JP2016067348A - 間質性肺炎モデル動物及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
以下の発明は、上記の成果及び考察に基づく。
[1]以下のステップ(1)及び(2)を含む、慢性且つ進行性の病態を示す間質性肺炎モデル動物の作製方法:
(1)MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAをホモ型で保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に対して、関節炎を誘導する処置を施すステップ、
(2)ステップ(1)後のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の肺腔内に、微小バブルと混合したブレオマイシンを投与した後、外部から超音波を照射して前記微小バブルを破砕するステップ。
[2]関節炎を誘導する前記処置が、1回あたりのII型コラーゲンの投与量を0.01mg〜0.05mgとして2回以上II型コラーゲンを投与することである、[1]に記載の作製方法。
[3]II型コラーゲンの投与回数が3〜5回である、[1]又は[2]に記載の作製方法。
[4]以下のステップ(A)を含む、慢性且つ進行性の病態を示す間質性肺炎モデル動物の作製方法:
(A) MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAをホモ型で保有し、且つB7.1遺伝子、及びB7.1遺伝子の変異体(但し、T細胞の活性化に関してB7.1遺伝子と同等の機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置されてなる外来性DNAをホモ型で保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の肺腔内に、微小バブルと混合したブレオマイシンを投与した後、外部から超音波を照射して前記微小バブルを破砕するステップ。
[5]前記微小バブルがマイクロバブルである、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の作製方法。
[6]ブレオマイシンの投与量が0.01mg〜0.2mgである、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の作製方法。
[7]前記微小バブルの量が、投与物の40%(v/v)〜90%(v/v)である、[1]〜[6]のいずれか一項に記載の作製方法。
[8]前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の作製方法。
[9]前記非ヒト哺乳動物の種(属)が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマからなる群より選択されるいずれかである、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の作製方法。
[10]前記非ヒト哺乳動物の種(属)がマウスである、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の作製方法。
[11]前記マウスの遺伝的な背景が99%以上DBAである、[10]に記載の作製方法。
[12]以下の(a)及び(b)のステップを含む、間質性肺炎用薬剤のスクリーニング方法:
(a)[1]〜[11]のいずれか一項に記載の方法で作製した間質性肺炎モデル動物に被験物質を投与するステップ;
(b)被験物質の治療効果又は予防効果を判定するステップ。
[13]ステップ(a)が、前記ステップ(2)から3週後以降に行われる、[12]に記載のスクリーニング方法
[14]ステップ(a)が、前記ステップ(2)から3週後〜20週後の間に行われる、[12]に記載のスクリーニング方法
[15]間質性肺炎の発症頻度、間質性肺炎の発症時期、間質性肺炎の進行又は重篤化、間質性肺炎の改善、血清肺サーファクタントプロテインD(SP-D)値、及び肺又は血清中のハイドロキシプロリン量からなる群より選択される一以上の指標に基づき、ステップ(b)の判定を行う、[11]〜[14]のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
[16]対照群との比較に基づきステップ(b)の判定を行う、[11]〜[15]のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
本発明の第1の局面は、慢性且つ進行性の病態を示す間質性肺炎モデル動物の作製方法に関する。本発明の作製方法では以下の二つのステップ(1)及び(2)が行われる。
(1)MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAをホモ型で保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に対して、関節炎を誘導する処置を施すステップ
(2)ステップ(1)後のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の肺腔内に、微小バブルと混合したブレオマイシンを投与した後、外部から超音波を照射して前記微小バブルを破砕するステップ
(A)MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAをホモ型で保有するとともに、B7.1遺伝子、及びB7.1遺伝子の変異体(但し、T細胞の活性化に関してB7.1遺伝子と同等の機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAをホモ型で保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の肺腔内に、微小バブルと混合したブレオマイシンを投与した後、外部から超音波を照射して前記微小バブルを破砕するステップ
本発明のスクリーニング方法は、本発明の作製方法で得られる間質性肺炎モデル動物に被験物質を投与するステップ(ステップ(a))と、被験物質の治療又は予防効果を判定するステップ(ステップ(b))とを含む。尚、本明細書において「間質性肺炎用薬剤」とは、間質性肺炎を発症している患者に対してその症状の改善などを目的として使用される薬剤はもとより、間質性肺炎を発症するおそれのある者に対して予防的に(再発防止の目的も含む)使用される薬剤も含む用語として用いられる。このように、本発明のスクリーニング方法を利用して得られる薬剤は、間質性肺炎の予防又は治療を目的として使用することができる。
(i)被験物質の投与によって、間質性肺炎の発症頻度が低下した場合、被験物質に予防効果があると判定する。
(ii)被験物質の投与によって、間質性肺炎の発症時期が遅延した場合、被験物質に予防効果があると判定する。
(iii)被験物質の投与によって、間質性肺炎の進行が又は重篤化が抑制された場合、被験物質に治療効果があると判定する。
(iv)被験物質の投与によって、間質性肺炎が改善した場合、被験物質に治療効果があると判定する。
(v)被験物質の投与によって、血清SP-D値の上昇抑制又は低下を認めた場合、被験物質に予防効果又は治療効果があると判定する。
(vi)被験物質の投与によって、ハイドロキシプロリン量の増加抑制又は低下を認めた場合、被験物質に予防効果又は治療効果があると判定する。
以下に示すように、CIITA遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスをManipulating the mouse embryo, a laboratory manual, second edition, Brigid Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに従って作製した。
以下の手順で、II型コラーゲンプロモーターの制御下にMHCクラスII転写活性化遺伝子(CIITA遺伝子)が配置されたベクター pCol2fluCIITANeof(図1)を構築した。本ベクターは以下の特徴を有する。1)約1kbpのラットII型コラーゲンプロモーター部の下流にヒトグロビンスプライシング配列がある。2)この直下にヒトCIITAポリAサイトを含むヒトCIITA cDNAが挿入され、この後方にラットII型コラーゲンエンハンサーが配置されている。3)さらにこの下流にPGKプロモーター直下にほ乳類細胞非耐性の薬剤マーカーNeo遺伝子 およびポリAシグナルを配置したカセットが配置されている。4)バックボーンのベクターは、大腸菌を用いた通常のクローニングに用いられる組換え用のDNAを使用出来る。本ベクターでは、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を有するpBR322を用いた。5)予め大腸菌由来のバックボーンのベクター部分を除けるようPvuI制限酵素サイトを有する。最終的には、以上の手順で構築したベクターをPvuI制限酵素処理し、大腸菌由来のバックボーンのベクター部分を除き直鎖状としたものを、DNA結合性を示すビーズ等を用いて精製し、これをインジェクション用のトランスジーンとした。尚、得られたトランスジーンをマウス軟骨培養細胞株であるMG615細胞に遺伝子導入し、細胞表面上にMHCクラスIIタンパク質が発現する事を確認している。DNAは、10mM Tris/0.2mM EDTA 緩衝液にて30〜100μg/mlに調整し保存しておく。
(2−1)マウスの準備
キメラマウスを作製するために用いられるマウスの系統は、FVB/NJとDBA/1の掛け合わせにより得られるF1世代とした。常法に従い受精卵を調製してインジェクションに用いた。
常法に従いHCGを打ち、交配後のメスマウス卵巣より受精卵を得る。受精卵内pronucleiおよびgranuleを確認後、マイクロインジェクションに用いる。
マイクロインジェクションは、一回当たり200個程の受精卵を用いる。マイクロマニピュレーターを用いDNAを注入する。注入用のDNAは、最終的に3μg/mlに調整後、0.22μmのフィルター濾過し、これを用いる。
予め偽妊診した仮親用のメスマウスを準備する。DNAを注入した胚は、直接仮親の卵管に移植するか、または一日培養後、胚の分裂を確認しこれを移植する。移植は、一匹当たり25〜35個の胚を移植する。
得られたトランスジェニックマウスは、サザンブロッティング法により同定した。離乳後、マウスの尾を用いDNA抽出を行い、これを解析した。サザンブロッティングに用いるプローブは、CIITAのC末端のコーディング領域(ヒトCIITA DNA配列(配列番号1)中2978〜3329番目)を用いた。またこの際遺伝子のコピー数を約10程度のものをDBAマウスとのバッククロスに用いた。マウスに導入された遺伝子は、サザンブロッティング法およびPCR法により同定した。
得られたトランスジェニックマウスをDBA/1マウスとバッククロスさせた。バッククロスは、遺伝的な背景が99%以上DBAとなるように7世代以上に渡り繰り返す事で系統を遺伝的なバックグランドを純化した。このようにして、ヘテロ型トランスジェニックマウス(ヘテロ型D1CCマウス)を得た。
以上の考察を踏まえ、安定的にD1CCマウスを維持する目的でホモ型D1CCマウスを樹立することにした。ヘテロ型D1CCマウスのオスとメスを交配し、25%の確立でホモ型D1CCマウスを得た。ホモ型であることの確認にはリアルタイムPCR法を利用した。同一量のゲノムDNAを用いてリアルタイムPCRを行うと、ヘテロ型に対してホモ型では1サイクル分ずれた状態でPCR反応が先に進む。
(1)方法
ホモ型D1CCマウス(オス、メス 各群10匹)を用い、間質性肺炎の誘導実験を行った。まず、初回免疫として0.01mgのII型コラーゲンを数カ所に分けて皮下注射した。尚、ウシ関節軟骨から精製したII型コラーゲン(純度99%、コラーゲン技術研修会製)を0.01M酢酸に溶解し、等量の完全アジュバント(DIFCO社製)と混合したものを使用した。初回免疫から2週間後、2次免疫として再度0.01mgのII型コラーゲンを数カ所に分け皮下注射した。2次免疫には、不完全アジュバントと混合したII型コラーゲンを使用した。以降、2週おきに2次免疫と同一の条件で5次免疫まで行った。このようにして関節炎を誘導した後、ブレオマイシンとマイクロバブルの混合物を肺腔内にスプレータイプのゾンデにより直接投与した(試験群)。ブレオマイシンとマイクロバブルの混合物は以下の手順で用意した。まず、ブレオ(登録商標)注射用15mg(日本化薬株式会社)を11.7mlのPBSに溶解し、ブレオマイシン溶液を調製した。当該溶液はブレオマイシン塩酸塩を1.28mg/mlの濃度で含有する(便宜上、この濃度を「ブレオマイシン濃度100%」とした)。マイクロバブルは超音波用マクロバブルSV-25(ネッパジーン株式会社)を使用した。このマイクロバブルは、主成分がヘキサフッ化硫黄であり、それ以外にマクロゴール4000、ステアリン酸ホスファチジルコリン、パルミチン酸ホスファチジルコリンナトリウム等を含有している。バブルの平均粒子径は2.5μmであり、90%以上のバブル粒子径が6μm以下である。添付の説明書に従いマイクロバブル溶液を調製した。ブレオマイシン溶液とマイクロバブル溶液及びPBSを以下の比率で混合し、所定の濃度の混合物を作製した。尚、ブレオマイシン濃度50%の場合、ブレオマイシン塩酸塩の投与量は0.032mg/50μlとなり、同様に40%では投与量0.0256mg/50μl、30%では投与量0.0192mg/50μlとなる。
試験群の間質性肺炎発症率及び死亡個体率を図2に示す。いずれの濃度においても、肺炎発症率(処置2週後)が高い。一方、処置9週後には慢性化が認められ、極めて早期に慢性化することがわかる。また、処置13週後でも、高い間質性肺炎発症率を維持しており、症状が持続することがわかる。
以下に示すように、B7.1遺伝子を導入したトランスジェニックマウスをManipulating the mouse embryo, a laboratory manual, second edition, Brigid Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに従って作製した。
以下の手順で、II型コラーゲンプロモーターの制御下にマウスB7.1遺伝子(配列番号6)が配置されたベクターpCol2B7.1(図6)を構築した。本ベクターは以下の特徴を有する。1)約1kbpのラットII型コラーゲンプロモーター部の下流にヒトグロビンスプライシング配列がある。2)この直下にポリAサイトを含むマウスB7.1遺伝子(cDNA)が挿入され、この後方にラットII型コラーゲンエンハンサーが配置されている。3)バックボーンのベクターは、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を有するpBR322を用いた。最終的には、以上の手順で構築したベクターをPvuI制限酵素処理し、大腸菌由来のバックボーンのベクター部分を除き線状化したものを、DNA結合性を示すビーズ等を用いて精製し、これをインジェクション用のトランスジーンとした。尚、得られたトランスジーンをマウス軟骨培養細胞株であるMC615細胞に遺伝子導入し、その発現をFACSで確認した。DNAは、10mM Tris/0.2mM EDTA緩衝液にて30〜100μg/mlに調節し保存しておく。
直鎖状化したトランスジーンを、FVB/NJとDBA/1マウス(Charles River Laboratories, Davis, CA)からのF1胚盤胞に注入した。その結果生まれた遺伝子導入マウスをD1CBマウスと名付けた。D1CBマウスではサザンブロット法によって約10コピーのB7.1遺伝子が検出された。系統維持とDBA/1遺伝的背景の純化のためD1CBマウスをDBA/1マウスと15回以上戻し交配した。このようにして、ヘテロ型トランスジェニックマウス(ヘテロ型D1CBマウス)を得た。
ヘテロ型D1CBマウスのオスとメスを交配し、25%の確立でホモ型D1CBマウスを得た。ホモ型であることの確認にはリアルタイムPCR法を利用した。同一量のゲノムDNAを用いてリアルタイムPCRを行うと、ヘテロ型に対してホモ型では1サイクル分ずれた状態でPCR反応が先に進む。
ホモ型D1CCマウスとホモ型D1BCマウスを交配し、ダブルホモ型マウスを作製した。ダブルホモ型マウスでは、外来遺伝子であるCIITA遺伝子とB.7遺伝子の両方がホモ型になっている。ダブルホモ型マウスは、関節炎非誘導時において、長期間(これまで確認できているところでは最長3週間)カットオフ値(53.9ng/ml)を超える事はないが、SP-D値が高い個体が15%程度の確率で観察される。このことから、ダブルホモ型マウスは、より間質性肺炎高感受性と考えられる。
(1)方法
ダブルホモ型マウスを用い、間質性肺炎の誘導実験を行った。対照としてホモ型D1CCマウスを用いた。まず、ブレオマイシンとマイクロバブルの混合物を肺腔内にスプレータイプのゾンデにより直接投与した。ブレオマイシンとマイクロバブルの混合物の調製方法や投与条件等は、上記実験(3.(1))と同様とした。但し、ブレオマイシン濃度は40%(ブレオマイシン塩酸塩の投与量は0.0256mg/50μl)とした。
血清SP-D値の測定結果を図7に示す。図7のグラフには、処置後8週目からのSP-D値を示した。ダブルホモ型マウスでは、この時点(8週目)から1か月間程度、間質性肺炎様の病態が維持される。一方、ホモ型D1CCマウスでは血清SP-D値が急激に低下してカットオフ値以下となる。ダブルホモ型マウスを用いると、従来法で間質性肺炎を誘導した場合も病態が維持されるが、その期間はマイクロバルブ法で間質性肺炎を誘導した場合よりも短くなる。
(i)ダブルホモ型マウスを用い、マイクロバブル法で任意の時期に間質性肺炎を誘導する(病態が維持される時期を事前に確認しておく)。
(ii)誘導後、一定期間(例えば1ヶ月程度)試験薬剤を投与し、コントロール(未投与)との比較から、その効果を判定する。
Claims (16)
- 以下のステップ(1)及び(2)を含む、慢性且つ進行性の病態を示す間質性肺炎モデル動物の作製方法:
(1)MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAをホモ型で保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に対して、関節炎を誘導する処置を施すステップ、
(2)ステップ(1)後のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の肺腔内に、微小バブルと混合したブレオマイシンを投与した後、外部から超音波を照射して前記微小バブルを破砕するステップ。 - 関節炎を誘導する前記処置が、1回あたりのII型コラーゲンの投与量を0.01mg〜0.05mgとして2回以上II型コラーゲンを投与することである、請求項1に記載の作製方法。
- II型コラーゲンの投与回数が3〜5回である、請求項1又は2に記載の作製方法。
- 以下のステップ(A)を含む、慢性且つ進行性の病態を示す間質性肺炎モデル動物の作製方法:
(A) MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAをホモ型で保有し、且つB7.1遺伝子、及びB7.1遺伝子の変異体(但し、T細胞の活性化に関してB7.1遺伝子と同等の機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置されてなる外来性DNAをホモ型で保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の肺腔内に、微小バブルと混合したブレオマイシンを投与した後、外部から超音波を照射して前記微小バブルを破砕するステップ。 - 前記微小バブルがマイクロバブルである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の作製方法。
- ブレオマイシンの投与量が0.01mg〜0.2mgである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記微小バブルの量が、投与物の40%(v/v)〜90%(v/v)である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記非ヒト哺乳動物の種(属)が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマからなる群より選択されるいずれかである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記非ヒト哺乳動物の種(属)がマウスである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記マウスの遺伝的な背景が99%以上DBAである、請求項10に記載の作製方法。
- 以下の(a)及び(b)のステップを含む、間質性肺炎用薬剤のスクリーニング方法:
(a)請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法で作製した間質性肺炎モデル動物に被験物質を投与するステップ;
(b)被験物質の治療効果又は予防効果を判定するステップ。 - ステップ(a)が、前記ステップ(2)から3週後以降に行われる、請求項12に記載のスクリーニング方法
- ステップ(a)が、前記ステップ(2)から3週後〜20週後の間に行われる、請求項12に記載のスクリーニング方法
- 間質性肺炎の発症頻度、間質性肺炎の発症時期、間質性肺炎の進行又は重篤化、間質性肺炎の改善、血清肺サーファクタントプロテインD(SP-D)値、及び肺又は血清中のハイドロキシプロリン量からなる群より選択される一以上の指標に基づき、ステップ(b)の判定を行う、請求項11〜14のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 対照群との比較に基づきステップ(b)の判定を行う、請求項11〜15のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
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