JP2016010330A - 人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、複数の外来遺伝子並びに薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子のｉＰＳ細胞への効果的なトランスフェクション方法と、該方法によって製造される前記外来遺伝子を１００％発現する胚様体の形成方法と、該方法によって製造された胚様体の提供を目的とする。
【解決手段】本発明は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法であって、
１）エピソーマルベクターを用いて、ｉＰＳ細胞に該外来遺伝子を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションする工程、
２）該外来遺伝子がトランスフェクションされたｉＰＳ細胞を、薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子を用いて選別する工程、
３）選別されたｉＰＳ細胞を、非静的な培養方法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
を含む方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、エピソーマルベクターを用いたｉＰＳ細胞からの効果的な分化誘導等を目的とする複数の外来遺伝子を胚様体に発現させる方法、該方法で製造する胚様体に関する。

ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は体細胞に分化するため、ｉＰＳ細胞は創薬及び再生医療のための有用なツールである（非特許文献１）。ヒト由来の体細胞の利用には限界がある。例えば、初代培養された肝細胞を治療に応用するとき、初代培養された肝細胞は薬物の効果及び毒性の予測に有用である（非特許文献２、３）。初代培養された肝細胞の肝不全の患者への移植が報告されている（非特許文献４）。しかし、培養された幹細胞は、アポトーシス及び損傷が惹起され易い（非特許文献５）。さらに、培養された肝細胞は増殖しない（非特許文献６）。そこで、肝細胞がｉＰＳ細胞から作製されれば、移植のために十分な量の肝細胞が提供されることになる。

また、創薬への応用のもう１つの例は筋ジストロフィーである。疾患患者由来の体細胞は創薬に有用である。しかし、十分な量の患者由来の体細胞は患者から得られない。そこで、Ｉｄ２又はＩｄ３遺伝子をはじめとする複数の遺伝子の発現を抑制するｉＰＳ細胞から筋細胞に分化させることにより、ｉＰＳ細胞を創薬のための研究に使用することができる（特許文献２、非特許文献７）。

ヒトｉＰＳ細胞は各患者毎にそれぞれに確立可能なため、倫理的問題及び移植片対宿主病をヒトｉＰＳ細胞の使用によって回避できる。したがって、ヒトｉＰＳ細胞は、患者のための理想的な治療細胞供給源となる。胚性幹細胞又はｉＰＳ細胞は懸滴法（hanging drop method）でそれら自身が結集され、接着分子の受容体を発現する（非特許文献８）。これらの細胞凝集体は胚様体（ＥＢ）と呼ばれる。胚様体は発生初期の３次元（３Ｄ）構造を模倣し、肝細胞又は心筋細胞などの分化した細胞タイプへのｉＰＳ細胞の分化を促進する（非特許文献９−１１）。胚様体の３Ｄ構造は２次元（２Ｄ）の細胞よりも分化をより効率的に促進し、３Ｄ構造がこの現象の根底のメカニズムであると提案されている（非特許文献１２）。増殖因子での刺激及び増殖因子の導入は、ヒトｉＰＳ細胞からの肝細胞様細胞の産生を促進する（特許文献１、非特許文献１３−１６）。分化に必要不可欠な遺伝子を発現する胚様体は、より効率的な分化を期待できる。したがって、複数の、例えば、転写因子等の目的とする分化のための、遺伝子を胚様体に発現させるための方法を確立する必要がある。

転写因子の導入は、分化した細胞タイプへのヒトｉＰＳ細胞の分化において重要なステップである（非特許文献１７）。特に、複数の転写因子のｉＰＳ細胞への導入は、標的体細胞への分化を促進する（特許文献１、非特許文献１８）。転写因子は、ベクター又はウィルスベクターを介してｉＰＳ細胞に導入される（非特許文献３、１７、１９、２０）。トランスフェクション試薬又はエレクトロポレーションが、関心のある遺伝子をｉＰＳ細胞に導入するために従来から用いられている（非特許文献２１、２２）。しかし、トランスフェクション試薬の効率は低く、トランスフェクションされた細胞の選択が必要である（非特許文献２０）。エレクトロポレーションは、細胞損傷を誘発する可能性があり問題である（非特許文献２３）。ウィルスベクターは、目的の遺伝子の導入を促進するためのより効果的な方法である。しかし、これらのウィルスベクターの構築は、複雑で、面倒である。アデノウィルスベクターの構築は、複数のステップ及び多くの日数を必要とする（非特許文献１６）。アデノウイルスベクターは、それ自体が異物であるため、免疫応答を惹起する（非特許文献２４）。さらに、遺伝子発現はアデノウィルスでは一過性である。レトロウイルスベクターは、それら自体が宿主ゲノムに組み込まれるため、発がん性を有する（非特許文献２５）。一方、プラスミドＤＮＡは、それ自体は外因性タンパク質を生成しないため、免疫応答を誘発しない（非特許文献２６）。プラスミドＤＮＡは、それ自体は宿主ゲノムに組み込まれないため、発がん性にも関係ない（非特許文献２７）。プラスミドＤＮＡの一種であるエピソーマルベクターは、ベクターの潜在的複製開始点（latent origin of plasmid replication）（ｏｒｉＰ）、及び、複製因子をエンコードするエプスタイン−バーウイルス核抗原（ＥＢＮＡ−１）遺伝子を含み、ｏｒｉＰ及びＥＢＮＡ−１は、エプスタイン−バーウイルスエピソームの持続的な有糸分裂分配を可能にする（非特許文献２８）。そこで、エピソーマルベクターは、エピソーマル複製を介して娘細胞に分配される。したがって、エピソーマルベクターは、複数の導入遺伝子を発現する安定な細胞株を１週間で確立するために使用することが可能である（非特許文献２９、３０）。

特開2013-226127号公報 特開2010-208980号公報

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本発明は、複数の外来遺伝子並びに薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子のｉＰＳ細胞への効果的なトランスフェクション方法と、該方法によって製造される前記外来遺伝子を１００％発現する胚様体の形成方法と、該方法によって製造された胚様体の提供を目的とする。

本発明者は、エピソーマルベクターでトランスフェクションされた複数の外来遺伝子を発現する胚様体を形成するためのさまざまな方法を検討し、外来遺伝子並びに薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子を１００％発現する胚様体の形成方法を確立した。

本発明において、最初に、トランスフェクション方法について最も効率的な方法を探求し、次に、胚様体の形成の効率的な方法の確立のために、２つのレポーター遺伝子及び薬剤選択マーカーをトランスフェクションした細胞を選択する方法と培養方法とを検討した。そして、ｉＰＳ細胞の増殖凝集体である胚様体が、２つのレポーター遺伝子及び薬剤選択マーカーを発現している細胞で形成されることを確認することにより、本発明を完成させた。

具体的には、本発明は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法であって、
１）エピソーマルベクターを用いて、ｉＰＳ細胞に外来遺伝子を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションする工程、
２）外来遺伝子がトランスフェクションされたｉＰＳ細胞を、薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子を用いて選別する工程、及び
３）選別されたｉＰＳ細胞を、非静的な培養方法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
を含む方法を提供する。

本発明の前記方法において、前記外来遺伝子が２種以上であり、遺伝子毎に異なる薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子を組み合わせてエピソーマルベクター構築物を作製する場合がある。

本発明の前記方法において、前記外来遺伝子が２種であり、外来遺伝子毎に異なる薬剤選択マーカー及び／又は配列番号７又は８に記載の配列を有するレポーター遺伝子から選択される核酸から選択される核酸を含む場合がある。

本発明の前記方法において、前記外来遺伝子が、分化を誘導する転写因子より選ばれる場合がある。

本発明の前記方法において、前記転写因子は、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ及びＣ／ＥＢＰαからなる群から選択される２種以上である場合がある。

本発明の前記方法において、前記非静的な培養方法は回転培養法である場合がある。

本発明の前記方法において、前記回転培養法における培養時の回転速度が２．５から９．９ｒｐｍである場合がある。

本発明の前記方法において、前記ｉＰＳ細胞の培養は、１．６から１６０×１０^３個／ｍＬの細胞濃度のｉＰＳ細胞の懸濁液を添加して培養する場合がある。

さらに、本発明は、前記方法により製造された前記外来遺伝子が導入された胚様体を提供する。

また、本発明は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法であって、
１）エピソーマルベクターに、
(i) 外来遺伝子、
(ii) Ｇ４１８（登録商標）又はハイグロマイシンＢに対する薬剤選択マーカー、及び、
(iii) ＥＧＦＰをコードする核酸配列（配列番号７）又はＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ（登録商標）をコードする核酸配列（配列番号８）を有するレポーター遺伝子
の(i)ないし(iii)を組み合わせて組み込んだ複数の種類のエピソーマルベクター構築物を作製する工程、
２）複数のエピソーマルベクター構築物を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてｉＰＳ細胞にトランスフェクションすることにより、複数の外来遺伝子をｉＰＳ細胞にトランスフェクションする工程、
３） (i)ないし(iii)の組み合わせに対応して、
Ｇ４１８及び／又はハイグロマイシンＢの添加により薬剤選択マーカーを用いて、及び／又は、
緑色及び／又は赤色の蛍光を指標としてレポーター遺伝子を用いて、
前記複数の外来遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞を選別する工程、並びに、
４）選別されたｉＰＳ細胞を、１．６から１６０×１０^３個／ｍＬの細胞濃度で、回転速度２．５から９．９ｒｐｍの回転培養法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
を含む方法を提供する。

本発明の方法を用いることにより、目的とする外来遺伝子を有するベクターを短期間で効率的にｉＰＳ細胞に導入し、薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子の発現を指標に、目的とする外来遺伝子を有するｉＰＳ細胞を効率的に選択し、前記複数の遺伝子を１００％の割合で発現するｉＰＳ細胞の増殖凝集体である胚様体を簡便な操作で短期間に高い効率で形成させることができる。この外来遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞からなる胚様体は、さらに増殖し、分化誘導させることにより、例えば、患者毎に移植可能な又は創薬研究に応用可能な肝細胞若しくは筋細胞又はそれらの前駆細胞等の体細胞様細胞を簡便な操作で、短期間に大量に製造することが可能である。

一過性のトランスフェクションの経時変化を示すグラフ。４つの試薬を、ｐＭｅｔＬｕｃ２−レポーターベクターを２０１Ｂ７細胞にトランスフェクションするために使用した。分泌型アルカリホスファターゼを発現するベクターをトランスフェクション効率をモニターするためにトランスフェクションした。トランスフェクションを、ウェル表面に接着している細胞（破線）、又は、培地に懸濁された細胞（実線）に対して実施した。９６ウェルプレートにおいて、１．８×１０^５細胞／ウェル（図１Ａ）又は９．０×１０^５細胞／ウェル（図１Ｂ）の細胞濃度の細胞をトランスフェクションした。細胞（１ウェルあたり１．８×１０^５細胞）を９６ウェルプレートに播種した。メトリディアルシフェラーゼが培地に分泌された。培地を採取し、ルシフェラーゼアッセイを用いて解析した。メトリディアルシフェラーゼの活性は分泌型アルカリホスファターゼの活性で除算した（相対ルシフェラーゼ活性）。メトリディアルシフェラーゼをｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｈｙｇ（ｐＥＢＭｕｌｔｉ／Ｍｅｔ−Ｈｙｇ）にサブクローニングし、ＬＴＸ又はＦｕＧＥＮＥ ＨＤ試薬を用いて２０１Ｂ７細胞にトランスフェクションした（図１Ｃ）。 誤差バーは同一条件で３回繰り返した実験結果の標準偏差を示す。また、アスタリスクはチューキー−クレーマー（Tukey-Kramer）検定でｐ値が０．０５未満であることを示す。黒丸はＦｕＧＥＮＥ ＨＤを示し、黒四角はリポフェクタミンＬＴＸを示し、白丸はＴｒａｎｓＩＴ ２０２０を示し、白四角はＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥを示す。 トランスフェクションされた細胞の選択のためのＧ４１８及びハイグロマイシンＢ濃度を示す顕微鏡写真を白黒に変換した図。２０１Ｂ７細胞を２４ウェルプレートでコンフルエントに培養し、Ｇ４１８又はハイグロマイシンＢを添加した。細胞を前記試薬の添加後７日に顕微鏡下で観察した。倍率は２００倍であり、目盛尺（scale bar）は１００μｍである。 トランスフェクションされた細胞の経時変化を示す顕微鏡写真を白黒図に変換した図。Ｅで示された列の写真は顕微鏡写真の緑色を、Ｃで示された列の写真は顕微鏡写真の赤色を、いずれも白色に変換することにより、白黒図を作成した。６ウェルプレートにおいて、２０１Ｂ７細胞が、４．５×１０^５細胞／ウェルで、リポフェクタミンＬＴＸ（「ＬＴＸ」と記載）又はＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（「Ｆｕ」と記載）での懸濁培養法を用いてｐＥＢＮＫ／ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ及びｐＥＢＮＫ／Ｃｈｅｒｒｙ−Ｈｙｇをトランスフェクションされた。Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢをトランスフェクション後４日ないし６日に添加した。Ｗは白色光を示し、ＥはＥＧＦＰを示し、ＣはＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒを示す。倍率は２００倍であり、目盛尺（scale bar）は１００μｍである。 ＥＧＦＰ及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒを発現する細胞を示す顕微鏡写真を白黒に変換した図、及び、経時変化（％）を示すグラフ。図４Ｂ及び図４Ｄは、顕微鏡写真の赤色を白色に変換することにより、白黒図を作成した。図３の同一実験の写真に対して、薬剤選択マーカーを１００％発現する細胞を得るためのＧ４１８及びハイグロマイシンＢでのインキュベーション期間を決定するために解析を行った。ＩｍａｇｅＪ １．４２ｑを用いて、細胞の領域を選択し、細胞領域を輪郭化した（矢印）（図４Ａ）。ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ陽性細胞の画像（図４Ｂ）は、赤色（図４Ｃ）、緑色及び青色の波長帯域に分離した。シグナルの閾値を設定し、ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒシグナル（赤色）の面積を測定した。ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ陽性細胞の面積（図４Ｄ）を、陽性細胞の割合（％）（図４Ｅ）を算出するために、輪郭化された領域の面積（図４Ａ）で除算した。矢印は細胞領域の輪郭を示す。倍率は２００倍であり、目盛尺（scale bar）は１００μｍである。図４Ｅにおいて、誤差バーは同一条件で３回繰り返した実験結果の標準偏差を示す。また、アスタリスクはチューキー−クレーマー（Tukey-Kramer）検定でｐ値が０．０５未満であることを示す。黒丸はＦｕＧＥＮＥ ＨＤを示し、黒四角はリポフェクタミンＬＴＸを示す。 ２０１Ｂ７細胞の回転培養の結果を示す顕微鏡写真の図及びグラフ。２０１Ｂ７細胞を、９６ウェル、２４ウェル、１２ウェル又は６ウェルプレート、及び、６ｃｍ又は１０ｃｍ組織培養ディッシュ又は１０ｃｍペトリ皿に播種した。細胞をマイルド細胞振盪機を用いて培養し、胚様体（ＥＢ）を形成させた。胚様体は、９．９ｒｐｍ（図５Ａ）及び２．５ｒｐｍ（図５Ｂ）で回転する６ウェルプレートに１．６×１０^５細胞の細胞濃度で播種した細胞から形成された。各胚様体の長さ（長径）（ａ）及び幅（短径）（ｂ）を測定した（図Ｃ）。細胞を、１．６×１０^３細胞／ｍＬ（ｓ）、１．６×１０^４細胞／ｍＬ（ｍ）、又は、１．６×１０^５細胞／ｍＬ（ｌ）の細胞濃度で播種した。プレート／ディッシュを、９．９ｒｐｍ（黒色）又は２．５ｒｐｍ（灰色）で回転した。ウェル／ディッシュあたりの胚様体数を、胚様体の形成効率を算出するために、回転培養（図５Ｅ）開始時の細胞数で除算した。胚様体のサイズは、前記長さ（ａ）に前記幅（ｂ）を乗算することによって算出した（図５Ｆ）。胚様体の幅と長さの割合は、前記長さ（ａ）を前記幅（ｂ）で除算して算出した（図５Ｇ）。 倍率は１００倍（図５Ａ、図５Ｂ）及び２００倍（図５Ｃ）であり、目盛尺（scale bar）は２００μｍ（図５Ａ、図５Ｂ）及び１００μｍ（図５Ｃ）である。誤差バーは同一条件で３回繰り返した実験結果の標準偏差を示す。また、アスタリスクはチューキー−クレーマー（Tukey-Kramer）検定でｐ値が０．０５未満であることを示す。 ＥＧＦＰ及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒをトランスフェクションしたヒト人工多能性幹細胞の回転培養の結果を示す顕微鏡写真の図。トランスフェクションしていない２０１Ｂ７細胞は、１２ウェルプレートで１時間９．９ｒｐｍでの回転培養に供された（図６Ａ、図６Ｃ、図６Ｅ）。ｐＥＢＮＫ／ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ及びｐＥＢＮＫ／Ｃｈｅｒｒｙ−Ｈｙｇを同時トランスフェクションした２０１Ｂ７細胞をＧ４１８及びハイグロマイシンＢを用いて選択した。生存する細胞を１２ウェルプレートで１時間９．９ｒｐｍでの回転培養に供した（図６Ｂ、図６Ｄ、図６Ｆ）。倍率は２００倍であり、目盛尺（scale bar）は１００μｍである。図６Ａ及び図６Ｂは白色光を示し、図６Ｃ及び図６ＤはＥＧＦＰを示し、図６Ｅ及び図６ＦはＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒを示す。図６Ｃ及び図６Ｄは緑色を白色に、図６Ｅ及び図６Ｆは赤色を白色に変換することにより、白黒図とした。 ＥＧＦＰ及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒをトランスフェクションした胚様体の顕微鏡写真の図。胚様体は、９．９ｒｐｍでの回転培養２４時間後に６ウェルプレートでヒト人工多能性幹細胞から形成された。胚様体は、ｐＥＢＮＫ／ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ及びｐＥＢＮＫ／Ｃｈｅｒｒｙ−Ｈｙｇがトランスフェクションされ、ＥＧＦＰ（図７Ｂ）及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ（図７Ｃ）を検出するために顕微鏡下で観察された（図７Ａ）。Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢを添加した（図７Ｄ）。倍率は１００倍であり、スケールバーは２００μｍである。なお、図７Ｂは緑色を、図７Ｃは赤色を、白色に変換することにより、顕微鏡写真の白黒図を作成した。

本発明は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法であって、
１）エピソーマルベクターを用いて、ｉＰＳ細胞に該外来遺伝子を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションする工程、
２）該外来遺伝子がトランスフェクションされたｉＰＳ細胞を、薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子を用いて選別する工程、及び、
３）選別されたｉＰＳ細胞を、非静的な培養方法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
を含む方法を提供する。

本発明の前記方法において、前記外来遺伝子が２種以上であり、遺伝子毎に異なる薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子を組み合わせてエピソーマルベクター構築を行う場合がある。

本明細書において、「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、「誘導多能性幹細胞ともいわれ、分化した体細胞（例えば、線維芽細胞）へ数種類の転写因子（遺伝子）を導入することにより確立されたＥＳ細胞（胚性幹細胞）に似た分化万能性を持つ細胞のことである。哺乳動物由来の体細胞を用いることにより、公知の方法でｉＰＳ細胞を作製可能である（特開２００８−２８３９７２、特開２００９−１６５４７８、特開２００９−１６５４７９等）。本発明において、ｉＰＳ細胞は、ヒト由来のｉＰＳ細胞が好ましい。ヒトｉＰＳ細胞は、独立行政法人医薬基盤研究所ＪＣＲＢ(Japanese Collection of Research Bioresources)細胞バンク、ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)、ＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Cultures）、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターのCELL BANK等より各種の細胞が分譲されており、これらを入手して使用することが可能である。また、ヒト人工多能性幹細胞の一種である２０１Ｂ７細胞は、理化学研究所から入手可能である。

本明細書において、「胚様体（ＥＢ；embryoid body）」とは、ｉＰＳ細胞を培養して非特異的に分化又は一部分化させて形成される球状の細胞塊をいう。ｉＰＳ細胞の分化は、典型的には、異なる細胞タイプ間の相互干渉を可能にする胚様体を形成する段階を含み、胚からの組織形成に類似した組織形成を促進する。

胚様体は、特にｉＰＳ細胞を３次元で培養するため目的の細胞への分化に有用である（Tomizawa Mら、 Cell Tissue Res 333:17-27；2008）。したがってエピソーマルベクターを使用してｉＰＳ細胞に分化誘導遺伝子又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）用の小核酸分子をコードする外来遺伝子を導入し、該外来遺伝子が発現した細胞のみを選択して胚様体を形成させ、さらに増殖、分化させることにより、目的の体細胞又はその前駆細胞を効率的に増殖し、分化誘導できる。

本明細書において、「外来遺伝子」とは、エピソーマルベクターに組み込まれて、トランスフェクション試薬を用いてｉＰＳ細胞に導入し、ｉＰＳ細胞又は該ｉＰＳ由来の細胞で発現させることにより、所望の形質を発現又は導入するための核酸をいう。具体的には、転写因子をコードするＤＮＡ及びＲＮＡ干渉を惹起するＲＮＡをコードするＤＮＡ等をいうが、これらに限定されない。

本明細書において、「エピソーマルベクター（episomal vector）」は、有核細胞の核内で環状ＤＮＡとして自己複製し、遺伝子導入細胞中においてベクターが細胞分裂後の娘細胞に分配されるベクターであって、数コピーから数十コピーで子孫細胞に維持されるプラスミドベクターを意味する。エピソーマルベクターは“oriP”と”Epstein-Barr virus nuclear antigen (EBNA-1)”を有する。oriPとEBNA-1が存在すると宿主の細胞分裂に伴い細胞質内でエピソーマルベクターも増幅する（Yates JLら、Nature 313:812-815；1985）。したがってエピソーマルベクターを用いて導入された遺伝子の発現は、宿主の細胞が分裂しても一定の期間減衰することなく維持される。エピソーマルベクターを用いると一週間で安定細胞株(stable cell line)が作製可能である（Tanaka Jら、 Biochem Biophys Res Commun 264: 938-943；1999、Shibata MAら、 Med Mol Morphol 40: 103-107；2007）。具体的には、例えばマウスポリオーマウイルス由来のエピソーマルベクター、ヒトポリオーマウイルスの一種であるＢＫウイルス由来のエピソーマルベクター、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）由来のエピソーマルベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）由来のエピソーマルベクター（特表２０１１−５２５７９４号公報）などのウイルス由来のエピソーマルベクターが挙げられる。また、ＥＢＶ由来のエピソーマルベクターの一部は市販されており、これらを使用することができる。

本発明において、エピソーマルベクターを使用してｉＰＳ細胞に目的とする形質を導入又は転換することにより、形質導入又は転換されたｉＰＳ細胞が分裂して増殖した細胞は、該形質を一定の期間安定して維持することができる。分化誘導のための転写因子を導入した場合には、ｉＰＳ細胞が分裂増殖しても、継続した安定した分化誘導が維持され、胚様体を形成させて、さらに増殖し、分化誘導させることにより所望の体細胞又はその前駆細胞を得ることができる。

形質を導入又は転換する外来遺伝子として、例えば、転写因子及び／又はエフェクター分子をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。また、ＲＮＡｉを惹起する小核酸分子をコードする核酸を発現させることにより、ｉＰＳ細胞又は該ｉＰＳ由来の細胞の形質を転換することも可能である。

転写因子の好ましい例の一つとして、ｉＰＳ細胞より肝細胞又は肝前駆細胞を製造する場合に、これに限定されない分化誘導用の転写因子が挙げられる。例えば、ｉＰＳ細胞から形成された胚様体をさらに増殖することにより大量の肝前駆細胞を短期間で製造するための分化誘導用転写因子として、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ及びＣ／ＥＢＰαが挙げられる（特許文献１）。これらの分化誘導用転写因子をコードする外来遺伝子を、エピソーマルベクターに挿入し、所定のトランスフェクション試薬でｉＰＳ細胞にトランスフェクションし、所定の培養方法で培養することにより、短期間で大量の肝前駆細胞を製造できる。製造した肝前駆細胞の肝疾患患者への移植による肝疾患の治療が期待される。

本明細書において、「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」とは、人工的に製造された小核酸分子を標的とする細胞に導入し、ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を調節することをいい、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介し得る小核酸分子として、例えば、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子が挙げられるが、これらに限定されない。

また、ＲＮＡ干渉用の小核酸分子をｉＰＳ細胞に導入することにより、ｉＰＳ細胞より分化誘導される細胞の所望の形質発現を調節することが可能となる。形質発現に関与するタンパク質の発現の抑制、又は、形質発現に関与するタンパク質発現を調節するタンパク質の発現の抑制により、前記所望の形質発現を調節することができ、胚様体を製造して、さらに増殖、分化させることにより所望の形質を有する体細胞又はその前駆細胞を得ることができる。

ｉＰＳ細胞から製造された胚様体を用いて、筋細胞への分化誘導を行うには、ｉＰＳ細胞の遺伝子発現を抑制する公知の方法により行うことができる。例えば、ｉＰＳ細胞のＩｄ２又はＩｄ３遺伝子の発現を抑制することにより、ｉＰＳ細胞を筋細胞に分化誘導することができる（特許文献２）。ｉＰＳ細胞のＩｄ２又はＩｄ３遺伝子を抑制するには、ＲＰ５８を導入する（特許文献２）、又は、ＲＮＡ干渉によりＩｄ２又はＩｄ３遺伝子の発現を抑制した胚様体を製造し、該胚様体をさらに増殖し、分化誘導させることにより筋細胞を得ることが可能である。ｉＰＳ細胞から分化誘導された筋細胞を用いて、創薬研究に使用することができる。

さらに、短期間で効率的かつ大量に目的とする外来遺伝子を導入した胚様体を製造する場合、前記転写因子をコードする外来遺伝子と共に、薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子をエピソーマルベクターに挿入し、共発現させ、薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子がコードする転写因子を発現した細胞を選別することにより、転写因子が発現した細胞を選択することが可能となる。転写因子が発現した細胞を選択することにより、非発現の細胞による増殖や分化の影響を受けることなく、目的とする外来遺伝子を組み込んだ胚様体を短期間で効率的かつ大量に製造することができる。

２種以上の前記転写因子をコードする外来遺伝子と共に、薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子をエピソーマルベクターに組み込むときに、２種以上の前記転写因子をコードする外来遺伝子毎にそれぞれ異なった薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子を組み合わせてそれぞれをエピソーマルベクターに挿入して共発現させることにより、各所望の分化誘導用転写因子の発現した細胞を簡便に選別し、体細胞又はその前駆細胞等への分化誘導効率を高めることができる。

本発明において、エピソーマルベクターに発現を目的とする外来遺伝子を組み込んだエピソーマルベクター構築物は、リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用してｉＰＳ細胞にトランスフェクションすることができる。本発明において、該エピソーマルベクター構築物をｉＰＳ細胞へ導入する時期は特に限定されないが、胚様体を形成する前が好ましい。

本明細書において、トランスフェクション試薬は、遺伝子を細胞に導入し、該細胞に形質を導入又は該細胞の形質を転換するためのエピソーマルベクター構築物をｉＰＳ細胞にトランスフェクションするための試薬をいう。本明細書において、「非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬」とは、カチオン性脂質を含むトランスフェクション試薬であって、非リポソーム型のものをいい、具体的には、これらに限定されない、特表２０１４−５０８１０２号公報に記載のカチオン性脂質を含有する非リポソーム型のトランスフェクション試薬、又は、市販され購入可能な非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬をいい、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）、ＧＳ ２８８８ ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＦＵＧＥＮＥ ＨＤ（登録商標）、ＦＵＧＥＮＥ ６（登録商標）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＬＩＰＯＴＡＸＩ（登録商標）、ＰＯＬＹＥＣＴ（登録商標）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）、ＴＦＸＮ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（商標）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）、ＴＲＡＮＳＭＥＳＳＥＮＧＥＲ（登録商標）、ベクタミジン（３−テトラデシルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−テトラデシルプロピオンアミジン（ジＣ１４−アミジン）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）をいう。本発明において、これらの市販の非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用可能であり、本発明において、好ましくはＦｕＧｅｎｅ ＨＤ（登録商標）である。

本発明において、エピソーマルベクターにより高効率に核酸が導入された細胞の選別は、薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子を前記所望の核酸と共にエピソーマルベクターに組み込みｉＰＳ細胞に導入することにより、公知の方法で、選別することができる。

本明細書において「薬剤選択マーカー」とは、遺伝学的解析で標識として用いられる遺伝子をいい、組換え実験などで組換え型の細胞等を検出するために用いられる遺伝子である。本発明では、薬剤選択マーカーを発現している細胞に、抗生物質又は薬物に対する耐性を与えるものでもよい。薬剤選択マーカーは、宿主細胞に特定の表現型を与えるために使用することもできる。例えば、薬剤耐性遺伝子として、Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びブラストサイジンＳ耐性遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において、「Ｇ４１８（登録商標）」は、ＩＵＰＡＣ名(2R,3S,4R,5R,6S)-5-amino-6-[(1R,2S,3S,4R,6S)-4,6-diamino-3-[(2R,3R,4R,5R)-3,5-dihydroxy-5-methyl-4-methylaminooxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-2-(1-hydroxyethyl)oxane-3,4-diolのゲンタマイシンに類似した構造のアミノグリコシド系抗生物質であり、ジェネティシン(geneticin)とも呼ばれる化合物をいう。

本明細書において、「ハイグロマイシンＢ(hygromycin B)」は、ＩＵＰＡＣ名 (3'R,3aS,4S,4'R,5'R,6R,6'R,7S,7aS)-4-[(1R,2S,3R,5S,6R)-3-amino-2,6-dihydroxy-5-(methylamino)cyclohexyl]oxy-6'-[(1S)-1-amino-2-hydroxyethyl]-6-(hydroxymethyl)spiro[4,6,7,7a-tetrahydro-3aH-[1,3]dioxolo[4,5-c]pyran-2,2'-oxane]-3',4',5',7-tetrolの抗生物質をいう。

本明細書において「レポーター遺伝子」は、トランスフェクションした細胞での発現が検出可能なものであれば特に制限されない。レポーター遺伝子となり得る遺伝子としては、酵素活性を有するタンパク質、蛍光性タンパク質又は化学発光性タンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。

例えば、酵素レポーターの例には、特に限定されないが、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、及びβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）等、蛍光タンパク質の例には、特に限定されないが、ＧＦＰ(Green Fluorescense Protein)等、並びに、好適な化学発光タンパク質には、特に限定されないが、エクオリン等を挙げることができる。

また、レポーター遺伝子は、市販のレポーター遺伝子を挿入したベクターよりレポータータンパク質をコードする核酸配列をサブクローニングすることにより、使用することができる。

レポーター遺伝子アッセイを実施するための方法は公知である（Schenbom,E.ら、Mol.Biotechnol. ,13：29-44；1999）。好ましくは、レポーター遺伝子はプロモーター又は最小プロモーターと共に存在するエンハンサーの転写調節下に置かれる。市販のセルソーターを用いることにより、レポーター遺伝子が発現する細胞を選別することができる。

前記薬剤選択マーカー又は前記レポーター遺伝子をクローニングする方法、及び、市販のベクターよりサブクローニングする方法として、制限酵素を用いるライゲーションクローニング法、ＴＡクローニング法又はインフュージョンクローニング法（米国特許7,575,860号公報）などの公知の方法が挙げられるが、これらに限定されない。サブクローニング法により、レポーター遺伝子を本発明で使用するベクターに組み込む場合、市販のレポーター遺伝子を挿入したベクターとして、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ１、ｐＺｓＧｒｅｅｎ、ｐＡｃＧＦＰ１、ｐＡｍＣｙａｎ、ｐＡｓＲｅｄ２、ｐｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｐｍＯｒａｎｇｅ、ｐＴａｇＣＦＰ−Ｃ、ｐＴａｇＹＦＰ−Ｃ、ｐＴａｇＲＦＰ−Ｃ、ｐＴａｇＢＦＰ−Ｃ、及びｐｍＫａｔｅ２−Ｃなどが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において、「ＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）」とは、ＧＦＰを改変することによりＧＦＰと比較して増強した蛍光性を有するタンパク質であり、該タンパク質をコードする核酸配列は配列番号７で表される。

本明細書において、ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ(登録商標)とは、赤色の蛍光を有するタンパク質であり、該タンパク質をコードする核酸配列は配列番号８で表される。

本発明において、安定細胞系の作製のために、目的とする外来遺伝子と共に薬剤選別マーカー及び／又はレポーター遺伝子をエピソーマルベクターに組み込むことによりエピソーマルベクター構築物を作製し、該エピソーマルベクター構築物をトランスフェクション試薬を用いてｉＰＳ細胞に導入することにより、形質導入されたｉＰＳ細胞を得ることができる。

本発明において、ｉＰＳ細胞からの胚様体の製造は、標的核酸を導入したｉＰＳ細胞を培養することにより製造されるが、培養方法は、固定培養法、懸濁培養法又は浮遊培養法のいずれでも良いが、好ましくは非静的な懸濁又は浮遊培養法で大量の細胞を培養可能な旋回培養、撹拌培養、振盪培養又は回転培養を用いる。もっとも好ましくは、回転培養法を用いる懸濁又は浮遊培養法で培養される。

前記外来遺伝子を組み込んだエピソーマルベクターをトランスフェクションしたｉＰＳ細胞を前記非静的な培養方法で培養する場合に、該ｉＰＳ細胞の細胞濃度は、１．０〜１００ｘ１０^３細胞／ｍＬ、好ましくは、１．６〜１６０ｘ１０^３細胞／ｍＬ、最も好ましくは、１６ｘ１０^３細胞／ｍＬのｉＰＳ細胞をより多くの用量で添加して培養することにより、より多くの個数の胚様体を得ることができる。

前記外来遺伝子を組み込んだエピソーマルベクターをトランスフェクションしたｉＰＳ細胞を前記非静的な培養方法で培養する場合に、該ｉＰＳ細胞の細胞濃度は、１．０〜１００ｘ１０^３細胞／ｍＬ、好ましくは、１．６〜１６０ｘ１０^３細胞／ｍＬ、最も好ましくは、１６ｘ１０^３細胞／ｍＬのｉＰＳ細胞を添加して培養することにより、添加ｉＰＳ細胞当たりもっとも多くの個数の胚様体を得ることができる。

前記外来遺伝子を組み込んだエピソーマルベクターをトランスフェクションしたｉＰＳ細胞を前記非静的な培養方法で培養する場合に、該ｉＰＳ細胞を培養する培養液の容量は、１ｍＬ以上、好ましくは３ｍＬ以上、もっとも好ましくは５ｍＬ以上において、より多数の胚様体を製造することが可能である。

回転培養法を使用してサイズが大きい胚様体を製造する場合の回転速度は、１．０ないし１５ｒｐｍ、好ましくは２．５ないし９．９ｒｐｍ、もっとも好ましくは２．５ｒｐｍである。

また、エピソーマルベクターを、ｉＰＳ細胞にトランスフェクションするときに、エピソーマルベクターのｉＰＳ細胞への効果的なトランスフェクションを阻害しないことを条件として、細胞培養条件（例えば、温度、時間、ガス組成、培養液、添加剤、抗生物質、細胞濃度、培養規模など）を変更する場合がある。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除および置換を行うことができる。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。ここに記述される実施例は本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

材料及び方法
細胞培養
ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７（理研細胞バンク、つくば）を、マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン、米国ニュージャージー州フランクリン・レイクス）の薄層コーティングを伴うプレート又はディッシュ（アサヒテクノグラス、船橋）においてＲｅｐｒｏＦＦ培地（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ、横浜）でフィーダー細胞なしで培養した。加湿チャンバーにおいて５％ＣＯ_２下、３７°Ｃに保たれ、アキュターゼ（イノベーティブ セル テクノロジーズ社、米国サンディエゴ）を用いて細胞を採取した。この細胞を、それぞれ、メトリディアルシフェラーゼ（ＭｅｔＬｕｃ）アッセイを実施するために２４ウェル及び９６ウェルプレートに播種した。これらのディッシュ及びプレートに対して、マトリゲル（０．３ｍＬ）及びＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（８．７ｍＬ）の混合物を塗布することによって薄くコーティングした。このディッシュを室温で３時間インキュベーションした。前記細胞の形態学的特徴をＣＫＸ４１Ｎ−３１ＰＨＰ顕微鏡（オリンパス、東京）で観察した。選択条件を決定するために、Ｇ４１８（和光純薬株式会社、大阪）及び／又はハイグロマイシンＢ（和光純薬株式会社）を培地に添加し、７時間後に顕微鏡下で細胞を観察した。２重トランスフェクションした細胞を選択するために、Ｇ４１８（２００μｇ／ｍＬ）及びハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を、それぞれ、トランスフェクション４日ないし６日後に添加した。トリパンブルーで染色し、血球計算盤を用いて細胞数を計測した。

回転培養
細胞（１．６×１０^３、×１０^４及び×１０^５細胞／ｍＬ）を、１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ−２７６３２（和光純薬）を添加したＲｅｐｒｏＦＦ培地に懸濁し、ＣＳＭ０３０２０マイルド細胞振盪機（タイテック、越谷）を用いて加湿チャンバーにおいて５％ＣＯ_２下、３７°Ｃで２４時間、回転培養した。５０μＬ、１００μＬ、３００μＬ及び５００μＬの細胞懸濁液を、それぞれ、９６ウェル、２４ウェル、１２ウェル及び６ウェルプレートのウェルに加えた。１ｍＬ、５ｍＬ及び５ｍＬの細胞懸濁液を、それぞれ、６ｃｍ及び１０ｃｍの組織培養ディッシュ及び１０ｃｍペトリ皿に加えた。Ｙ−２７６３２を、Ｒｈｏ関連コイルドコイルフォーミングキナーゼ（Rho-associated coiled-coil forming kinase）を阻害し、２０１Ｂ７細胞のアポトーシスを回避するために添加した（Watanabe Kら、Nat Biotechnol.25:681-6；2007）。至適細胞固定及び増殖について表面処理の効果を比較するために、１０ｃｍ組織培養ディッシュ及び１０ｃｍペトリ皿を比較した。回転速度は、回転速度の効果を解析するために９．９ｒｐｍ又は２．５ｒｐｍに設定した。胚様体のサイズ及び形状を解析するために長さ（長径）及び幅（短径）を測定した。

ベクター構築物の作製
ＥＧＦＰをコードする配列（配列番号７：クロンテック、カリフォルニア州マウンテンビュー）を有するポリヌクレオチドをＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラ、京都）を用いてｐＥＧＦＰ−Ｎ１から増幅し、ｐＢｌｕｅ／ＥＧＦＰを作製するためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（アジレント・テクノロジー株式会社、カリフォルニア州サンタクララ）の５’−ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ−３’部位にサブクローニングした。ＥＧＦＰ配列をバリデーションした（株式会社バイオマトリックス研究所、流山）。ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ（登録商標：ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ１）（クロンテック）のコーディング領域（配列番号８）をＬＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１を用いて増幅し、ｐＢｌｕｅ／Ｃｈｅｒｒｙを作製するためにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）の５’−ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ−３’部位にサブクローニングした。前記コーディング領域の配列をバリデーションした（株式会社バイオマトリックス研究所）。

ＥＧＦＰのクローニングに使用したフォワードプライマー（配列番号１）及びリバースプライマー（配列番号２）は、それぞれ、以下のとおりである。
（配列番号１） 5’-ATCGTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’
（配列番号２） 5’-ATCGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’
ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒのクローニングに使用したフォワードプライマー（配列番号３）及びリバースプライマー（配列番号４）は、それぞれ、以下のとおりである。
（配列番号３） 5’-ATCGTCTAGAATGATGGTGGACGGCGACAA-3’
（配列番号４） 5’-ATCGGGTACCTCATTTGTACAGCTCGTCCA-3’

ＰＣＲは以下の条件で実施された。
（１）９８°Ｃで変性反応２０秒間
（２）６０°Ｃでアニーリング及び伸長反応３分間
（１）及び（２）を３０サイクル

ＥＧＦＰは、ｐＥＢＮＫ／ＥＧＦＰ−Ｎｅｏを作製するのに制限酵素切断部位５’−ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−３’を用いてｐＢｌｕｅ／ＥＧＦＰからｐＥＢＮＫ−Ｎｅｏにサブクローニングした。ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒを、ｐＥＢＮＫ／Ｃｈｅｒｒｙ−Ｈｙｇを作製するのに制限酵素切断部位５’−ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−３’を用いてｐＢｌｕｅ／ＣｈｅｒｒｙからｐＥＢＮＫ−Ｈｙｇにサブクローニングした。ｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｎｅｏ及びｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｈｙｇを和光純薬株式会社から入手した。ｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｎｅｏ及びｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｈｙｇの制限酵素切断部位は、５’−ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−３’の方向にそろえた。ＥＧＦＰ及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒの５’−ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−３’断片は２つのベクターにサブクローニングし、挿入断片を逆向きに挿入した。ＥＧＦＰ及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒの５’−ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−３’断片を正しい向きに挿入するために、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を５’−ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−３’に変更した。この実施のために、リンカー配列（配列番号５及び６）をＮｏｔＩ及びＫｐｎＩで消化し、ｐＥＢＮＫ−Ｎｅｏ及びｐＥＢＮＫ−Ｈｙｇを作製するためにｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｎｅｏ及びｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｈｙｇにサブクローニングした。
（配列番号５）5’-AGCGGCCGCGAGCTCGGTACCTA-3’
（配列番号６）5’-GGCCTAGGTACCGAGCTCGCGGCCGCTGTAC-3’

メトリディアルシフェラーゼ（ＭｅｔＬｕｃ）を、ｐＥＢＭｕｌｔｉ／Ｍｅｔ−Ｈｙｇを作製するために制限酵素切断部位５’−ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ−３’を用いてｐＭｅｔＬｕｃ２−レポーター（クロンテック）からｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｈｙｇにサブクローニングした。

２０１Ｂ７細胞のトランスフェクション
接着培養法では、播種後２４時間の細胞がウェルの底に接着したときに、細胞にトランスフェクションした。懸濁培養法では、細胞をアキュターゼで採取し、ドラフト内において、室温で５分間トランスフェクション試薬に懸濁した後、インキュベーションした。トランスフェクション試薬は、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）、リポフェクタミンＬＴＸ（ライフテクノロジーズ、米国ニューヨーク州グランドアイランド）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬（ロシュ、スイスバーゼル）、及び、ＴｒａｎｓＩＴ−２０２０トランスフェクション試薬（ミラスバイオ、米国ウィスコンシン）を製造者の取扱説明書に従って使用した。

胚様体（ＥＢ）のトランスフェクション
胚様体を６ウェルプレートで２０１Ｂ７細胞から形成させた。胚様体を１５６×ｇでの遠心分離によって採取し、上清を除去した。この胚様体を、ＲｅｐｒｏＦＦ培地に懸濁し、そしてトランスフェクションした。胚様体を２ｍＬのＲｅｐｒｏＦＦに懸濁し、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤとともに、１．０μｇのｐＥＢＮＫ／ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ及び１．０μｇのｐＥＢＮＫ／Ｃｈｅｒｒｙ−Ｈｙｇでトランスフェクションした。

メトリディアルシフェラーゼ及び分泌型アルカリホスファターゼアッセイ
９６ウェルプレートでは、ウェルあたり５０μＬの培地で培養した２０１Ｂ７細胞に１００ｎｇのｐＭｅｔＬｕｃ２−レポーターをトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞はメトリディアルシフェラーゼを前記培地中に分泌する。トランスフェクション後、培地を５０μＬのＲｅｐｒｏＦＦで毎日交換した。メトリディアルシフェラーゼの活性を、製造者の取扱説明書に従ってＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｌｏｗ分泌型ルシフェラーゼレポーターアッセイ（クロンテック）を用いて測定した。ルシフェラーゼ活性をモニターするために前記培地を毎日交換した。ルシフェラーゼ活性は、Ｇｅｎｅ Ｌｉｇｈｔ（ＧＬ−２００Ａ）（マイクロテック社、船橋）を用いて測定した。トランスフェクション効率をモニターするために、ｐＳＥＡＰ２対照ベクター（クロンテック）を、ｐＭｅｔＬｕｃ２−レポーター又はｐＥＢＭｕｌｔｉ／Ｍｅｔ−Ｈｙｇの１０％でトランスフェクションした。転写活性は、製造者の取扱説明書に従って分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）化学発光キット（クロンテック）及びＧｅｎｅ Ｌｉｇｈｔを用いて測定した。ルシフェラーゼ活性は、前記メトリディアルシフェラーゼ活性を前記ＳＥＡＰ活性で除算して算出した。

ＥＧＦＰ及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒを発現する細胞の選択
懸濁培養法を用いて、２０１Ｂ７細胞に対してＦｕＧＥＮＥ ＨＤを用いて１．０μｇのｐＥＢＮＫ／ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ及び１．０μｇのｐＥＢＮＫ／Ｃｈｅｒｒｙ−Ｈｙｇをトランスフェクションした後、１０μｍｏｌ／ＬのＹ−２７６３２を添加した６ウェルプレートで培養した。Ｇ４１８（２００μｇ／ｍＬ）及びハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）を、トランスフェクション後４日に添加した。Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢを、インキュベーション後２日に培地から除去した。

画像解析
ＩｍａｇｅＪ １．４２ｑ（アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）を画像解析で使用した。画像の２０１Ｂ７細胞の領域を輪郭化し、その面積を測定した。ソフトウェアでＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒのシグナル面積を自動的に測定した。この画像を、赤色、緑色及び青色の波長帯域に分離した。この赤色の波長帯域（ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ）をさらなる解析のために選定した。ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ陽性細胞の百分率を算出するために、ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒシグナルの面積を、上記輪郭化された関心領域の面積で除算した。

統計解析
一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、ＪＭＰ １０．０．２ソフトフェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｊａｐａｎ株式会社、ノースカロライナ州ケーリー）で行った。ｐ値が０．０５未満の場合に、統計学的に有意とした。チューキー−クレーマー（Tukey-Kramer）検定を対の統計学的有意なデータの研究に適用した。

結果
ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ、リポフェクタミンＬＴＸ、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ及びＴｒａｎｓＩＴ−２０２０のトランスフェクション試薬について比較することにより、トランスフェクションの最も効率的な試薬を同定した。接着細胞及び懸濁された細胞におけるメトリディアルシフェラーゼの活性を分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の活性で除算して、相対ルシフェラーゼ活性によって比較した。トランスフェクション効率における細胞濃度の影響を比較するために、９６ウェルプレートに１．８×１０^５及び９．０×１０^５細胞／ウェルで細胞を播種した。実験を３回繰り返した。ＦｕＧＥＮＥ ＨＤを用いる細胞トランスフェクションの懸濁培養法が、１．８×１０^５細胞／ウェル（図１Ａ）及び９．０×１０^５細胞／ウェル（図１Ｂ）の両方の細胞濃度で最も効率的であった（Ｐ＜０．０５）。１．８×１０^５細胞／ウェル（図１Ａ）で、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤを用いる懸濁培養法又は接着培養法、及び、ＬＴＸを用いる接着培養法は、より高い相対ルシフェラーゼ活性を示した（Ｐ＜０．０５）。９．０×１０^５細胞／ウェル（図１Ｃ）での、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ及びＬＴＸを用いる懸濁培養法又は接着培養法が、最高効率をもたらした（Ｐ＜０．０５）。さらなる研究のために、９．０×１０^５細胞／ウェルで、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ又はリポフェクタミンＬＴＸを用いる懸濁培養法を選択した。

相対ルシフェラーゼ活性の経時的な変化の検討を、エピソーマルベクターの発現期間を決定するために実施した（図１Ｃ）。ｐＥＢＭｕｌｔｉ／Ｍｅｔ−Ｈｙｇ（１００ｎｇ）を、ｐＳＥＡＰ２対照ベクター（１０ｎｇ）とともに、懸濁培養法を用いて９６ウェルプレートの２０１Ｂ７細胞（１．８×１０^５細胞／ウェル）にトランスフェクションした。相対ルシフェラーゼ活性はトランスフェクション後４日でピーク活性に達し、エピソーマルベクターでトランスフェクションした遺伝子の発現レベルがピークに達したことをも示した。相対ルシフェラーゼ活性は、リポフェクタミンＬＴＸよりもＦｕＧＥＮＥ ＨＤでのトランスフェクションでより高かった（Ｐ＜０．０５）。したがって、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤを用いる懸濁培養法を、さらなる研究で使用した。

２０１Ｂ７細胞を顕微鏡下で試験した後、Ｇ４１８又はハイグロマイシンＢを、これらの至適濃度を決定するために培地に添加した。２０１Ｂ７細胞は、いずれのベクターでもトランスフェクションされていない。インキュベーション７日後、全ての２０１Ｂ７細胞に対して、Ｇ４１８（２００μｇ／ｍＬ）又はハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍＬ）処理によって傷害（選択圧）が与えられた。これらの濃度を、トランスフェクションした細胞の後の選択で使用した（図２）。

懸濁培養法を用いて、２０１Ｂ７細胞（４．５×１０^５細胞／ウェル）を、６ウェルプレートで、リポフェクタミンＬＴＸ又はＦｕＧＥＮＥ ＨＤを用いてｐＥＢＮＫ／ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ及びｐＥＢＮＫ／Ｃｈｅｒｒｙ−Ｈｙｇをトランスフェクションした（図３）。細胞の小集団は、ＥＧＦＰ及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒに対して陽性であった。ＥＧＦＰ及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ由来のシグナルが同一の細胞で観察された。Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢは、トランスフェクション後４日の、ルシフェラーゼ活性がピークに達する日に添加された（図１Ｃ）。顕著な変化は、Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢの１日間のインキュベーション後に全く観察されなかった。インキュベーション２日後、全ての生存細胞はＥＧＦＰ及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒを発現し、２日間のＧ４１８及びハイグロマイシンＢのインキュベーションが、トランスフェクションした細胞の選択に十分であることを示した。Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢは、トランスフェクション後６日に培地から除去された。ＥＧＦＰ及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒのシグナル強度は、トランスフェクション後１１日に減弱した。

図３での同一実験の写真を、薬剤選択マーカーを１００％発現している細胞を得るための、Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢでのインキュベーション期間を決定するために解析した。Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢでの２日間のインキュベーション後（トランスフェクション後６日）、前記細胞の１００％がＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒに対して陽性であった（図４）。前記細胞は、図３に基づいてＥＧＦＰ及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒを同時に発現させたため、ＣｈｅｒｒＰｉｃｋｅｒを解析した。細胞をトランスフェクション後１１日に観察すると、この割合は減少していた。Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢでの２日間のインキュベーションは、薬剤選択マーカーを発現する細胞の選択に適切であることが示された。

次に、２０１Ｂ７細胞からの胚様体の形成の最適な方法を検討するために、２０１Ｂ７細胞から胚様体を形成させるための異なる方法を実験した（図５）。胚様体のサイズ及び形状を同様に解析した。１．６×１０^５細胞／ｍＬの細胞濃度の細胞を、９．９ｒｐｍ（図５Ａ）及び２．５ｒｐｍ（図５Ｂ）で回転する６ウェルプレートで胚様体を形成させるために培養した。胚様体のサイズ及び形状を解析するために胚様体の長さ及び幅を測定した（図５Ｃ）。胚様体は、１．６×１０^３細胞／ウェルの細胞濃度で播種された細胞からは形成されなかった。最大数の胚様体が、１０ｃｍの組織培養ディッシュ及びペトリ皿に播種された細胞から形成された（Ｐ＜０．０５）（図５Ｄ）。これらの結果は、５ｍＬの細胞懸濁液でより多くの細胞を培養した結果と推測された。胚様体の形成効率は、形成された胚様体の個数を、培養された細胞数で除算して算出された（図５Ｅ）。胚様体の形成は、他のプレート／ディッシュのいずれと比較して６ウェルプレート及び６ｃｍディッシュで最も効率的であった（Ｐ＜０．０５）。９．９ｒｐｍでの回転は、胚様体の形成の促進において、２．５ｒｐｍでの回転よりもより効率的であった。ディッシュ／プレートのいずれのタイプにおいても、１．６×１０^５細胞の細胞濃度で播種された細胞から作製された胚様体は、９．９ｒｐｍよりも２．５ｒｐｍでより大きかった（図５Ｆ）。低回転速度が胚様体の形成により効果的であることが示された。

胚様体の形状を解析するために、幅と長さの割合を算出した（図５Ｇ）。完全に丸い胚様体は１．０の割合である。この割合は、プレート／ディッシュ、細胞濃度、又は、回転速度に依存した有意な相違を示さなかった。

次に、胚様体が２重トランスフェクションした遺伝子を発現できるかについて検討した。懸濁培養法を用いて、４．３×１０^５細胞／ウェルの細胞濃度の２０１Ｂ７細胞に対して、６ウェルプレートで、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤを用いて１．０μｇのｐＥＢＮＫ／ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ及び１．０μｇのｐＥＢＮＫ／Ｃｈｅｒｒｙ−Ｈｙｇをトランスフェクションした。Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢを、トランスフェクション後４日に添加した。生存する２０１Ｂ７細胞をアキュターゼを用いて採取し、１２ウェルプレートで、９．９ｒｐｍで１時間、回転培養に供した（図６Ｂ、Ｄ及びＦ）。Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢでの選択で十分な細胞を得られなかったため、１２ウェルプレートを使用した。トランスフェクションしていない対照２０１Ｂ７細胞を、１２ウェルプレートで、９．９ｒｐｍで１時間、回転培養に供した（図６Ａ、Ｃ、Ｅ）。胚様体の形成が白色光下で観察された（図６Ａ、Ｂ）。トランスフェクションしていない胚様体は、ＥＧＦＰ（図６Ｃ）又はＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ（図６Ｅ）を発現しなかった。一方、ｐＥＢＮＫ／ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ及びｐＥＢＮＫ／Ｃｈｅｒｒｙ−Ｈｙｇをトランスフェクションした胚様体は、ＥＧＦＰ（図６Ｄ）及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ（図６Ｆ）の両方を発現した。

次に、トランスフェクションが胚様体で起こった領域の選択、及び、トランスフェクションされた部分を選択することが可能であるかについて検討した。胚様体に、ｐＥＢＮＫ／ＥＧＦＰ−Ｎｅｏ及びｐＥＢＮＫ／Ｃｈｅｒｒｙ−Ｈｙｇをトランスフェクションし、Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢでの選択に供した。胚様体を、トランスフェクション後に白色光下で観察した（図７Ａ）。ＥＧＦＰ（図７Ｂ）及びＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ（図７Ｃ）シグナルは胚様体の表面で観察された。胚様体は、Ｇ４１８及びハイグロマイシンＢの２日間のインキュベーション後に完全に死滅した（図７Ｄ）。胚様体の表面細胞だけがトランスフェクションされ、内部細胞にトランスフェクションすることは困難であることをこれらのデータは示した。

総括
さまざまな試薬でのベクターのトランスフェクションの操作は簡単である。ベクターのトランスフェクションで大きく制限されることの１つは、低いトランスフェクション効率である。本発明では、初めに、ｉＰＳ細胞でより高いトランスフェクション効率を達成する方法を確立するために、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ、リポフェクタミンＬＴＸ、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ及びＴｒａｎｓＩＴ−２０２０の試薬を比較した。トランスフェクションは、典型的に、プレート又はディッシュで増殖し付着している細胞で実施される。しかし、解離細胞及び懸濁細胞でのアデノウイルスベクターの導入は、接着細胞よりもより効率的であることが示されている（非特許文献３）。接着培養法を用いて、アデノウイルスベクターは、ｉＰＳ細胞コロニーの周縁部に導入される（非特許文献３）。本発明者は、接着培養法及び懸濁培養法を比較した。上記の結果は、非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬であるＦｕＧＥＮＥ ＨＤトランスフェクション試薬を用いる懸濁培養法が最も効果的であることを示した。特に、ＦｕＧＥＮＥは、エレクトロポレーションの場合のように、同一のトランスフェクション効率を達成する（非特許文献１９）。したがって、懸濁培養法を用いてのＦｕＧＥＮＥ ＨＤでのトランスフェクションが、ｉＰＳ細胞にベクターを導入するのに最も適しているとの結論を得た。

エピソーマルベクターは従来のベクターと異なり、エピソーマルベクターを娘細胞に伝達する。上記結果は、エピソーマルベクターの発現をトランスフェクション後１１日に検出できることを示した。エピソーマルベクターのもう１つのメリットは、２種以上の外来遺伝子の安定なトランスフェクションを達成できることである。従来のベクターを用いる場合、安定なトランスフェクションされた細胞は１つの遺伝子を発現する（非特許文献２０）。ｉＰＳ細胞を分化した細胞タイプに分化させるのに、複数の遺伝子を導入することが必要である。上記の実験結果は、安定な多重トランスフェクションがエピソーマルベクターで可能であることを明らかにした。標準的な方法を用いると、抗生物質での選択で２週間必要である（非特許文献２０、２３）。対照的に、上記の結果では、安定なトランスフェクション細胞を得るのに６日間しか要しない。エピソーマルベクターが、従来のベクターよりも短時間で安定な多重トランスフェクションを可能にすることを上記結果は示した。

増殖因子の存在下で、胚様体の形成はｉＰＳ細胞の分化を促進する（非特許文献２１、及びGreenhough Sら、Cell Reprogram.15:9-14；2013）。胚様体が分化に不可欠な転写因子を発現する場合に、標的細胞タイプがより効率的に獲得される。エピソーマルベクターが、胚様体を形成しているｉＰＳ細胞において、２種以上のトランスフェクションする遺伝子を発現できることを上記の結果は示した。また、胚様体はその表面のみでトランスフェクションされるため、ｉＰＳ細胞に胚様体の形成前に目的とする外来遺伝子をトランスフェクションすることが推奨される。

結論として、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤを用いることによるエピソーマルベクター構築物のトランスフェクションと回転培養法によるトランスフェクション細胞の培養が、ｉＰＳ細胞のための最も適切な方法であった。さらに、エピソーマルベクターは、標的とする転写因子をコードする外来遺伝子等が導入された胚様体を形成するのに安定な多重トランスフェクションを行うことができる。

Claims (10)

1. ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法であって、
   １）エピソーマルベクターを用いて、ｉＰＳ細胞に外来遺伝子を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションする工程、
   ２）外来遺伝子がトランスフェクションされたｉＰＳ細胞を、薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子を用いて選別する工程、及び
   ３）選別されたｉＰＳ細胞を、非静的な培養方法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
   を含む方法。
2. 前記外来遺伝子が２種以上であり、遺伝子毎に異なる薬剤選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子を組み合わせてエピソーマルベクター構築物を作製することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記外来遺伝子が２種であり、外来遺伝子毎に異なる薬剤選択マーカー及び／又は配列番号７又は８に記載の配列を有するレポーター遺伝子から選択される核酸を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記外来遺伝子が、分化を誘導する転写因子より選ばれることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記転写因子は、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＨＥＸ及びＣ／ＥＢＰαからなる群から選択される２種以上であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 前記非静的な培養方法は回転培養法であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記回転培養法における培養時の回転速度が２．５から９．９ｒｐｍであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記ｉＰＳ細胞の培養は、１．６から１６０×１０^３個／ｍＬの細胞濃度のｉＰＳ細胞の懸濁液を添加して培養することを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
9. 請求項１から８のいずれか１項に記載の方法により製造された前記外来遺伝子が導入された胚様体。
10. ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から成る胚様体に複数の外来遺伝子を発現させる方法であって、
    １）エピソーマルベクターに、
    (i) 外来遺伝子、
    (ii) Ｇ４１８（登録商標）又はハイグロマイシンＢに対する薬剤選択マーカー、及び、
    (iii) ＥＧＦＰをコードする核酸配列（配列番号７）又はＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ（登録商標）をコードする核酸配列（配列番号８）を有するレポーター遺伝子
    の(i)ないし(iii)を組み合わせて組み込んだ複数の種類のエピソーマルベクター構築物を作製する工程、
    ２）複数のエピソーマルベクター構築物を非リポソーム型カチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてｉＰＳ細胞にトランスフェクションすることにより、複数の外来遺伝子をｉＰＳ細胞にトランスフェクションする工程、
    ３） (i)ないし(iii)の組み合わせに対応して、
    Ｇ４１８及び／又はハイグロマイシンＢの添加により薬剤選択マーカーを用いて、及び／又は、
    緑色及び／又は赤色の蛍光を指標としてレポーター遺伝子を用いて、
    前記複数の外来遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞を選別する工程、並びに、
    ４）選別されたｉＰＳ細胞を、１．６から１６０×１０^３個／ｍＬの細胞濃度で、回転速度２．５から９．９ｒｐｍの回転培養法で培養し、胚様体まで増殖させる工程
    を含む方法。