JP2015536682A - 特定の代謝物の細胞内濃度がその野生型に比べて増加した細胞の同定方法であって、細胞の改変が組み換え操作によって達成される同定方法、ならびに特定の代謝物を最適に産生する、その野生型に比べて遺伝的に改変された産生細胞の製造方法、この代謝物の製造方法、およびそれに適した核酸 - Google Patents

Abstract

本発明は、特定の代謝物の細胞内濃度がその野生型に比べて増加した細胞の同定方法であって、細胞の改変が組み換え操作によって達成される同定方法、ならびに特定の代謝物を最適に産生する、その野生型に比べて遺伝的に改変された産生細胞の製造方法、この代謝物の製造方法、およびそれに適した核酸に関する。本発明によると、公知のリコンビナーゼ遺伝子と相同である、リコンビナーゼをコードする遺伝子が、ベクターを介して細胞中に形質転換され、これらの細胞に少なくとも一つの改変された遺伝子Ｇ１〜Ｇｎまたは少なくとも一つの変異Ｍ１〜Ｍｎを含むＤＮＡが細胞中に挿入され、最高の代謝物産生を示す他ならぬその細胞が代謝物センサーを用いて同定される。これらの細胞から、産生増加の原因とされる変異が単離され、遺伝子または変異が取り出され、産生株中に挿入され、それによって産生株は代謝物の産生増加を示す。

Description

本発明は、特定の代謝物の細胞内濃度がその野生型に比べて増加した細胞の同定方法であって、細胞の改変が組み換え操作によって達成される同定方法、ならびに特定の代謝物を最適に産生する、その野生型に比べて遺伝的に改変された産生細胞の製造方法、この代謝物の製造方法、およびそれに適した核酸に関する。

微生物は、数十年前から低分子の産生のために大規模に使用されている。低分子は、例えばアミノ酸（ＥＰ１０７０１３２Ｂ１（特許文献１）、ＷＯ２００８／００６６８０Ａ８（特許文献２））、ヌクレオシドおよびヌクレオチド（ＥＰ２０９７５１２Ｃ１（特許文献３）、ＣＡ２２９７６１３Ｃ１（特許文献４））、脂肪酸（ＷＯ２００９／０７１８７８Ｃ１（特許文献５）、ＷＯ２０１１／０６４３９３Ｃ１（特許文献６））、ビタミン（ＥＰ０６６８３５９Ｃ１（特許文献７））、有機酸（ＥＰ０４５０４９１Ｂ１（特許文献８）、ＥＰ０３６６９２２Ｂ１（特許文献９））または糖（ＥＰ０８６１９０２Ｃ１（特許文献１０）、ＵＳ３６４２５７５Ａ（特許文献１１））のような天然細菌代謝物である。細菌によって産生される低分子は、また、例えば植物に由来する異種遺伝子の発現によって生成されるような分子である。これらは植物活性成分である。これには、例えばタキソール（ＷＯ１９９６／０３２４９０Ｃ１（特許文献１２）、ＷＯ１９９３／０２１３３８Ｃ１（特許文献１３））、アルテミシニン（ＷＯ２００９／０８８４０４Ｃ１（特許文献１４））、およびイソプレノイド、フェニルプロパノイドまたはアルカロイドのクラスに属する他の分子が属する（Ｍａｒｉｅｎｈａｇｅｎ Ｊ、Ｂｏｔｔ Ｍ、２０１２、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０１２．０６．００１（非特許文献１））。一般に、植物起原の分子または分子の前駆体以外に、経済的に関心対象の分子も、微生物を用いて獲得することができる。これには、例えばメタクリラートの製造のためのヒドロキシイソ酪酸（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５３９４（特許文献１５））、プラスチックの製造のためのジアミン（ＪＰ２００９−２８４９０５Ａ（特許文献１６））、または燃料として使用するためのアルコール（ＷＯ２０１１／０６９１０５Ｃ２（特許文献１７）、ＷＯ２００８／１３７４０６Ｃ１（特許文献１８））も属する。

低分子の産生のための微生物として、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、および酵母が適している。適切な細菌は、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ属に属するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、またはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ属に属するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのようなＢａｃｉｌｌｕｓ種、またはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ属に属するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのようなＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ種もしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉのようなＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、またはＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ属に属するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種もしくはＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのようなＹａｒｒｏｗｉａ種、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種である。

コリネバクテリアのうち、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ（ＤＳＭ４４５４９）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ６８７１）、ただし特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ１３０３２）が好ましい。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのいくつかの種は、他の名前でも現況技術により公知である。例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ ＤＳＭ２０１３７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ ＡＴＣＣ１７９６５、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ ＡＴＣＣ１４０２０、およびＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４がそうである。

低分子の生成および産生を達成するために、微生物固有の遺伝子または低分子の合成経路の同種遺伝子もしくは異種遺伝子が発現もしくは増強発現されるか、またはそのｍＲＮＡの安定性が増大される。そのために、遺伝子は、プラスミドもしくはベクターに載せて細胞内に挿入することができるか、または遺伝子は、エピソーム上に存在しうるか、もしくは染色体中に組み込むことができる。細胞固有の染色体によってコードされる遺伝子も、その発現を増大させることができる。これは、例えばプロモーター領域内で染色体に適切な変異を誘発することによって達成される。産物の増加に導く他の変異、例えばｍＲＮＡの安定性、もしくは浸透圧安定性、ｐＨ変動に対する耐性に影響する変異、または機能が不明であるが産物生成に有利に作用する遺伝子も、染色体に導入することもできる。また、同種遺伝子または異種遺伝子も、染色体中に組み込まれるか、または染色体中に複数のコピーで存在するように組み込まれる。

ゲノム中への変異または遺伝子の標的化組み込みは、制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡリガーゼを利用した、ＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えによって製造されるプラスミドの構築を必要とする。染色体変異を標的化導入するための全体的な手順は、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ置換を達成するための以下の段階、すなわち置換の成功について試験する段階、および最後に産物生成の増加について試験する段階を含む。これは、図１（左）に模式的に記載された多数の段階Ａ１〜Ａ８を必要とする。この方法は、小さな分子の産生のために使用される多数の細菌に応用される。例は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｓｍａｌｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ ｍｕｌｔｉ−ｐｕｒｐｏｓｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｐＫ１８ ａｎｄ ｐＫ１９： ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ． Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ａ、Ｔａｕｃｈ Ａ、Ｊａｅｇｅｒ Ｗ、Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ Ｊ、Ｔｈｉｅｒ−ｂａｃｈ Ｇ、Ｐｕｅｈｌｅｒ Ａ． Ｇｅｎｅ． １９９４ Ｊｕｌ ２２；１４５（１）：６９〜７３頁（非特許文献２））、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ａｌｌｅｌｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ＣｏｌＥ１−ｔｙｐｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃａｓ−ｓｅｔｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｐｏｒｔａｂｌｅ ｏｒｉＴ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓａｃＢ ｍａｒｋｅｒ． Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ ＨＰ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９２ Ｍａｙ；６（９）：１１９５〜２０４頁（非特許文献３））、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｆａｍｉｌｙ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｇｉｍｐｅｌ Ｍ、Ｂｒａｎｔｌ Ｓ． Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１２ Ｎｏｖ；９１（２）：３１２〜７頁（非特許文献４））、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（Ｎｏｖｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｏｕｂｌｅ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ａｌｌｅｌｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ． Ａｌ−Ｈｉｎａｉ ＭＡ、Ｆａｓｔ ＡＧ、Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ ＥＴ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１２ Ｎｏｖ；７８（２２）：８１１２〜２１頁（非特許文献５））である。

染色体への変異および遺伝子の標的化導入は、プラスミドを製造するために制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡリガーゼを使用しながらＤＮＡ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えすることを必要とする（図１、Ａ１）。そのために必要なプラスミドは、適切な条件で所望の生産体中で複製しないプラスミドである。エレクトロポレーション、化学的または弾道的形質転換による微生物中へのプラスミドの挿入後に（図１、Ａ２）、染色体への組み込みが起こる。組み込みについては、ベクター介在耐性によって選択される（図１、Ａ３）。適切なプラスミドは、例えばｐＢＲＨ１（ＷＯ２００３０７６４５２Ｃ２（特許文献１９））またはｐＷＶ０１（ＵＳ６０２５１９０（特許文献２０））であり、それらは、ＡｚｅｔｏｂａｃｔｅｒまたはＢａｃｉｌｌｕｓにおいて形質転換（図１、Ａ２）後に温度上昇させることによって細胞中でそれ以上複製することができず、その結果、耐性細胞において染色体へのベクターの組み込みが起こる。プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢは、最初からＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのようなＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて複製することができず、その結果、カナマイシン存在下でのみクローンが選択され、その場合、染色体へのベクターの組み込みは相同組み換えによって行われる（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、Ｇｅｎｅ １４５、６９〜７３頁（１９９４）（非特許文献６）（図１、Ａ３）。これらの非複製プラスミドは、ベクターとして、染色体中の遺伝子を定方向変異させるため、プロモーター配列を変異させるため、配列を欠失させるため、または配列を置換するため、または染色体中に新しい遺伝子を導入するために役立つ。この方法は、プラスミドをｉｎ ｖｉｔｒｏで個別に構築しなければならないので、労力を要する。抗生物質耐性についての選択または前記の温度上昇のような適切な選択方法を経て、まず、置換されるべき配列と一緒にプラスミドを染色体中に組み込むことが実現され、次の段階で、再び染色体からのプラスミドの欠失が達成されるので、さらに労力を要する（図１、Ａ４）。次に、後続の試験、通常はＰＣＲ増幅によって、置換されるべき配列が所望のように実際に染色体中に残っているかどうかをようやく試験することができる（図１、Ａ５）。そのように、個別のクローンが構築され、そのクローンが続いて培養され（図１、Ａ６）、その産物が定量され（図１、Ａ７）、そのようにして、場合により改良された生産体が得られる（図１、Ａ８）。微生物生産体を獲得するための、このプラスミド構築および相同組み換えの技法は、様々に、例えばＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥ．ｃｏｌｉにおいて対立遺伝子置換または欠失を達成するために応用されている（ＵＳ８，２９３，５１４（特許文献２１）；ＵＳ８，２５７，９４３（特許文献２２）；ＵＳ８，２１６，８２０（特許文献２３）；ＷＯ２００８／００６６８０Ａ８（特許文献２）；ＥＰ２３８６６５０Ｃ１（特許文献２４））。

最近、標的化ゲノム変異のさらなる手法として、いわゆる「組み換え操作」が導入されている。変異を導入することは、プラスミドを使用した変異の組み込みよりもはるかに少ない段階を必要とする（図１、右、Ｂ１〜Ｂ２）。組み換え操作は、染色体ＤＮＡと外部から供給されたＤＮＡとの間の相同組み換えを引き起こすファージ遺伝子またはプロファージ遺伝子を使用する。このＤＮＡは、最も簡単な場合、商業的な合成１本鎖ＤＮＡとして使用される。ＰＣＲを用いて増幅された２本鎖ＤＮＡも使用することができる。適切なファージ遺伝子またはプロファージ遺伝子が存在する場合、この手法は、ほんの少数の段階しか必要としない。もちろん欠点は、この手法が、他の変異を認識することができないので、例えば抗生物質耐性の導入のような、主として選択培地上での成長を可能にする変異の導入に限定されることである。したがって、迅速な作製のために産物生成微生物に直接適用することは、非常に限られており、これまでにＥ．ｃｏｌｉおよび産物リコペンだけについて記載されている（Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｗａｎｇ ＨＨ、Ｉｓａａｃｓ ＦＪ、Ｃａｒｒ ＰＡ、Ｓｕｎ ＺＺ、Ｘｕ Ｇ、Ｆｏｒｅｓｔ ＣＲ、Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００９；４６０（７２５７）：８９４〜８頁（非特許文献７））。この特別な場合では、着色したリコペンに基づきコロニーの色により産物生成を推測することができた。他の生物および例えばアミノ酸または他の有機酸のような他の産物について、産物生成増加の直接認識は、これまでのところ不可能である。さらなる欠点は、組み換え操作が、Ｅ．ｃｏｌｉ、ならびにＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのような非常に限られた数の他の微生物に限定されることである。

さらなる一問題は、これまでに、組み換え操作の直後に産物生成微生物を大きな細胞集団中から同定し、そのような細胞集団から単離するために一般的なシステムがないということにある。これまでに組み換えの際に適用されたペトリ皿上での選択手法は、言及したように、非常に特別な適用に限られ、さらにまたペトリ皿上に得られる組み換え体の数が限られ、そのことが、その方法を大きな組み換え体ライブラリーのスクリーニングに不適切にしている。

組み換え操作は、ファージまたはプロファージに由来するタンパク質によって仲介される相同組み換えに基づく。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉについて２種の相同システム、すなわちＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ、ならびにλバクテリオファージのＲｅｄ−γ、Ｒｅｄ−βおよびＲｅｄ−αからなるｒｅｄオペロンが公知である。両方のシステムは、２種の異なるＤＮＡ分子の間で自由選択可能なＤＮＡセグメントの置換を可能にする。ＤＮＡの置換は、目的断片に隣接する３０〜１００塩基対長の２個の相同（類似または同一）領域にわたり行われる。染色体変異を導入するために、変異を担持するＤＮＡ分子が１本鎖として商業的に合成され（図１、Ｂ１）、タンパク質Ｒｅｄ−βを発現するＥ．ｃｏｌｉ中に挿入される。挿入されたＤＮＡ分子と染色体との間の相同性のせいで、Ｒｅｄ−βタンパク質によって配列の組み換えおよび置換が仲介される。このように、Ｅ．ｃｏｌｉの染色体のｇａｌＫ遺伝子における変異が修正される。無傷ｇａｌＫ遺伝子だけがガラクトースを利用可能であるので、成長によって組み換えクローンが、ペトリ皿上のコロニーとして選択される（図１、Ｂ２）（Ｒｅｋｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ： ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ、ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ． Ｓａｗｉｔｚｋｅ ＪＡ、Ｔｈｏｍａｓｏｎ ＬＣ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｎ、Ｂｕｂｕｎｅｎｋｏ Ｍ、Ｄａｔｔａ Ｓ、Ｃｏｕｒｔ ＤＬ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２００７；４２１：１７１〜９９頁（非特許文献８））。同様に、耐性遺伝子を導入するか、または対応する変異を修正することができ、それによって、組み換え操作が成功した後に再び成長について選択することができる。これは、また、クロラムフェニコール、ヒグロマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリンまたはスペクチノマイシンに対する耐性をコードする遺伝子を用いて実施することができる（Ｒｅｋｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ： ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ、ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ． Ｓａｗｉｔｚｋｅ ＪＡ、Ｔｈｏｍａｓｏｎ ＬＣ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｎ、Ｂｕｂｕｎｅｎｋｏ Ｍ、Ｄａｔｔａ Ｓ、Ｃｏｕｒｔ ＤＬ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２００７；４２１：１７１〜９９頁（非特許文献８））。それで、容易に選択可能な表現型を有する他の遺伝子も、組み換え操作によってＥ．ｃｏｌｉの染色体中に挿入するか、または染色体中で変異させることができる。選択の可能性がない場合、これは、同時選択もしくはコロニーハイブリダイゼーション（Ｒｅｋｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ： ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ、ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ． Ｓａｗｉｔｚｋｅ ＪＡ、Ｔｈｏｍａｓｏｎ ＬＣ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｎ、Ｂｕｂｕｎｅｎｋｏ Ｍ、Ｄａｔｔａ Ｓ、Ｃｏｕｒｔ ＤＬ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２００７；４２１：１７１〜９９頁（非特許文献８））、またはクローンのＰＣＲ分析のような様々な技法によっても回避することができるが、そのことは、もちろん追加的な段階を必要とし、染色体の迅速な標的化変異誘発の長所を組み換え操作によって再び台なしにする。そのうえ、それは、極めて高い組み換え頻度を仮定している。さもないと数百種のクローンを個別に試験しなければならないからである。したがって、改良された微生物代謝物生産体を単離するために、クローン培養なしの染色体組み換え操作は、まだ一般に使用することができない。特例は、目立つ赤色コロニーをもたらす微生物産物リコペンである。それで、リコペン生成の増加を達成するために、Ｅ．ｃｏｌｉを用いた反復性多重連続組み換え操作およびペトリ皿上のコロニーの色強度の視覚的質的評価によって２０個の染色体遺伝子座が変異された（Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｗａｎｇ ＨＨ、Ｉｓａａｃｓ ＦＪ、Ｃａｒｒ ＰＡ、Ｓｕｎ ＺＺ、Ｘｕ Ｇ、Ｆｏｒｅｓｔ ＣＲ、Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００９；４６０（７２５７）：８９４〜８頁（非特許文献７））。微生物生産体を開発するための組み換え操作の適用の制約は、微生物により製造された大部分の低分子が、選択できる表現型を有さないことに基づく。

産物検出の現況技術に、個別の細菌における産物生成の増加を検出することができる代謝物センサー（ナノセンサーの名称でも公知である）も属する。そのような代謝物センサーは、細菌または酵母中の低分子代謝物を検出するために転写因子またはＲＮＡアプタマーを使用する。転写因子に基づく公知の代謝物センサーは、例えばｐＳｅｎＬｙｓ、ｐＳｅｎＡｒｇ、ｐＳｅｎＳｅｒ、ｐＳｅｎＯＡＳまたはｐＪＣ１−ｌｒｐ−ｂｒｎＦ−ｅｙｆｐである（ＷＯ２０１１１３８００６（特許文献２５）；ＤＰＡ１０２０１２０１６７１６．４（特許文献２６））。その際、代謝物センサーは、その発現が特定の代謝物の細胞内濃度に依存する自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む。その際、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列の発現の制御は、特定の代謝物の細胞内濃度に依存して転写レベルで行われる。したがって、それぞれの代謝物の細胞内濃度に依存して、多少のｍＲＮＡが生成され、そのｍＲＮＡはリボソーム中で翻訳されて自己蛍光タンパク質を生成することができる。代謝物センサーを含有する微生物は、あらゆる任意の微生物でありうる。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような細菌、酵母または腸内細菌を挙げることができる。

産物生成が増加した細胞を使用するための代謝物センサーの使用は、代謝物の生成が増加した場合に、増加した代謝物が産生されて細胞外に蓄積されるだけでなく、野生型に比べて高い細胞内濃度の代謝物があることに基づく（Ａ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ． Ｂｉｎｄｅｒ Ｓ、Ｓｃｈｅｎｄｚｉｅｌｏｒｚ Ｇ、Ｓｔａｅｂｌｅｒ Ｎ、Ｋｒｕｍｂａｃｈ Ｋ、Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｋ、Ｂｏｔｔ Ｍ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２０１２ Ｍａｙ ２８；１３（５）：Ｒ４０（非特許文献９）；Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｆｕｅｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｏｒｔ ｕｓｉｎｇ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐｓ． Ｄｕｎｌｏｐ ＭＪ、Ｄｏｓｓａｎｉ ＺＹ、Ｓｚｍｉｄｔ ＨＬ、Ｃｈｕ ＨＣ、Ｌｅｅ ＴＳ、Ｋｅａｓｌｉｎｇ ＪＤ、Ｈａｄｉ ＭＺ、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ Ａ． Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ． ２０１１ Ｍａｙ １０；７：４８７（非特許文献１０））。

微生物の変異体ライブラリーから産物生成が増加した変異体を認識し、これらの変異体を、フローサイトメトリーおよび自動分取装置を用いて分取するために、代謝物センサーが記載されているＷＯ２０１１１３８００６（特許文献２５）；ＤＰＡ１０２０１２０１６７１６．４（特許文献２６））。この場合、変異体ライブラリーは、染色体の化学的非特異的（ｕｎｇｅｒｉｃｈｔｅｔ）変異誘発を用いて、または欠陥ポリメラーゼ鎖反応によりプラスミドコード遺伝子に変異を導入することによって製造されていた。本発明は、化学的非特異的変異誘発または欠陥ポリメラーゼ鎖反応による変異誘発に関係しない。

株開発のための従来の技法の欠点は、細胞性遺伝子または染色体に標的化変異を導入するため、同時に、変異の導入後に改良された代謝物生産体をクローン培養（ペトリ皿）なしに細胞懸濁物中から個別の細胞として直接同定するため、およびそれを細胞懸濁物から単離するために利用可能な技法がこれまでにないことである。

ＥＰ１０７０１３２Ｂ１ ＷＯ２００８／００６６８０Ａ８ ＥＰ２０９７５１２Ｃ１ ＣＡ２２９７６１３Ｃ１ ＷＯ２００９／０７１８７８Ｃ１ ＷＯ２０１１／０６４３９３Ｃ１ ＥＰ０６６８３５９Ｃ１ ＥＰ０４５０４９１Ｂ１ ＥＰ０３６６９２２Ｂ１ ＥＰ０８６１９０２Ｃ１ ＵＳ３６４２５７５Ａ ＷＯ１９９６／０３２４９０Ｃ１ ＷＯ１９９３／０２１３３８Ｃ１ ＷＯ２００９／０８８４０４Ｃ１ ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５５３９４ ＪＰ２００９−２８４９０５Ａ ＷＯ２０１１／０６９１０５Ｃ２ ＷＯ２００８／１３７４０６Ｃ１ ＷＯ２００３０７６４５２Ｃ２ ＵＳ６０２５１９０ ＵＳ８，２９３，５１４ ＵＳ８，２５７，９４３ ＵＳ８，２１６，８２０ ＥＰ２３８６６５０Ｃ１ ＷＯ２０１１１３８００６ ＤＰＡ１０２０１２０１６７１６．４ ５，７７０，４０９ ＵＳ５，９９０，３５０ ＵＳ５，２７５，９４０ ＷＯ２００７／０１２０７８ ＵＳ５，８２７，６９８ ＷＯ２００９／０４３８０３ ＵＳ５，７５６，３４５ ＵＳ７，１３８，２６６ ＵＳ７，１４４，７３４ ＵＳ７，６７４，６２１ ＤＰＡ１０２０１２０１７０２６．２

Ｍａｒｉｅｎｈａｇｅｎ Ｊ、Ｂｏｔｔ Ｍ、２０１２、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｂｉｏｔｅｃ．２０１２．０６．００１ Ｓｍａｌｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ ｍｕｌｔｉ−ｐｕｒｐｏｓｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｐＫ１８ ａｎｄ ｐＫ１９： ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ． Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ａ、Ｔａｕｃｈ Ａ、Ｊａｅｇｅｒ Ｗ、Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ Ｊ、Ｔｈｉｅｒ−ｂａｃｈ Ｇ、Ｐｕｅｈｌｅｒ Ａ． Ｇｅｎｅ． １９９４ Ｊｕｌ ２２；１４５（１）：６９〜７３頁 Ａｌｌｅｌｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ＣｏｌＥ１−ｔｙｐｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃａｓ−ｓｅｔｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｐｏｒｔａｂｌｅ ｏｒｉＴ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓａｃＢ ｍａｒｋｅｒ． Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ ＨＰ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９２ Ｍａｙ；６（９）：１１９５〜２０４頁 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｆａｍｉｌｙ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｇｉｍｐｅｌ Ｍ、Ｂｒａｎｔｌ Ｓ． Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１２ Ｎｏｖ；９１（２）：３１２〜７頁 Ｎｏｖｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｏｕｂｌｅ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ａｌｌｅｌｉｃ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｅｎａｂｌｉｎｇ ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ． Ａｌ−Ｈｉｎａｉ ＭＡ、Ｆａｓｔ ＡＧ、Ｐａｐｏｕｔｓａｋｉｓ ＥＴ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０１２ Ｎｏｖ；７８（２２）：８１１２〜２１頁 Ｓｃｈａｅｆｅｒら、Ｇｅｎｅ １４５、６９〜７３頁（１９９４） Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ． Ｗａｎｇ ＨＨ、Ｉｓａａｃｓ ＦＪ、Ｃａｒｒ ＰＡ、Ｓｕｎ ＺＺ、Ｘｕ Ｇ、Ｆｏｒｅｓｔ ＣＲ、Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００９；４６０（７２５７）：８９４〜８頁 Ｒｅｋｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ： ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ、ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ． Ｓａｗｉｔｚｋｅ ＪＡ、Ｔｈｏｍａｓｏｎ ＬＣ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｎ、Ｂｕｂｕｎｅｎｋｏ Ｍ、Ｄａｔｔａ Ｓ、Ｃｏｕｒｔ ＤＬ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２００７；４２１：１７１〜９９頁 Ａ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｇｅｎｏｍｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ ａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｌｅｖｅｌ． Ｂｉｎｄｅｒ Ｓ、Ｓｃｈｅｎｄｚｉｅｌｏｒｚ Ｇ、Ｓｔａｅｂｌｅｒ Ｎ、Ｋｒｕｍｂａｃｈ Ｋ、Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｋ、Ｂｏｔｔ Ｍ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２０１２ Ｍａｙ ２８；１３（５）：Ｒ４０ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｂｉｏｆｕｅｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｏｒｔ ｕｓｉｎｇ ｅｆｆｌｕｘ ｐｕｍｐｓ． Ｄｕｎｌｏｐ ＭＪ、Ｄｏｓｓａｎｉ ＺＹ、Ｓｚｍｉｄｔ ＨＬ、Ｃｈｕ ＨＣ、Ｌｅｅ ＴＳ、Ｋｅａｓｌｉｎｇ ＪＤ、Ｈａｄｉ ＭＺ、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ Ａ． Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ． ２０１１ Ｍａｙ １０；７：４８７ 「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１） Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃＥ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｒａｃ ｐｒｏｐｈａｇｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｒｅｃＴ ｇｅｎｅ． Ｃｌａｒｋ， Ａ．Ｊ．、Ｓｈａｒｍａ， Ｖ．、Ｂｒｅｎｏｗｉｔｚ， Ｓ．、Ｃｈｕ， Ｃ．Ｃ．、Ｓａｎｄｌｅｒ， Ｓ．、Ｓａｔｉｎ， Ｌ．、Ｔｅｍｐｌｉｎ， Ａ．、Ｂｅｒｇｅｒ， Ｉ．、Ｃｏｈｅｎ， Ａ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． （１９９３） Ｈｅｎｄｒｉｘ， Ｒ．Ｗ． （１９９９）． Ａｌｌ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ’ｓ ａ ｐｈａｇｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃ ＵＳＡ ９６： ２１９２〜２１９７頁 Ｒｅｋｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｈａｇｅｓ． ｖａｎ Ｋｅｓｓｅｌ ＪＣ、Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ ＬＪ、Ｈａｔｆｕｌｌ ＧＦ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００８ Ｎｏｖ；６（１１）：８５１〜８５７頁 Ｓｔａｄｅｎ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４、２１７〜２３２頁（１９８６）） Ｍａｒｃｋ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６、１８２９〜１８３６頁（１９８８）） Ｂｕｔｌｅｒ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３９、７４〜９７頁（１９９８）） Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７． Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）： ３３８９〜３４０２頁 「Ｔｈｅ ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｆｉｒｍａ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ （Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ、１９９３） Ｌｉｅｂｌら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ４１： ２５５〜２６０頁（１９９１）） Ｈｙｂａｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ、Ｈｙｂａｉｄ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ、１９９６ Ｔｈｅ ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ、１９９５ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｔａ−ｔｙｐｅ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｕｓｉｎｇ ｐＣＢ４２ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｋｉｍｃｈｉ． Ｅｏｍ ＨＪ、Ｍｏｏｎ ＪＳ、Ｃｈｏ ＳＫ、Ｋｉｍ ＪＨ、Ｈａｎ ＮＳ． Ｐｌａｓｍｉｄ． ２０１２ Ｊａｎ；６７（１）：３５〜４３頁 Ｇｉｒｂａｌ Ｌ、ｖｏｎ Ａｂｅｎｄｒｏｔｈ Ｇ、Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｍ、Ｂｅｎｔｏｎ ＰＭ、Ｍｅｙｎｉａｌ−Ｓａｌｌｅｓ Ｉ、Ｃｒｏｕｘ Ｃ、Ｐｅｔｅｒｓ ＪＷ、Ｈａｐｐｅ Ｔ、Ｓｏｕｃａｉｌｌｅ Ｐ （２００５） Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ａｎｄ ａｌｇａｌ Ｆｅ−ｏｎｌｙ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７１：２７７７〜２７８１頁 Ｐｌａｓｍｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ａｄｄｉｃｔｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ ｔｗｏ ｒｅｌａｔｅｄ ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ ＩｎｃＱ−ｌｉｋｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ． Ｄｅａｎｅ ＳＭ、Ｒａｗｌｉｎｇｓ ＤＥ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００４ Ａｐｒ；１８６（７）：２１２３〜３３頁 Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００６ Ｊｕｌ；７１（４）：４５５〜６２． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｐ４５０ＲｈＦ ｆｒｏｍ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＮＣＩＭＢ ９７８４． Ｎｏｄａｔｅ Ｍ、Ｋｕｂｏｔａ Ｍ、Ｍｉｓａｗａ Ｎ． Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＴＯＬ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｍｔ−２ ｂｙ Ｒｅｗｉｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＸｙｌＲ． ｄｅ Ｌａｓ Ｈｅｒａｓ Ａ、Ｆｒａｉｌｅ Ｓ、ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｖ． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ． ２０１２ Ｏｃｔ；８（１０）：ｅ１００２９６３ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｍａｌｌ ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ． ｄｅ Ｌｉｍａ Ｐｒｏｃｏｐｉｏ ＲＥ、Ａｒａｕｊｏ ＷＬ、Ａｎｄｒｅｏｔｅ ＦＤ、Ａｚｅｖｅｄｏ ＪＬ． Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１１ Ｊａｎ； ３４（１）：１０３〜９頁 Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＲＩＯ−５ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｌａＢＥＳ． Ｂｏｎｎｉｎ ＲＡ、Ｐｏｉｒｅｌ Ｌ、Ｓａｍｐａｉｏ ＪＬ、Ｎｏｒｄｍａｎｎ Ｐ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２０１２ Ｆｅｂ； ５６（２）：１１１６〜９頁 Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ： ａ ｎｅｗ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ［Ｆｅ−Ｆｅ］ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ． Ｓｙｂｉｒｎａ Ｋ、Ａｎｔｏｉｎｅ Ｔ、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ Ｐ、Ｆｏｕｒｍｏｎｄ Ｖ、Ｒｏｕｓｓｅｔ Ｍ、Ｍｅｊｅａｎ Ｖ、Ｂｏｔｔｉｎ Ｈ． ＢＭＣ Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８ Ｓｅｐ １８；８：７３ Ｍｅｎｋｅｌら、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９） ６４： ５４９〜５５４頁 Ａ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｔｉｇｈｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｌａｕｓｂｅｒｇ Ｆ、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ ＡＲ、Ｈｅｙｅｒ Ａ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ、Ｆｒｅｕｄｌ Ｒ． Ｐｌａｓｍｉｄ． ２０１２ ６８（２）：１４２〜７頁 Ｔａｕｃｈら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０４、２７〜４０頁（２００３）） Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｓＤＮＡ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｗａｎｇ Ｙ、Ｗｅｎｇ Ｊ、Ｗａｓｅｅｍ Ｒ、Ｙｉｎ Ｘ、Ｚｈａｎｇ Ｒ、Ｓｈｅｎ Ｑ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１２ Ｊｕｌ；４０（１２）：ｅ９１ Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｒｅｋｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ． ｖａｎ Ｐｉｊｋｅｒｅｎ ＪＰ、Ｂｒｉｔｔｏｎ ＲＡ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１２、４０（１０）：ｅ７６ Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９８３； １６６（４）：５５７〜８０頁 Ｔａｕｃｈ Ａ、Ｋｉｒｃｈｎｅｒ Ｏ、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ Ｂ、Ｇｏｅｔｋｅｒ Ｓ、Ｐｕｅｈｌｅｒ Ａ、Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ Ｊ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｎｉ−ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＧＣ１． Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００２； ４５（５）：３６２〜７頁 Ｓａｃｋ Ｕ、Ｔａｒｎｏｋ Ａ、Ｒｏｔｈｅ Ｇ （編）： Ｚｅｌｌｕｌａｅｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ． Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｕｎｄ ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ Ａｎｗｅｎｄｕｎｇｅｎ ｄｅｒ Ｄｕｒｃｈｆｌｕｓｓｚｙｔｏｍｅｔｒｉｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｋａｒｇｅｒ、２００７、２７〜７０頁 Ｗｈｅｅｌｅｒ、Ｄａｖｉｄ； Ｂｈａｇｗａｔ、Ｍｅｄｈａ （２００７）．「Ｃｈａｐｔｅｒ ９、ＢＬＡＳＴ ＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ」、Ｂｅｒｇｍａｎ、Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｈ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ３９５〜３９６頁、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｔｈｅ Ｅ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＯｄｈＡ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕ−ｔａｍｉｃｕｍ ｈａｓ ｓｕｃｃｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｌｉｐｏｙｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＡｃｅＦ． Ｈｏｆｆｅｌｄｅｒ Ｍ、Ｒａａｓｃｈ Ｋ、ｖａｎ Ｏｏｙｅｎ Ｊ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２０１０； １９２（１９）：５２０３〜１１頁 Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＲｅｃＪ、ＲｅｃＯ、ａｎｄ ＲｅｃＲ ｉｎ ＲｅｃＥＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ Ｋ、Ｈａｎａｄａ Ｋ、Ｉｗａｋｕｒａ Ｙ、Ｉｋｅｄａ Ｈ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００２ Ｓｅｐ；１８４（１７）：４７１５〜２１頁 Ｃｒｅｍｅｒ Ｊ、Ｔｒｅｐｔｏｗ Ｃ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ、Ｓａｈｍ Ｈ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ． Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９８８；１３４（１２）：３２２１〜９頁 Ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ． Ｂｌｏｍｂａｃｈ Ｂ、Ｈａｎｓ Ｓ、Ｂａｔｈｅ Ｂ、Ｅｉｋｍａｎｎｓ ＢＪ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００９ Ｊａｎ；７５（２）：４１９〜４２７頁 Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｃｅｌｌｓ． Ｌｉｅｂｌ Ｗ、Ｂａｙｅｒｌ Ａ、Ｓｃｈｅｉｎ Ｂ、Ｓｔｉｌｌｎｅｒ Ｕ、Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ ＫＨ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． １９８９ Ｄｅｃ；５３（３）：２９９〜３０３頁 Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｌｖＢ−ｉｌｖＮ−ｉｌｖＣ ｏｐｅｒｏｎ． Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ Ｃ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ、Ｓａｈｍ Ｈ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９３ Ｓｅｐ；１７５（１７）：５５９５〜６０３頁 Ｂｉｎｄｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２、１３：Ｒ４０

したがって、小分子の微生物生産体の開発を促進するためのかかる方法を提供し、現況技術の欠点を克服することが、本発明の課題である。

本発明によると、その課題は、請求項１に記載の細胞、並列の請求項６、７および１５に記載の方法、請求項１８に記載のリコンビナーゼ遺伝子、請求項１９に記載のリコンビナーゼ、ならびに請求項２０に記載の核酸によって解決される。

本発明の好都合な変形形態は、従属請求項に示される。

代謝物の産生増加のために、細胞、方法、リコンビナーゼ遺伝子、リコンビナーゼ、同定された遺伝子Ｇ１〜Ｇｎおよび変異Ｍ１〜Ｍｍを用いて、特に迅速な方法で細胞を作製することが、今や可能である。その細胞を用いると、出発細胞に比べて代謝物の産生増加が可能である。

本発明は、これから図および非限定的な例を基に、より詳細に説明される。

（左）本発明の理解のために現況技術による方法の経過、すなわち特定のプラスミドの構築（Ａ１）から、ペトリ皿上での二つの選択段階（Ａ３〜Ａ４）、およびクローン培養（Ａ６）を経て、産生改良の試験（Ａ７〜Ａ８）までの段階Ａ１〜Ａ８による染色体変異の製造原理、ならびに（右）合成ＤＮＡ（Ｂ１）およびペトリ皿上での耐性クローンまたはペトリ皿上での着色クローン（Ｂ２）の選択に基づく組み換え操作による染色体変異の製造原理を示す図である。 本発明による低分子の生物工学的産生に関連する微生物のための組み換え操作の開発を示す図である。配列分析によって、リコンビナーゼが同定され（ｃ１）、それが適切な発現ベクター中に組み込まれる（ｃ２．１）。宿主において高いリコンビナーゼ発現を引き起こし、宿主にＤＮＡ取り込み能を与える段階の後に（ｃ２．２〜ｃ２．４）、ＤＮＡが１本鎖または２本鎖ＤＮＡとして添加され（ｃ２．５）、試験株の適切な表現型について選択される（ｃ２．６）。最後に、組み換え操作についての全体試験（ｃ２）においてさらにその最適化（ｃ３）が行われる。 微生物代謝物生産体を単離するための代謝物センサーによるサイトメトリー性産物分析および既存の代謝物生産体を改良するためのそのように同定された変異のさらなる利用と連結した本発明の組み換え操作を示す図である。リコンビナーゼを発現し、代謝物センサーを有するセンサープラスミドを含む細胞にＤＮＡが添加される（Ｃ１）。細胞中では、リコンビナーゼによって、変異Ｍ１〜Ｍｍを有する変異型遺伝子Ｇ１〜Ｇｎを有するＤＮＡの添加後の組み込みが行われる。高められた産物生成を有し、したがって高められた蛍光を有する細胞が、高スループットフローサイトメトリー選択（ＦＡＣＳ）を用いて単離され（Ｃ２）、それで、改良された代謝物生成に導く変異を同定するための細胞を供給する（Ｃ３）。場合によりこれらの細胞は、すでに改良された代謝物生産体でもある。公知の方法を用いて、段階Ｃ３から生じた細胞のゲノムまたはプラスミドは、遺伝子Ｇ１〜Ｇｎにおける変異Ｍ１〜Ｍｍの同定のために配列決定されるが（Ｃ３．Ａ）、それは、さらなる改良のためにこれらの変異を既存の代謝物生産体に公知の方法（Ｃ３．Ｂ）により導入するためである（Ｃ３．Ｃ）。

以下に、本発明をその全般的な形態で説明する。

本発明により、リコンビナーゼをコードする遺伝子配列および追加的に代謝物センサーをコードする遺伝子配列を含む、その野生型に比べて遺伝的に改変された細胞が提供される。

細胞は、とりわけ微生物、好ましくは細菌、特にＣｏｒｙｎｅｂａｋｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｋｔｅｒｉｕｍ属またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特に好ましくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。

リコンビナーゼをコードする遺伝子配列は、所望の微生物において公知のリコンビナーゼに比べて改良された機能性を有する配列でありうる。細胞外から添加されたＤＮＡを細胞固有のＤＮＡと組み換えるタンパク質をコードする、リコンビナーゼをコードする遺伝子配列が対象である。機能性に関する試験は、図２に概略的に図示されるように実施することができる。配列番号１または配列番号７および９による遺伝子配列が特に適切であることが明らかになった。

リコンビナーゼをコードする遺伝子配列は、ベクター、例えばプラスミドを用いて細胞中に形質転換および発現させることができ、その際、リコンビナーゼが生成される。

その方法に使用されるリコンビナーゼは、細胞外から添加されたＤＮＡを細胞固有のＤＮＡと組み換えることによって特徴づけられる。リコンビナーゼは、可能性のあるリコンビナーゼが公知のリコンビナーゼとの配列比較により同定される、例えばメタゲノムのようなより大きな遺伝子プールに由来しうる。さらに、そのような配列比較によって、可能性のあるリコンビナーゼは、既存のデータベースからも同定することもできる。さらにまた、リコンビナーゼ活性が認められるか、またはそのような活性が推定されるタンパク質も、機能的特徴づけによってリコンビナーゼとして認識することができる。好ましくは、リコンビナーゼは、ファージまたはプロファージから単離することができる。それで、リコンビナーゼは、生物工学的に関連する細菌Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ、Ａｚｏａｒｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｅｗａｎｉｅｌｌａ、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびそれぞれ類縁種のプロファージから単離および使用することができる。プロファージＲａｃのリコンビナーゼＲｅｃＴ、またはλファージのリコンビナーゼＢｅｔと相同であるリコンビナーゼが好ましい。Ｅ．ｃｏｌｉプロファージＲａｃ由来のリコンビナーゼＲｅｃＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ λファージ由来のリコンビナーゼＢｅｔ、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒｉｍｕｃｏｓｕｍ由来のリコンビナーゼｒＣａｕ（ｃａｕｒｉ＿１９６２）が特に好ましい。

代謝物センサーをコードする、使用される遺伝子配列は、アミノ酸、有機酸、脂肪酸、ビタミンまたは植物活性成分のような代謝物を認識して蛍光によって可視化するタンパク質をコードするベクター、例えばプラスミドの配列である。蛍光が強いほど、代謝物の細胞内濃度は高い。それによって、遺伝的に未改変の形態に比べて蛍光が増加し、それに伴い産物生成が増加した細胞を同定することができる。

そのように改変された細胞は、変異Ｍ１〜Ｍｍまたは変異型遺伝子Ｇ１〜Ｇｎを担持する外部から供給されたＤＮＡ分子を細胞固有のＤＮＡに組み込むため、およびＤＮＡの組み込みによって引き起こされた特定の代謝物の産生増加を蛍光によって識別し易くするために適切である。その際、代謝センサーは、増大して生成されるべき代謝物の検出に応答するように選択される。

さらに本発明は、特定の代謝物の細胞内濃度がその野生型に比べて増加した細胞を細胞懸濁物中から同定するための方法であって：
ｉ）前記種類の細胞を含む細胞懸濁物を準備する段階、
ｉｉ）少なくとも一つの改変遺伝子Ｇ１〜Ｇｎまたは少なくとも一つの変異Ｍ１〜Ｍｍを含むＤＮＡの添加下での組み換え操作によって細胞を遺伝的に改変して、中の細胞が特定の代謝物の細胞内濃度に関して異なる細胞懸濁物を得る段階、
ｉｉｉ）代謝物センサーを用いた蛍光検出によって、特定の代謝物の細胞内濃度が増加した個別の細胞を細胞懸濁物中から同定する段階
を含む方法を含む。

細胞として、とりわけ微生物、好ましくは細菌、特にＣｏｒｙｎｅｂａｋｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｋｔｅｒｉｅｎ属またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特に好ましくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが使用される。

組み換え操作は、現況技術により公知の方法および特定の明細書部分に例示的であるが非限定的に開示された方法である。とりわけ、リコンビナーゼ遺伝子はプラスミドに載せて細胞中に導入される。特に好ましくは、配列番号１によるリコンビナーゼ遺伝子が細胞中に導入される。

そのために、細胞は、とりわけ配列番号３〜９によるベクター、特に好ましくはプラスミドを用いて形質転換される。

野生型に比べて高い細胞内濃度を生じる代謝物は、例えばアミノ酸、有機酸、脂肪酸、ビタミンまたは植物活性成分でありうる。それは、産生が改良されるべき所望の産物である。

細胞懸濁物は、例えば塩含有水溶液中に存在する、場合により栄養素を含有する細胞でありうる。

組み換え操作による細胞の遺伝的改変では、１本鎖または２本鎖ＤＮＡとしてのＤＮＡ、および合成ＤＮＡまたは細胞から単離されたＤＮＡも使用することができる。ＤＮＡは、５０ｂｐ〜３Ｍｂを含む場合があり、好ましくは、ＤＮＡは５０〜１５０ｂｐ長を有する。ＤＮＡは、遺伝子工学的に改変されうる生産体のタンパク質またはタンパク質の部分をコードしうる。同様に、遺伝子工学的に改変されうる生産体のプロモーター領域または未知機能の領域と相同であるＤＮＡを使用することができる。さらにまた、ＤＮＡは、遺伝子工学的に改変されうる生産体以外の生物由来の遺伝子または調節エレメントをコードしうる。

特定のＤＮＡ分子以外にＤＮＡ分子の混合物も使用することができるが、これは、例えば大きな遺伝的多様性の発生に有利である。

その際、挿入は、染色体またはプラスミド中に行うことができる。

代謝物センサーを用いた蛍光検出法は、当業者に公知である。

一形態において、本発明は、その野生型に比べて遺伝的に改変された、特定の代謝物の最適に産生する産生細胞を製造するための方法であって：
ｉ）前記種類の細胞を含む細胞懸濁物を準備する段階；
ｉｉ）少なくとも一つの改変遺伝子Ｇ１〜Ｇｎまたは少なくとも一つの変異Ｍ１〜Ｍｍを含むＤＮＡの添加下での組み換え操作によって細胞を遺伝的に改変して、中の細胞が特定の代謝物の細胞内濃度に関して異なる細胞懸濁物を得る段階；
ｉｉｉ）代謝物センサーを用いた蛍光検出によって、特定の代謝物の細胞内濃度が増加した個別の細胞を細胞懸濁物中から同定する段階；
ｉｖ）細胞懸濁物から同定後の細胞を分離する段階；
ｖ）同定および分離後の細胞中から、特定の代謝物の細胞内濃度増加の原因である遺伝的に改変された遺伝子Ｇ１〜Ｇｎまたは変異Ｍ１〜Ｍｍを同定する段階；
ｖｉ）特定の代謝物を最適に産生する、その野生型に比べて遺伝的に改変された産生細胞であって、ゲノムが少なくとも一つの遺伝子Ｇ１〜Ｇｎおよび／または少なくとも一つの変異Ｍ１〜Ｍｍを含む産生細胞を製造する段階
を含む方法にも関する。

特定の代謝物の細胞内濃度がその野生型に比べて増加した細胞を細胞懸濁物中から同定するための方法と同じ関連が、細胞、組み換え操作、代謝物、細胞懸濁物および蛍光検出方法、ベクター、段階ｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）の細胞中に挿入されるべきＤＮＡにあてはまる。

同定後の細胞の分離は、公知の方法を用いて行うことができる。

野生型に比べて改変された産生細胞の製造のために、産生増加の同定のために使用された細胞であって、代謝物の産生増大を蛍光増加によって示す細胞が単離される。

これらの細胞において、一つまたは複数の遺伝子Ｇ１〜Ｇｎ中の一つまたは複数の変異Ｍ１〜Ｍｍが同定される。これは、遺伝子Ｇ１〜Ｇｎおよび／または変異部位Ｍ１〜Ｍｍ中の目的遺伝子のＰＣＲ増幅に続く配列決定によって行うことができる。同様に、ゲノムの配列決定を行うことができる。

続いて、同定後の産物増大性変異Ｍ１〜Ｍｍおよび／または遺伝子Ｇ１〜Ｇｎが産生細胞中に移入される。これは、現況技術により当業者に公知の方法を用いて行うことができる。

記号Ｇ１〜Ｇｎは、組み換え操作の枠内で細胞に加えられた、代謝物の特に良好な産生増大の原因となる遺伝子Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３〜Ｇｎの少なくとも一つを指す。

記号Ｍ１〜Ｍｍは、工程段階ｉｉ）で細胞に添加され遺伝子Ｇ１〜Ｇｎ中に含まれる、今度は代謝物の特に良好な産生増大の原因となる変異Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３〜Ｍｍを指す。

これらの遺伝子またはこれらの変異は、細胞から単離され産生細胞のゲノム中に公知の方法により挿入される。その際に、一つまたは複数の遺伝子または変異は、産生細胞の染色体ＤＮＡまたはプラスミド中に挿入することができる。

これらの遺伝子または変異は、とりわけ所望の代謝物の生合成経路または場合によりそれに関係する代謝過程の段階のタンパク質をコードするＤＮＡセグメントである。また、産物生成のための遺伝子のプロモーター活性または遺伝子のｍＲＮＡの安定性が促進的に影響されるＤＮＡも、対象でありうる。

とりわけ、Ｌ−リシンの産生を増大させるために適した、配列番号３３〜配列番号４４の配列による遺伝子が見いだされた。

さらに本発明は、
ａ）特定の代謝物を最適に産生する、その野生型に比べて遺伝的に改変された産生細胞を上記の方法によって製造する工程段階、
ｂ）栄養素を含む培養培地中で、産生細胞が栄養素から特定の代謝物を産生する条件で細胞を培養する工程段階
を含む、代謝物の製造方法に関する。

このやり方で製造された代謝物は、培養培地中に分泌され、培養培地から単離することができる。

使用されるべき培養培地または発酵培地は、それぞれの株の要求を適切なやり方で満たさなければならない。適切な培養培地は、当業者に公知である。様々な微生物の培養培地の説明は、ハンドブック「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）（非特許文献１１）に収載されている。培養培地および発酵培地、または培地の概念は、相互に交換できる。

炭素源として、糖および炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、サトウダイコンまたはサトウキビ加工品からのサッカロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物およびセルロースなど、油および脂肪、例えばダイズ油、ヒマワリ油、ラッカセイ油およびヤシ油など、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸など、アルコール、例えばグリセリン、メタノールおよびエタノールなど、ならびに有機酸、例えば酢酸または乳酸などを使用することができる。

窒素源として、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、きな粉および尿素などの窒素含有有機化合物または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機化合物を使用することができる。窒素源は、単独で、または混合物として使用することができる。

リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を使用することができる。

培養培地は、さらに、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のように、成長に必要な塩、例えば金属の塩化物または硫酸塩の形態で、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムおよび鉄などを含まなければならない。最後に、アミノ酸、例えばホモセリンおよびビタミン、例えばチアミン、ビオチンまたはパントテン酸などの必須成長物質を上記物質に追加的に使用することができる。

前記の成分は、独特なアプローチの形で培養物に加えるか、または培養中に適切な方法で供給することができる。

培養物のｐＨ制御のために、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水のような塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物が、適切な方法で使用される。ｐＨ値は、一般に、６．０〜８．５、とりわけ６．５〜８の値に調整される。泡の発生を制御するために、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、例えば抗生物質などの適切な選択的作用物質を培地に加えることができる。発酵は、好ましくは好気的条件で実施される。これを維持するために、酸素または例えば空気などの酸素含有混合気体を培養物中に通気される。過酸化水素が濃縮されている液体の使用も可能である。場合により、発酵は、過圧で、例えば０．０３〜０．２ＭＰａの過圧で行われる。培養物の温度は、通常、２０℃〜４５℃、とりわけ２５℃〜４０℃、特に好ましくは３０°〜３７℃である。バッチ法では、培養は、好ましくは、例えばアミノ酸、有機酸、ビタミン、または植物活性成分のような所望の代謝物を獲得するための手段にとって十分な量が生成するまで継続される。この目標は、通常、１０〜１６０時間以内に達成される。連続法では、より長い培養時間が可能である。微生物の活動によって、発酵培地および／または微生物細胞中への代謝物の濃縮（蓄積）に至る。

適切な発酵培地の例は、とりわけ、特許明細書５，７７０，４０９（特許文献２７）、ＵＳ５，９９０，３５０（特許文献２８）、ＵＳ５，２７５，９４０（特許文献２９）、ＷＯ２００７／０１２０７８（特許文献３０）、ＵＳ５，８２７，６９８（特許文献３１）、ＷＯ２００９／０４３８０３（特許文献３２）、ＵＳ５，７５６，３４５（特許文献３３）またはＵＳ７，１３８，２６６（特許文献３４）中にある。

代謝物を製造するための本発明の方法を用いて、例えばアミノ酸、有機酸、ビタミン、炭水化物または植物活性成分を特に効果的に製造することができる。

とりわけ、本方法を用いて、Ｌ−アミノ酸、ヌクレオチドおよび植物活性成分、特に好ましくはＬ−リシンが産生される。

本発明の対象は、また、配列番号１によるリコンビナーゼ遺伝子、ならびに少なくとも７０％、とりわけ８０％、特に好ましくは８５％、および／または９０％の相同性、特に好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するその対立遺伝子である。

本発明の対象は、また、配列番号２によるリコンビナーゼ、および９５％、９６％、９７％、とりわけ９８％または９９％の相同性を有するその相同タンパク質である。

さらに、本発明の構成要素は、特に生産性の高い産生株を得ることができ、かつ本来、変異の同定のための細胞に由来する遺伝子をコードする、配列番号３３〜配列番号４４の配列による核酸である。

以下に、本発明が、特定の明細書部分でより詳細に、しかしながら非限定的に説明される。

リコンビナーゼが同定および使用される方法は、提供された課題を解決するために寄与する。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ、Ａｚｏａｒｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、ＳｈｅｗａｎｉｅｌｌａおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのような生物工学的に関連する細菌についてのリコンビナーゼを同定するために、公知のリコンビナーゼと相同であり、所望の生物において、公知のリコンビナーゼよりも良好な機能が予期または期待されるタンパク質について、ゲノムデータベースが公知の方法により解析される。ゲノムデータベースは自由に利用することができる。それで例えばＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＥＭＢＬ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）のデータベース、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）のデータベース、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のデータベース、またはＰｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＰＩＲ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ）およびＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ、〒４１１−８５４０三島市谷田１１１１、日本）である。

上記データベースは、例えばプロファージＲａｃ由来のＲｅｃＴ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃＥ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｒａｃ ｐｒｏｐｈａｇｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｒｅｃＴ ｇｅｎｅ． Ｃｌａｒｋ， Ａ．Ｊ．、Ｓｈａｒｍａ， Ｖ．、Ｂｒｅｎｏｗｉｔｚ， Ｓ．、Ｃｈｕ， Ｃ．Ｃ．、Ｓａｎｄｌｅｒ， Ｓ．、Ｓａｔｉｎ， Ｌ．、Ｔｅｍｐｌｉｎ， Ａ．、Ｂｅｒｇｅｒ， Ｉ．、Ｃｏｈｅｎ， Ａ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． （１９９３）（非特許文献１２））、λファージ由来のＢｅｔａ（Ｈｅｎｄｒｉｘ， Ｒ．Ｗ． （１９９９）． Ａｌｌ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ’ｓ ａ ｐｈａｇｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃ ＵＳＡ ９６： ２１９２〜２１９７頁（非特許文献１３））、マイコバクテリオファージＣｈｅ９ｃ由来のｇｐ６１またはマイコバクテリオファージＨａｌｏ由来のｇｐ４３（Ｒｅｋｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｈａｇｅｓ． ｖａｎ Ｋｅｓｓｅｌ ＪＣ、Ｍａｒｉｎｅｌｌｉ ＬＪ、Ｈａｔｆｕｌｌ ＧＦ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００８ Ｎｏｖ；６（１１）：８５１〜８５７頁（非特許文献１４））のような、すでに公知のリコンビナーゼと相同であるタンパク質を検索するために使用される（図２、ｃ１）。相同タンパク質についての検索は、公知のアルゴリズムおよび配列解析プログラムを用いて、公的に利用できる公知の方法により、例えばＳｔａｄｅｎ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４、２１７〜２３２頁（１９８６））（非特許文献１５）もしくはＭａｒｃｋ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６、１８２９〜１８３６頁（１９８８））（非特許文献１６）に記載されたように、またはＢｕｔｌｅｒ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３９、７４〜９７頁（１９９８））（非特許文献１７）のＧＣＧプログラムを利用して行われる。

本発明によると、本発明の配列は、そのような配列の作用方式または機能および目的が維持される限り、これらの配列の一つに対して７０％、とりわけ８０％、より好ましくは８５％（核酸配列に関して）または９０％（同じくポリペプチドに関して）を超える、好ましくは９１％、９２％、９３％または９４％を超える、より好ましくは９５％または９６％を超える、特に好ましくは９７％、９８％または９９％を超える（両方の種類の配列に関して）相同性（アミノ酸レベル）または同一性（核酸レベル、自然縮重を除く）を示す配列も含む。本明細書に使用されるような「相同性」（または同一性）という用語は、式Ｈ（％）＝［１−Ｖ／Ｘ］×１００によって定義することができる［式中、Ｈは相同性を意味し、Ｘは比較配列の核酸塩基／アミノ酸の合計数であり、Ｖは、比較配列と異なる、調査配列の核酸塩基／アミノ酸の数である］。いずれにせよポリペプチドをコードする核酸配列という概念を用いて、遺伝コードの縮重に応じて現れる可能性のある全ての配列が含まれる。

配列表に示されたアミノ酸配列との一致率は、現況技術で公知の方法を用いて当業者によって容易に確定されうる。本発明により使用することができる適切なプログラムは、ＢＬＡＳＴＰ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７． Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）： ３３８９〜３４０２頁（非特許文献１８））である。

本発明によると、配列表に示された配列は、前記とハイブリダイゼーションする核酸配列も含む。当業者は、ハイブリダイゼーションの解説書を、とりわけ会社Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ、１９９３）のハンドブック「Ｔｈｅ ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（非特許文献１９）およびＬｉｅｂｌら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ４１： ２５５〜２６０頁（１９９１））（非特許文献２０）から見いだす。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で実施され、すなわちプローブ、例えば遺伝子と相補的なヌクレオチド配列と、目的配列、すなわちプローブで処理されたポリヌクレオチドとが少なくとも７０％同一であるハイブリッドだけが生成される。洗浄段階込みのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが緩衝剤組成、温度および塩濃度の変動によって影響または決定されることが公知である。ハイブリダイゼーション反応は、一般に洗浄段階よりも比較的低いストリンジェンシーで実施される（Ｈｙｂａｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ、Ｈｙｂａｉｄ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ、１９９６）（非特許文献２１）。ハイブリダイゼーション反応のために、例えば５×ＳＳＣ緩衝液に対応する緩衝液を温度約５０℃〜６８℃で使用することができる。その際、プローブは、プローブの配列と７０％未満の同一性を示すポリヌクレオチドともハイブリダイゼーションすることができる。そのようなハイブリッドは安定性が低く、ストリンジェントな条件での洗浄によって除去される。これは、例えば塩濃度を２×ＳＳＣに、場合により続いて０．５×ＳＳＣ（Ｔｈｅ ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ、１９９５）（非特許文献２２）に低下させることによって達成することができ、その際、温度は約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４℃〜６８℃、約６６℃〜６８℃に調整される。とりわけ洗浄段階は、温度約６２℃〜６８℃、好ましくは６４℃〜６８℃または約６６℃〜６８℃、特に好ましくは約６６℃〜６８℃で実施される。場合により、塩濃度を０．２×ＳＳＣまたは０．１×ＳＳＣに対応する濃度に低下させることが可能である。ハイブリダイゼーション温度を５０℃から６８℃まで約１〜２℃刻みで段階的に上昇させることによって、例えば使用されたプローブの配列と少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％〜９５％または少なくとも９６％〜９８％または少なくとも９９％の同一性を有する、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド断片を単離することができる。ハイブリダイゼーションのさらなる解説書は、いわゆる市販のキットの形態で入手可能である（例えば会社Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＤｅｕｔｓｃｈｌａｎｄのＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ、カタログ番号１６０３５５８）。

そのように確定された、リコンビナーゼ遺伝子ｒｅｃＴを含む（配列番号１）および機能的リコンビナーゼｒＣａｕをコードする（配列番号２）Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒｉｍｕｃｏｓｕｍ由来の新しいＤＮＡ配列は、本発明の構成要素である。

同定されたリコンビナーゼは、ベクター中に、例えばプラスミド中にクローニングされ、そのベクターは、組み換えが実施されるべき宿主におけるリコンビナーゼ遺伝子の誘導発現を許す（図２、ｃ２．１）。発現ベクターは、現況技術である。それで、例えばＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのためにベクターｐＣＢ４２を（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｔａ−ｔｙｐｅ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｕｓｉｎｇ ｐＣＢ４２ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｋｉｍｃｈｉ． Ｅｏｍ ＨＪ、Ｍｏｏｎ ＪＳ、Ｃｈｏ ＳＫ、Ｋｉｍ ＪＨ、Ｈａｎ ＮＳ． Ｐｌａｓｍｉｄ． ２０１２ Ｊａｎ；６７（１）：３５〜４３頁（非特許文献２３））、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍのためにｐｔＨｙｄＡを（Ｇｉｒｂａｌ Ｌ、ｖｏｎ Ａｂｅｎｄｒｏｔｈ Ｇ、Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｍ、Ｂｅｎｔｏｎ ＰＭ、Ｍｅｙｎｉａｌ−Ｓａｌｌｅｓ Ｉ、Ｃｒｏｕｘ Ｃ、Ｐｅｔｅｒｓ ＪＷ、Ｈａｐｐｅ Ｔ、Ｓｏｕｃａｉｌｌｅ Ｐ （２００５） Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ａｎｄ ａｌｇａｌ Ｆｅ−ｏｎｌｙ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７１：２７７７〜２７８１頁（非特許文献２４））、ＴｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓのためにｐＴＦ−ＦＣ２を（Ｐｌａｓｍｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ａｄｄｉｃｔｉｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ ｔｗｏ ｒｅｌａｔｅｄ ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ ＩｎｃＱ−ｌｉｋｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ． Ｄｅａｎｅ ＳＭ、Ｒａｗｌｉｎｇｓ ＤＥ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００４ Ａｐｒ；１８６（７）：２１２３〜３３頁（非特許文献２５））、ＡｌｃａｎｉｖｏｒａｘのためにｐＲＥＤを（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００６ Ｊｕｌ；７１（４）：４５５〜６２． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｐ４５０ＲｈＦ ｆｒｏｍ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＮＣＩＭＢ ９７８４． Ｎｏｄａｔｅ Ｍ、Ｋｕｂｏｔａ Ｍ、Ｍｉｓａｗａ Ｎ．（非特許文献２６））、ＢａｃｉｌｌｕｓのためにｐＭＧを（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｆａｍｉｌｙ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｇｉｍｐｅｌ Ｍ、Ｂｒａｎｔｌ Ｓ． Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１２；９１（２）：３１２〜７頁（非特許文献４））、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのためにｐＷＷ０を（Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ Ｓｉｇｎａｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＴＯＬ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｍｔ−２ ｂｙ Ｒｅｗｉｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＸｙｌＲ． ｄｅ Ｌａｓ Ｈｅｒａｓ Ａ、Ｆｒａｉｌｅ Ｓ、ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｖ． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ． ２０１２ Ｏｃｔ；８（１０）：ｅ１００２９６３（非特許文献２７））、ＰａｎｔｏｅａのためにｐＡＧＡを（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｍａｌｌ ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ． ｄｅ Ｌｉｍａ Ｐｒｏｃｏｐｉｏ ＲＥ、Ａｒａｕｊｏ ＷＬ、Ａｎｄｒｅｏｔｅ ＦＤ、Ａｚｅｖｅｄｏ ＪＬ． Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１１ Ｊａｎ； ３４（１）：１０３〜９頁（非特許文献２８））、ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒのためにｐＲＩＯ−５を（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＲＩＯ−５ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ−β−ｌａｃｔａｍａｓｅ ｇｅｎｅ ｂｌａＢＥＳ． Ｂｏｎｎｉｎ ＲＡ、Ｐｏｉｒｅｌ Ｌ、Ｓａｍｐａｉｏ ＪＬ、Ｎｏｒｄｍａｎｎ Ｐ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ２０１２ Ｆｅｂ； ５６（２）：１１１６〜９頁（非特許文献２９））、ＳｈｅｗａｎｉｅｌｌａのためにｐＢＢＲ１−ＭＣＳを（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ： ａ ｎｅｗ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ［Ｆｅ−Ｆｅ］ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ． Ｓｙｂｉｒｎａ Ｋ、Ａｎｔｏｉｎｅ Ｔ、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ Ｐ、Ｆｏｕｒｍｏｎｄ Ｖ、Ｒｏｕｓｓｅｔ Ｍ、Ｍｅｊｅａｎ Ｖ、Ｂｏｔｔｉｎ Ｈ． ＢＭＣ Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌ． ２００８ Ｓｅｐ １８；８：７３（非特許文献３０））、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、特にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのためにｐＺ１（Ｍｅｎｋｅｌら、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９８９） ６４： ５４９〜５５４頁（非特許文献３１））もしくはｐＣＬＴＯＮを（Ａ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｔｉｇｈｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｌａｕｓｂｅｒｇ Ｆ、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ ＡＲ、Ｈｅｙｅｒ Ａ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ、Ｆｒｅｕｄｌ Ｒ． Ｐｌａｓｍｉｄ． ２０１２ ６８（２）：１４２〜７頁（非特許文献３２））使用することができる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける発現プラスミドに関する総説は、Ｔａｕｃｈら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０４、２７〜４０頁（２００３））（非特許文献３３）によって記載されている。

本発明のベクターの好ましい一実施形態によると、ベクターｐＣＬＴＯＮ２−ｂｅｔ（配列番号３）、ｐＣＬＴＯＮ２−ｒｅｃＴ（配列番号４）、ｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ４３（配列番号５）、ｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ６１（配列番号６）、ｐＣＬＴＯＮ２−ｒＣａｕ（配列番号７）、ｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴ（配列番号８）、ｐＥＫＥｘ３−ｂｅｔ（配列番号９）が対象である。

それぞれの宿主において、そのように製造されたベクターのリコンビナーゼ活性が試験される（図２、ｃ２）。活性試験は、簡単に検査されうる表現型が組み換え操作によって製造されるはずである宿主の試験株を製造することを含む（図２、ｃ２．１）。さらなる段階は、試験株の形質転換（図２、ｃ２．２）、リコンビナーゼ遺伝子の発現誘導（図２、ｃ２．３）、線状ＤＮＡを取り込むためのコンピテント細胞の製造（図２、ｃ２．４）、線状ＤＮＡを用いたコンピテント細胞の形質転換（図２、ｃ２．５）、および表現型の樹立の試験（図２、ｃ２．６）を含む。予期される表現型が樹立されたなら、組み換え操作が行われる。個別の段階ｃ２．１〜ｃ２．６は、当業者に公知である。それで、試験株において、簡単に検査されうる表現型として（図２、ｃ２．１）例えば欠陥抗生物質耐性遺伝子が染色体中に組み込まれ、その機能が組み換え操作の成功によって再度樹立される。抗生物質耐性遺伝子として、カナマイシン、クロラムフェニコール、ヒグロマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する遺伝子が使用可能である。また、選択マーカーとして特定の基質での成長を可能にする遺伝子、例えばガラクトキナーゼをコードするｇａｌＫ遺伝子を使用することもできる。リコンビナーゼを発現する試験プラスミドを用いた試験株の形質転換（図２、ｃ２．２）は、例えばエレクトロポレーション、化学的形質転換または弾道的形質転換などの公知の方法により行われる。発現ベクターにリコンビナーゼ遺伝子（図２、ｃ２．３）を導入するために、そのベクター特有の誘導物質が培地に添加される。このアプローチは、当業者に公知であり、誘導物質は、例えばイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、アンヒドロテトラサイクリン、サカシン（ｓａｋａｃｉｎ）、またはアセトアミドである。コンピテント細胞の製造（図２、ｃ２．４）、細胞の形質転換（図２、ｃ２．５）、およびペトリ皿上での平板培養による表現型の樹立試験（図２、ｃ２．６）のようなさらなる段階は、微生物学の標準方法であり、同じく当業者に公知である。

所望の表現型が記載の方法により樹立されたならば、続いて、とりわけ組み換え操作の最適化が行われる（図２、ｃ３）。これは、３０分〜６時間の範囲で誘導時間を変えること、組み換え操作に使用されるＤＮＡを変えること、ならびに再生時間および分離時間、および場合により当業者に公知の他のパラメーターを変えることを含む。

組み換え操作に使用されるＤＮＡは、商業的供給者によって合成された、最大３００塩基対長でありうる１本鎖ＤＡＮＮである。その際、ＤＮＡの中央には、染色体中に導入されるべき所望の変異が存在し、それに隣接して、ＤＮＡは、宿主の染色体配列と相同である配列を含む（ＵＳ７，１４４，７３４（特許文献３５））。最適化は、様々な長さのＤＮＡの試験を含む。ＤＮＡとして２０〜３００塩基対長、好ましくは１００塩基対長のＤＮＡが使用される。最適化は、様々な量のＤＮＡの試験を含み、その際、０．２〜３０μｇ、好ましくは１０μｇが形質転換のために使用される。最適化は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかと相同であるＤＡＮＮの試験をさらに含み、その際、好ましくはアンチセンス鎖と相同なＤＮＡが使用される（ＵＳ７，６７４，６２１（特許文献３６））。個別の最適化段階は当業者に公知であり、例えばＥ．ｃｏｌｉ（Ｒｅｋｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ： ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ、ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ． Ｓａｗｉｔｚｋｅ ＪＡ、Ｔｈｏｍａｓｏｎ ＬＣ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｎ、Ｂｕｂｕｎｅｎｋｏ Ｍ、Ｄａｔｔａ Ｓ、Ｃｏｕｒｔ ＤＬ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２００７； ４２１：１７１〜９９頁（非特許文献８））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｓＤＮＡ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒｅｇｉｏｎｓ． Ｗａｎｇ Ｙ、Ｗｅｎｇ Ｊ、Ｗａｓｅｅｍ Ｒ、Ｙｉｎ Ｘ、Ｚｈａｎｇ Ｒ、Ｓｈｅｎ Ｑ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１２ Ｊｕｌ；４０（１２）：ｅ９１（非特許文献３４））、またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｒｅｋｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ． ｖａｎ Ｐｉｊｋｅｒｅｎ ＪＰ、Ｂｒｉｔｔｏｎ ＲＡ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０１２、４０（１０）：ｅ７６（非特許文献３５））について記載されている。

微生物生産体を得るために組み換え操作を実施するために（図２、Ｃ１〜Ｃ４）、変異されるべき遺伝子座が染色体中から選択される。これは、公知の遺伝子、機能が未知の遺伝子、または遺伝子間領域でありうる。生産体の場合、それは、例えば同化もしくは異化または調節過程に関与する遺伝子または遺伝子のプロモーター領域、あるいはｍＲＮＡまたはタンパク質の半減期に影響するそれらである。

組み換えのために使用されるＤＮＡは、合成されるか、またはＰＣＲ増幅によって製造される。そのＤＮＡは、３０〜３０００塩基対長であり、編成構造Ａ−Ｂ−Ｃを有する。ここで、Ｂは中央に位置する所望の変異である。挿入する際に、この変異は、１〜３０００塩基対、好ましくは１〜１０００、さらに好ましくは１〜１００、特に好ましくは１塩基対の配列でありうる。配列ＡおよびＣは、染色体性配列と相同である。これらの配列は、それぞれ２０〜１００塩基対長の合成ＤＮＡの状態である。染色体中の所望の欠失の場合、Ｂは０塩基対長であり、ＡおよびＣは、欠失されるべき領域に直接隣接する染色体中の配列と相同である。配列ＡおよびＣは、２０〜１００塩基対長の合成ＤＮＡの状態である。染色体中の欠失は、１塩基対または最大１０ｋｂでありうる。Ｂは、染色体中の塩基の置換のために置換されるべき、１〜５０塩基対を含みうる領域を意味する。配列ＡおよびＣは、置換されるべき領域に隣接する染色体配列と相同である。これらの配列は、２０〜１００塩基長の合成ＤＮＡの状態である。ＤＮＡの合成は、例えばＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．、８６０ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ ０８８５４、ＵＳＡ）、またはＥｕｒｏｆｉｎｓ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ａｎｚｉｎｇｅｒｓｔｒ．７ａ、８５５６０ Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはＤＮＡ２．０（ＤＮＣ２．０ Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ、１１４０ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｓｕｉｔｅ Ａ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ９４０２５、ＵＳＡ）が実行する。

合成ＤＮＡまたはＰＣＲ増幅によって製造されたＤＮＡは、リコンビナーゼを発現し代謝物センサーを含む微生物中に形質転換によって挿入される（図３、Ｃ１）。そのような代謝物センサーを含む微生物が記載されている（ＷＯ２０１１１３８００６（特許文献２５）、ＤＰＡ１０２０１２０１６７１６．４（特許文献２６）、ＤＰＡ１０２０１２０１７０２６．２（特許文献３７））。形質転換および組み換えのために使用されるＤＮＡは、前記のような特定のＤＮＡ配列である。

形質転換および組み換えのために、様々なＤＮＡ配列の特定の混合物も使用することができる。これらの混合物は、好ましくは領域「Ｂ」の染色体中の塩基を置換する際に使用され、ここで、「Ｂ」は、ＤＮＡ配列の編成構造Ａ−Ｂ−Ｃの場合に置換されるべき範囲を意味する。それで、例えば遺伝子と同時に微生物集団において、様々なアミノ酸をポリペプチド中のある位置で置換することができる。また同時に、様々なアミノ酸をポリペプチドの様々な位置で置換することができる。また同時に、プロモーター領域中で様々なヌクレオチドを交換することができる。対応するＤＮＡ混合物は、個別の特定のＤＮＡ配列を混合することによって自分で製造することができるか、または製造業者ですでに混合物として合成されており、それによって最大数千種の異なるＤＮＡ分子が調製物中に存在し、次にそれらのＤＮＡ分子も調製物中で形質転換および組み換え（図３、Ｃ１）のために使用される。そのような様々な配列を有するＤＮＡ混合物は、商業的に購入することができる。それで、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １２９Ｂ、６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔの「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」または「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」または「Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」が用意されており、それらは、組み換え操作に直接使用することができる。

形質転換および組み換えのために、さらになお、非特定のＤＮＡ配列も使用することができる。例として、既存の生産体由来のゲノムＤＮＡである。このように、産物生成に促進的であるＤＮＡセグメントおよび／または変異および／または遺伝子を同定することができる。

リコンビナーゼおよびナノセンサー含有微生物の形質転換に関連して、当業者に公知のように、例えばＥ．ｃｏｌｉ（Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９８３； １６６（４）：５５７〜８０頁（非特許文献３６））、またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｔａｕｃｈ Ａ、Ｋｉｒｃｈｎｅｒ Ｏ、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ Ｂ、Ｇｏｅｔｋｅｒ Ｓ、Ｐｕｅｈｌｅｒ Ａ、Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ Ｊ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｎｉ−ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＧＣ１． Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００２； ４５（５）：３６２〜７頁（非特許文献３７））について記載されているように、再生は複合培地中で行われる。再生後に細胞は、場合により分離のために最少培地中に移され、それについて、本発明の方法による個別の細胞での産物分析がフローサイトメトリーによって直接行われ、産生株が選択される（図３、Ｃ２）。選択された個別の細胞は、ペトリ皿中の培地で保存されるか、またはさらなる培養のために液体培地を有するマイクロタイタープレート中でも直接保存される。フローサイトメトリーを用いた細胞懸濁物の分析のための詳細は、例えばＳａｃｋ Ｕ、Ｔａｒｎｏｋ Ａ、Ｒｏｔｈｅ Ｇ （編）： Ｚｅｌｌｕｌａｅｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ． Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｕｎｄ ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ Ａｎｗｅｎｄｕｎｇｅｎ ｄｅｒ Ｄｕｒｃｈｆｌｕｓｓｚｙｔｏｍｅｔｒｉｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｋａｒｇｅｒ、２００７、２７〜７０頁（非特許文献３８）から引用することができる。細胞を最大１０００００個／秒分析し、ソーティング機能を保持する適切なフローサイトメーターは、例えばＡｒｉａ−ＩＩＩ装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３５０ Ｑｕｍｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ、９５１３１、８７７．２３２．８９９５）またはＭｏＦｌｏ−ＸＤＰ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ、Ｅｕｒｏｐａｒｋ Ｆｉｃｈｔｅｎｈａｉｎ Ｂ１３、４７８０７ Ｋｒｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）である。

生産体の単離に関連して（図３、Ｃ３）、産物生成特性の検証は、振盪フラスコまたはマイクロタイタープレート中で行われる。特に適切な生産体が選択される。その生産体は、段階Ｃ１（図３）でＤＮＡ移行に使用された出発株よりも多い微生物産物を産生する。段階Ｃ１において添加されたＤＮＡによって定義されている領域のゲノムまたはそのうえ染色体全体、またはそのうえプラスミドによってコードされるＤＮＡの配列決定によって、発生した産物増大変異を同定することができる（図３、Ｃ３．Ａ）。そのように既存の代謝物生産体をさらに改良するために（図３、Ｃ３．Ｃ）、対応する変異Ｍ１〜Ｍｍおよび／または遺伝子Ｇ１〜Ｇｎは、場合により公知の方法により他の生産体株に移行される（図３、Ｃ３．Ｂ）。

例１：リコンビナーゼの同定
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）のデータベースにアクセス番号ＣＡＤ６１７８９．１で寄託されている、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのプロファージＲａｃ由来ＲｅｃＴの配列を用いて、プログラムＢｌａｓｔ、ＢＬＡＳＴ２．２．２７^＋による相同性検索を実施した（Ｗｈｅｅｌｅｒ、Ｄａｖｉｄ； Ｂｈａｇｗａｔ、Ｍｅｄｈａ （２００７）．「Ｃｈａｐｔｅｒ ９、ＢＬＡＳＴ ＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ」、Ｂｅｒｇｍａｎ、Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｈ． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ３９５〜３９６頁、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（非特許文献３９））。相同性検索を、以下のコリネバクテリア種のゲノム中にコードされている全てのタンパク質に対して行った：Ｃ．ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃ．ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ、Ｃ．ａｕｒｉｍｕｃｏｓｕｍ、Ｃ．ｂｏｖｉｓ、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ｃ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｃ．ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．ｊｅｉｋｅｉｕｍ、Ｃ．ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ、Ｃ．ｌｉｐｏｐｈｉｌｏｆｌａｖｕｍ、Ｃ．ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｃ．ｎｕｒｕｋｉ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｃ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｒｅｓｉｓｔｅｎｓ、Ｃ．ｓｔｒｉａｔｕｍ、Ｃ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｔｅａｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｃ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍおよびＣ．ｖａｒｉａｂｉｌｅ。

結果として、２７２アミノ酸長のタンパク質をコードする配列ｃａｕｒｉ＿１９６２が得られたが、その配列は、ＲｅｃＴの配列と４１％同一で６１％類似である。そのように確定された、リコンビナーゼ遺伝子ｒｅｃＴを含むＣ．ａｕｒｉｍｕｃｏｓｕｍ由来のＤＮＡ配列を配列番号１として、タンパク質配列を配列番号２として記載する。

例２：リコンビナーゼのクローニング
リコンビナーゼのクローニングは、発現ベクターｐＣＬＴＯＮ２（Ａ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｔｉｇｈｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｌａｕｓｂｅｒｇ Ｆ、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ ＡＲ、Ｈｅｙｅｒ Ａ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ、Ｆｒｅｕｄｌ Ｒ． Ｐｌａｓｍｉｄ． ２０１２ ６８（２）：１４２〜７頁（非特許文献３２））、およびベクターｐＥＫＥｘ３（Ｔｈｅ Ｅ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＯｄｈＡ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕ−ｔａｍｉｃｕｍ ｈａｓ ｓｕｃｃｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｌｉｐｏｙｌ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＡｃｅＦ． Ｈｏｆｆｅｌｄｅｒ Ｍ、Ｒａａｓｃｈ Ｋ、ｖａｎ Ｏｏｙｅｎ Ｊ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２０１０； １９２（１９）：５２０３〜１１頁（非特許文献４０））に入れて行った。

例２ａ：ｐＣＬＴＯＮ２−ｂｅｔの製造
Ｂｅｔをクローニングするために、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（注文番号１２９６３）を用いてＥ．ｃｏｌｉからベクターｐＳＩＭ８（Ｒｅｋｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ： ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ、ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ． Ｓａｗｉｔｚｋｅ ＪＡ、Ｔｈｏｍａｓｏｎ ＬＣ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｎ、Ｂｕｂｕｎｅｎｋｏ Ｍ、Ｄａｔｔａ Ｓ、Ｃｏｕｒｔ ＤＬ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２００７；４２１：１７１〜９９頁（非特許文献８））を単離した。このプラスミドは、プライマー対ｂｅｔ−Ｆおよびｂｅｔ−Ｒを用いたＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして役立った。
ｂｅｔ−Ｆ ａａｇｇａｇａｔａｔａｇａｔＡＴＧＡＧＴＡＣＴＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＣ
ｂｅｔ−Ｒ ＴＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣ

結果として生じた０．８ｋｂの断片を、Ｑｕｉａｇｅｎ製のＭｉｎｉｅｌｕｔｅ Ｅｘｔｒａｋｔｉｏｎｓ Ｋｉｔ（注文番号２８７０４）を用いたゲル単離により単離し、クレノウ断片を補充し、続いてＦｅｒｍｅｎｔａｓ製のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（注文番号ＥＫ００３１を用いてリン酸化した。ベクターｐＣＬＴＯＮ２（Ａ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｔｉｇｈｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｌａｕｓｂｅｒｇ Ｆ、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ ＡＲ、Ｈｅｙｅｒ Ａ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ、Ｆｒｅｕｄｌ Ｒ． Ｐｌａｓｍｉｄ． ２０１２ ６８（２）：１４２〜７頁（非特許文献３２））をＳｍａＩで切断し、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ製のエビ由来アルカリホスファターゼ（注文番号ＥＦ０５１１）で脱リン酸化した。この断片とベクターを、Ｒｏｃｈｅ製のＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（注文番号１１ ６３５ ３７９ ００１）を用いて連結し、それを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を形質転換した。形質転換後の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有複合培地で平板培養した。

所望の連結産物について試験するために、プライマー対Ｐｃｌ＿ｆｗおよびＰｃｌ＿ｒｖ−ｐＥＫＥｘ２＿ｆｗを用いたコロニーＰＣＲを実施した。
Ｐｃｌ＿ｆｗ ＧＴＡＡＣＴＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣ
Ｐｃｌ＿ ｒｖ−ｐＥＫＥｘ２＿ｆｗ ＣＧＧＣＧＴＴＴＣＡＣＴＴＣＴＧＡＧＴＴＣＧＧＣ

サイズ１．１７ｋｂのＰＣＲ産物をもたらしたクローンからＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（注文番号１２９６３）を用いてプラスミドをより大規模に調製した。プラスミドをｐＣＬＴＯＮ２−ｂｅｔと称し、その配列を配列番号３と称した。

例２ｂ：ｐＣＬＴＯＮ２−ｒｅｃＴの製造
ｒｅｃＴのクローニングのために、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（注文番号１２９６３）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉからベクターｐＲＡＣ３（Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＲｅｃＪ、ＲｅｃＯ、ａｎｄ ＲｅｃＲ ｉｎ ＲｅｃＥＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ Ｋ、Ｈａｎａｄａ Ｋ、Ｉｗａｋｕｒａ Ｙ、Ｉｋｅｄａ Ｈ、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ２００２ Ｓｅｐ；１８４（１７）：４７１５〜２１頁（非特許文献４１））を単離した。このプラスミドは、プライマー対ｒｅｃＴ−ＦおよびｒｅｃＴ−Ｒを用いたＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして役立った。
ｒｅｃＴ−Ｆ ａａｇｇａｇａｔａｔａｇａｔＡＴＧＡＣＴＡＡＧＣＡＡＣＣＡＣＣＡＡＴＣ
ｒｅｃＴ−Ｒ ＣＧＧＴＴＡＴＴＣＣＴＣＴＧＡＡＴＴＡＴＣＧ

結果として生じた０．８ｋｂの断片を例２ａ記載のように単離し、ｐＣＬＴＯＮ２と連結し、それを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を形質転換した。形質転換後の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有複合培地で平板培養した。

所望の連結産物について試験するために、例２ａ記載のようにコロニーＰＣＲを実施した。サイズ１．１９４ｋｂのＰＣＲ産物をもたらしたクローンからプラスミドをより大規模に調製した。プラスミドをｐＣＬＴＯＮ２−ｒｅｃＴと称し、その配列を配列番号４と称した。

例２ｃ：ｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ４３の製造
ｇｐ４３のクローニングのために、遺伝子は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ−ＭＷＧ−Ｏｐｅｒｏｎ（Ａｎｚｉｎｇｅｒｓｔｒ．７ａ、８５５６０ Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）で合成された。合成された断片の配列を配列番号１０として挙げる。この断片を、１４０７ｂｐの断片として制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いて調製し、クレノウ断片で処理し、続いてＦｅｒｍｅｎｔａｓ製のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（注文番号ＥＫ００３１）でリン酸化した。この断片を例２ａ記載のように単離し、ｐＣＬＴＯＮ２と連結し、それを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を形質転換した。形質転換後の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有複合培地上で平板培養した。

所望の連結産物について試験するために、例２ａ記載のようなコロニーＰＣＲを実施した。サイズ１．７９ｋｂのＰＣＲ産物をもたらしたクローンからプラスミドをより大規模に調製した。このプラスミドをｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ４３と称し、その配列を配列番号５と称した。

例２ｄ：ｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ６１の製造
ｇｐ６１のクローニングのために、遺伝子は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ−ＭＷＧ−Ｏｐｅｒｏｎ（Ａｎｚｉｎｇｅｒｓｔｒ．７ａ、８５５６０ Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）で合成された。合成された断片の配列を配列番号１１として挙げる。この断片を、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＭｕｎＩを用いて１０８２ｂｐとして調製し、クレノウ断片で処理し、続いてＦｅｒｍｅｎｔａｓ製のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（注文番号ＥＫ００３１）でリン酸化した。これを例２ａ記載のように単離し、ｐＣＬＴＯＮ２と連結し、それを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を形質転換した。形質転換後の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有複合培地上で平板培養した。

所望の連結産物について試験するために、例２ａ記載のようにコロニーＰＣＲを実施した。サイズ１．４５ｋｂのＰＣＲ産物をもたらしたクローンからプラスミドをより大規模に調製した。このプラスミドをｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ６１と称し、その配列を配列番号６と称した。

例２ｅ：ｐＣＬＴＯＮ２−ｒＣａｕの製造
ｒＣａｕ（ｃａｕｒｉ＿１９６２）のクローニングのために、遺伝子は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ−ＭＷＧ−Ｏｐｅｒｏｎ（Ａｎｚｉｎｇｅｒｓｔｒ．７ａ、８５５６０ Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）で合成された。合成された断片の配列を配列番号１として挙げる。この断片を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＭｕｎＩを用いて８３９ｂｐとして調製し、クレノウ断片で処理し、続いてＦｅｒｍｅｎｔａｓ製のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（注文番号ＥＫ００３１）でリン酸化した。これを例２ａ記載のように単離し、ｐＣＬＴＯＮ２と連結し、それを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を形質転換した。形質転換後の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有複合培地上で平板培養した。

所望の連結産物について試験するために、例２ａ記載のようにコロニーＰＣＲを実施した。サイズ１．２２ｋｂのＰＣＲ産物をもたらしたクローンからプラスミドをより大規模に調製した。このプラスミドをｐＣＬＴＯＮ２−ｒＣａｕと称し、その配列を配列番号７と称した。

例２ｆ：ｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴの製造
ｒｅｃＴをｐＥＫＥｘ３中にクローニングするために、ＰＣＲ増幅用のテンプレートとして例２ｂからのｐＣＬＴＯＮ２−ｒｅｃＴを使用した。この遺伝子を、プライマー対ＢｇｌＩＩ−ＲＢＳ−ＲｅｃＴ−ＦおよびＥｃｏＲＩ−ＲｅｃＴ−Ｒを用いて増幅した。
ＢｇｌＩＩ−ＲＢＳ−ＲｅｃＴ−Ｆ ｇｃａｇａｔｃｔａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔＡＴＧＡＣＴＡＡＧＣＡＡＣＣＡＣＣＡＡＴＣＧ
ＥｃｏＲＩ−ＲｅｃＴ−Ｒ ｇｃｇｃｇａａｔｔｃｃａｇｇＣＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＣＴＣ

結果として生じた０．８４ｋｂの断片を、Ｑｕｉａｇｅｎ製のＭｉｎｉｅｌｕｔｅ Ｅｘｔｒａｋｔｉｏｎｓ ＫＩＴ（注文番号２８７０４）を用いたゲル単離により単離し、クレノウ断片で処理し、続いてＦｅｒｍｅｎｔａｓ製のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（注文番号ＥＫ００３）でリン酸化した。ベクターｐＥＫＥｘ３をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、結果として生じた８２９８ｂｐの断片をＦｅｒｍｅｎｔａｓ製のエビ由来アルカリホスファターゼ（注文番号ＥＦ０５１１）で脱リン酸化した。この断片とベクターを、Ｒｏｃｈｅ製のＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（注文番号１１ ６３５ ３７９ ００１）で連結し、それを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を形質転換した。形質転換後の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有複合培地上で平板培養した。

所望の連結産物について試験するために、プライマー対ｃｏｌ−ｐＥＫＥｘ３−Ｆおよびｃｏｌ−ｐＥＫＥｘ３−Ｒを用いたコロニーＰＣＲを実施した。
ｃｏｌ−ｐＥＫＥｘ３−Ｆ ＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧ
ｃｏｌ−ｐＥＫＥｘ３−Ｒ ＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣ

サイズ１．７１ｋｂのＰＣＲ産物をもたらしたクローンからＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（注文番号１２９６３）を用いてプラスミドをより大規模に調製した。プラスミドをｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴと称し、その配列を配列番号８と称した。

例２ｇ：ｐＥＫＥｘ３−ｂｅｔの製造
リコンビナーゼＢｅｔのクローニングのために、ＰＣＲ増幅用のテンプレートとして例２ｅからのｐＣＬＴＯＮ２−ｒＣａｕを使用した。この遺伝子を、プライマー対ＢｇｌＩＩ−ＲＢＳ−ｂｅｔ−ＦおよびＥｃｏＲＩ−ｂｅｔ−Ｒを用いて増幅した。
ＢｇｌＩＩ−ＲＢＳ−ｂｅｔ−Ｆ ｃｇｇｃａｇａｔｃｔａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔＡＴＧＡＧＴＡＣＴＧＣＡＣＴＣＧＣＡＡＣ
ＥｃｏＲＩ−ｂｅｔ−Ｒ ｇｃｇｃｇｇａａｔｔＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣ

結果として生じた０．８１ｋｂの断片を、Ｑｕｉａｇｅｎ製のＭｉｎｉｅｌｕｔｅ Ｅｘｔｒａｋｔｉｏｎｓ ＫＩＴ（注文番号２８７０４）を用いたゲル単離により単離し、クレノウ断片で処理し、続いてＦｅｒｍｅｎｔａｓ製のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（注文番号ＥＫ００３１）でリン酸化した。ベクターｐＥＫＥｘ３をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、結果として生じた８２９８ｂｐの断片をＦｅｒｍｅｎｔａｓ製のエビ由来アルカリホスファターゼ（注文番号ＥＦ０５１１）で脱リン酸化した。この断片とベクターを、Ｒｏｃｈｅ製のＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（注文番号１１ ６３５ ３７９ ００１）で連結し、それを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５を形質転換した。形質転換後の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有複合培地上で平板培養した。

所望の連結産物について試験するために、例２ｅのようにプライマー対ｃｏｌ−ｐＥＫＥｘ３−Ｆおよびｃｏｌ−ｐＥＫＥｘ３−ｒを用いたコロニーＰＣＲを実施した。サイズ１．０８ｋｂのＰＣＲ産物をもたらしたクローンからＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（注文番号１２９６３）を用いてプラスミドをより大規模に調製した。プラスミドをｐＥＫＥｘ３−ｂｅｔと称し、その配列を配列番号９と称した。

例３：試験株の製造
カナマイシン耐性付与遺伝子の非機能コピーをＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２の染色体中に組み込むために、まず、プライマー対ＳｃａＩ−ＫａｎＲ−Ｆ／Ｋａｎ（−）−Ｌ−ＲおよびＭｕｎＩ−Ｒ−Ｒ／Ｋａｎ（−）−Ｒ−Ｆを用いて、ベクターｐＪＣ１（Ｃｒｅｍｅｒ Ｊ、Ｔｒｅｐｔｏｗ Ｃ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ、Ｓａｈｍ Ｈ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ． Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９８８；１３４（１２）：３２２１〜９頁（非特許文献４２））と融合されるべき２種のＰＣＲ断片をテンプレートとして製造した。
ＳｃａＩ−ＫａｎＲ−Ｆ ＣＧＡＧＴＡＣＴＡＣＡＡＡＣＧＣＧＧＣＣＡＴＡＡＣ
Ｋａｎ（−）−Ｌ−Ｒ ＧＴＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＴＡＧ
Ｋａｎ（−）−Ｒ−Ｆ ＧＣＴＧＡＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＡＣＣＡＴＣ
ＭｕｎＩ−Ｒ−Ｒ ＡＴＡＣＡＡＴＴＧＡＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＣＧＴＣＣ

結果として生じた両方のＰＣＲ断片を、Ｑｕｉａｇｅｎ製のＭｉｎｉｅｌｕｔｅ Ｅｘｔｒａｋｔｉｏｎｓ Ｋｉｔ（注文番号２８７０４）を用いて精製し、プライマー対ＳｃａＩ−ＫａｎＲ−Ｆ／ＭｕｎＩ−Ｒ−Ｒを用いた融合ＰＣＲで欠陥カナマイシン耐性遺伝子と融合させた。この遺伝子は、位置２３４に追加的なヌクレオチドとしてシトシンを含み、それによってフレームシフトが存在し、その遺伝子は完全には読み取られない。生成した産物を、ＳｃａＩおよびＭｕｎＩで制限分解し、続いてＥｃｏＲＩおよびＳｃａＩで切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ−ｌｙｓＯＰ７（Ａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ． Ｂｌｏｍｂａｃｈ Ｂ、Ｈａｎｓ Ｓ、Ｂａｔｈｅ Ｂ、Ｅｉｋｍａｎｎｓ ＢＪ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００９ Ｊａｎ；７５（２）：４１９〜４２７頁（非特許文献４３））中にクローニングした。このベクターでは、欠陥カナマイシン耐性遺伝子にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムの２個の非コード領域が隣接し、それを介してゲノムへの相同組み込みが行われる。続いて、カセット全体を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノム中の位置１，０４５，５０３から１，０４５，５９６の間に公知の方法により２回の正の選択を経て組み込んだ（Ｓｍａｌｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｂｌｅ ｍｕｌｔｉ−ｐｕｒｐｏｓｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｐＫ１８ ａｎｄ ｐＫ１９： ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｉｎｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ． Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ａ、Ｔａｕｃｈ Ａ、Ｊａｅｇｅｒ Ｗ、Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ Ｊ、Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ Ｇ、Ｐｕｅｈｌｅｒ Ａ Ｇｅｎｅ． １９９４ Ｊｕｌ ２２；１４５（１）：６９〜７３頁（非特許文献２））。欠陥カナマイシン耐性遺伝子の染色体への正しい組み込みは、プライマー対ｃｏｌＮＣＲ−Ｌ２およびｃｏｌＮＣＲ−Ｒ２を用いて検証した。ＰＣＲフラグメントのサイズは３９３７ｂｐであった。
ｃｏｌＮＣＲ−Ｌ２： ＣＡＴＴＧＧＴＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＴＧＴＧＧ
ｃｏｌＮＣＲ−Ｒ２： ＡＡＴＣＡＡＴＧＡＧＣＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧ

例４：リコンビナーゼ活性の試験
試験株の形質転換は、ＴａｕｃｈらによってＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍについて記載されたように行った（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｎｉ−ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＧＣ１． Ｔａｕｃｈ Ａ、Ｋｉｒｃｈｎｅｒ Ｏ、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ Ｂ、Ｇｏｅｔｋｅｒ Ｓ、Ｐｕｅｈｌｅｒ Ａ、Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ Ｊ． Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００２ Ｎｏｖ；４５（５）：３６２〜３６７頁（非特許文献３７））。この株をコンピテントにし、リコンビナーゼをコードするベクターそれぞれ０．５μｇをエレクトロポレーションのために使用した。スペクチノマイシン耐性クローンは、スペクチノマイシン１００μｇを含有する複合培地ブレイン−ハート−インフュージョン−ソルビトール、ＢＨＩＳ（Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｃｅｌｌｓ． Ｌｉｅｂｌ Ｗ、Ｂａｙｅｒｌ Ａ、Ｓｃｈｅｉｎ Ｂ、Ｓｔｉｌｌｎｅｒ Ｕ、Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ ＫＨ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． １９８９ Ｄｅｃ；５３（３）：２９９〜３０３頁（非特許文献４４））（ＢＨＩＳ−Ｓｐｅｃ１００）で選択した。

ベクターｐＣＬＴＯＮ２−ｂｅｔ、ｐＣＬＴＯＮ２−ｒｅｃＴ、ｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ４３、ｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ６１、ｐＣＬＴＯＮ２−ｒＣａｕ、ｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴ、またはｐＥＫＥｘ３−ｂｅｔを含む、試験株の各クローンをＢＨＩＳ−Ｓｐｅｃ１００ ５０ｍｌ中に接種し、三角フラスコ中、１３０ｒｐｍにて３０℃で一晩培養した。翌朝、一晩インキュベーションされた培地１０ｍｌを、ＢＨＩＳ−Ｓｐｅｃ１００ ５００ｍｌ＋ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ、ｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴ、ｐＥＫＥｘ３−ｂｅｔを使用する場合）またはテトラサイクリン（２５０ｎｇ／ｍｌ、ｐＣＬＴＯＮ２−ｂｅｔ、ｐＣＬＴＯＮ２−ｒｅｃＴ、ｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ４３、ｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ６１、ｐＣＬＴＯＮ２−ｒＣａｕを使用する場合）に接種し、ＯＤが１．５〜２に達するまで４〜６時間培養した。続いて、培養物を氷上で３０分間冷却し、１０％グリセリン、１ｍＭトリス（ｐＨ８）５０ｍｌで２回、続いて１０％グリセリンで２回洗浄した。戻し工程（Ｒｕｅｃｋｌａｕｆ）で細胞ペレットを追加的に１０％グリセリン１ｍｌ中に再懸濁し、それぞれ１５０μｌに小分けし、液体窒素中で瞬間冷凍し、使用まで−７５℃で保存した。使用するために、細胞を氷上で穏やかに２０分以内に解凍し、ＤＮＡ １μｇと混合した。

ＤＮＡとして、配列
ＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＧＧＡＧＴＡＣＧＧＡＴＡＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＴＧＧＴＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＴＡＡＡＴＴＣＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＴＴＴＡＧＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＴＴＧＧＣ
を有するオリゴＫａｎ１００^＊を使用した。このＤＮＡは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ−ＭＷＧ−Ｏｐｅｒｏｎ（Ａｎｚｉｎｇｅｒｓｔｒ．７ａ、８５５６０ Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）で合成された。

細胞およびＤＮＡ １μｇの懸濁物をエレクトロポレーションキュベット中に移し、氷冷１０％グリセリン８００μｌを慎重に重層し、続いてエレクトロポレーションを行った。再生のために、予め４６℃に加温したＢＨＩＳ ４ｍｌに細胞を直ちに移し、４６℃で６分間インキュベーションした。続いて、１５ｍｌ容Ｆａｌｃｏｎに入れて３０℃および１７０ｒｐｍで１〜６時間培養を行った。その後、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＢＨＩＳに細胞を移した。結果を表１に示す。アプローチ１回あたり最大５７個の細胞が自然カナマイシン耐性であり、ｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴでクローン２００５４個という最大組み換え頻度が得られ、ｐＣＬＴＯＮ２−ｒｅｃＴ、ｐＥＫＥｘ３−ｂｅｔ、ｐＣＬＴＯＮ２−ｒＣａｕ、およびｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ６１で降順のリコンビナーゼ活性が得られたことを示している。ｐＣＬＴＯＮ２−ｇｐ４３でのリコンビナーゼ活性は、バックグラウンドを辛うじて超え、ｐＣＬＴＯＮ２−ｂｅｔは不活性である。

例５：リコンビナーゼ活性の最適化
ｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴを有する試験株をＢＨＩＳ−Ｓｐｅｃ１００ ５０ｍｌ中に接種し、三角フラスコに入れて１３０ｒｐｍおよび３０℃で一晩培養した。翌朝、一晩インキュベーションされた培地１０ｍｌを、ＢＨＩＳ−Ｓｐｅｃ１００ ５００ｍｌ＋０．５ｍＭ ＩＰＴＧに接種し、０、１、または４時間培養した。ｐＣＬＴＯＮ２−ｒｅｃＴを有する試験株をＢＨＩＳ−Ｓｐｅｃ１００ ５０ｍｌ中に接種し、三角フラスコに入れて１３０ｒｐｍおよび３０℃で一晩培養した。翌朝、一晩インキュベーションされた培地１０ｍｌを、ＢＨＩＳ−Ｓｐｅｃ１００ ５００ｍｌ＋テトラサイクリン２５０ｎｇに接種し、０、１、または４時間培養した。続いて培養物を氷上で３０分間冷却し、１０％グリセリン、１ｍＭトリス（ｐＨ８）５０ｍｌで２回、続いて１０％グリセリンで２回洗浄した。戻し工程で細胞ペレットを追加的に１０％グリセリン１ｍｌ中に再懸濁し、それぞれ１５０μｌに小分けし、液体窒素中で瞬間冷凍し、使用まで−７５℃で保存した。使用するために、細胞を２０分以内に氷の上で穏やかに解凍し、ＤＮＡ １μｇと混合した。

エレクトロポレーションおよび再生は、例４記載のように行った。表２に、ベクターｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴ中にリコンビナーゼｒｅｃＴを使用した場合、４時間誘導後に最大の組み換え頻度であることを示す。

さらなる最適化のために、前回のようなｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴを有する試験株細胞を使用したが、漸増する量のＤＮＡを添加した。表３に、ベクターｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴ中のリコンビナーゼｒｅｃＴを使用する場合にＤＮＡ濃度１０μｇで最大組み換え頻度であることを示す。

例６：ＤＮＡ分子を用いたｌｙｓＣ遺伝子中での組み換え操作によるリシン生産体の獲得
出発株由来で、リシン産生が増大した株を直接単離するために、ナノセンサーｐＳｅｎＬｙｓを用いてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２を形質転換した。ナノセンサーｐＳｅｎＬｙｓは、ＷＯ２０１１１３８００６（特許文献２５）に記載されている。結果として生じた株の細胞を、ｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴを用いて形質転換し、例４記載のようにリコンビナーゼを誘導した。ＤＮＡ ｌｙｓＣ−１００^＊は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ−ＭＷＧ−Ｏｐｅｒｏｎ（Ａｎｚｉｎｇｅｒｓｔｒ．７ａ、８５５６０ Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）で合成された。それは、配列番号３２として寄託されている。
ｌｙｓＣ−１００＊： ＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＴＣＧＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＡＡＧＡＧＡＣＧＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＡＴ

ＤＮＡ ｌｙｓＣ−１００^＊ １０μｇを例４記載のようにエレクトロポレーションによって株に移入した（図１、Ｃ１）。続いて、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを有するＢＨＩＳ中で４時間、株の再生を行った。続いて細胞を遠心分離し、ＣＧＸＩＩ−グルコース ７００μｌ中に再懸濁した。この最少培地は、Ｋｅｉｌｈａｕｅｒらに記載されている（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｌｖＢ−ｉｌｖＮ−ｉｌｖＣ ｏｐｅｒｏｎ． Ｋｅｉｌｈａｕｅｒ Ｃ、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ Ｌ、Ｓａｈｍ Ｈ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９３ Ｓｅｐ；１７５（１７）：５５９５〜６０３頁（非特許文献４５））。定常期に到達するまで細胞を３０℃で４０時間インキュベーションした。その後、新たなＣＧＸＩＩ−グルコース培地に１：１０の比で接種し、４時間インキュベーションし、細胞懸濁液をサイトメトリー性産物分析および個別細胞の選択に供した（図２、Ｃ２）。

高い蛍光を有する細胞のフローサイトメトリー分析および分取のために、細胞懸濁物をＣＧＸＩＩ−グルコース培地中に光学密度０．１未満に調整し、直接ＡＲＩＡ ＩＩ高速細胞分取器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＧｍｂＨ、Ｔｕｌｌａｓｔｒ．８−１２、６９１２６ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）に供給した。分析は、励起波長４８８および６３３ｎｍで、検出は、発光波長５３０±１５ｎｍおよび６６０±１０ｎｍならびに試験圧７０ｐｓｉで行った。データは、その装置に付属するソフトウェア−バージョンＢＤ ＤＩＶＡ６．１．３で解析した。非細菌性粒子を排除するために、電子ゲーティングは、前方散乱および後方散乱に基づき調整した。ＥＹＦＰ陽性細胞を分取するために、電子ゲーティングの次のステップを、非蛍光発生細胞を排除するために選択した。この方法で、ＢＨＩＳ培地を含むペトリ皿上に蛍光発生細胞５１個を分取した。

ペトリ皿を３０℃で３０時間インキュベーションし、続いてＢｉｏＬｅｃｔｏｒ Ｋｕｌｔｉｖｉｅｒｕｎｇｓｓｙｓｔｅｍ（ｍ２ｐｌａｂｓ ＧｍｂＨ、Ａａｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のマイクロタイタープレートＦｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（ウェル４８個）の４６個の反応容器の１個にクローン１個ずつ接種した。各反応容器はＣＧＸＩＩ−グルコース０．７μｌを含んでいた。反応容器の１個に陰性対照を、１個に陽性対照を接種した。続いて、マイクロタイタープレートを３０℃、１２００ｒｐｍ、振盪半径３ｍｍで２日間インキュベーションした。ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ Ｋｕｌｔｉｖｉｅｒｕｎｇｓｓｙｓｔｅｍにおいて成長を散乱光として６２０ｎｍでオンライン記録し、培養物の蛍光は、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍで連続的に記録した。

２日後に、記録後のデータから培養物の比蛍光を算出した。それは、３３種のクローン培養物において陰性対照の少なくとも４倍に増大していた。これらの培養物の１２種からゲノム中のｌｙｓＣ配列を決定した。全ての場合で遺伝子の位置９３２のシトシンがチミジンに置換されていた。したがって、この配列は、合成されたオリゴｌｙｓＣ−１００^＊上に存在した、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの場合リシン生成に導く配列領域と対応した（Ｂｉｎｄｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２、１３：Ｒ４０（非特許文献４６））。

例７：複数種のＤＮＡ分子を同時に用いたｍｕｒＥ遺伝子における組み換え操作によるリシン生産体の獲得
出発株由来で、ｍｕｒＥ変異によりリシン産生が増大した株を直接単離するために、ｐＳｅｎＬｙｓおよびｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴを有する例６記載の出発株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２を使用した。個別のｍｕｒＥ ＤＮＡオリゴは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ−ＭＷＧ−Ｏｐｅｒｏｎ（Ａｎｚｉｎｇｅｒｓｔｒ．７ａ、８５５６０ Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）によって合成された。以下のｍｕｒＥ配列を使用した：ｍｕｒＥＧ８１ａｍｂ^＊、配列番号１２；ｍｕｒＥＧ８１Ａ^＊、配列番号１３；ｍｕｒＥＧ８１Ｃ^＊、配列番号１４；ｍｕｒＥ Ｇ８１Ｄ^＊、配列番号１５；ｍｕｒＥＧ８１Ｅ^＊、配列番号１６；ｍｕｒＥＧ８１Ｆ^＊、配列番号１７；ｍｕｒＥＧ８１Ｈ^＊、配列番号１８；ｍｕｒＥＧ８１Ｉ^＊、配列番号１９；ｍｕｒＥＧ８１Ｋ^＊、配列番号２０；ｍｕｒＥＧ８１Ｌ^＊、配列番号２１；ｍｕｒＥＧ８１Ｍ^＊、配列番号２２；ｍｕｒＥＧ８１Ｎ^＊、配列番号２３；ｍｕｒＥＧ８１Ｐ^＊、配列番号２４；ｍｕｒＥＧ８１Ｑ^＊、配列番号２５；ｍｕｒＥＧ８１Ｒ^＊、配列番号２６；ｍｕｒＥＧ８１Ｓ^＊、配列番号２７；ｍｕｒＥＧ８１Ｔ^＊、配列番号２８；ｍｕｒＥＧ８１Ｖ^＊、配列番号２９；ｍｕｒＥＧ８１Ｗ^＊、配列番号３０；ｍｕｒＥＧ８１Ｙ^＊、配列番号３１。

これらのＤＮＡオリゴ各１μｇを取り出し、結果として生じた２０μｇを一定分量の細胞と混合し、例４記載のようにエレクトロポレーションによって株に移入した（図２、Ｃ１）。続いて細胞の再生を行い、続いて培養し、例５記載のように細胞のフローサイトメトリー分析および分取を行った（図２、Ｃ２）。

このようにして、ＢＨＩＳ培地を含むペトリ皿上に蛍光発生細胞６２種が分取された。ペトリ皿を３０℃で３０時間インキュベーションし、続いてＢｉｏＬｅｃｔｏｒ Ｋｕｌｔｉｖｉｅｒｕｎｇｓｓｙｓｔｅｍ（ｍ２ｐｌａｂｓ ＧｍｂＨ、Ａａｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のマイクロタイタープレートＦｌｏｗｅｒｐｌａｔｅ（４８ウェル）の反応容器４６個のうち１個にクローン１種を接種した。各反応容器はＣＧＸＩＩ−グルコース０．７μｌを含んでいた。反応容器の１個に陰性対照を、１個に陽性対照を接種した。続いて、マイクロタイタープレートを３０℃、１２００ｒｐｍ、振盪半径３ｍｍで２日間インキュベーションした。ＢｉｏＬｅｃｔｏｒ Ｋｕｌｔｉｖｉｅｒｕｎｇｓｓｙｓｔｅｍでは、成長を６２０ｎｍでの散乱光としてオンラインで記録し、培養物の蛍光は、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍで連続的に記録した。

２日後に記録されたデータから培養物の比蛍光を算出した。クローン培養物３３種において、比蛍光は陰性対照に対して少なくとも１２倍に増大していた。産物生成の検証のために（図２、Ｃ３）、培養物２１種から培地中のＬ−リシンの決定も行った。リシンの決定は、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＡＡＡ Ｃ１８ ３．５ミクロン４．６×７５ｍｍ逆相カラムおよび蛍光検出器を備えるｕＨＰＬＣ１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いた高圧液体クロマトグラフィーによって、ｏ−フタルジアルデヒド（ｏ−Ｐｈｔｈｄｉａｌｄｅｈｙｄ）誘導体として行った。溶出液として、０．０１Ｍホウ酸Ｎａ（ｐＨ８．２）中のメタノール濃度を増加させる勾配を使用し、蛍光発生イソインドール誘導体の検出は、励起波長２３０ｎｍおよび発光波長４５０ｎｍで行った。表４に示されたＬ−リシン値を決定したが、それらの値は、出発株に比べてＬ−リシン生成が改良されたことを示している。

これらのクローン２１種から、ゲノム中のｍｕｒＥ配列を決定した。配列決定は、会社Ｅｕｒｏｆｉｎｓ−ＭＷＧ−Ｏｐｅｒｏｎ（Ａｎｚｉｎｇｅｒｓｔｒ．７ａ、８５５６０ Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）でＰＣＲ増幅後に行われた。得られた変異を表４にまとめる。このようにして、出発株から１０種の異なるｍｕｒＥ変異が得られ、そのうち９種が出発株に比べてリシン生成の増大に至ったことを示す。得られたｍｕｒＥ対立遺伝子の配列は、配列番号３３、ｍｕｒＥＧ８１Ｗ；配列番号３４、ｍｕｒＥＧ８１Ｙ；配列番号３５、ｍｕｒＥＧ８１Ｎ；配列番号３６、ｍｕｒＥＧ８１Ｃ；配列番号３７、ｍｕｒＥＧ８１Ｓ；配列番号３８、ｍｕｒＥＧ８１Ｆ；配列番号３９、ｍｕｒＥＧ８１Ｖ；配列番号４０、ｍｕｒＥＧ８１Ｌ；配列番号４１、ｍｕｒＥＧ８１Ｈ；配列番号４２、ｍｕｒＥＧ８１Ｉ；配列番号４３、ｍｕｒＥＧ８１Ｔ；および配列番号４４、ｍｕｒＥＧ８１Ｒである。

^ａｃｆｕ（ｒｅｃ）は、Ｋａｎ^＊オリゴを用いた組み換え操作によって発生したカナマイシン耐性クローンの数を示す；ｃｆｕ（ｓｐｏｎｔ）は、Ｋａｎ^＊オリゴの代わりに水を含有する対照調製物から生じた自然発生カナマイシン耐性クローンの数である。ｐＥＫＥｘ３−ｒｅｃＴまたは同じくｐＣＬＴＯＮ２−ｒｅｃＴ中のリコンビナーゼｒｅｃＴを用いて高い組み換え効率が得られることが、はっきりと分かる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒｉｍｕｃｏｓｕｍ由来のリコンビナーゼｒＣａｕも非常に高い組み換え効率を達成し、それは自然発生耐性クローンの効率を明らかに超えている。

^ａｃｆｕ（ｒｅｃ）およびｃｆｕ（ｓｐｏｎｔ）は、表１の通りである。リコンビナーゼ発現のための誘導時間が組み換え効率に及ぼす影響が、はっきりと分かる。

^ａｃｆｕ（ｒｅｃ）およびｃｆｕ（ｓｐｏｎｔ）は、表１の通りである。組み換え操作調製物に添加されたＤＮＡ量がどのように組み換え頻度を増大するかが、はっきりと分かる。ＤＮＡが約１０μｇの場合に最大組み換え頻度に到達する。

Claims (20)

1. 野生型に存在しないリコンビナーゼをコードする遺伝子配列および追加的に代謝物センサーをコードする遺伝子配列を含む、その野生型に比べて遺伝的に改変された細胞。
2. 代謝物センサーをコードする遺伝子配列が、アミノ酸、有機酸、脂肪酸、ビタミンまたは植物活性成分を認識するタンパク質をコードする配列であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞。
3. リコンビナーゼをコードする遺伝子配列が、細胞外から添加されたＤＮＡを細胞固有のＤＮＡと組み換えるタンパク質をコードする配列であることを特徴とする、請求項１または２に記載の細胞。
4. リコンビナーゼをコードする遺伝子配列が、配列番号１によるＤＮＡであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の細胞。
5. Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＥｎｔｅｒｏｂａｋｔｅｒｉｕｍまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細胞であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の細胞。
6. 細胞懸濁物中の特定の代謝物の細胞内濃度がその野生型に比べて増加した細胞を同定するための方法であって、
   ｉ）請求項１〜４のいずれか一つに記載の細胞を含む細胞懸濁物を準備する工程段階；
   ｉｉ）少なくとも一つの改変された遺伝子Ｇ１〜Ｇｎまたは少なくとも一つの変異Ｍ１〜Ｍｍを含むＤＡＮＮの添加下での組み換え操作によって段階ｉ）による細胞を遺伝的に改変して、中の細胞が特定の代謝物の細胞内濃度に関して異なる細胞懸濁物を得る工程段階；
   ｉｉｉ）代謝物センサーを用いた蛍光検出によって、特定の代謝物の細胞内濃度が増加した個別の細胞を細胞懸濁物中から同定する工程段階、
   を含む方法。
7. 特定の代謝物の産生が最適化された、その野生型に比べて遺伝的に改変された細胞の製造方法であって：
   ｉ）請求項１〜４のいずれか一つに記載の細胞を含む細胞懸濁物を準備する段階；
   ｉｉ）少なくとも一つの改変された遺伝子Ｇ１〜Ｇｎまたは少なくとも一つの変異Ｍ１〜Ｍｍを含むＤＮＡの添加下での組み換え操作によって段階ｉ）による細胞を遺伝的に改変して、中の細胞が特定の代謝物の細胞内濃度に関して異なる細胞懸濁物を得る段階；
   ｉｉｉ）代謝物センサーを用いた蛍光検出によって、特定の代謝物の細胞内濃度が増加した個別の細胞を細胞懸濁物中から同定する段階；
   ｉｖ）細胞懸濁物から同定後の細胞を分離する段階；
   ｖ）同定および分離後の細胞中から、特定の代謝物の細胞内濃度増加の原因である少なくとも一つの遺伝的に改変された遺伝子Ｇ１〜Ｇｎまたは少なくとも一つの変異Ｍ１〜Ｍｍを同定する段階；
   ｖｉ）特定の代謝物を最適に産生する、その野生型に比べて遺伝的に改変された産生細胞であって、ゲノムが少なくとも一つの遺伝子Ｇ１〜Ｇｍおよび／または少なくとも一つの変異Ｍ１〜Ｍｍを含む産生細胞を製造する段階
   を含む製造方法。
8. 段階ｉｉｉ）による同定が、アミノ酸、有機酸、脂肪酸、ビタミン、炭水化物、または植物活性成分についての代謝物センサーによって行われることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
9. 段階ｉｉ）による細胞の遺伝的改変が、一つもしくは複数の改変された遺伝子Ｇ１〜Ｇｎおよび／または一つもしくは複数の変異Ｍ１〜Ｍｍを含む、細胞中に挿入された一つまたは複数のＤＮＡ分子を、染色体またはプラスミドとして存在する細胞固有のＤＮＡ中に組み込むリコンビナーゼによって行われることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一つに記載の方法。
10. 請求項１〜４のいずれか一つに記載の、特定の代謝物の細胞内濃度がその野生型に比べて増加した同定用の細胞が、ベクター中に存在するリコンビナーゼ遺伝子を用いて形質転換されることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一つに記載の方法。
11. リコンビナーゼ遺伝子として、配列番号１による遺伝子が使用されることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
12. 配列番号３〜９によるベクターが使用されることを特徴とする、請求項６〜１１のいずれか一つに記載の方法。
13. 少なくとも一つの改変された遺伝子Ｇ１〜Ｇｎおよび／または少なくとも一つの変異Ｍ１〜Ｍｍのために、代謝物の生合成経路由来の段階の一つをコードするＤＮＡが使用されることを特徴とする、請求項７〜１２のいずれか一つに記載の方法。
14. 改変された遺伝子が、配列番号３３〜４４による配列の群からの少なくとも一つの要素であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
15. ａ）特定の代謝物を最適に産生する、その野生型に比べて遺伝的に改変された細胞を、請求項７〜１４のいずれか一つに記載の方法によって製造する工程段階、
    ｂ）栄養素を含む培養培地中で、細胞が栄養素から特定の代謝物を産生する条件で細胞を培養する工程段階
    を含む、代謝物の製造方法。
16. 代謝物が、アミノ酸、有機酸、脂肪酸、ビタミン、炭水化物、または植物活性成分の群からの要素であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. 代謝物がアミノ酸Ｌ−リシンであることを特徴とする、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 配列番号１によるＤＮＡと７０％〜１００％の相同性を有するリコンビナーゼ遺伝子。
19. 配列番号２によるタンパク質と８０〜１００％の相同性のリコンビナーゼ。
20. 配列番号３３〜４４による核酸。

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