JP2016037460A - 天然物由来成分を基材とするナノ粒子の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ガレート型カテキンおよび動物性タンパク質という機能性素材を用いた天然物由来のナノ粒子を作製する製造方法を提供すること。【解決手段】ガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物を、水または含水溶媒または有機溶媒に溶解または分散させて、ガレート型カテキン含有溶液または分散液を作製し、ゼラチン、コラーゲン、およびこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質を、水または含水溶媒または有機溶媒に溶解または膨潤させて、動物性タンパク質含有溶液または膨潤液を作製し、前記ガレート型カテキン含有溶液又は分散液と、前記動物性タンパク質含有液または膨潤液とをガレート型カテキンの固形分（ａ）、動物性タンパク質の固形分（ｂ）の重量が０．０７≦（ｂ）／（ａ）≦７．０となるように混合し、ｐＨ１．０〜４．０に調整した混合液中において平均粒子径が１０〜１００ｎｍである、ナノ粒子を形成させる。【選択図】なし

Description

本発明は、ガレート型カテキンとゼラチン、コラーゲンおよびこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質からなるナノ粒子の製造方法であり、更に詳しくは、これらを混合する重量比の最適化およびｐＨを選択することにより簡便な混合作業で平均粒子径が１００ｎｍ以下のナノ粒子を製造する方法に関する。

近年、物質のナノ粒子化の技術が様々な分野で研究され、幅広い利用が期待されている。特に、医薬品、化粧品分野において活発に検討がなされ、多くの報告が出されている。

これまで、特に進んで研究されてきたのは医薬品分野であり、ナノ粒子化により、医薬品成分を目的の臓器や組織に提供するためのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に注目が集まっている。例えば、ガン組織において、血管新生が盛んであることから血管に間隙ができ、その間隙のサイズを利用したＤＤＳなどにナノ粒子の利用が考えられてきた。これにより、医薬品成分を安定に効率的に運搬するだけでなく、副作用の軽減も可能となりうる。医薬品分野のＤＤＳには例えば、リポソーム、ポリエチレングリコールなどの基材が検討されている（非特許文献１）。この抗ガン剤としての利用に適したナノ粒子のサイズは１００〜２００ｎｍとされ、このサイズでの開発が活発であった。しかし、これらを基材としたナノ粒子作成は合成品などの成分や溶媒が多く利用されてきたことから、その用途が医薬品に限定され、食品等にはほとんど利用されていない。

また、食品分野でのナノ化技術に関する報告もある。食品分野のナノ粒子化では、食感や味の向上、フレーバーなどのリリース、溶解性や透明性、吸収性や反応性の向上などを目指して開発がなされている。しかし、実際のところ、食品分野でのナノ化技術はナノサイズに近いマイクロサイズまで含むことが多く、１００μｍまで含まれることもあった。ところが、実際に体内への吸収が良くなるサイズは、１００ｎｍ以下という報告がある（非特許文献２）。

これまでに、食品や食品添加物の分野では、例えばキトサンを用いたナノ粒子の製造方法（特許文献１、２、３）が報告されており、また、シリカ、ナノクレイ、リポソーム、白金ナノ粒子なども報告されている（非特許文献３）。特許文献１の場合、キトサンを酸で溶解後に冷却する方法によってナノ粒子が得られているが、その粒子径は８００ｎｍ〜３１００ｎｍと平均粒子径が大きい。また特許文献２の場合、１００ｎｍ以下の粒子が形成されているが、マイクロ流路を通過させるため、その製造には専門の装置が必要になる。特許文献３はキトサンとタンニンを混合することでナノ粒子が得られているが、その粒子径は１００ｎｍ以下とはなっていない。さらに、これらはナノ粒子として食品に用いられてきたが、キャリアとしての性質が強く、そのもの自体の機能性についてはほとんど注目されていなかった。

また、ポリフェノールのカプセル化技術に関する報告もある（非特許文献４）。しかし、この報告についてもほとんどがマイクロスケールであり、ナノ粒子とは異なる性質であると考えられる。

以上のことから、作製されたナノ粒子自体が有効な機能性を有し、且つナノ粒子の材料が天然物由来で安全性が高く、食品にも利用可能であり、１００ｎｍ以下のサイズであるナノ粒子はほとんど報告されていない。

ところで、主にお茶などの天然物に含まれるガレート型カテキンには、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）、カテキンガレート（Ｃｇ）の４種類が存在し、抗酸化作用、抗肥満作用、抗ガン作用、抗菌作用、抗炎症作用などの優れた機能を有している。

中でもＥＧＣｇはその含有量の多さから注目を集め、多くの報告がなされているが、一方、特にＥＣｇにはこれまでに様々な有用性が報告されている。例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌において、βラクタム系抗生物質との相乗効果で細胞壁を変化させる効果が他のガレート型カテキンよりも優れた効果を有することが報告されている（非特許文献５）。また、これまでに、本発明者らはＥＣｇがＬＯＸ−１（レクチン様酸化低密度リポ蛋白質受容体）アンタゴニストとして特に有用であることを見出し、報告している（特許文献４）。また、ＥＧＣｇとＥＣｇでは、ＥＣｇのほうが脂質二重膜と相互作用しやすいという報告がある（非特許文献６）。また、ヒト試験において、ＥＣｇのほうが血中に取り込まれやすいことも報告がある（非特許文献７）。
以上のことから、ガレート型カテキンであるＥＣｇが非常に有用な化合物であることが明らかである。

しかし、ガレート型カテキン類であるＥＧＣｇ、ＥＣｇ、ＣｇおよびＧＣｇは、これらの間での苦味や渋味に大差はないものの、ＥＧＣやＥＣなどの非ガレート型カテキン類よりも苦味や渋味が強いことが示されており、中でもＥＧＣｇ、ＥＣｇの苦味・渋味閾値濃度は３倍程度低いとされている（非特許文献８）。
したがって、緑茶飲料やカテキン含有食品を調整するに際し、苦味や渋味の制御は、当業者において大きな課題となっている。

そこで、本発明者らは、これまでに、ガレート型カテキンの苦味、渋味の改善に関する研究の結果、分子量４０００以上の水溶性コラーゲンと水溶性大豆食物繊維によって、ガレート型カテキンの苦渋味や不快味が低減されることを見出し、報告している（特許文献５）。ただし、特許文献２の条件では得られる粒子の粒子径は記載がないが、本発明者らが測定したところ約１３０ｎｍ以上である。

加えて、本発明者らは、これまでに、ガレート型カテキンとコラーゲンの組み合わせにより、リパーゼ阻害作用（特許文献６）、およびカフェインをさらに加えた組成物で高い抗肥満作用（特許文献７）などの効果が得られることを報告している。
これらの報告から、ガレート型カテキンとコラーゲンやゼラチンを組み合わせることは非常に有用であると考えられる。

これまでに、ＥＧＣｇを含むカテキンとゼラチンの混合物について、ナノ粒子を作製した報告もあるが（非特許文献９）最終濃度がカテキン、ゼラチンともに０．１％までという非常に限定的なものであり、平均粒子径が１００ｎｍ以下となる条件では最終濃度がカテキン０．０５％、ゼラチン０．０１２５％と薄すぎるために、測定結果も信用できないとの記述がある。また、カテキン由来、ゼラチン由来の成分をともに０．１％含む条件では、平均粒子径が１５２ｎｍ以上となっている。機能性成分であるガレート型カテキンとゼラチンを効率的に摂取するためには、より高い濃度でのナノ粒子作製が求められるが、非特許文献９では達成できていない。

また、ＥＧＣｇとゼラチンをレイヤーバイレイヤーでナノ粒子化する方法も報告されている（非特許文献１０）が、製造工程が煩雑であり、使用するＭｎＣＯ₃およびＥＤＴＡは食品に使用できず、摂取に関して安全とは言いがたい。また、ゼラチンにポリアニオンとポリカチオンを用いてレイヤーバイレイヤーでコーティングし、ＥＧＣｇを吸着させて作製するナノ粒子に関する報告がある（非特許文献１１）が、やはり製造工程が煩雑である。

以上のことから、機能性成分であるガレート型カテキンとタンパク質の組み合わせは有用であり、これらのナノ粒子を作製した例はあるものの、それぞれ限定的な条件下であることや、使用する材料の安全性やナノ粒子作製の効率が十分でないことから、より簡便な方法で、実用性に富み、食品にも利用可能な平均粒子径１００ｎｍ以下のナノ粒子を作製することが望まれていた。

特許第０５５６４２００号公報 特開２００９−０９０１６０号公報 米国特許第８，６４２，０８８号明細書 特開２０１２−１１１７４７号公報 特開２０１３−００００７３号公報 特開２０１３−０８２６７３号公報 特願２０１３−０１７７６２号公報

Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ２６−１，２０１１ 農林水産省委託研究プロジェクト「食品ナノテクノロジープロジェクト［食品素材のナノスケール加工及び評価技術の開発］」（平成２２年８月２０日作成）６１−６３頁 厚生労働省「ナノマテリアルの安全対策に関する検討会報告書」（平成２１年３月３１日）５−６頁 Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１１，３，７９３−８２９ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００７，１５３，２０９３−２１０３ 化学と生物 ２０１１，４９（４），ｐ２４３−２４９ Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ２００１，ｖｏｌ．３１，ｎｏ．１２，８９１−９０１ 「食品の変色の化学」、ｐ１２４−ｐ１２５（光琳） Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，２０１０，５８，６７２８−６７３４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，３３０，２７６−２８３ ＡＣＳＮＡＮＯ，２００９，ｖｏｌ．３，ｎｏ．７，１８７７−１８８５

したがって、本発明は、ガレート型カテキンおよび動物性タンパク質という機能性素材を用いた天然物由来のナノ粒子を作製する製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、食品にも利用可能なナノ粒子について鋭意検討した結果、ガレート型カテキンと動物性タンパク質を適切な条件下で混合するという非常に簡便な方法で、ガレート型カテキンと動物性タンパク質とのコアセルベートを形成し、天然物由来の原料からなる平均粒子径１００ｎｍ以下のナノ粒子を作製することに成功した。また、本発明者らは、ゼラチン、コラーゲンの分子量とナノ粒子の粒子径が逆相間するという驚くべき現象を発見し、本発明を完成するに至った。

本発明の要旨は、
〔１〕平均粒子径が１０〜１００ｎｍである、天然物由来成分を基材とするナノ粒子の製造方法であって、
ガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物を、水または含水溶媒または有機溶媒に溶解および／または分散させて、ガレート型カテキン含有溶液または分散液を作製する工程、
ゼラチン、コラーゲン、およびこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質を、水または含水溶媒または有機溶媒に溶解および／または膨潤させて、動物性タンパク質含有溶液または膨潤液を作製する工程、ならびに
前記ガレート型カテキン含有溶液又は分散液と、前記動物性タンパク質含有液または膨潤液とを
（ａ）ガレート型カテキンの固形分
（ｂ）動物性タンパク質の固形分
の重量が、０．０７≦（ｂ）／（ａ）≦８．０となるように混合し、ｐＨ１．０〜４．０に調整した混合液中でナノ粒子を形成させてナノ粒子含有液を作製する工程
を有することを特徴とする、ガレート型カテキンと動物性タンパク質からなるナノ粒子の製造方法、
〔２〕前記混合液が、ガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物由来の固形分を０．１重量％以上、且つ、ゼラチン、コラーゲン、およびこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質由来の固形分を０．１重量％以上含有する前記〔１〕記載のナノ粒子の製造方法、
〔３〕前記動物性タンパク質の平均分子量が３９０００以上である前記〔１〕または〔２〕記載のナノ粒子の製造方法、
〔４〕前記動物性タンパク質が豚骨由来タンパク質および牛骨由来タンパク質以外の動物性タンパク質である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のナノ粒子の製造方法、
〔５〕固形分値０．２〜１．０重量％に調整したナノ粒子含有液を、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）を用い、分析設定を水として得られるゼータ電位の絶対値が１０ｍＶ以上である前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のナノ粒子の製造方法
に関する。

本発明で得られるナノ粒子は、ガレート型カテキンおよび動物性タンパク質という天然物由来の原料からなり、しかもガレート型カテキンおよび動物性タンパク質に由来する優れた健康機能性が期待されるものである。例えば、本発明者らは、これまでにコラーゲンとガレート型カテキンを用いたリパーゼ阻害組成物を報告しているが、本発明によって得られたナノ粒子もその機能を保持していることが期待される。

図１は、実施例４で算出した動物性タンパク質の平均分子量（ｘ）と、ナノ粒子の平均粒子径（ｙ）の関係を示すグラフである。動物性タンパク質の平均分子量が大きいほど粒子径が小さくなることが分かる。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のナノ粒子の製造方法は、平均粒子径が１０〜１００ｎｍである、天然物由来成分を基材とするナノ粒子の製造方法であって、
ガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物を、水または含水溶媒または有機溶媒に溶解または分散させて、ガレート型カテキン含有溶液または分散液を作製する工程、
ゼラチン、コラーゲン、およびこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質を、水または含水溶媒または有機溶媒に溶解または膨潤させて、動物性タンパク質含有溶液または膨潤液を作製する工程、ならびに
前記ガレート型カテキン含有溶液又は分散液と、前記動物性タンパク質含有液または膨潤液とを
（ａ）ガレート型カテキンの固形分
（ｂ）動物性タンパク質の固形分
の重量が、０．０７≦（ｂ）／（ａ）≦８．０となるように混合し、ｐＨ１．０〜４．０に調整した混合液中でナノ粒子を形成させてナノ粒子含有液を作製する工程
を有することを特徴とする

本発明で作製するナノ粒子の平均粒子径は、１０〜１００ｎｍであり、体内への吸収性および、製造性が良好である観点から、好ましくは１０〜９０ｎｍであり、より好ましくは２０〜８０ｎｍであり、特に好ましくは、３０〜７０ｎｍであり、さらに好ましくは、３０〜６０ｎｍである。
前記ナノ粒子の平均粒子径は、後述の実施例に記載のように、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）にて測定することができる。

本発明でいう天然物由来成分とは、原料である、ガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物、および動物性タンパク質がともに天然物由来であることを示す。なお、前記原料として試薬等を使用する際にも、その試薬が天然物由来であればよい。

（ガレート型カテキン含有溶液または分散液作製工程）
本発明のナノ粒子の製造方法では、前記ガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物を、水または含水溶媒または有機溶媒に溶解または分散させて、ガレート型カテキン含有溶液または分散液を作製する。

本発明で用いるガレート型カテキンとしては、ＥＧＣｇ、ＥＣｇ、ＧＣｇ、Ｃｇが挙げられる。前記ガレート型カテキンは、非重合体でも重合体でもよく、それらを混合しても、単独で使用してもよい。効率的な粒子形成の観点よりＥＧＣｇおよび／またはＥＣｇを含有することが好ましい。

また、本発明で用いるガレート型カテキンを含む組成物としては、例えば、前記ガレート型カテキンを含む茶抽出物やコーヒー抽出物等が挙げられる。また、粒子作製の効率の面から、組成物中のガレート型カテキン量が２０重量％以上のものが好ましく、さらに好ましくは、３０重量％以上のもの、より好ましくは６０重量％以上のものがよい。

前記溶媒として使用する有機溶媒としては水と混和するものであれば特に限定はされないが、得られたナノ粒子の使用用途に適した溶媒を選択することが好ましく、例えば、食品としてはグリセリン、プロピレングリコール、エタノール等が挙げられ、医薬品としては上記に加えてメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。また、前記溶媒として使用する含水溶媒とは、前記有機溶媒と水との混合溶媒をいう。

前記溶解または分散させる手段としては、公知の手段であれば特に限定はない。例えば、ガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物を、前記溶媒に添加・混合することで、溶解または分散させることができる。また、前記溶解または分散させる際には、ガレート型カテキンの溶解性の観点から、前記溶媒の温度を２０〜９０℃に調整しておくことが好ましいが溶解もしくは分散すれば特に限定はない。

前記ガレート型カテキン含有溶液または分散液中のガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物の固形分値は平均粒子径１００ｎｍ以下のナノ粒子を効率的に作製する観点から、０．１〜２４重量％であることが好ましい。より好ましくは０．１〜２０重量％であることが好ましいが、所望のナノ粒子が作製できれば、特に限定されることはない。

（動物性タンパク質含有溶液または膨潤液作製工程）
また、本発明のナノ粒子の製造方法では、前記動物性タンパク質を、水または含水溶媒または有機溶媒に溶解または膨潤させて、動物性タンパク質含有溶液または膨潤液を作製する。

本発明で用いる動物性タンパク質は、ガレート型カテキンとコアセルベートを形成可能なゼラチン、コラーゲンペプチド、およびこれらの分解物などであればよい。動物性タンパク質の由来は、豚、魚、ニワトリ等、および遺伝子組み換え体のいずれかを用いることができ、これらの由来のタンパク質は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。なお、牛骨または豚骨由来の動物性タンパク質は、１００ｎｍ以下の粒子が一部形成されるものの、その平均粒子径が１００ｎｍを超える大きさになるため、本発明では使用することが難しい。
ただし、牛骨または豚骨由来のタンパク質が含まれている動物性タンパク質であっても、平均粒子径１００ｎｍ以下のナノ粒子が作製できれば、特に限定はなく使用することができる。

本発明に用いられる動物性タンパク質は、例えばゼラチンを用いて作製したときに得られる粒子径のグラフから、得られるナノ粒子の平均粒子径が１００ｎｍとなるよう、分子量３９０００以上が好ましく、より好ましくは５００００以上、さらに好ましくは１０００００以上である。

前記溶媒として使用する前記含水溶媒とは、水と混和する有機溶媒をいう。また、有機溶媒としては水と混和するものであれば特に限定はされないが、得られたナノ粒子の使用用途に適した溶媒を選択することが好ましく、例えば、食品としてはグリセリン、プロピレングリコール、エタノール等が上げられ、医薬品としては上記に加えてメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。

前記溶解または膨潤させる手段としては、公知の手段であれば特に限定はない。例えば、前記動物性タンパク質を、前記溶媒に添加・混合することで、溶解または膨潤させることができる。
なお、膨潤とは、動物性タンパク質に水、含水溶媒もしくは有機溶媒を添加してゲル状にすることをいう。
また、前記溶解または膨潤させる際には、効率的に溶解または膨潤させる観点から、前記溶媒の温度を２０〜９０℃に調整しておくことが好ましい。

前記動物性タンパク質含有溶液または膨潤液中の動物性タンパク質の固形分値は、平均粒子径１００ｎｍ以下のナノ粒子を効率的に作製する観点から、０．１〜１９重量％であることが好ましく、より好ましくは、０．１〜１０重量％であるが、所望のナノ粒子が作製できれば、特に限定されることはない。
なお、ゼラチンを使用する場合、前記固形分値が２０重量％以上であれば液の粘度の上昇により扱いにくくなる。

（ナノ粒子含有液作製工程）
本発明のナノ粒子の製造方法では、前記ガレート型カテキン含有溶液又は分散液と、前記動物性タンパク質含有液または膨潤液とを
（ａ）ガレート型カテキンの固形分
（ｂ）動物性タンパク質の固形分
の重量が、０．０７≦（ｂ）／（ａ）≦８．０となるように混合し、ｐＨ１．０〜４．０に調整した混合液中でナノ粒子を形成させてナノ粒子含有液を作製する。

本工程における前記ガレート型カテキン含有溶液又は分散液と、前記動物性タンパク質含有液または膨潤液との混合方法としては、均一に混合可能であればよく、静置している前記ガレート型カテキン含有溶液又は分散液に前記動物性タンパク質含有液または膨潤液を添加する方法、その逆の添加方法、攪拌しながら添加する方法、ホモジナイズしながら添加する方法、予め水をそれぞれの液に混合する方法、等が使用可能であるが、特に限定はない。

本工程において、混合する際の温度などの条件については、成分の大幅な変化などが生じず、均一に混合可能な条件であればよく、使用する成分に適した温度であればよい。例えば、ゼラチンの場合、低温であると溶液の粘度が上昇し、濃度が数％以上などと高い場合、均一に混合することが困難となることから、５０℃以上であることが好ましい。さらに、高温の場合、成分の変化が起こりやすくなるため、５０〜８０℃がより好ましく、さらに好ましくは、５０〜７０℃がよい。

本工程では、前記ガレート型カテキン含有溶液又は分散液と、前記動物性タンパク質含有液または膨潤液との量として、
（ａ）ガレート型カテキンの固形分
（ｂ）動物性タンパク質の固形分
の重量が、０．０７≦（ｂ）／（ａ）≦８．０となるように調整する。

前記重量比が８．０を超える場合、１００ｎｍ以下の粒子が一部生成されるが、平均粒子径としては１００ｎｍを超える。また、前記重量比が０．０７未満であっても同様である。前記重量比については、上限値が７．０以下であることが好ましい。

また、前記ガレート型カテキン含有溶液又は分散液と、前記動物性タンパク質含有液または膨潤液との混合液のｐＨは、１．０〜４．０であり、１．５〜３．５がより好ましい。さらに好ましくは、１．５〜３．１がよい。ｐＨが１．０より低すぎるとナノ粒子が溶解してしまったり、粒子径が大きくなったりする。このように低いｐＨでナノ粒子の粒子径を調整した報告はほとんどない。一方、ｐＨが４．０より高いと、一時的に粒子を形成するが、凝集、沈殿が生じやすい。また、ｐＨ７以上ではガレート型カテキンの安定性が減少するため効率的なナノ粒子を形成させることができない。

ｐＨの調整には、ナノ粒子の使用用途に応じて、使用可能な酸であれば特に制限はない。例えば、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸、トリフルオロ酢酸のような有機酸、塩酸、過塩素酸、炭酸のような無機酸、又は緩衝液、などで調整することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。得られたナノ粒子を医薬品、化粧品、食品等に利用する場合は、それぞれの使用用途に適した酸を選択することが好ましい。

なお、前記混合液のｐＨを調整するには、ガレート型カテキン含有溶液または分散液と、動物性タンパク質含有溶液または膨潤液のｐＨを予め調整してもよい。このように予めｐＨを調整することで、ガレート型カテキン含有溶液または分散液と、動物性タンパク質含有溶液または膨潤液を混合するだけでも、混合液のｐＨを１．０〜４．０の範囲に調整することができる。

前記のようにｐＨを１．０〜４．０の範囲に調整した混合液中において、ガレート型カテキンと動物性タンパク質とがコアセルベートを形成し、このコアセルベート中に平均粒子径１０〜１００ｎｍのナノ粒子が生じる。

前記混合液中においては、効率的にナノ粒子を作製する観点から、ガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物由来の固形分を０．１重量％以上、ゼラチン、コラーゲン、およびこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質由来の固形分を０．１重量％以上含有することが好ましい。また、前記ガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物由来の固形分および動物性タンパク質由来の固形分の合計量は、０．２８重量％以上がより好ましく、１．０重量％以上がさらに好ましく、１．８重量％以上が最も好ましい。
なお、前記ガレート型カテキン含有溶液又は分散液と、前記動物性タンパク質含有液または膨潤液との混合時に所望の濃度となるよう調整してもよく、ナノ粒子を作製した後に濃縮してもよい。

前記のようにして得られるナノ粒子含有液は、限外濾過、透析等を施してもよい。透析をすれば、粒子化していない成分を分離しやすい。限外濾過膜としては例えばペンシル型ＵＦ膜（旭化成社製）、透析膜としてはＳｎａｋｅＳｋｉｎ（ピアス社製）が挙げられる。これ以外にもナノ粒子を失わずに限外ろ過および透析ができれば特に限定はない。

本発明で得られるナノ粒子は、安定性に優れたものである。例えば、ナノ粒子の安定性を示す指標にナノ粒子表面のゼータ電位を測定する方法が知られており、このゼータ電位の絶対値が大きいほど安定性に優れるといえる。例えば、本発明で得られるナノ粒子としては、固形分値０．２〜１．０重量％に調整したナノ粒子含有液を、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）を用い、分析設定を水として得られるゼータ電位の絶対値が１０ｍＶ以上であるものが好ましい。
なお、測定時におけるナノ粒子含有液の溶媒は、水、含水溶媒、有機溶媒のいずれでもよいが、測定誤差などが生じにくい観点から、水または含水溶媒であることが好ましい。

本発明で得られるナノ粒子は、食品に利用可能な条件で作製した場合は、飲食品に配合してもよい。飲食品としては特に限定されず、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子、機能性食品、健康食品、健康志向食品等が挙げられる。保存性、携帯性、摂取の容易さ等を考慮すると、菓子類が好ましく、菓子類の中でも、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット、チューイングガム等が好ましい。

前記ナノ粒子を飲食品に配合する場合、ナノ粒子の飲食品における含有量は、その生理活性効果が期待できる量であればよい。通常１日あたり１０〜１００００ｍｇ、より好ましくは１００〜３０００ｍｇ摂取できるように配合量を決定することが好ましい。例えば、固形状食品の場合には５〜５０重量％、飲料等の液状食品の場合には０．０１〜１０重量％が好ましい。

また、本発明で得られるナノ粒子は、安全性に優れたものであると考えられるので、ヒトに対してだけでなく、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。

次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。

（実施例１）ガレート型カテキンと動物性タンパク質によるナノ粒子作製の検討
Ｇ微粉（豚皮由来）、ＡＰＨ−２５０（豚皮由来）、ＦＧＬ−２５０（魚由来）、ＧＢＬ−２５０（豚骨由来）、Ａ３３０（牛骨由来）、＃２５０（牛骨由来）（いずれも新田ゼラチン株式会社製）、ニワトリゼラチン（鶏由来、日本ハム社製）などの平均分子量３９０００以上の動物性タンパク質０．１ｇを、５０℃の水に溶かした７種類の動物性タンパク質含有水溶液をそれぞれ９０ｇずつ作製した。
一方、緑茶抽出物（ガレート型カテキン（以下Ｇカテキンと記載）含量６７重量％）０．１８ｇを５０℃の水に溶かしたガレート型カテキン含有水溶液１０ｇを７つ作製した。
次いで、７種類の前記動物性タンパク質含有水溶液９０ｇに対して、それぞれガレート型カテキン含有水溶液１０ｇを加え、混合したところ、いずれも凝集・沈殿のないコロイド状薄白色液体１００ｇ（ｐＨ３．２）となった。得られた液体の粒子の平均粒子径とゼータ電位を、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）にて測定した。
また、Ｇカテキンを含まない緑茶抽出物サンフェノンＸＬＢ−１００（太陽化学社製）を用いた比較品も作製した。結果を表１に示す。
なお、ゼータ電位および平均粒子径は、分析設定を水として測定した。

表１の結果より、Ｇカテキンを含まない緑茶抽出物とＧ微粉を用いた場合には、ナノ粒子が形成されないのに対して、豚皮、魚、鶏などに由来する動物性タンパク質とＧカテキンとを混合することで１００ｎｍ以下のナノ粒子が作製できることが分かる。また、豚皮、魚、鶏などに由来する動物性タンパク質を用いると、ゼータ電位の絶対値が１９〜４６ｍＶと大きくなっており、豚骨、牛骨由来の動物性タンパク質よりも安定性に優れることがわかった。
一方、豚骨および牛骨由来の動物性タンパク質を用いた場合には、理由は不明であるが粒子の平均粒子径は１００ｎｍを超えるものとなった。

（実施例２）動物性タンパク質とＧカテキン比率の検討
ナノ粒子作製においての動物性タンパク質とＧカテキン比率検討のために、混合するゼラチンとＧカテキンの比率のみを変更して実施例１に準じた方法で平均粒子径を測定した。ゼラチンとしてはＧ微粉を用いた。結果は表２に示す。なお、表中の「Ｇ微分」、「Ｇカテキン」の数値の単位はいずれも重量％である。

表２の結果より、動物性タンパク質の固形分（ｂ）とＧカテキンの固形分（ａ）との比率（（ｂ）/（ａ））が０．０７〜７.０の範囲内において１００ｎｍ以下のナノ粒子が形成されていることが分かる。

（実施例３）ｐＨの検討
ナノ粒子作製においてのｐＨ検討のために、実施例１に準じた方法にてナノ粒子を作製し、その後、クエン酸、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウムで混合液のｐＨを調整して平均粒子径を測定した。ゼラチンとしてはＧ微粉を用い、動物性タンパク質の固形分とＧカテキンの固形分の混合する重量比率は０．８３とした。結果を表３に示す。

表３の結果より、混合液のｐＨを１．９〜４．０に調整することで、平均粒子径が１００ｎｍ以下のナノ粒子が得られることがわかる。

（実施例４）分子量の検討
ナノ粒子作製におけるタンパク質の分子量検討のために、動物性タンパク質として３種類のコラーゲンペプチド（１）商品名：ＨＢＣ―Ｐ２０、新田ゼラチン株式会社製、分子量２００００、（２）商品名：ＳＣＰ―５２００、新田ゼラチン株式会社製、分子量５０００、（３）商品名：ＳＣＰ―２０００、新田ゼラチン株式会社製、分子量２０００およびＧ微分（平均分子量１０００００）を用い、実施例１に準じた方法にて３種類のナノ粒子を作製した。動物性タンパク質の固形分とＧカテキンの固形分の混合する重量比率は０．８３とした。結果を図１に示す。

図１に示す結果より、動物性タンパク質の平均分子量と、ナノ粒子の平均粒子径との間には、逆相間（相関係数０．９９２６）にあることが分かり、以下の公式が見出された。ついで１００ｎｍ以下の粒子を形成する平均分子量を算出した。
公式：平均粒子径＝（４４７９５５×平均分子量）^-0.7952
そして、前記公式にナノ粒子の平均粒子径１００ｎｍを代入したところ、動物性タンパク質の平均分子量が３９０００と算出されたことから、平均分子量が３９０００以上のタンパク質を使用することで１００ｎｍ以下のナノ粒子が形成できることが分かる。

（実施例５）ナノ粒子の吸収性評価
ナノ粒子の吸収性評価のためにラットを用いた吸収性評価試験を行った。
７週齢のラットに実施例１で得られたＧ微粉を用いた本発明品、ガレート型カテキン単独を投与し、１、２、３、５、７時間に尾部より採血を行って血漿を作成した。得られた血漿をＧｒｕｃｕｒｏｎｏｄａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製）およびＳｕｌｆａｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製）で脱抱合を行い、ＬＣ−ＭＳにてカテキン濃度を測定した。測定するカテキンはＥＧＣｇとＥＣｇとした。その結果、本発明品において吸収性の向上が認められた。

Claims (5)

1. 平均粒子径が１０〜１００ｎｍである、天然物由来成分を基材とするナノ粒子の製造方法であって、
   ガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物を、水または含水溶媒または有機溶媒に溶解または分散させて、ガレート型カテキン含有溶液または分散液を作製する工程、
   ゼラチン、コラーゲン、およびこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質を、水または含水溶媒または有機溶媒に溶解または膨潤させて、動物性タンパク質含有溶液または膨潤液を作製する工程、ならびに
   前記ガレート型カテキン含有溶液又は分散液と、前記動物性タンパク質含有液または膨潤液とを
   （ａ）ガレート型カテキンの固形分
   （ｂ）動物性タンパク質の固形分
   の重量が、０．０７≦（ｂ）／（ａ）≦８．０となるように混合し、ｐＨ１．０〜４．０に調整した混合液中でナノ粒子を形成させてナノ粒子含有液を作製する工程
   を有することを特徴とする、ガレート型カテキンと動物性タンパク質からなるナノ粒子の製造方法。
2. 前記混合液が、ガレート型カテキンまたはガレート型カテキンを含む組成物由来の固形分を０．１重量％以上、且つ、ゼラチン、コラーゲン、およびこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質由来の固形分を０．１重量％以上含有する請求項１記載のナノ粒子の製造方法。
3. 前記動物性タンパク質の平均分子量が３９０００以上である請求項１または２記載のナノ粒子の製造方法。
4. 前記動物性タンパク質が豚骨由来タンパク質および牛骨由来タンパク質以外の動物性タンパク質である請求項１〜３のいずれかに記載のナノ粒子の製造方法。
5. 固形分値０．２〜１．０重量％に調整したナノ粒子含有液を、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、「ＤｅｌｓａＭａｘ ＰＲＯ」）を用い、分析設定を水として得られるゼータ電位の絶対値が１０ｍＶ以上である請求項１〜４のいずれかに記載のナノ粒子の製造方法。

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