JP2015536345A - 組換え型の細胞表面捕捉タンパク質 - Google Patents

Abstract

免疫グロブリンCH3ドメインおよび/または置換されたCH3ドメインを有する分泌性でヘテロ二量体の関心対象のタンパク質(POI)を産生する細胞を単離および検出するのに有用である組換え型の細胞表面捕捉タンパク質および検出分子が提供される。また、二重特異性抗体を単離および検出する組換え型の細胞表面捕捉タンパク質および検出分子も提供される。本発明はまた、CH3ドメインおよび/または改変されたCH3ドメイン、例えば、H95およびY96(IMGT)にアミノ酸置換を有するまたは有しないCH3ドメインを含む関心対象のタンパク質を認識し結合することができる組換え型の抗原結合タンパク質も提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により具体的に本明細書に組み入れられる2012年11月14日に出願された米国特許仮出願第61/726,040号の35USC§119(e)に基づく恩典を主張する。

配列リスト
本出願は、2013年11月12日に作成されたファイル8600WO_ST25.txt(86,267バイト)としてコンピューターで読み取り可能な形態で提出された配列リストを、参照により組み入れる。

発明の分野
本発明の分野は、組換え型の細胞表面捕捉タンパク質、ならびにヘテロ二量体、例えば二重特異性タンパク質である分泌タンパク質を産生する細胞を同定、単離、および富化するための方法に関する。より具体的には、これらの細胞表面捕捉タンパク質および方法により、ヘテロ二量体タンパク質、例えば、二重特異性抗体を分泌する特定のハイブリドーマおよび細胞の迅速かつ効率的な単離を含む、高発現の組換え型抗体産生細胞株の迅速かつ効率的な単離が可能になり、それによって、ヘテロ二量体化学種(二重特異性分子)を富化し、ホモ二量体化学種からヘテロ二量体化学種を優先的に分離することが可能になる。

宿主細胞において関心対象の遺伝子(GOI)を発現させるための先行技術の方法は公知である。簡単に説明すると、GOIを有する発現ベクターが、細胞中に導入される。安定な組込みの後に、高発現細胞を単離するための標準的方法は、細胞プールの回収、プレートからのコロニーの手作業による選別(hand-picking)、限界希釈による単細胞の単離、または当技術分野において公知の他の方法を含む。次いで、プールまたは個々のクローンは、増殖させられ、関心対象のタンパク質(POI)の活性の直接測定、POIの免疫学的検出、または他の適切な技術によって、POIの産生についてスクリーニングされる。これらの手順は、労力を要し非効率的で費用がかかり、通常、解析することができるクローンの数は数百個に制限される。

安定な組込み後の細胞によるタンパク質発現の不均一性の程度が高いため、安定な高発現産生細胞株をもたらす稀な組込み事象を特定することを目指して、多数の個々のクローンをスクリーニングすることが要求される。この要求のために、最も高レベルのタンパク質産生を示す細胞の迅速な同定および単離を可能にする方法が必要とされる。さらに、クローンプールまたは手作業で選別されたコロニーを回収する場合、速く増殖する低発現細胞よりもゆっくりと増殖することが多い高発現細胞を失う危険がある。したがって、分泌POIの高レベル発現が可能な個々の細胞の迅速なスクリーニングおよび単離を可能にする方法が必要とされている。POIが複数のサブユニットを含んでいる場合、ホモ二量体化学種よりも所望のヘテロ二量体化学種を優先的に選択することが必要である。

安定な発現細胞株の単離のために使用される方法にフローサイトメトリーを組み入れることにより、多数の個々のクローンをスクリーニングする能力は向上したが、現在利用可能な方法は、様々な理由から依然として不適切である。また、特徴が異なる細胞間でのPOIの拡散も、問題であった。

簡潔な説明
本発明は、関心対象のタンパク質(POI)を直接的にスクリーニングすることによる、タンパク質を分泌する細胞を迅速に単離するためのハイスループットなスクリーニング方法を説明する。また、本発明により、製造プロセスの間、単細胞ベースでPOI発現を簡便にモニターすることが可能になる。さらに、この技術は、二重特異性抗体産生細胞、またはヘテロ二量体タンパク質を産生する任意の細胞のスクリーニングに直接応用することができる。また、この技術は、改変されたT細胞受容体を産生する細胞、例えば、可溶型のT細胞受容体を産生する細胞のスクリーニングに直接応用することもできる。

1つの局面において、本発明は、a)POIに結合できる細胞表面捕捉分子をコードする核酸分子を構築する段階;b)POIを発現する細胞に段階a)の核酸分子をトランスフェクトする段階;c)POIに結合する検出分子を細胞と接触させることによって、表面に提示されたPOIを検出する段階;およびd)検出分子に基づいて細胞を単離する段階を含む、分泌性の関心対象のタンパク質(POI)を産生する細胞を検出および単離する方法を提供する。

様々な態様において、関心対象のタンパク質には、リガンド、可溶性受容体タンパク質、増殖因子、融合タンパク質、抗体、二重特異性抗体、Fab、単鎖抗体(ScFv)、またはその断片が含まれる。関心対象のタンパク質が抗体である場合、抗体は、IgM、IgG、IgA、IgD、またはIgE、ならびにこれらの様々なサブタイプまたは変異体からなる群より選択される。特定の態様において、抗体は、抗Dll4抗体、抗ErbB3抗体、抗EGFR抗体、二重特異的な抗ErbB3/EGFR二重特異性抗体、または抗IL-6受容体抗体である。

より具体的な態様において、関心対象のタンパク質は、インターロイキン(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、毛様体神経栄養因子(CNTF)、エリスロポエチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンギオポエチン1(Ang-1)、アンギオポエチン2(Ang-2)、TNF、インターフェロン-γ、GM-CSF、TGFβ、およびTNF受容体からなる群より選択される増殖因子である。

様々な態様において、関心対象のタンパク質は、T細胞受容体の可変ドメインを含む。特定の態様において、関心対象のタンパク質は、可溶性T細胞受容体(sTCR)、またはFcに融合されたT細胞受容体細胞外ドメイン(TCR-Fc)を含むタンパク質である。特定の態様において、FcはヒトFcである。様々な態様において、タンパク質は、T細胞受容体細胞外ドメインの可変ドメインを含む。様々な態様において、タンパク質は、T細胞受容体細胞外ドメインの可変ドメインおよび定常領域を含む。

関心対象のタンパク質をコードする核酸は、任意の供給源に由来し、天然に存在するか、または組換え技術によって構築されてよく、DNAライブラリーより選択されてよい。

様々な態様において、細胞表面捕捉分子は、リガンド特異的受容体、受容体特異的リガンド、抗体結合タンパク質、抗体もしくは抗体断片、例えばScFv、またはペプチドである。捕捉分子がペプチドである場合、そのペプチドは、ファージディスプレイライブラリーから単離されてよい。より具体的な態様において、捕捉分子は、Ang1、Ang2、VEGF、Tie1、Tie2、VEGFRI(Flt1)、VEGFRII(Flk1またはKDR)、CNTF、CNTFR-α、サイトカイン受容体構成要素、2つもしくはそれ以上のサイトカイン受容体構成要素の融合物、またはそれらの断片であってよい。捕捉分子が抗体結合タンパク質である場合、その抗体結合タンパク質は、Fc受容体、抗免疫グロブリン抗体、抗免疫グロブリン(抗Ig)ScFv、抗Fc抗体、抗Fc^*抗体、プロテインA、プロテインL、プロテインG、プロテインH、またはそれらの機能的断片であってよい。したがって、いくつかの態様において、捕捉分子は、膜貫通ドメインまたはGPIリンカーに融合された抗原、プロテインA、または抗Ig ScFvを含む、融合タンパク質である。

関心対象のタンパク質がT細胞受容体可変ドメインを含む様々な態様において、細胞表面捕捉分子は、T細胞受容体の可変ドメインによって認識されることができるFc受容体または膜結合抗原を含む。

関心対象のタンパク質がヘテロ二量体タンパク質、例えば、第1のサブユニットおよび第2のサブユニットを有するヘテロ二量体タンパク質であるいくつかの態様において、細胞表面捕捉分子は、第1のサブユニットに結合できるが第2のサブユニットには結合できない抗原、プロテインA、もしくはScFvを含むか、またはそのような細胞表面捕捉分子は、第2のサブユニットに結合するが第1のサブユニットには結合しない。

関心対象のタンパク質が、IgG1、IgG2、IgG4、もしくはプロテインAへの結合をなくす(abrogate)変異を含む1つのCH3ドメインおよびプロテインAに結合できるもう1つのCH3ドメインを有する二重特異性抗体;またはIgG1、IgG2、IgG4に由来するFc領域、もしくはプロテインAへの結合をなくす変異を含む1つのCH3ドメインおよびプロテインAに結合できるもう1つのCH3ドメインを有するFc領域を含む融合タンパク質である様々な態様において、細胞表面捕捉分子は、抗Fcまたは抗Fc^*ScFvなどの抗免疫グロブリンScFvを含む。

いくつかの態様において、本発明の方法は、細胞の外側に露出されるようにPOIを細胞膜につなぎ留める働きをし、したがって細胞表面捕捉分子として機能する膜アンカーもさらに含む。特定の態様において、膜アンカーは、膜貫通アンカーまたはGPIリンクである。具体的な膜貫通アンカーの例には、Fc受容体の膜貫通ドメイン、例えばヒトFcγRIの膜貫通ドメインが含まれ、その例をSEQ ID NO: 17に挙げている。膜アンカーは、細胞に本来備わっていても、組換えでも、または合成であってもよい。

様々な態様において、関心対象のタンパク質はT細胞受容体可変領域を含み、細胞表面捕捉分子は膜結合抗原を含む。特定の態様において、膜結合抗原は、膜アンカーに融合されたT細胞受容体可変領域によって認識されることができる抗原を含む組換え融合タンパク質であり、この抗原は、細胞表面に結合している。特定の態様において、組換え融合タンパク質は、膜貫通アンカーまたはGPIリンクに融合された抗原を含む。別の特定の態様において、細胞表面捕捉分子は、膜アンカー、ならびに限定されるわけではないが、例えば、腫瘍抗原および表現型が形質転換した自己タンパク質を含む、主要組織適合性(MHC)分子に結合できる抗原を含む、組換え融合タンパク質を含む。

別の態様において、タンパク質が細胞表面に輸送され、細胞表面捕捉分子として機能するように、シグナル配列がPOIのアミノ末端に付加される。シグナル配列は、細胞に本来備わっていても、組換えでも、または合成であってもよい。

様々な態様において、細胞表面捕捉分子に結合するブロッキング分子が、発現細胞から隣接細胞へのPOIの拡散を減少させるために添加される。別の態様において、発現細胞から隣接細胞へのPOIの拡散およびその細胞への接着は、媒体の粘度を高めることによって低減される。

本発明の方法によって単離される細胞は、不死化細胞に融合された抗体産生細胞であってよい。より具体的な態様において、抗体産生細胞は、B細胞またはその派生物である。B細胞派生物は、形質細胞、ハイブリドーマ、骨髄腫、または組換え細胞であってよい。

さらに、本発明の方法は、所望の特異性、親和性、またはアイソタイプの分泌性抗体を発現するB細胞およびその派生物、またはハイブリドーマを同定するのに有用である。本発明はまた、所望のレベルの抗体または抗体断片を発現する細胞を単離するのにも使用され得る。

提示されたPOIを有する細胞の検出は、提示されたPOIに直接的にまたは間接的に結合することができる任意の分子を用いることによって達成することができる。このような検出分子によって、POIを提示する細胞の検出および/または単離が容易になり得る。1つの態様において、互いに結合し、示差的に標識されている2つの分子が使用される。検出および/または単離は、当技術分野において公知の標準的技術によって達成され得る。

別の局面において、本発明は、a)POIに結合できる細胞表面捕捉分子をコードする核酸を細胞にトランスフェクトする段階;b)POIをコードする第2の核酸を、同時にまたは続いてa)の細胞にトランスフェクトする段階であって、POIが発現され分泌される段階;c)POIに結合する検出分子を細胞と接触させることによって、表面に提示されたPOIを検出する段階;およびd)検出分子に基づいて細胞を単離する段階を含む、分泌性の関心対象のタンパク質(POI)を産生する細胞を検出および単離する方法を特徴とする。

別の局面において、本発明は、a)高収率で細胞表面捕捉分子を発現する細胞を検出する段階;b)(a)で検出された細胞を単離および培養する段階;c)POIをコードする核酸を、(b)の細胞にトランスフェクトする段階であって、そのようなPOIが分泌される段階;d)POIに結合する検出分子を細胞と接触させることによって、表面に提示されたPOIを検出する段階;ならびにe)検出分子に基づいて細胞を単離する段階を含む、POIを産生する細胞を検出および単離する方法を特徴とする。

別の局面において、本発明は、a)POIに結合できるそのような(such)細胞表面捕捉分子をコードする核酸を、POIを発現する細胞にトランスフェクトする段階;b)高収率で前記細胞表面捕捉分子を発現する(a)の細胞を検出する段階;c)高収率の細胞を単離および培養する段階;d)POIに結合する検出分子を細胞と接触させることによって、表面に提示されたPOIを検出する段階;ならびにe)検出された細胞を単離する段階を含む、高レベルの関心対象のタンパク質(POI)を産生する細胞を検出および単離する方法を提供する。

別の局面において、本発明は、(a)膜アンカードメインを含む融合タンパク質であり、ヘテロ二量体タンパク質の第1のサブユニットに結合できる細胞表面捕捉分子をコードする核酸を、ヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞にトランスフェクトする段階;(b)高収率で表面捕捉分子を発現する(a)の細胞を検出する段階;(c)高収率で表面捕捉分子を発現する細胞を単離および培養する段階;(d)ヘテロ二量体タンパク質の第2のサブユニットに結合する検出分子を用いて、段階(c)の単離および培養された細胞の表面のヘテロ二量体タンパク質を検出する段階;ならびに(e)検出されたヘテロ二量体タンパク質をその表面に有する段階(d)で検出された細胞を単離する段階を含む、高レベルのヘテロ二量体タンパク質を産生する細胞を検出および単離する方法を提供する。

別の局面において、本発明は、(a)免疫グロブリンに結合できる細胞表面捕捉分子をコードする核酸を、免疫グロブリンを発現する細胞にトランスフェクトする段階;(b)高収率で表面捕捉分子を発現する(a)の細胞を検出する段階;(c)高収率で表面捕捉分子を発現する細胞を単離および培養する段階;(d)免疫グロブリンに結合する検出分子を用いて、段階(c)の単離および培養された細胞の表面の免疫グロブリンを検出する段階;ならびに(e)検出された免疫グロブリンをその表面に有する段階(d)で検出された細胞を単離する段階を含む、高レベルの免疫グロブリンを産生する細胞を検出および単離する方法を提供する。

別の局面において、本発明は、(a)ScFv融合タンパク質のような、膜アンカードメインを含む融合タンパク質であり、二重特異性抗体に結合できる細胞表面捕捉分子をコードする核酸を、二重特異性抗体を発現する細胞にトランスフェクトする段階;(b)高収率で表面捕捉分子を発現する(a)の細胞を検出する段階;(c)高収率で表面捕捉分子を発現する細胞を単離および培養する段階;(d)二重特異性抗体に結合する検出分子を用いて、段階(c)の単離および培養された細胞の表面の二重特異性抗体を検出する段階;ならびに(e)検出された二重特異性抗体をその表面に有する段階(d)で検出された細胞を単離する段階を含む、高レベルの二重特異性抗体を産生する細胞を検出および単離する方法を提供する。

別の局面において、T細胞受容体(TCR)可変領域を含む所望のレベルの親和性作用物質(affinity agent)を産生する細胞を検出するための方法が提供される。

別の局面において、(a)TCR-Fcに結合できるFc受容体をコードする核酸を、TCR-Fcによって認識される抗原を発現する細胞にトランスフェクトする段階;(b)高収率でTCR-Fcを発現する(a)の細胞を検出する段階;(c)高収率でTCR-Fcを発現する細胞を単離および培養する段階;(d)検出分子を用いて、段階(c)の単離および培養された細胞の表面の抗原を検出する段階;ならびに(e)検出された抗原をその表面に有する段階(d)で検出された細胞を単離する段階を含む、所望のレベルのTCR-Fcを産生する細胞を検出するための方法が提供される。

様々な態様において、TCRは、ヒトTCR、およびラットTCR、マウスTCR、またはハムスターTCRなどのげっ歯動物TCRより選択される。特定の態様において、FcはヒトFcである。別の特定の態様において、FcはヒトFcであり、Fc受容体は高親和性のヒトFc受容体である。特定の態様において、高親和性ヒトFc受容体はヒトFcγRIである。

様々な態様において、細胞表面捕捉タンパク質は、表面結合型抗原である。特定の態様において、抗原は、膜貫通ドメインまたはGPIリンカーへの融合によって、表面に結合している。

関心対象のタンパク質を産生する増強された細胞を選択するための方法のいくつかの局面において、組換え型の抗原結合タンパク質が、細胞表面捕捉タンパク質(CSCP)、検出分子(DM)、および/またはブロッキング分子として使用され得る。したがって、本発明は、組換え型の抗原結合タンパク質を提供する。

1つの局面において、本発明は、ヒトIgG1-Fcドメイン、ヒトIgG2-Fcドメイン、もしくはヒトIgG4-Fcドメイン、またはヒトFcをコードするSEQ ID NO: 26のアミノ酸配列を例えば含む任意のタンパク質に結合する、組換え型の抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、組換え型の抗原結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約40nM未満のK_Dでポリペプチドに結合する。

いくつかの態様において、組換え型の抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む。1つの場合において、タンパク質は、SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR-1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1);およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む。いくつかの場合において、タンパク質は、SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するHCVR(いくつかは、SEQ ID NO: 15と同一である)およびSEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するLCVR(いくつかは、SEQ ID NO: 16と同一である)を含む。

抗体である組換え型の抗原結合タンパク質は、検出分子(DM)として有用である。

いくつかの態様において、組換え型の抗原結合タンパク質はScFv融合タンパク質であり、いくつかの場合において、ScFv融合タンパク質は、SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一である(または同一である)アミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、SEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一である(または同一である)アミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、および膜アンカードメインを含む。1つの態様において、膜アンカードメインは、SEQ ID NO: 17、または膜貫通ドメインだけでなくC末端細胞質内ドメイン(SEQ ID NO: 18)も含むSEQ ID NO: 21によって表されるように、Fc受容体、例えばヒトFcγR1タンパク質の膜貫通ドメインに由来する。1つの特定の態様において、ScFv融合タンパク質は、SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を有する。ScFv融合タンパク質である組換え型の抗原結合タンパク質は、CSCPおよびDMとして有用である。

別の局面において、本発明は、前述の局面の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。1つの態様において、例えば、抗原結合タンパク質が抗体である場合、ポリヌクレオチドは軽鎖をコードする。同様に、ポリヌクレオチドは重鎖もコードし得る。抗原結合タンパク質がScFv融合タンパク質である場合において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 19のScFv-FcγRTM-cyto融合タンパク質をコードし得る。例えば、SEQ ID NO: 20のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 19をコードする。

別の局面において、本発明は、前述の局面のポリヌクレオチドを含む核酸ベクターを提供する。1つの態様において、ベクターは、上流のプロモーター機能的に連結され、下流のポリアデニル化配列が後に続いている、抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。プロモーターは、例えばCMVプロモーターのような任意のプロモーターであり得る。したがって、1つの場合において、ベクターは、SEQ ID NO: 25の配列を含み得る。1つの態様において、ベクターは、例えばネオマイシン耐性のような選択マーカーをコードする核酸配列を含んでよい。1つの態様において、ベクターは、エネルギー転移タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、またはその誘導体、例えば黄色蛍光タンパク質(YFP)をコードする核酸配列を含んでよい。したがって、1つの場合において、ベクターは、SEQ ID NO: 24の配列を含み得る。

ベクターは、環状でも直線状でもよく、宿主細胞のゲノムに対してエピソームでも宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよい。いくつかの態様において、ベクターは環状プラスミドであり、この環状プラスミドは、1つの特定の態様において、ScFv-FcγR-TM-cytoをコードするポリヌクレオチドとしてSEQ ID NO: 23の核酸配列を有し、別の特定の態様において、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含み、さらに別の特定の態様において、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含む。いくつかの態様において、ベクターは直線状構築物であり、宿主細胞染色体中に組み込まれ得る。1つの特定の態様において、直線状構築物は、ScFv-FcγR-TM-cytoをコードするポリヌクレオチドとしてSEQ ID NO: 22の核酸配列を有する。別の特定の態様において、直線状構築物は、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含む。さらに別の特定の態様において、直線状構築物は、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含む。

宿主細胞は、原核性または真核性の任意の細胞であってよい。しかしながら、1つの特定の態様において、宿主細胞はCHO細胞、例えばCHO-K1細胞である。

別の局面において、本発明は、前記局面の抗原結合タンパク質を発現し、かつ/または前記局面のポリヌクレオチドベクターまたは核酸ベクターを含む、宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、宿主細胞はCHO細胞である。特定の態様において、宿主細胞はCHO-K1細胞である。1つの態様において、宿主細胞は、関心対象のタンパク質の作製において使用され、抗原結合タンパク質は、本出願において開示される方法に従う細胞表面捕捉タンパク質として使用される。

1つの局面において、本発明は、関心対象のタンパク質の作製において有用な宿主細胞を提供する。宿主細胞は、前記局面のポリヌクレオチドベクターまたは核酸ベクターを内部に持ち、細胞表面捕捉タンパク質として役立つ前記局面の抗原結合タンパク質を産生する。細胞表面捕捉タンパク質は、宿主細胞の内部の関心対象のタンパク質に結合し、細胞の分泌装置を通って輸送され、宿主細胞の表面で発現される。したがって、1つの態様において、宿主細胞は、宿主細胞の形質膜中に位置し、捕捉部分が細胞の外側に向いている、細胞表面捕捉タンパク質を含む。1つの態様において、細胞表面捕捉分子は関心対象のタンパク質に結合し、関心対象のタンパク質は形質膜に配置され細胞の外側に向けられる。

1つの態様において、宿主細胞は、IMGT位置95番にヒスチジンを含みIMGT位置96番にチロシンを含むFcドメインを含む関心対象のタンパク質に結合するScFv融合タンパク質を産生するか、または産生することができる。例には、IgG1タンパク質、IgG2タンパク質、およびIgG4タンパク質が含まれる。1つの態様において、ScFv融合タンパク質は、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、およびSEQ ID NO: 31に示すアミノ酸配列を含む。1つの特定の態様において、ScFv融合タンパク質は、SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含む。特定の態様において、宿主細胞は、形質膜に位置し、かつIgG1、IgG2、もしくはIgG4に、またはIgG1、IgG2、もしくはIgG4の少なくとも1つの重鎖を含み、かつ別のタイプのものである第2の重鎖または1つもしくは複数のアミノ酸置換を含む第2の重鎖を有し得る二重特異性抗体に結合する、細胞表面捕捉タンパク質を含む。

1つの局面において、本発明は、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく(a)95R、ならびに(b)95Rおよび96F、もしくはEU番号付与システムに基づく(a')435R、ならびに(b')435Rおよび436Fからなる群より選択される1つもしくは複数のアミノ酸置換を含む置換されたCH3ポリペプチドに、または置換されたヒトFc(Fc^*としても公知)をコードするSEQ ID NO: 42のアミノ酸配列を例えば含む任意のタンパク質に結合する、組換え型の抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの態様において、組換え型の抗原結合タンパク質は、表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約60nM未満のK_Dでポリペプチドに結合する。

いくつかの態様において、組換え型の抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO: 38と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 39と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む。1つの場合において、タンパク質は、SEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR1)、SEQ ID NO: 33のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 34のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 36のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む。いくつかの場合において、タンパク質は、SEQ ID NO: 38と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するHCVR(いくつかは、SEQ ID NO: 38と同一である)およびSEQ ID NO: 39と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するLCVR(いくつかは、SEQ ID NO: 39と同一である)を含む。

いくつかの態様において、組換え型の抗原結合タンパク質は、重鎖および軽鎖を含む抗体である。重鎖は、SEQ ID NO: 40と少なくとも95％同一である(または100％同一である)アミノ酸配列を含み得る。軽鎖は、SEQ ID NO: 41と少なくとも95％同一である(または100％同一である)アミノ酸配列を含み得る。抗体である組換え型の抗原結合タンパク質は、検出分子(DM)として有用である。

いくつかの態様において、組換え型の抗原結合タンパク質はScFv融合タンパク質であり、いくつかの場合において、ScFv融合タンパク質は、SEQ ID NO: 38と少なくとも95％同一である(または同一である)アミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、SEQ ID NO: 39と少なくとも95％同一である(または同一である)アミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、および膜アンカードメインを含む。1つの態様において、膜アンカードメインは、SEQ ID NO: 17、または膜貫通ドメインだけでなくSEQ ID NO: 19のC末端細胞質内ドメインも含むSEQ ID NO: 21によって表されるように、Fc受容体、例えばヒトFcγR1タンパク質の膜貫通ドメインに由来する。1つの特定の態様において、ScFv融合タンパク質は、SEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を有する。ScFv融合タンパク質である組換え型の抗原結合タンパク質は、CSCPおよびDMとして有用である。

別の局面において、本発明は、前述の局面の抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。1つの態様において、例えば、抗原結合タンパク質が抗体である場合、ポリヌクレオチドは、軽鎖、例えばSEQ ID NO: 41の軽鎖をコードする。同様に、ポリヌクレオチドは、重鎖、例えばSEQ ID NO: 40の重鎖もコードし得る。抗原結合タンパク質がScFv融合タンパク質である場合において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 43のScFv-FcγR-TM-cyto融合タンパク質をコードし得る。代表例のポリヌクレオチドには、それぞれSEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、およびSEQ ID NO: 51のポリヌクレオチドが含まれる。

別の局面において、本発明は、前述の局面のポリヌクレオチドを含む核酸ベクターを提供する。1つの態様において、ベクターは、上流のプロモーター機能的に連結され、下流のポリアデニル化配列が後に続いている、抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。プロモーターは、例えばCMVプロモーターのような任意のプロモーターであり得る。したがって、1つの場合において、ベクターは、SEQ ID NO: 47の配列を含み得る。1つの態様において、ベクターは、例えばネオマイシン耐性のような選択マーカーをコードする核酸配列を含んでよい。1つの態様において、ベクターは、エネルギー転移タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)、またはその誘導体、例えば黄色蛍光タンパク質(YFP)をコードする核酸配列を含んでよい。したがって、1つの場合において、ベクターは、SEQ ID NO: 46の配列を含み得る。

ベクターは、環状でも直線状でもよく、宿主細胞のゲノムに対してエピソームでも宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよい。いくつかの態様において、ベクターは環状プラスミドであり、この環状プラスミドは、1つの特定の態様において、ScFv-FcγR-TM-cytoをコードするポリヌクレオチドとしてSEQ ID NO: 44の核酸配列を有し、別の特定の態様において、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドの核酸配列を有し、さらに別の特定の態様において、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドの核酸配列を有する。いくつかの態様において、ベクターは直線状構築物であり、宿主細胞染色体中に組み込まれ得る。1つの特定の態様において、直線状構築物は、ScFv-FcγR-TM-cytoをコードするポリヌクレオチドとしてSEQ ID NO: 51の核酸配列を含む。別の特定の態様において、直線状構築物は、抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドとしてSEQ ID NO: 50の核酸配列を含む。さらに別の特定の態様において、直線状構築物は、抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドとしてSEQ ID NO: 49の核酸配列を含む。

宿主細胞は、原核性または真核性の任意の細胞であってよい。しかしながら、1つの特定の態様において、宿主細胞はCHO細胞、例えばCHO-K1細胞である。

別の局面において、本発明は、前記局面の抗原結合タンパク質を発現し、かつ/または前記局面のポリヌクレオチドベクターまたは核酸ベクターを含む、宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、宿主細胞はCHO細胞である。特定の態様において、宿主細胞は、CHO-K1 細胞である。1つの態様において、宿主細胞は、関心対象のタンパク質の作製において使用され、抗原結合タンパク質は、本出願において開示される方法に従う細胞表面捕捉タンパク質として使用される。

1つの局面において、本発明は、関心対象のタンパク質の作製において有用な宿主細胞を提供する。宿主細胞は、前記局面のポリヌクレオチドベクターまたは核酸ベクターを内部に持ち、細胞表面捕捉タンパク質として役立つ前記局面の抗原結合タンパク質を産生する。細胞表面捕捉タンパク質は、宿主細胞の内部の関心対象のタンパク質に結合し、細胞の分泌装置を通って輸送され、宿主細胞の表面で発現される。したがって、1つの態様において、宿主細胞は、宿主細胞の形質膜中に位置し、捕捉部分が細胞の外側に向いている、細胞表面捕捉タンパク質を含む。1つの態様において、細胞表面捕捉分子は関心対象のタンパク質に結合し、関心対象のタンパク質は形質膜に配置され細胞の外側に向けられる。

1つの態様において、宿主細胞は、IMGT位置95番にアルギニンを含みIMGT位置96番にフェニルアラニンを含むFcドメイン(Fc^*)を含む関心対象のタンパク質に結合するScFv融合タンパク質を産生するか、または産生することができる。例には、IgG3タンパク質、ならびにIgG1タンパク質、IgG2タンパク質、およびIgG4タンパク質の置換されたCH3領域が含まれる。1つの態様において、ScFv融合タンパク質は、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、およびSEQ ID NO: 37に示すアミノ酸配列を含む。1つの特定の態様において、ScFv融合タンパク質は、SEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含む。特定の態様において、宿主細胞は、形質膜に位置し、かつIgG3、もしくは置換されたIgG1、IgG2、もしくはIgG4(IMGT位置95番にアルギニンを含みIMGT位置96番にフェニルアラニン(「Fc^*」)を含む)に、またはFc^*タイプの少なくとも1つの重鎖および野生型IgG1、IgG2、もしくはIgG4のもう1つの重鎖を含む二重特異性抗体に結合する、細胞表面捕捉タンパク質を含む。

別の局面において、本発明は、関心対象のタンパク質(POI)を安定に発現する細胞を検出、単離、または富化する方法を提供する。この方法は、細胞表面捕捉タンパク質(CSCP)およびPOIを宿主細胞において発現させる段階を含む。この方法によれば、CSCPは、POI上の「第1の部位」に結合して、宿主細胞の内部でCSCP-POI複合体を形成する。次いで、このCSCP-POI複合体は、宿主細胞の分泌系によって輸送され、細胞から分泌される。CSCPは膜結合ドメイン(例えばSEQ ID NO: 17)を含むため、CSCP-POI複合体は、宿主細胞の表面に、POIが細胞の外側に露出された状態で提示される。この方法によれば、次いで、宿主細胞は、POIの「第2の部位」に結合する検出分子(DM)と接触させられる。DMに結合する細胞が、同定、単離、プール(pooling)、および/または富化のために選択される。1つの態様において、DMが結合した宿主細胞は、蛍光活性化細胞選別によって選択される。

1つの態様において、方法は、宿主細胞を選択する前に、細胞をブロッキング分子と接触させる段階も含む。ブロッキング分子は、POIに結合していない任意のCSCPに結合する。ブロッキング分子は、CSCP-POI複合体には結合しない。

いくつかの態様において、POIは、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む抗体のように、複数のサブユニットを含む。その場合、POI上の第1の部位は第1のサブユニット上に存在し得、POI上の第2の部位は第2のサブユニット上に存在し得る。いくつかの態様において、POIは、ヘテロ二量体タンパク質のように複数のサブユニットを含む。ヘテロ二量体タンパク質の場合、POI上の第1の部位は、第1の受容体のような第1のサブユニット上に存在し得、POI上の第2の部位は、第2の受容体または補助受容体のような第2のサブユニット上に存在し得る。いくつかの態様において、ヘテロ二量体タンパク質は、相互作用してヘテロ二量体を形成する様々な受容体である。POIが抗体である場合、POI上の第1の部位は第1の重鎖上に存在し得、POI上の第2の部位は第2の重鎖上に存在し得る。いくつかの態様において、抗体は、例えば、野生型CH3ドメインを有する少なくとも1つの重鎖およびCH3ドメイン中に少なくとも1つのアミノ酸置換を有するもう1つの重鎖を有する抗体のように、少なくとも1つのアミノ酸が異なるサブユニットを含む。この場合、CSCPは、本明細書において説明する抗原結合タンパク質、例えば、抗原または抗Ig ScFv融合タンパク質であってよい。この際、検出分子(DM)は、本明細書において説明する標識された組換え型の抗原結合タンパク質、例えば、標識された抗原または抗Ig抗体もしくはScFv分子を含んでよい。

いくつかの場合において、例えば、POIが二重特異性抗体である場合、第1の部位は、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にヒスチジン残基を含みIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にチロシン残基を含むCH3ドメインを有する重鎖(Fc)上に存在し得る。その場合、第2の部位は、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にアルギニン残基を含みIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にフェニルアラニン残基を含むCH3ドメインを有する重鎖(Fc^*)上に存在し得る。この場合、CSCPは、前記局面において説明した抗原結合タンパク質、例えば、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を含むScFv融合タンパク質であってよく、特定の態様において、SEQ ID NO: 19を含む。また、この際、検出分子(DM)は、前記局面で説明した標識された組換え型の抗原結合タンパク質、例えば、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を含む抗体またはScFv分子を含んでよく、特定の態様において、SEQ ID NO: 40およびSEQ ID NO: 41(抗Fc^*抗体)、またはSEQ ID NO: 43(ScFv^*)のいずれかを含む。この際、ブロッキング分子は、hFcのようなFcポリペプチド(例えば単鎖)、またはCSCPに結合できるがDMに同様に結合することはない任意の分子であってよい。1つの態様において、検出分子は、標識された抗ヒトIgG F(ab')₂であってよい。

POIが二重特異性抗体である他の場合において、第1の部位は、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にアルギニン残基を含みIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にフェニルアラニン残基を含むCH3ドメインを有する重鎖(Fc^*)上に存在し得る。その場合、第2の部位は、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にヒスチジン残基を含みIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にチロシン残基を含むCH3ドメインを有する重鎖上に存在し得る。この場合、CSCPは、前記局面において説明した抗原結合タンパク質、例えば、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を含むScFv融合タンパク質であってよく、特定の態様において、SEQ ID NO: 43を含む。また、この際、検出分子(DM)は、前記局面で説明した標識された組換え型の抗原結合タンパク質、例えば、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を含む抗体またはScFv分子を含んでよく、特定の態様において、重鎖および軽鎖(抗hFc抗体)、またはSEQ ID NO: 19(ScFv)のいずれかを含む。この際、ブロッキング分子は、Fc^*ポリペプチド(例えば単鎖)、またはCSCPに結合できるがDMに同様に結合することはない任意の分子であってよい。1つの態様において、検出分子は、標識された抗ヒトIgG F(ab')₂であってよい。

いくつかの局面において、本発明は、(a)細胞表面捕捉タンパク質(CSCP)およびヘテロ二量体タンパク質を宿主細胞において発現させる段階であって、(i)CSCPがヘテロ二量体タンパク質上の第1の部位に結合して、宿主細胞内部でCSCP-ヘテロ二量体タンパク質複合体を形成し、(ii)CSCP-ヘテロ二量体タンパク質複合体が宿主細胞を通って輸送され、(iii)次いで、宿主細胞の表面に提示される、段階;(b)宿主細胞を、ヘテロ二量体タンパク質上の第2の部位に結合する検出分子と接触させる段階;ならびに(c)検出分子に結合する宿主細胞を選択する段階を含む、ヘテロ二量体タンパク質を安定に発現する細胞を検出または単離する方法を提供する。いくつかの態様において、ヘテロ二量体タンパク質は複数のサブユニットを含み、ヘテロ二量体タンパク質上の第1の部位は第1のサブユニット上に存在し、ヘテロ二量体タンパク質上に存在する第2の部位は第2のサブユニット上に存在する。いくつかの態様において、細胞表面捕捉分子は、第1のサブユニットに結合できるが第2のサブユニットには結合できない抗原、プロテインA、またはScFvを含む。

1つの局面において、本発明は、細胞表面捕捉タンパク質(「CSCP」)、抗体軽鎖、IMGT位置95番にヒスチジンを含みIMGT位置96番にチロシンを含むCH3ドメインを含む第1の抗体重鎖、およびIMGT位置95番にアルギニンを含みIMGT位置96番にフェニルアラニンを含むCH3ドメインを含む第2の抗体重鎖を宿主細胞において発現させる段階を含む、二重特異性抗体を作製する方法を提供する。宿主細胞の内部に存在する間に、CSCPは第1の抗体重鎖に結合するが第2の抗体重鎖には結合せず、第2の抗体重鎖が第1の抗体重鎖に結合し、かつ軽鎖がそれらの重鎖に結合し、したがって、CSCP-抗体三元複合体を形成する。この三元複合体は分泌され、宿主細胞の表面に提示される。宿主細胞は、ブロッキング分子と接触させられる場合がある。このブロッキング分子は、細胞表面のCSCPに結合するが、ただし、CSCPが関心対象の抗体に結合していない状況に限っており、すなわち「空の」CSCPに結合する。次いで、宿主細胞は、第2の抗体重鎖に結合するか、または結合できるDMと接触させられる。DMに結合する宿主細胞が、同定、選択、および/またはプールされる。いくつかの態様において、DMに結合する宿主細胞が選択、プール、培養、および増殖させられ、次いで、もう1巡の発現、検出、選択、プール、および増殖に供される。この工程を複数回反復して、高力価の二重特異性抗体の産生を豊富にすることができる。

1つの態様において、方法で使用されるCSCPは、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を含むScFv融合タンパク質である。1つの態様において、CSCPは、SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含む。1つの態様において、方法で使用されるDMは、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を含むタンパク質である。1つの態様において、DMは、SEQ ID NO: 40の重鎖配列およびSEQ ID NO: 41の軽鎖配列を含む抗体である。別の態様において、DMは、SEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含むScFv融合タンパク質である。標識、例えば、FITCまたはAlexa Fluor(登録商標)488のような蛍光部分がDMに結合されてもよい。蛍光活性化細胞選別が、検出および選択の手段として使用され得る。

代替の態様において、二重特異性抗体を作製する方法は、細胞表面捕捉タンパク質(「CSCP」)、抗体軽鎖、IMGT位置95番にアルギニンを含みIMGT位置96番にフェニルアラニンを含むCH3ドメインを含む第1の抗体重鎖(Fc^*)、およびIMGT位置95番にヒスチジンを含みIMGT位置96番にチロシンを含むCH3ドメインを含む第2の抗体重鎖を宿主細胞において発現させる段階を含む。宿主細胞の内部に存在する間に、CSCPは第1の抗体重鎖に結合するが第2の抗体重鎖には結合せず、第2の抗体重鎖が第1の抗体重鎖に結合し、かつ軽鎖がそれらの重鎖に結合し、したがって、CSCP-抗体三元複合体を形成する。この三元複合体は分泌され、宿主細胞の表面に提示される。宿主細胞は、ブロッキング分子と接触させられる場合がある。このブロッキング分子は、細胞表面のCSCPに結合するが、ただし、CSCPが関心対象の抗体に結合していない状況に限っており、すなわち「空の」CSCPに結合する。次いで、宿主細胞は、第2の抗体重鎖に結合するか、または結合できるDMと接触させられる。DMに結合する宿主細胞が、同定、選択、および/またはプールされる。いくつかの態様において、DMに結合する宿主細胞が選択、プール、培養、および増殖させられ、次いで、もう1巡の発現、検出、選択、プール、および増殖に供される。この工程を複数回反復して、高力価の二重特異性抗体の産生を豊富にすることができる。

この代替の態様の1つの態様において、方法で使用されるCSCPは、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を含むScFv-融合タンパク質である。1つの態様において、CSCPは、SEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含む。1つの態様において、方法で使用されるDMは、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を含むタンパク質である。1つの態様において、DMは、重鎖配列および軽鎖配列を含む抗体である。別の態様において、DMは、SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含むScFv融合タンパク質である。標識、例えば、FITCまたはAlexa Fluor(登録商標)488のような蛍光部分がDMに結合されてもよい。蛍光活性化細胞選別が、検出および選択の手段として使用され得る。

第1の態様および代替の態様の両方において、選択、プール、および増殖の反復から得られた産物である宿主細胞は、少なくとも2g/Lの力価の二重特異性抗体を産生できるか、または実際に(does)産生し、その際、二重特異性抗体種(Fc/Fc^*)は、宿主細胞によって産生される抗体全体(Fc/Fc+Fc^*/Fc^*+Fc/Fc^*)の少なくとも40質量％に相当する。

他の目的および利点は、以下の詳細な説明を再検討することによって明らかになると考えられる。

詳細な説明
本発明の方法を説明する前に、本発明は、説明される特定の方法および実験条件に限定されず、したがって、方法および条件は変化し得ることを理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を説明することだけを目的とし、限定することを意図しないことも理解すべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈において特に規定がない限り、複数の指示内容を含む。したがって、例えば、「1つの方法」への言及は、本明細書において説明する、かつ/または本開示などを読むと当業者に明らかになると考えられるタイプの、1つまたは複数の方法および/または段階を含む。

他に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において説明されるものと同様または等価な任意の方法および材料を、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に説明する。本明細書において言及される刊行物はすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

概要
本発明の方法は、タンパク質分泌細胞を単離および同定するための現行の方法よりも優れた実質的利点を提供する。例えば、抗体を分泌する細胞が、所望の特異性、結合活性、またはアイソタイプに基づいて迅速かつ簡便に単離され得る。さらに、分泌タンパク質の産生が間接的に定量される先行技術の多くの方法とは違って、産生された分泌タンパク質の量が直接的に定量され得る。

最近、フローサイトメトリーを利用する別の方法がさらに2つ、安定な高発現細胞株のハイスループットな単離のために開発された。1つ目の方法は、GOI mRNAを得るための転写読み取りを含むように発現プラスミドを改変することを含む。これは、ほとんどの場合、配列内リボソーム進入部位(IRES)およびそのタンパク質産物がフローサイトメトリーによって容易にモニターされる(最も頻繁であるのは、緑色蛍光タンパク質(GFP))遺伝子をGOIの停止コドンと末端ポリA部位の間に挿入することによって達成される(Meng et al. (2000) Gene 242:201)。IRESが存在することにより、POIおよびGFPが同じmRNAから翻訳されることが可能になる。したがって、GFP遺伝子の発現レベルは、GOIのmRNAレベルと間接的に関係している。GFPを高レベルで蓄積するクローンがフローサイトメトリーによって単離され、次いで、POI産生に関してスクリーニングされる。この方法は、組換え構築物中でIRESを使用することによりGOI発現をレポーター遺伝子と結び付ける(coupling)ことに依存しているため、ハイブリドーマの単離には応用できない。

発現クローンを単離する際にフローサイトメトリーを使用することにより、ハイスループットな形式で多数のクローンを迅速に解析することが可能になる。さらに、フローサイトメトリーの使用により、細胞を直接取り扱うことが顕著に減る。あいにく、GFP産生のレベルは、POIの産生レベルの直接的指標ではない。様々なメカニズムが原因となって、分泌POIの産生とGFPの蓄積との結び付きがなくなり(uncouple)得る。POI産生とGFPレポーター産生の差は、これら2種の遺伝子の翻訳効率、POIの分泌効率、またはポリシストロニックmRNAの安定性の差に起因し得る。

フローサイトメトリーを使用して発現クローンを単離するもう1つの方法は、アガロース微小滴内に細胞を封入することを含む(Weaver et al. (1990) Methods Enzymol. 2:234)。この方法では、POIに特異的なビオチン標識抗体が、ストレプトアビジンを介してビオチン標識アガロースに結合され、その結果、分泌されたPOIが捕捉され、微小滴内に保持される(Gray et al., (1995) J. Immunol. Methods 182:155)。閉じ込められたPOIは、POIに特異的な抗体を用いた免疫染色によって検出される。封入しているアガロースが隣接細胞から分泌されるPOIを吸収するのを減らすために、細胞は低透過性媒体中に置かれる。包埋しているアガロース中のPOIの抗体染色の程度が最も高い細胞が、フローサイトメトリーによって同定され単離される。このゲル微小滴アプローチは、GOI mRNAの発現について間接的にスクリーニングするのではなく、POIを分泌する能力について細胞を直接的にスクリーニングするが、分泌されたPOIを閉じ込め染色するのに適切な抗体を入手できる必要があり、その手順では、アガロースゲル微小滴を作製するための特殊な機器が必要となる。さらに、一部の細胞は、封入工程に敏感である可能性がある。

この方法の変形法は、POIに特異的な抗体を細胞表面に直接的に結合することにより、マトリックス中に細胞を包埋する必要を回避している(Manz et al. (1995) PNAS 92:1921-1925)。この方法では、ビオチン-ヒドロキシスクシンイミドエステルによって細胞表面タンパク質を非特異的にビオチン標識した後に、POIに結合できるストレプトアビジン結合抗体と接触させる。POIを分泌する細胞は、POIでラベルされ(decorated)、次いで、適切に標識された二次抗体を用いて検出される。しかしながら、隣接細胞間でのPOIの拡散が問題であり、この方法もまた、POIが拡散して発現細胞から離れるのを減らすために、高粘度の媒体を必要とする。細胞を区別するのに、これら高粘度の媒体が必要とされるため、細胞は、洗浄され、かつそのように所望される場合には、細胞選別に適した媒体中に入れられなければならない。

高発現組換え細胞株の同定および単離に関連するこれらの問題は、関心対象の抗体を発現するハイブリドーマの単離に特に当てはまる。しかしながら、有用なハイブリドーマの同定は、いくつかのさらなる問題を含む;それらは、抗原結合活性について最初に、次いで、免疫グロブリンアイソタイプについてスクリーニングされなければならない。さらに、GFPに基づく方法は、ハイブリドーマの同定および単離には応用できない。ハイブリドーマの構築は、抗体遺伝子の発現をGFPのような転写レポーターに関連づけることができるような組換え構築物を含まないことがその理由である。ハイブリドーマのスクリーニングは、スクリーニングされるクローンの数が既存の技術によって限定されている、遅くて労力を要する試みである。

本発明は、分泌タンパク質を産生する細胞を同定および単離する、新規かつ以前に知られていない方法を説明する。本発明は、POIに結合する細胞表面に局在した分子を発現する細胞株の作製に基づいている。次いで、細胞表面に提示されたPOIは、様々な検出分子で標識することによって検出することができる。細胞表面に提示されたPOIの量は、特定の条件下では、分泌されたPOIの総量の直接的測定値である。次いで、POI生産者(producers)は、非生産者から分離され得、産生レベルまたはPOIの特徴が区別され得る。本発明の利点は、mRNAを間接的に測定するのではなく、分泌されたPOIを直接的に定量することである。

本発明は、POIを産生する同じ細胞において様々な分泌POIに結合する細胞表面捕捉分子を発現する細胞の構築または使用に関する。細胞がPOIを分泌するとすぐに、これらの細胞表面捕捉分子がそれに結合するか、またはPOIと細胞表面捕捉分子の複合体が細胞内で形成し、次いで分泌され得る。結合は、オートクリン様式で、または分泌されている間に起こり得る。次いで、分泌POIを産生する細胞が、同定され単離され得る。このような同定および単離は、POIの特徴、POIの産生もしくはその欠如に基づいてよく、または指定された産生レベルに基づいて(by)よい。細胞表面捕捉分子および/もしくはPOIは、天然の状態で細胞によって産生されてもよく、または細胞表面捕捉分子および/もしくはPOIは、組換えによって作製されてもよい。そのような細胞の構築または使用を通じて、二者(分泌タンパク質と細胞表面捕捉分子)の間に対応する親和性が存在するという前提で、任意の分泌タンパク質は細胞表面捕捉分子によって捕捉されることができる。さらに説明するように、細胞表面捕捉分子として使用できるように任意の分子を操作することができる。したがって、本発明は、タンパク質を分泌する任意の細胞を単離するのに使用され得る。

たいていの任意のタンパク質は、本発明によって説明する細胞表面捕捉分子として機能する能力を有している。必要となるのは、所望のタンパク質が細胞膜につなぎ留められ、細胞外空間に露出されるのが可能になることである。所望の細胞がシグナル配列を有している場合、それが細胞膜につなぎ留められ細胞の外側に露出されたままとなるように細胞表面捕捉分子に付加される必要があるのは、膜貫通アンカーまたはGPI連結シグナルを非限定的に含む膜アンカーだけである。さらに、所望のタンパク質がシグナル配列を欠いている場合、それが細胞表面に輸送されるように、所望のタンパク質のアミノ末端にシグナル配列を付加してもよい。シグナル配列および膜アンカーは、細胞に本来備わっていても、組換えでも、または合成であってもよい。

細胞はしばしば、内因的にまたは組換えDNAの導入後に、多種多様のタンパク質を分泌する。本発明の方法に従って、任意の分泌タンパク質を同定することができ、それを産生する細胞を単離することができる。このような分泌タンパク質には、増殖因子、増殖因子受容体、リガンド、可溶性受容体構成要素、抗体、二重特異性抗体、組換えTrap分子、Fcを含む融合タンパク質、sTCR、TCR-Fc'、およびペプチドホルモンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。このような分泌タンパク質は、組換えであってもなくてもよい。すなわち、所望の細胞からの関心対象のいくつかのタンパク質の分泌には、付加的なヌクレオチド配列の導入が必要ではない場合がある。例えば、B細胞または形質細胞からの抗体の分泌は、B細胞または形質細胞に組換えヌクレオチド配列を導入した結果ではない。組換え分泌タンパク質は、当業者に周知の標準的な分子生物学技術によって作製され得る(例えば、Sambrook, J., E. F. Fritsch And T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols 1, 2, and 3, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley Interscience, NYを参照されたい)。これらの分泌タンパク質は、多くの商業的目的および研究目的にとって有用である。本発明は、本発明の方法論によるこのような分泌タンパク質の作製を包含する。提示されたPOIを有する細胞の検出は、提示されたPOIに直接的にまたは間接的に結合できる任意の分子を用いることによって達成することができる。このような検出分子によって、POIを提示する細胞の検出および/または単離が容易になり得る。

本発明は、特に、a)細胞表面捕捉分子としてリガンド特異的受容体を用いることによる、リガンド産生細胞の、b)細胞表面捕捉分子として表面結合受容体特異的リガンドを用いることによる、可溶性受容体産生細胞の、c)細胞表面捕捉分子として抗体結合タンパク質を用いることによる、抗体産生細胞の、d)細胞表面捕捉分子としてs-TCR結合タンパク質(例えば、TCRによって認識される抗原)を用いることによる、sTCR'の、e)細胞表面捕捉分子としてFc結合タンパク質を用いることによる、TCR-Fc'の、またはf)FcγR膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインに融合されたScFvドメインを含む融合タンパク質捕捉分子を用いることによる、プロテインA結合をなくす変異をCH3ドメインの内の1つに含む二重特異性抗体の、単離に応用可能である。

本発明の方法論によれば、最初に、細胞は、細胞表面捕捉分子が発現される条件下で、分泌POIに結合できる細胞表面捕捉分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターでトランスフェクトされる。次いで、このような細胞表面捕捉分子の適切な生産者であるトランスフェクトされた細胞は、検出および単離され、このような細胞が培養される。これらの細胞がPOIを自然に産生してもよく、またはPOIは組換えによって作製されてもよい。細胞がPOIを自然に産生する場合、それらはそのまま検出および単離できる。POIが組換えによって作製されることになる場合、指定の細胞表面捕捉分子を発現する単離され培養された細胞は、分泌POIが発現される条件下で、分泌POIをコードする第2のヌクレオチド配列をトランスフェクトされる。発現されると、分泌されたPOIは細胞表面捕捉分子に結合し、結合されたPOIを提示している細胞が検出および単離される。

POIが細胞によって自然に産生される場合、細胞は、POIをコードするヌクレオチド配列をトランスフェクトされない。したがって、本発明のこの局面は、POIを産生する任意およびすべての細胞に応用可能である。さらに、細胞表面捕捉分子が細胞によって自然に産生される場合、細胞は、細胞表面捕捉分子をコードするヌクレオチド配列をトランスフェクトされる必要がない。したがって、本発明のこの局面は、細胞表面捕捉分子を産生する任意およびすべての細胞に応用可能である。

多種多様の宿主細胞が、トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、原核生物由来または真核生物由来のいずれかであってよい。これらの細胞は、しばしば、不死化された真核細胞、特に、哺乳動物細胞、例えばサル腎臓細胞(COS)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、HeLa細胞、仔ハムスター腎臓細胞(BHK)、ヒト胎児由来腎臓細胞(HEK293)、白血球、骨髄腫、アデノウイルス遺伝子、例えば、AD5 E1をトランスフェクトされた細胞株(限定されるわけではないが、アデノウイルス遺伝子をトランスフェクトされた不死化ヒト網膜細胞、例えばPER.C6(商標)細胞を含む)、および胚性幹細胞である。また、これらの細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、および昆虫細胞を含む非哺乳動物細胞であってもよく、限定されるわけではないが、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilus)、アスペルギルス(Aspergillus)属の各種、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)が含まれる。細胞はすべて、適切な条件下の培養トレーの培地中で、または相助関係的な宿主中で増殖させてよい。最も望ましい細胞は、培養可能な哺乳動物細胞であると考えられる。

細胞表面捕捉分子に結合した分泌POIは、当技術分野において公知の様々な技術によって検出および単離され得る。分泌POIを提示している培養細胞は、分泌POIに直接的にまたは間接的に結合できる分子と接触させられてよく、その際、そのような検出分子は、例えば、発色性標識、蛍光原性標識、着色標識、蛍光性標識、または磁性標識などの検出標識を含んでよい。様々な方法を用いて、検出分子に結合された標識が検出され、細胞が単離され得る。最も好ましくは、細胞集団内で標識が検出され、フローサイトメトリーを用いて細胞が単離される。あるいは、検出分子は、POIを提示する細胞を直接的に単離するのに使用されることもできる。これは、培養プレート、常磁性分子、または他の任意の粒子もしくは固体支持体に検出分子を結合することによって達成することができる。さらに、提示されたPOIは、検出分子またはPOIの性質に基づいて、直接的に検出することもできる。

1つの態様において、互いに結合し差次的に標識されている2つの検出分子が、その相互作用を妨害する提示された分泌POIを検出するのに使用される。細胞が、第1の検出分子に結合し、第1の検出分子と第2の検出分子との相互作用を妨害する分泌POIを提示する場合、その細胞は、表面に第1の検出分子のみが存在することに基づいて単離され得る。それに対して、細胞が、第1の検出分子に結合するが、第1の検出分子と第2の検出分子との相互作用を妨害しない分泌POIを提示する場合、その細胞は、表面に両方の検出分子が存在することに基づいて単離され得る。例えば、受容体-リガンド複合体の形成を特異的に妨害するか、または妨害しない抗体を発現する抗体産生細胞が同定され得る。検出分子が、差次的に標識された受容体およびそのリガンドである場合、受容体-リガンド複合体が形成するのを妨害する抗体を発現する抗体産生細胞は、表面に1つの標識が存在することに基づいて検出され得るのに対し、受容体-リガンド複合体が形成するのを妨害しない抗体を発現する抗体産生細胞は、表面に両方の標識が存在することに基づいて検出され得る。

態様のいずれかにおいて、非発現細胞または発現が少ない細胞から発現細胞を分離することに関して、POIが分泌タンパク質である場合、主な困難の1つは、隣接細胞間でのPOIの拡散である。したがって、細胞表面の分泌POIを捕捉するように設計されている任意の方式は、発現細胞から隣接細胞へのPOIの拡散およびその細胞への接着を防がなければならないことが不可欠である。拡散が起こることが可能であり、隣接細胞が分泌POIでラベルされる場合、POIラベルの程度に基づく細胞分離では、高発現細胞と発現レベルの低い細胞とを区別することができず、発現細胞を非発現細胞から効果的に分離できない場合がある。

したがって、本発明の1つの態様は、隣接細胞間での分泌POIの拡散を妨害することである。これは、細胞表面捕捉分子またはPOIのいずれかに結合し、分泌POIが細胞表面捕捉分子に結合するのを防ぐブロッキング分子を添加することによって達成することができる。この局面において、検出分子は、ブロッキング分子に結合しない。例えば、細胞表面受容体がhFcγRIであり、分泌POIがヒトIgG Fc断片を有している場合、外因性ラットIgGを培地に添加することによって、隣接細胞間での分泌POIの拡散を妨害することができる。分泌POIを提示し、結合されたラットIgGは提示していない細胞の検出は、ヒトIgG Fcに特異的でありラットIgGを認識しない抗体を使用することによって実現する。別の態様において、隣接細胞間での分泌POIの結合は、媒体の粘度を高めることによって低減される。

本発明の1つの態様において、分泌POIは、培地中に蓄積することができない。これは、POIを短時間発現させて、細胞表面捕捉分子に結合するには十分であるが拡散するには不十分な量のPOIが生じるように、分泌POIおよび/または細胞表面捕捉分子の発現を調節することによって達成することができる。別の態様において、細胞は、蓄積したPOIを含む培地から除去されてよく、それらの細胞に結合したPOIは取り除かれ、分泌POIが培地中に蓄積しないように限定された期間、POIの発現を継続することが許容される。タンパク質は、当技術分野において公知の方法、例えば、低pH緩衝液で細胞を洗浄することによって、取り除くことができる。

本発明によれば、最も多くの検出分子に結合する細胞集団中の細胞は、最も多くの分泌POIも発現する。実際、個々の細胞が分泌するPOIが多いほど、細胞表面に提示されるPOIは多い。表面に提示されるPOIの量とその細胞におけるPOIの発現レベルとにこの相関関係があるため、所望の相対的発現レベルを有する細胞を細胞集団から迅速に同定することが可能になる。

1つの態様において、DNAライブラリーが、細胞表面捕捉分子によって細胞表面に提示され得る分泌タンパク質を発現させるのに使用され得る。例えば、DNAライブラリーは、免疫化された動物から単離されたB細胞に由来する抗体可変ドメインのコード領域から作製されてもよい。その場合、所望の特異性、アイソタイプ、または結合活性のクローンを本発明の方法によって同定および単離できるように、抗体に特異的な細胞表面捕捉分子を発現する細胞においてDNAライブラリーを発現させてよい。別の態様において、DNAライブラリーは、T細胞に由来するT細胞受容体可変ドメインのコード領域から作製され、例えばFc結合タンパク質に結合できるFcに融合され得る。その場合、所望の特異性、アイソタイプ、または結合活性のクローンを本明細書において説明するようにして同定および単離できるように、Fc結合タンパク質を発現する細胞においてDNAライブラリーを発現させてよい。

別の態様において、1種または複数種の細胞型において特定の細胞表面捕捉分子を発現するトランスジェニック哺乳動物が作り出され得る。次いで、このようなトランスジェニック哺乳動物に由来する細胞は、POIの産生に関して直接的にスクリーニングされ得る。例えば、形質細胞において抗体に特異的な細胞表面捕捉分子を発現させることが望ましい場合がある。したがって、免疫化されたマウスに由来する形質細胞を採取してよく、所望の抗原に特異的な抗体を産生する細胞を本発明の方法によって単離することができる。

本発明のさらなる態様において、抗体産生は、POIである特定の抗体またはTCR-Fcに結合するヒトFcγR1 受容体(FcγRI)を発現するCHO細胞株の使用を通じて測定される。

本発明の別の局面において、関心対象のタンパク質は、1つまたは複数のT細胞受容体可変ドメインまたは可溶性T細胞受容体を含む。1つまたは複数のT細胞受容体可変ドメインは、細胞表面捕捉タンパク質に結合できる部分に共有結合的に連結され得る。特定の態様において、1つまたは複数のT細胞受容体可変ドメインは、Fc配列、例えば、ヒトFc配列に融合され、細胞表面捕捉タンパク質は、Fc受容体、例えば、FcγRである。

TCR可変ドメインの一般的構造は公知である(例えば、参照により本明細書に組み入れられるLefranc and Lefranc (2001) The T Cell Receptor FactsBook, Academic Press(例えば17〜20頁を参照されたい)を参照されたい;また、それぞれ参照により本明細書に組み入れられるLefranc et al. (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, Developmental and Comparative Immunology 27:55-77およびLefranc et al. (2005) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains, Developmental and Comparative Immunology 29:185-203も参照されたい)。1つの態様において、TCR-FcのTCR可変ドメインは、アミノ酸104〜125個の可変ドメインを有するN末端領域を含む。別の態様において、TCR-Fcは、アミノ酸91〜129個を含むTCR定常領域をさらに含む。別の態様において、TCR-Fcは、アミノ酸21〜62個を含む連結ペプチドをさらに含む。

1つの態様において、Fc配列は、直接的にまたはリンカーによってTCR可変ドメインに融合されている。別の態様において、TCR-Fcは、TCR可変領域およびTCR定常領域を含み、Fc配列は、直接的にまたはリンカーによってTCR定常領域に融合されている。別の態様において、TCR-Fcは、TCR可変領域、TCR定常領域、および連結ペプチドを含み、Fc配列は、直接的にまたはリンカーによって連結ペプチドに融合されている。

sTCR、TCR-Fc、または1つもしくは複数のT細胞受容体可変領域を含む融合タンパク質は、関心対象の抗原、例えば、腫瘍細胞によって産生される物質、例えば、宿主において免疫応答を引き起こすことができる腫瘍細胞物質に特異的に結合するように選択することができる。特定の態様において、抗原は、腫瘍細胞の表面に存在し(すなわち、腫瘍抗原)、T細胞によって認識され、かつ宿主において免疫応答を引き起こす抗原である。腫瘍抗原には、例えば、αフェトプロテイン(AFP)、癌胎児性抗原(CEA)、MUC-1、上皮性腫瘍抗原(ETA)、(例えば悪性黒色腫に関する)チロシナーゼ、黒色腫関連抗原(MAGE)、および変異型または異常型の他のタンパク質、例えば、ras、p53などが含まれる。

1つの態様において、POIはTCR-Fcであり、TCR-Fcは、Fc配列に融合されたTCR α鎖可変領域およびFc配列に融合されたTCR β鎖(それぞれ、直接的にまたはリンカーによる)を含み、TCR α鎖-Fc融合物とTCR β鎖-Fc融合物が結合してαβ TCR-Fcを形成する。特定の態様において、αβ TCR-Fcは、次の2つのポリペプチド:(1)Fc配列に融合されたTCR α鎖定常領域に融合されたTCR α鎖可変領域、および(2)Fc配列に融合されたTCR β鎖定常領域に融合されたTCR β鎖可変領域を含む。

別の態様において、POIは、TCR α可変領域およびTCR β可変領域、ならびに任意でTCR α定常領域および/またはTCR β定常領域を有するTCR-Fcである。特定の態様において、TCR-Fcは、(5'から3'に向かって)TCR α可変領域配列、任意でその次にTCR α定常領域配列、TCR β可変領域配列、任意でその次にTCR β定常領域配列、任意でリンカー、次いでFc配列を含む核酸配列によってコードされる。特定の態様において、TCR-Fcは、(5'から3'に向かって)TCR β可変領域配列、任意でその次にTCR β定常領域配列、TCR α可変領域配列、任意でその次にTCR α定常領域配列、任意でリンカー、次いでFc配列を含む核酸配列によってコードされる。様々な態様において、TCR-Fc'をコ―ドする構築物の前に、それらを分泌可能(secretable)にするためのシグナル配列、例えば分泌シグナル配列が存在する。

別の態様において、POIはTCR-Fcであり、TCR-Fcは、Fc配列に融合されたTCR γ鎖およびFc配列に融合されたTCR δ鎖可変領域を含むTCR-Fcを含んで、γδTCR-Fcを形成する。特定の態様において、γδ TCR-Fcは、次の2つのポリペプチド:Fc配列に融合されたTCR γ鎖定常領域に融合されたTCR γ鎖可変領域、および(2)Fc配列に融合されたTCR δ鎖定常領域に融合されたTCR δ鎖可変領域を含む。

T細胞受容体可変領域は、当技術分野において公知である任意の方法によって同定および/またはクローニングすることができる。関心対象のタンパク質のT細胞受容体可変領域は、例えば、ヒトFc配列に例えば融合された再配列されたT細胞受容体可変領域DNAを細胞において発現させることによって、得ることができる。特定の抗原に特異的な再配列されたT細胞受容体可変領域は、当技術分野において公知である任意の適切な方法(下記の参考文献を参照されたい)によって得ることができ、例えば、マウスを抗原に曝露し、マウスのT細胞を単離し、マウスのT細胞のハイブリドーマを作製し、関心対象の抗原を用いてハイブリドーマをスクリーニングして、関心対象のハイブリドーマを得ることによる。関心対象の抗原に対して特異的な再配列されたT細胞可変領域は、関心対象のハイブリドーマからクローニングすることができる。また、ある抗原に特異的なT細胞受容体可変領域は、例えば、下記の参考文献において提供されるようなファージディスプレイ技術を用いて同定することもできる。次いで、可変領域をクローニングし、例えばヒトFcに融合して、FcγRである細胞表面捕捉分子に結合できる関心対象のタンパク質を作製することができる。

T細胞受容体可変領域を同定および/またはクローニングするための方法は、例えば、米国特許第5,635,354号(プライマーおよびクローニング法);Genevee et al. (1992) An experimentally validated panel of subfamily-specific oligonucleotide primers (Vα1-w29/Vβ1-w24) for the study of human T cell receptor variable V gene segment usage by polymerase chain reaction, Eur. J. Immunol. 22:1261-1269(プライマーおよびクローニング法); Gorski et al. (1994) Circulating T Cell Repertoire Complexity in Normal Individuals and Bone Marrow Recipients Analyzed by CDR3 Size Spectratyping, J. Immunol. 152:5109-5119(プライマーおよびクローニング法); Johnston, S. et al. (1995) A novel method for sequencing members of multi-gene families, Nucleic Acids Res. 23/15:3074-3075(プライマーおよびクローニング法); Pannetier et al. (1995) T-cell repertoire diversity and clonal expansions in normal and clinical samples, Immunology Today 16/4:176-181(クローニング法); Hinz, T. and Kabelitz, D. (2000) Identification of the T-cell receptor alpha variable (TRAV) gene(s) in T-cell malignancies, J. Immunol. Methods 246:145-148(クローニング法); van Dongen et al. (2002) Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations:米国特許第6,623,957号(クローニング法およびプライマー); Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936, Leukemia 17:2257-2317(プライマーおよびクローニング法); Hodges et al. (2002) Diagnostic role of tests for T cell receptor (TCR) genes, J. Clin. Pathol. 56:1-11 (クローニング法); Moysey, R. et al. (2004) Amplification and one-step expression cloning of human T cell receptor genes, Anal. Biochem. 326:284-286(クローニング法); Fernandes et al. (2005) Simplified Fluorescent Multiplex PCR Method for Evaluation of the T-Cell Receptor Vβ-Chain Repertoire, Clin. Diag. Lab. Immunol. 12/4:477-483(プライマーおよびクローニング法); Li, Y. et al. (2005) Directed evolution of human T-cell receptors with picomolar affinities by phage display, Nature Biotech. 23/3:349-354(プライマーおよびクローニング法); Wlodarski et al. (2005) Pathologic clonal cytotoxic T-cell responses: nonrandom nature of the T-cell receptor restriction in large granular lymphocyte leukemia, Blood 106/8:2769-2780(クローニング法); Wlodarski et al. (2006) Molecular strategies for detection and quantitation of clonal cytotoxic T-cell responses in aplastic anemia and myelodysplastic syndrome, Blood 108/8:2632-2641(プライマーおよびクローニング法); Boria et al. (2008) Primer sets for cloning the human repertoire of T cell Receptor Variable regions, BMC Immunology 9:50(プライマーおよびクローニング法); Richman, S. and Kranz, D. (2007) Display, engineering, and applications of antigen-specific T cell receptors, Biomolecular Engineering 24:361-373 (クローニング法)において説明されている。sTCRの例は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,080,840号および同第7,329,731号;ならびにLaugel, B et al. (2005) Design of Soluble Recombinant T Cell Receptors for Antigen Targeting and T Cell Inhibition, J. Biol. Chem. 280:1882-1892において提供されている。Fc配列は本明細書において開示される;Fc配列の例および融合タンパク質におけるそれらの使用は、例えば、Stahlらによる米国特許第6,927,044号において提供されている。前述の参考文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。

本発明のさらなる態様において、細胞表面捕捉分子は、FcγR捕捉分子に通常は十分な親和性で結合できないか、または低い親和性で結合する関心対象のタンパク質と結合し提示するように設計されている。これらの関心対象のタンパク質には、IgG4分子およびIgG2分子が含まれる。したがって、モジュラー捕捉分子は、FcγRの膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインに融合されたScFvドメインに基づいて設計され構築(built)された。ScFvドメインは、高親和性抗ヒトFc抗体に由来した。ScFvドメインは、軽鎖可変ドメインに融合された重鎖可変ドメインを含む。FcγR-TM-細胞質内ドメインを用いて、形質膜に適切に挿入し方向を定めることができた。ScFv-FcγR-TM-cyto融合タンパク質は、IgG2およびIgG1のサブタイプだけでなく、IgG4およびFcを含む他の分子、ならびに少なくとも1つの野生型CH3ドメインを含み、もう1つのCH3ドメインはFc^*型置換を含む場合があるヘテロ二量体のもの(例えば二重特異性抗体)に結合することができる。

本発明のさらなる態様において、細胞表面捕捉分子は、改変されたCH3ドメイン、例えば、H95Rアミノ酸置換およびY96Fアミノ酸置換を含むFc^*ポリペプチド(番号付与はIMGTシステムに基づいている)、例えばSEQ ID NO: 42を含む関心対象のタンパク質に結合し提示するように設計される。これらの関心対象のタンパク質には二重特異性抗体が含まれ、例えば、二重特異性抗体の製造に有用である抗体ヘテロ四量体は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2010年12月30日の米国特許出願公開US 2010/0331527 A1において大まかに説明されている。したがって、モジュラー捕捉分子は、FcγRの膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインに融合されたScFv^*ドメインに基づいて設計され構築された。ScFv^*ドメインは、高親和性抗Fc^*抗体に由来した。ScFv^*ドメインは、軽鎖可変ドメインに融合された重鎖可変ドメインを含む。FcγR-TM-細胞質内ドメインを用いて、形質膜に適切に挿入し方向を定めることができた。ScFv^*-FcγR-TM-cyto融合タンパク質は、Fc^*を含む任意の分子、例えば、少なくとも1つのFc^*ポリペプチド配列を含む野生型IgG3、ならびにIgG4、IgG2、およびIgG1のヘテロ二量体に結合する。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために発表され、本発明者らが自分達の発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。使用する数値(例えば、量、温度など)に関しては正確性を徹底するよう努力を払ったが、いくつかの実験上の誤差およびずれは考慮されるべきである。別段の定めがない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度の単位は摂氏温度であり、圧力は、大気圧またはほぼ大気圧である。

実施例1
pTE084の構築
ヒトFcγRI(hFcγRI;Genbankアクセッション番号M21091)をコードするpCAE100に由来する1,436bpのXba I断片をpRG821のXba I部位に連結することによって、pTE084を構築した。連結の結果として得られる望ましいプラスミド中のhFcγRIの配置を、Not I、Pst I、Eco RI、およびStu Iを用いた制限酵素マッピングによって検査した。pTE084は、hFcγRI、すなわちヒトIgGのFcドメインに対する高親和性細胞表面受容体を高レベルで発現させるために設計した。これは、2つの独立した発現カセットを含む。一方のカセットは、CMV-MIEプロモーターによって駆動されるhFcγRI遺伝子であり、2つ目のカセットは、G418に対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(npt)遺伝子であり、SV40後期プロモーターによって駆動される。

hFcγRIを発現するCHO K1派生物の構築
製造業者の提案に従ってLipofectamine(商標)(Life Technologies; Rockville, MD)を用いて、CHO K1細胞(4×10⁶個)にpTE084をトランスフェクトした。これらの細胞を、500μg/ml G418(Life Technologies)を含む培地(10％ウシ胎児血清、90％ハムF-12、2mM L-グルタミン;試薬はすべてLife Technologies, Rockville, MDから入手)中に15日間入れた。G418選択から生き残った細胞をトリプシン処理し、プールし、FITC結合ヒトIgG Fc断片(FITC-hFc; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)を用いて染色した。簡単に説明すると、10cm培養皿上で増殖させた細胞を、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Life Technologies)で1回洗浄した。各プレートに、0.25％トリプシン(Life Technologies)3mlを添加した。細胞がプレートから離れるまで、プレートを回転させた。離れた細胞を含む各プレートに、培地10mlを直ちに加えた。次いで、1,000×gで4分間の遠心分離によって、細胞を回収した。上清を除去した後、培地で希釈した4mlの2μg/ml FITC-hFc中に細胞を再懸濁した。次いで、細胞をプラットホーム振盪機上に置き、室温で1時間、染色した。未結合FITC-hFcを除去するために、PBS 20mlで2回、細胞を洗浄した。細胞上のFITC-hFc標識の程度を、MOFLO(商標)細胞選別機(Cytomation; Fort Collins, CO)を用いてフローサイトメトリーによって測定した。FITC-hFcによって、モックトランスフェクトされた親CHO K1細胞は染色されなかったが、G418耐性のpTE084をトランスフェクトされたプールでは蛍光の分布が生じた。フローサイトメトリーによって、選択されたプールの最も蛍光が強い上位1％の細胞を、細胞1個/ウェルの密度で96ウェルプレートに入れた。9日後、96ウェルプレート中の細胞クローン88個を24ウェルプレート中に増殖させた。3日後、個々のウェル中の細胞をPBS 1mlで1回洗浄し、0.5mlの2μg/ml FITC-hFcで1時間染色し、PBS 1mlで2回洗浄し、蛍光顕微鏡下で細胞表面染色について検査した。最も蛍光が強いクローン33個を選択し、増殖させ、次いでフローサイトメトリーによってスクリーニングした。

IgGを添加することによって、発現細胞と非発現細胞間での分泌タンパク質の細胞間拡散を妨害した:hFcγRIクローン細胞株の細胞はすべて、細胞表面hFcγRIを発現するため、それらは皆、IgGまたはIgGのFcドメインからなる融合タンパク質に結合する能力を有している。hFcγRIは様々な種に由来するIgGに結合するため(van de Winkel and Anderson, 1991)、ヒトIgG1(hIgG1)Fcタグを含むタンパク質(4SC622)がhFcγRI発現細胞に結合するのを妨害する能力について、動物IgGのパネルを試験した。4SC622は、hIL-4Rγ細胞外ドメインに融合されたIL-2Rγ細胞外ドメインからなるキメラ分子であり、次いでhIgG1-Fcドメインに融合されている。本実験において、RGC1の培養物、すなわち、pTE084を安定にトランスフェクトされたCHO K1細胞より選択されたhFcγRI発現細胞株を、37℃の組織培養インキュベーター中、様々な種に由来する1mg/ml IgGの存在下または非存在下で18時間、1μg/mlの4SC622と共にインキュベートした。

FITC-hFcを用いた細胞染色について概説されている手順に従って、4SC622のhIL-2Rγ構成要素に特異的なフィコエリトリン結合マウスIgG1モノクローナルAG184(PE-AG184)(BD Pharmingen; San Diego, CA)を用いて、洗浄した細胞を染色した後に、4SC622の細胞表面結合をフローサイトメトリーによって測定した。

hIgGは、RGC1の表面で発現されたhFcγR1に4SC622が結合するのを完全に妨害することが判明した。ラット、ウサギ、およびイヌ科動物に由来するIgGもまた、結合を効果的に妨害したのに対し、ウシおよびヒツジに由来するIgGは妨害しなかった。外部から添加されたラットIgGが、外部から添加されたhIgG1 Fcタグ付きタンパク質(4SC622)が細胞表面hFcγRIに結合するのを妨害できることから、ラットIgGは様々なレベルでhIgG1 Fcタグ付きタンパク質を発現する細胞間の移動も妨害できることが示唆される。これを試験するために、緑色蛍光タンパク質(EGFP)の存在または非存在によって区別できる2種の細胞株をRGC1から作製した。簡単に説明すると、RGC1細胞にEGFPで印を付けるために、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターによって駆動されるヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子をコードするPTE073 0.5mgおよびCMV-MIEプロモーターによって駆動されるEGFP遺伝子をコードするpRG816-EGFP 5mgをRGC1細胞2×10⁶個に同時トランスフェクトした。200μg/mlヒグロマイシンB(Sigma; St. Louis, MO)を2週間用いて、トランスフェクトされた細胞を選択した。フローサイトメトリーによって緑色蛍光細胞を単離した。EGFPおよびhFcγRIを発現する1つのクローンRGC2を、細胞混合実験において使用した。これらの実験において使用したもう1つの細胞株RGC4は、プラスミドpEE14.1-622をRGC1に安定にトランスフェクションすることによって作製した。pEE14.1-622は、4SC622の発現がCMV-MIEプロモーターによって駆動されるプラスミドであり、類似体メチオニンスルホキシミン(MSX)に対する耐性を与え安定な組込み事象の選択を可能にするグルタミンシンセターゼミニ遺伝子を含む。RGC4細胞は、細胞表面にhFcγRIを発現し、hIgG1 Fcタグ付きタンパク質4SC622を分泌する。50％のRGC2細胞および50％のRGC4細胞を含む混合細胞を入れた1つのプレートを1mg/mlのラットIgGと共に18時間インキュベートした後にPE-AG184を用いて染色し、その後、フローサイトメトリーによって検査した。RGC2細胞のEGFP蛍光から、PE-AG184蛍光の増加によって示されるように、RGC2細胞もまた、外部から添加された4SC622(1μg/ml)に結合することが示される。RGC4は、EGFPゲート中で蛍光を発しなかった。意義深いことには、外部から添加されたラットIgGによって、細胞表面4SC622について陽性に染色されたRGC4細胞の比率は減少しなかったことから、hFcγRIへの4SC622の結合は、それらのタンパク質が細胞表面へ移行する間に起こることが示唆された。RGC2細胞およびRGC4細胞を混合した場合、RGC4細胞から分泌された4SC622タンパク質は、培地中に蓄積し、RGC2細胞の大半に結合した。しかしながら、1mg/mlラットIgGを添加すると、4SC622に結合するRGC2細胞の比率が有意に減少したことから、ラットIgGが、分泌されたhIgG1 Fcタグ付きタンパク質が発現細胞から非発現細胞へと移動するのを妨害することが実証された。

実施例2:細胞表面の蛍光は、4SC622の発現レベルと相関している
pEE14.1-622をRGC1細胞(4×10⁶個)にトランスフェクトし、10％の透析済みウシ胎児血清、90％グルタミン不含ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、1×GS補充物質(supplement)、および25μM MSX(試薬はすべて、JRH Biosciences, Lenexa, KSから入手した)からなる培地中で2週間選択した後に、安定なトランスフェクタントのプールを得た。免疫染色する18時間前に、ラットIgGを1mg/mlになるまで培地に添加した。これらの細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、実施例1のFITC-hFc染色に関して説明した手順に従って、室温で1時間、1.5μg/mlのFITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG (H+L)F(ab')₂断片(Jackson ImmunoResearch Laboratories)を用いて染色した。次いで、フローサイトメトリーによって細胞染色を解析した。選択されたプールが、4SC622発現レベルが広範囲に渡る細胞を含むことが、蛍光分布から示唆された。免疫蛍光に関して上位3％(R3グループ(bracket))、7〜11％(R5グループ)、および15〜19％(R7グループ)の細胞を3つの別個のプールに選別し、9日間増殖させた。製造業者の推奨に従い、免疫に基づくPandexアッセイ法(Idexx; Westbrook, ME)によって、3日間増殖させた後の培地中の細胞数および4SC622レベルを測定することにより、各プールの細胞当たりの平均4SC622産生を測定した。Pandexアッセイ法において、ヤギ抗ヒトIgG、g鎖特異的抗体(Sigma)でコーティングされたフルオリコン(fluoricon)ポリスチレンアッセイ用粒子を用いて4SC622を培地から捕捉し、FITC結合ヤギ抗ヒトIgG(Fc特異的)(Sigma)を用いて、ビーズが結合した4SC622を検出した。較正のために、公知の量の精製4SC622をアッセイ法に含めた。上位3％プール、7〜11％プール、および15〜19％プールの細胞は、それぞれ1.42、0.36、および0.22pg/細胞/日の4SC622を産生することが判明した。したがって、細胞表面4SC622染色と単位当たりの(specific)タンパク質産生の間には相関があった。この結果から、FITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG (H+L)F(ab')₂断片によって最も明るく染色された細胞を単離することによって、4SC622を高レベルで発現する個々の細胞を得ることができることが示唆される。

実施例3:RGC1からの(in)発現クローンの単離:IL-4トラップ
分泌タンパク質を高レベルで産生するクローン細胞株を作製する際の効率を本発明者らの方法論に基づいて直接的に明らかにするために、4SC622を産生するクローン細胞株をRGC1から作製した。pEE14.1-622をRGC1細胞(4×10⁶個)にトランスフェクトし、25μM MSXを用いて2週間選択して、安定なトランスフェクタントのプールを得た。MSX耐性細胞をプールし、1mg/mlヒトIgGと共に18時間インキュベートした後、PE-AG184を用いて染色した。細胞表面4SC622染色のフローサイトメトリー解析によって測定した際の上位5％ゲートから細胞6個を単離し、増殖させた。それら6個のクローン株からの4SC622産生を測定し、選択コロニーを手作業で選び(hand-picking)続いて希釈によってクローニングし増幅させることによって得られたクローンからの4SC622産生と比較した。1つのRGC1由来クローン、すなわちRGC4は、12pg/細胞/日の4SC622を産生した。このレベルは、2,700個のクローンを手作業で選び解析することによって単離した最良の4SC622生産者のレベルと同様である。したがって、コロニーを手作業で選ぶことと比べると、本発明で概説する方法論は、高レベル(high)の生産者をスクリーニングおよびクローニングする際の効率がはるかに高いことが分かる。

VEGFトラップ
プラスミドpTE080およびpTE081は、VEGFトラップ、hVEGF-R1R2、およびhVEGF-R1R3の遺伝子をコードする。hVEGF-R1R2は、hVEGFR2の第2のIgドメインに融合されたhVEGFR1の第1のIgドメインからなるキメラ分子であり、次いでhIg1FCドメインに融合されている。hVEGF-R1R3は、hVEGFR3の第2のIgドメインに融合されたhVEGFR1の第1のIgドメインからなるキメラ分子であり、次いでhIgG1-Fcドメインに融合されている。これらのプラスミドにおいて、VEGFトラップの遺伝子はCMV-MIEプロモーターによって駆動され、かつMSXに対する耐性を与えるグルタミンシンセターゼミニ遺伝子が、安定な組込み事象の選択のために発現させられる。これらのプラスミドのいずれかをRGC1細胞にトランスフェクトし、25μM MSXを含む培地中で2週間増殖させて、プラスミドが安定に組み込まれた細胞を選択した。0.1μg/mlのIgG2aおよびマウスIgG3と共にMSX耐性細胞を18時間インキュベートした後に、1.5μg/mlのFITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG(H+L)F(ab')₂断片を用いて染色した。細胞を1時間染色し、次いで、フローサイトメトリーに先立ってPBSで2回洗浄した。蛍光が最上位1％の中に入っていた細胞のプールから、単細胞を96ウェル組織培養プレート中に選別した。各ウェル中の細胞を増殖させ、Pandexアッセイ法によってそれらの生産力を測定した。手作業で選別された最高レベルで発現するMSX耐性コロニーと比べて、hVEGF-R1R2およびhVEGF-R1R3の両方を発現するRGC由来クローンの方が、単位当たり生産力(specific productivities)がより高く、より少数のクローンをスクリーニングすることによって単離された。表1を参照されたい。

（表１）

実施例4:細胞表面に結合したhIgG1 Fcタグ付きタンパク質は、RGC1によって内部移行される
hFcγRIは、細胞表面に結合したリガンドの内部移行を誘導することが公知である。RGC1細胞が細胞表面に結合した4SC622を内部移行できるかどうかを解析するために、1μg/ml 4SC622をRGC1細胞に1時間添加し、次いで、PE-AG184による4SC622免疫染色およびフローサイトメトリー解析のために細胞を直ちに処理した。93％の細胞が、細胞表面4SC622について陽性に染色された。あるいは、1μg/ml 4SC622をRGC1細胞に1時間添加し、次いで、細胞を洗浄し、4SC622を含まない培地中でPE-AG184と共に18時間、インキュベートした。4SC622の免疫染色後のフローサイトメトリー解析により、9％の細胞が細胞表面に4SC622を保持していることが示された。表面に結合した4SC622の喪失をさらに明らかにするために、RGC1および親CHO K1細胞の培地に精製4SC622タンパク質を添加し、次いで、培地中の4SC622のレベルをある期間に渡って測定した。10cmプレート中の培地に2μg/mlまで添加された4SC622は、3日間のインキュベーション後のRGC1馴化培地において、CHO K1対照と比べて有意に少なかった。これらの結果から、培地中の4SC622の濃度は、細胞表面にhFcγRIが存在することによって低下することが示される。これらの結果から、培地から4SC622が枯渇するのは、hFcγRI-4SC622複合体の内部移行の結果であったことが示唆される。受容体-リガンド複合体のこの内部移行によって、18時間のブロッキング段階の間にブロッキングIgGの存在下で非発現細胞からすべての4SC622を効果的に除去することが容易になり得る。

実施例5:hFcγRIが誘導発現されるCHO K1細胞株の構築
hFcγRIを使用するフローサイトメトリーに基づく自己分泌トラップ(FASTR(商標))法は、高発現クローンの迅速な単離を可能にする。しかしながら、hFcγRIがFcタグ付きタンパク質の代謝回転をもたらす場合、操作されたhFcγRI発現細胞によって実現される分泌タンパク質産生は、産生期間中にhFcγRI発現を阻害できるならば、より多くなると考えられる。このために、hFcγRIの発現がテトラサイクリンまたは類似体ドキシサイクリンによって誘導されるCHO K1細胞株を構築した。この系では、CHO K1細胞を最初に操作してテトラサイクリンリプレッサータンパク質(TetR)を発現させ、TetRによって活性が調節されるプロモーターの転写制御下にhFcγRIを置いた。2つの直列型のTetRオペレーター(TetO)をpTE084のCMV-MIEプロモーター/エンハンサーのすぐ下流に配置してpTE158を作製した。pTE158におけるCMV-MIEプロモーターからのhFcγRIの転写は、テトラサイクリンも他の何らかの適切な誘導因子もない場合、TetRによって妨害された。誘導因子の存在下では、TetRタンパク質はTetOに結合することができず、hFcγRIの転写が起こった。

pcDNA6/TR、すなわちブラストサイジンに対する耐性を与え、TetRの発現がCMV-MIEプロモーターから始まるプラスミド(Invitrogen; Carlsbad, CA)を、CHO K1細胞にトランスフェクトした。2.5μg/mlブラストサイジン(Invitrogen)を用いて2週間選択した後、安定なトランスフェクタントをプールした。次いで、このプールに、pTE158、すなわちG418に対する耐性を与え、hFcγRIの発現がCMV-MIE/TetOハイブリッドプロモーターに依存しているプラスミドをトランスフェクトした。pcDNA6/TRおよびpTE158を連続的にトランスフェクトされた細胞を、400μg/ml G418および2.5μg/mlブラストサイジンを用いて12日間選択し、次いでプールした。1μg/mlドキシサイクリンの添加によって、このプールを2日間誘導し、次いでFITC-hFcで染色して、hFcγRIを発現する細胞を同定した。hFcγRIを発現する細胞の上位5％をプールとして回収し、ドキシサイクリンの非存在下で6日間増殖させ、hFcγRIの存在についてFITC-hFcで再び染色した。hFcγRIに関して染まらなかった細胞を回収し、1μg/mlドキシサイクリンを含む培地中で3日間増殖させた。次いで、hFcγRIの存在についてプールを染色し、フローサイトメトリーによって単離した。最も高レベルのhFcγRIを発現した細胞(上位1％)を、1ウェル当たり細胞1個となるように96ウェルプレートに選別した。これらの細胞はおそらく、FcγR1の低い非誘導性発現レベルおよびFcγR1の高い誘導性レベルを有する細胞を含んでいた。増殖後、20個のクローンにおけるドキシサイクリンによるhFcγRIの誘導を、FITC-hFcによる免疫染色およびフローサイトメトリーによって確認した。さらに特徴を明らかにするために1つのクローンを選択し、RGC10と名付けた。

ドキシサイクリンの非存在下では、RGC10は検出可能なレベルのhFcγRIを発現しなかったのに対し、1μg/mlのドキシサイクリンで3日間誘導された細胞では高レベルのhFcγRIが観察された。ドキシサイクリンによる誘導後、RGC10細胞の平均蛍光量は増加し、1,000倍を超えた。

実施例6:RGC10からの4SC622産生細胞株の単離
RGC10細胞にpEE14.1-622をトランスフェクトし、25mM MSXを用いて2週間選択した後、MSX耐性細胞をプールした。培地に1μg/mlドキシサイクリンを3日間添加することによって、hFcγRIの発現を誘導した。ドキシサイクリンを含む培地に1mg/mlラットIgGを18時間添加した後、FITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG(H+L)F(ab')₂断片を用いて染色し、フローサイトメトリーによって解析した。最も高レベルの4SC622を発現した細胞(上位1％)を、1ウェル当たり細胞1個となるように96ウェルプレートに選別した。ドキシサイクリンによってhFcγRI発現を誘導しない場合、FITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG(H+L)F(ab')₂断片を用いて染色することによって細胞表面に結合した4SC622を検出することはできない。ドキシサイクリンの非存在下で、60個のクローンを増殖させた。最も高レベルの(highest)13個の生産者の単位当たり生産力をPandexアッセイ法によって測定した。クローン1C2の単位当たり生産力は17.8pg/細胞/日であった。この値は、調節されていないhFcγRI細胞株RGC1を用いて以前に単離した最良の4SC622細胞株において観察された12pg/細胞/日よりも有意に優れていた。

実施例7:Sp2/0骨髄腫細胞を操作して、細胞表面捕捉タンパク質を発現させることができる
本実施例において、自己分泌トラップ法がCHO以外の細胞株に応用可能であることを実証するために、Sp2/0-Ag14骨髄腫細胞株を操作してhFcγRIを安定に発現させた。レトロウイルス感染によって、hFcγRIの遺伝子を骨髄腫細胞に導入した。プラスミドpLXRN(Clontech; Palo Alto, CA)、すなわち関心対象の遺伝子を上流のMoloneyマウス肉腫ウイルス長末端反復配列(MoMuSV LTR)プロモーターから発現させることができるレトロウイルスDNAベクターを用いて、hFcγRI遺伝子をコードするレトロウイルスを作製した。ヒトFcγRI遺伝子をコ―ドするpTE084由来の1,363bp Xho I断片をpLXRNのXho I部位にクローニングした。hFcγRI cDNA発現がMoMuSV LTRに依存しているプラスミドを選択し、pTE255と名付けた。

製造業者のガイドラインにほぼ従って、hFcγRIを発現させるための向汎性レトロウイルスを作製した。パッケージング細胞株GP-293、すなわちウイルスタンパク質gagおよびpolを安定に発現するHEK293ベースの細胞株(Clontech; Palo Alto, CA)に、各10mgのpVSV-GおよびpTE255を同時トランスフェクトした。プラスミドpVSV-Gは、感染性粒子に広宿主域を与えるウイルスエンベロープタンパク質VSV-Gの発現を可能にする。

Sp2-hFcγRI-4の構築
向汎性hFcγRIレトロウイルスを用いて、Sp2/0-Ag14骨髄腫細胞(American Type Culture Collection; Manassas, VA)1×10⁷個を細胞1個当たり感染性粒子約10個の多重度で感染させた。感染後3日目に、細胞を1時間染色し、次いで、フローサイトメトリーによる解析に先立ってPBSで2回洗浄した。結合したFITC-hFcによって示されるhFcγRI発現細胞を、フローサイトメトリーによってプールとして回収した。このプールを13日間増殖させ、次いでFITC-hFcで再び染色し、hFcγRI発現細胞をフローサイトメトリーによってプールとして回収した。選別したこれらの細胞を、4.5g/lブドウ糖および4mMグルタミンを含む10％ウシ胎児血清90％ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で3週間培養し、FITC-hFcで染色し、平均蛍光量が集団の上位1％である細胞を単細胞選別によってクローニングした。増殖後、前述したようにして、24個のクローンをhFcγRIの発現についてフローサイトメトリーによって検査し、さらに特徴を明らかにするために、1つのクローン、Sp2-hFcγRI-4を選択した。

4SC622タンパク質を発現するSp2-hFcγRI-4細胞の単離
pTE209、すなわちCMV-MIEプロモーターからの4SC622の構成的発現を可能にし、ヒグロマイシンに対する耐性を与えるプラスミドを、Sp2-hFcγRI-4細胞(1×10⁷個)にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、10％FCS、90％D-MEM、および400μg/mlヒグロマイシンを含む培地中に14日間入れた。ヒグロマイシン耐性細胞を1mg/mlウサギIgGと共に18時間インキュベートした後、FITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG(H+L)F(ab')₂断片を用いて染色した。細胞を1時間染色し、次いで、フローサイトメトリーによる解析に先立ってPBSで2回洗浄した。標識された細胞をフローサイトメトリーによってプールとして回収し、次いで5日間培養し、前述のようにして選別した。次いで、増殖させたプールに由来する、最も多くのFITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG(H+L)F(ab')₂断片に結合した細胞、すなわち上位1％の集団を単細胞選別によってクローニングした。10個のクローンの4SC622産生をELISAによって解析したところ、10個のクローンはすべて4SC622を発現することが判明した。クローン5H11は、0.5pg/細胞/日の4SC622を産生した。これらのデータから、自己分泌トラップ法によって、4SC622を分泌するクローンが、Sp2-hFcγRI-4細胞へのpTE209の安定なトランスフェクションに由来する不均一な細胞プールから効率的に単離されることが示された。

4SC622およびhFcγRIの両方を発現する骨髄腫細胞の表面に4SC622が自己由来で提示されることを確認するために、クローン5H11を1mg/mlウサギIgGと共に18時間インキュベートし、次いで、FITC結合抗ヒトIgG(H+L)F(ab')₂断片を用いて染色し、クローン5H11が細胞表面4SC622を提示することを認めた。ウサギIgGによって相互移動(cross-feeding)が妨害されている条件下で分泌タンパク質が提示されたことから、4SC622の自己提示が実証された。これらのデータから、前述の自己分泌トラップ法がCHO細胞に限定されておらず、骨髄腫および他の細胞型にも同様に拡大適用され得ることが示された。

実施例8:プロテインGキメラタンパク質は、細胞表面捕捉タンパク質として機能し得る
hFcγRI以外の細胞表面捕捉タンパク質に自己分泌トラップ法を応用できることを実証するために、プロテインGを発現する細胞株を構築した。プロテインGはストレプトコッカス(Streptococcus)株G148に由来し、ヒトおよびマウスのすべてのIgGサブクラスに結合し、したがって、抗体またはIgG Fc融合タンパク質を発現する組換え細胞の単離に役に立つ。プロテインG IgG Fc結合ドメインが、ヒトおよびマウスのすべてのIgGサブクラスに結合できる細胞表面捕捉タンパク質として使用され得ることを実証するために、本発明者らは、hFcγRIの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインに融合されたプロテインGのFc結合ドメインからなるキメラタンパク質を発現するCHO株を構築した。プロテインGのFc結合ドメインは、55アミノ酸長の相同な反復配列を3つ含み(Guss et al., (1986) EMBO 5:1567およびSjobring et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:399)、各反復配列は1つのIgG Fcに結合することができる。CHO細胞におけるこのキメラタンパク質の発現を向上させるために、本発明者らは、マウスROR1遺伝子由来のシグナル配列がプロテインG(アクセッション番号X06173)のFc結合ドメイン、すなわちアミノ酸303〜497(SEQ ID NO: 1)に融合されている合成DNAを構築した。この合成DNAは、オリゴヌクレオチドアニーリング、ギャップ充填、およびPCR増幅の組合せによって作製した。次いで、hFcγRI(アクセッションM21091)の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、すなわちアミノ酸279〜374(SEQ ID NO: 2)をコードするDNAに、PCRによってこの合成DNAを融合させた。プロテインG/hFcγRIキメラタンパク質をコードする得られたDNAをpTE158のCMV-MIEプロモーターの下流にクローニングして、hFcγRIをコードする遺伝子を置換して、プラスミドpTE300を得た。

無血清培地中で増殖するように順応させたCHO K1細胞株RGC14にpTE300をトランスフェクトし、3日後、pTE300の安定な組込みを選択するために、400μg/ml G418を培地に添加した。選択開始後2週目に、細胞をFITC-hFcで染色して、hFcγRIを発現する細胞を同定した。これらの細胞をフローサイトメトリーによって解析し、hFcγRIを発現する細胞をプールとして回収した。これらの細胞を10日間増殖させ、hFcγRIを発現する細胞の集団をフローサイトメトリーによって再び単離した。これらの細胞を再び増殖させ、FITC-hFcで染色し、高レベルのプロテインG/hFcγRIキメラタンパク質を発現する単細胞をフローサイトメトリーによって単離した。FITC-hFc結合について陽性に染色された単細胞を、10％ウシ胎児血清、90％ハムF12、および400μg/ml G418から構成される培地中に選別した。2週間のインキュベーション後、FITC結合抗ウシIgG F(ab')₂断片(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)を用いて染色することによって、培地中に存在するウシIgGへの結合に関して48個のクローンを検査した。1つのクローン、すなわちこの抗体で陽性に染色されるRGC18を、さらに特徴を明らかにするために選択した。

RGC18からの発現クローンの単離:RGC18細胞(6×10⁶個)にpTE209をトランスフェクトし、400μg/mlヒグロマイシン中で18日間増殖させることによって、プラスミドの組込みに関して選択した。ヒグロマイシン耐性細胞を1mg/mlウサギIgGと共に18時間インキュベートした後、FITC結合ポリクローナル抗ヒトIgG(H+L)F(ab')₂断片を用いて染色した。細胞を1時間染色し、次いで、フローサイトメトリーによる解析に先立ってPBSで2回洗浄した。最も蛍光が強い細胞(上位5％)を単細胞選別によって単離し、3週間増殖させた。4SC622分泌に関して10個のクローンを検査した。試験したクローンはすべて4SC622を高レベルで分泌し、最も優れたクローンであるRGC19は、単位当たり生産力が6.4pg/細胞/日であった。この結果から、自己分泌トラップ法によって、4SC622を発現する細胞が、RGC18へのpTE209の安定なトランスフェクションに由来する不均一な細胞プールから効率的に単離されることが実証された。さらに、これらのデータから、プロテインGの断片は、シグナル配列および膜貫通ドメインを含むように操作することができ、細胞表面捕捉タンパク質として機能できることがはっきりと実証された。

プロテインG/hFcγRIキメラタンパク質および4SC622の両方を発現するRGC19細胞の表面に4SC622が自己由来で提示されることを確認するために、RGC19を1mg/mlウサギIgGと共に18時間インキュベートし、次いで、FITC結合抗ヒトIgG(H+L)F(ab')₂断片を用いて染色し、フローサイトメトリーによって解析した。ウサギIgGによって相互移動が妨害されているこれらの条件下でRGC19細胞が細胞表面4SC622を有することが判明したことから、4SC622の自己提示が示唆された。ウサギ IgGは、RGC18細胞に外因性4SC622タンパク質が結合するのを効果的に妨害したが、4SC622を発現する細胞の細胞表面での4SC622の提示は妨害しなかった。これらのデータから、プロテインG/hFcγRIキメラタンパク質の特性が細胞表面捕捉タンパク質としてのhFcγRIの特性と類似していることが実証され、自己分泌トラップ法では細胞表面捕捉タンパク質として他のタンパク質を使用できることが示唆された。

実施例9:RGC10からの抗体産生細胞の単離
組換え抗体を発現するCHO細胞株の単離のために自己分泌トラップ法が有用であることを実証するために、本発明者らは、KD5ハイブリドーマに由来する可変軽鎖遺伝子および可変重鎖遺伝子をコードするDNAをクローニングした。KD5は、ヒトTie-2受容体に特異的なモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマである。

500ngのマウス脾臓ポリA+RNA(Clontech, Palo Alto, CA)から、マウスIgG定常領域遺伝子配列をクローニングした。ランダムヘキサマー50ngを用いて開始されるRT-PCR用SuperScript第一鎖合成システム(First-Strand Synthesis System)(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いて、一本鎖cDNAを合成した。プライマー

を用いたPCRによって、このcDNAからマウスκ軽鎖定常DNA配列(アクセッション番号Z37499)を増幅した。プライマー

を用いたPCRによって、このcDNAからマウスIgG2a定常領域DNA配列(アクセッション番号AJ294738)も増幅した。TOPO TA Cloningキット(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を用いて、これらのPCR産物をpCR2.1-TOPO中にクローニングし、定常領域の配列を確認した。

RT-PCRによってKD5ハイブリドーマmRNAからKD5可変領域遺伝子を増幅し、Amersham-Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ)社製の重鎖可変領域および軽鎖可変領域プライマーミックスを用いて、pCR2.1-TOPO中にクローニングした。プライマー

を用い、pCR2.1-TOPOにクローニングした可変領域を鋳型として用いて、可変重鎖遺伝子をPCR増幅し、BspMIで消化し、プライマー

を用いて増幅した、BsaIによって消化したIgG2a定常重鎖遺伝子PCR断片に連結した。次いで、この断片をpRG882のBspMI部位およびNotI部位に連結した。得られたプラスミドpTE317は、mROR1シグナル配列に融合されたKD5組換え重鎖遺伝子をCMV-MIEプロモーターから発現させることができた。プライマー

を用い、pCR2.1-TOPOにクローニングした可変領域を鋳型として用いて、可変軽鎖遺伝子をPCR増幅し、BsmBIで消化し、プライマー

を用いて増幅した、BsaIによって消化したκ定常軽鎖遺伝子PCR断片に連結した。次いで、この断片をpRG882のBspMI部位およびNotI部位に連結した。得られたプラスミドpTE316は、mROR1シグナル配列に融合されたKD5組換え軽鎖遺伝子をCMV-MIEプロモーターから発現させることができた。

KD5重鎖遺伝子をコードするpTE317由来の1450bp EcoRI-NotI断片を、ヒグロマイシンに対する耐性を与え、UbCプロモーターに対して組換え遺伝子の発現を可能にするベクターpRG980のEcoRI部位およびNotI部位中にクローニングして、プラスミドpTE322を得た。同様に、KD5軽鎖遺伝子をコードするpTE316由来の750bp EcoRI-NotI断片を、ピューロマイシンに対する耐性を与え、UbCプロモーターに対して組換え遺伝子の発現を可能にするベクターpRG985のEcoRI部位およびNotI部位中にクローニングして、プラスミドpTE324を得た。RGC10細胞(5×10⁶個)に3μgのpTE322および3μgのpTE322をトランスフェクトし、10％ウシ胎児血清ならびにピューロマイシン20μgおよび400μg/mlヒグロマイシンを添加したF12培地中で14日間増殖させることによって、プラスミドの組込みに関して選択した。培地に1μg/mlドキシサイクリンを3日間添加することによって、hFcγRIの発現を誘導した。二重耐性細胞を1mg/mlウサギIgGと共に18時間インキュベートした後、FITC結合ヤギポリクローナル抗マウスIgG(Fcγ)F(ab')₂断片(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)を用いて染色した。細胞を1時間染色し、次いで、フローサイトメトリーによる解析に先立ってPBSで2回洗浄した。最も蛍光が強い細胞(上位5％)をプールとして単離し、10日間増殖させ、その後、プロトコールを繰り返した。ただし、最も蛍光が強い上位1％の細胞をプールとして単離した。このプールを10日間増殖させ、次いで、最も蛍光が強い上位0.1％の細胞を単細胞として96ウェルプレート中に単離した。ELISAによってクローンの抗体発現を解析し、解析した53個のクローンから7個のクローンを選択した。これらのクローンの単位当たり生産力の平均は35pg/細胞/日であり、最も優れたクローンは54pg/細胞/日の組換えKD5モノクローナル抗体を発現した。

実施例10:CSCP発現レベルに影響されないFASTR(商標)スクリーニング
CSCPの発現レベルが、結合されるsPOIを発現する細胞を単離する能力に有意な影響を及ぼさないことを実証するために、同じCSCPを発現するが高レベルまたは低レベルのいずれかでそれぞれ発現する2種の異なる宿主細胞株における同じsPOIのFASTR(商標)スクリーニングを比較した。

FASTR(商標)宿主細胞株RGC10が、pTE158の安定な組込みによるhFcγRIタンパク質の高レベル発現に関して選択され、組み込まれたhFcγRI遺伝子コピーを40個含むことが判明した。安定なトランスフェクションおよび単一コピー遺伝子組込みに関する選択後、hFcγRIタンパク質を低レベルで発現する新しい細胞株RS527をCHO K1から作製した。FASTR(商標)細胞株の全細胞溶解物をウェスタンブロット解析によって測定したところ、RS527細胞は、RGC10細胞よりも有意に少なくhFcγRIタンパク質を発現した。

手短に言えば、hFc融合分泌タンパク質Rc1-hFcを発現しヒグロマイシンに対する耐性を与えることができるプラスミドpTE462を、RGC10細胞およびRS527細胞にトランスフェクトした。ヒグロマイシンを2週間用いて、トランスフェクトされた培養物を選択した。本明細書において説明するFASTR(商標)法に従って、ヒグロマイシン耐性細胞を1μg/mlドキシサイクリン(Dox)で誘導し、ウサギIgGを用いて一晩ブロックした。翌日、RGC10/pTE462培養物およびRS527/pTE462培養物を、hFcに特異的なFITC結合抗体によって染色し、次いでフローサイトメトリーによって解析した。低度、中度、および高度の蛍光をそれぞれ有する細胞を表す3つの細胞区分(bin)R4、R5、およびR6を各宿主株から選別し、組織培養で増殖させた。

6つの細胞区分のRc1-hFcタンパク質産生レベルを比較するために、各区分について同数の細胞を用いて、6つの培養物を準備した。3日後、馴化培地を回収した。馴化培地中のRc1-hFcタンパク質の力価をELISAによって測定し、各細胞区分の平均蛍光量に対してプロットした。RGC10宿主株およびRS527宿主株の両方において、平均蛍光量(細胞表面に提示されたRc1-hFcの量)と単離された細胞プールのsPOIタンパク質産生レベルとの間に同様の相関が存在した。最も重大なことには、RGC10およびRS527に由来する2つの高度蛍光R6区分のsPOI力価が類似していた。これらのデータから、FASTR(商標)宿主細胞株におけるCSCPの発現レベルは、その宿主を用いて、トランスフェクトされた細胞をsPOI発現レベルに基づいて単離することに有意に影響を及ぼさないことが実証される。

実施例11:細胞表面捕捉タンパク質としてのTie2受容体
FcγR1以外の細胞表面捕捉タンパク質(CSCP')を、本明細書において説明する方法において使用することができる。本実施例において、Tie2受容体は、CSCPとして機能し、Tie2受容体の細胞外ドメインに特異的に結合するC1bモノクローナル抗体から作製されるTie特異的ScFv_C1b-Fc融合タンパク質を発現する細胞を単離するのに使用される。ScFv_C1b-Fcに対するCSCPはhFcgRIであり得るが、本実施例では、ScFv_C1b-Fcに対するCSCPとしてTie2も使用できることを実証する。

誘導性Tie2 CSCP細胞株を構築するために、最初にTetRプラスミドpcDNA6/TRをCHO K1に安定にトランスフェクトした。次いで、Tie2の細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインからなるタンパク質の誘導発現を可能にするプラスミドpTE259を、ブラストサイジン耐性細胞プールに安定にトランスフェクトした。Tie2に特異的な抗体を用いて染色した後に、フローサイトメトリーによって誘導性細胞クローンを単離した。ScFv_C1b-Fcの発現に関してFASTR(商標)を実施できる可能性を調査するために、RGC54クローンを選択した。

hFc融合分泌タンパク質ScFv_C1b-Fcを発現しヒグロマイシンに対する耐性を与えることができるプラスミドpTE988を、RGC54細胞に安定にトランスフェクトした。ヒグロマイシンを2週間用いて、トランスフェクトされた培養物を選択した。ヒグロマイシン耐性細胞をDoxで誘導し、1mg/mlの精製C1b mAbを用いてブロックした。C1bモノクローナル抗体は、ScFv_C1b-Fcの可変領域の供給源であった。翌日、細胞プールを、hFcに特異的なFITC結合抗体によって染色し、次いでフローサイトメトリーによって解析した。高度、中度、および低度の蛍光をそれぞれ有する細胞を表す3つの細胞区分R6、R7、およびR8を選別し、組織培養で増殖させた。各区分について同数の細胞を用いて3つの培養物を準備して、ELISAによって測定してScFv_C1b-Fcタンパク質産生を明らかにした。平均蛍光量(細胞表面のTie2に結合するScFv_C1b-Fcの量)と単離された細胞プールのScFv_C1b-Fcタンパク質産生レベルとの間に相関が存在した。

これらのデータから、hFcγRI以外のCSCPがCSCPとして働き得ることが示され、また、その細胞質内ドメインを除去することによって任意の受容体をCSCPに変換できることが示唆される。また、これらのデータから、抗原をCSCPにできること、および抗原特異的な抗体関連分子を発現する細胞をFASTR(商標)スクリーニングするのに使用できることも実証される。

実施例12:低親和性を有するCSCP:sPOIペアを用いた効果的なFASTR(商標)スクリーニング
アンギオポエチン(angiopoetin)-1は、Tie2受容体に対するリガンドである。アンギオポエチン-1受容体結合ドメインおよびhFcを含むキメラタンパク質(FD1-hFc)は、BIAcore(商標)によって測定した場合に親和定数174nMでTie2に結合する。FD1-hFcおよびTie2をsPOIおよびCSCPとしてそれぞれ選択して、FASTR(商標)スクリーニングのためにCSCPとsPOIの間に最低限の親和性が必要であるかを判定した。

細胞ラベル(decoration)実験において、外部から添加されたFD1-hFcは、Tie2を介してRGC54細胞に特異的に結合した。Tie2とFD1-hFcの間の親和性がFASTR(商標)スクリーニングを可能にするのに十分であるかを判定するために、hFc融合分泌タンパク質FD1-hFcを発現しヒグロマイシンに対する耐性を与えることができるプラスミドpTE942を、RGC54細胞に安定にトランスフェクトした。ヒグロマイシンを2週間用いて、トランスフェクトされた培養物を選択した。ヒグロマイシン耐性細胞をDoxで誘導し、マウスIgG1 Fcを含む1mg/mlの精製FD1-mFcを用いてブロックした。翌日、細胞プールを、hFcに特異的なFITC結合抗体によって染色し、次いでフローサイトメトリーによって解析した。高度、中度、および低度の蛍光をそれぞれ有する細胞を表す3つの細胞区分R6、R7、およびR8を回収した。各区分について同数の細胞を用いて培養物を準備して、ELISAによって測定して馴化培地におけるFD1-hFcタンパク質産生レベルを明らかにした。平均蛍光量(細胞表面に結合したTie2に結合するFD1-Fc)と単離された細胞プールのFD1-hFcタンパク質産生レベルとの間に相関があった。蛍光量の最も多い区分が、FD1-hFcを最も多く産生した。

これらのデータから、低親和性(174nM KD)のCSCP:sPOIペアを効果的なFASTR(商標)スクリーニングに使用できることが実証される。重要なことには、FD1-Fc:Tie2結合の解離t_1/2は2分より短いことから、親和性が測定可能な任意のCSCP:sPOIペアがFASTR(商標)スクリーニングにおいて役に立ち得ることが示唆される。さらに、この実験からもまた、FcγRI受容体ではないものも、そのリガンドを発現する細胞を単離するためのCSCPとして使用され得ることが示される。

実施例12:ScFvに膜貫通ドメインを融合させることによって、機能的CSCPを作製する
CSCPは、sPOIに対して測定可能な親和性を有している任意の細胞表面結合タンパク質であることができる。これを実証するために、PDGF受容体由来の膜貫通ドメインを、マウスκ鎖特異的モノクローナル抗体HB58由来の可変領域を含むScFvに融合することによって、完全に合成のCSCPを構築した。このキメラタンパク質(ScFv_HB58-TM_PDGFR)を発現するFASTR(商標)宿主を構築し、これを用いて、アンギオポエチン(angiopoeitin)-2 FDドメイン特異的P12抗体を発現する細胞を単離した。

CHO K1に由来するRS655細胞株は、ScFv_HB58-TM_PDGFRを構成的に発現する。ScFv_HB58-TM_PDGFRを発現する細胞は、P12 mAb、FD2-hFc、およびFITC結合抗hIgGと共に逐次的にインキュベーションすることによって染色することができる。すなわち、HB58 ScFvによって細胞表面に捕捉されたP12を、FD2に対するその親和性に基づいて検出し、次にhFcタグの認識によってFD2を検出した。RS656細胞は、eYFPの遺伝子をコードするプラスミドを安定にトランスフェクションした後のRS655細胞に由来した。RS656細胞のほぼ100％がeYFP陽性であり、大半(76％)は、FD2-hFcへの結合によって検出したところ、ScFv_HB58-TM_PDGFRの発現を維持していた。

P12抗体の重鎖および軽鎖を発現しピューロマイシンに対する耐性を与えることができるプラスミドpTE693を、RS655細胞に安定にトランスフェクトした。トランスフェクトされた培養物を、ピューロマイシンを用いて2週間選択して、P12 mAb発現に関して不均一な細胞(RS655/pTE693)のプールを得た。

ScFv_HB58-TM_PDGFRがCSCPとして機能し得、非生産者から抗体産生細胞を分離するのを容易にし得るかを判定するために、同数のRS656細胞およびRS655/pTE693細胞を混合し、同時培養した。RS655/pTE693細胞から発現されたP12が拡散し、RS656細胞の表面のScFv_HB58に結合できた場合、黄色の細胞の大きな集団もまた、FD2-hFc結合に関して陽性であった。しかしながら、RS656の表面のScFv_HB58が過剰なマウスIgGと結合した場合、黄色ではない細胞のみがFD2-hFc結合に関して陽性であったことから、発現細胞が非発現細胞から効果的に分離されたことが実証された。

これらのデータから、ScFvを細胞膜にターゲティングすることによってScFvを機能的CSCPにできることが実証される。また、このデータから、FASTR(商標)により、分泌抗体を発現する細胞を、抗体の抗原を用いて検出できることが示される。

実施例13:T細胞受容体可変領域を含む関心対象のタンパク質
TCR-Fcである関心対象のタンパク質を発現する細胞株の高発現クローンを単離するための、フローサイトメトリーに基づく自己分泌トラップ(FASTR(商標))法は、関心対象の抗体を発現する細胞株の調製に類似した様式で準備される。hFcγRに結合した関心対象のTCR-Fcを表面に提示する細胞をスクリーニングすることによって、高発現クローンを同定する。

これらの例において、細胞表面捕捉分子として誘導性FcγR1を含むCHO K1細胞株RGC10が使用される。直接的にインフレームで、またはTCR可変領域とヒトFc領域の間のリンカー配列と共に、TCR可変領域をヒトFc領域にインフレームでクローニングすることによって、RGC10が組換えTCR-Fc'を発現するようにさせる。

Fcが結合したTCR α可変ドメインおよびFcが結合したTCR β可変ドメインを含む二量体である関心対象のタンパク質を作製するために、RGC10に次の2つのベクターをトランスフェクトする:ヒトFc配列を有するTCR α可変ドメイン融合タンパク質を発現できる第1のベクター、および同じヒトFc配列を有するTCR βドメイン融合タンパク質を発現できる第2のベクター。各ベクターは、TCR可変領域に対して5'側のリーダー配列(例えば、分泌シグナル配列)および薬物耐性遺伝子である選択マーカーを含む。各ベクターのトランスフェクション後、適切な薬物選択により、そのベクターを含む細胞を選択する。この選択の結果、第1のベクターおよび第2のベクターの両方を有しているRGC10細胞株が得られる。β可変ドメインに対する抗体、α可変ドメインに対する抗体、およびFcドメインに対する抗体の内の1種または複数種を用いて、関心対象のタンパク質を発現する細胞を検出することができる。

Fcに融合されたTCR α可変ドメインおよびTCR β可変ドメインの両方を含む二量体である関心対象のタンパク質を作製するために、関心対象のタンパク質をコードする、次のようにして構築される単一のベクターをRGC10にトランスフェクトする:リーダー配列(例えば分泌シグナル配列)、それに続いてリンカーに融合されたTCR β可変ドメイン、次いでリンカーはTCR α可変ドメインに融合され、次いでTCR α可変ドメインはFc配列に融合されている。あるいは、次のようにして単一のベクターを構築することもできる:リーダー配列(例えば分泌シグナル配列)、それに続いてリンカーに融合されたTCR α可変ドメイン、次いでリンカーはTCR β可変ドメインに融合され、次いでTCR β可変ドメインはFc配列に融合されている。β可変ドメインに対する抗体、α可変ドメインに対する抗体、およびFcドメインに対する抗体の内の1種または複数種を用いて、関心対象のタンパク質を発現する細胞を検出することができる。

TCR α定常ドメインおよび/またはTCR β定常ドメインも含む関心対象のタンパク質を前述のように作製するために、TCR可変ドメイン(αまたはβ)をTCR定常ドメインに融合し(例えば、TCR α可変ドメインをTCR α定常ドメインに融合し、TCRβ可変ドメインをTCRβ定常ドメインに融合する)、TCR 可変＋定常ドメインを、直接的にまたはリンカーを介してFcドメインに融合する。β可変ドメインに対する抗体、α可変ドメインに対する抗体、およびFcドメインに対する抗体の内の1種または複数種を用いて、関心対象のタンパク質を発現する細胞を検出することができる。

α可変ドメインに対する抗体、β可変ドメインに対する抗体、α定常ドメインに対する抗体、およびβ定常ドメインに対する抗体、ならびにFcドメインに対する抗体の内の1種または複数種を用いて、本明細書において説明した4SC622産生細胞株を単離する際に使用したのと同じ手順により、所望の量のTCR-Fcを発現する細胞を単離する。最も高レベルのTCR-Fcを発現する細胞を、TCR-Fc産生細胞株として選択する。

実施例14:複数のIgGアイソタイプおよび二重特異性抗体を単離するための、ScFvをベースとするCSCP
ゲノムの免疫グロブリン重鎖VDJ領域および免疫グロブリンκ鎖VJ領域がヒトオルソログで置換された遺伝子改変マウス(すなわち、Velocimmune(登録商標)マウス;その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,105,348号を参照されたい)を、ヒトIgG4タンパク質のFc断片(hFcもしくは単にFc;SEQ ID NO: 26)またはジペプチド変異を含むヒトΔAdpFcポリペプチド(IMGTによるH95R、Y96F;Fc^*としても公知;SEQ ID NO: 42)のいずれかで免疫化した。これらのマウスからモノクローナル抗体を得、Fc、Fc^*、またはFcおよび/もしくはFc^*を含む抗体に結合する能力についてスクリーニングした。Fcに結合できる3種の抗体(Ab1、Ab2、Ab3)およびFc^*に結合できる3種(Ab4、Ab5、Ab6)を、次の形態:Fc/Fc、Fc/Fc^*(二重特異性抗体であり得る)、およびFc^*/Fc^*の内の1つを有している分子に結合する能力について試験した。

Biacore 2000機器において、結合親和性および動力学的定数を明らかにするための測定を行った。抗体(Ab1〜Ab8のそれぞれ)を抗マウスFcセンサー表面(Mab捕捉形式)上に捕捉し、ヒトFc(SEQ ID NO: 26)ホモ二量体、ヒトFc^*ホモ二量体(SEQ ID NO: 42)、またはFc/Fc^*ヘテロ二量体を表面に注入した。Scrubber 2.0曲線当てはめソフトウェアを用いてデータを処理し1:1結合モデルに当てはめることによって、動力学的な結合速度定数(k_a)および解離速度定数(k_d)を決定した。次のように、動力学的速度定数から結合解離平衡定数(K_D)および解離半減期(t_1/2)を算出した:K_D(M)=k_d/k_aおよびt_1/2(分)=(ln2/(60^*k_d)。表2に示すように、抗体は、次の3つの異なるカテゴリーに分かれた:Fcに特異的なもの、Fc^*に特異的なもの、およびFcとFc^*の識別を示さないもの(非特異的)。Fc特異的抗体は、ジペプチド変異(H95R、Y96F)を有するヒトFc^*には結合しないため、これらの抗体はアミノ酸His95および/またはTyr96に依存していた。対照的に、Fc^*特異的抗体は野生型ヒトFcには結合しないため、これらの抗体はArg95および/またはPhe96に依存していた。

実施例15:Ab2およびAb2由来ScFv-FcγR融合タンパク質を産生する細胞株
Fc特異的Ab2の重鎖および軽鎖の配列を決定した。組換えAb2抗体を製造するために、重鎖をコードする発現ベクタープラスミドを構築し、軽鎖をコードする発現ベクタープラスミドを構築した。どちらのベクターも、CHO細胞における各サブユニットの発現および分泌を可能にする。抗体を発現させるために、両方のプラスミドをCHO-K1細胞にトランスフェクトし、安定な形質転換体を単離した。構成的CMVプロモーターによって、抗体鎖の発現を駆動した。

（表２）抗体の親和性−表面プラズモン共鳴研究

重鎖配列および軽鎖配列を用いて、抗Fc ScFv表面捕捉分子を作り出した。Ab2由来抗Fc ScFv-FcγR表面捕捉分子をコードする核酸を製造するために、Ab2免疫グロブリン重鎖可変ドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO: 15)およびAb2免疫グロブリン軽鎖可変ドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO: 16)を逆翻訳し、CHO細胞発現のためにコドン最適化した。同様に、ヒトFcγRIのC末端部分も、CHO細胞発現のためにコドン最適化した。コドン最適化したヌクレオチド配列をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し連結して、SEQ ID NO: 19のScFv-FcγR融合タンパク質をコードする連続した核酸配列(SEQ ID NO: 20)を形成させた。

標準的PCRおよび制限エンドヌクレアーゼクローニング技術を用いて、ScFv-FcγR-TM-cyto融合タンパク質をコードする核酸を発現ベクターに挿入した。SEQ ID NO: 23に例示した、結果として生じる環状プラスミドは、β-ラクタマーゼをコードする核酸配列および2つのオペロンを含む。1つ目のオペロンは、SV40プロモーターによって駆動される、ネオマイシン耐性マーカーとインフレームで緑色蛍光タンパク質の変異体である黄色蛍光タンパク質(YFP)をコードする核酸配列(例えばSEQ ID NO: 24)を含む。第2のオペロンは、本発明のこの局面の目的のためのベクターの「機能を果たす部分(business-end)」であり、hCMV-IEプロモーターおよびhCMVイントロンによって駆動される、コドン最適化されたScFv-FcγR融合タンパク質をコードする核酸配列(例えばSEQ ID NO: 25)を含む。

SEQ ID NO: 23のプラスミドをCHO-K1細胞にトランスフェクトした。SEQ ID NO: 22の直線状構築物を自身のゲノム中に組み込んだ安定な組込み体を単離した。

環状プラスミドは、第1のオペロンおよび第2のオペロンに隣接する2つのLox部位を含んでおり、宿主細胞のゲノム中に直線状構築物としてこれらのオペロンを組み込むことを可能にする。第1のLox部位から第2のLox部位に及ぶ直線状構築物は、SEQ ID NO: 22に例示しており、5プライムから3プライムに向かって、以下を含む:SV40プロモーター、ネオマイシン耐性をコードする核酸、IRES、eYFPをコードする核酸、SV40ポリアデニル化配列、hCMV-IEプロモーター、hCMVイントロン、Tetオペレーター配列(ScFv-FcγR-TM-cyto融合タンパク質の制御された発現のため)、mRORシグナル配列をコードする核酸、Ab2 ScFvをコードする核酸、FcγRの膜貫通部分および細胞質内部分をコードする核酸(SEQ ID NO: 21)、ならびにSV40ポリアデニル化配列。

実施例16:ScFv-FcγR-TM-cyto表面捕捉標的
組み込まれたSEQ ID NO: 22配列を含むCHO-K1細胞に、様々なサブタイプの抗体、例えば、IgG1、IgG2、IgG4、95R/435R-96F/436F二重置換を有する1つのCH3ドメインを含むがもう1つのCH3ドメインは野生型であるIgG4二重特異性抗体(IgG4 Fc/Fc^*)、およびIgG1 Fc/Fc^*形態のIgG1二重特異性抗体をコードするプラスミドをトランスフェクトした。細胞をドキシサイクリンで処理して、抗体と共に捕捉分子の産生を誘導した。抗体および捕捉分子を同時発現させた後、場合によってはこれらの細胞をhFcブロッキングタンパク質および検出分子(FITC標識抗hFab)で処理した。表3はこれらの結果を要約したものであり、ScFv-FcγR表面捕捉融合タンパク質がIgG4分子、IgG2分子、およびIgG1分子に結合するのに対し、野生型FcγR表面捕捉分子はIgG1に結合するがIgG4にもIgG2にも結合しないことを大まかに示している。

（表３）ブロッキング分子競合アッセイ法

¹ ドキシサイクリンあり
² ドキシサイクリンなし

実施例17:Ab6およびAb6由来ScFv^*-FcγR-TM-cytoを産生する細胞株
Fc^*特異的Ab6の重鎖および軽鎖の配列を決定した。軽鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO: 41であると決定した。重鎖のアミノ酸配列がSEQ ID NO: 40であると決定した。組換えAb6抗体を製造するために、重鎖をコードする発現ベクタープラスミドを構築し、軽鎖をコードする発現ベクタープラスミドを構築した。抗体を発現させるために、両方のプラスミドをCHO-K1細胞にトランスフェクトし、安定な形質転換体を単離し、構成的CMVプロモーターによって発現を駆動した。

Ab6由来の抗Fc^*特異的ScFv^*-FcγR表面捕捉分子をコードする核酸を製造するために、Ab6抗体の免疫グロブリン重鎖可変ドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO: 38)およびAb6の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO: 39)を逆翻訳し、CHO細胞発現のためにコドン最適化した。同様に、ヒトFcγRIのC末端部分(SEQ ID NO: 21)も、CHO細胞発現のためにコドン最適化した。コドン最適化したヌクレオチド配列をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し連結して、抗Fc^* ScFv^*-FcγR融合タンパク質(SEQ ID NO: 43)をコードする連続した核酸配列(SEQ ID NO: 45)を形成させた。

標準的PCRおよび制限エンドヌクレアーゼクローニング技術を用いて、ScFv^*-FcγR-TM-cyto融合タンパク質をコードする核酸を発現ベクターに挿入した。SEQ ID NO: 44に例示した、結果として生じる環状プラスミドは、β-ラクタマーゼをコードする核酸配列および2つのオペロンを含む。1つ目のオペロンは、SV40プロモーターによって駆動される、ネオマイシン耐性マーカーとインフレームで緑色蛍光タンパク質の変異体である黄色蛍光タンパク質(YFP)をコードする核酸配列(例えばSEQ ID NO: 46)を含む。第2のオペロンは、本発明のこの局面の目的のためのベクターの「機能を果たす部分」であり、hCMV-IEプロモーターおよびhCMVイントロンによって駆動される、コドン最適化された抗Fc^* ScFv-FcγR融合タンパク質をコードする核酸配列(例えばSEQ ID NO: 47)を含む。

SEQ ID NO: 44のプラスミドをCHO-K1細胞にトランスフェクトした。SEQ ID NO: 48の直線状構築物を組み込んだ安定な組込み体を単離した。

環状プラスミドは、第1のオペロンおよび第2のオペロンに隣接する2つのLox部位を含んでおり、宿主細胞のゲノム中に直線状構築物としてこれらのオペロンを組み込むことを可能にする。第1のLox部位から第2のLox部位に及ぶ直線状構築物は、SEQ ID NO: 48に例示しており、5プライムから3プライムに向かって、以下を含む:SV40プロモーター、ネオマイシン耐性をコードする核酸、IRES、eYFPをコードする核酸、SV40ポリアデニル化配列、hCMV-IEプロモーター、hCMVイントロン、Tetオペレーター配列(抗Fc^* ScFv^*-FcγR融合タンパク質の制御された発現のため)、mRORシグナル配列をコードする核酸、Ab6由来抗Fc^*特異的ScFv^*をコードする核酸、FcγRの膜貫通ドメインポリペプチドおよび細胞質内ドメインポリペプチドをコードする核酸(SEQ ID NO: 21)、ならびにSV40ポリアデニル化配列。

実施例18:二重特異性抗体の選別
抗Fc捕捉および抗Fc ^* 検出
Ab2に由来する抗Fc特異的ScFv-FcγR表面捕捉系を、二重特異性抗体を産生する細胞を検出および富化する能力に関して試験した。CH3ドメインの内の1つに95R/435R-96F/436F置換を含む(Fc^*と呼ばれる)二重特異性抗体を検出する能力を評価するために、hFcをブロッキング分子として用い、FITC標識Ab6抗Fc^*抗体(例えば、SEQ ID NO: 40のHCおよびSEQ ID NO: 41のLCを有するmAb)を検出分子として用いて、Ab2に由来する抗Fc特異的ScFv-FcγR表面捕捉細胞株において様々な抗体を発現させた。Ab2に由来する抗Fc特異的ScFv-FcγR表面捕捉細胞株は、Fc^*特異的Ab6を検出分子として用いて、任意のFc^*/Fc^*単特異性抗体またはFc/Fc 単特異性抗体より優先して二重特異性抗体(Fc/Fc^*)を検出および識別することができた(表4)。FcγRはIgG4に結合することができないか、または非常に低い親和性でIgG4に結合するため、野生型FcγR表面捕捉細胞株は、Fc/Fc^*、Fc^*/Fc^*、およびFc/Fc IgG4種を識別することができなかった。

抗Fc ^* 捕捉および抗Fc検出
逆に、Ab6に由来する抗Fc^*特異的ScFv^*-FcγR表面捕捉系を、二重特異性抗体を産生する細胞を検出および富化する能力に関して試験した。CH3ドメインの内の1つに95R/435R-96F/436F置換を含む(Fc^*と呼ばれる)二重特異性抗体を検出する能力を評価するために、hFcをブロッキング分子として用い、置換されていないCH3を認識するAlexa 488標識Ab2抗Fc抗体を検出分子として用いて、Ab6に由来する抗Fc^*特異的ScFv^*-FcγR表面捕捉細胞株において様々な抗体を発現させた。Ab6に由来する抗Fc^*特異的ScFv^*-FcγR表面捕捉細胞株は、Fc特異的Ab2を検出分子として用いて、Fc^*/Fc^*単特異性抗体またはFc/Fc単特異性抗体より優先して二重特異性抗体(Fc/Fc^*)を検出および識別することができた(表4)。FcγR表面捕捉細胞株は、Fc/Fc^*、Fc^*/Fc^*、およびFc/Fc IgG4種を識別することができなかった。

（表４）二重特異性抗体の検出−平均蛍光強度(MFI)

¹細胞表面捕捉タンパク質
²検出分子

実施例19:Fc/Fc^*二重特異性抗体の富化
(Ab2由来)ScFv-FcγR CSCP/(Ab6)抗Fc^*DM系および(Ab6由来)ScFv^*-FcγR CSCP/(Ab2)抗Fc DM系が二重特異性抗体を選別および富化する能力を評価するために、hFcをブロッキング分子として用い、FITC標識抗Fc^*(Ab6)抗体を検出分子として用いて、Fc/Fc^* IgG4モノクローナル抗体(IgG4-mAb-2)および抗Fc ScFv-FcγR融合タンパク質を同時発現する細胞株を、連続的な蛍光活性化細胞選別およびFc/Fc^*種の産生を富化するためにプールした。5番目および6番目の系列のプールに由来するFc/Fc^*を生じる細胞を、合計抗体力価ならびに各抗体形態、すなわちFc/Fc^*、Fc/Fc、およびFc^*/Fc^*の力価について解析した。これらの細胞は、置換されていないCH3ドメイン(「Fc」、すなわち、IMGT位置95番にヒスチジンを含みIMGT位置96番にチロシンを含む)をコードする重鎖と、置換されたCH3ドメイン(「Fc^*」、すなわち、IMGT位置95番にアルギニンを含みIMGT位置96番にフェニルアラニンを含む)をコードする重鎖の両方をコードするため、純粋に数学的なパネットのスクエア解析によると、細胞は理論上、25％のFc/Fc、50％のFc/Fc^*、および25％のFc^*/Fc^*を産生すると予想される。しかしながら、生物学的には、産生される抗体の(富化前の)ほとんどはFc/Fcであると予想され得る。

表5に示されるように、選択し、プールし、二重特異性抗体産生を富化させた細胞は、49％ものFc/Fc^*種を産生し、Fc/Fc^*二重特異性抗体の力価は少なくとも約3.2g/Lであった。

（表５）Fc/Fc^*二重特異性抗体IgG4-mAb-2の富化

前述の本発明は、例示および例としていくらか詳しく説明してきたが、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、いくつかの変更および修正を本発明の教示に加え得ることは、当業者には容易に明らかになると考えられる。

Claims (115)

1. ヒトIgG1-Fcドメイン、ヒトIgG2-Fcドメイン、またはヒトIgG4-Fcドメインに結合する、組換え型の抗原結合タンパク質。
2. SEQ ID NO: 26のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項1記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
3. 表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約40nM未満のK_Dでポリペプチドに結合する、請求項1または請求項2記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
4. SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
5. SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
6. SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
7. SEQ ID NO: 15のアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16のアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
8. (a)SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)SEQ ID NO: 17またはSEQ ID NO: 21と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項1〜7のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
9. SEQ ID NO: 15と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 16と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項1〜8のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
10. SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含むScFv融合タンパク質である、請求項1〜9のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
11. SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む抗体が結合するのと同じ、置換されたCH3ポリペプチド上のエピトープに結合する、組換え型の抗原結合タンパク質。
12. 請求項1〜11のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
13. 核酸が、SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項12記載の単離されたポリヌクレオチド。
14. (a)請求項12または13記載のポリヌクレオチド;
    (b)該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター;および
    (c)ポリアデニル化配列
    を含む、核酸ベクター。
15. プロモーターがCMVプロモーターである、請求項14記載の核酸ベクター。
16. 選択マーカーをコードする核酸を含む、請求項14または15記載の核酸ベクター。
17. 選択マーカーがネオマイシン耐性を与える、請求項16記載の核酸ベクター。
18. エネルギー転移タンパク質をコードする核酸を含む、請求項14〜17のいずれか一項記載の核酸ベクター。
19. エネルギー転移タンパク質が緑色蛍光タンパク質の誘導体である、請求項18記載の核酸ベクター。
20. 緑色蛍光タンパク質の誘導体が黄色蛍光タンパク質(「YFP」)である、請求項19記載の核酸ベクター。
21. 環状である、請求項14〜20のいずれか一項記載の核酸ベクター。
22. 直線状である、請求項14〜20のいずれか一項記載の核酸ベクター。
23. 宿主細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項22記載の核酸ベクター。
24. 宿主細胞がCHO細胞である、請求項14〜23のいずれか一項記載の核酸ベクター。
25. 請求項1〜11のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞。
26. CHO細胞である、請求項25記載の宿主細胞。
27. IMGTのエキソン番号付与システムに基づく(a)95R、ならびに(b)95Rおよび96F、またはEU番号付与システムに基づく(a')435R、ならびに(b')435Rおよび436Fからなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を含む置換されたCH3ポリペプチドに特異的に結合する、組換え型の抗原結合タンパク質。
28. SEQ ID NO: 42のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項27記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
29. 表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約60nM未満のK_Dでポリペプチドに結合する、請求項27または請求項28記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
30. SEQ ID NO: 38と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 39と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む、請求項27〜29のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
31. SEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR-1)、SEQ ID NO: 33のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 34のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、SEQ ID NO: 36のアミノ酸配列を有するLCDR-2、およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を有するLCDR-3を含む、請求項27〜30のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
32. SEQ ID NO: 38と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 39と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項27〜31のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
33. SEQ ID NO: 38のアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項27〜32のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
34. SEQ ID NO: 40と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 41と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体である、請求項27〜33のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
35. SEQ ID NO: 40と同一のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 41と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項27〜34のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
36. (a)SEQ ID NO: 38と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 39と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項27〜33のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
37. SEQ ID NO: 38と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 39と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項27〜33および36のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
38. SEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含むScFv融合タンパク質である、請求項27〜33、36、および37のいずれか一項記載の組換え型の抗原結合タンパク質。
39. SEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR1)、SEQ ID NO: 33のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 34のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、SEQ ID NO: 36のアミノ酸配列を有するLCDR-2、およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を有するLCDR-3を含む抗体が結合するのと同じ、置換されたCH3ポリペプチド上のエピトープに結合する、組換え型の抗原結合タンパク質。
40. 請求項27〜39のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
41. 核酸が、SEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項40記載の単離されたポリヌクレオチド。
42. 核酸が、SEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項40記載の単離されたポリヌクレオチド。
43. 核酸が、SEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項40記載の単離されたポリヌクレオチド。
44. (a)請求項40〜43のいずれか一項記載のポリヌクレオチド;
    (b)該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター;および
    (c)ポリアデニル化配列
    を含む、核酸ベクター。
45. プロモーターがCMVプロモーターである、請求項44記載の核酸ベクター。
46. 選択マーカーをコードする核酸を含む、請求項44または45記載の核酸ベクター。
47. 選択マーカーがネオマイシン耐性を与える、請求項46記載の核酸ベクター。
48. エネルギー転移タンパク質をコードする核酸を含む、請求項44〜47のいずれか一項記載の核酸ベクター。
49. エネルギー転移タンパク質が緑色蛍光タンパク質の誘導体である、請求項48記載の核酸ベクター。
50. 緑色蛍光タンパク質の誘導体が黄色蛍光タンパク質(「YFP」)である、請求項49記載の核酸ベクター。
51. 環状である、請求項44〜50のいずれか一項記載の核酸ベクター。
52. 直線状である、請求項44〜50のいずれか一項記載の核酸ベクター。
53. 宿主細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項52記載の核酸ベクター。
54. 宿主細胞がCHO細胞である、請求項44〜53のいずれか一項記載の核酸ベクター。
55. 請求項27〜39のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞。
56. CHO細胞である、請求項55記載の宿主細胞。
57. (a)細胞表面捕捉タンパク質(CSCP)およびヘテロ二量体タンパク質を宿主細胞において発現させる段階であって、(i)CSCPがヘテロ二量体タンパク質上の第1の部位に結合して、宿主細胞内部でCSCP-ヘテロ二量体タンパク質複合体を形成し、(ii)CSCP-ヘテロ二量体タンパク質複合体が宿主細胞を通って輸送され、(iii)次いで、宿主細胞の表面に提示される、段階;
    (b)宿主細胞を、ヘテロ二量体タンパク質上の第2の部位に結合する検出分子と接触させる段階;ならびに
    (c)検出分子に結合する宿主細胞を選択する段階
    を含む、ヘテロ二量体タンパク質を安定に発現する細胞を検出または単離する方法。
58. 段階(c)で宿主細胞を選択する前に、該細胞をブロッキング分子と接触させる段階であって、ブロッキング分子は、ヘテロ二量体タンパク質に結合していないCSCPには結合するが、CSCP-ヘテロ二量体タンパク質複合体には結合しない、段階を含む、請求項57記載の方法。
59. 選択する段階(c)が蛍光活性化細胞選別によって実施される、請求項57または58記載の方法。
60. ヘテロ二量体タンパク質が複数のサブユニットを含み、ヘテロ二量体タンパク質上の第1の部位が第1のサブユニット上に存在し、かつヘテロ二量体タンパク質上の第2の部位が第2のサブユニット上に存在する、請求項57〜59のいずれか一項記載の方法。
61. ヘテロ二量体タンパク質が抗体を含む、請求項60記載の方法。
62. 抗体上の第1の部位が、野生型CH3ドメインを含む重鎖上に存在する、請求項61記載の方法。
63. 抗体上の第1の部位が、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にヒスチジン残基を含みかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にチロシン残基を含むCH3ドメインを含む重鎖上に存在する、請求項57〜62のいずれか一項記載の方法。
64. CSCPが、ヒトIgG1-Fcドメイン、ヒトIgG2-Fcドメイン、またはヒトIgG4-Fcドメインに結合する組換え型の抗原結合タンパク質を含む、請求項57〜63のいずれか一項記載の方法。
65. 抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 26のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項57〜64のいずれか一項記載の方法。
66. 抗原結合タンパク質が、プロテインAまたはプロテインAの機能的断片を含む、請求項57〜65のいずれか一項記載の方法。
67. 抗原結合タンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインを含むキメラタンパク質である、請求項66記載の方法。
68. キメラタンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインおよび膜アンカーを含む、請求項67記載の方法。
69. キメラタンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインおよびFc受容体の膜貫通ドメインを含む、請求項68記載の方法。
70. 抗原結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約40nM未満のK_Dでポリペプチドに結合する、請求項57〜64のいずれか一項記載の方法。
71. CSCPが、(a)SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質を含む、請求項57〜70のいずれか一項記載の方法。
72. 検出分子(DM)が、SEQ ID NO: 38と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 39と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を含む、請求項71記載の方法。
73. CSCPが、(a)SEQ ID NO: 38と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 39と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質を含む抗原結合タンパク質を含む、請求項57〜59のいずれか一項記載の方法。
74. 検出分子(DM)が、SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を含む、請求項73記載の方法。
75. ブロッキング分子が非ヒトIgGまたはヒトFc分子である、請求項57〜74のいずれか一項記載の方法。
76. (a)膜アンカードメインを含む融合タンパク質でありかつヘテロ二量体タンパク質の第1のサブユニットに結合できる細胞表面捕捉タンパク質(CSCP)をコードする核酸を、ヘテロ二量体タンパク質を発現する細胞にトランスフェクトする段階;
    (b)高収率でCSCPを発現する(a)の細胞を検出する段階;
    (c)高収率でCSCPを発現する該細胞を単離および培養する段階;
    (d)ヘテロ二量体タンパク質の第2のサブユニットに結合する検出分子を用いて、段階(c)の単離および培養された細胞の表面のヘテロ二量体タンパク質を検出する段階;ならびに
    (e)検出されたヘテロ二量体タンパク質をその表面に有する段階(d)で検出された細胞を単離する段階
    を含む、ヘテロ二量体タンパク質を高レベルで産生する細胞を検出および単離する方法。
77. ヘテロ二量体タンパク質が抗体を含む、請求項76記載の方法。
78. ヘテロ二量体タンパク質の第1のサブユニットが、野生型CH3ドメインを含む重鎖ドメインを含む、請求項76または77記載の方法。
79. ヘテロ二量体タンパク質の第1のサブユニットが、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にヒスチジン残基を有しかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にチロシン残基を有しているCH3ドメインを含む重鎖を含む、請求項76〜78のいずれか一項記載の方法。
80. CSCPが、ヒトIgG1-Fcドメイン、ヒトIgG2-Fcドメイン、またはヒトIgG4-Fcドメインに結合する組換え型の抗原結合タンパク質を含む、請求項76〜79のいずれか一項記載の方法。
81. 組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 26のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項76〜80のいずれか一項記載の方法。
82. 組換え型の抗原結合タンパク質が、プロテインAまたはプロテインAの機能的断片を含む、請求項76〜81のいずれか一項記載の方法。
83. 組換え型の抗原結合タンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインを含む融合タンパク質である、請求項82記載の方法。
84. 融合タンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインおよび膜アンカーを含む、請求項82または83記載の方法。
85. 融合タンパク質が、プロテインAのFc結合ドメインおよびFc受容体の膜貫通ドメインを含む、請求項82〜84のいずれか一項記載の方法。
86. 組換え型の抗原結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約40nM未満のK_Dでポリペプチドに結合する、請求項76〜81のいずれか一項記載の方法。
87. 組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む、請求項76〜81のいずれか一項記載の方法。
88. 組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR-1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む、請求項76〜81または87のいずれか一項記載の方法。
89. 組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む抗体が結合するのと同じ、CH3ドメイン上のエピトープに結合する、請求項76〜81、87、または88のいずれか一項記載の方法。
90. 抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項76〜81または87〜89のいずれか一項記載の方法。
91. 抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 15のアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16のアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項76〜81または87〜90のいずれか一項記載の方法。
92. CSCPが、(a)SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)SEQ ID NO: 17またはSEQ ID NO: 21と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項76〜81のいずれか一項記載の方法。
93. CSCPが、SEQ ID NO: 15と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 16と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含むScFv融合タンパク質である、請求項76〜81または92のいずれか一項記載の方法。
94. CSCPが、SEQ ID NO: 19のアミノ酸配列を含むScFv融合タンパク質である、請求項76〜81、92、または93のいずれか一項記載の方法。
95. ヘテロ二量体タンパク質の第2のサブユニットが、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にアルギニン残基を含みかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にフェニルアラニン残基を含むCH3ドメインを含む重鎖を含む、請求項76〜94のいずれか一項記載の方法。
96. 検出分子(DM)が、ヒトIgG1-Fcドメイン、ヒトIgG2-Fcドメイン、またはヒトIgG4-Fcドメインに結合する標識された組換え型の抗原結合タンパク質を含み、Fcドメインが、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にアルギニン残基を含みかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にフェニルアラニン残基を含む、請求項95記載の方法。
97. 検出分子が、標識された抗ヒトIgG F(ab')2を含む、請求項95または96記載の方法。
98. 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する、請求項96または97記載の方法。
99. 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、表面プラズモン共鳴アッセイ法で測定した場合に約60nM未満のK_Dでポリペプチドに結合する、請求項96〜98のいずれか一項記載の方法。
100. 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 38と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 39と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む、請求項96〜99のいずれか一項記載の方法。
101. 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR-1)、SEQ ID NO: 33のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 34のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 35のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、SEQ ID NO: 36のアミノ酸配列を有するLCDR-2、およびSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を有するLCDR-3を含む、請求項96〜100のいずれか一項記載の方法。
102. 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 38と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 39と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項96〜101のいずれか一項記載の方法。
103. 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 38のアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項96〜102のいずれか一項記載の方法。
104. 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 40と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖およびSEQ ID NO: 41と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む標識された抗体である、請求項96〜103のいずれか一項記載の方法。
105. 標識された抗体が、SEQ ID NO: 40と同一のアミノ酸配列を有する重鎖およびSEQ ID NO: 41と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項104記載の方法。
106. ヘテロ二量体タンパク質の第1のサブユニットが、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にアルギニン残基を有しかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にフェニルアラニン残基を有するCH3ドメインを含む重鎖ドメインを含み、ヘテロ二量体タンパク質の第2のサブユニットが、IMGTのエキソン番号付与システムに基づく95番にヒスチジン残基を有しかつIMGTのエキソン番号付与システムに基づく96番にチロシン残基を有するCH3ドメインを含む重鎖ドメインを含む、請求項76〜78のいずれか一項記載の方法。
107. CSCPが、(a)SEQ ID NO: 38と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、(b)SEQ ID NO: 39と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および(c)膜アンカードメインを含むScFv融合タンパク質を含む、請求項106記載の方法。
108. ScFv融合タンパク質が、SEQ ID NO: 38と同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよびSEQ ID NO: 39と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項107記載の方法。
109. ScFv融合タンパク質がSEQ ID NO: 43のアミノ酸配列を含む、請求項107または108記載の方法。
110. 検出分子(DM)が、SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)またはSEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を含む標識された組換え型の抗原結合タンパク質を含む、請求項106〜109のいずれか一項記載の方法。
111. 標識された組換え型の抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1 (HCDR-1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む、請求項110記載の方法。
112. 検出分子(DM)が、SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有する重鎖CDR-1(HCDR1)、SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有するHCDR-2、SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有するHCDR-3、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR-1(LCDR-1)、およびSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有するLCDR-2を含む抗体が結合するのと同じ、CH3ドメイン上のエピトープに結合する標識された組換え型の抗原結合タンパク質を含む、請求項106記載の方法。
113. 標識された抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 15と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項112記載の方法。
114. 標識された抗原結合タンパク質が、SEQ ID NO: 15のアミノ酸配列を有するHCVRおよびSEQ ID NO: 16のアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項112または113記載の方法。
115. ブロッキング分子が非ヒトIgGまたはヒトFc分子である、請求項76〜114のいずれか一項記載の方法。