JP2016500077A - 治療的使用のためのリポソーム封入ビンクリスチンの調製のための改良法 - Google Patents

Abstract

誤操作および汚染の危険性が減少した静脈内注射（ＶＳＬＩ）のためにリポソーム封入ビンクリスチンを効率的に構成するための改良法を開示する。【選択図】なし

Description

関連出願
本願は、２０１２年１１月２０日に出願され、その全体が参照により本明細書中で援用される、米国特許仮出願第６１／７２８３７８号、表題「治療的使用のためのリポソーム封入ビンクリスチンの調製のための改良法」の優先権を吸長する。

リポソームは、薬物の血漿分布および薬物動態を非封入形態よりも改善することによって、治療効果のある薬物の有効性を増強できる、充分確立されたナノ粒子である（例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： Ｆｒｏｍ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， （Ｏｓｔｒｏ， Ｍ． Ｊ．， ｅｄ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ． ２７７−３３８， （１９８７）。例えば、硫酸ビンクリスチンリポソーム注射（ＶＳＬＩ）は、標準的硫酸ビンクリスチン注射ＵＳＰ（ＶＳＩ）よりも高い有効性を提供するスフィンゴミエリン−コレステロールリポソーム中に封入された抗ガン治療用硫酸ビンクリスチンのリポソーム配合物である。臨床試験は、非封入ビンクリスチンと比較してビンクリスチンの循環半減期を有意に延長することによってＶＳＬＩは薬剤投与量の増加を容易にすることも示す。リポソームは遅延型薬物放出のための機構を提供し、リポソームサイズは、薬物が溢出によってガン組織中に蓄積することを可能にする（Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４２：４６１−４７０， １９９８； Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５８：２４５−２５５， ２００６）。これらの特性は、標準的ＶＳＩよりも改善された臨床的利点になる。

硫酸ビンクリスチンのスフィンゴミエリン−コレステロールリポソーム中への封入は、典型的には、酸性リポソーム内ｐＨ（例えば、ｐＨ４）および中性ｐＨ（例えば、ｐＨ７）の外部媒体を使用することによって達成される。このｐＨ勾配によって、弱塩基性ビンクリスチンがリポソーム内部に高効率で拡散することが可能になる（Ｃｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ９： ２６８−２７２， １９９１； Ｂｏｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １１５２：２５３−２５８， １９９３）。膜貫通ｐＨ勾配を有するリポソーム内部にビンクリスチンを蓄積させるために、リポソーム膜はビンクリスチンの立体的容積に対して一時的に透過性にならなければならない。したがって、多くの場合、リポソーム中に受動的に封入することができる中性またはアニオン性薬物とは異なって、スフィンゴミエリン−コレステロールリポソームの温度は、膜貫通ｐＨ勾配がビンクリスチンと機能するために上昇させなければならない。かみあったスフィンゴミエリンとコレステロール分子の配置であるリポソーム二重層は、サーモトロピック不規則遷移状態を創出するために独特の過渡熱パターンを必要とする。これらの遷移状態は、膜脂質間の弱い分子間結合を本質的に減弱させ、かみあった脂質にギャップを形成し、そしてリポソームバイオ層（ｂｉｏｌａｙｅｒ）を一時的に透過性にする。封入プロセスは、周囲温度まで冷ますと起こるスフィンゴミエリン−コレステロール脂質の自発的自己再構成を利用し、これは膜完全性を回復させる。

薬物封入に関するこの加熱プロフィールは、熱への暴露に対するビンクリスチンの化学的不安定性とバランスを平衡させなければならない（Ｖｅｎｄｒｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ． Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ５０： １８９−１９６， １９８９； Ｓｅｔｈｉ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４５：５３８６−５３８９， １９８５）。ビンクリスチンは熱的に不安定であり、高温の存在下で容易にＮ−デスホルミルビンクリスチンに分解する。ビンクリスチンのこのホルムアミド加水分解は周知の分解経路であり、硫酸ビンクリスチン注射（ＶＬＳＩ）の安定性持続期間に影響を及ぼす。例えば、ＶＬＳＩ溶液はこの熱不安定性のために加熱滅菌できず、安定性の延長を実現するためには、冷蔵温度で保管し、輸送しなければならない。

したがって、現在、硫酸ビンクリスチンリポソーム注射（ＶＳＬＩ）はＦＤＡで認可されたラベル上に提供される指示（ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ；参照ＩＤ：３１７２２１１、２０１２）にしたがって、薬局で個々の成分から調製される。これらの指示には、スフィンゴミエリン−コレステロールリポソーム中のビンクリスチンの効率のよい封入を達成し、ビンクリスチンの化学的純度を維持するために、水浴の使用を必要とする加熱処置が含まれる。水の優れた熱伝達特性によって、薬物の感知され得る化学分解がなくビンクリスチンの９５％を超える封入が可能になる。

ＶＳＬＩは注射可能な薬物であるので、成分の製造および薬局調剤は無菌状態を維持するために厳密に規制される。したがって、ＶＳＬＩの調製の間に開放型水浴（ｏｐｅｎ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）を使用することは、さらなる資源、計画、および装置（例えば、浮き輪（ｆｌｏａｔｉｎｇ ｒｉｎｇ））、たとえば無菌環境を維持するために無菌フードまたは「クリーン」ルームを必要とする。一部の薬局では、無菌環境の維持に関する制限のためにＶＳＬＩの構成を実施することができない。

したがって、現在必要とされるさらなる資源および装置なしで効率的かつ再現可能に実施できるＶＳＬＩ調製の改良法が依然として必要とされている。

本発明は、少なくとも一つには、封入プロセス中に加熱した水浴の使用の必要性を回避するＶＳＬＩ調製法の開発に基づく。したがって、本発明は効率のよい再現可能なＶＳＬＩ調製法であって、意外にも容易かつ汚染のリスクが低く広く使用することができる方法を提供する。

１つの態様において、本発明は、実質的な分解生成物のないリポソーム封入ビンクリスチンを含む薬剤的に許容される液体組成物を調製する方法であって、（ａ）１つのバイアル中で、（ｉ）約１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの濃度で硫酸ビンクリスチンを含む第１溶液であって、約３．５〜約５．５のｐＨを有する第１溶液と、（ｉｉ）低ｐＨでスフィンゴミエリン／コレステロールリポソームを含む第２溶液とを構成するステップ；（ｂ）１つのバイアル中で構成溶液の約７．０〜７．５のｐＨを上昇させるステップ；（ｃ）約７５℃で平衡化された乾燥加熱ブロック中で構成溶液を含む１つのバイアルを少なくとも約１３〜約１８分加熱するステップであって、前記加熱ブロックが、構成されたリポソーム封入ビンクリスチンを含む溶液を製造するために１つのバイアルの平均長さまたは直径よりも約１〜５％大きな１以上の孔を含む、ステップ；（ｄ）構成された溶液を室温に平衡化させるステップ；（ｅ）約１．５〜約２．４ｍｇ／ｍ^２の患者の用量のリポソーム封入ビンクリスチンを含む構成された溶液の体積を、静脈内投与に適した医薬希釈剤で希釈して、薬剤的に許容される液体組成物を製造するステップ；および（ｆ）薬剤的に許容される液体組成物を患者に投与するステップであって、リポソーム封入ビンクリスチンを含む構成された溶液が（ｉ）約２．５％未満の遊離ビンクリスチンと（ｉｉ）約１．５％未満のＮ−デスホルミルビンクリスチンとを含むステップを含む方法を特徴とする。

いくつかの実施形態において、硫酸ビンクリスチンを含む第１溶液は、約４．５〜約４．７のｐＨを有する。１つの実施形態では、第１溶液は約１００〜２００ｍｇ／ｍＬの濃度でマンニトールをさらに含む。

いくつかの実施形態において、リポソームを含む第２溶液のｐＨは約４．０である。１つの実施形態では、第２溶液はクエン酸塩緩衝液をさらに含む。

いくつかの実施形態では、構成溶液のｐＨを、約９．０のｐＨの緩衝液を含む第３溶液の添加によって上昇させる。１つの実施形態では、第３溶液はリン酸ナトリウム緩衝液を含む。

いくつかの実施形態において、構成溶液は、約０．１／１．０〜約０．２／２．０の硫酸ビンクリスチン対脂質の濃度比を含む。

いくつかの実施形態において、構成された溶液中の硫酸ビンクリスチンの濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、構成された溶液中の硫酸ビンクリスチンの濃度は約０．１５ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬ付近である。１つの実施形態では、構成された溶液中の硫酸ビンクリスチンの濃度は約０．１６ｍｇ／ｍＬである。

１つの実施形態では、第１溶液は硫酸ビンクリスチンＵＳＰ（５ｍｇ／５ｍＬ）（４．５ｍｇ／５ｍＬのビンクリスチン遊離塩基に等しい）と５００ｍｇ／５ｍＬのマンニトールとを含み、第２溶液は７３．５ｍｇ／ｍＬのスフィンゴミエリンと２９．５ｍｇ／ｍＬのコレステロールと３３．６ｍｇ／ｍＬのクエン酸、３５．４ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウムとからなるスフィンゴミエリン／コレステロールリポソームを含み、そして第３溶液は３５５ｍｇ／２５ｍＬのリン酸水素ナトリウムと２２５ｍｇ／２５ｍＬの塩化ナトリウムとを含む。

いくつかの実施形態において、リポソーム中のスフィンゴミエリン対コレステロールの比は約７５／２５モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロール〜３０／５０モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロールである。いくつかの実施形態において、リポソームは約７０／３０モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロール〜４０／４５モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロールを含む。１つの実施形態では、リポソームは約５５／４５モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロールを含む。別の実施形態では、約６０／４０モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロールを含むリポソーム。

いくつかの実施形態において、リポソームは約０．０５〜０．５ミクロンのサイズ範囲を有する。いくつかの実施形態において、リポソームは約５０〜２００ｎｍの平均直径を有する。１つの実施形態では、リポソームは約９０〜１２５ｎｍの平均直径を有する。

いくつかの実施形態では、構成溶液は約２０〜５０ｍＬの体積を有する。いくつかの実施形態では、構成溶液は３０〜３５ｍＬの体積を有する。

いくつかの実施形態において、構成溶液を含むバイアルの挿入前に加熱ブロックを約１５分間７５±２℃に平衡化する。いくつかの実施形態において、構成溶液を７５±２℃で平衡化したドライブロックのカリバー孔内で約１３〜１５分間加熱する。１つの実施形態では、構成溶液を７５±２℃に平衡化させたドライブロックのカリバー孔内で１４分±３０秒間加熱する。

いくつかの実施形態において、加熱ブロック中の孔は構成溶液を含む１つのバイアルの平均長さまたは直径よりも約３％未満大きい。いくつかの実施形態において、構成溶液を含む１つのバイアルは約３５．８〜約３７．３ｍｍの直径を有し、加熱ブロック中のカリバー孔は直径３７．２〜３７．８ｍｍの円筒形である。

いくつかの実施形態において、構成された溶液を室温に少なくとも約３０分間平衡化する。

いくつかの実施形態において、約１．５〜約２．４ｍｇ／ｍ^２の患者のためのリポソーム封入ビンクリスチンの用量を含む構成された溶液の体積を静脈内投与に適した標準的医薬希釈剤で希釈して、薬剤的に許容される液体組成物を製造する。いくつかの実施形態において、患者の算出された用量の体積を注入容器から取り出し、構成されたＶＳＬＩ溶液の算出された体積と置換する。

いくつかの実施形態において、リポソーム封入ビンクリスチンを含む薬剤的に許容される液体組成物を構成後２４時間以内で患者に投与する。

本発明の方法にしたがって製造されるＶＳＬＩは典型的にはガンを有する患者に投与される。いくつかの実施形態において、ガンは、リンパ腫、白血病、骨髄腫、脳腫瘍または神経芽細胞腫である。

いくつかの実施形態において、リポソーム封入ビンクリスチンを含む薬剤的に許容される液体組成物を静脈内注入によって約３０〜６０分の期間にわたって投与する。いくつかの実施形態において、リポソーム封入ビンクリスチンを含む薬剤的に許容される液体組成物を静脈内注入によって７〜２８日ごとに１回投与する。１つの実施形態では、リポソーム封入ビンクリスチンを含む薬剤的に許容される液体組成物を静脈内注入により７日ごとに１回投与する。

図１は、ドライブロックおよび水浴を使用した、硫酸ビンクリスチンおよびスフィンゴミエリン／コレステロールリポソームを含有する構成された溶液の内部熱プロフィールを示すグラフである。

本発明は、現在使用されているＶＬＳＩ調製法での水浴の使用に関連する欠点を克服する。驚くべきことに、ＶＳＬＩを構成するために使用される容器に適合するように設計された特注設計の挿入物を有する加熱ブロックの使用は、顕著な分解なしにビンクリスチンの均一な封入を達成するために必要な熱プロフィールを提供することが判明した。

加えて、本明細書中に記載されるＶＳＬＩの調製方法がパラメトリック放出を示す改善された能力が顕著である。ＶＳＬＩの安定性は「ジャストインタイム（ｊｕｓｔ ｉｎ ｔｉｍｅ）」の調製を保証するので、構成プロセスは非常に効率がよくなければならず、また薬剤師によって再現可能でなければならない。熱によって誘導されるプロセスは「構成プロセスの間に集められた情報の再検討およびパラメトリック放出に関連する特定のＧＭＰ要件の順守に基づいて、生成物が意図する品質のものであることを保証する放出系」を提供するので、これによって封入が達成されたことを薬剤師が知っている（すなわちパラメトリック的に）必要がある（Ａｎｎｅｘ １７ ＥＵ ｇｕｉｄａｎｃｅ）。

本発明の加熱ブロック手順は、９５％を超える封入効率でＶＳＬＩの構成を達成するための便利で柔軟なプロセスを提供する。関連するステップが少ないので、誤操作の可能性が減少する。プロセスは全体的により簡単であり、時間がかからず、使用する資源が少なく、そして日常的な薬剤業務に好都合である。さらに、ＶＳＬＩの個々の調製は、水浴または加熱された水浴からの水蒸気中で増殖する微生物に由来する潜在的な微生物汚染に対応する必要がない。

定義
特に断りのない限り、本明細書中で使用する全ての技術および科学用語は、治療および薬剤科学の当業者には通常理解される標準的定義を有する。

単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は文脈上明らかに別段の指示がない限り複数の参照物を包含する。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅおよびｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、包括的で限定されない意味で使用して、さらなる要素が含まれ得ることを意味する。

「約」という語は、特に所与の量または数について言及する場合、±５パーセントの偏差を含むことを意味する。

「無菌」組成物または容器は、本明細書中で用いられる場合、ＵＳＰ無菌テストを用いて判定される生存可能な微生物がない。（“米国薬局方協会：２００８を参照のこと）。

「リポソーム」「小胞」および「リポソーム小胞」は、水性内容物を封入する脂質含有膜を有する構造を指すと理解される。この構造は、別段の指示がない限り、１以上の脂質膜を有し得るが、一般的には膜を１つだけ有する。そのような単層リポソームを本明細書中では「ユニラメラ」と称する。多層リポソームを本明細書中では「マルチラメラ」と称する。

「標準的」治療薬、または「遊離」治療薬とは、リポソーム封入されていない治療薬を指す。通常、薬物は、別段の定めがない限り「標準的」または「遊離」であると推定される。しかしながら、遊離形態の標準的ビンカ・アルカロイドはそれでも化学療法化合物、医薬担体、または錯化剤などの他の試薬との組み合わせで存在する可能性がある、すなわち、本明細書中で用いる場合、この語はビンカ・アルカロイドの脂質配合物を特に除外するだけである。

「ジャストインタイム」という語句は、製剤の品質を維持する（例えば、分解を最小限に抑える）ために、患者に投与する前に製剤（例えば、ＶＳＬＩ）の別個の成分をすぐに（例えば、２４時間以内）組み合わせることを指す。

「全身性送達」は、本明細書中で用いられる場合、有機体内での化合物の広い生体内分布に至る送達を指す。全身性送達は、化合物の有用で、好ましくは治療量が身体のほとんどの部分に暴露されることを意味する。広い生体内分布を得るためには、概して、疾患部位に到達する前に化合物が（例えば初回通過器官（肝臓、肺など）によるか、または迅速な非特異的細胞結合により）急速に分解または一掃されないような導入経路を必要とする。リポソーム封入ビンカ・アルカロイドの全身性送達は、好ましくは静脈内送達によって得られる。

「治療有効量」という語句は、哺乳類における疾患または障害（例えば、ガン）を治療するために有効で、例えば不変疾患、ガン状態の部分寛解または完全寛解をもたらす薬物（例えば、ＶＳＬＩ）の量を指す。

「不変疾患」は、本明細書中で用いられる場合、薬物（例えば、ＶＳＬＩ）の投与によって標準的臨床的、放射線学的および／または生化学的手段によって測定される腫瘍またはガンの成長または有病率が停止するが、ガンのサイズまたは有病率の軽減または減少がない状態を指す。

「部分応答」または「部分寛解」は、治療に反応した、標準的臨床的、放射線学的および／または生化学的手段によって測定されるガン状態の改善を指す。典型的には、「部分応答」とは、腫瘍のサイズまたはガンを示す血液マーカーのレベルが治療に反応してベースラインレベルから（例えば、２０％、３０％、４０％または５０％）減少したことを意味する。例えば、血液ガンの治療に関して、応答を国際作業部会基準（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ （ＩＷＳ）基準；ＢＤ Ｃｈｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １５：４６４２−４６４９）に基づいて評価する。

「完全応答」または「完全寛解」は、例えば、腫瘍サイズおよび／またはガンマーカーレベルによって測定されるようなガン状態が治療後に検出できないことを意味する。

「神経毒性」は、感覚麻痺、知覚過敏、錯感覚、反射低下、反射消失、神経痛、顎痛、振動感覚の低下、脳神経障害、腸閉塞、灼熱感、関節痛、筋肉痛、筋けいれん、虚弱、ならびに／または治療前および治療中の両方での起立性低血圧（ｈｙｐｔｅｎｓｉｏｎ）などの神経障害の症状を包含する。起立性低血圧が起こる可能性がある。神経毒性を、国立がん研究所（ＮＣＩ）有害事象共通用語規準（ＣＴＣＡＥ）バージョン４．０３（ｈｔｔｐ：／／ｃｔｅｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ／ｅｔｃ．ｈｔｍｌ）に基づいてグレード１〜グレード３として評価する。

硫酸ビンクリスチン
硫酸ビンクリスチンは、ツルニチニチソウ（ｐｅｒｉｗｉｎｋｌｅ ｐｌａｎｔ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ））から最初に単離されたビンカ・アルカロイドファミリーのメンバーである。硫酸ビンクリスチンは、細胞周期特異的抗がん活性を有する。ビンカ・アルカロイドはチューブリンと結合し、チューブリン重合を変え、中期停止、細胞有糸分裂の阻害、および細胞死に至る。細胞周期特異的薬剤として、その治療反応は、拡張された薬物レベルを維持するリポソーム封入によって向上される。細胞のビンクリスチン（および他の細胞周期特異的薬物）への延長された暴露は、薬物のインビトロ細胞毒性を増強することが示されている（Ｂｆｕｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ， ＪＮＣＩ ８４； １８１６−１８２６， １９９２； Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３：４４９−４５４， １９９７； Ｊａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３９：４３４６−４３４９， １９７９）。

硫酸ビンクリスチンは、通常、１：１硫酸塩として単離される。それは、吸湿性の白色から若干黄色がかった結晶性粉末であり、これは水中に可溶性である。それは、９２３．０４（塩形態）／８２４．９８（塩基形態）の分子量およびＣ_４６Ｈ_５６Ｎ_４Ｏ_１０・Ｈ_２ＳＯ_４の分子式を有する。硫酸ビンクリスチンの化学名は２２−オキソビンカロイコブラスチンであり、以下の化学構造を有する：

硫酸ビンクリスチンは、硫酸ビンクリスチン注射ＵＳＰとして（例えば、１ｍｇ／ｍＬ溶液として）処方され、硫酸ロイコクリスチン、キオクリスチン、ビンコシド、ビンクレックス、オンコビン、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ（登録商標）としても知られ、多くの供給源から市販されている。

リポソーム
本発明のリポソーム担体成分は、スフィンゴミエリンおよびコレステロールリポソーム注射（ＳＣＬＩ）から構成される。リポソーム中に存在するスフィンゴミエリンとコレステロールの比は様々であり得るが、一般的には７５／２５モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロール〜３０／５０モル％モル％スフィンゴミエリン／コレステロールの範囲内である。１つの実施形態では、リポソーム組成物は約７０／３０モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロール〜４０／４５モル％モル％スフィンゴミエリン／コレステロールを含む。別の実施形態では、リポソーム組成物は約５５／４５モル％モル％スフィンゴミエリン／コレステロールを含む。さらに別の実施形態では、リポソーム組成物は約６０／４０モル％モル％スフィンゴミエリン／コレステロールを含む。

ある実施形態では、例えば脂質酸化を防止するため、またはリガンドをリポソーム表面上に結合させるために、さらなる脂質が配合物中に存在してもよい。一般的に、他の脂質を含めることにより、スフィンゴミエリン／コレステロール比が減少する。

本発明で使用するスフィンゴミエリン／コレステロールリポソームはマルチラメラまたはユニラメラであり得る。リポソームを調製するための好適な方法としては、限定されるものではないが、超音波処理、押出、高圧／均質化、顕微溶液化、界面活性剤透析法（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｄｉａｌｙｓｉｓ）、小リポソーム小胞のカルシウム誘発性融合、薄膜蒸発、およびエーテル注入法が挙げられ、これらはすべて当該技術分野で周知である。例えば、Ｓｚｏｋａ， ｅｔ ａｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９：４６７ （１９８０）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、同第４，９４６，７８７号、同第５，５４３，１５２号、同第６，７２３，３３８号、国際公開第９１／１７４２４号、Ｄｅａｍｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｇｈａｍ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ４４３：６２９ ６３４ （１９７６）； Ｆｒａｌｅｙ， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６：３３４８ ３３５２ （１９７９）； Ｈｏｐｅ， ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ８１２：５５ ６５ （１９８５）； Ｍａｙｅｒ， ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ８５８： １６１ １６８ （１９８６）； Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８５：２４２ ２４６ （１９８８）， ｔｈｅ ｔｅｘｔ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ， Ｍａｒｃ Ｊ． Ｏｓｔｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３， Ｃｈａｐｔｅｒ １、およびＨｏｐｅ， ｅｔ ａｌ， Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｌｉｐ．， ４０：８９ （１９８６）で記載されているような様々な方法がリポソームの調製のために利用可能であり、これらはすべて参照により本明細書中で援用される。

リポソーム調製後、当該技術分野で周知の標準方法（例えば米国特許第６，７２３，３３８号を参照のこと）を使用してリポソームをサイズ分類して所望の粒子サイズ範囲を達成することができる。本明細書中で記載されるＶＳＬＩ製剤で使用できる典型的なリポソームは、約０．０５〜０．５ミクロン（５０〜５００ｎｍ）、０．２〜０．４ミクロン（２００〜４００ｎｍ）、約０．１〜０．４ミクロン（１００〜４００ｎｍ）、約０．０５〜０．２（５０〜２００ｎｍ）または約０．５（５００ｎｍ）〜約０．１５ミクロン（１５０ｎｍ）のサイズ範囲を有する。ある実施形態では、リポソームは、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１９０ｎｍ、または約２００ｎｍの平均粒子径を有する粒子サイズを有する。１つの実施形態では、平均粒子サイズは９０〜１２５ｎｍであり、好ましい平均粒子サイズは約１０７．５ｎｍであって、粒子サイズ分布の２５％は７０ｎｍ以上であり、分布の９０％は１７０ｎｍ以下の粒子サイズを有する。

スフィンゴミエリン／コレステロールリポソームは、本明細書中で記載するＶＳＬＩ製材で使用されるリポソーム成分として機能し、リポソーム内部が低ｐＨになるように製造される。構成プロセスの間、低ｐＨを有するＶＳＩ、および低ｐＨを有するＳＰＬＩを高ｐＨの緩衝液中で希釈し、そのため、外部ＶＳＬＩ溶液の最終ｐＨはほぼ生理学的に中性である。結果として、脂質膜内外でｐＨ勾配が生じ、この場合、ｐＨはリポソームの内側コア中では外側の周囲の溶液よりも低い。そのような勾配は、公知方法（例えば、ＵＳ６，７２３，３３８）にしたがって達成される。例えば、勾配は、約２〜約６のｐＨ、約３〜約５のｐＨを有する緩衝液の存在下でリポソームを配合し、続いてリポソームをより高いｐＨ、例えば、約７．０〜約７．５のｐＨに移すことによって達成することができる。１つの実施形態では、リポソームは約４．０の内部ｐＨを有する。リン酸ナトリウムなどの任意の数の希釈緩衝液を使用できる。１つの実施形態において、緩衝液は、最終的な希釈された外部リポソーム溶液がＶＳＩおよびＳＰＬＩと混合された場合に生理的中性ｐＨを有するように、８〜１０、好ましくは９．０のｐＨを有する。

本明細書中で記載する方法にしたがってＶＳＬＩの調製で使用する前に、ＳＰＬＩリポソームは、患者へ投与するためのＶＳＬＩの薬物封入および構成前の実質的な期間、冷蔵条件で保存することができる。別法として、リポソームを脱水し、保管し、周知方法にしたがって使用する前に再水和することができる（例えば、米国特許第５，０７７，０５６号または同第５，７３６，１５５号を参照のこと）。

ＶＳＬＩ調製
ＶＳＬＩを厳格な無菌技術で、例えば生物学的安全キャビネット中、または無菌注射可能な配合物および有害薬物の調製のための確立された薬学的安全手順により、調製する。抗がん剤の取り扱いおよび廃棄の手順は厳格に守られなければならない（ＮＩＯＳＨ Ａｌｅｒｔ： Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｈａｚａｒｄｏｕｓ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｓｅｔｔｉｎｇｓ． ２００４． Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ， ＤＨＨＳ （ＮＩＯＳＨ） Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ２００４− １６； ＯＳＨＡ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ， ＴＥＤ １−０．１５ Ａ， Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩ： Ｃｈａｐｔｅｒ ２． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ Ｈａｚａｒｄｏｕｓ Ｄｒｕｇｓ． ＯＳＨＡ， １９９９； Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ． ＡＳＨＰ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｈａｎｄｌｉｎｇ Ｈａｚａｒｄｏｕｓ Ｄｒｕｇｓ． Ａｍ Ｊ Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ Ｐｈａｒｍ． （２００６） ６３： １１７２−１１９３； Ｐｏｌｏｖｉｃｈ Ｍ， Ｗｈｉｔｅ ＪＭ， Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ＬＯ （ｅｄｓ．） ２００５． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒａｃｔｉｃｅ （２ｎｄ． ｅｄ．） Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ： Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｎｕｒｓｉｎｇ Ｓｏｃｉｅｔｙ）

構成されたＶＳＬＩを調製するためのプロセスは、以下の一般的ステップを含む：
・約３．５〜約５．５、または約４．５〜約４．７のｐＨで約１００〜約２００ｍｇ／ｍＬのマンニトール（硫酸ビンクリスチンが安定なままである他の薬剤的に許容される賦形剤も使用できる）を含有する緩衝液中、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬまたは約５ｍｇ／ｍＬを含有する硫酸ビンクリスチンの第１溶液と、低ｐＨ（例えば、約４．０）の緩衝液中に懸濁させたリポソームの第２溶液とを適切な濃度比、例えば、０．１／１．０〜０．２／１．０（重量硫酸ビンクリスチン対重量脂質）で混合することによって、構成溶液を調製する。
・硫酸ビンクリスチンおよびリポソームを含有する構成溶液のｐＨを次いで約７．０〜約７．５まで上昇させて、ｐＨ勾配を生じさせる。これは、例えば、より高いｐＨ（例えば、約９．０）の緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム）の添加によって達成することができる。
・構成溶液を次いで少なくとも約１３〜約１８分間、構成溶液を含む容器の平均長さまたは直径よりも約５％未満大きなカリバーウェルを含む約７５℃に平衡化させたドライ加熱ブロック中で加熱して、構成された生成物ＶＳＬＩを得る。
・構成された生成物を含む加熱された構成溶液を次いで少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間または少なくとも約６０分間、室温（１５℃〜３０℃）に平衡化させる。
・患者に投与される構成されたＶＳＬＩの用量に相当する体積の構成溶液を次いで静脈内投与に適した溶液と混合して、約１００ｍＬの最終体積にする。

いくつかの実施形態において、硫酸ビンクリスチン、リポソームおよび高ｐＨ緩衝液の溶液を３つの別個の容器中で提供する。ある実施形態では、３つの溶液を、例えば、約２０〜５０ｍＬ、約２５〜４０ｍＬ、または約３０〜３５ｍＬの溶液の総体積を含むような容量を有する１つの無菌容器中で構成する。

１つの実施形態では、別個の成分を３以上のバイアルを含むキットとして提供する。バイアルの少なくとも１つは、たとえば１００または２００ｍｇ／ｍＬのマンニトール（薬剤的に許容され、ビンクリスチンが長時間安定なままである他の賦形剤も使用できる）を含む緩衝液中、たとえば１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、または５ｍｇ／ｍＬの硫酸ビンクリスチンを含み、ｐＨ３．５〜５．５、または好ましくはｐＨ４．５〜ｐＨ４．７に調節した、ビンクリスチン溶液を含む。バイアルの１つは、たとえばｐＨ４．０の３００ｍＭのクエン酸塩緩衝液中に懸濁されたスフィンゴミエリンおよびコレステロールリポソームを含む溶液を含む。別のバイアル（複数可）はリン酸水素ナトリウムなどのアルカリ性リン酸塩緩衝液（例えば、ｐＨ９．０）、１４．２ｍｇ／ｍＬ（２０ｍｌ／バイアル）を含む。

１つの実施形態では、（ｉ）硫酸ビンクリスチンＵＳＰ（５ｍｇ／５ｍＬ）（４．５ｍｇ／５ｍＬのビンクリスチン遊離塩基に等しい）、および５００ｍｇ／５ｍＬのマンニトール；（ｉｉ）７３．５ｍｇ／ｍＬのスフィンゴミエリン、２９．５ｍｇ／ｍＬのコレステロール、３３．６ｍｇ／ｍＬのクエン酸、３５．４ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、および０．１％以下のエタノールからなるスフィンゴミエリン／コレステロールリポソーム注射（ＳＰＬＩ）；および（ｉｉｉ）３５５ｍｇ／２５ｍＬのリン酸水素ナトリウムおよび２２５ｍｇ／２５ｍＬの塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウム注射（ＳＰＩ）（すべて注射用水で調製）を含有する３つのバイアル中でＶＳＬＩの構成のための成分を別々に提供する。

本発明の方法で使用される容器は、無菌であり、任意の薬剤的に許容される物質（例えば、ガラスまたはプラスチック）から構成される。多くの異なる製造業者（例えば、Ｗｈｅａｔｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって市販されている多くの異なる種類、サイズのバイアルがある。１つの実施形態では、約３６．５ｍｍの平均直径、および約３５．８〜約３７．３ｍｍの平均範囲を有する無菌バイアル中で成分を構成する。

安全な乾燥定温源を提供する好適なドライブロックヒーターは、多くの供給源（例えば、Ｂｉｂｂｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ， Ｖ＆ Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．， Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｉｎｃ．）から市販されている。構成溶液の容器を受容するように適応させた口径の１以上の孔を有する熱伝導性挿入物は、金属（例えば、陽極酸化処理アルミニウム、銅）または他の好適な熱伝導性材料であってよい。適切なサイズの開口部の孔を含む挿入物を容易に得ることができる（例えば、Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｉｎｃ．）、または標準的方法を用いて製造することができる。ある実施形態では、加熱ブロックは、構成溶液を含む容器の平均長さまたは直径よりも約１〜５％、または約４．５％、４．２％、４．０％、３．８％、３．５％、３．３％、３．０％、２．８％、２．５％、２．２％、２．０％、１．８％、１．５％、１．２％もしくは１．０％大きな開口部を含む。いくつかの実施形態において、加熱ブロックは円筒形開口部を含む。１つの実施形態では、開口部は直径３７．２〜３７．８ｍｍ、または直径約３７．４〜３７．６ｍｍである。

いくつかの実施形態では、構成溶液を約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約７５℃にて加熱する。１つの実施形態では、構成溶液を７５℃で平衡化させた加熱ブロック中で約１４分間加熱する。

構成されたＶＳＬＩを、例えば前もって充填された無菌容器（ガラスビン、プラスチックビンまたはプラスチックバッグ）中で提供してもよい、患者への静脈内投与に適した薬剤的に許容される希釈剤（例えば、デキストロース、塩化ナトリウム）と混合してもよい。いくつかの実施形態において、患者の計算された用量の体積を輸液バッグから取り出し、計算された体積の構成されたＶＳＬＩ溶液と置換して輸液バッグ中に入れ、例えばこの場合、注入容器の最終容積は１００ｍＬである。１つの実施形態では、薬剤的に許容される希釈剤は５％デキストロース注射または０．９％塩化ナトリウム注射のものである。

ＶＳＬＩ
本明細書中で記載する方法にしたがって製造されるＶＳＬＩは、眼に見える異物および凝集物が本質的にない白色から灰白色の半透明懸濁液に見える。典型的には、硫酸ビンクリスチンの約９５％超、約９６％、約９７％、約９８％またはそれ以上がリポソーム中に封入される。

本明細書中で記載する方法にしたがって製造されるＶＳＬＩは、約４．０％未満、３．５％、３．４％、３．２％、３．１％または３．０％の全不純物を含む。いくつかの実施形態において、ＶＳＬＩは、約２．０％未満、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％または１．３％のＮ−デスホルミルビンクリスチンを含む。

本明細書中で記載する方法にしたがって製造されるＶＳＬＩは、７２時間以内で少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％または約８５％の平均インビトロ放出速度（ＩＶＲ）またはインビボ放出速度を有する。

ビンクリスチン封入レベル、不純物のレベルおよびリポソームからのビンクリスチンの放出速度を決定するためのアッセイは当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第５５４３１５２号および同第５８３７２８２号；Ｚｈｉｇａｌｓｔｅｖ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０４： １０３−１１１， ２００５）；Ｐｕｓｃａｌａｕ ｅｔ ａｌ． Ａｍ． Ｊ． Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ． Ｐｈａｒｍ． ６２： １６０６−１６１２， ２００５）を参照のこと。

一般的に、本明細書中で記載する方法にしたがって製造されるＶＳＬＩは硫酸ビンクリスチンを約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．５ｍｇ／ｍＬで含む。ある実施形態では、硫酸ビンクリスチンは約０．１５ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬで存在する。１つの実施形態では、硫酸ビンクリスチンは約０．１６ｍｇ／ｍＬで存在する。１つの実施形態では、ＶＳＬＩは５ｍｇの硫酸ビンクリスチン、５００ｍｇのマンニトール、７３．５ｍｇのスフィンゴミエリン、２９．５ｍｇのコレステロール、３６ｍｇのクエン酸ナトリウム、３８ｍｇのクエン酸、３５５ｍｇのリン酸ナトリウム、および２２５ｍｇの塩化ナトリウムを含む。

用量および投与
本明細書中で記載する方法にしたがって調製されるＶＳＬＩを使用して、原発性、再発性および難治性ガンをはじめとする任意の種類のがんを治療することができる。ＶＬＳＩで治療される患者または対象は、ヒト、ヒト以外の霊長類、鳥類、ウマ種、イヌ種、ネコ種、ウシ種、ブタ、ウサギ目、げっ歯類、およびその他を含む様々な動物であってよい。ある実施形態では、ＶＳＬＩを使用して、限定されるものではないが、リンパ腫、白血病および骨髄腫をはじめとする血液およびリンパ系のガンを治療する。ある実施形態では、ＶＳＬＩを使用して、限定されるものではないが、神経芽細胞腫および脳腫瘍をはじめとする腫瘍を治療する。

ＶＳＬＩを単剤として、またはシクロホスファミド、ドキソルビシンおよび／またはプレドニゾンなどの他の化学療法剤と組み合わせて使用できる。１つの実施形態では、ＶＳＬＩを、リポソームＣＨＯＰ配合物（“ｌｉｐｏ−ＣＨＯＰ）としてシクロホスファミド、ドキソルビシンおよびプレドニゾンとともに投与する。別の実施形態では、ＶＳＬＩを少なくとも１つのさらなる抗腫瘍剤と同時投与する。別の実施形態では、さらなる抗腫瘍剤は抗腫瘍モノクローナル抗体、例えばＯｎｃｏｌｙ（商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）、またはＢｅｘｘａｒ（商標）である。別の実施形態では、さらなる抗腫瘍剤は、アンチセンス薬物または抗腫瘍ワクチンである。別の実施形態では、ＶＳＬＩをガバペンチン（Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ（商標））などの神経毒性の予防または治療薬と同時投与する。

典型的には、ＶＳＬＩを、患者への投与の約２４時間以内に調製し、そして室温（１５℃〜３０℃）または冷蔵（２〜８℃）で保存する。

ＶＳＬＩを静脈内送達によって患者に全身投与する。１つの実施形態では、ＶＳＬＩを静脈内注入によって、例えば約３０分、約４５分、約６０分、約９０分またはそれ以上の期間にわたって投与する。

典型的には、ＶＳＬＩを定期的に、例えば７〜２８日ごとに１回投与する。ある実施形態では、ＶＳＬＩを３、５、７、１０、１４、２１または２８日ごとに１回投与する。１つの実施形態では、ＶＳＬＩを静脈内注入により１４日ごとに投与する。別の実施形態では、ＶＳＬＩを静脈内注入により７日ごとに投与する。本明細書中で用いられる場合、ＶＳＬＩの各投与は、治療の１「コース」とみなされる。

用量あたり投与されるＶＳＬＩの量は、患者の病歴、他の治療法の使用、および疾患の性質（例えば、第１、再発性または難治性ガン）などの多くの因子に左右されるであろう。典型的には、本明細書中で記載する方法にしたがって調製されるＶＳＬＩを約１．４〜約２．４ｍｇ／ｍ^２の用量で投与する。ある実施形態では、ＶＳＬＩを約１．５ｍｇ／ｍ^２、約１．８ｍｇ／ｍ^２、約２．０ｍｇ／ｍｍ^２、２．１ｍｇ／ｍ^２、２．２ｍｇ／ｍ^２、２．３ｍｇ／ｍ^２または２．４ｍｇ／ｍ^２（すなわち、体表面積１ｍ^２当たりのビンクリスチンｍｇ）の用量で投与する。１つの実施形態では、ＶＳＬＩを２．２５ｍｇ／ｍ^２の用量で静脈内注入により約６０分にわたって７日ごとに１回投与する。

他の実施形態において、ＶＳＬＩの投与は、治療の間、一時的に中断および／または減少される可能性がある。例えば、１つの実施形態では、グレード３末梢神経障害または持続性グレード２末梢神経障害を呈する患者に投与されるＶＳＬＩの用量は、約７日まで中断してもよく、その後、グレード１または２に回復すると約２ｍｇ／ｍ^２の用量まで減らしてもよい。別の実施形態では、持続性グレード２末梢神経障害を呈する患者に投与される用量は、減らした用量を受容した後でも、最高７日間中断してもよく、その後、１．８２５ｍｇ／ｍ^２の用量、または１．５ｍｇ／ｍ^２まで減らしてもよい。

周知方法にしたがって対象の体表面積（ＢＳＡ）を計算することによって、ＶＳＬＩの投与量を決定する。例えば、ＢＳＡは対象の体重（ｋｇ）と身長（ｃｍ）の積を３６００で割ったものの平方根に等しいというモステラーの式にしたがう。ヒトにおいて「正常な」ＢＳＡは、一般的に１．７ｍ^２であると考えられるが、個体の年齢および性別をはじめとする他の因子にも依存する。例えば：
・成人男性の平均ＢＳＡ：１．９ｍ^２
・成人女性の平均ＢＳＡ：１．６ｍ^２
・小児（９歳）の平均ＢＳＡ：１．０７ｍ
・小児（１０歳）の平均ＢＳＡ：１．１４ｍ^２
・小児（１２〜１３歳）の平均ＢＳＡ：１．３３ｍ^２
（Ｍｏｓｔｅｌｌｅｒ ＲＤ． Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｄｙ−ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８７；３１７： １０９８）

実施例
実施例１
ＶＳＬＩバイアル溶液の温度プロフィールをドライブロックでの加熱プロセス中に調査し、そしてＭａｒｑｉｂｏ（登録商標）の認可された標識指示（ＦＤＡ／ｃｄｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＩＤ： ３１７２２１１， Ａｕｇｕｓｔ ２０１２）にしたがって水浴で加熱した場合に観察される温度プロフィールと比較した。

装置および材料
・Ｍａｒｑｉｂｏ（登録商標）キットで構成されたＶＳＬＩ、ロットＮＴ２６８０３５（部分的に使用したバイアルの内容物を１つのバイアルに合する
・直径１．４８０”のウェルおよび温度計ポケットを備えたＴｅｃｈｎｅ Ｄｒｉ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）ＤＢ−３ヒーター（Ｂｉｂｂｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｉｍｉｔｅｄ）。
・デジタル温度計；０℃〜１００℃の範囲で±１℃の精度
・Ｉｓｏｔｅｍｐ ２０２ ＃００９４７水浴（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
・Ｆｌｕｋｅ ７２６ ＃９１４００２熱電対温度較正器（Ｆｌｕｋｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）

手順
温度プロフィール測定値は、加熱装置（すなわち、ドライブロックまたは水浴）中に入れた後のバイアル内部の溶液温度を記録することによって得られた。０時は、バイアルを加熱装置中に入れた時点であった。以下の手順を使用した：
１．成分ＶＳＩおよびＳＣＬＩを１つのＳＰＩバイアル（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．）中に合わせた。デジタル熱電対を、バイアルの隔壁を通して挿入し、バイアルの底表面から約５ｍｍで保持し、液体溶液の中央に配置した。
２．１．４８０インチのバイアル容器ホールを含むブロックを有するドライブロックヒーターを使用した。バイアル容器ホールに近接して配置されたブロックの温度計ホール中に温度計を入れることによってブロック温度をモニタリングした。ブロックヒーターを７５℃の温度にセットし、ブロック温度計が７５±２℃を表示するまで温めた。加熱されたブロックを最低１５分間７５±２℃で平衡化させた。バイアルを次いで７５±２℃で平衡化されたブロックのウェル中に１４分±１５秒間挿入し、次いで取り出した。構成されたバイアルを約６０分間周囲条件に置くことによって周囲温度にした。同じバイアルを用いてこの手順を２回繰り返した。
３．バイアル内側液体温度、およびブロック温度を１分間隔で（または表示どおりに）記録し、表１で一覧にした。
４．比較のために、水温が６５±５℃になるまで水浴を加熱した。水浴を最低１５分間平衡化させた。構成されたＶＳＬＩを含むバイアルを次いで水浴中に１０分±１分間挿入し、次いで取り出した。構成されたバイアルを周囲温度にした。
５．バイアル内側液体温度、時間および水温を記録し、表１で一覧にした。

結果および考察
構成されたＶＳＬＩバイアルの液体内容物を７５℃±２℃にて平衡化されたドライブロックで加熱する温度プロフィールは、６５℃±５℃まで均一かつ緩徐な加熱速度を示す。表１および図１で示した結果は、４．２１℃／分の平均速度でバイアル内容物を加熱した水浴に対して、ドライブロックは３．２６℃／分の平均速度で液体バイアル内容物を加熱したことを示す。６５℃±５℃の所望の温度は、水浴では１０分かかったのに対して、ドライブロックでは１４分で達成された。どちらの加熱装置でも、一旦バイアルを熱源から取り出すと、徐々に冷却された。温度はドライブロックから取り出した後３〜４分間、水浴から取り出した後１〜２分は、５９〜６５℃の範囲内のままであった。両方の装置で、バイアルは、ドライブロックでは５０〜６５℃に少なくとも２０分間、水浴では１５分間暴露された。いずれかの装置で加熱した後、溶液は視覚的に同じまま、すなわち目に見える異物および凝集物が本質的にない白色から灰白色半透明懸濁液のままであった。

結論
この実験により、ドライブロックがＶＳＬＩバイアル内側液体温度を１４分以内で６５℃±５℃に到達させる好適な温度加熱プロフィールを示し、２０分で５０〜６５℃の範囲内での熱への暴露を提供することが示された。これは、６５℃±５℃の内部液体温度を１０分で達成し、５０〜６５℃の範囲内で１５分の全体的加熱暴露を達成する、水浴中でのバイアルの加熱に匹敵する。両方法についての加熱速度は緩徐かつ均一であった。７５℃±２℃にセットされたドライブロックでは、１分につき３．２６℃の加熱速度が得られ、６５℃±５℃にセットされた水浴では、１分あたり４．２１℃の速度が得られた。加熱は、水浴では横ばいになったが、一方で、ドライブロック中での加熱速度は７５℃±２℃セットポイントに向かって引き続き一定速度であった。バイアルをいずれかの加熱装置から取り出すと、周囲温度への冷却は約６０分かかった。これらの加熱プロフィールは、ビンクリスチンの定量的に近い封入が熱力学的プロセスであり、これはそれらの条件を達成する動力学よりもむしろ膜封入を促進する温度への全体的な暴露に左右される。

要約すれば、ドライブロックおよび水浴は、ＶＳＬＩの効率的な調製のためにビンクリスチンのスフィンゴミエリンコレステロールリポソーム中への封入を可能にする熱力学的プロフィールを提供できる。

実施例２
乾燥加熱ブロックを用いて構成されるＶＳＬＩのビンクリスチン分解生成物のレベルを調査した。

装置および材料：
・４８０”直径ウェルおよび温度計ポケットを備えたＴｅｃｈｎｅ ＤＢ−３ Ｄｒｉ−Ｂｌｏｃｋ（登録商標）。
・７ｍｍ以下の直径を有し、０℃〜１００℃の範囲で±１℃の精度の温度計
・較正されたストップウォッチまたはタイマー
・マイクロメーター（０〜２”）または等価物。
・３０ Ｍａｒｑｉｂｏ（登録商標）Ｋｉｔｓ、ロット番号ＴＴＸ０６１１（Ｔａｌｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）

手順
最大および最小外径を有するＳＰＩバイアルを有する３０Ｍａｒｑｉｂｏ（登録商標）キットからのバイアルを実験で使用した。ＳＰＩバイアルの直径を、最近傍０．００１”まで測定し、記録した。結果を表２に示す。

２つのバイアルを構成のために選択した。許容されるＳＰＩバイアル直径の下端である１．４１インチに近いかまたは等しい直径を有するバイアル（「バイアル１」）の直径の測定値は１．４３０５インチであった。許容されるＳＰＩバイアル直径の上端である１．４７インチに近いかまたは等しい直径を有するバイアル（「バイアル２」）の直径の測定値は１．４５４５インチであった。

選択されたキットを上述のように構成し、硫酸ビンクリスチン、関連する化合物ならびに粒子サイズおよび分布について適合硫酸ビンクリスチン注射ＵＳＰ法にしたがって試験した。

水浴の代わりに１．４８０インチのバイアル容器ホールを含むブロックを有するＤｒｉ−Ｂｌｏｃｋヒーターを使用したことを除いて、前記指示を用いて２つの実験キットを構成した。バイアル容器ホールの近くにあるブロックの温度計ホール中に温度計を入れることによってブロック温度をモニタリングした。ブロックヒーターを７５℃の温度にセットし、ブロック温度計が７５±２℃を表示するまで加熱した。加熱されたブロックを次いで最低１５分間平衡化させた（時間を記録）。条件を表３に記載する。各バイアルを次いで７５±２℃に加熱されたブロック中に１４分±１５秒間挿入し（時間を記録）、次いで取り出し、バイアルを約６０分にわたって周囲条件に置くことによって周囲温度にした。

時間およびブロック温度は構成の間、表４で示すように記録された。分析結果を表５、６および７に記録した。

結果および考察
ＶＳＬＩの構成は、Ｄｒｉ−Ｂｌｏｃｋヒーターを使用して１．４３０５および１．４５４５インチの直径を有する構成バイアルを使用して達成された。これらは、バイアル直径として許容される１．４１インチの下限と１．４７インチの上限にもっとも近いバイアルであった。加熱ブロック中でＶＳＬＩバイアルを１４分間インキュベーションする間、ブロック温度は、ブロックウェル直径とバイアルのいずれかの直径との間隙間の温度平衡化のために１度以下降下した。熱伝達のこの動力学は、ＶＳＬＩの調製に影響を及ぼさなかった。７５℃で平衡化されたＤｒｉ−Ｂｌｏｃｋ熱に１４分暴露させた後、両バイアルから結果として得られる構成されたＶＳＬＩは９７％を超えるビンクリスチン封入を達成した。Ｄｒｉ−Ｂｌｏｃｋを用いたインキュベーションの結果、平均２．１７５％の遊離ビンクリスチンの封入効率が得られた。Ｄｒｉ−Ｂｌｏｃｋ加熱プロフィールで新しい不純物または不純物の増加は観察されなかった。主な分解物（ｄｅｇｒａｄａｎｔ）であるＮ−デスホルミルビンクリスチンは平均１．３３％で観察され、０．５７４％を超える他の不純物はなく、３．１０％以下の総不純物であった。粒子サイズ分布は平均直径１０７．５ｎｍならびに平均Ｄ_２５９０．５ｎｍおよびＤ_９０１３８．５ｎｍのＶＳＬＩ明細と一致し、Ｄｒｉ−Ｂｌｏｃｋ加熱で調製されたＶＳＬＩはＩＶＲ分析によると７２時間までにビンクリスチンの約８４パーセントを放出した。

結論として、１４分±１５秒のインキュベーション期間で７５±２°にて平衡化されたＤｒｉ−Ｂｌｏｃｋヒーターを用いて構成されたＶＳＬＩは、スフィンゴミエリン−コレステロールリポソーム中にビンクリスチンの９９％以上を封入し、この実験中に異常は観察されなかった。データは、ビンクリスチンを効率的に封入する生成物をもたらし、ドライブロックヒーターがＶＳＬＩの構成において水浴と置換できることを示すドライブロック構成温度プロフィールを証明した。

実施例３
この試験で、ビンクリスチン分解生成物のレベルを測定して、ドライブロック手順を用いて様々な構成時間を提供した。

装置および材料
・１．４７６”（±０．００４）直径のウェルおよび温度計ポケットを備えたＤｒｉ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）
・７ｍｍ以下の直径を有し、０℃〜１００℃の範囲内で±１℃の精度の温度計
・較正されたストップウォッチまたはタイマー
・Ｍａｒｑｉｂｏ（登録商標）Ｋｉｔ、ロット番号ＴＴＸ０６１１（Ｔａｌｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）

手順
３つのＭａｒｑｉｂｏ（登録商標）Ｋｉｔをランダムに選択し、３つの異なる時間（それぞれ１３、１４および１５分）で７５℃にてドライブロック中で加熱することによって構成した。構成されたバイアルを全および遊離硫酸ビンクリスチン、関連化合物、粒子サイズおよび分布について、適合硫酸ビンクリスチン注射ＵＳＰ法を用いて試験した。

水浴の代わりに、１．４７６インチ（±０．００４”）バイアル容器ホールを含むブロックを有するＤｒｉ−ｂｌｏｃｋ（登録商標）ヒーターを使用したことを除いては、上述の指示を用いて実験キットを構成した。バイアル容器ホールに近接して設置されたブロックの温度計ホール中に温度計を入れることによってブロック温度をモニタリングした。ブロックを７５℃の温度にセットし、ブロック中の温度計が７５±２℃を表示するまで加熱した。加熱されたブロックを次いで最低１５分間平衡化させた。状態を表９に記録した。各バイアルを次いで７５±２℃に加熱したブロック中に、それぞれ１３分±１５秒間、１４分±１５秒間、および１５分±１５秒間挿入した。バイアルを次いで取り出し、周囲温度に置いた。構成されたバイアルを試験前少なくとも６０分間周囲温度まで冷却させた。

時間およびブロック温度は構成の間、表９および２０で示されるように記録された。分析結果を表１１、１２およびｌ３に記録した。

結果および考察
１つの構成されたキットを７５℃の平衡化された加熱ブロック中にそれぞれ１３、１４および１５分間入れた。すべてのサンプル時間で封入ビンクリスチンが得られ、３つのバイアル間で記録された試験結果において有意な差はなかった。９７％を超えるビンクリスチン封入がＤｒｉ−Ｂｌｏｃｋを使用する３つのバイアルすべてで観察され、最大２．３％遊離ビンクリスチンの封入効率が得られた。Ｄｒｉ−Ｂｌｏｃｋ加熱プロフィールで新しい不純物または不純物の増加は観察されなかった。主な分解物であるＮ−デスホルミルビンクリスチンは最大１．５１％で観察され、０．５９％を超える他の不純物はなく、総不純物は３．３％以下であった。粒子サイズ分布は、平均直径１０７ｎｍならびに平均Ｄ_２５９０ｎｍおよびＤ_９０１３７ｎｍのＶＳＬＩ明細と一致した。

結論として、１３〜１５分（±１５秒）のインキュベーション期間で７５±２℃にて平衡化させたドライブロックで水浴を置換して構成されたＶＳＬＩは、ビンクリスチンを効率的に封入し、実験を実施する間、異常は記録されなかった。データは、効率のよいＶＳＬＩ構成に至るＤｒｉ−Ｂｌｏｃｋ構成温度プロフィールを立証し、Ｄｒｉ−ｂｌｏｃｋヒーターがＶＳＬＩの構成で水浴と置換できることを示す。

本明細書中で記載される実施例および実施形態は例示目的のためだけであり、当業者にはその点に関して様々な修飾および変更が示唆され、本出願の主旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれると理解される。すべての刊行物、本明細書中で引用される特許および特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中で参照により援用される。

Claims (37)

1. 実質的な分解生成物のないリポソーム封入ビンクリスチンを含む薬剤的に許容される液体組成物を調製する方法であって：
   （ａ）１つのバイアル中で、（ｉ）約１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの濃度で硫酸ビンクリスチンを含む第１溶液であって、約３．５〜約５．５のｐＨを有する第１溶液、および
   （ｉｉ）低ｐＨでスフィンゴミエリン／コレステロールリポソームを含む第２溶液を構成すること、
   （ｂ）前記１つのバイアル中の前記構成溶液のｐＨをｐＨ約７．０〜７．５まで上昇させること、
   （ｃ）前記構成溶液を含む前記１つのバイアルを約７５℃で平衡化させたドライ加熱ブロック中で少なくとも約１３〜約１８分間加熱することであって、ここで、前記加熱ブロックは、構成されたリポソーム封入ビンクリスチンを含む溶液を製造するために１つのバイアルの前記平均長さまたは直径よりも約１〜５％大きな１以上の孔を含む、加熱すること；
   （ｄ）前記構成された溶液を室温に平衡化すること；
   （ｅ）約１．５〜約２．４ｍｇ／ｍ^２の前記患者用のリポソーム封入ビンクリスチンの用量を含む前記構成された溶液の体積を静脈内投与に適した医薬希釈剤で希釈して、前記薬剤的に許容される液体組成物を製造すること；および
   （ｆ）前記薬剤的に許容される液体組成物を前記患者に投与すること、
   を含み、ここで、リポソーム封入ビンクリスチンを含む前記構成された溶液は、（ｉ）約２．５％未満の遊離ビンクリスチンと（ｉｉ）約１．５％未満のＮ−デスホルミルビンクリスチンとを含む、方法。
2. 硫酸ビンクリスチンを含む前記第１溶液が約４．５〜約４．７のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１溶液が約１００〜２００ｍｇ／ｍＬの濃度でマンニトールをさらに含む、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
4. 前記リポソームを含む前記第２溶液の前記ｐＨが約４．０である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記第２溶液がクエン酸塩緩衝液をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 約９．０のｐＨの緩衝液を含む第３溶液の添加によって前記構成溶液の前記ｐＨを上昇させる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記第３溶液がリン酸ナトリウム緩衝液を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記構成溶液が約０．１／１．０〜約０．２／２．０の硫酸ビンクリスチン対脂質の濃度比を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 前記構成された溶液中の硫酸ビンクリスチンの前記濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約０．５ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 前記構成された溶液中の硫酸ビンクリスチンの前記濃度が約０．１５ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬ付近である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 前記構成された溶液中の硫酸ビンクリスチンの前記濃度が約０．１６ｍｇ／ｍＬ付近である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記第１溶液が硫酸ビンクリスチンＵＳＰ（５ｍｇ／５ｍＬ）（４．５ｍｇ／５ｍＬのビンクリスチン遊離塩基に等しい）、および５００ｍｇ／５ｍＬのマンニトールを含み、前記第２溶液が７３．５ｍｇ／ｍＬのスフィンゴミエリン、２９．５ｍｇ／ｍＬのコレステロール、３３．６ｍｇ／ｍＬのクエン酸、３５．４ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウムからなるスフィンゴミエリン／コレステロールリポソームを含み、前記第３溶液が３５５ｍｇ／２５ｍＬのリン酸水素ナトリウムおよび２２５ｍｇ／２５ｍＬの塩化ナトリウムを含む、請求項６に記載の方法。
13. 前記リポソーム中のスフィンゴミエリン対コレステロールの前記比が約７５／２５モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロール〜３０／５０モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロールである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記リポソームが、約７０／３０モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロール〜４０／４５モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロールを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 前記リポソームが約５５／４５モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロールを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
16. 前記リポソームが約６０／４０モル％／モル％スフィンゴミエリン／コレステロールを含む、請求項１３に記載の方法。
17. 前記リポソームが約０．０５〜０．５ミクロンのサイズ範囲を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記リポソームが約５０〜２００ｎｍの平均直径を有する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
19. 前記リポソームが約９０〜１２５ｎｍの平均直径を有する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記構成溶液が約２０〜５０ｍＬの体積を有する、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
21. 前記構成溶液が３０〜３５ｍＬの体積を有する、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
22. 前記加熱ブロックを７５±２℃に約１５分間平衡化させる、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
23. 前記構成溶液を７５±２℃で平衡化されたドライブロックの前記カリバー孔内で約１３〜１５分間加熱する、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
24. 前記構成溶液を７５±２℃で平衡化されたドライブロックの前記カリバー孔内で１４分±３０秒間加熱する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
25. 前記加熱ブロック中の前記孔が、構成溶液を含む１つのバイアルの前記平均長さまたは直径よりも約３％未満大きい、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
26. 構成溶液を含む１つのバイアルが約３５．８〜約３７．３ｍｍの直径を有する、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
27. 前記加熱ブロック中の前記カリバー孔が直径３７．２〜３７．８ｍｍの円筒形である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記構成された溶液を室温に少なくとも約３０分間平衡化させる、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
29. 約１．５〜約２．４ｍｇ／ｍ^２の前記患者についてのリポソーム封入ビンクリスチンの用量を含む前記構成された溶液の体積を静脈内投与に適した標準的医薬希釈剤で希釈して前記薬剤的に許容される液体組成物を製造する、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
30. 前記患者の計算された用量の前記体積を注入容器から取り出し、前記構成されたＶＳＬＩ溶液の前記算出体積と置換する、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
31. 前記リポソーム封入ビンクリスチンを含む薬剤的に許容される液体組成物をステップ（ｃ）後２４時間以内に前記患者に投与する、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
32. 前記患者がガンを有する、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
33. 前記ガンが、リンパ腫、白血病、骨髄腫、脳腫瘍および神経芽細胞腫からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
34. リポソーム封入ビンクリスチンを含む前記薬剤的に許容される液体組成物を約３０〜６０分にわたって静脈内注入によって投与する、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
35. リポソーム封入ビンクリスチンを含む前記薬剤的に許容される液体組成物を、７〜２８日ごとに１回静脈内注入によって投与することを含む、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
36. リポソーム封入ビンクリスチンを含む前記薬剤的に許容される液体組成物を７日ごとに１回静脈内注入によって投与する、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
37. 実質的な分解生成物を含まないリポソーム封入ビンクリスチンを含む薬剤的に許容される液体組成物を調製する方法であって、
    （ａ）１つのバイアル中で、（ｉ）硫酸ビンクリスチンを約１ｍｇ／ｍＬの濃度で、そしてマンニトールを約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む第１溶液であって、約４．５〜約４．７のｐＨを有する第１溶液；（ｉｉ）ｐＨ約４．０でクエン酸塩緩衝液中６０／４０モル％／モル％のスフィンゴミエリン／コレステロールを有するリポソームを含む第２溶液；および（ｉｉｉ）ｐＨ約９．０のリン酸ナトリウム緩衝液を含む第３溶液を構成することであって、ここで、前記構成溶液の前記最終ｐＨは約７．０〜約７．６であり、硫酸ビンクリスチンの前記濃度は約０．１６ｍｇ／ｍＬである、構成すること；
    （ｂ）７５℃±２℃で平衡化した乾燥加熱ブロック中構成溶液を含む前記１つのバイアルを１４分±３０秒間加熱して、構成されたリポソーム封入ビンクリスチンを含む溶液を製造することであって、ここで、１つのバイアルは約３５．８ｍｍ〜約３７．３ｍｍの直径を有し、加熱ブロックは約３７．２ｍｍ〜約３７．８ｍｍの直径を有する１以上の円筒形孔を含む、製造すること；
    （ｄ）前記構成された溶液を室温に少なくとも３０分間平衡化させること；
    （ｅ）前記リポソーム封入ビンクリスチンを含む体積の前記構成された溶液を医薬希釈剤で希釈して、約１．５〜約２．４ｍｇ／ｍ^２の投与量でのビンクリスチンの静脈内投与に好適な薬剤的に許容される液体組成物を製造することであって、ここで、リポソーム封入ビンクリスチンを含む前記構成された溶液は、（ｉ）約２．５％未満の遊離ビンクリスチンと（ｉｉ）約１．５％未満のＮ−デスホルミルビンクリスチンとを含む、製造すること、
    を含む、方法。

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