CN102382862A - 利用悬浮培养葡萄细胞生产13c标记反式白藜芦醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物细胞培养技术，具体地说是一种利用葡萄悬浮培养细胞生产¹³C标记反式白藜芦醇的方法，将葡萄细胞置于液体培养基中培养，细胞接种量为50～200g/L湿重，在细胞接种时每升培养基中加入50～200g的无菌吸附剂；在细胞指数生长初期，于每升培养基中加入浓度分别为5～1000μM的单一诱导剂或诱导剂组合，同时添加浓度为1～10mM的¹³C标记前体；所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子。本发明中，因绝大部分¹³C标记反式白藜芦醇外泌到胞外且被吸附到吸附剂上，因而大大简化了提取分离纯化的操作，从而降低了成本，易于实现工业化生产。同位素标记反式白藜芦醇在心脑血管疾病和癌症的治疗研究中被广泛应用，因此该技术有重要的应用前景。

Description

利用悬浮培养葡萄细胞生产13C标记反式白藜芦醇的方法

技术领域

本发明涉及植物细胞培养技术，具体地说是一种通过添加¹³C标记前体生产¹³C标记反式白藜芦醇的方法。

背景技术

反式白藜芦醇(trans-resveratrol)是一种类黄酮类多酚化合物，化学名为3，5，4’-三羟基-反-二苯代乙烯)。天然的白藜芦醇存在于葡萄皮、花生及传统中药虎杖等植物体中，它属于一种植物抗毒素，在恶劣环境或是植物受到霉菌感染时产生(M.Jang，L.Cai，G.Udeani，K.Slowing，C.Thomas，C.Beecher，H.Fong，N.Farnsworth，A.Kinghorn，R.Mehta，Cancer chemopreventive activity of resveratrol，anatural product derived from grapes，Science，1997，275：218)。大量研究表明，反式白藜芦醇能够阻止低密度脂蛋白的氧化，具有抗菌、抗脂质过氧化、防治心脏病、抗癌、抗血小板凝集与血管松弛、降低血脂和抗诱变等多种药理作用，被确认为抗肿瘤剂和治疗心血管疾病的有效成分(Donnez，D.，et al.，Bioproduction ofresveratrol and stilbene derivatives by plant cells and microorganisms.Trends inbiotechnology，2009.27(12)：p.706-713.)。

随着反式白藜芦醇药理作用的阐明和研究，反式白藜芦醇正成为人们研究和开发的热点，在1990年到2000年的十年间共报道有170多篇白藜芦醇的研究工作，而在2000年到2002年的两年时间里白藜芦醇的研究文献骤然上升到238篇(P.Jeandet，A.C.Douillet-Breuil，R.Bessis，S.Debord，M.Sbaghi，M.Adrian，Phytoalexins from the Vitaceae：Biosynthesis，Phytoalexin Gene Expression inTransgenic Plants，Antifungal Activity，and Metabolism，Journal of Agriculture andFood Chemistry，2002，50：2731-2741)。而同位素¹³C标记反式白藜芦醇作为研究反式白藜芦醇在人和动物中代谢吸收的一个重要工具，其重要性越来越受到人们的关注。目前，市场上并没有专门供应¹³C标记反式白藜芦醇的公司，国外一些反式白藜芦醇药代动力学研究机构中的¹³C标记反式白藜芦醇的应用也主要来源于化学合成。但是，化学合成除了造价昂贵之外，其生产过程毒性较大也成为制约了这种方式生产的¹³C标记反式白藜芦醇在临床研究中的应用。葡萄细胞培养作为生产¹³C标记反式白藜芦醇的替代方法已受到关注(Krisa，S.，et al.，Stilbene production by Vitis vinifera cell suspension cultures：methyljasmonate induction and ¹³C biolabeling.J.Nat.Prod，1999.62(12)：p.1688-1690；Aumont，V.，et al.，Production of highly C-13-labeled polyphenols in Vitisvinifera cell bioreactor cultures.Journal of Biotechnology，2004.109(3)：p.287-294)。

目前国际上通过诱导剂及吸附剂联合诱导调控同时添加¹³C标记前体来高产量生产¹³C标记反式白藜芦醇的方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用葡萄(Vitis vinifera)悬浮细胞培养体系，以一种或多种诱导剂联合诱导并与吸附剂添加相结合，同时添加¹³C标记前体的联合调控手段来生产¹³C标记反式白藜芦醇的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

将葡萄细胞置于液体培养基中悬浮培养，细胞接种量为50～200g/L湿重，在细胞接种时每升培养基中加入50～200g的无菌吸附剂；在细胞指数生长初期，于每升培养基中加入浓度分别为5～1000μM的诱导剂，同时添加¹³C标记前体。所述诱导剂为非生物诱导剂，所述前体为¹³C标记苯丙氨酸或酪氨酸。

所述非生物诱导剂为硝酸银、水杨酸或茉莉酸及其衍生物，所述前体为¹³C标记苯丙氨酸或酪氨酸。

葡萄细胞的培养条件为：培养温度为20～30℃，暗培养；培养周期为5～20天，每隔5～10天传代一次；所述细胞指数生长初期是指细胞接种于培养基后的第2～6天，即两种诱导子及前体的添加时间。

所述吸附剂为经处理对白藜芦醇有较强吸附能力并对细胞无毒的多孔材料，如各种大孔吸附树脂。

葡萄细胞的液体培养基组成为：于B5基础培养基中添加0.1～0.4mg/L激动素，0.05～0.3萘乙酸，0.1～1g/L酶解酪蛋白及10～40g/L蔗糖，pH值为5.5～6.5。

本发明方法原理：在添加多种诱导剂的同时添加特定种类和浓度的吸附剂能显著提高反式白藜芦醇产量，同时添加¹³C标记前体可使得部分同位素标记前体转化为¹³C标记反式白藜芦醇，其主要原理有以下四方面：1、诱导剂能有效刺激植物细胞次生代谢能力，促进白藜芦醇生物合成生产；2、多种诱导剂能产生协同效应共同促进白藜芦醇生物合成生产；3、通过特定吸附剂的加入使细胞中的白藜芦醇苷以白藜芦醇的形式外泌到细胞外，从而合成了价格昂贵的白藜芦醇并解除了产物的反馈抑制，避免了白藜芦醇苷存在于胞内对细胞生长的伤害及对进一步生产的阻碍，同时也避免了白藜芦醇苷在胞内的降解；4、由于标记前体为反式白藜芦醇生物合成步骤中必须的底物，因此¹³C标记前体的添加可以使得生产的部分反式白藜芦醇被标记。

本发明具有如下优点：

1、联合应用两种或多种诱导剂和吸附剂同时添加¹³C标记前体来在葡萄细胞中生产¹³C标记反式白藜芦醇，获得的产量远远超过目前国内外文献报道的最高值。Krisa等人的报道中称总芪的产量达770μmol/L(主要产物为白藜芦醇苷，折合¹³C标记白藜芦醇的产量为300mg/L)(Krisa，S.，et al.，Stilbeneproduction by Vitis vinifera cell suspension cultures：methyl jasmonateinduction and ¹³C biolabeling.J.Nat.Prod，1999.62(12)：p.1688-1690)。之后，Aumont等人在2L生物反应器中获得360mg/L的13C标记白藜芦醇苷(折合210mg/L13C标记白藜芦醇)，本发明中生产¹³C标记反式白藜芦醇(白藜芦醇分为正式和反式，反式白藜芦醇为其活性构型)产量可达1000～1200mg/L.

2、本发明使得反式白藜芦醇95％以上外泌，被吸附到吸附剂上。大大简化了提取分离纯化的操作，降低了成本，为进一步工业化生产提供了很大的可能性(在国内的文献中反式白藜芦醇的生产大都通过对生产得到反式白藜芦醇苷进行酶解而获得)。

3、¹³C标记前体的添加使得生产的反式白藜芦醇被标记，标记率最高可达到30％～40％，这种生产方法代替了常规的化学合成的生产方法，生产过程无毒，大大降低了生产的成本和对环境的污染。

附图说明

图1显示反式白藜芦醇的¹³C标记位置；

图2为¹³C标记反式白藜芦醇的二维核磁的谱图；

图3为不同树脂促进反式白藜芦醇生产的效果比较。

具体实施方式

以下将通过实施例对本发明的有关内容作进一步说明。

一种利用葡萄细胞诱导产生白藜芦醇的方法，包括以下步骤：

(1)葡萄细胞的培养：

本实验细胞株为市购获得，也可通过对葡萄(Vitis vinifera)的种子按照常规方法诱导获得(Cormier，F.，et al.，Development of processstrategies for anthocyanin-based food colorant using Vitis vinifera cellcultures.Plant cell cultures secondary metabolism：toward industrialapplication，ed.F.Dicosmo and M.Misawa.1996，New York：CRC Press)。采用常用培养基B5培养基(Gamborg，O.L.，R.A.Miller，and K.Ojima，Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.Experimental Cell Research，1968.50(1)：p.151)，添加0.1～0.4mg/L激动素，0.05～0.3萘乙酸，0.1～1g/L酶解酪蛋白及10～40g/L蔗糖，pH值为5.5～6.5。每隔7天传代一次，使用旋转式摇床时转速为60～200rpm，培养温度为20～30℃，暗培养。

(2)¹³C标记反式白藜芦醇的联合诱导生产；

将步骤(1)所获得的葡萄细胞置于含上述培养基中培养，细胞接种量为50～200g/L湿重。培养条件为：培养温度为20～30℃，暗培养。培养周期为5～20天。

在细胞接种时每升培养基中加入50～200g的无菌吸附剂，在细胞指数生长初期同时添加一种或多种诱导剂和¹³C标记前体，于每升培养基中加入诱导子浓度为5～1000μM，前体浓度为0.1～2mM。

从由获得的培养物分离得到的吸附剂部分中提取反式白藜芦醇。反式白藜芦醇最高产量可达1000～1200mg/L。

(3)¹³C标记反式白藜芦醇含量的测定：

取1g吸附剂，加入20ml的甲醇，摇床上过夜提取；取提取液14,000g离心，备做HPLC。

HPLC采用Agilent1100高效液相色谱仪，检测波长为307nm。色谱柱采用购买的美国菲罗门公司生产的Luna柱(100mm×4.6mm，5μm)，流动相分别为20％的乙腈和85％的乙腈。流速0.4ml/min，进样量10μL。用提前制作的标准曲线来计算反式白藜芦醇含量。

(4)¹³C标记反式白藜芦醇的纯化：

吸附剂的甲醇提取物旋转蒸发后溶于5mL的甲醇中，然后用反相C₁₈柱分离纯化，包含反式白藜芦醇的部分浓缩后用硅胶柱进一步纯化，最后在SEP-PAKC₁₈半制备柱中纯化后过滤得到白色粉末即为反式白藜芦醇纯品。

(5)¹³C标记反式白藜芦醇的鉴定及¹³C标记率的测定

¹³C标记反式白藜芦醇的标记位置通过二维核磁(Varian INOVA 400 MNMR)来确定，¹³C标记率通过EA-IRMS(Flash EA 1112HT，Finnigan MAT DeltaV advantage)测定。

实施例1

培养条件：100ml摇瓶悬浮培养，采用B5培养基，另添加0.2mg/L激动素和0.1mg/L萘乙酸，0.25g酶解酪蛋白和30g/L蔗糖，pH为6.0。将过滤得到的2g提前培养的湿葡萄细胞接种到含有20ml上述培养基的摇瓶中，旋转式摇床转速100rpm，25℃培养。

第0天添加200g/L的HP2MGL，第4天添加茉莉酸和水杨酸至终浓度分别为10μM和500μM同时添加1mM的[1-13C]-L-苯丙氨酸。继续培养至第10天收获。¹³C标记反式白藜芦醇在第10天产量达到最大(1144.1mg/L)，此时反式白藜芦醇的标记率为20.8％，¹³C标记反式白藜芦醇在第5天标记率最大达到35.7％，此时¹³C标记反式白藜芦醇产量为746.2mg/L。

实施例2

实施例2与实施例1不同之处在于，通过对几种常用树脂(XAD-4、XAD-7、XAD-16、HP20和HP2MGL)的比较，结果见图3，图3中表明，HP2MGL和XAD-7树脂在促进反式白藜芦醇的生产方面优于其他树脂。

Claims (7)

1.利用悬浮培养葡萄细胞生产¹³C标记反式白藜芦醇的方法，其利用悬浮培养葡萄细胞经过诱导，添加吸附剂和添加¹³C标记前体产生¹³C标记反式白藜芦醇，其特征在于：将葡萄细胞置于液体培养基中培养，细胞接种量为50～200g/L湿重，在细胞接种时每升培养基中加入50-200g的无菌吸附剂；在细胞指数生长初期，于每升培养基中加入浓度分别为5～1000μM的单一诱导剂或诱导剂组合，同时添加1～10mM¹³C标记前体；所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子。

2.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述非生物诱导剂为硝酸银、水杨酸或茉莉酸及其衍生物。

3.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述葡萄细胞的培养条件为：培养温度为20～30℃，暗培养；培养周期为5～20天，每隔5～14天传代一次。

4.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述细胞指数生长初期是指细胞接种于培养基后的第4～10天，即诱导剂的添加时间。

5.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述吸附剂为大孔吸附树脂或对白藜芦醇及其他植物酚类和黄酮类化合物有优良吸附作用的树脂。

6.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述¹³C标记前体为¹³C标记苯丙氨酸或酪氨酸。

7.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述葡萄细胞的培养基组成为，于B5基础培养基中添加0.1～1.0mg/Lα-萘乙酸，0.2～1mg/L激动素，0.2～2g/L酶解酪蛋白及10～60g/L蔗糖，pH值为5.5～6.5。

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