JP2015536345A - 組換え型の細胞表面捕捉タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照により具体的に本明細書に組み入れられる2012年11月14日に出願された米国特許仮出願第61/726,040号の35USC§119(e)に基づく恩典を主張する。
本出願は、2013年11月12日に作成されたファイル8600WO_ST25.txt(86,267バイト)としてコンピューターで読み取り可能な形態で提出された配列リストを、参照により組み入れる。
本発明の分野は、組換え型の細胞表面捕捉タンパク質、ならびにヘテロ二量体、例えば二重特異性タンパク質である分泌タンパク質を産生する細胞を同定、単離、および富化するための方法に関する。より具体的には、これらの細胞表面捕捉タンパク質および方法により、ヘテロ二量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体を分泌する特定のハイブリドーマおよび細胞の迅速かつ効率的な単離を含む、高発現の組換え型抗体産生細胞株の迅速かつ効率的な単離が可能になり、それによって、ヘテロ二量体化学種(二重特異性分子)を富化し、ホモ二量体化学種からヘテロ二量体化学種を優先的に分離することが可能になる。
本発明は、関心対象のタンパク質(POI)を直接的にスクリーニングすることによる、タンパク質を分泌する細胞を迅速に単離するためのハイスループットなスクリーニング方法を説明する。また、本発明により、製造プロセスの間、単細胞ベースでPOI発現を簡便にモニターすることが可能になる。さらに、この技術は、二重特異性抗体産生細胞、またはヘテロ二量体タンパク質を産生する任意の細胞のスクリーニングに直接応用することができる。また、この技術は、改変されたT細胞受容体を産生する細胞、例えば、可溶型のT細胞受容体を産生する細胞のスクリーニングに直接応用することもできる。
本発明の方法を説明する前に、本発明は、説明される特定の方法および実験条件に限定されず、したがって、方法および条件は変化し得ることを理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を説明することだけを目的とし、限定することを意図しないことも理解すべきである。
本発明の方法は、タンパク質分泌細胞を単離および同定するための現行の方法よりも優れた実質的利点を提供する。例えば、抗体を分泌する細胞が、所望の特異性、結合活性、またはアイソタイプに基づいて迅速かつ簡便に単離され得る。さらに、分泌タンパク質の産生が間接的に定量される先行技術の多くの方法とは違って、産生された分泌タンパク質の量が直接的に定量され得る。
pTE084の構築
ヒトFcγRI(hFcγRI;Genbankアクセッション番号M21091)をコードするpCAE100に由来する1,436bpのXba I断片をpRG821のXba I部位に連結することによって、pTE084を構築した。連結の結果として得られる望ましいプラスミド中のhFcγRIの配置を、Not I、Pst I、Eco RI、およびStu Iを用いた制限酵素マッピングによって検査した。pTE084は、hFcγRI、すなわちヒトIgGのFcドメインに対する高親和性細胞表面受容体を高レベルで発現させるために設計した。これは、2つの独立した発現カセットを含む。一方のカセットは、CMV-MIEプロモーターによって駆動されるhFcγRI遺伝子であり、2つ目のカセットは、G418に対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(npt)遺伝子であり、SV40後期プロモーターによって駆動される。
製造業者の提案に従ってLipofectamine(商標)(Life Technologies; Rockville, MD)を用いて、CHO K1細胞(4×106個)にpTE084をトランスフェクトした。これらの細胞を、500μg/ml G418(Life Technologies)を含む培地(10%ウシ胎児血清、90%ハムF-12、2mM L-グルタミン;試薬はすべてLife Technologies, Rockville, MDから入手)中に15日間入れた。G418選択から生き残った細胞をトリプシン処理し、プールし、FITC結合ヒトIgG Fc断片(FITC-hFc; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)を用いて染色した。簡単に説明すると、10cm培養皿上で増殖させた細胞を、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Life Technologies)で1回洗浄した。各プレートに、0.25%トリプシン(Life Technologies)3mlを添加した。細胞がプレートから離れるまで、プレートを回転させた。離れた細胞を含む各プレートに、培地10mlを直ちに加えた。次いで、1,000×gで4分間の遠心分離によって、細胞を回収した。上清を除去した後、培地で希釈した4mlの2μg/ml FITC-hFc中に細胞を再懸濁した。次いで、細胞をプラットホーム振盪機上に置き、室温で1時間、染色した。未結合FITC-hFcを除去するために、PBS 20mlで2回、細胞を洗浄した。細胞上のFITC-hFc標識の程度を、MOFLO(商標)細胞選別機(Cytomation; Fort Collins, CO)を用いてフローサイトメトリーによって測定した。FITC-hFcによって、モックトランスフェクトされた親CHO K1細胞は染色されなかったが、G418耐性のpTE084をトランスフェクトされたプールでは蛍光の分布が生じた。フローサイトメトリーによって、選択されたプールの最も蛍光が強い上位1%の細胞を、細胞1個/ウェルの密度で96ウェルプレートに入れた。9日後、96ウェルプレート中の細胞クローン88個を24ウェルプレート中に増殖させた。3日後、個々のウェル中の細胞をPBS 1mlで1回洗浄し、0.5mlの2μg/ml FITC-hFcで1時間染色し、PBS 1mlで2回洗浄し、蛍光顕微鏡下で細胞表面染色について検査した。最も蛍光が強いクローン33個を選択し、増殖させ、次いでフローサイトメトリーによってスクリーニングした。
pEE14.1-622をRGC1細胞(4×106個)にトランスフェクトし、10%の透析済みウシ胎児血清、90%グルタミン不含ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、1×GS補充物質(supplement)、および25μM MSX(試薬はすべて、JRH Biosciences, Lenexa, KSから入手した)からなる培地中で2週間選択した後に、安定なトランスフェクタントのプールを得た。免疫染色する18時間前に、ラットIgGを1mg/mlになるまで培地に添加した。これらの細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、実施例1のFITC-hFc染色に関して説明した手順に従って、室温で1時間、1.5μg/mlのFITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG (H+L)F(ab')2断片(Jackson ImmunoResearch Laboratories)を用いて染色した。次いで、フローサイトメトリーによって細胞染色を解析した。選択されたプールが、4SC622発現レベルが広範囲に渡る細胞を含むことが、蛍光分布から示唆された。免疫蛍光に関して上位3%(R3グループ(bracket))、7〜11%(R5グループ)、および15〜19%(R7グループ)の細胞を3つの別個のプールに選別し、9日間増殖させた。製造業者の推奨に従い、免疫に基づくPandexアッセイ法(Idexx; Westbrook, ME)によって、3日間増殖させた後の培地中の細胞数および4SC622レベルを測定することにより、各プールの細胞当たりの平均4SC622産生を測定した。Pandexアッセイ法において、ヤギ抗ヒトIgG、g鎖特異的抗体(Sigma)でコーティングされたフルオリコン(fluoricon)ポリスチレンアッセイ用粒子を用いて4SC622を培地から捕捉し、FITC結合ヤギ抗ヒトIgG(Fc特異的)(Sigma)を用いて、ビーズが結合した4SC622を検出した。較正のために、公知の量の精製4SC622をアッセイ法に含めた。上位3%プール、7〜11%プール、および15〜19%プールの細胞は、それぞれ1.42、0.36、および0.22pg/細胞/日の4SC622を産生することが判明した。したがって、細胞表面4SC622染色と単位当たりの(specific)タンパク質産生の間には相関があった。この結果から、FITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG (H+L)F(ab')2断片によって最も明るく染色された細胞を単離することによって、4SC622を高レベルで発現する個々の細胞を得ることができることが示唆される。
分泌タンパク質を高レベルで産生するクローン細胞株を作製する際の効率を本発明者らの方法論に基づいて直接的に明らかにするために、4SC622を産生するクローン細胞株をRGC1から作製した。pEE14.1-622をRGC1細胞(4×106個)にトランスフェクトし、25μM MSXを用いて2週間選択して、安定なトランスフェクタントのプールを得た。MSX耐性細胞をプールし、1mg/mlヒトIgGと共に18時間インキュベートした後、PE-AG184を用いて染色した。細胞表面4SC622染色のフローサイトメトリー解析によって測定した際の上位5%ゲートから細胞6個を単離し、増殖させた。それら6個のクローン株からの4SC622産生を測定し、選択コロニーを手作業で選び(hand-picking)続いて希釈によってクローニングし増幅させることによって得られたクローンからの4SC622産生と比較した。1つのRGC1由来クローン、すなわちRGC4は、12pg/細胞/日の4SC622を産生した。このレベルは、2,700個のクローンを手作業で選び解析することによって単離した最良の4SC622生産者のレベルと同様である。したがって、コロニーを手作業で選ぶことと比べると、本発明で概説する方法論は、高レベル(high)の生産者をスクリーニングおよびクローニングする際の効率がはるかに高いことが分かる。
プラスミドpTE080およびpTE081は、VEGFトラップ、hVEGF-R1R2、およびhVEGF-R1R3の遺伝子をコードする。hVEGF-R1R2は、hVEGFR2の第2のIgドメインに融合されたhVEGFR1の第1のIgドメインからなるキメラ分子であり、次いでhIg1FCドメインに融合されている。hVEGF-R1R3は、hVEGFR3の第2のIgドメインに融合されたhVEGFR1の第1のIgドメインからなるキメラ分子であり、次いでhIgG1-Fcドメインに融合されている。これらのプラスミドにおいて、VEGFトラップの遺伝子はCMV-MIEプロモーターによって駆動され、かつMSXに対する耐性を与えるグルタミンシンセターゼミニ遺伝子が、安定な組込み事象の選択のために発現させられる。これらのプラスミドのいずれかをRGC1細胞にトランスフェクトし、25μM MSXを含む培地中で2週間増殖させて、プラスミドが安定に組み込まれた細胞を選択した。0.1μg/mlのIgG2aおよびマウスIgG3と共にMSX耐性細胞を18時間インキュベートした後に、1.5μg/mlのFITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG(H+L)F(ab')2断片を用いて染色した。細胞を1時間染色し、次いで、フローサイトメトリーに先立ってPBSで2回洗浄した。蛍光が最上位1%の中に入っていた細胞のプールから、単細胞を96ウェル組織培養プレート中に選別した。各ウェル中の細胞を増殖させ、Pandexアッセイ法によってそれらの生産力を測定した。手作業で選別された最高レベルで発現するMSX耐性コロニーと比べて、hVEGF-R1R2およびhVEGF-R1R3の両方を発現するRGC由来クローンの方が、単位当たり生産力(specific productivities)がより高く、より少数のクローンをスクリーニングすることによって単離された。表1を参照されたい。
hFcγRIは、細胞表面に結合したリガンドの内部移行を誘導することが公知である。RGC1細胞が細胞表面に結合した4SC622を内部移行できるかどうかを解析するために、1μg/ml 4SC622をRGC1細胞に1時間添加し、次いで、PE-AG184による4SC622免疫染色およびフローサイトメトリー解析のために細胞を直ちに処理した。93%の細胞が、細胞表面4SC622について陽性に染色された。あるいは、1μg/ml 4SC622をRGC1細胞に1時間添加し、次いで、細胞を洗浄し、4SC622を含まない培地中でPE-AG184と共に18時間、インキュベートした。4SC622の免疫染色後のフローサイトメトリー解析により、9%の細胞が細胞表面に4SC622を保持していることが示された。表面に結合した4SC622の喪失をさらに明らかにするために、RGC1および親CHO K1細胞の培地に精製4SC622タンパク質を添加し、次いで、培地中の4SC622のレベルをある期間に渡って測定した。10cmプレート中の培地に2μg/mlまで添加された4SC622は、3日間のインキュベーション後のRGC1馴化培地において、CHO K1対照と比べて有意に少なかった。これらの結果から、培地中の4SC622の濃度は、細胞表面にhFcγRIが存在することによって低下することが示される。これらの結果から、培地から4SC622が枯渇するのは、hFcγRI-4SC622複合体の内部移行の結果であったことが示唆される。受容体-リガンド複合体のこの内部移行によって、18時間のブロッキング段階の間にブロッキングIgGの存在下で非発現細胞からすべての4SC622を効果的に除去することが容易になり得る。
hFcγRIを使用するフローサイトメトリーに基づく自己分泌トラップ(FASTR(商標))法は、高発現クローンの迅速な単離を可能にする。しかしながら、hFcγRIがFcタグ付きタンパク質の代謝回転をもたらす場合、操作されたhFcγRI発現細胞によって実現される分泌タンパク質産生は、産生期間中にhFcγRI発現を阻害できるならば、より多くなると考えられる。このために、hFcγRIの発現がテトラサイクリンまたは類似体ドキシサイクリンによって誘導されるCHO K1細胞株を構築した。この系では、CHO K1細胞を最初に操作してテトラサイクリンリプレッサータンパク質(TetR)を発現させ、TetRによって活性が調節されるプロモーターの転写制御下にhFcγRIを置いた。2つの直列型のTetRオペレーター(TetO)をpTE084のCMV-MIEプロモーター/エンハンサーのすぐ下流に配置してpTE158を作製した。pTE158におけるCMV-MIEプロモーターからのhFcγRIの転写は、テトラサイクリンも他の何らかの適切な誘導因子もない場合、TetRによって妨害された。誘導因子の存在下では、TetRタンパク質はTetOに結合することができず、hFcγRIの転写が起こった。
RGC10細胞にpEE14.1-622をトランスフェクトし、25mM MSXを用いて2週間選択した後、MSX耐性細胞をプールした。培地に1μg/mlドキシサイクリンを3日間添加することによって、hFcγRIの発現を誘導した。ドキシサイクリンを含む培地に1mg/mlラットIgGを18時間添加した後、FITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG(H+L)F(ab')2断片を用いて染色し、フローサイトメトリーによって解析した。最も高レベルの4SC622を発現した細胞(上位1%)を、1ウェル当たり細胞1個となるように96ウェルプレートに選別した。ドキシサイクリンによってhFcγRI発現を誘導しない場合、FITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG(H+L)F(ab')2断片を用いて染色することによって細胞表面に結合した4SC622を検出することはできない。ドキシサイクリンの非存在下で、60個のクローンを増殖させた。最も高レベルの(highest)13個の生産者の単位当たり生産力をPandexアッセイ法によって測定した。クローン1C2の単位当たり生産力は17.8pg/細胞/日であった。この値は、調節されていないhFcγRI細胞株RGC1を用いて以前に単離した最良の4SC622細胞株において観察された12pg/細胞/日よりも有意に優れていた。
本実施例において、自己分泌トラップ法がCHO以外の細胞株に応用可能であることを実証するために、Sp2/0-Ag14骨髄腫細胞株を操作してhFcγRIを安定に発現させた。レトロウイルス感染によって、hFcγRIの遺伝子を骨髄腫細胞に導入した。プラスミドpLXRN(Clontech; Palo Alto, CA)、すなわち関心対象の遺伝子を上流のMoloneyマウス肉腫ウイルス長末端反復配列(MoMuSV LTR)プロモーターから発現させることができるレトロウイルスDNAベクターを用いて、hFcγRI遺伝子をコードするレトロウイルスを作製した。ヒトFcγRI遺伝子をコ―ドするpTE084由来の1,363bp Xho I断片をpLXRNのXho I部位にクローニングした。hFcγRI cDNA発現がMoMuSV LTRに依存しているプラスミドを選択し、pTE255と名付けた。
向汎性hFcγRIレトロウイルスを用いて、Sp2/0-Ag14骨髄腫細胞(American Type Culture Collection; Manassas, VA)1×107個を細胞1個当たり感染性粒子約10個の多重度で感染させた。感染後3日目に、細胞を1時間染色し、次いで、フローサイトメトリーによる解析に先立ってPBSで2回洗浄した。結合したFITC-hFcによって示されるhFcγRI発現細胞を、フローサイトメトリーによってプールとして回収した。このプールを13日間増殖させ、次いでFITC-hFcで再び染色し、hFcγRI発現細胞をフローサイトメトリーによってプールとして回収した。選別したこれらの細胞を、4.5g/lブドウ糖および4mMグルタミンを含む10%ウシ胎児血清90%ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で3週間培養し、FITC-hFcで染色し、平均蛍光量が集団の上位1%である細胞を単細胞選別によってクローニングした。増殖後、前述したようにして、24個のクローンをhFcγRIの発現についてフローサイトメトリーによって検査し、さらに特徴を明らかにするために、1つのクローン、Sp2-hFcγRI-4を選択した。
pTE209、すなわちCMV-MIEプロモーターからの4SC622の構成的発現を可能にし、ヒグロマイシンに対する耐性を与えるプラスミドを、Sp2-hFcγRI-4細胞(1×107個)にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、10%FCS、90%D-MEM、および400μg/mlヒグロマイシンを含む培地中に14日間入れた。ヒグロマイシン耐性細胞を1mg/mlウサギIgGと共に18時間インキュベートした後、FITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG(H+L)F(ab')2断片を用いて染色した。細胞を1時間染色し、次いで、フローサイトメトリーによる解析に先立ってPBSで2回洗浄した。標識された細胞をフローサイトメトリーによってプールとして回収し、次いで5日間培養し、前述のようにして選別した。次いで、増殖させたプールに由来する、最も多くのFITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG(H+L)F(ab')2断片に結合した細胞、すなわち上位1%の集団を単細胞選別によってクローニングした。10個のクローンの4SC622産生をELISAによって解析したところ、10個のクローンはすべて4SC622を発現することが判明した。クローン5H11は、0.5pg/細胞/日の4SC622を産生した。これらのデータから、自己分泌トラップ法によって、4SC622を分泌するクローンが、Sp2-hFcγRI-4細胞へのpTE209の安定なトランスフェクションに由来する不均一な細胞プールから効率的に単離されることが示された。
hFcγRI以外の細胞表面捕捉タンパク質に自己分泌トラップ法を応用できることを実証するために、プロテインGを発現する細胞株を構築した。プロテインGはストレプトコッカス(Streptococcus)株G148に由来し、ヒトおよびマウスのすべてのIgGサブクラスに結合し、したがって、抗体またはIgG Fc融合タンパク質を発現する組換え細胞の単離に役に立つ。プロテインG IgG Fc結合ドメインが、ヒトおよびマウスのすべてのIgGサブクラスに結合できる細胞表面捕捉タンパク質として使用され得ることを実証するために、本発明者らは、hFcγRIの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合されたプロテインGのFc結合ドメインからなるキメラタンパク質を発現するCHO株を構築した。プロテインGのFc結合ドメインは、55アミノ酸長の相同な反復配列を3つ含み(Guss et al., (1986) EMBO 5:1567およびSjobring et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:399)、各反復配列は1つのIgG Fcに結合することができる。CHO細胞におけるこのキメラタンパク質の発現を向上させるために、本発明者らは、マウスROR1遺伝子由来のシグナル配列がプロテインG(アクセッション番号X06173)のFc結合ドメイン、すなわちアミノ酸303〜497(SEQ ID NO: 1)に融合されている合成DNAを構築した。この合成DNAは、オリゴヌクレオチドアニーリング、ギャップ充填、およびPCR増幅の組合せによって作製した。次いで、hFcγRI(アクセッションM21091)の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、すなわちアミノ酸279〜374(SEQ ID NO: 2)をコードするDNAに、PCRによってこの合成DNAを融合させた。プロテインG/hFcγRIキメラタンパク質をコードする得られたDNAをpTE158のCMV-MIEプロモーターの下流にクローニングして、hFcγRIをコードする遺伝子を置換して、プラスミドpTE300を得た。
組換え抗体を発現するCHO細胞株の単離のために自己分泌トラップ法が有用であることを実証するために、本発明者らは、KD5ハイブリドーマに由来する可変軽鎖遺伝子および可変重鎖遺伝子をコードするDNAをクローニングした。KD5は、ヒトTie-2受容体に特異的なモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマである。
を用いたPCRによって、このcDNAからマウスκ軽鎖定常DNA配列(アクセッション番号Z37499)を増幅した。プライマー
を用いたPCRによって、このcDNAからマウスIgG2a定常領域DNA配列(アクセッション番号AJ294738)も増幅した。TOPO TA Cloningキット(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いて、これらのPCR産物をpCR2.1-TOPO中にクローニングし、定常領域の配列を確認した。
を用い、pCR2.1-TOPOにクローニングした可変領域を鋳型として用いて、可変重鎖遺伝子をPCR増幅し、BspMIで消化し、プライマー
を用いて増幅した、BsaIによって消化したIgG2a定常重鎖遺伝子PCR断片に連結した。次いで、この断片をpRG882のBspMI部位およびNotI部位に連結した。得られたプラスミドpTE317は、mROR1シグナル配列に融合されたKD5組換え重鎖遺伝子をCMV-MIEプロモーターから発現させることができた。プライマー
を用い、pCR2.1-TOPOにクローニングした可変領域を鋳型として用いて、可変軽鎖遺伝子をPCR増幅し、BsmBIで消化し、プライマー
を用いて増幅した、BsaIによって消化したκ定常軽鎖遺伝子PCR断片に連結した。次いで、この断片をpRG882のBspMI部位およびNotI部位に連結した。得られたプラスミドpTE316は、mROR1シグナル配列に融合されたKD5組換え軽鎖遺伝子をCMV-MIEプロモーターから発現させることができた。
CSCPの発現レベルが、結合されるsPOIを発現する細胞を単離する能力に有意な影響を及ぼさないことを実証するために、同じCSCPを発現するが高レベルまたは低レベルのいずれかでそれぞれ発現する2種の異なる宿主細胞株における同じsPOIのFASTR(商標)スクリーニングを比較した。
FcγR1以外の細胞表面捕捉タンパク質(CSCP')を、本明細書において説明する方法において使用することができる。本実施例において、Tie2受容体は、CSCPとして機能し、Tie2受容体の細胞外ドメインに特異的に結合するC1bモノクローナル抗体から作製されるTie特異的ScFvC1b-Fc融合タンパク質を発現する細胞を単離するのに使用される。ScFvC1b-Fcに対するCSCPはhFcgRIであり得るが、本実施例では、ScFvC1b-Fcに対するCSCPとしてTie2も使用できることを実証する。
アンギオポエチン(angiopoetin)-1は、Tie2受容体に対するリガンドである。アンギオポエチン-1受容体結合ドメインおよびhFcを含むキメラタンパク質(FD1-hFc)は、BIAcore(商標)によって測定した場合に親和定数174nMでTie2に結合する。FD1-hFcおよびTie2をsPOIおよびCSCPとしてそれぞれ選択して、FASTR(商標)スクリーニングのためにCSCPとsPOIの間に最低限の親和性が必要であるかを判定した。
CSCPは、sPOIに対して測定可能な親和性を有している任意の細胞表面結合タンパク質であることができる。これを実証するために、PDGF受容体由来の膜貫通ドメインを、マウスκ鎖特異的モノクローナル抗体HB58由来の可変領域を含むScFvに融合することによって、完全に合成のCSCPを構築した。このキメラタンパク質(ScFvHB58-TMPDGFR)を発現するFASTR(商標)宿主を構築し、これを用いて、アンギオポエチン(angiopoeitin)-2 FDドメイン特異的P12抗体を発現する細胞を単離した。
TCR-Fcである関心対象のタンパク質を発現する細胞株の高発現クローンを単離するための、フローサイトメトリーに基づく自己分泌トラップ(FASTR(商標))法は、関心対象の抗体を発現する細胞株の調製に類似した様式で準備される。hFcγRに結合した関心対象のTCR-Fcを表面に提示する細胞をスクリーニングすることによって、高発現クローンを同定する。
ゲノムの免疫グロブリン重鎖VDJ領域および免疫グロブリンκ鎖VJ領域がヒトオルソログで置換された遺伝子改変マウス(すなわち、Velocimmune(登録商標)マウス;その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,105,348号を参照されたい)を、ヒトIgG4タンパク質のFc断片(hFcもしくは単にFc;SEQ ID NO: 26)またはジペプチド変異を含むヒトΔAdpFcポリペプチド(IMGTによるH95R、Y96F;Fc*としても公知;SEQ ID NO: 42)のいずれかで免疫化した。これらのマウスからモノクローナル抗体を得、Fc、Fc*、またはFcおよび/もしくはFc*を含む抗体に結合する能力についてスクリーニングした。Fcに結合できる3種の抗体(Ab1、Ab2、Ab3)およびFc*に結合できる3種(Ab4、Ab5、Ab6)を、次の形態:Fc/Fc、Fc/Fc*(二重特異性抗体であり得る)、およびFc*/Fc*の内の1つを有している分子に結合する能力について試験した。
Fc特異的Ab2の重鎖および軽鎖の配列を決定した。組換えAb2抗体を製造するために、重鎖をコードする発現ベクタープラスミドを構築し、軽鎖をコードする発現ベクタープラスミドを構築した。どちらのベクターも、CHO細胞における各サブユニットの発現および分泌を可能にする。抗体を発現させるために、両方のプラスミドをCHO-K1細胞にトランスフェクトし、安定な形質転換体を単離した。構成的CMVプロモーターによって、抗体鎖の発現を駆動した。
組み込まれたSEQ ID NO: 22配列を含むCHO-K1細胞に、様々なサブタイプの抗体、例えば、IgG1、IgG2、IgG4、95R/435R-96F/436F二重置換を有する1つのCH3ドメインを含むがもう1つのCH3ドメインは野生型であるIgG4二重特異性抗体(IgG4 Fc/Fc*)、およびIgG1 Fc/Fc*形態のIgG1二重特異性抗体をコードするプラスミドをトランスフェクトした。細胞をドキシサイクリンで処理して、抗体と共に捕捉分子の産生を誘導した。抗体および捕捉分子を同時発現させた後、場合によってはこれらの細胞をhFcブロッキングタンパク質および検出分子(FITC標識抗hFab)で処理した。表3はこれらの結果を要約したものであり、ScFv-FcγR表面捕捉融合タンパク質がIgG4分子、IgG2分子、およびIgG1分子に結合するのに対し、野生型FcγR表面捕捉分子はIgG1に結合するがIgG4にもIgG2にも結合しないことを大まかに示している。
Fc*特異的Ab6の重鎖および軽鎖の配列を決定した。軽鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO: 41であると決定した。重鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO: 40であると決定した。組換えAb6抗体を製造するために、重鎖をコードする発現ベクタープラスミドを構築し、軽鎖をコードする発現ベクタープラスミドを構築した。抗体を発現させるために、両方のプラスミドをCHO-K1細胞にトランスフェクトし、安定な形質転換体を単離し、構成的CMVプロモーターによって発現を駆動した。
抗Fc捕捉および抗Fc * 検出
Ab2に由来する抗Fc特異的ScFv-FcγR表面捕捉系を、二重特異性抗体を産生する細胞を検出および富化する能力に関して試験した。CH3ドメインの内の1つに95R/435R-96F/436F置換を含む(Fc*と呼ばれる)二重特異性抗体を検出する能力を評価するために、hFcをブロッキング分子として用い、FITC標識Ab6抗Fc*抗体(例えば、SEQ ID NO: 40のHCおよびSEQ ID NO: 41のLCを有するmAb)を検出分子として用いて、Ab2に由来する抗Fc特異的ScFv-FcγR表面捕捉細胞株において様々な抗体を発現させた。Ab2に由来する抗Fc特異的ScFv-FcγR表面捕捉細胞株は、Fc*特異的Ab6を検出分子として用いて、任意のFc*/Fc*単特異性抗体またはFc/Fc 単特異性抗体より優先して二重特異性抗体(Fc/Fc*)を検出および識別することができた(表4)。FcγRはIgG4に結合することができないか、または非常に低い親和性でIgG4に結合するため、野生型FcγR表面捕捉細胞株は、Fc/Fc*、Fc*/Fc*、およびFc/Fc IgG4種を識別することができなかった。
逆に、Ab6に由来する抗Fc*特異的ScFv*-FcγR表面捕捉系を、二重特異性抗体を産生する細胞を検出および富化する能力に関して試験した。CH3ドメインの内の1つに95R/435R-96F/436F置換を含む(Fc*と呼ばれる)二重特異性抗体を検出する能力を評価するために、hFcをブロッキング分子として用い、置換されていないCH3を認識するAlexa 488標識Ab2抗Fc抗体を検出分子として用いて、Ab6に由来する抗Fc*特異的ScFv*-FcγR表面捕捉細胞株において様々な抗体を発現させた。Ab6に由来する抗Fc*特異的ScFv*-FcγR表面捕捉細胞株は、Fc特異的Ab2を検出分子として用いて、Fc*/Fc*単特異性抗体またはFc/Fc単特異性抗体より優先して二重特異性抗体(Fc/Fc*)を検出および識別することができた(表4)。FcγR表面捕捉細胞株は、Fc/Fc*、Fc*/Fc*、およびFc/Fc IgG4種を識別することができなかった。
(Ab2由来)ScFv-FcγR CSCP/(Ab6)抗Fc*DM系および(Ab6由来)ScFv*-FcγR CSCP/(Ab2)抗Fc DM系が二重特異性抗体を選別および富化する能力を評価するために、hFcをブロッキング分子として用い、FITC標識抗Fc*(Ab6)抗体を検出分子として用いて、Fc/Fc* IgG4モノクローナル抗体(IgG4-mAb-2)および抗Fc ScFv-FcγR融合タンパク質を同時発現する細胞株を、連続的な蛍光活性化細胞選別およびFc/Fc*種の産生を富化するためにプールした。5番目および6番目の系列のプールに由来するFc/Fc*を生じる細胞を、合計抗体力価ならびに各抗体形態、すなわちFc/Fc*、Fc/Fc、およびFc*/Fc*の力価について解析した。これらの細胞は、置換されていないCH3ドメイン(「Fc」、すなわち、IMGT位置95番にヒスチジンを含みIMGT位置96番にチロシンを含む)をコードする重鎖と、置換されたCH3ドメイン(「Fc*」、すなわち、IMGT位置95番にアルギニンを含みIMGT位置96番にフェニルアラニンを含む)をコードする重鎖の両方をコードするため、純粋に数学的なパネットのスクエア解析によると、細胞は理論上、25%のFc/Fc、50%のFc/Fc*、および25%のFc*/Fc*を産生すると予想される。しかしながら、生物学的には、産生される抗体の(富化前の)ほとんどはFc/Fcであると予想され得る。
Claims (115)
- ヒトIgG1-Fcドメイン、ヒトIgG2-Fcドメイン、またはヒトIgG4-Fcドメインに結合する、組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 26のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項1記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- 表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約40nM未満のKDでポリペプチドに結合する、請求項1または請求項2記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 16と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 15のアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16のアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- (a)SEQ ID NO: 15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 16と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)SEQ ID NO: 17またはSEQ ID NO: 21と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項1〜7のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 15と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 16と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項1〜8のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含むScFv融合タンパク質である、請求項1〜9のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む抗体が結合するのと同じ、置換されたCH3ポリペプチド上のエピトープに結合する、組換え型の抗原結合タンパク質。
- 請求項1〜11のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 核酸が、SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項12記載の単離されたポリヌクレオチド。
- (a)請求項12または13記載のポリヌクレオチド;
(b)該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター;および
(c)ポリアデニル化配列
を含む、核酸ベクター。 - プロモーターがCMVプロモーターである、請求項14記載の核酸ベクター。
- 選択マーカーをコードする核酸を含む、請求項14または15記載の核酸ベクター。
- 選択マーカーがネオマイシン耐性を与える、請求項16記載の核酸ベクター。
- エネルギー転移タンパク質をコードする核酸を含む、請求項14〜17のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- エネルギー転移タンパク質が緑色蛍光タンパク質の誘導体である、請求項18記載の核酸ベクター。
- 緑色蛍光タンパク質の誘導体が黄色蛍光タンパク質(「YFP」)である、請求項19記載の核酸ベクター。
- 環状である、請求項14〜20のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- 直線状である、請求項14〜20のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- 宿主細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項22記載の核酸ベクター。
- 宿主細胞がCHO細胞である、請求項14〜23のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- 請求項1〜11のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞。
- CHO細胞である、請求項25記載の宿主細胞。
- IMGTのエキソン番号付与システムに基づく(a)95R、ならびに(b)95Rおよび96F、またはEU番号付与システムに基づく(a')435R、ならびに(b')435Rおよび436Fからなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を含む置換されたCH3ポリペプチドに特異的に結合する、組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 42のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項27記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- 表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約60nM未満のKDでポリペプチドに結合する、請求項27または請求項28記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 38と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 39と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む、請求項27〜29のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR-1)、SEQ ID NO: 33のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 34のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、SEQ ID NO: 36のアミノ酸配列を有するLCDR-2、およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を有するLCDR-3を含む、請求項27〜30のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 38と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 39と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項27〜31のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 38のアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項27〜32のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 40と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 41と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体である、請求項27〜33のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 40と同一のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 41と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項27〜34のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- (a)SEQ ID NO: 38と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 39と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項27〜33のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 38と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 39と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項27〜33および36のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含むScFv融合タンパク質である、請求項27〜33、36、および37のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
- SEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR1)、SEQ ID NO: 33のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 34のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、SEQ ID NO: 36のアミノ酸配列を有するLCDR-2、およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を有するLCDR-3を含む抗体が結合するのと同じ、置換されたCH3ポリペプチド上のエピトープに結合する、組換え型の抗原結合タンパク質。
- 請求項27〜39のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 核酸が、SEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項40記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 核酸が、SEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項40記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 核酸が、SEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項40記載の単離されたポリヌクレオチド。
- (a)請求項40〜43のいずれか一項記載のポリヌクレオチド;
(b)該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター;および
(c)ポリアデニル化配列
を含む、核酸ベクター。 - プロモーターがCMVプロモーターである、請求項44記載の核酸ベクター。
- 選択マーカーをコードする核酸を含む、請求項44または45記載の核酸ベクター。
- 選択マーカーがネオマイシン耐性を与える、請求項46記載の核酸ベクター。
- エネルギー転移タンパク質をコードする核酸を含む、請求項44〜47のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- エネルギー転移タンパク質が緑色蛍光タンパク質の誘導体である、請求項48記載の核酸ベクター。
- 緑色蛍光タンパク質の誘導体が黄色蛍光タンパク質(「YFP」)である、請求項49記載の核酸ベクター。
- 環状である、請求項44〜50のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- 直線状である、請求項44〜50のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- 宿主細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項52記載の核酸ベクター。
- 宿主細胞がCHO細胞である、請求項44〜53のいずれか一項記載の核酸ベクター。
- 請求項27〜39のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞。
- CHO細胞である、請求項55記載の宿主細胞。
- (a)細胞表面捕捉タンパク質(CSCP)およびヘテロ二量体タンパク質を宿主細胞において発現させる段階であって、(i)CSCPがヘテロ二量体タンパク質上の第1の部位に結合して、宿主細胞内部でCSCP-ヘテロ二量体タンパク質複合体を形成し、(ii)CSCP-ヘテロ二量体タンパク質複合体が宿主細胞を通って輸送され、(iii)次いで、宿主細胞の表面に提示される、段階;
(b)宿主細胞を、ヘテロ二量体タンパク質上の第2の部位に結合する検出分子と接触させる段階;ならびに
(c)検出分子に結合する宿主細胞を選択する段階
を含む、ヘテロ二量体タンパク質を安定に発現する細胞を検出または単離する方法。 - 段階(c)で宿主細胞を選択する前に、該細胞をブロッキング分子と接触させる段階であって、ブロッキング分子は、ヘテロ二量体タンパク質に結合していないCSCPには結合するが、CSCP-ヘテロ二量体タンパク質複合体には結合しない、段階を含む、請求項57記載の方法。
- 選択する段階(c)が蛍光活性化細胞選別によって実施される、請求項57または58記載の方法。
- ヘテロ二量体タンパク質が複数のサブユニットを含み、ヘテロ二量体タンパク質上の第1の部位が第1のサブユニット上に存在し、かつヘテロ二量体タンパク質上の第2の部位が第2のサブユニット上に存在する、請求項57〜59のいずれか一項記載の方法。
- ヘテロ二量体タンパク質が抗体を含む、請求項60記載の方法。
- 抗体上の第1の部位が、野生型CH3ドメインを含む重鎖上に存在する、請求項61記載の方法。
- 抗体上の第1の部位が、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にヒスチジン残基を含みかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にチロシン残基を含むCH3ドメインを含む重鎖上に存在する、請求項57〜62のいずれか一項記載の方法。
- CSCPが、ヒトIgG1-Fcドメイン、ヒトIgG2-Fcドメイン、またはヒトIgG4-Fcドメインに結合する組換え型の抗原結合タンパク質を含む、請求項57〜63のいずれか一項記載の方法。
- 抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 26のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項57〜64のいずれか一項記載の方法。
- 抗原結合タンパク質が、プロテインAまたはプロテインAの機能的断片を含む、請求項57〜65のいずれか一項記載の方法。
- 抗原結合タンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインを含むキメラタンパク質である、請求項66記載の方法。
- キメラタンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインおよび膜アンカーを含む、請求項67記載の方法。
- キメラタンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインおよびFc受容体の膜貫通ドメインを含む、請求項68記載の方法。
- 抗原結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約40nM未満のKDでポリペプチドに結合する、請求項57〜64のいずれか一項記載の方法。
- CSCPが、(a)SEQ ID NO: 15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 16と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質を含む、請求項57〜70のいずれか一項記載の方法。
- 検出分子(DM)が、SEQ ID NO: 38と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 39と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を含む、請求項71記載の方法。
- CSCPが、(a)SEQ ID NO: 38と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 39と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質を含む抗原結合タンパク質を含む、請求項57〜59のいずれか一項記載の方法。
- 検出分子(DM)が、SEQ ID NO: 15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 16と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を含む、請求項73記載の方法。
- ブロッキング分子が非ヒトIgGまたはヒトFc分子である、請求項57〜74のいずれか一項記載の方法。
- (a)膜アンカードメインを含む融合タンパク質でありかつヘテロ二量体タンパク質の第1のサブユニットに結合できる細胞表面捕捉タンパク質(CSCP)をコードする核酸を、ヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞にトランスフェクトする段階;
(b)高収率でCSCPを発現する(a)の細胞を検出する段階;
(c)高収率でCSCPを発現する該細胞を単離および培養する段階;
(d)ヘテロ二量体タンパク質の第2のサブユニットに結合する検出分子を用いて、段階(c)の単離および培養された細胞の表面のヘテロ二量体タンパク質を検出する段階;ならびに
(e)検出されたヘテロ二量体タンパク質をその表面に有する段階(d)で検出された細胞を単離する段階
を含む、ヘテロ二量体タンパク質を高レベルで産生する細胞を検出および単離する方法。 - ヘテロ二量体タンパク質が抗体を含む、請求項76記載の方法。
- ヘテロ二量体タンパク質の第1のサブユニットが、野生型CH3ドメインを含む重鎖ドメインを含む、請求項76または77記載の方法。
- ヘテロ二量体タンパク質の第1のサブユニットが、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にヒスチジン残基を有しかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にチロシン残基を有しているCH3ドメインを含む重鎖を含む、請求項76〜78のいずれか一項記載の方法。
- CSCPが、ヒトIgG1-Fcドメイン、ヒトIgG2-Fcドメイン、またはヒトIgG4-Fcドメインに結合する組換え型の抗原結合タンパク質を含む、請求項76〜79のいずれか一項記載の方法。
- 組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 26のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項76〜80のいずれか一項記載の方法。
- 組換え型の抗原結合タンパク質が、プロテインAまたはプロテインAの機能的断片を含む、請求項76〜81のいずれか一項記載の方法。
- 組換え型の抗原結合タンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインを含む融合タンパク質である、請求項82記載の方法。
- 融合タンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインおよび膜アンカーを含む、請求項82または83記載の方法。
- 融合タンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインおよびFc受容体の膜貫通ドメインを含む、請求項82〜84のいずれか一項記載の方法。
- 組換え型の抗原結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約40nM未満のKDでポリペプチドに結合する、請求項76〜81のいずれか一項記載の方法。
- 組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 16と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む、請求項76〜81のいずれか一項記載の方法。
- 組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR-1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む、請求項76〜81または87のいずれか一項記載の方法。
- 組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む抗体が結合するのと同じ、CH3ドメイン上のエピトープに結合する、請求項76〜81、87、または88のいずれか一項記載の方法。
- 抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項76〜81または87〜89のいずれか一項記載の方法。
- 抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 15のアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16のアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項76〜81または87〜90のいずれか一項記載の方法。
- CSCPが、(a)SEQ ID NO: 15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 16と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)SEQ ID NO: 17またはSEQ ID NO: 21と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項76〜81のいずれか一項記載の方法。
- CSCPが、SEQ ID NO: 15と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 16と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項76〜81または92のいずれか一項記載の方法。
- CSCPが、SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含むScFv融合タンパク質である、請求項76〜81、92、または93のいずれか一項記載の方法。
- ヘテロ二量体タンパク質の第2のサブユニットが、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にアルギニン残基を含みかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にフェニルアラニン残基を含むCH3ドメインを含む重鎖を含む、請求項76〜94のいずれか一項記載の方法。
- 検出分子(DM)が、ヒトIgG1-Fcドメイン、ヒトIgG2-Fcドメイン、またはヒトIgG4-Fcドメインに結合する標識された組換え型の抗原結合タンパク質を含み、Fcドメインが、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にアルギニン残基を含みかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にフェニルアラニン残基を含む、請求項95記載の方法。
- 検出分子が、標識された抗ヒトIgG F(ab')2を含む、請求項95または96記載の方法。
- 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項96または97記載の方法。
- 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約60nM未満のKDでポリペプチドに結合する、請求項96〜98のいずれか一項記載の方法。
- 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 38と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 39と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む、請求項96〜99のいずれか一項記載の方法。
- 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR-1)、SEQ ID NO: 33のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 34のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、SEQ ID NO: 36のアミノ酸配列を有するLCDR-2、およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を有するLCDR-3を含む、請求項96〜100のいずれか一項記載の方法。
- 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 38と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 39と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項96〜101のいずれか一項記載の方法。
- 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 38のアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項96〜102のいずれか一項記載の方法。
- 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 40と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 41と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む標識された抗体である、請求項96〜103のいずれか一項記載の方法。
- 標識された抗体が、SEQ ID NO: 40と同一のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 41と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項104記載の方法。
- ヘテロ二量体タンパク質の第1のサブユニットが、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にアルギニン残基を有しかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にフェニルアラニン残基を有するCH3ドメインを含む重鎖ドメインを含み、ヘテロ二量体タンパク質の第2のサブユニットが、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にヒスチジン残基を有しかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にチロシン残基を有するCH3ドメインを含む重鎖ドメインを含む、請求項76〜78のいずれか一項記載の方法。
- CSCPが、(a)SEQ ID NO: 38と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 39と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質を含む、請求項106記載の方法。
- ScFv融合タンパク質が、SEQ ID NO: 38と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 39と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項107記載の方法。
- ScFv融合タンパク質がSEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含む、請求項107または108記載の方法。
- 検出分子(DM)が、SEQ ID NO: 15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 16と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む標識された組換え型の抗原結合タンパク質を含む、請求項106〜109のいずれか一項記載の方法。
- 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1 (HCDR-1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む、請求項110記載の方法。
- 検出分子(DM)が、SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む抗体が結合するのと同じ、CH3ドメイン上のエピトープに結合する標識された組換え型の抗原結合タンパク質を含む、請求項106記載の方法。
- 標識された抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 15と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項112記載の方法。
- 標識された抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 15のアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16のアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項112または113記載の方法。
- ブロッキング分子が非ヒトIgGまたはヒトFc分子である、請求項76〜114のいずれか一項記載の方法。
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