CN106359108B - 一种山葡萄愈伤组织培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种山葡萄愈伤组织培养基，以MS培养基为基础添加蔗糖、琼脂、6‑苄氨基腺嘌呤和生长素类似物；生长素类似物选自萘乙酸、吲哚丁酸和2,4‑二氯苯氧乙酸中的一种。本发明还提供了使用该培养基进行耐盐山葡萄愈伤组织的诱导培养方法：将山葡萄的展叶新梢的叶片剪裁后作为外植体接种至诱导培养基上，后将诱导出的愈伤组织转移到继代培养基，后取继代愈伤组织，切成小块后接种至耐盐继代培养基，后取新生长出的愈伤组织，切成小块后接种至新的耐盐继代培养基，重复3‑4次得到耐盐愈伤组织，将其接种至扩增培养基。HPLC测定结果表明耐盐愈伤组织白藜芦醇含量为1580μg/g显著高于对照的505μg/g，约为对照的3倍。

Description

一种山葡萄愈伤组织培养基及其应用

技术领域

本发明涉及植物培养领域，具体而言，涉及一种山葡萄愈伤组织培养基及其应用。

背景技术

在有限的耕地面积下，开发利用盐荒地成为国内外研究的热点。山葡萄作为东北地区葡萄酒酿造工业的主要原料，在栽植过程中同样面临土壤盐渍化适应的难题。例如，吉林西部地区优良气候条件非常有利于山葡萄糖分的积累及葡萄酒品质的提升，但该地区土壤盐渍化程度高，极大限制了优良山葡萄资源的栽培推广。因此，选育耐盐作物品种目前已成为开发利用盐碱荒地的关键。

植物愈伤组织作为未分化的细胞团，具有脱分化和再分化潜力，是植物细胞生物学、植物胚胎学、发育和分子生物学等研究的良好基础平台，又由于愈伤组织通常具有生长迅速、繁殖量大、占用空间小、能够在控制条件下进行工厂化生产的优越性和特点，可作为医药生物反应器加以应用，同时愈伤细胞还是良种、种质保存的理想途径。近年来通过筛选耐盐愈伤组织并再生植株，已成为选育耐盐品种的重要手段。其中盐浓度的确定是进行耐盐细胞筛选的关键。若选择压力过高则可能杀死变异的细胞，若选择压力过低则会增加获得假阳性变异细胞的几率。因此，需要确定一个适宜的临界盐浓度来筛选耐盐愈伤组织。

山葡萄作为木本植物，愈伤组织诱导具有的一定难度，而有关适宜临界盐浓度的筛选及耐盐山葡萄细胞团的获得目前也未见研究报道。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种山葡萄愈伤组织培养基，所述培养基通过6-苄氨基腺嘌呤和添加生长素类似物促进愈伤组织的形成和生长，可以用于进行山葡萄愈伤组织的初代、继代以及扩增培养。

本发明的第二目的在于提供使用所述培养基进行耐盐山葡萄愈伤组织的诱导培养，本方法通过在本发明的培养基上进行初代和继代的山葡萄愈伤组织培养后，使用添加了无机盐的培养基进行诱导筛选，得到耐盐的山葡萄愈伤组织,该耐盐愈伤组织的白藜芦醇含量高。白藜芦醇是一种重要的营养物质，具有抗氧化功能。

本发明提供了一种耐盐、高白藜芦醇含量的山葡萄变异体诱导方法。研究中以山葡萄叶片外植体为材料诱导愈伤组织，以NaCl为选择因子，并且分析了不同盐浓度下愈伤组织中白藜芦醇含量，最终在适宜的选择压下，对愈伤组织进行定向直接筛选，从而获得耐盐且白藜芦醇含量较高的山葡萄变异体，以便为优异耐盐山葡萄品种选育及生物反应器研究提供基础材料。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明的一个方面涉及一种山葡萄愈伤组织培养基，所述培养基以MS培养基为基础，添加蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤和生长素类似物；其中，所述生长素类似物选自萘乙酸、吲哚丁酸和2,4-二氯苯氧乙酸中的任意一种。

优选地，所述培养基中各添加物的加入量如下：

蔗糖25-35g/L；

琼脂4-8g/L；

6-苄氨基腺嘌呤1.5-2.5mg/L；

生长素类似物0.05-0.2g/L；

优选地，所述生长素类似物是2,4-二氯苯氧乙酸。

生长调节物质是培养基中不可缺少的，虽然用量极少，但对外植体愈伤组织诱导起着重要的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素最为常用，2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)属于生长素类物质，其主要作用是诱导愈伤组织的形成。6-BA属于细胞分裂素类物质，它可以促进细胞分裂和分化。

组织培养过程中，激素含量的使用及用量是最为重要的。6-BA的浓度过低起不到分化效果，浓度过高会导致愈伤组织生根。生长素类似物浓度过高会抑制愈伤组织形成。

优选地，所述培养基的pH＝5.5-6.5。

本发明的另一个方面涉及一种耐盐且高白藜芦醇含量的山葡萄愈伤组织的诱导培养方法，所述方法包括以下步骤：

1)将山葡萄的展叶新梢剪成小段，清洗并消毒；

2)将所述小段的叶片剪裁至适合培养的大小后作为外植体接种至诱导培养基上；

3)25-30天后，将诱导出的愈伤组织转移到继代培养基上进行培养；

4)25-30天后，取继代愈伤组织，切割成小块后接种至耐盐继代培养基上；

5)18-23天后，取新生长出的愈伤组织，切割成小块后接种至新的耐盐继代培养基上继续培养；

6)重复步骤5)3-4次后，得到耐盐愈伤组织，将所述耐盐愈伤组织接种至扩增培养基上培养；

其中，所述诱导培养基、所述继代培养基和所述扩增培养基均为所述山葡萄愈伤组织培养基；所述耐盐继代培养基为所述的山葡萄愈伤组织培养基中添加了按质量百分比计1-1.5％的无机盐。

采用本发明的方法诱导培育山葡萄愈伤组织，可以使得山葡萄愈伤组织具有耐盐特性，同时还能使其白藜芦醇含量得到提高，这种高白藜芦醇含量的愈伤组织在今后生物反应器及营养成分提取过程中可以发挥重要作用，而且非转基因材料，更加安全。

优选地，所述消毒使用0.05-0.15％的升汞作为消毒剂，消毒时间为30-240s，消毒完成后使用无菌水冲洗，优选地，所述消毒时间为50-70s。

优选地，所述步骤2)中将叶片剪裁成0.5-2cm见方的小块，优选地，将叶片剪裁成0.9-1.1cm见方的小块。

优选地，所述步骤4)和5)中，将愈伤组织切割成0.4-0.6cm见方的小块。

优选地，所述无机盐是NaCl和/或KCl，优选地，所述无机盐是NaCl。

优选地，所述诱导培养基、所述继代培养基和所述扩增培养基的组分及配比完全相同；所述耐盐继代培养基除含有无机盐外，其余组分与配比与所述诱导培养基、所述继代培养基和所述扩增培养基完全相同。

优选地，所述山葡萄的品种为“左优红”、“北冰红”和“双红”中的一种，更优选地，所述山葡萄的品种为“双红”。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、本发明的培养基特别适于培养山葡萄的愈伤组织；

2)、本发明的诱导培养方法通过向合理的实验操控，逐步诱导得到山葡萄的耐盐愈伤组织，并且可以通过扩增培养实现增产；

3)、使用本发明的方法得到的山葡萄耐盐变异体，其白藜芦醇的含量高于非耐盐变异体。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为不同培养基山葡萄叶片愈伤组织诱导情况；

图2为山葡萄叶片愈伤组织的诱导培养情况；

图3为耐盐变异体与非耐盐普通愈伤组织在不同盐浓度下相对生长率的比较；

图4为山葡萄品种“双红”非耐盐普通愈伤组织在不同盐浓度下的白藜芦醇含量；

图5为耐盐愈伤组织和非耐盐普通愈伤组织的白藜芦醇含量对照。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

按照以下步骤诱导培育耐盐山葡萄变异体，其中所用山葡萄品种为左优红。

山葡萄愈伤组织培养：生长季从大田中剪取生长正常、无病虫害的山葡萄新梢带回实验室，将展叶新梢剪成小段，放入少量洗衣粉水中摇晃10min，流水冲洗20min，取叶片于超净工作台上用0.1％升汞表面消毒1min，无菌水冲洗5次后，之后将消毒的叶片剪成1cm×1cm，作为外植体接种到愈伤诱导培养基上。2周后叶片边缘开始出现愈伤组织，4周后有大量的愈伤组织产生。将愈伤组织移至继代培养基上进行继代培养。以MS为基本培养基，愈伤诱导培养基和继代培养基相同:MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L 2，4-D，pH 6.0，蔗糖含量为30g/L，琼脂6g/L。

山葡萄耐盐变异体的获得：将普通愈伤组织放到含1.5％NaCl的继代培养基上。3周后，80％以上愈伤组织变褐死亡，但在部分变褐死亡的愈伤组织周围长出了新的愈伤组织团，将长出的细胞团接种到新的含1.5％NaCl的培养基上继代，每3周继代1次，3个月后，即继代4次后获得耐盐愈伤组织，将耐盐愈伤组织放到无盐培养基上进行扩增培养，从而获得了大量耐盐山葡萄变异体，耐盐变异体白藜芦醇含量为1036μg/g鲜重，非耐盐愈伤组织中白藜芦醇含量为317μg/g鲜重。由此可见，耐盐变异体白藜芦醇含量约是非耐盐愈伤组织的3倍多。

实施例2

按照以下步骤诱导培育耐盐山葡萄变异体，其中所用山葡萄品种为双红。

山葡萄愈伤组织培养：生长季从大田中剪取生长正常、无病虫害的山葡萄新梢带回实验室，将展叶新梢剪成小段，放入少量洗衣粉水中摇晃10min，流水冲洗20min，取叶片于超净工作台上用0.15％升汞表面消毒0.5min，无菌水冲洗5次后，之后将消毒的叶片剪成0.5cm×0.5cm，作为外植体接种到愈伤诱导培养基上。2周后叶片边缘开始出现愈伤组织，25天后有大量的愈伤组织产生。将愈伤组织移至继代培养基上进行继代培养。以MS为基本培养基，愈伤诱导培养基和继代培养基相同:MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA，蔗糖含量均为25g/L，琼脂4g/L。

山葡萄耐盐变异体的获得：将普通愈伤组织放到含1.5％NaCl的继代培养基上。3周后，80％以上愈伤组织变褐死亡，但在部分变褐死亡的愈伤组织周围长出了新的愈伤组织团，将长出的细胞团接种到新的含1.5％NaCl的培养基上继代，每3周继代1次，3个月后，即继代4次后获得耐盐愈伤组织，将耐盐愈伤组织放到无盐培养基上进行扩增培养，从而获得了大量耐盐山葡萄变异体。耐盐变异体白藜芦醇含量为1526μg/g鲜重，非耐盐愈伤组织中白藜芦醇含量为505μg/g鲜重；耐盐变异体白藜芦醇含量是非耐盐愈伤组织的3倍多。

实施例3

按照以下步骤诱导培育耐盐山葡萄变异体，其中所用山葡萄品种为北冰红。

山葡萄愈伤组织培养：生长季从大田中剪取生长正常、无病虫害的山葡萄新梢带回实验室，将展叶新梢剪成小段，放入少量洗衣粉水中摇晃10min，流水冲洗20min，取叶片于超净工作台上用0.1％升汞表面消毒4min，无菌水冲洗5次后，之后将消毒的叶片剪成2cm×2cm，作为外植体接种到愈伤诱导培养基上。2周后叶片边缘开始出现愈伤组织，30天后有大量的愈伤组织产生。将愈伤组织移至继代培养基上进行继代培养。以MS为基本培养基，愈伤诱导培养基和继代培养基相同:MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA，蔗糖含量均为25g/L，琼脂4g/L。

山葡萄耐盐变异体的获得：将普通愈伤组织放到含1.0％NaCl的继代培养基上。3周后，80％以上愈伤组织变褐死亡，但在部分变褐死亡的愈伤组织周围长出了新的愈伤组织团，将长出的细胞团接种到新的含1.0％NaCl的培养基上继代，每3周继代1次，继代3次后获得耐盐愈伤组织，将耐盐愈伤组织放到无盐培养基上进行扩增培养，从而获得了大量耐盐山葡萄变异体。耐盐变异体白藜芦醇含量为749μg/g鲜重，非耐盐愈伤组织中白藜芦醇含量为343μg/g鲜重；耐盐变异体白藜芦醇含量是非耐盐愈伤组织的2倍多。

实施例4

按照以下步骤诱导培育耐盐山葡萄变异体，其中所用山葡萄品种为双红。

山葡萄愈伤组织培养：生长季从大田中剪取生长正常、无病虫害的山葡萄新梢带回实验室，将展叶新梢剪成小段，放入少量洗衣粉水中摇晃10min，流水冲洗20min，取叶片于超净工作台上用0.1％升汞表面消毒1min，无菌水冲洗5次后，之后将消毒的叶片剪成1cm×1cm，作为外植体接种到愈伤诱导培养基上。2周后叶片边缘开始出现愈伤组织，4周后有大量的愈伤组织产生。将愈伤组织移至继代培养基上进行继代培养。以MS为基本培养基，愈伤诱导培养基和继代培养基相同:MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，蔗糖含量为35g/L，琼脂8g/L。

山葡萄耐盐变异体的获得：将普通愈伤组织放到含1.5％NaCl的继代培养基上。3周后，80％以上愈伤组织变褐死亡，但在部分变褐死亡的愈伤组织周围长出了新的愈伤组织团，将长出的细胞团接种到新的含1.5％NaCl的培养基上继代，每3周继代1次，3个月后，即继代4次后获得耐盐愈伤组织，将耐盐愈伤组织放到无盐培养基上进行扩增培养，从而获得了大量耐盐山葡萄变异体。耐盐变异体白藜芦醇含量为1580μg/g鲜重，非耐盐愈伤组织中白藜芦醇含量为505μg/g鲜重；耐盐变异体白藜芦醇含量是非耐盐愈伤组织的3倍多。

实验例1

最优培养基的选择

山葡萄愈伤组织诱导培养：生长季从大田中剪取生长正常、无病虫害的山葡萄新梢带回实验室，将展叶新梢剪成小段，放入少量洗衣粉水中摇晃10min，流水冲洗20min，取叶片于超净工作台上用0.1％升汞表面消毒1min，无菌水冲洗5次后，之后将消毒的叶片剪成1cm×1cm左右，作为外植体接种到愈伤诱导培养基上(或者将组培苗叶片剪成1cm×1cm左右，直接作为外植体进行愈伤组织诱导培养)。2周后叶片边缘开始出现愈伤组织，4周后有大量的愈伤组织产生。将愈伤组织移至继代培养基上进行继代培养。以MS为基本培养基，愈伤诱导培养基和继代培养基相同将叶片外植体分别接种于以下五种培养基上，它们的蔗糖含量均为30g/L，琼脂6g/L，pH 6.0：

1.MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA；

2.MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA；

3.MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA；

4.MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L 2,4-D；

5.改良MS+2.0mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA。

其中，改良的MS培养基是将MS培养基中大量元素含量扩大10倍，其它元素含量不变，即为改良MS培养基。

优选第4种山葡萄叶片愈伤组织培养基MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L 2，4-D，诱导效果最好。详见图1、2。可见，MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L 2，4-D愈伤组织诱导效率最高，愈伤组织不易发生褐变，诱导出的愈伤组织为浅黄色疏松型愈伤组织。

实验例2

山葡萄耐盐愈伤组织筛选的临界盐浓度的确定

将实验例1中得到的继代愈伤组织切成0.5cm左右的小块分别接种到含0～2.0％NaCl的继代培养基中，每个浓度接种10瓶，每瓶8块愈伤组织。培养4周后，统计愈伤组织的相对生长率，并测定不同盐浓度下的白藜芦醇含量，来确定筛选耐盐愈伤组织的盐浓度。相对生长率计算公式如下:相对生长率＝(愈伤组织鲜重-愈伤组织的原始重量)/愈伤组织的原始重量。

山葡萄耐盐变异体在不同盐浓度下的相对生长率统计：统计公式同上，其与非耐盐普通愈伤组织的对比结果详见图3。可见，在各盐浓度处理下的耐盐愈伤组织相对生长率显著高于非耐盐愈伤组织的相对生长率呈显著性差异。可见本发明获得的耐盐愈伤组织具有明显的耐盐性。

经实验检测，0.5％NaCl对愈伤组织生长的抑制作用并不显著，1.0％及更高浓度的NaCl则明显抑制愈伤组织的生长，其中1.5％和2.0％处理4周后，愈伤组织大部分发生褐化死亡。因此，1％以上的NaCl浓度为适宜耐盐愈伤组织筛选的盐浓度。

对愈伤组织的白藜芦醇含量进行测定，方法如下：

称取愈伤组织0.5g，加入5mL甲醇研磨，避光提取12h后，0.45mm微孔滤膜过滤，获得的滤液采用高效液相色谱法测定白藜芦醇含量。Agilent-2100型液相色谱色谱条件：色谱柱Zorbax反相C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流速1mL/min；柱温30℃；检测波长306mm，288mm；梯度洗脱为流动相A：水；流动相B：乙腈。洗脱程序：0～10min，B为5～15％；10～20min，B为15～30％；20～30min，B为30～50％；30～35min，B为50～100％；34～40min，B为100～5％；40～45min，B为5％。

山葡萄愈伤组织在0～1.5％NaCl浓度处理下白藜芦醇含量逐渐增加，2.0％NaCl浓度下愈伤组织中白藜芦醇含量则降低至对照水平。综上所述，本研究优选1.5％NaCl为耐盐愈伤组织筛选的临界盐浓度。详见图4。

实验例3

山葡萄耐盐愈伤组织和非耐盐普通愈伤组织的白藜芦醇含量对比

采用实施例2中的白藜芦醇测定方法对使用本发明的方法诱导培育出的山葡萄愈伤组织的白藜芦醇含量进行测定。

以适宜的培养环境培养同种山葡萄的非耐盐普通愈伤组织，并对其白藜芦醇含量进行测定。

结果如图5所示，可见，采用本发明的方法培育的山葡萄愈伤组织不仅能够在高盐环境下生长，其白藜芦醇含量同时也得到了显著的提高。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (13)

1.一种耐盐高白芦藜醇山葡萄愈伤组织的诱导培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)将山葡萄的展叶新梢剪成小段，清洗并消毒；

2)将所述小段的叶片剪裁至适合培养的大小后作为外植体接种至诱导培养基上；

3)25-30天后，将诱导出的愈伤组织转移到继代培养基上进行培养；

4)25-30天后，取继代愈伤组织，切割成小块后接种至耐盐继代培养基上；

5)18-23天后，取新生长出的愈伤组织，切割成小块后接种至新的耐盐继代培养基上继续培养；

6)重复步骤5)3-4次后，得到耐盐愈伤组织，将所述耐盐愈伤组织接种至扩增培养基上培养；

其中，所述诱导培养基、所述继代培养基和所述扩增培养基均为山葡萄愈伤组织培养基，所述山葡萄愈伤组织培养基以MS培养基为基础，添加蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤和生长素类似物；其中，所述生长素类似物选自萘乙酸、吲哚丁酸和2,4-二氯苯氧乙酸中的任意一种，所述培养基中各添加物的加入量如下：

蔗糖25-35g/L；

琼脂4-8g/L；

6-苄氨基腺嘌呤1.5-2.5mg/L；

生长素类似物0.05-0.2g/L；

所述耐盐继代培养基为所述山葡萄愈伤组织培养基中添加了按质量百分比计1-1.5％的无机盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生长素类似物是2,4-二氯苯氧乙酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述山葡萄愈伤组织培养基的pH＝5.5-6.5。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述消毒使用0.1％的升汞作为消毒剂，消毒时间为30-240s，消毒完成后使用无菌水冲洗。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述消毒时间为50-70s。

6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中将叶片剪裁成0.5-2cm见方的小块。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将叶片剪裁成0.9-1.1cm见方的小块。

8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤4)和5)中，将愈伤组织切割成0.4-0.6cm见方的小块。

9.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述无机盐是NaCl和/或KCl。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述无机盐是NaCl。

11.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基、所述继代培养基和所述扩增培养基的组分及配比完全相同；所述耐盐继代培养基除含有无机盐外，其余组分与配比与所述诱导培养基、所述继代培养基和所述扩增培养基完全相同。

12.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述山葡萄的品种为“左优红”、“北冰红”和“双红”中的一种。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述山葡萄品种是“双红”。