前記フラスコから最初のバイオリアクタに植菌するステップと、
前記果実細胞を前記最初のバイオリアクタから別のバイオリアクタに植菌するステップと、
前記最後のバイオリアクタから前記果実細胞を収穫するステップとを含み、
前記別のバイオリアクタが最後のバイオリアクタまたは中間のバイオリアクタであり、かつ前記最初のバイオリアクタまたは前記別のバイオリアクタのうちの少なくとも一方が使い捨てであり、
前記最後のバイオリアクタから収穫された前記果実細胞が乾燥されることを特徴とする方法。 - 前記組成物が1日1回投与されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 大規模スケールアッププロセスにおいてインビトロで増殖したブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物を含む粉末状の組成物であって、
前記ブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物が、ブドウ果実横断切片、ブドウ果皮、ブドウ果実果肉、ブドウ種子、有核または無核の品種のブドウ胚、あるいはブドウ種皮のうちの1つ若しくは複数に由来するものであり、
前記ブドウ果実細胞の細胞株カルス培養物が、粉末1kg当たり少なくとも1000mgの量のレスベラトロールを含むことを特徴とする組成物。 - 当該組成物の単回投与後における、血漿中のレスベラトロールの2つの濃度ピークによって特徴付けられることを特徴とする請求項27に記載の組成物。
- 対象者において血圧を低下させる方法であって、
前記対象者に対して、インビトロで増殖した果実細胞の細胞株カルス培養物を含む組成物を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
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