JP2016121989A - 酵素電極 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】電極と、
前記電極と接触し、酵素と架橋剤と導電性ポリマーと糖とを含む検知層を含み、
前記検知層における前記酵素と前記電極間で電子授受が行われることを特徴とする、酵素電極。
【選択図】図4
Description
すなわち、本発明の一側面は、目的物質の濃度を高感度かつ定量的に測定するための酵素電極を提供することを目的とする。
すなわち、本発明の一側面は、電極と、
前記電極と接触し、酵素と架橋剤と導電性ポリマーと糖とを含む検知層を含み、
前記検知層における前記酵素と前記電極間で電子授受が行われることを特徴とする、酵素電極に関する。上記糖は、二糖類以上の多糖類から選ばれる少なくとも1種類であることが好ましい。また、前記酵素は酸化還元酵素であることが好ましい。
バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの電圧印加により得られる、測定対象物質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流を検出する、検出部と、
前記電流値から前記物質の濃度を算出する、演算部と、
前記算出された前記物質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置に関する。
図1は、実施形態に係る酵素電極を模式的に示した図である。図1において、酵素電極Aは、電極1と、電極1の表面(図1では上面)に形成された検知層2とを備える。
電極1は、金(Au),白金(Pt),銀(Ag),パラジウムのような金属材料、或いはカーボンのような炭素材料を用いて形成される。電極1は、例えば、図1に示すような絶縁性基板3上に形成される。絶縁性基板3は、ポリエーテルイミド(PEI)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリエチレン(PE)のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂(プラスチック)、ガラス、セラミック、紙のような絶縁性材料で形成される。電極1をなす電極材料及び絶縁性基板3の材料は、公知のあらゆる材料を適用することができる。電極1及び絶縁性基板3の大きさ、厚さは適宜設定可能である。以下、絶縁性基板3と電極1との組合せを「基材」と呼ぶこともある。
検知層2は、電極1と接触し、酵素4と、導電性ポリマー5と、糖6と、架橋剤7と、を含んでおり、電子メディエータを含んでいない。
なお、電子伝達メディエータを用いる場合でも、電子伝達メディエータが固定化されており拡散しないような場合は電荷移動律速電流を測定することができる。
動することができる。すなわち、実施形態に係る酵素電極Aは、検知層2における直接電子移動によって酵素4と電極1との間で電子授受が行われる。
酵素4は、例えば、酸化還元酵素が挙げられる。例えばグルコースオキシダーゼ(GOD)、ガラクトースオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、D−又はL−アミノ酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、L−乳酸オキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、チトクロムオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、17Bヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、エストラジオール17Bデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ、3−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、チトクロムオキシドレダクターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ等が挙げられる。中でも、糖類の酸化還元酵素であることが好ましく、糖類の酸化還元酵素の例としては、例えば、グルコースオキシダーゼ(GOD)、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
また、酸化還元酵素は、電子伝達サブユニット若しくは、電子伝達ドメインを含むことができる。電子伝達サブユニットとしては、例えば、電子授受の機能を持つヘムを有するサブユニット挙げられる。このヘムを有するサブユニットを含む酸化還元酵素としては、シトクロムを含むものが挙げられ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼや、PQQGDHとシトクロムとの融合蛋白質を適用することができる。
また、電子伝達ドメインを含む酵素としては、コレステロールオキシダーゼ、キノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ(QHEDH (PQQ Ethanol dh)が挙げられる。さらに、電子伝達ドメインは、電子授受の機能を持つヘムを有するシトクロムを含むドメインを適用するのが好ましい。例えば、 "QHGDH" (fusion enzyme; GDH with heme domain of QHGDH))、ソルビトールデヒドロゲナーゼ(Sorbitol DH)、D-フルクトースデヒドロゲナーゼ(Fructose DH)、Agrobacterium tumefasience由来のグルコース-3-デヒドロゲナーゼ(Glucose-3-Dehydrogenase)(G3DH from Agrobacterium tumefasience)、セロビオースデヒドロゲナーゼが挙げられる。なお、上述したシトクロムを含むサブユニットの例示であるPQQGDHとシトクロムとの融合蛋白質、及びシトクロムを含むドメインの例示であるPQQGDHのシトクロムドメインは、例えば、国際公開WO2005/030807号公報に開示されている。また、
酸化還元酵素は、少なくとも触媒サブユニットおよび電子受容体の機能を持つヘムを有するシトクロムを含むサブユニットから構成されているオリゴマー酵素を適用するのが好ましい。
導電性ポリマー5としては、ポリピロール、ポリアニリン、ポリスチレンスルホネート、ポリチオフェン、ポリイソチアナフテン、ポリエチレンジオキシチオフェン(ポリ(3,4−エチレンジオキシチオフェン)ポリ(スチレンスルホネート))、又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。これらの市販品として、例えば、ポリピロールとして、例えば、「SSPY」(3−メチル−4−ピロールカルボン酸エチル)(化研産業株式会社製)等がある。また、ポリアニリンとして、例えば「AquaPASS 01−x」(ティーエーケミカル社製)等がある。また、ポリスチレンスルホネートとして、例えば「ポリナス」(東ソー有機化学株式会社製)等がある。ポリチオフェンとして、例えば「エスペイサー100」(ティーエーケミカル社製)等がある。ポリイソチアナフテンとして、例えば「エスペイサー300」(ティーエーケミカル社製)等がある。ポリエチレンジオキシチオフェン(ポリ(3,4−エチレンジオキシチオフェン)ポリ(スチレンスルホネート))として、例えば、「PEDOT−PSS」(Polysciences,Inc.)等がある。
また、様々な属性(例えば、水溶性)を有する導電性ポリマーを適用することができる。導電性ポリマー5の官能基は、水酸基又はスルホ基を有することが好ましい。
糖6は酵素4の基質とならない糖であり、糖6の構成糖の数は、例えば、1〜6であり、好ましくは2〜6である。これらはD体、L体のいずれであってもよく、またその混合物であっても良く、1種単独で又は2種以上を適宜組み合わせて使用することができる。ただし、グルコースなどの糖を測定対象とするときは、糖6として、測定対象の糖とは異なる糖であって、酵素4の基質とならない糖を用いる。
二糖類としては、キシロビオース、アガロビオース、カラビオース、マルトース、イソマルトース、ソホロース、セロビオース、トレハロース、ネオトレハロース、イソトレハロース、イヌロビオース、ビシアノース、イソプリメベロース、サンブビオース、プリメベロース、ソラビオース、メリビオース、ラクトース、リコビオース、エピセロビオース、スクロース、ツラノース、マルツロース、ラクツロース、エピゲンチビオース、ロビノビオース、シラノビオース、ルチノース等が挙げられる。三糖類としては、グルコシルトレハロース、セロトリオース、カコトリオース、ゲンチアノース、イソマルトトリオース、イソパノース、マルトトリオース、マンニノトリオース、メレジトース、パノース、プランテオース、ラフィノース、ソラトリオース、ウンベリフェロースなどが挙げられる。四糖類としては、マルトシルトレハロース、マルトテトラオース、スタキオースなどが挙げられる。五糖類としては、マルトトリオシルトレハロース、マルトペンタオース、ベルバスコースなどが挙げられる。六糖類としてはマルトヘキサオースなどが挙げられる。
架橋剤7の種類として、具体的には、アルデヒド基含有化合物として、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、マロンアルデヒド、テレフタルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、イソバレルアルデヒド、シンナムアルデヒド、ニコチンアルデヒド、グリセルアルデヒド、グリコアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジプアルデヒド、イソフタルアルデヒド、テレフタルアルデヒドなどが挙げられる。カルボジイミド基含有化合物として、ヘキサメチレンジイソシアネート、水添キシリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネート、2,2,4−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート、1,12−ジイソシアネートドデカン、ノルボルナンジイソシアネート、2,4−ビス−(8−イソシアネートオクチル)−1,3−ジオクチルシクロブタン、4,4’−ジシク
ロヘキシルメタンジイソシアネート、テトラメチルキシリレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートなどが挙げられる。またカルボジイミド基含有化合物はカルボジライトV−02、カルボジライトV−02−L2、カルボジライトV−04、カルボジライトV−06、カルボジライトE−02、カルボジライトV−01、カルボジライトV−03、カルボジライトV−05、カルボジライトV−07、カルボジライトV−09(何れも商品名、日清紡ケミカル株式会社製)などとして市販されている。マレイミド基含有化合物として、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル4−(p−マレイミドフェニル)ブチレート、m−マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル、N−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン1−カルボキシレート、N−スクシニミジル−2−マレイミド酢酸、N−スクシンイミジル4−マレイミド酪酸、N−スクシンイミジル6−マレイミドヘキサン酸、N-スクシンイミジル4−マレイミドメチルシクロヘキサン−1−カルボン酸、N−スルホスクシンイミジル4−マレイミドメチルシクロヘキサン−1−カルボン酸、N−スクシンイミジル4−マレイミドメチル安息香酸、N−スクシンイミジル3−マレイミド安息香酸、N-スクシンイミジル4−マレイミドフェニル−4−酪酸、N−スルホスクシンイミジル4−マレイミドフェニル−4−酪酸、N,N’−オキシジメチレン−ジマレイミド、N,N’−o−フェニレン-ジマレイミド、N,N’−m−フェニレン−ジマレイミド、N,N’−p−フェニレン-ジマレイミド、N,N’−ヘキサメチレン−ジマレイミド、N−スクシンイミジルマレイミドカルボン酸などが挙げられる。また、サンフェルBM−G(三新化学工業株式会社製)などの市販品も挙げられる。オキサゾリン基含有化合物として、2,2’−ビス−(2−オキサゾリン)、2,2’−メチレン− ビス−(2−オキサゾリン)、2,2’−エチレン−ビス−(2−オキサゾリン)、2,2’−トリメチレン−ビス−(2−オキサゾリン)、2,2’−テトラメチレン−ビス−(2−オキサゾリン)、2,2’−ヘキサメチレン−ビス−(2−オキサゾリン)、2,2’−オクタメチレン−ビス−(2−オキサゾリン)、2,2’−エチレン−ビス−(4,4’−ジメチル−2−オキサゾリン)、2,2’−p−フェニレン−ビス−(2−オキサゾリン)、2,2’−m−フェニレン−ビス−(2−オキサゾリン)、2,2’−m−フェニレン−ビス−(4,4’−ジメチル−2−オキサゾリン)、ビス−(2−オキサゾリニルシクロヘキサン)スルフィド、ビス−(2−オキサゾリニルノルボルナン)スルフィドなどのオキサゾリン化合物。また、付加重合性オキサゾリン化合物として2−ビニル−2−オキサゾリン、2−ビニル−4−メチル−2−オキサゾリン、2−ビニル−5−メチル−2−オキサゾリン、2−イソプロペニル−2−オキサゾリン、2−イソプロペニル−4−メチル−2−オキサゾリン、2−イソプロペニル−5−エチル−2−オキサゾリンなどが挙げられ、これらの1種もしくは2種以上の化合物を重合または共重合したものを使用可能である。またオキサゾリン基含有化合物は、エポクロスWS−500、エポクロスWS−700、エポクロスK−1010E、エポクロスK−1020E、エポクロスK−1030E、エポクロスK−2010E、エポクロスK−2020E、エポクロスK−2030E、エポクロスRPS−1005、エポクロスRAS−1005 (いずれも株式会社日本触媒社製)、NKリンカーFX(新中村化学工業株式会社製)などとして市販されている。エポキシ基含有化合物として、具体的には、ソルビトールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、などが挙げられ、これらの化合物を2種以上併用して用いることもできる。またエポキシ基含有化合物は、デナコールEX−611、デナコールEX−612、デナコールEX−614、デナコールEX−614B、デナコールEX−512、デナコールEX−521、デナコールEX−421、デナコールEX−313、デナコールEX−314、デナコールEX−321、デナコールEX−810、デナコールEX−811、デナコールEX−850、デナコールEX−
851、デナコールEX−821、デナコールEX−830、デナコールEX−832、デナコールEX−841、デナコールEX−861、デナコールEX−911、デナコールEX−941、デナコールEX−920、デナコールEX−145、デナコールEX−171(いずれも商品名、ナガセケムテックス株式会社製)、SR−PG、SR−2EG、SR−8EG、SR−8EGS、SR−GLG、SR−DGE、SR−4GL、SR−4GLS、SR−SEP(いずれも商品名、阪本薬品工業株式会社製)、エポライト200E、エポライト400E、エポライト400P(いずれも共栄社化学株式会社製)、などとして市販されている。架橋剤の種類は、上記化合物、市販品に限定されず、アルデヒド基、マレイミド基、カルボジイミド基、オキサゾリン基、エポキシ基の少なくとも1つの官能基を含む化合物であってもよい。また架橋剤の形態も限定されず、モノマー、ポリマーの何れの形態であってもよい。
検知層はさらに導電性粒子を含むことが好ましい。導電性粒子は、金、白金、銀、パラジウムのような金属製粒子、或いは、炭素を材料とした高次構造体を適用することができる。高次構造体は、例えば、導電性カーボンブラック,ケッチェンブラック(登録商標)、カーボンナノチューブ(CNT)、フラーレンから選択される微粒子(炭素微粒子)の1種以上を含有することができる。
上記した酵素電極Aは、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、絶縁性基板3の片面に、電極1として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ(例えば100μm程度)のフィルム状の絶縁性基板3の片面に、金属材料を物理蒸着(PVD,例えばスパッタリング)、或いは化学蒸着(CVD)によって成膜することによって、所望の厚さ(例えば30nm程度)を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、炭素材料で形成された電極層を形成することもできる。
次に、電極1上に検知層2が形成される。すなわち、酵素4、導電性ポリマー5、糖6、架橋剤7を含有する溶液(試薬)が調製される。ここで、糖の濃度は0.1〜2重量%が好ましく、0.2〜2重量%がより好ましい。溶液(試薬)は、電極1の表面に滴下される。溶液(試薬)が電極1上で乾燥により固化することで、電極1上に検知層2が形成された酵素電極Aを得ることができる。
本発明の酵素電極はグルコースセンサなどのバイオセンサに使用できる。バイオセンサは、本発明の酵素電極とともに対極となる電極を含む。対極としては、バイオセンサの対極として一般的に使用できるものであればよいが、例えば、スクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着(PVD,例えばスパッタリング)、或いは化学蒸着(CVD)によって成膜した金属電極や、スクリーン印刷により製膜した銀/塩化銀電極を用いる
ことができる。また、銀/塩化銀電極やスクリーン印刷により製膜したカーボン電極や、物理蒸着(PVD,例えばスパッタリング)、或いは化学蒸着(CVD)によって成膜した金属電極を参照極とした3電極系を用いてもよい。
次に、図面を用いて、本発明の測定装置について説明する。ここでは、バイオセンサとしてグルコースセンサを使用したグルコース測定装置について例示したが、本発明の測定装置は以下の態様には限定されない。
図2は、測定装置B内に収容された主な電子部品の構成例を示す。制御コンピュータ18,ポテンショスタット19,電力供給装置11が、筐体内に収容された基板20上に設けられている。
制御コンピュータ18は、ハードウェア的には、CPU(中央演算処理装置)のようなプロセッサと、メモリ(RAM(Random Access Memory),ROM(Read Only Memory))のような記録媒体と、通信ユニットを含んでおり、プロセッサが記録媒体(例えばROM)に記憶されたプログラムをRAMにロードして実行することによって、出力部10、制御部12、演算部13及び検出部14を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ18は、半導体メモリ(EEPROM,フラッシュメモリ)やハードディスクのような、補助記憶装置を含んでいても良い。
ポテンショスタット19は、作用極の電位を参照電極に対して一定にする装置であり、制御部12によって制御され、端子CR,Wを用いて、グルコースセンサ17の対極と作用極との間に所定の電圧を印加し、端子Wで得られる作用極の応答電流を測定し、応答電流の測定結果を検出部14に送る。
(試薬溶液の調製)
以下のような実施例1、比較例1に係る2種類の試薬溶液を調製した。
(実施例1)
ケッチェンブラック(三菱カーボンブラック) 1.20%
導電性ポリマー:スルホン化 ポリアニリン水溶液(商品名:aquaPASS−01x、三菱レイヨン株式会社製) 0.40%
オキサゾリン基含有ポリマーエポクロスWS-700(日本触媒)6.0%
酵素(Cy−GDH) 4.5mg/mL
糖 (スクロース) 0.50%
リン酸緩衝液(pH5.8) 10mM
なお、“%”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量%濃度を示す。
ケッチェンブラック(三菱カーボンブラック) 1.20%
導電性ポリマー:スルホン化 ポリアニリン水溶液(商品名:aquaPASS−01x
、三菱レイヨン株式会社製) 0.40%
オキサゾリン基含有ポリマーエポクロスWS-700(日本触媒)6.0%
酵素(Cy−GDH) 4.5mg/mL
リン酸緩衝液(pH5.8) 10mM
なお、“%”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量%濃度を示す。このように、比較例1の試薬溶液は、実施例1の試薬溶液から糖が除かれたものである。
次に、片面に金蒸着によって電極(電極層)が形成された複数の絶縁性基板(基材)を用意し、各絶縁性基板に実施例1、比較例1に係る試薬溶液を夫々分注し、低湿度乾燥炉で30分間放置し、乾燥させた。このようにして、試薬が電極上で固化することにより検知層が形成された実施例1に係る酵素電極(試料)と、比較例1に係る酵素電極(試料)とを得た。
次に、各酵素電極を用いて、グルコース343mg/dLに調整したヒト全血(サンプル:S)またはグルコース0mg/dLヒト全血(ブランク:B)に対する応答電流値の測定を行った。グルコース測定は、電極基板上に形成された参照極・対極(共にカーボン)、参照極(銀/塩化銀)を用い、作用極への印加電圧を+0.2V(vs.銀/塩化銀)で測定を行った。
図4は、比較例1と実施例1の酵素電極を用いて得られた電流値のS/B比を示すグラフで
ある。図4に示す試験結果によれば、糖を検知層に含む実施例1の酵素電極では、糖を検知層に含まない比較例1の酵素電極を用いた場合と比べて、検出感度が向上することがわかる。
以下の組成の検知層を有する酵素電極を上記と同様の手順で作製した。
ケッチェンブラック(三菱カーボンブラック) 1.20%
導電性ポリマー:スルホン化 ポリアニリン水溶液(商品名:aquaPASS−01x、三菱レイヨン株式会社製) 0.40%
酵素(Cy−GDH) 4.5mg/mL
糖 0.50%
リン酸緩衝液(pH5.8) 10mM
なお、“%”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量%濃度を示す。このように、比較例2の試薬溶液は、実施例1の試薬溶液から架橋剤が除かれたものである。
実施例1において、糖として、スクロースの代わりに各種糖を検知層に含有させた以外は同じ組成を有する検知層を有する酵素電極を作製し、実施例1と同様にして、調整したヒト全血グルコース濃度256mg/dl、512mg/dl(サンプル:S)またはヒト全血グルコース濃度0mg/dL(ブランク:B)に対する応答電流値の測定を行い、それぞれ、S/B比を測定した。
1・・・電極
2・・・検知層
3・・・絶縁性基板
4・・・酵素
5・・・導電性ポリマー
6・・・糖
7・・・架橋剤(主鎖)
7’・・・架橋剤(側鎖)
B・・・測定装置
10・・・出力部
11・・・電力供給装置
12・・・制御部
13・・・演算部
14・・・検出部
15・・・表示部ユニット
16・・・バッテリ
17・・・グルコースセンサ
18・・・制御コンピュータ
19・・・ポテンショスタット
20・・・基板
CR、W・・・端子
Claims (6)
- 電極と、
前記電極と接触し、酵素と架橋剤と導電性ポリマーと糖とを含む検知層を含み、
前記検知層における前記酵素と前記電極間で電子授受が行われることを特徴とする、酵素電極。 - 糖は、二糖類以上の多糖類から選ばれる少なくとも1種類である、請求項1に記載の酵素電極。
- 前記検知層は導電性粒子を含む、請求項1または2に記載の酵素電極。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の酵素電極を備えたバイオセンサ。
- 請求項4に記載のバイオセンサと、
バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの電圧印加により得られる、測定対象物質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流を検出する、検出部と、
前記電流値から前記物質の濃度を算出する、演算部と、
前記算出された前記物質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置。 - 電極上に、酵素と架橋剤と導電性ポリマーと糖との混合液を塗布して検知層を形成することを含む、酵素と電極間で電子授受が行われる酵素電極の製造方法。
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