JP2016114556A - 糖鎖固定方法、及び糖鎖固定化固相 - Google Patents

Abstract

【課題】糖鎖を効率よく固定化する方法を提供する。【解決手段】本発明の糖鎖固定方法は、糖鎖又は糖鎖修飾物質を固相に固定する方法であって、前記糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液を、糖鎖と特異的に結合する固定化物質を備えた固相に接触させる工程Ａと、前記固相上の溶液を乾燥させる工程Ｂと、乾燥後の固相を加熱する工程Ｃと、を有することを特徴とする。【選択図】なし

Description

本発明は、糖鎖固定方法、及び糖鎖固定化固相に関する。

生化学分野において、核酸、タンパク質に続く第三のバイオポリマーとして、糖鎖が注目されている。糖鎖は、タンパク質や脂質の機能を高め、細胞の接着、移動、発生、分化、増殖、アポトーシス（細胞死）、感染、免疫といったさまざまな生命現象に関与している。
そのため、糖鎖に異常が生じると、がん、糖尿病、肺気腫等の様々な病気が引き起こされるほか、糖鎖に関連する遺伝子異常によって、脳や神経、筋肉等に重篤な先天性疾患が起きることが知られている。

このような知見から、糖鎖をターゲットとした新たな医薬や医薬材料を創製しようとする試みがなされている。係る試みにおいて、糖鎖を固定化するための基材の開発が行われている（特許文献１〜２参照）。

特許文献１には、三官能性スペーサーを用いて、第一の官能基に糖鎖を結合させ、第二の官能基に固相担体、第三の官能基に発色団を結合させる糖鎖アレイの作製方法が示されている。

特許文献２には、スペーサー基を介してチオアルキル化によって糖鎖を基材に固定させる方法が記載されている。

特開２００４−１１５６１６号公報 特開２００６−０７８４１８号公報

しかしながら、特許文献１〜２に記載の方法では、糖鎖を効率よく固定化する点において、未だ改良の余地があった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、糖鎖を効率よく固定化する方法を提供することを目的とする。

［１］本発明の糖鎖固定方法は、糖鎖又は糖鎖修飾物質を固相に固定する方法であって、 前記糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液を、糖鎖と特異的に結合する固定化物質を備えた固相に接触させる工程Ａと、前記固相上の溶液を乾燥させる工程Ｂと、乾燥後の固相を加熱する工程Ｃと、を有することを特徴とする。
［２］本発明の糖鎖固定方法は、前記工程Ｃにおいて、加熱温度は６０℃以上であることが好ましい。
［３］本発明の糖鎖固定方法は、前記工程Ｃにおいて、加熱時間は１時間以上であることが好ましい。
［４］本発明の糖鎖固定方法は、前記工程Ｃにおいて、前記固相は、固相基板であることが好ましい。
[５] 本発明の糖鎖固定方法は、前記固定化物質が、一級アミノ基を含有することが好ましい。
［６］本発明の糖鎖固定方法は、前記固定化物質が、ヒドラジド基又はオキシルアミノ基を含有することが好ましい。
［７］本発明の糖鎖固定化固相は、前記［１］〜［６］のいずれかの糖鎖固定方法を、少なくとも一種類以上組み合わせて得られたことを特徴とする。

本発明によれば、糖鎖を効率よく固定化することができる。
また、本発明によれば、固定化の難しい糖鎖を含めた多種類の糖鎖又は糖鎖修飾物質のアレイを提供することができる。

＜糖鎖固定方法＞
本発明の糖鎖固定方法は、糖鎖又は糖鎖修飾物質を固相に固定する方法であって、前記糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液を、糖鎖と特異的に結合する固定化物質を備えた固相に接触させる工程Ａと、前記固相上の溶液を乾燥させる工程Ｂと、乾燥後の固相を加熱する工程Ｃと、を有する。
以下、各工程について説明する。

［工程Ａ］
工程Ａは、糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液を、糖鎖と特異的に結合する固定化物質を備えた固相に接触させる工程である。

工程Ａにおいて、糖鎖修飾物質としては、糖鎖修飾を受けた生体分子であれば、特に限定されず、糖鎖修飾ペプチド、糖鎖修飾タンパク質、糖鎖修飾核酸、糖鎖修飾脂質等が挙げられる。糖鎖としては、還元末端としてアルデヒド基を有するものであれば特に限定されず、単糖類が２つ以上、グリコシド結合により繋がりあった多糖が挙げられる。糖鎖は、１種類の単糖類から構成されるもの（ホモ糖鎖）であってもよく、２種類以上の単糖類から構成されるもの（ヘテロ糖鎖）であってもよい。糖鎖を構成する単糖類の種類、個数については特に制限はなく、また単糖類間のグリコシド結合はα結合、β結合のいずれであってもよい。糖鎖は天然由来のものであってもよく、天然由来のものに人工的に官能基の付加や置換等の修飾を加えたものであってもよく、化学的に合成されたものであってもよい。
単糖類としては、単糖やその誘導体を用いればよく、特に限定されない。例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸等の単糖及びこれらの誘導体等が挙げられる。

糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液としては、特に限定されないが、後述する固定化物質との反応効率の観点からｐＨ３〜８の溶液が好ましく、ｐＨ４〜６の溶液がより好ましい。

固相としては、固相担体が挙げられ、固相粒子、固相基板が好ましく、固相基板がより好ましい。
固定化物質としては、糖鎖固定化能を有するものであれば特に限定されないが、一級アミノ基が効率的に糖鎖を固定化させることができる点から好ましく、その中でもヒドラジド基又はオキシルアミノ基を含有する物質がより好ましい。

[固相担体］
固相担体として用いることができる物質としては、例えば無機物質としてシリカ、アルミナ、ガラス、金属等が挙げられる。また、有機高分子物質としては、熱可塑性樹脂等が挙げられる。糖鎖を固定した固相担体を蛍光観察に用いる場合は、前記熱可塑性樹脂は、蛍光発生量の少ないものが好ましい。蛍光発生量の少ない樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン樹脂；環状ポリオレフィン樹脂；含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィン樹脂を用いることがより好ましい。本発明において、飽和環状ポリオレフィン樹脂とは、環状オレフィン構造を有する単独重合体又は環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体に水素添加した飽和重合体を指す。

≪固相粒子≫
本願において、固相担体のうち粒子状のものを固相粒子と呼ぶ。固相粒子の形状は球であることが好ましく、平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子がより好ましい。このような範囲の粒径を有する担体の粒子は、遠心分離、フィルタ等による回収が容易であり、かつ、充分な表面積を有しているために糖鎖との反応効率も高いと考えられる。平均粒径が５００μｍ以下の場合、表面積が小さ過ぎず、糖鎖との反応効率が高い。平均粒径０．１μｍ以上の場合、フィルタによる粒子の回収を効率よく行うことができ、粒子をカラムに充填して用いる場合に、通液の際の圧力損失が大きくなるおそれがない。

≪固相基板≫
本願において、固相担体のうちスライドガラス形状、マルチウェルプレート等の形状のものを、固相基板と呼ぶ。固相基板の材質としては、固相担体で説明した物質を使用することができる。

固相粒子、固相基板いずれにおいても、固定化物質として、ヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基に代表される一級アミノ基を有する固定化物質を使用することが挙げられる。ヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基を有するユニットは、特に構造を限定されるものではないが、例えば下記一般式（３）で表されるように、（メタ）アクリル残基とヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基に代表される一級アミノ基がスペーサーＹを介して結合した構造であることが好ましい。ここで、一例として、Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、又は−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖を示す。また、オキシルアミノ基の場合、Ｚは酸素原子を、ヒドラジド基の場合、ＺはＮＨを、セミカルバジド基の場合、ＺはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨを、チオセミカルバジド基の場合、ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨを示す。ｎは本来自然数であるが、各成分の組成割合として標記される場合がある。アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹの構造は、特に制限されるものではないが、下記一般式（４）または（５）であることが好ましい。固相粒子あるいは固相基板に一級アミノ基を導入する方法としては、前記ヒドラジド基またはオキシルアミノ基含有捕捉物質で基板を被覆する方法、前記ヒドラジド基またはオキシルアミノ基を保護基で保護した物質を被覆し、その後保護基を脱保護する方法等が挙げられる。

［式中、Ｒ^３は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは、モノマーユニット数を表し、ｑ及びｒは、それぞれ独立に１〜１０の整数を表す。］
前記ヒドラジド基あるいはオキシルアミノ基に代表される一級アミノ基を固定化物質に導入する場合、合成の容易さから、少なくとも一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーをラジカル重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から保護基を除去する工程、を含む製造方法により得ることができる。あるいは、少なくとも一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマーをラジカル重合する工程、該工程により得られた高分子化合物に一級アミノ基を導入する工程、を含む製造方法により得ることができる。

一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーは、特に構造を限定しないが、下記一般式(６)（式中、Ｒ^４は水素原子またはメチル基、Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサー、Ｚは酸素原子、ＮＨ、ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨまたはＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨを、Ｗは保護基を示す。）で表されるように、（メタ）アクリル基と、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、セミカルバジド基またはチオセミカルバジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。

保護基Ｗとしてはアミノ基を保護基できるものであれば何ら制限を受けるものではなく、任意に用いることができる。中でもｔ―ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）やベンジロキシカルボニル基（Ｚ基、Ｃｂｚ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等が好適に用いられる。

具体的なモノマーの例としては、下記式（７）で表されるようなものである。

脱保護化は、トリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができる。

また、ヒドラジド基またはオキシルアミノ基に代表される一級アミノ基含有固定化物質には、基板に良好に吸着するという観点から、疎水性基を有することが好ましい。
疎水性基を有するユニットとしては、例えば下記一般式（８）の構成単位で表されるような構造であり、この疎水性基を構成するモノマーとしては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、sec−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらの中で、基板への密着性を高める場合の構造としては、下記式（９）で表されるシクロヘキシル（メタ）アクリレートが挙げられる。

［一般式（８）中、Ｒ^２は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ^５は炭素数１〜２０のアルキル基を表し、ｍはモノマーユニット数を示す。］

［一般式（９）中、ｏはモノマーユニット数を示す。］

また、ヒドラジド基またはオキシルアミノ基に代表される一級アミノ基含有固定化物質においては、生体分子の非特異的吸着を抑制する観点から、親水性基を有することが好ましい。
親水性基を有するユニットは、特に構造を限定されるものではないが、例えば下記一般式（１０）の構成単位で表されるような構造が好ましい。親水性基を構成するモノマーとして例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等が挙げられ、下記式（１１）で表される２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンで構成されるものが挙げられる。

［一般式（１０）中、Ｒ^１は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｘは、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアルコキシ基、又は炭素数１〜２０のアルコキシアルキル基を表し、ｌはモノマーユニット数を示し、ｓは１〜１０の整数を表す。］

［一般式（１１）中、ｐはモノマーユニット数を示す。］
親水性基を有するユニットは、（メタ）アクリル残基とポリエチレングリコールが結合した構造であってもよい。これを構成するモノマーとしては、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。
以上を考慮した上で、もっとも好ましい構成としては、下記式（７−１−２）で表されるポリマーである。

［式中、ｍ、ｏ、ｐはモノマーユニット数を示す。］
工程Ａにおいて、固相担体として固相粒子を用いる場合には、例えばマイクロチューブ内で糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液と、糖鎖と特異的に結合する固定化物質を備えた固相粒子を接触させる工程が挙げられる。固相担体として固相基板を用いる場合には、例えば糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液を、糖鎖と特異的に結合する固定化物質を備えた固相基板上に整列的に点着する工程が挙げられる。

［工程Ｂ］
工程Ｂは、固相上の前記糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液を乾燥させる工程である。上記工程Ａにおいて、糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液を、固定化物質を備えた固相に接触させることで、糖鎖又は糖鎖修飾物質固定化固相を得ることができる。そして、この固相に残留している液を工程Ｂにて乾燥させる。
乾燥条件としては、特に限定されず、２０〜９０℃の温度で、１〜１６時間インキュベートしてもよく、室温で風乾させてもよい。
なお、この乾燥工程は前工程Ａ、または次工程Ｃと同時に行っても良い。

［工程Ｃ］
工程Ｃは、乾燥後の固相を加熱する工程である。工程Ａにおいて、固相として固相粒子を用いる場合、糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液中に投入後、取り出す処理を行う。固相として固相基板を用いる場合、接触させる糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液の液量は、好ましくは１００μＬ以下、より好ましくは１０μＬ以下、更に好ましくは１μＬ以下であり、工程Ｂの乾燥工程において、該溶液は、容易に乾燥する。
乾燥後の固相を加熱したところで、糖鎖と固定化物質の結合反応に影響を与えないと思われるところ、驚いたことに本発明者は、乾燥後の固相を加熱することにより、糖鎖固定化能が向上することを見出した。

加熱温度の下限値としては、６０℃が好ましく、６５℃がより好ましく、７０℃が更に好ましい。上限値としては、固相の軟化点未満であれば特に限定されず、１００℃が好ましく、９５℃がより好ましく、９０℃が特に好ましい。

加熱時間の下限値としては、１時間が好ましく、３時間がより好ましく、６時間が更に好ましく、１２時間が特に好ましく、２４時間が最も好ましい。加熱時間の上限値としては、特に限定されないが、操作効率の観点から、４８時間が好ましく、３６時間がより好ましい。

本発明の糖鎖固定方法は、糖鎖固定化能が向上した固定方法であるため、生体試料中の微量の糖鎖を固定化するのに適している。更に、固定化物質との結合能の観点から、固定化が難しかった糖鎖をアレイ化するのにも適している。

＜糖鎖固定化固相＞
本発明の糖鎖固定化固相は、上述した糖鎖固定方法を、少なくとも一種類以上組み合わせて得られた固相である。本発明の糖鎖固定化固相は、糖鎖固定化能が向上した固定方法を用いて製造されたものであるため、固定化の難しい糖鎖を含めた多種類の糖鎖又は糖鎖修飾物質のアレイを提供することができる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［アミノオキシ基を有する重合体で被覆された基板の作製］
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２−ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度：１２３℃）を用い、射出成形により、スライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作製した。得られた固相基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、シクロヘキシルメタクリレート（ＣＨＭＡ）、Ｎ−［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミン）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリアミド（ＯＡ）の共重合体（共重合体において、各モノマーに由来する繰り返し構成単位のモル比は２６：６６：８である）の１．０重量％エタノール混合溶液に浸漬した後、室温で０．５時間乾燥することにより、表面がアミノオキシ基を有する重合体で被覆された基板（以下において、アミノオキシ基被覆基板とも記す。）を得た。

［ビオチン化ＳＮＡ溶液の作製］
α２，６シアル酸を特異的に認識するタンパク質であるＳＮＡ（レクチンの一種）をビオチン化標識したビオチン化ＳＮＡ（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製、「Ｂ−１０８５」）をトリス緩衝液（ｐＨ７．５、０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含む）に濃度が１００μｇ／ｍＬになるように溶解して、ビオチン化ＳＮＡ溶液を得た。

前記アミノオキシ基被覆基板を２Ｎの塩酸に浸漬し、３７℃で１６時間処理することにより、アミノオキシ基を保護しているＢｏｃ基（ｔ−ブトキシカルボニル基）の除去を行った。

［６’−シアリルラクトースの固定化能の検討］
６’−シアリルラクトース（以下、６ＳＬともいう。）を酢酸ナトリウム緩衝液で溶解し、１ｍＭの６ＳＬ溶液を作製した。自動スポッターを用いて、上記で得られたアミノオキシ基被覆基板上に、１ｍＭの６ＳＬ溶液を３箇所スポットした。その後、基板を、８０℃で、１、３、６、９、１２、２４時間加熱することでスポットの乾燥および加熱を行った。上記で得られたビオチン化ＳＮＡ溶液を、糖鎖を固定した基板の表面を浸すようにして基板と接触させ、室温で２時間静置することにより、糖鎖（６ＳＬ）とビオチン化ＳＮＡとを反応させた。反応後、室温において、基板をトリス緩衝液（ｐＨ７．５、０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。
次いで、Ｃｙ３−ストレプトアビジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）をトリス緩衝液（ｐＨ７．５、０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含む）で２μｇ／ｍＬになるように希釈した。この希釈溶液を２５℃にて１時間、糖鎖を認識する分子と反応させた基板と接触させることによりビオチン化ＳＮＡとＣｙ３−ストレプトアビジンを結合させて蛍光標識反応を実施した。反応後、室温において、基板をトリス緩衝液（ｐＨ７．５、０．０５ｗｔ％のＴｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。その後、遠心分離機を用いて基板を遠心乾燥させた。
スポットの加熱時間を振った、蛍光標識反応後の基板について、蛍光量の測定を行い、スポットシグナル強度値を評価した。蛍光量の測定には、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製のバイオチップスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度５０％、励起波長６３３ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度１０μｍであった。結果を表１に示した。

表１の結果から分かるように、スポット乾燥後、基板を８０℃で加熱することにより、加熱時間依存的にシグナル強度の増加が観察された。特に２４時間反応させた基板では、１時間反応させた基板と比較して７倍の強度のシグナルが得られた。

本発明の糖鎖固定方法によれば、所望の糖鎖を効率よく固相に固定できることが明らかである。

Claims (7)

1. 糖鎖又は糖鎖修飾物質を固相に固定する方法であって、
   前記糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液を、糖鎖と特異的に結合する固定化物質を備えた固相に接触させる工程Ａと、
   前記固相上の溶液を乾燥させる工程Ｂと、
   乾燥後の固相を加熱する工程Ｃと、
   を有することを特徴とする糖鎖固定方法。
2. 前記工程Ｃにおいて、加熱温度は６０℃以上である請求項１に記載の糖鎖固定方法。
3. 前記工程Ｃにおいて、加熱時間は１時間以上である請求項１又は２に記載の糖鎖固定方法。
4. 前記固相は、固相基板である請求項１〜３のいずれか一項に記載の糖鎖固定方法。
5. 前記固定化物質は、一級アミノ基を含有する請求項１〜４のいずれか一項に記載の糖鎖固定方法。
6. 前記固定化物質は、ヒドラジド基又はオキシルアミノ基を含有する請求項１〜５のいずれか一項に記載の糖鎖固定方法。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の糖鎖固定方法を、少なくとも一種類以上組み合わせて得られたことを特徴とする糖鎖固定化固相。