JP2016192923A - 判定装置、判定システム、判定プログラム、細胞の製造方法、及び細胞 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞の培養等における観察物体の状態判定の精度の向上。【解決手段】位相差観察により観察された観察物体の位相差画像を撮像する画像取得部１１１と、撮像された前記位相差画像中の観察物体における特定領域の位相差情報をもとに前記観察物体の状態を判定する判定部１１３とを備え、細胞標本の場合、位相差画像より決定された細胞膜の全周の長さと、位相差画像で認識された細胞膜の長さとを比較した値によって細胞標本の状態を判定する判定装置１０。例えば、網膜色素上皮細胞等の色素細胞のトリパンブルー染色による生死判定等の精度が向上する。【選択図】図２

Description

本発明は、判定装置、判定システム、判定プログラム、細胞の製造方法、及び細胞に関するものである。

一般的に、例えば細胞の培養状態を評価する技術は、再生医療などの先端医療分野や医薬品のスクリーニングを含む幅広い分野での基盤技術となっている。この細胞の培養状態を評価するプロセスでは、細胞の状態を的確に判定することが求められる。一例として、トリパンブルーなど生細胞の細胞膜よりも、死細胞の細胞膜を優先的に透過する色素によって判定対象の細胞を染色することにより、細胞の生死判定を行う方法が開示されている（特許文献１参照）。
また、細胞の培養状態の評価の分野に限らず、様々な観察物体を撮像した画像から、観察物体の状態を評価する技術は、様々な分野で重要な技術となっている。

特表２０１４−５０５４６５号公報

近年、複雑な構造を有している物体の状態を、この観察物体が撮像された画像から高精度に判定することが望まれている。

そこで本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、観察物体が撮像された画像による、観察物体の状態判定の精度を向上することを可能とする判定装置を提供することを課題とする。

上記問題を解決するために、本発明の一態様は、位相差観察により観察された観察物体の位相差画像を撮像する画像取得部と、撮像された前記位相差画像中の観察物体における特定領域の位相差情報をもとに前記観察物体の状態を判定する判定部と、を備えることを特徴とする判定装置である。

また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、観察物体を位相差撮像することにより位相差画像を生成する位相差撮像部と、上述の判定装置と、前記判定装置の判定結果を出力する出力部と、を備えることを特徴とする判定システムである。

また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、コンピュータに、観察物体を位相差撮像することにより位相差画像を生成する位相差撮像手順と、前記位相差撮像手順において生成された前記位相差画像中の観察物体における特定領域の位相差情報に基づいて、前記観察物体の状態を判定する判定手順と、を実行させるための判定プログラムである。

また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、細胞を位相差撮像することにより位相差画像を生成する位相差撮像手順と、前記位相差撮像手順において生成された前記位相差画像に含まれる前記細胞を示す細胞画像の径方向に、前記細胞の細胞膜を示す位相差の変化に基づいて、前記細胞が生細胞と死細胞とのいずれであるかを判定する判定手順とを有することを特徴とする細胞の製造方法である。

また、上記問題を解決するために、本発明の一態様は、上述の細胞の製造方法により製造された細胞である。

本発明によれば、撮像した画像から撮像した物体の状態判定の精度を向上することができる。

本実施形態の判定システムの構成の概要を示す模式図である。 本実施形態の判定装置の機能構成を示すブロック図である。 本実施形態の制御部による処理の流れの一例を示す流れ図である。 本実施形態の判定システムが扱う画像の一例を示す模式図である。 本実施形態の判定部による生細胞の判定例を示す模式図である。 本実施形態の判定部による死細胞の判定例を示す模式図である。 本実施形態の変形例における位相差の変化曲線の一例を示す模式図である。

［実施形態］
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。初めに、図１を参照して、本発明の実施形態による判定システム１の構成について説明する。
図１は、本実施形態の判定システム１の構成の概要を示す模式図である。判定システム１は、判定装置１０と、表示部２０と、位相差顕微鏡装置３０とを備える。

［位相差顕微鏡装置の構成］
位相差顕微鏡装置３０は、観察対象である被検体Ｓに照明光Ｌを照射し、この被検体Ｓからの透過光Ｌｐの位相差を明暗差に変換することによって得られた被検体Ｓの拡大像を得る。この位相差顕微鏡装置３０の具体的な構成について説明する。

位相差顕微鏡装置３０は、照明光Ｌを出射する光源３１と、光源３１からの照明光Ｌを被検体Ｓに照射する照明光学系３２と、被検体Ｓからの透過光Ｌｐを結像する結像光学系３３と、結像光学系３３により結像された透過光Ｌｐを受光し電気信号に変換して被検体Ｓの画像を生成する固体撮像素子３４とを備えている。

照明光学系３２と結像光学系３３との間には、ステージ３６が配置されている。
ステージ３６は、被検体Ｓが載置される載置面３６ａを有している。また、ステージ３６は、その面内において互いに直交する２つの方向（図１中に示すＸ軸方向及びＹ軸方向）に移動操作される。これにより、被検体Ｓの観察位置を任意に変更することが可能となっている。さらに、ステージ３６は、高さ方向（図１中に示すＺ軸方向）に移動操作される構成であってもよい。

なお、以下において、光源３１から出射された照明光Ｌの光軸（光束の中心軸）をＺ軸方向とし、このＺ軸と直交する面内において互いに直交する２つの方向をＸ軸方向及びＹ軸方向として説明する。なお、光源３１から出射された照明光Ｌを、図１の破線によって模式的に示す。

光源３１は、例えば白色光などの可視光又はその近傍の波長域の光を照明光Ｌとして照射する。光源３１には、反射鏡等を利用して自然光や白色蛍光灯、白色電球などの外部光源からの光を照明光Ｌとして用いることができる。また、光源３１には、ハロゲンランプやタングステンランプなどの内部光源からの光を照明光Ｌとして用いることができる。

また、光源３１には、発光ダイオード（ＬＥＤ）等を用いてもよい。この場合、光源３１は、例えば赤、青、緑の各波長の光を発するＬＥＤの組み合わせにより構成することができる。また、これら波長の異なるＬＥＤの点灯及び消灯を制御することによって、光源３１が発する照明光の波長を可変に制御できるため、このようなＬＥＤを光源３１に用いた場合は、波長フィルタなどの波長変換部材を省略することが可能である。

照明光学系３２には、光源３１側から順に、第１のコンデンサレンズ３７と、第１の空間光変調素子３８と、第２のコンデンサレンズ３９とが配置されている。これらのうち、第１のコンデンサレンズ３７、及び第２のコンデンサレンズ３９は、光源３１から出射された照明光Ｌをステージ３６上の被検体Ｓに集光させる。

第１の空間光変調素子３８は、結像光学系３３の瞳位置に対して共役となる位置に配置されている。第１の空間光変調素子３８は、被検体Ｓに照射される照明光Ｌの光強度分布を可変に調整するもの（絞り）であり、この絞りの開口（照明光Ｌを通過させる領域）３８ａの形状や大きさ等を自由に変化させることが可能である。

結像光学系３３は、上記ステージ３６側から順に、対物レンズ４０と、第２の空間光変調素子４１とが配置されている。

対物レンズ４０は、被検体Ｓからの透過光Ｌｐを固体撮像素子３４の受光面上に結像させる。

第２の空間光変調素子４１は、結像光学系３３の瞳位置又はその近傍に配置されている。また、第１の空間光変調素子３８と第２の空間光変調素子４１とは、互いに共役な位置に配置されている。

第２の空間光変調素子４１は、被検体Ｓからの透過光Ｌｐに付加する位相の空間分布を可変に調整するものであり、透過光Ｌｐに付加する位相を０°又は±９０°に調整する。
具体的に、この第２の空間光変調素子４１は、被検体Ｓからの透過光Ｌｐのうち、被検体Ｓを通過した直接光（０次光）を４分の１波長（±９０°）だけ位相がずれた状態で透過させる位相変調領域４１ａと、この位相変調領域４１ａの周囲に被検体Ｓで回折した回折光をそのままの位相（０°）で透過させる回折光透過領域４１ｂとを有している。

第２の空間光変調素子４１は、この回折光透過領域４１ｂに対して位相変調領域４１ａの形状や大きさ等を自由に変化させることが可能である。また、このような第２の空間光変調素子４１としては、例えば液晶パネル（液晶素子）などを用いることができる。

さらに、第２の空間光変調素子４１は、上述した位相の空間分布と共に、被検体Ｓからの透過光Ｌｐを透過させる透過率の空間分布を可変に調整する機能を有することが好ましい。一般に、第２の空間光変調素子４１を通過する透過光Ｌｐのうち、位相変調領域４１ａを透過する直接光は、回折光透過領域４１ｂを透過する回折光に比べて光強度が強いため、ＮＤフィルタ等を用いて光強度を弱める調整を行う。

なお、このようなＮＤフィルタについては、例えば特表２０１０−５０７１１９号公報に開示されているような透過率の空間分布を可変に調整できる光学素子などを用いることができる。また、上記第２の空間光変調素子４１には、このような光学素子等を付加したものを用いることができる。

固体撮像素子３４は、例えばＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサなどの受光波長の異なる受光素子を複数有するものからなり、上述した結像光学系３３により結像された透過光Ｌｐを受光し電気信号（画像信号）に変換して判定装置１０に出力する。

以上のような構造を有する位相差顕微鏡装置３０では、光源３１から出射された照明光Ｌが第１のコンデンサレンズ３７を通過することによって、平行な照明光Ｌに変換された後、この平行な照明光Ｌが第１の空間光変調素子３８に入射することになる。そして、この第１の空間光変調素子３８の開口３８ａを通過した照明光Ｌが第２のコンデンサレンズ３９を通過することによって、平行な照明光Ｌに変換された後、この平行な照明光Ｌがステージ３６の載置面３６ａ上に載置された被検体Ｓに照射される。

そして、被検体Ｓからの透過光Ｌｐが対物レンズ４０を通過した後、第２の空間光変調素子４１に入射する。このとき、被検体Ｓからの透過光Ｌｐのうち、位相変調領域４１ａを透過した直接光が、４分の１波長だけ位相がずれた状態で、ＮＤフィルタで減光された後、固体撮像素子３４の受光面上に結像される。一方、回折光透過領域４１ｂを透過した回折光がそのままの位相（０°）で、固体撮像素子３４の受光面上に結像される。位相差顕微鏡では、これら直進光と回折光との干渉によって、位相の変化を光の明暗として観察することが可能である。

[判定対象の細胞について]
ここで、位相差顕微鏡装置３０の被検体Ｓ、すなわち判定システム１の判定対象の細胞の具体例について説明する。この一例において、被検体Ｓとは、染色処理された細胞である。この染色処理について、細胞が動物細胞である場合を一例にして説明する。染色処理においては、例えばトリパンブルーなどの色素が細胞に滴下される。死細胞の細胞膜には損傷があるため、生細胞に比べて色素が細胞内部に浸透しやすい。このため、トリパンブルーは、生細胞と死細胞とのうち、死細胞に選択的に浸透する。つまり、トリパンブルーによって細胞を染色した場合、生細胞は染色されずに、死細胞は青色に染色される。この青色に染色された細胞数を計数することにより、死細胞の数を算定することができる。
なお、ここでは染色処理の一例として、トリパンブルーによる染色について説明したが、これに限られない。生細胞と死細胞とを選択的に染め分けられる色素であれば、トリパンブルー以外の色素によって染色してもよい。

ここで、染色処理される細胞が色素を持たない細胞であれば、細胞の色味を判定することにより、生細胞か、死細胞かを判定することが容易にできる。しかしながら、染色処理される細胞が色素を持つ細胞である場合、すなわち色素細胞（又は、有色細胞）である場合には、細胞本来の色味であるのか、染色処理による色味であるのかを判定することが困難である場合がある。特に、網膜色素上皮細胞（以下、ＲＰＥ細胞とも記載する。）などの色素細胞は、その細胞自身が持つ色素による色味が、細胞の成熟に伴って淡色から濃色に変化する。したがって、ＲＰＥ細胞に対してトリパンブルー染色を行った場合、細胞の色が、ＲＰＥ細胞本来の色味であるのか、染色処理による色味であるのかを判定することが困難である場合がある。以下、ＲＰＥ細胞などの色素細胞の生死判定を行うことができる、判定装置１０の構成について説明する。

［判定装置の構成］
次に、判定装置１０の構成について図２を参照して説明する。
図２は、本実施形態の判定装置１０の機能構成を示すブロック図である。判定装置１０は、制御部１１と、記憶部１２とを備えている。
記憶部１２には、細胞の生死判定に用いられる判定プログラムと、位相差顕微鏡装置３０の制御プログラムとが予め記憶されている。
制御部１１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）を備えており、記憶部１２に記憶されている制御プログラムに従って、位相差顕微鏡装置３０の各部を駆動する。この制御部１１による位相差顕微鏡装置３０の制御の具体的な内容については、既知であるため、その説明を省略する。

制御部１１は、画像取得部１１１と、フィルタ部１１２と、判定部１１３とを、その機能部として備えている。
画像取得部１１１は、位相差顕微鏡装置３０によって撮像された位相差画像を取得する。
フィルタ部１１２は、画像取得部１１１が取得する位相差画像に対して、フィルタ処理を行う。このフィルタ処理には、位相差画像に対して画素値の積分処理及び微分処理が含まれる。この積分処理によって、位相差画像の色むらが平滑化される。また微分処理によって位相差画像の画素値が急変するエッジ部分が強調される。また、このフィルタ部１１２は、位相差画像に含まれる細胞の外形を示す画像を抽出する。以下の説明において、このフィルタ部１１２が抽出する細胞の外形を示す画像を、細胞領域ＲＯＩとも記載する。
判定部１１３は、画像取得部１１１が取得した位相差画像に含まれる細胞の画像に基づいて、細胞が生細胞と死細胞とのいずれであるかを判定する。この判定部１１３が行う判定処理の詳細について、図３から図７を参照して説明する。

［判定処理の流れ］
図３は、本実施形態の制御部１１による処理の流れの一例を示す流れ図である。
画像取得部１１１は、位相差顕微鏡装置３０によって撮像された位相差画像を取得する（ステップＳ１０）。このステップＳ１０において取得される位相差画像の一例を、図４（Ａ）に示す。

図４は、本実施形態の判定システム１が扱う画像の一例を示す模式図である。画像取得部１１１は、図４（Ａ）に示す位相差画像を取得する。この位相差画像には、細胞Ｃ１の画像と、細胞Ｃ２の画像と、細胞Ｃ３の画像とが含まれる。これらの細胞のうち、細胞Ｃ１及び細胞Ｃ２は、いずれも生細胞である。また、細胞Ｃ３は、死細胞である。画像取得部１１１は、取得した位相差画像をフィルタ部１１２に出力する。
図４（Ａ）中、例えば細胞Ｃ１の例では、図面上やや濃い色で表現されている輪帯状部（一部途切れている部分あり）が細胞膜存在領域であると推測される部位である。

図３に戻り、フィルタ部１１２は、ステップＳ１０において取得された位相差画像に対して、フィルタ処理を行う（ステップＳ２０）。この一例においては、フィルタ部１１２は、ステップＳ１０において取得された位相差画像に対して、積分フィルタ及び微分フィルタを適用して、細胞の輪郭を抽出しやすい状態にする。なお、このステップＳ２０におけるフィルタ処理は必須ではない。フィルタ部１１２は、位相差画像の状態によっては、ステップＳ２０におけるフィルタ処理を行わなくてもよい。

次に、フィルタ部１１２は、細胞領域ＲＯＩを抽出する（ステップＳ３０）。このフィルタ部１１２により抽出された細胞領域ＲＯＩの一例を図４（Ｂ）に示す。フィルタ部１１２は、図４（Ａ）に示す位相差画像に含まれる細胞の輪郭を抽出する。この一例では、フィルタ部１１２は、細胞Ｃ１の輪郭を、細胞領域ＲＯＩ１として抽出する。また、フィルタ部１１２は、細胞Ｃ２の輪郭を、細胞領域ＲＯＩ２として、細胞Ｃ３の輪郭を、細胞領域ＲＯＩ３として、それぞれ抽出する。このフィルタ部１１２が行う輪郭抽出処理には、エッジ検出などの既知の方法が適用される。フィルタ部１１２は、細胞領域ＲＯＩを抽出した後の画像を、判定部１１３に出力する。

図３に戻り、判定部１１３は、ステップＳ３０において抽出された細胞領域ＲＯＩごとに、細胞の生死の状態を判定する。具体的には、判定部１１３は、細胞領域ＲＯＩの径方向の判定ラインＪＬを定める（ステップＳ４０）。ここで、判定対象の細胞が生細胞である場合の、判定部１１３が定める判定ラインＪＬの一例について、図５（Ａ）を参照して説明する。

［判定対象が生細胞である場合］
図５は、本実施形態の判定部１１３による生細胞の判定例を示す模式図である。判定部１１３が、ある生細胞の画像ＰＣｅｌｌ１について判定する場合の一例を、図５（Ａ）に示す。画像ＰＣｅｌｌ１とは、生細胞が撮像された位相差画像である。この画像ＰＣｅｌｌ１には、細胞核Ｃｎと、細胞膜Ｃｍと、細胞質Ｃｙとの各画像が含まれる。なお、この図５（Ａ）においては、位相差画像の位相差Δｐが大きい部分を黒く、位相差Δｐが小さい部分を白くして、位相差Δｐを示す。

判定部１１３は、画像ＰＣｅｌｌ１の径方向に判定ラインＪＬを定める。画像ＰＣｅｌｌ１の径方向とは、図５（Ａ）に示す一例では、同図のＸ軸方向である。すなわち、この一例では、画像ＰＣｅｌｌ１の径方向とは、画像ＰＣｅｌｌ１の直径方向である。

図３に戻り、判定部１１３は、判定ラインＪＬ上の位相差Δｐの変化の回数を求める（ステップＳ５０）。具体的には、判定部１１３は、位相差のしきい値ＴｈＬ１と、位相差Δｐの変化曲線Ｗ１との交点の個数を算出することにより、判定ラインＪＬ上の位相差Δｐの変化の回数を求める。

より具体的には、判定部１１３は、図５（Ａ）に示す判定ラインＪＬに沿ってＸ軸方向に位相差Δｐの変化曲線を求める。この図５（Ａ）に示す一例では、判定ラインＪＬ上の位置ｘ２から位置ｘ３と、位置ｘ５から位置ｘ７と、位置ｘ９から位置ｘ１０の部分の位相差Δｐが比較的大きい。また、この図５（Ａ）に示す一例では、判定ラインＪＬ上の位置ｘ１と、位置ｘ４から位置ｘ５と、位置ｘ７から位置ｘ８と、位置ｘ１１との部分の位相差Δｐが比較的小さい。この判定ラインＪＬに沿った位相差Δｐの変化曲線Ｗ１を図５（Ｂ）に示す。

ここで、トリパンブルーによって染色された細胞が生細胞である場合、その生細胞の位相差画像には、細胞膜Ｃｍを示す位相差Δｐの変化が現れる。つまり、生細胞の細胞膜Ｃｍの部分の位相差Δｐは、比較的大きい。また、生細胞の細胞質Ｃｙの部分、及び細胞外の部分の位相差Δｐは、比較的小さい。ここで、図５（Ａ）に示す判定ラインＪＬ上の位置ｘ１は、細胞外の部分を示す。この判定ラインＪＬ上の位置ｘ２から位置ｘ３の部分は、細胞膜Ｃｍを示す。この判定ラインＪＬ上の位置ｘ４から位置ｘ５の部分は、細胞質Ｃｙを示す。

この図５（Ａ）に示す判定ラインＪＬ上の、細胞外の位置ｘ１から、細胞膜Ｃｍを示す位置ｘ２の間において、位相差Δｐの変化曲線Ｗ１がしきい値ＴｈＬ１を超えるように、変化曲線Ｗ１としきい値ＴｈＬ１とが交差する。この位置ｘ１と位置ｘ２との間における、変化曲線Ｗ１としきい値ＴｈＬ１との交点は、細胞膜Ｃｍの外周部の位置を示している。
また、判定ラインＪＬ上の、細胞膜Ｃｍを示す位置ｘ３から細胞質Ｃｙを示す位置ｘ４の間において、位相差Δｐの変化曲線Ｗ１がしきい値ＴｈＬ１以下になるように、変化曲線Ｗ１としきい値ＴｈＬ１とが交差する。この位置ｘ３と位置ｘ４との間における、変化曲線Ｗ１としきい値ＴｈＬ１との交点は、細胞膜Ｃｍの内周部の位置を示している。
つまり、変化曲線Ｗ１としきい値ＴｈＬ１との２つの交点は、細胞膜Ｃｍの外周部の位置と、内周部の位置とを示している。

なお、ここでは、判定ラインＪＬ上の位置のうち、中心線ＣＬからＸ軸の負方向側、つまり、位置ｘ１から位置ｘ６の範囲について説明した。すなわち、径方向の長さの半分以下の範囲について説明した。判定ラインＪＬ上の位置のうち、中心線ＣＬからＸ軸の正方向側、つまり、位置ｘ６から位置ｘ１１の範囲についても同様である。すなわち、位置ｘ８と位置ｘ９との間における、変化曲線Ｗ１としきい値ＴｈＬ１との交点は、細胞膜Ｃｍの内周部の位置を示している。また、位置ｘ１０と位置ｘ１１との間における、変化曲線Ｗ１としきい値ＴｈＬ１との交点は、細胞膜Ｃｍの外周部の位置を示している。

ここで、判定ラインＪＬ上の位置のうち、中心線ＣＬからＸ軸の負方向側、又は中心線ＣＬからＸ軸の正方向側のいずれかの位置において、細胞膜Ｃｍを示す位相差Δｐの変化が存在すれば、判定部１１３は、判定対象の細胞を生細胞であると判定する。つまり、細胞の径方向の長さの半分以下の範囲において、細胞膜Ｃｍを示す位相差Δｐの変化が存在すれば、判定部１１３は、判定対象の細胞を生細胞であると判定する。

［判定対象が死細胞である場合］
次に、上述したステップＳ４０及びステップＳ５０において、判定部１１３による判定対象の細胞が死細胞である場合について、図６を参照して説明する。
図６は、本実施形態の判定部１１３による死細胞の判定例を示す模式図である。判定部１１３が、ある死細胞の画像ＰＣｅｌｌ２について判定する場合の一例を、図６（Ａ）に示す。画像ＰＣｅｌｌ２とは、死細胞が撮像された位相差画像である。この画像ＰＣｅｌｌ２においては、細胞核Ｃｎと、細胞膜Ｃｍと、細胞質Ｃｙとが判別困難な状態である。なお、この図６（Ａ）においては、上述した図５（Ａ）と同様に、位相差画像の位相差Δｐが大きい部分を黒く、位相差Δｐが小さい部分を白くして、位相差Δｐを示す。

判定部１１３は、画像ＰＣｅｌｌ２の径方向に判定ラインＪＬを定める。画像ＰＣｅｌｌ２の径方向とは、図６（Ａ）に示す一例では、同図のＸ軸方向である。すなわち、この一例では、画像ＰＣｅｌｌ２の径方向とは、画像ＰＣｅｌｌ２の直径方向である。

判定部１１３は、上述したステップＳ５０において、判定ラインＪＬ上の位相差Δｐの変化の回数を求める。具体的には、判定部１１３は、位相差のしきい値ＴｈＬ１と、位相差Δｐの変化曲線Ｗ２との交点の個数を算出することにより、判定ラインＪＬ上の位相差Δｐの変化の回数を求める。

より具体的には、判定部１１３は、図６（Ａ）に示す判定ラインＪＬに沿ってＸ軸方向に位相差Δｐの変化曲線を求める。この図６（Ａ）に示す一例では、判定ラインＪＬ上の位置ｘ２から位置ｘ１０の部分の位相差Δｐが比較的大きい。また、この図６（Ａ）に示す一例では、判定ラインＪＬ上の位置ｘ１と、位置ｘ１１との部分の位相差Δｐが比較的小さい。この判定ラインＪＬに沿った位相差Δｐの変化曲線Ｗ２を図６（Ｂ）に示す。

ここで、トリパンブルーによって染色された細胞が死細胞である場合、その死細胞の位相差画像には、細胞膜Ｃｍを示す位相差Δｐの変化が現れにくい。つまり、死細胞においては、細胞膜Ｃｍの部分の位相差Δｐと、細胞質Ｃｙの部分の位相差Δｐとの差が小さい。これは、生細胞において、細胞膜Ｃｍの部分の位相差Δｐが比較的大きく、細胞質Ｃｙの部分、及び細胞外の部分の位相差Δｐが比較的小さいことと相違する。

より具体的には、図６（Ａ）に示す判定ラインＪＬ上の、細胞外の位置ｘ１から、細胞膜Ｃｍを示す位置ｘ２の間において、位相差Δｐの変化曲線Ｗ２がしきい値ＴｈＬ１を超えるように、変化曲線Ｗ２としきい値ＴｈＬ１とが交差する。この位置ｘ１と位置ｘ２との間における、変化曲線Ｗ２としきい値ＴｈＬ１との交点は、細胞膜Ｃｍの外周部の位置を示している。
また、判定ラインＪＬ上の、位置ｘ２から位置ｘ６の間において、位相差Δｐの変化曲線Ｗ２がしきい値ＴｈＬ１以下にならない。これは、生細胞において、位相差Δｐの変化曲線Ｗ２がしきい値ＴｈＬ１以下になるのと相違する。

なお、ここでは、判定ラインＪＬ上の位置のうち、中心線ＣＬからＸ軸の負方向側、つまり、位置ｘ１から位置ｘ６の範囲について説明した。すなわち、径方向の長さの半分以下の範囲について説明した。判定ラインＪＬ上の位置のうち、中心線ＣＬからＸ軸の正方向側、つまり、位置ｘ６から位置ｘ１１の範囲についても同様である。

ここで、判定ラインＪＬ上の位置のうち、中心線ＣＬからＸ軸の負方向側、又は中心線ＣＬからＸ軸の正方向側のいずれかの位置において、細胞膜Ｃｍを示す位相差Δｐの変化が存在しなければ、判定部１１３は、判定対象の細胞を死細胞であると判定する。つまり、細胞の径方向の長さの半分以下の範囲において、細胞膜Ｃｍを示す位相差Δｐの変化が存在しなければ、判定部１１３は、判定対象の細胞を死細胞であると判定する。
また本実施形態では、フィルタ部１１２で抽出した特定部位である細胞領域ＲＯＩの情報と上記とは異なる部位の特定領域である細胞膜の画像情報とを用い、細胞膜の長さまたは面積、細胞面積に着目し、例えば細胞の生死判定等の物体の状態判定を行うことが可能である。
まず、図４（Ａ）の細胞Ｃ１を例に説明する。
細胞Ｃ１について上記と同様の処理を実施し、図４（Ｂ）に示すように細胞領域ＲＯＩ１を抽出する。この細胞領域ＲＯＩ１には、図４（Ａ）で判るように図面上やや濃い色で表現されている輪帯状部（一部途切れている部分あり）で図示されている細胞膜と推測される外側領域に白くにじんだ領域のハロ領域（ノイズ成分）が存在する。このハロ領域は、細胞は存在していない領域である。したがって、ハロ領域を削除することで細胞Ｃ１の輪郭を抽出することが可能となる。この輪郭は細胞膜の外側の壁部分と仮定できる。このハロ領域の特定は位相差画像の輝度情報を基に画像認識により行うことが可能である。または、細胞種毎に予めハロ領域の寸法情報、例えば、ハロ領域の外周部から細胞内部に向かうハロが存在する長さ情報を記憶しておき、この情報を基にハロ領域を除くことも可能である。このようにハロ領域を除いた細胞Ｃ１の輪郭は細胞膜の外周部に相当が存在する領域であると定義でき、細胞Ｃ１の細胞膜の全周を測定することが可能となる。
次に上記と同様の処理を実施し、図４（Ｃ）に示すように例えば細胞Ｃ１を対象にした場合、細胞膜の画像ＣＴ１１〜ＣＴ１４を認識し、抽出する。この細胞膜の画像ＣＴ１１〜ＣＴ１４の周方向の長さに着目する。上記の様に細胞膜の全周の長さは測定可能となっている。この細胞膜の全周の長さに対する細胞膜の画像ＣＴ１１〜ＣＴ１４の長さの和の割合（比）を算出することで細胞の生死判定の基準とすることが可能である。この基準は、細胞種によっても異なる。したがって、細胞種毎に生死判定基準値を予め記憶しておき、この基準値を満たすか否かでの判断を行うことも可能である。また、上記の例では細胞膜全周の長さに対する実際の細胞膜の長さの割合で生死判断を行ったがこれに限定されるものではい。例えば実際の細胞膜の長さの絶対値によっても生死判定することが可能である。この場合、細胞種や培養条件等毎の生死判定基準を予め定め、これに従って判定することも可能である。
更に、細胞の面積と細胞膜の面積を用い判定することも可能である。
この例では、まず、上記と同様の処理により図４（Ｂ）に示すようにフィルタ部１１２により、細胞領域ＲＯＩを抽出する（ステップＳ３０）。次に細胞領域ＲＯＩの面積を算出する。例えば細胞Ｃ１を対象にした場合、細胞領域ＲＯＩ１の面積を算出する。次に上記と同様に細胞膜の画像ＣＴ１１〜ＣＴ１４を認識し、抽出する。この細胞膜の画像ＣＴ１１〜ＣＴ１４の面積に着目し、面積を算出する。この細胞膜の画像ＣＴ１１〜ＣＴ１４の面積の和と細胞領域ＲＯＩ１の面積の割合（比）を算出することで細胞の生死判定の基準とすることが可能である。この基準は、細胞種によっても異なる。したがって、細胞種毎に生死判定基準値を予め記憶しておき、この基準値を満たすか否かでの判断を行うことも可能である。また、例えば実際の細胞膜の面積の絶対値によっても生死判定することが可能である。この場合、細胞種や培養条件等毎の生死判定基準を予め定め、これに従って判定することも可能である。
上記のような細胞膜、細胞領域の長さや面積は、例えば撮像素子のピクセルを用い、ピクセル数をもとに算出することが可能である。
本願発明は、培養された複数の細胞の中から、少なくとも1つの細胞を抜き取り、上記のような画像解析を行うことが可能であることから抜き取られた検査細胞以外の培養中の細胞に対しては悪影響を及ぼすことなく細胞状態を判定することが可能である。
本発明に適用可能な観察物は、本実施例で説明したような細胞に限られるものではなく、例えば幹細胞や神経細胞、心筋細胞、皮膚細胞、肝細胞、血液細胞、免疫細胞等の各種細胞のほか、微生物等の生物や組織等に適用可能であり、位相差観察が可能な観察物全般に適用可能である。
また、細胞の生死判定に限らず、分化状態、分化時期、スクリーニングにおける薬効、毒性等の細胞状態判定に用いることができる。また。細胞に限らず、微生物の成育状態、機能検出にも応用可能である。このようなスクリーニング、薬品の毒性試験、薬効試験または再生医療の処理工程に本願発明の状態判定方法を採用することにより、より効率的なスクリーニング、効率的な薬品の製造、または効率的な再生細胞の作製を行うことが可能となる。
また、本願発明の方法をプログラミングした制御装置により観察装置を駆動させることで観察対象となる物体の状態を判定可能な観察装置、スクリーニング装置、細胞培養装置を構築することも可能である。

［生細胞及び死細胞の判定］
上述したように、生細胞と、死細胞とでは、判定ラインＪＬ上の位相差Δｐの変化曲線が相違する。判定部１１３は、この位相差Δｐの変化曲線が、生細胞を示す変化曲線（例えば、図５（Ｂ）に示す変化曲線Ｗ１）であれば、判定対象の細胞を生細胞であると判定する。また、判定部１１３は、この位相差Δｐの変化曲線が、死細胞を示す変化曲線（例えば、図６（Ｂ）に示す変化曲線Ｗ２）であれば、判定対象の細胞を死細胞であると判定する。

ここで、判定部１１３は、判定対象の細胞の径方向の長さの半分以下の範囲における、位相差Δｐの変化曲線と、しきい値ＴｈＬ１との交点の個数に基づき、判定対象の細胞が生細胞であるか死細胞であるかを判定する（ステップＳ６０）。
具体例として、判定対象の細胞が生細胞の場合について説明する。図５（Ｂ）に示すように、位置ｘ１から位置ｘ６の範囲において、変化曲線Ｗ１としきい値ＴｈＬ１との交点の個数は、２個である。この場合、判定部１１３は、変化曲線Ｗ１としきい値ＴｈＬ１との交点の個数を、２個であると算出する。
また他の具体例として、判定対象の細胞が死細胞の場合について説明する。図６（Ｂ）に示すように、位置ｘ１から位置ｘ６の範囲において、変化曲線Ｗ２としきい値ＴｈＬ１との交点の個数は、１個である。この場合、判定部１１３は、変化曲線Ｗ２としきい値ＴｈＬ１との交点の個数を、１個であると算出する。

この一例では、判定部１１３は、位相差Δｐの変化曲線と、しきい値ＴｈＬ１との交点の個数が２個以上であれば、判定対象の細胞を生細胞である（ステップＳ６０；ＹＥＳ）と判定して、処理をステップＳ７０に進める。また、判定部１１３は、位相差Δｐの変化曲線と、しきい値ＴｈＬ１との交点の個数が１個以下であれば、判定対象の細胞を死細胞である（ステップＳ６０；ＮＯ）と判定して、処理をステップＳ８０に進める。

次に、判定部１１３は、判定対象のすべての細胞領域ＲＯＩについて生死判定したか否かを判定する（ステップＳ９０）。判定部１１３は、判定対象のすべての細胞領域ＲＯＩについて生死判定していないと判定した場合（ステップＳ９０；ＮＯ）には、処理をステップＳ４０に戻して、次の細胞領域ＲＯＩについての処理を継続する。判定部１１３は、判定対象のすべての細胞領域ＲＯＩについて生死判定したと判定した場合（ステップＳ９０；ＹＥＳ）には、一連の処理を終了する。

以上説明したように、本実施形態の判定システム１は、判定部１１３を備えている。この判定部１１３は、画像取得部１１１が取得した位相差画像に基づいて、細胞が生細胞と死細胞とのいずれであるかを判定する。上述したように、位相差画像によると、位相差を用いない画像に比べて、被検体Ｓの物理的な構造がその画像に現れやすい。例えば、動物細胞においては、その細胞膜の物理的な構造が位相差画像に現れやすい。したがって、位相差画像による判定を行うことにより、判定対象の細胞が色素細胞であった場合でも、その細胞の色味が判定に及ぼす影響を低減することができる。つまり、本実施形態の判定部１１３によれば、位相差画像に基づいて判定することにより、細胞の色味が判定に及ぼす影響を低減することができる。

また、本実施形態の判定部１１３は、細胞を示す画像の、径方向の位相差Δｐの変化に基づいて、細胞が生細胞と死細胞とのいずれであるかを判定する。上述したように、死細胞に対して選択的に染色を行うと、色素が死細胞の内部に透過する。これにより、死細胞においては、細胞内部の物理的な構造が位相差画像に現れにくくなる。換言すれば、生細胞においては、細胞内部の物理的な構造に応じて、位相差Δｐに変化が生じやすい。一方、死細胞においては、細胞内部の物理的な構造に応じて、位相差Δｐに変化が生じにくい。つまり、生細胞と死細胞とでは、位相差画像の位相差Δｐの変化の状態が相違する。判定部１１３は、この位相差画像の位相差Δｐの変化の状態が相違する点を利用して、判定対象の細胞が生細胞であるか、死細胞であるかを判定する。したがって、本実施形態の判定部１１３によれば、細胞の色味が判定に及ぼす影響を低減することができる。つまり、本実施形態の判定システム１によれば、細胞の生死判定の精度を向上することができる。

また、本実施形態の判定部１１３は、細胞の径方向の長さの半分以下の範囲における位相差Δｐの変化に基づいて、細胞が生細胞と死細胞とのいずれであるかを判定する。すなわち、本実施形態の判定部１１３は、細胞の径方向のすべての範囲ではなく、一部の範囲における位相差Δｐの変化に基づいて、細胞が生細胞と死細胞とのいずれであるかを判定する。これにより、判定部１１３は、位相差画像に細胞膜を示す画像が一部でも含まれていれば、細胞が生細胞と死細胞とのいずれであるかを判定することができる。

また、本実施形態の判定システム１は、フィルタ部１１２を備えている。このフィルタ部１１２は、細胞の外形を抽出する。このフィルタ部１１２により、判定部１１３における判定を容易にすることができる。

［変形例］
なお、ここまで判定部１１３がしきい値ＴｈＬ１に基づいて判定する場合を一例にして説明したが、これに限られない。判定部１１３は、しきい値ＴｈＬ２に基づいて、細胞の生死を判定してもよい。このしきい値ＴｈＬ２によれば、図５（Ｂ）に示すように、細胞膜Ｃｍによる位相差Δｐの変化に加え、細胞核Ｃｎによる位相差Δｐの変化をも検出することができる。

また、これまで、細胞の位相差画像において、細胞膜部分の位相差Δｐが大きいとして説明したが、これに限られない。図７に示すように、図５（Ａ）及び図６（Ａ）に示す位相差画像と、位相差が反転していてもよい。
図７は、本実施形態の変形例における位相差Δｐの変化曲線の一例を示す模式図である。ここで、図７（Ａ）に示す変化曲線Ｗ３とは、図５（Ａ）に示す生細胞の変化曲線Ｗ１を反転させた曲線である。また、図７（Ｂ）に示す変化曲線Ｗ４とは、図６（Ａ）に示す生細胞の変化曲線Ｗ２を反転させた曲線である。

また、上述したフィルタ部１１２は、画像取得部１１１が取得した位相差画像に対して画素値の積分処理及び微分処理を行うことにより、図４（ｃ）に示すように、細胞膜部分を強調した画像を生成してもよい。この場合には、フィルタ部１１２は、図４（Ｂ）に示す細胞領域ＲＯＩを示す画像とともに、図４（ｃ）に示す細胞膜部分を強調した画像を判定部１１３に出力する構成であってもよい。図４（ｃ）に示す一例の場合、フィルタ部１１２は、細胞Ｃ１について、細胞膜の画像ＣＴ１１〜ＣＴ１４を強調した画像を判定部１１３に出力する。また、フィルタ部１１２は、細胞Ｃ２について、細胞膜の画像ＣＴ２１〜ＣＴ２３を強調した画像を判定部１１３に出力する。

また、本実施形態における判定システム１の各処理を実行するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、当該記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することにより、上述した種々の処理を行ってもよい。

なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものであってもよい。また、「コンピュータシステム」は、ＷＷＷシステムを利用している場合であれば、ホームページ提供環境（あるいは表示環境）も含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等の書き込み可能な不揮発性メモリ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。

さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムが送信された場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリ（例えばＤＲＡＭ（Dynamic Random Access Memory））のように、一定時間プログラムを保持しているものも含むものとする。また、上記プログラムは、このプログラムを記憶装置等に格納したコンピュータシステムから、伝送媒体を介して、あるいは、伝送媒体中の伝送波により他のコンピュータシステムに伝送されてもよい。ここで、プログラムを伝送する「伝送媒体」は、インターネット等のネットワーク（通信網）や電話回線等の通信回線（通信線）のように情報を伝送する機能を有する媒体のことをいう。また、上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであっても良い。さらに、前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるもの、いわゆる差分ファイル（差分プログラム）であってもよい。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。

１…判定システム、１０…判定装置、１１１…画像取得部、１１２…フィルタ部、１１３…判定部、２０…表示部、３０…位相差顕微鏡装置

Claims (12)

1. 位相差観察により観察された観察物体の位相差画像を撮像する画像取得部と、
   撮像された前記位相差画像中の観察物体における特定領域の位相差情報をもとに前記観察物体の状態を判定する判定部と、
   を備えることを特徴とする判定装置。
2. 前記位相差画像中の観察物体における特定領域は、少なくとも２つの異なる部位の特定領域であり、前記判定部は、前記異なる部位の特定領域の位相差情報をもとに前記観察物体の状態を判定することを特徴とする請求項１に記載の判定装置。
3. 前記判定部は、前記異なる部位の特定領域の位相差情報を比較することで前記観察物体の状態を判定することを特徴とする請求項２に記載の判定装置。
4. 前記判定部での判定に関わる前記位相差情報は、前記観察物体の特定部位の形態に関わる情報であることを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載の判定装置。
5. 前記位相差情報は前記特定部位の長さおよび面積の少なくとも何れか１つの情報であることを特徴とする請求項４に記載の判定装置。
6. 前記判定部は、取得された前記位相差画像中のノイズ成分を除外する処理を行い決定された特定領域の位相差情報基に判定することを特徴とする請求項１から５の何れか一項に記載の判定装置。
7. 前記観察物体は、細胞標本であり、
   前記特定領域は、細胞領域と前記細胞領域内に存在する細胞膜であることを特徴とする請求項１から６の何れか一項に記載の判定装置。
8. 前記判定部は、前記位相差画像より決定された細胞膜の全周の長さと、前記位相差画像で認識された細胞膜の長さとを比較した値によって細胞標本の状態を判定することを特徴とする請求項７に記載の判定装置。
9. 観察物体を位相差撮像することにより位相差画像を生成する位相差撮像部と、
   請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の判定装置と、
   前記判定装置の判定結果を出力する出力部と、
   を備えることを特徴とする判定システム。
10. コンピュータに、
    観察物体を位相差撮像することにより位相差画像を生成する位相差撮像手順と、
    前記位相差撮像手順において生成された前記位相差画像中の観察物体における特定領域の位相差情報に基づいて、前記観察物体の状態を判定する判定手順と、
    を実行させるための判定プログラム。
11. 細胞を位相差撮像することにより位相差画像を生成する位相差撮像手順と、
    前記位相差撮像手順において生成された前記位相差画像に含まれる前記細胞を示す細胞画像の径方向に、前記細胞の細胞膜を示す位相差の変化に基づいて、前記細胞が生細胞と死細胞とのいずれであるかを判定する判定手順と、
    を有することを特徴とする細胞の製造方法。
12. 請求項１１に記載の細胞の製造方法により製造された細胞。