JP2015525765A - Cart細胞を調節するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、CAR T細胞療法中の健常組織の枯渇を阻害するための方法であって、CAR T細胞療法を受けている対象に、薬物および分子を含む薬物-分子結合体を投与する段階を含み、該分子が、T細胞の表面上に発現したCARと結合する、方法を提供する。本発明は、結合体の細胞内への内部移行および該細胞の薬物媒介性死滅をもたらす、結合体とCARとの結合に関する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2012年7月13日に提出された米国仮出願第61/671,518号の優先権を主張し、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2012年7月13日に提出された米国仮出願第61/671,518号の優先権を主張し、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の背景
特異的な細胞表面標的に対するキメラ抗原受容体(CAR)の形質導入によって、正常T細胞を、腫瘍を攻撃するように再方向づけすることができる。1つの事例として、CARは、慢性白血病の患者において顕著な抗腫瘍効果を示している(Porter et al., 2011, New Engl J Med, 365(8): 725-733(非特許文献1); Kalos et al, 2011, Sci Tr Med, 3(95): 95ra73(非特許文献2))。
特異的な細胞表面標的に対するキメラ抗原受容体(CAR)の形質導入によって、正常T細胞を、腫瘍を攻撃するように再方向づけすることができる。1つの事例として、CARは、慢性白血病の患者において顕著な抗腫瘍効果を示している(Porter et al., 2011, New Engl J Med, 365(8): 725-733(非特許文献1); Kalos et al, 2011, Sci Tr Med, 3(95): 95ra73(非特許文献2))。
このモデルでは、慢性リンパ性白血病(CLL)などのB細胞悪性腫瘍の表面上に発現する抗原であるCD19に対する抗体フラグメント(「scFv」と呼ばれる)を発現するように、T細胞が遺伝的に操作された。しかし、これと同じ分子は正常Bリンパ球上でも発現する。Bリンパ球の正常な機能は、抗体を産生して、T細胞が感染症を抑えるのを助けることである。現在までに、遺伝的に改変された抗CD19 T細胞(「CART-19細胞」)によって治療された患者において、B細胞枯渇と特異的に関連のある感染性合併症はみられていないが、遷延性の重度B細胞枯渇の転帰は未だに不明である。さらに、新たな特異性を備えた他の複数のCAR T細胞製品も現在開発中である。これらの新たなCAR T細胞製品には、試験対象である特定の種類の癌と同じ標的化抗原を発現するバイスタンダー細胞の選択的枯渇に関連する特有の毒性が伴う可能性がある。
したがって当技術分野では、CAR T細胞療法中の健常なバイスタンダー細胞の望まれない枯渇を予防することを目的として、CARを表面に発現する細胞を特異的にかつ要求に応じて標的化することのできる組成物および方法を開発することが求められている。本発明は、この満たされていない需要に応える。
Porter et al., 2011, New Engl J Med, 365(8): 725-733
Kalos et al, 2011, Sci Tr Med, 3(95): 95ra73
本発明は、細胞の表面上に発現したCARと結合する、薬物および分子を含む薬物-分子結合体を提供する。
1つの態様において、結合体とCARとの結合は、該結合体の細胞内への内部移行をもたらす。
1つの態様において、結合体とCARとの結合は、細胞の薬物媒介性死滅をもたらす。
1つの態様において、細胞はT細胞であり、結合体とCARとの結合は、該T細胞の活性化の薬物媒介性阻害をもたらす。
1つの態様において、分子は、抗体、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、小分子、およびそれらの断片からなる群より選択される。
本発明は、CAR T細胞療法中の健常組織の枯渇を阻害するための方法であって、CAR T細胞療法を受けている対象に、薬物および分子を含む薬物-分子結合体を投与する段階を含み、該分子が、T細胞の表面上に発現したCARと結合する、方法を提供する。
1つの態様において、結合体とCARとの結合は、該結合体の細胞内への内部移行をもたらす。
1つの態様において、結合体とCARとの結合は、細胞の薬物媒介性死滅をもたらす。
1つの態様において、結合体とCARとの結合は、T細胞の活性化の薬物媒介性阻害をもたらす。
1つの態様において、分子は、抗体、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、小分子、およびそれらの断片からなる群より選択される。
本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、さらによく理解されるであろう。本発明を例示するために、本明細書において好ましい態様を図面中に示している。しかし、本発明は、図面中に示された態様の厳密な配置および手段には限定されないことが理解されるべきである。
詳細な説明
本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように改変されたT細胞の活性を調節するための組成物および方法を提供する。CARを発現するように遺伝的に改変されたT細胞は癌に対する治療に用いられており、その場合、CARは、腫瘍抗原を認識するように改変T細胞を再方向づける。場合によっては、CAR T細胞を効果的に制御および調節して、その結果、それらが正常なバイスタンダー細胞に影響を与えずに腫瘍細胞を死滅させるようにすることが有益であると考えられる。したがって、1つの態様において、本発明はまた、正常な非癌性細胞の枯渇を最小限に抑えながら、癌性細胞を死滅させる方法も提供する。
本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように改変されたT細胞の活性を調節するための組成物および方法を提供する。CARを発現するように遺伝的に改変されたT細胞は癌に対する治療に用いられており、その場合、CARは、腫瘍抗原を認識するように改変T細胞を再方向づける。場合によっては、CAR T細胞を効果的に制御および調節して、その結果、それらが正常なバイスタンダー細胞に影響を与えずに腫瘍細胞を死滅させるようにすることが有益であると考えられる。したがって、1つの態様において、本発明はまた、正常な非癌性細胞の枯渇を最小限に抑えながら、癌性細胞を死滅させる方法も提供する。
1つの態様において、本発明は、細胞上に発現する複数の種類のCARを提供し、ここで、CAR T細胞活性化のためには、複数の種類のCARとそれらの標的抗原との結合が必要である。1つの態様において、本発明の方法は、複数の種類のCARを発現するようにT細胞を遺伝的に改変する段階を含み、ここで、T細胞活性化は、複数の種類のCARとそれらの標的抗原との結合に依存する。例えば、1つの態様において、T細胞は、第1の所望の抗原に対して標的化された第1のCAR、および第2の所望の抗原に対して標的化された第2のCARを発現することができる。1つの態様において、改変T細胞の活性化は、第1のCARが第1の所望の抗原と結合し、かつ第2のCARが第2の所望の抗原と結合した場合にのみ起こる。1つの態様において、複数の異なるCARの結合に対する依存性により、CAR T細胞療法の特異性が向上する。
1つの態様において、本発明は阻害性CARを提供し、ここで、阻害性CARと正常細胞との結合は、CAR T細胞活性の阻害をもたらす。1つの態様において、阻害性CARは、治療用腫瘍指向性CARと同じT細胞において共発現する。1つの態様において、阻害性CARは、正常な非癌性細胞および細胞質ドメインに付随する抗原を認識する抗原結合ドメインを含む。1つの態様において、本方法は、少なくとも1つの阻害性CARおよび少なくとも1つの治療用腫瘍指向性CARを発現するように、T細胞を遺伝的に改変する段階を含む。1つの態様において、阻害性CARと、非癌性細胞に付随する抗原との結合により、CAR T細胞の死滅がもたらされる。1つの態様において、治療用腫瘍指向性CARと、癌性細胞上の腫瘍抗原との結合により、T細胞活性化および癌性細胞のT細胞媒介性死滅がもたらされる。
1つの態様において、本発明は、細胞表面に発現したCARと結合する薬物-分子結合体を提供する。1つの態様において、結合体とCARとの結合により、結合体の内部移行が誘導され、これにより、薬物がCAR T細胞を死滅させることが可能になる。本発明はまた、薬物-分子結合体を投与することによってCAR T細胞活性を調節する方法であって、薬物-分子結合体がCARの内部移行およびCAR T細胞の死滅を招く方法も提供する。
定義
別に定める場合を除き、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと同様または同等な任意の方法および材料を本発明の試験のために実地に用いることができるが、本明細書では好ましい材料および方法について説明する。本発明の説明および特許請求を行う上では、以下の専門用語を用いる。
別に定める場合を除き、本明細書で用いる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと同様または同等な任意の方法および材料を本発明の試験のために実地に用いることができるが、本明細書では好ましい材料および方法について説明する。本発明の説明および特許請求を行う上では、以下の専門用語を用いる。
また、本明細書中で用いる専門用語は、特定の態様を説明することのみを目的とし、限定的であることは意図しないことも理解される必要がある。
「1つの(a)」および「1つの(an)」という冠詞は、本明細書において、その冠詞の文法的目的語の1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を指して用いられる。一例として、「1つの要素」は、1つの要素または複数の要素を意味する。
量、時間的長さなどの測定可能な値に言及する場合に本明細書で用いる「約」は、特定された値からの±20%または±10%、場合によっては±5%、場合によっては±1%、かつ場合によっては±0.1%のばらつきを包含するものとするが、これはそのようなばらつきが、開示された方法を実施する上で妥当なためである。
「活性化」とは、本明細書で用いる場合、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたT細胞の状態のことを指す。また、活性化が、サイトカイン産生の誘導、および検出可能なエフェクター機能を伴うこともある。「活性化されたT細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を行っているT細胞のことを指す。
「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子のことを指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであってもよく、無傷の免疫グロブリンの免疫応答部分であってもよい。抗体は、免疫グロブリン分子のものであることが多い。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab)2、ならびに単鎖抗体およびヒト化抗体を含む、種々の形態で存在しうる(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY;Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York;Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。
「抗体フラグメント」という用語は、無傷の抗体の一部分のことを指し、無傷の抗体の抗原決定可変領域のことも指す。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFvフラグメント、直鎖状抗体、scFv抗体、ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が非限定的に含まれる。
「抗体重鎖」とは、本明細書で用いる場合、天然に存在するコンフォメーションにあるすべての抗体分子中に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち、大きい方のことを指す。
「抗体軽鎖」とは、本明細書で用いる場合、天然に存在するコンフォメーションにあるすべての抗体分子中に存在する2種類のポリペプチド鎖のうち、小さい方のことを指す。κ軽鎖およびλ軽鎖とは、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプのことを指す。
本明細書で用いる「合成抗体」とは、組換えDNA技術を用いて作製される抗体、例えば、本明細書に記載のバクテリオファージによって発現される抗体のことを意味する。この用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成によって作製される抗体であって、そのDNA分子が抗体タンパク質またはその抗体を指定するアミノ酸配列を発現し、そのDNA配列またはアミノ酸配列が、利用可能であって当技術分野において周知であるDNA配列またはアミノ酸配列の合成技術を用いて得られたような抗体も意味するとみなされるべきである。
本明細書で用いる「抗原」または「Ag」という用語は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれかまたは両方が含まれうる。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原としての役を果たしうることを理解するであろう。その上、抗原が組換えDNAまたはゲノムDNAに由来してもよい。当業者は、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のDNAが、それ故に、本明細書中でその用語が用いられる通りの「抗原」をコードすることを理解するであろう。その上、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要はないことも理解するであろう。本発明が1つまたは複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を非限定的に含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を惹起するさまざまな組み合わせで並べられていることは直ちに明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことも理解するであろう。抗原を合成して作製することもでき、または生物試料から得ることもできることは直ちに明らかである。そのような生物試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体液が非限定的に含まれうる。
本明細書で用いる「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、期待余命の延長、または癌性病状に付随するさまざまな生理的症状の改善によって明らかになる生物学的効果のことを指す。「抗腫瘍効果」はまた、腫瘍のそもそもの発生を予防する、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても明らかになる。
「自己抗原」という用語は、本発明によれば、それが外来性であるかのように免疫系によって認識される、あらゆる自己抗原のことを意味する。自己抗原には、細胞表面受容体を含む、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質が非限定的に含まれる。
本明細書で用いる「自己免疫疾患」は、自己免疫反応に起因する障害と定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切かつ過剰な反応の結果である。自己免疫疾患の例には、とりわけ、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病(I型)、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー(Guillain-Barr)症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、尋常性白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が非限定的に含まれる。
本明細書で用いる場合、「自己」という用語は、後にその個体に再び導入される、同じ個体に由来する任意の材料を指すものとする。
「同種」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片のことを指す。
「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片のことを指す。
本明細書で用いる「癌」という用語は、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖を特徴とする疾患と定義される。癌細胞は局所的に広がることもあれば、または血流およびリンパ系を通じて身体の他の部分に広がることもある。さまざまな癌の例には、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などが非限定的に含まれる。
「共刺激リガンド」には、この用語が本明細書で用いられる場合、T細胞上のコグネイト共刺激分子と特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子のTCR/CD3複合体への結合によって与えられる一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化などを非限定的に含むT細胞応答を媒介するシグナルも与えることのできる、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)上の分子が含まれる。共刺激リガンドには、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド(ICOS-L)、細胞内接着分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、Tollリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが非限定的に含まれる。共刺激リガンドはまた、とりわけ、これらに限定されるわけではないがCD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3などのT細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体、およびCD83に特異的に結合するリガンドも包含する。
「共刺激分子」とは、共刺激リガンドに特異的に結合し、それにより、これに限定されるわけではないが増殖などの、T細胞による共刺激応答を媒介する、T細胞上のコグネイト結合パートナーのことを指す。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLAおよびTollリガンド受容体が非限定的に含まれる。
「共刺激シグナル」とは、本明細書で用いる場合、TCR/CD3連結などの一次シグナルとの組み合わせで、T細胞の増殖、および/または鍵となる分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを導く分子のことを指す。
「疾患」とは、動物が恒常性を維持することができず、その疾患が改善しなければその動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態のことを指す。対照的に、動物における「障害」とは、その動物が恒常性を維持することはできるが、その動物の健康状態が、障害の非存在下にあるよりもより不都合である健康状態のことである。治療されないままであっても、障害は必ずしもその動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
本明細書で用いる「有効量」とは、治療的または予防的な有益性をもたらす量のことを意味する。
「コードする」とは、所定のヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)または所定のアミノ酸配列のいずれか、およびそれに起因する生物学的特性を有する、生物過程において他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして働く、遺伝子、cDNAまたはmRNAなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性のことを指す。すなわち、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、そのタンパク質をコードする。mRNA配列と同一であって通常は配列表として提示されるヌクレオチド配列を有するコード鎖と、遺伝子またはcDNAの転写のためのテンプレートとして用いられる非コード鎖の両方を、タンパク質、またはその遺伝子もしくはcDNAの他の産物をコードすると称することができる。
本明細書で用いる場合、「内因性」とは、生物体、細胞、組織もしくは系に由来するか、またはその内部で産生される任意の材料のことを指す。
本明細書で用いる場合、「外因性」という用語は、生物体、細胞、組織もしくは系の外部で産生された、該生物体、細胞、組織もしくは系に導入された任意の材料のことを指す。
本明細書で用いる「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳と定義される。
「発現ベクター」とは、発現させようとするヌクレオチド配列と機能的に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターのことを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用エレメントを含む;発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給されうる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み入れたコスミド、プラスミド(例えば、裸のもの、またはリポソーム中に含まれるもの)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)といった、当技術分野において公知であるすべてのものが含まれる。
「相同な」とは、2つのポリペプチドの間または2つの核酸分子の間の配列類似性または配列同一性のことを指す。比較する2つの配列の両方において、ある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおいて、ある位置がアデニンによって占められている場合には、それらの分子はその位置で相同である。2つの配列間の相同度(percent of homology)は、2つの配列が共通して持つ一致する位置または相同な位置の数を、比較する位置の数によって除算した上で100を掛けた関数である。例えば、2つの配列中の10個の位置のうち6個が一致するかまたは相同であるならば、2つの配列は60%相同である。一例として、DNA配列ATTGCCおよびTATGGCは50%の相同性を有する。一般に、比較は、最大の相同性が得られるように2つの配列のアラインメントを行った上で行われる。
「免疫グロブリン」または「Ig」という用語は、本明細書で用いる場合、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。B細胞によって発現される抗体は、BCR(B細胞受容体)または抗原受容体と称されることも時にある。このタンパク質のクラスに含まれる5つのメンバーは、IgA、IgG、IgM、IgDおよびIgEである。IgAは、唾液、涙液、母乳、消化管分泌物、ならびに気道および泌尿生殖路の粘液分泌物などの身体分泌物中に存在する主要な抗体である。IgGは、最も一般的な流血中抗体である。IgMは、ほとんどの哺乳動物で一次免疫応答において産生される主な免疫グロブリンである。これは凝集反応、補体固定および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。IgDは抗体機能が判明していない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として働いている可能性がある。IgEは、アレルゲンに対する曝露時にマスト細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
本明細書で用いる場合、「説明資料(instructional material」には、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために用いうる、刊行物、記録、略図または他の任意の表現媒体が含まれる。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の核酸、ペプチドおよび/もしくは組成物を含む容器に添付してもよく、または核酸、ペプチドおよび/もしくは組成物を含む容器と一緒に出荷してもよい。または、説明資料および化合物がレシピエントによって一体として用いられることを意図して、説明資料を容器と別に出荷してもよい。
「単離された」とは、天然の状態から変更されるかまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然の状態で共存する物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することもでき、または例えば宿主細胞などの非天然の環境で存在することもできる。
本発明に関連して、一般的に存在する核酸塩基に関しては以下の略語を用いる。「A」はアデノシンのことを指し、「C」はシトシンのことを指し、「G」はグアノシンのことを指し、「T」はチミジンのことを指し、「U」はウリジンのことを指す。
別に指定する場合を除き、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、相互に縮重型であって、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチドが含まれる。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句には、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部の型においてイントロンを含みうる限り、イントロンも含まれうる。
本明細書で用いる「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科(Retroviridae)ファミリーの属のことを指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させうるという点で、レトロウイルスの中でも独特である;それらはかなりの量の遺伝情報を宿主細胞のDNA中に送達することができるため、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIVおよびFIVはすべて、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボでかなり高いレベルの遺伝子移入を達成するための手段を与える。
「モジュレートする」という用語は、本明細書で用いる場合、治療もしくは化合物の非存在下でのその対象における反応のレベルと比較して、および/または他の点では同一であるが治療を受けていない対象における反応のレベルと比較して、対象における反応のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、対象、好ましくはヒトにおいて、天然のシグナルまたは反応を擾乱させかつ/またはそれに影響を及ぼすことにより、有益な治療反応を媒介することを包含する。
別に指定する場合を除き、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、相互に縮重型であって、かつ同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチドが含まれる。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列が、イントロンを含んでもよい。
「機能的に連結した」という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の、後者の発現を結果的にもたらす機能的連結のことを指す。例えば、第1の核酸配列が第2の核酸配列との機能的関係の下で配置されている場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能的に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターはコード配列と機能的に連結している。一般に、機能的に連結したDNA配列は連続しており、2つのタンパク質コード領域を接続することが必要な場合には、同一のリーディングフレーム内にある。
「過剰発現された」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織または臓器の内部にある固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の発現が、その組織または臓器からの正常細胞における発現のレベルに比して異常なレベルであることを指し示すことを意図している。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野において公知の標準的なアッセイによって判定することができる。
免疫原性組成物の「非経口的」投与には、例えば、皮下(s.c.)、静脈内(i.v.)、筋肉内(i.m.)または胸骨内の注射法または輸注法が含まれる。
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書において互換的に用いられ、本明細書に記載の方法を適用しうる、インビトロまたはインサイチューの別を問わない、任意の動物またはその細胞のことを指す。ある非限定的な態様において、患者、対象または個体はヒトである。
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの連鎖と定義される。その上、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で用いる核酸およびポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、それらはモノマー性「ヌクレオチド」に加水分解されうるという一般知識を有する。モノマー性ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解されうる。本明細書で用いるポリヌクレオチドには、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCRなどを用いて組換えライブラリーまたは細胞ゲノムから核酸配列をクローニングすること、および合成手段を非限定的に含む、当技術分野で利用可能な任意の手段によって得られる、すべての核酸配列が非限定的に含まれる。
本明細書で用いる場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基で構成される化合物のことを指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互に結合した2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で用いる場合、この用語は、例えば、当技術分野において一般的にはペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖、ならびに当技術分野において一般にタンパク質と称される長鎖の両方のことを指し、それらには多くの種類がある。「ポリペプチド」には、いくつか例を挙げると、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはこれらの組み合わせが含まれる。
本明細書で用いる「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列と定義される。
本明細書で用いる場合、「プロモーター/調節配列」という用語は、プロモーター/調節配列と機能的に連結した遺伝子産物の発現のために必要とされる核酸配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であってよく、また別の場合には、この配列が、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列および他の制御エレメントをも含んでもよい。プロモーター/制御配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現させるものであってもよい。
「構成性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。
「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、実質的にはそのプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在する場合にのみ、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。
「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、実質的には細胞がそのプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、その遺伝子産物が細胞内で産生されるようにするヌクレオチド配列のことである。
「特異的に結合する」という用語は、抗体に関して本明細書で用いる場合、試料中の特異的な抗原を認識するが、他の分子は実質的に認識もせず、それらと結合もしない抗体のことを意味する。例えば、1つの種由来の抗原と特異的に結合する抗体が、1つまたは複数の種由来のその抗原と結合してもよい。しかし、そのような種間反応性はそれ自体では、抗体の分類を特異的として変更させることはない。もう1つの例において、抗原と特異的に結合する抗体が、その抗原の異なるアレル形態と結合してもよい。しかし、そのような交差反応性はそれ自体では、抗体の分類を特異的として変更させることはない。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗体、タンパク質またはペプチドの第2の化学種との相互作用に言及して、その相互作用が、化学種での特定の構造(例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存することを意味して用いることができる;例えば、ある抗体は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識してそれと結合する。抗体がエピトープ「A」に対して特異的であるならば、エピトープAを含有する分子(または遊離した非標識A)の存在は、標識「A」およびその抗体を含む反応において、その抗体と結合した標識Aの量を減少させると考えられる。
「刺激」という用語は、刺激分子(例えば、TCR/CD3複合体)がそのコグネイトリガンドと結合して、それにより、これに限定されるわけではないがTCR/CD3複合体を介するシグナル伝達などのシグナル伝達イベントを媒介することによって誘導される、一次応答のことを意味する。刺激は、TGF-βのダウンレギュレーション、および/または細胞骨格構造の再構築などのような、ある種の分子の発現の改変を媒介してもよい。
「刺激分子」とは、この用語が本明細書で用いられる場合、抗原提示細胞上に存在するコグネイト刺激リガンドに特異的に結合する、T細胞上の分子のことを意味する。
「刺激リガンド」とは、本明細書で用いる場合、抗原提示細胞(例えば、aAPC、樹状細胞、B細胞など)上に存在する場合に、T細胞上のコグネイト結合パートナー(本明細書では「刺激分子」と称する)と特異的に結合して、それにより、活性化、免疫応答の開始、増殖などを非限定的に含む、T細胞による一次応答を媒介することのできるリガンドのことを意味する。刺激リガンドは当技術分野において周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたMHCクラスI分子、抗CD3抗体、スーパーアゴニスト抗CD28抗体およびスーパーアゴニスト抗CD2抗体を包含する。
「対象」、「患者」、および「個体」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、免疫応答を惹起させることができる、生きている生物(例えば、哺乳動物)を含むことを意図している。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。
本明細書で用いる場合、「実質的に精製された」細胞とは、他の細胞型を本質的に含まない細胞のことである。また、実質的に精製された細胞とは、その天然の状態に本来付随する他の細胞型から分離された細胞のことも指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団とは、均一な細胞集団のことを指す。また別の場合には、この用語は、単に、天然の状態において本来付随する細胞から分離された細胞のことを指す。いくつかの態様において、細胞はインビトロで培養される。他の態様において、細胞はインビトロでは培養されない。
本明細書で用いる「治療的」という用語は、治療および/または予防のことを意味する。治療効果は、疾病状態の抑制、寛解または根絶によって得られる。
「治療的有効量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床専門家が詳しく調べようとしている、組織、系または対象の生物学的または医学的な反応を誘発すると考えられる対象化合物の量のことを指す。「治療的有効量」という用語には、投与された場合に、治療される障害または疾患の徴候または症状のうち1つもしくは複数の発生を予防するか、またはそれをある程度改善するのに十分な、化合物の量が含まれる。治療的有効量は、化合物、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重などに応じて異なると考えられる。
ある疾患を「治療する」とは、この用語が本明細書で用いられる場合、対象が被っている疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症状の頻度または重症度を軽減することを意味する。
本明細書で用いる「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞内に移入または導入される過程のことを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞とは、外因性核酸をトランスフェクトされた、外因性核酸によって形質転換された、または外因性核酸を形質導入された細胞である。この細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
本明細書で用いる「転写制御下」または「機能的に連結した」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために正しい位置および向きにあることを意味する。
「ベクター」とは、単離された核酸を含み、かつその単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いうる組成物のことである。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを非限定的に含む数多くのベクターが、当技術分野において公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律複製性プラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性および非ウイルス性の化合物も含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが非限定的に含まれる。
範囲:本開示の全体を通じて、本発明のさまざまな局面を、範囲形式で提示することができる。範囲形式による記載は、単に便宜上かつ簡潔さのためであって、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定とみなされるべきではないことが理解される必要がある。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内におけるすべての可能な部分的範囲とともに、個々の数値も具体的に開示されていると考慮されるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分的範囲とともに、その範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3および6も、具体的に開示されていると考慮されるべきである。これは範囲の幅広さとは関係なく適用される。
説明
本発明は、CAR T細胞療法による非癌性細胞の枯渇を制限するための組成物および方法を提供する。本明細書で開示したように、治療用CAR T細胞はその標的と結合した時に抗腫瘍特性を示し、一方、阻害性CARは、阻害性CARがその標的と結合した時にCAR T細胞活性の阻害をもたらす。
本発明は、CAR T細胞療法による非癌性細胞の枯渇を制限するための組成物および方法を提供する。本明細書で開示したように、治療用CAR T細胞はその標的と結合した時に抗腫瘍特性を示し、一方、阻害性CARは、阻害性CARがその標的と結合した時にCAR T細胞活性の阻害をもたらす。
CARの種類にかかわらず、CARは、細胞質ドメインに融合した抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように遺伝子操作される。1つの態様において、CARは、T細胞で発現された場合に、抗原特異性に基づく抗原認識を再方向づけすることができる。例示的な抗原はCD19であるが、これはこの抗原がB細胞リンパ腫上で発現するためである。しかし、CD19は正常B細胞上でも発現し、そのため、抗CD19ドメインを含むCARは正常B細胞の枯渇をもたらす可能性がある。B細胞は通常、感染を抑える上でT細胞を補助することから、正常B細胞の枯渇は、治療された対象を感染にかかりやすくする恐れがある。本発明は、CAR T細胞療法中の正常組織の枯渇を制限するための組成物および方法を提供する。1つの態様において、本発明は、健常なバイスタンダー細胞の枯渇を制限しながら、CAR T細胞療法を用いて癌および他の障害を治療するための方法を提供する。
1つの態様において、本発明は、CAR T細胞活性を制御または調節することを含む。1つの態様において、本発明は、複数の種類のCARを発現するようにT細胞を遺伝的に改変することに関係する組成物および方法を含み、ここで、CAR T細胞活性化は複数の種類のCARとそれらの標的受容体との結合に依存する。複数の種類のCARの結合に対する依存性により、CAR T細胞の溶解活性の特異性が向上し、それにより、正常な健常組織が枯渇する可能性が低くなる。
もう1つの態様において、本発明は、阻害性CARによってT細胞を遺伝的に改変することに関係する組成物および方法を含む。1つの態様において、阻害性CARは、正常な非癌性細胞および阻害性細胞質ドメインに付随する抗原を認識する細胞外抗原結合ドメインを含む。
1つの態様において、本発明は、二重(dual)CARを提供し、ここで、T細胞は、阻害性CARおよび治療用腫瘍指向性CARを発現するように遺伝的に改変される。1つの態様において、阻害性CARと正常な非癌性細胞との結合は、CAR T細胞の阻害をもたらす。例えば、1つの態様において、阻害性CARの結合は、CAR T細胞の死滅をもたらす。もう1つの態様において、阻害性CARの結合は、治療用腫瘍指向性CARのシグナル伝達の阻害をもたらす。さらにもう1つの態様において、阻害性CARの結合は、改変T細胞がその抗腫瘍活性を示すのを妨げるシグナル伝達シグナルの誘導をもたらす。したがって、本発明の二重CARは、CAR T細胞の活性を調節するための機序を提供する。
1つの態様において、本発明は、治療用腫瘍指向性CARと結合する薬物-分子結合体に関係する組成物および方法を含む。1つの態様において、結合体と治療用腫瘍指向性CARとの結合は、CARおよび薬物-分子結合体の内部移行をもたらす。1つの態様において、結合体とCARとの結合は、CAR T細胞の死滅をもたらす。もう1つの態様において、結合体とCARとの結合は、治療用腫瘍指向性CARのシグナル伝達の阻害をもたらす。さらにもう1つの態様において、結合体とCARとの結合は、改変T細胞がその抗腫瘍活性を示すのを妨げるシグナル伝達シグナルの誘導をもたらす。したがって、本発明は、CAR T細胞の活性を調節するための機序を提供する。
1つの態様において、本発明は、正常な健常組織の枯渇を最小限に抑えながら、CAR T細胞療法を用いて癌および他の障害を治療するための方法を提供する。癌は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、原発性腫瘍または転移性腫瘍であってよい。本発明の組成物および方法を用いて治療しうる他の疾患には、ウイルス感染症、細菌感染症および寄生虫感染症ならびに自己免疫疾患が含まれる。
1.複数CARによる戦略
1つの態様において、本発明は、複数の種類のCARを発現するようにT細胞を遺伝的に改変することによって、CAR T細胞療法の特異性を高めるためおよび正常な健常組織の枯渇を制限するための組成物および方法であって、T細胞の活性化が複数の種類のCARの結合に依存する組成物および方法を提供する。複数の種類のCARの結合に対する依存性により、治療法の特異性が高まり、それ故に、正常な健常組織の枯渇の量が制限される。本明細書中の他所に記載したように、複数の種類のCARを発現するように改変されたT細胞は、レンチウイルスベクター、インビトロ転写RNA、またはそれらの組み合わせを細胞に投与することによって作製することができる。
1つの態様において、本発明は、複数の種類のCARを発現するようにT細胞を遺伝的に改変することによって、CAR T細胞療法の特異性を高めるためおよび正常な健常組織の枯渇を制限するための組成物および方法であって、T細胞の活性化が複数の種類のCARの結合に依存する組成物および方法を提供する。複数の種類のCARの結合に対する依存性により、治療法の特異性が高まり、それ故に、正常な健常組織の枯渇の量が制限される。本明細書中の他所に記載したように、複数の種類のCARを発現するように改変されたT細胞は、レンチウイルスベクター、インビトロ転写RNA、またはそれらの組み合わせを細胞に投与することによって作製することができる。
キメラ抗原受容体
本発明は、細胞外および細胞内のドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を含む。CARを作製する組成物及び方法はPCT/US11/64191に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
本発明は、細胞外および細胞内のドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)を含む。CARを作製する組成物及び方法はPCT/US11/64191に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
細胞外ドメインは、別の言い方では抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合エレメントを含む。いくつかの態様において、細胞外ドメインはまたヒンジドメインも含む。1つの態様において、細胞内ドメイン、または別の言い方では細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、CARの一部分のことを指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な反応のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子のことである。
CARの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはCARの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインを組み入れてもよい。本明細書で用いる場合、「スペーサードメイン」という用語は、一般に、ポリペプチド鎖中の膜貫通ドメインを、細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかと連結させる働きをするオリゴペプチドまたはポリペプチドのことを意味する。スペーサードメインは、最大で300アミノ酸、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸で構成されうる。
本発明は、細胞内に直接的に形質導入しうる、CARを発現するレトロウイルスベクター構築物およびレンチウイルスベクター構築物を含む。本発明はまた、細胞内にトランスフェクトすることができるRNA構築物も含む。トランスフェクションに用いるためのmRNAを作製するための方法は、3'および5'非翻訳配列(「UTR」)、5'キャップおよび/または配列内リボソーム進入部位(IRES)、発現させようとする遺伝子、ならびに典型的には長さが50〜2000塩基であるポリA尾部を含有する構築物を生成するための、特別に設計されたプライマーを用いるテンプレートのインビトロ転写(IVT)、およびその後のポリA付加を伴う。そのようにして生成されたRNAは、さまざまな種類の細胞を効率的にトランスフェクトさせることができる。1つの態様において、テンプレートはCAR用の配列を含む。
好ましくは、CARは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは、そのようなドメインの任意の所望の供給源から導き出すことができる。場合によっては、本発明のCARのヒンジドメインは、CD8αヒンジドメインを含む。
1つの態様において、本発明のCARは、別の言い方では抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合エレメントを含む。モイエティーの選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドの種類および数によって決まる。例えば、抗原結合ドメインを、特定の疾病状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択することができる。このように、本発明のCARにおける抗原モイエティードメインとして作用しうる細胞表面マーカーの例には、ウイルス感染、細菌感染症および寄生虫感染症、自己免疫疾患ならびに癌細胞と関連するものが含まれる。
1つの態様において、本発明のCARは、腫瘍細胞上の抗原と特異的に結合する所望の抗原結合ドメインを作製することによって、関心対象の腫瘍抗原を標的とするように操作することができる。本発明に関連して、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性(hyperporoliferative)障害抗原」または「過剰増殖性障害と関連する抗原」とは、癌などの特定の過剰増殖性障害に共通する抗原のことを指す。本明細書で考察する抗原は、単に一例として含めているに過ぎない。リストは排他的であることを意図してはおらず、そのほかの例も当業者には容易に明らかとなるであろう。
腫瘍抗原とは、免疫応答、特にT細胞媒介性免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質のことである。本発明の抗原結合ドメインの選択は、治療される癌の具体的な種類に依存すると考えられる。腫瘍抗原は当技術分野において周知であり、これには例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原(CEA)、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、チログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、プロスターゼ、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、プロステイン、PSMA、Her2/neu、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン増殖因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体ならびにメソテリンが含まれる。
1つの態様において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する1つまたは複数の抗原性癌エピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原としての役を果たしうる数多くのタンパク質を発現する。これらの分子には、黒色腫におけるMART-1、チロシナーゼおよびGP 100、ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)および前立腺特異的抗原(PSA)などの組織特異的抗原が非限定的に含まれる。他の標的分子には、腫瘍遺伝子HER-2/Neu/ErbB-2などの形質転換関連分子の群に属するものがある。標的抗原のさらにもう1つの群には、腫瘍胎児性抗原などの癌胎児性抗原(CEA)がある。B細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個々の腫瘍に固有である、真に腫瘍特異的である免疫グロブリン抗原で構成される。CD19、CD20およびCD37などのB細胞分化抗原は、B細胞リンパ腫における標的抗原の別の候補である。これらの抗原のいくつか(CEA、HER-2、CD19、CD20、イディオタイプ)は、モノクローナル抗体を用いる受動免疫療法の標的として用いられ、ある程度の成果を上げている。
本発明において言及される腫瘍抗原の種類は、腫瘍特異的抗原(TSA)または腫瘍関連抗原(TAA)であってもよい。TSAは腫瘍細胞に固有であり、体内の他の細胞上には存在しない。TAA関連抗原は腫瘍細胞に固有ではなく、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導することができない条件下で、正常細胞上でも発現する。腫瘍上での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で起こりうる。TAAは、免疫系が未熟であって応答することができない胎児発生中に正常細胞上で発現する抗原であってよく、またはそれらは、正常細胞上に極めて低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上でははるかに高いレベルで発現する抗原であってもよい。
TSA抗原またはTAA抗原の非限定的な例には、以下のものが含まれる:MART-1/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel 17)、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2などの分化抗原、およびMAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15などの腫瘍特異的多系列抗原;過剰発現する胎児抗原、例えばCEAなど;過剰発現する腫瘍遺伝子および突然変異した腫瘍抑制遺伝子、例えばp53、Ras、HER-2/neuなど;染色体転座に起因する固有の腫瘍抗原;BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RARなど;ならびに、ウイルス抗原、例えばエプスタイン・バーウイルス抗原EBVAならびにヒトパピローマウイルス(HPV)抗原E6およびE7など。その他の大型のタンパク質ベースの抗原には、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-カテニン、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-フェトプロテイン、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合タンパク質\シクロフィリンC関連タンパク質、TAAL6、TAG72、TLP、およびTPSが含まれる。
1つの好ましい態様において、CARの抗原結合ドメイン部分は、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂質F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCRなどを非限定的に含む抗原を標的とする。
標的にすることが望まれる抗原に応じて、本発明のCARを、所望の抗原標的に対して特異的な適切な抗原結合モイエティーを含むように操作することができる。
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびそれらのフラグメントを非限定的に含む、抗原と結合する任意のドメインでありうる。場合によっては、抗原結合ドメインは、CARが最終的に用いられることになるものと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトで用いる目的には、CARの抗原結合ドメインがヒト抗体またはそのフラグメントを含むことが有益であると考えられる。したがって、1つの態様において、抗原結合(biding)ドメイン部分はヒト抗体またはそのフラグメントを含む。または、いくつかの態様において、非ヒト抗体はヒト化されており、ここで、抗体の特定の配列または領域は、ヒトにおいて自然下で産生される抗体に対する類似性が高くなるように改変されている。
本発明の1つの態様においては、複数の種類のCARが、1つのT細胞の表面で発現する。複数の異なる種類のCARは、それらの抗原結合ドメインに違いがあってもよい。すなわち、1つの態様において、複数の異なる種類のCARはそれぞれ、異なる抗原と結合する。1つの態様において、これらの異なる抗原は、特定の腫瘍に関するマーカーである。例えば、1つの態様において、複数の異なる種類のCARはそれぞれ、異なる抗原と結合し、ここで、各抗原は特定の種類の腫瘍上で発現する。そのような抗原の例については、本明細書中の他所で考察している。
膜貫通ドメインに関して、CARは、CARの細胞外ドメインと融合した膜貫通ドメインを含むように設計することができる。1つの態様においては、CARの中のドメインの1つに天然に結合する膜貫通ドメインを用いる。場合によっては、膜貫通ドメインを、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を避けるように選択すること、またはそのためのアミノ酸置換によって選択もしくは改変することもできる。
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれに由来してもよい。供給源が天然である場合には、ドメインは任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。本発明において特に有用性のある膜貫通領域は、T細胞受容体のα、βまたはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOSに由来しうる(すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域を含む)。または、膜貫通ドメインが合成性であってもよく、この場合には、それは主として、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むと考えられる。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に認められるであろう。任意で、好ましくは長さが2〜10アミノ酸である短いオリゴペプチドまたはポリペプチドのリンカーが、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連鎖を形成してもよい。グリシン-セリンのダブレットは特に適したリンカーとなる。
本発明のCARの細胞質ドメイン、または別の言い方では細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが入れられた免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも1つの活性化の原因となる。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特化した機能のことを指す。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であろう。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達して、細胞が特化した機能を遂行するように導く、タンパク質の部分を指す。通常は細胞内シグナル伝達ドメインの全体を使用しうるが、多くの場合には、その鎖全体を用いることは必要でない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分(truncated portion)が用いられる範囲内において、そのような短縮部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに用いることができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、それ故に、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むものとする。
本発明の1つの態様において、細胞のエフェクター機能は、その標的抗原に対する複数種類のCARの結合に依存する。例えば1つの態様において、その標的に対する1種類のCARの結合は、細胞のエフェクター機能を誘導するためには不十分である。
本発明のCARに用いるための細胞内シグナル伝達ドメインの例には、抗原と受容体との係合後にシグナル伝達を惹起するように協調的に作用するT細胞受容体(TCR)および共受容体の細胞質配列、ならびに、同じ機能的能力を有する、これらの配列の任意の誘導体または変異体および任意の合成配列が含まれる。
TCRのみを通じて生成されるシグナルは、T細胞の完全な活性化のためには不十分であること、および二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要とされることが公知である。このため、T細胞活性化は、2つの別個のクラスの細胞質シグナル伝達配列によって媒介されると言うことができる:TCRを通じての抗原依存的な一次活性化を惹起するもの(一次細胞質シグナル伝達配列)、および、抗原非依存的な様式で作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすもの(二次細胞質シグナル伝達配列)。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的な方式または阻害的な方式で、TCR複合体の一次活性化を調節する。刺激的な様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)すなわちITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含有しうる。
本発明において特に有用性のある、ITAMを含有する一次細胞質シグナル伝達配列の例には、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれる。本発明のCARにおける細胞質シグナル伝達分子は、CD3ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。
1つの態様において、CARの細胞質ドメインは、CD3-ζシグナル伝達ドメインを、それ自体で、または本発明のCARの文脈において有用な他の任意の所望の細胞質ドメインと組み合わせて含むように、設計することができる。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、CARの一部分のことを指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な反応のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子のことである。そのような分子の例には、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドなどが含まれる。
本発明のCARの細胞質シグナル伝達部分の内部の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序または指定された順序で互いに連結させることができる。任意で、好ましくは長さが2〜10アミノ酸である短いオリゴペプチドまたはポリペプチドのリンカーが連鎖を形成してもよい。グリシン-セリンのダブレットは特に適したリンカーとなる。
1つの態様において、細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。もう1つの態様において、細胞質ドメインは、CD3-ζのシグナル伝達ドメインおよび4-1BBのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。本発明の1つの態様においては、複数の種類のCARが1つの細胞上で発現し、ここで、複数の異なる種類のCARは、それらの細胞質ドメインが異なってもよい。1つの態様において、少なくとも1つの種類のCARはCD3ζドメインを含み、一方、少なくとも1つの種類のCARは補助刺激ドメイン、例えば4-1BBドメインを含む。しかし、複数の異なる種類のCARは、いかなる特定の細胞質ドメインにも限定されない。例えば、それぞれの種類のCARが任意のITAM含有配列、補助刺激ドメイン、またはそれらの組み合わせを含み、その結果、それぞれの個々の種類のCARの結合ではエフェクター機能を誘導するには不十分であるが、複数の種類のCARが結合するとエフェクター機能を誘導しうるようにしてもよい。すなわち、それぞれの種類のCARのドメインが相伴って働いて、エフェクター機能を誘導する。
2.阻害性CARによる戦略
本発明は、阻害性CARを発現するようにT細胞を遺伝的に改変することによって、正常な健常組織の枯渇を制限するための組成物および方法を提供する。1つの態様において、本発明の阻害性CARは、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、抗原結合ドメインと称される標的特異的結合エレメントを含む。1つの態様において、阻害性CARは、正常な健常組織に付随する抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。例えば、1つの態様において、阻害性CARの抗原結合ドメインは、非癌性細胞において特異的に認められる抗原と結合する。本明細書中の他所に記載したように、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびそれらのフラグメントを非限定的に含む、抗原と特異的に結合する任意のドメインでありうる。
本発明は、阻害性CARを発現するようにT細胞を遺伝的に改変することによって、正常な健常組織の枯渇を制限するための組成物および方法を提供する。1つの態様において、本発明の阻害性CARは、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、抗原結合ドメインと称される標的特異的結合エレメントを含む。1つの態様において、阻害性CARは、正常な健常組織に付随する抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。例えば、1つの態様において、阻害性CARの抗原結合ドメインは、非癌性細胞において特異的に認められる抗原と結合する。本明細書中の他所に記載したように、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびそれらのフラグメントを非限定的に含む、抗原と特異的に結合する任意のドメインでありうる。
本発明の阻害性CARは、膜貫通ドメインを含んでもよい。本明細書中の他所に記載したように、膜貫通ドメインは任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来してよい。または、膜貫通ドメインが合成性であってもよい。
本発明の阻害性CARは、CAR T細胞の阻害活性を担う細胞質ドメインを含む。本発明の1つの態様において、阻害性CARは、本明細書中の他所に記載した1つまたは複数の治療用抗腫瘍CARと同じT細胞において発現する。1つの態様において、阻害性CARの細胞質ドメインは、T細胞の活性化を妨げるか、T細胞の細胞溶解活性を阻害するか、またはT細胞のヘルパー活性を阻害する。
本発明の阻害性CARは、CAR T細胞活性を阻害する機能に関して、いかなる特定のものにも限定されない。例えば、阻害性CARは、標的抗原と結合した後に治療用CARの内部移行を誘導するか、CAR T細胞の活性化を阻害するか、またはCAR T細胞の死滅を誘導する、細胞質ドメインを含みうる。
1つの態様において、阻害性CARの細胞質ドメインは、阻害性ITAM含有配列を含む。
1つの態様において、阻害性CARの細胞質ドメインは、デスドメイン(DD)を含む。本明細書で用いる場合、DDとは、TNFR1、Fas、DR3、DR4/TrailR1、DR5/TrailR2、DR6、FADD、MyD88、Raidd、IRAK、IRAK-2、IRAK-M、p75NTR、Tradd、DAPキナーゼ、RIP、NMP84、およびアンキリン類といったDDタンパク質のDDドメインとの配列相同性を有し、かつ、他の公知のDDタンパク質のものに類似した結合特性を有することが本明細書において見いだされている領域のことを指す。
腫瘍壊死因子(TNF)受容体ファミリーのアポトーシス誘導性メンバーは、その細胞内デスドメイン(DD)とアダプタータンパク質との相互作用を通じて、前駆型カスパーゼファミリー細胞死プロテアーゼをリガンド結合型受容体複合体へと動員する(Ashkenazi and Dixit, Science 281: 1305-1308 (1998);Wallach et al., Annu. Rev. Immunol. 17:331-367 (1999))。カスパーゼファミリーのメンバーはいくつか知られており、それには例えば、カスパーゼ-1、カスパーゼ-2、カスパーゼ-3、カスパーゼ-4、カスパーゼ-5、カスパーゼ-6、カスパーゼ-7、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、カスパーゼ-10、カスパーゼ-11、カスパーゼ-12、カスパーゼ-13、およびカスパーゼ-14がある(Grutter, Curr. Opin. Struct. Biol. 10:649-655 (2000))。
TNF-R1およびFasなどの細胞死受容体はオリゴマーを形成し、それらの細胞内DDを介してシグナルを伝達する。シグナルは、サイトゾル中のアダプターによってカスパーゼへと運ばれる。Fasに関する細胞死誘導シグナル伝達複合体(DISC)は、最小限、Fas三量体、Faddおよびカスパーゼ-8を含む。DR4およびDR5についても、類似のDISC複合体が見いだされている。TRAIL受容体の場合には、混在性複合体、例えば、2つのDR4に1つのDR5が加わって三量体となったものが機能しているように思われる。デスドメインを有しないか不完全にしか有しないデコイ受容体、例えば、DcR1、DcR2およびDcR3は、おそらくはDISC形成に干渉することによって、アポトーシスを阻害することができる。
TNFRファミリーのいくつかのメンバー(TNFR1;ニュートロフィン受容体p75NTR、これは神経成長因子受容体p75NGFRとも呼ばれる;Fas;DR3;DR4/TrailR1;DR5/TrailR2;DR6)の細胞内領域は、「デスドメイン」(DD)として知られる構造を含有しており、リガンドが結合するとアポトーシスを誘導する(Ashkenazi and Dixit, Science 281: 1305-1308 (1998), Wallach et al., Annu. Rev. Immunol. 17:331-367 (1999))。そのような「細胞死受容体」によるアポトーシス誘導の機序は、ある種のカスパーゼファミリー細胞死プロテアーゼプロドメインと結合するアダプタータンパク質への受容体複合体の動員を伴う。カスパーゼは生細胞内にチモーゲンとして存在し、その活性化には、典型的にはタンパク質分解によるプロセシングが必要である。しかし、前駆型カスパーゼは弱いプロテアーゼ活性を有するため、受容体により媒介されるそれらのクラスター化は、「誘導接近(induced proximity)」機序を通じて、トランス性タンパク質分解(trans-proteolysis)をもたらす(Salvesen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 10964-10967 (1999))。
1つの態様において、阻害性CARは、正常な非癌性細胞およびデスドメインまたはその一部分を含む細胞質ドメインに付随する抗原と結合する細胞外抗原結合ドメインを含む。1つの態様において、阻害性CARとその標的抗原との結合は、CAR T細胞のアポトーシス性死滅をもたらし、それにより、CAR T細胞の活性化を妨げ、正常な健常組織の枯渇を軽減する。1つの態様において、T細胞は、本明細書中の他所に記載したように、阻害性CARと1つまたは複数の治療用腫瘍標的指向性CARとを発現するように遺伝的に改変される。CAR T細胞と腫瘍抗原との結合は、CAR T細胞の活性化および腫瘍の消失をもたらし、一方、CAR T細胞と、非癌性組織に付随する抗原との結合は、CAR T細胞活性の阻害(例えば、活性化の阻害、アポトーシス性細胞死など)をもたらす。本明細書中の他所に記載したように、阻害性CARと少なくとも1つの腫瘍指向性CARを発現するように操作されたT細胞は、レンチウイルスベクター、インビトロ転写RNA、またはそれらの組み合わせを細胞に投与することによって作製することができる。
3.薬物-分子結合体
本発明は、CAR T細胞療法を受けている対象に薬物-分子結合体を投与することによって、正常な健常組織の枯渇を制限するようにCAR T細胞療法をモジュレートするための組成物および方法を提供する。1つの態様において、薬物-分子結合体はCARと結合し、その結果、CARおよび薬物-分子結合体の内部移行をもたらす。本発明は、標的認識後にCARが一過性に内部移行されるという観察所見に基づく。このため、この挙動は、CAR T細胞活性を能動的かつ制御可能なように調節するための方法に利用することができる。さらに、本明細書に記載したような薬物-分子結合体の投与を介したCAR T細胞活性の調節は、CAR T細胞のさらなる遺伝的改変を必要を必要とせず、その結果、過度の技術的複雑さも、細胞の遺伝的操作をさらに行うために必要なコスト増加も必要としなくなる。
本発明は、CAR T細胞療法を受けている対象に薬物-分子結合体を投与することによって、正常な健常組織の枯渇を制限するようにCAR T細胞療法をモジュレートするための組成物および方法を提供する。1つの態様において、薬物-分子結合体はCARと結合し、その結果、CARおよび薬物-分子結合体の内部移行をもたらす。本発明は、標的認識後にCARが一過性に内部移行されるという観察所見に基づく。このため、この挙動は、CAR T細胞活性を能動的かつ制御可能なように調節するための方法に利用することができる。さらに、本明細書に記載したような薬物-分子結合体の投与を介したCAR T細胞活性の調節は、CAR T細胞のさらなる遺伝的改変を必要を必要とせず、その結果、過度の技術的複雑さも、細胞の遺伝的操作をさらに行うために必要なコスト増加も必要としなくなる。
分子
1つの態様において、薬物-分子結合体の分子は、遺伝的に改変された細胞上で発現したCARと結合する分子を含む。分子は、CARの任意の部分と結合してよい。例えば、分子は、CARの抗原結合領域またはリンカー領域と結合することができる。分子は、CARのある領域と結合しうる任意の種類のものであってよい。例えば、分子は、ペプチド、ヌクレオチド、抗体、小分子などであってよい。
1つの態様において、薬物-分子結合体の分子は、遺伝的に改変された細胞上で発現したCARと結合する分子を含む。分子は、CARの任意の部分と結合してよい。例えば、分子は、CARの抗原結合領域またはリンカー領域と結合することができる。分子は、CARのある領域と結合しうる任意の種類のものであってよい。例えば、分子は、ペプチド、ヌクレオチド、抗体、小分子などであってよい。
1つの態様において、分子は、CARの細胞外ドメインと結合するように標的化された抗体またはそのフラグメントを含む。1つの態様において、抗体は抗原と結合し、ここで抗原はCARまたはCARの1つの領域である。抗体の作製および使用の方法は、当技術分野において周知である。例えば、本発明において有用なポリクローナル抗体は、当技術分野において周知の標準的な免疫学的手法に従って、ウサギに免疫処置を行うことによって作製することができる(例えば、Harlow et al., 1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.)を参照。
しかし、本発明は、これらの抗体を含む方法および組成物のみに、または抗原のこれらの部分のみに限定されるとはみなされるべきでない。そうではなくて、本発明は、本明細書中の他所で定義されているような他の抗体、抗原、またはそれらの部分も含むとみなされるべきである。当業者は、本明細書に提供された開示内容に基づいて、抗体がCARの任意の部分と特異的に結合しうること、および完全長CARまたはCARの任意の部分を用いて、それに対して特異的な抗体を作製しうることを理解するであろう。しかし、本発明は、完全長タンパク質を免疫原として用いることには限定されない。そうではなくて、本発明は、タンパク質の免疫原性部分を用いて、特定の抗原と特異的に結合する抗体を作製することを含む。すなわち、本発明は、抗原の免疫原性部分または抗原決定基を用いて、動物に免疫処置を行うことを含む。
さらに、当業者は、本明細書に提供された開示内容に基づき、非保存的な免疫原性部分を用いて、その非保存的な領域に対して特異的な抗体を作製し、それにより、1つまたは複数の保存的部分を共通に有する可能性のある他のタンパク質とは交差反応しない抗体を作製しうることを理解するであろう。このため、当業者は、本明細書に提示された開示内容に基づき、関心対象の抗原の非保存的領域を用いて、その抗原のみに対して特異的であり、他の種類のCARを含む他のタンパク質と非特異的に交差反応することはない抗体を作製しうることを理解するであろう。
当業者は、本明細書に提示された開示内容に基づき、本発明は単一の抗原エピトープを認識する単一の抗体の使用を含むが、本発明が単一の抗体の使用に限定されるわけではないことを理解するであろう。実際には、本発明は、抗体が同一または異なる抗原性タンパク質エピトープを対象としうる、少なくとも1つの抗体の使用を包含する。
ポリクローナル抗体の作製は、例えば、Harlow et al.(1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.)に記載されたもののような標準的な抗体産生方法を用いて、所望の動物に抗原を接種し、抗原と特異的に結合する抗体をそれから単離することによって実現される。
完全長のタンパク質もしくはペプチドまたはそれらのペプチド断片を対象とするモノクローナル抗体は、例えば、Harlow et al.(1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.)およびTuszynski et al. (1988, Blood, 72: 109-115)に記載されたもののような、あらゆる周知のモノクローナル抗体調製手法を用いて調製しうる。また、ある数量の所望のペプチドを、化学合成技術を用いて合成することもできる。または、所望のペプチドをコードするDNAをクローニングして、大量のペプチドの作製のために適した細胞において、適切なプロモーター配列から発現させることもできる。ペプチドを対象とするモノクローナル抗体は、本明細書で言及したような標準的な手法を用いて、ペプチドによる免疫処置を行ったマウスから作製することができる。
本明細書に記載の手法を用いて得られたモノクローナル抗体をコードする核酸のクローニングおよびシークエンシングを、当技術分野において利用可能な技術を用いて行うこともでき、それらは例えば、Wright et al.(1992, Critical Rev. Immunol. 12: 125-168)、および本明細書で引用した参考文献に記載されている。さらに、本発明の抗体を、Wright et al.,およびその中に引用された参考文献、ならびにGu et al.(1997, Thrombosis and Hematocyst 77:755-759)に記載された技術、ならびに当技術分野において周知であるかまたは今後開発されるであろう、抗体のその他のヒト化方法を用いて、「ヒト化」することもできる。
本発明はまた、関心対象の抗原のエピトープと特異的に反応するヒト化抗体の使用も含む。本発明のヒト化抗体は、ヒトフレームワークを有し、かつ、関心対象の抗原と特異的に反応する抗体、典型的にはマウス抗体由来の1つまたは複数の相補性決定領域(CDR)を有する。本発明に用いる抗体がヒト化される場合には、Queen, et al.(米国特許第6,180,370号)、Wright et al.,(前記)およびその中に引用された参考文献、またはGu et al.(1997, Thrombosis and Hematocyst 77(4):755-759)に記載されたようにして、抗体を作製することができる。Queen et al.に開示された方法は、一部には、所望の抗原、例えば関心対象の抗原上のエピトープと結合しうるドナー免疫グロブリン由来の重鎖および軽鎖相補性決定領域(CDR)をコードする組換えDNAセグメントに、アクセプターヒトフレームワーク領域をコードするDNAセグメントが結びついたものを発現させることによって産生されるヒト化免疫グロブリンを設計することに向けられている。一般的に言えば、Queenの特許における発明は、実質的にあらゆるヒト化免疫グロブリンの設計への適用可能性を有する。Queenは、DNAセグメントは典型的には、天然に付随するかまたは異種性のプロモーター領域を含む、発現制御DNA配列が、ヒト化免疫グロブリンをコードする配列と機能的に連結されたものを含むと説明している。発現制御配列は、真核生物宿主細胞の形質転換もしくはトランフェクションを行えるベクター中にある真核生物プロモーター系であってもよく、または発現制御配列が、原核生物宿主細胞の形質転換もしくはトランフェクションを行えるベクター中にある原核生物プロモーター系であってもよい。ひとたびベクターを適切な宿主内に組み入れた上で、導入したヌクレオチド配列の高レベル発現のために適した条件下で宿主を維持し、必要に応じて、ヒト化軽鎖、重鎖、軽鎖/重鎖二量体、またはインタクト抗体、結合性断片もしくは他の免疫グロブリン形態の収集および精製を続いて行うことができる(Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, New York, (1979)、これは参照により本明細書に組み入れられる)。
本発明の1つの態様において、本明細書中の他所に詳述したようにして、ファージ抗体ライブラリーを作製することもできる。ファージ抗体ライブラリーを作製するためには、ファージ表面で発現させようとする所望のタンパク質、例えば所望の抗体を発現する細胞、例えば末梢血リンパ球から単離したmRNAから、まずcDNAライブラリーを入手する。mRNAのcDNAコピーは、逆転写酵素を用いて生成させる。免疫グロブリン断片と特定されるcDNAをPCRによって入手し、その結果得られたDNAを、適したバクテリオファージベクター中にクローニングして、免疫グロブリン遺伝子と特定されるDNAを含むバクテリオファージDNAライブラリーを作製する。異種DNAを含むバクテリオファージライブラリーを作るための手法は当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., 前記に記載されている。
所望の抗体をコードするバクテリオファージを、その表面にそのタンパク質が、その対応する結合タンパク質、例えば抗体が対象とする抗原、例えば関心対象の抗原などとの結合を行えるような様式で提示されるように操作することもできる。このため、特異的抗体を発現するバクテリオファージを、対応する抗原の存在下でインキュベートすると、バクテリオファージは抗原と結合すると考えられる。抗体を発現しないバクテリオファージは、抗原とは結合しないと考えられる。そのようなパニング手法は当技術分野において周知であり、例えば、Wright et al.(前記)に記載されている。
上記のもののようなプロセスが、M13バクテリオファージディスプレイを用いるヒト抗体の作製のために開発されている(Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57: 191-280)。本質的には、抗体産生細胞の集団から得られたmRNAから、cDNAライブラリーを作製する。mRNAは再編成された免疫グロブリン遺伝子をコードし、それ故に、cDNAも同じものをコードする。増幅されたcDNAをM13発現ベクター中にクローニングして、ヒトFabフラグメントを表面に発現するファージのライブラリーを作り出す。関心対象の抗体を提示するファージを抗原結合によって選択し、細菌の中で増殖させて可溶性ヒトFab免疫グロブリンを産生させる。したがって、従来のモノクローナル抗体合成とは対照的に、この手法では、ヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなくて、ヒト免疫グロブリンをコードするDNAを不死化する。
直前に提示した手法は、抗体分子のFab部分をコードするファージの作製について述べている。しかし、本発明は、Fab抗体をコードするファージの作製のみに限定されるとみなされるべきではない。そうではなくて、単鎖抗体(scFv/ファージ抗体ライブラリー)をコードするファージも、同じく本発明に含まれる。Fab分子はIg軽鎖全体を含み、すなわち、それは軽鎖の可変領域および定常領域の両方を含むが、重鎖については可変領域および第1の定常領域ドメイン(CH1)しか含まない。単鎖抗体分子は、Ig Fvフラグメントを含む単鎖タンパク質を含む。Ig Fvフラグメントは、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のみを含み、その中に含まれる定常領域は全く有しない。scFv DNAを含むファージライブラリーを、Marks et al.(1991, J. Mol. Biol. 222:581-597)に記載された手法に従って作製することもできる。所望の抗体の単離のための、そのようにして作製されたファージのパニングは、Fab DNAを含むファージライブラリーに関して述べたものと同様の様式で実施される。
また、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、考えられる特異性のほとんどすべてを含むように合成されている合成ファージディスプレイライブラリーも含むとみなされるべきである(Barbas, 1995, Nature Medicine 1:837-839;de Kruif et al. 1995, J. Mol. Biol. 248:97-105)。
本発明のもう1つの態様において、免疫処置を受けた動物に由来する、ファージによりクローニングされた抗体を、公知の手法によってヒト化することもできる。
1つの態様において、本発明の薬物-分子結合体の分子は、CARによって標的化される抗原エピトープに由来するペプチドを含む。例えば、CARをCD19に向かわせる場合、本発明の分子は、CARと結合するCD19のエピトープに由来するペプチドを含みうる。そのため、ペプチドは完全長タンパク質またはそれらの部分を含むことができる。ペプチドはそれ故に、CARの抗原結合領域によって標的化される抗原を模倣することになる。
本発明のペプチドを、化学的方法を用いて作ることもできる。例えば、ペプチドを、固相手法(Roberge J Y et al (1995) Science 269: 202-204)によって合成し、樹脂から切り離した上で、調製用高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。自動合成は、例えば、ABI 431 A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)を、製造元によって提供される説明書に従って用いて達成することができる。
薬物
本発明の薬物-分子結合体は薬物を含み、1つの態様において、その薬物はCAR T細胞内へ内部移行される。本明細書中の他所に記載したように、結合体とCARとの結合が起こると、CARは結合体とともに内部移行される。1つの態様において、薬物はCAR T細胞の活性を調節する。本発明に用いられる薬物の種類は、いかなる特定の種類にも限定されない。そうではなくて、CAR T細胞の活性を調節するあらゆる薬物を用いることができる。例えば、1つの態様において、薬物はCAR T細胞の死滅を引き起こす。
本発明の薬物-分子結合体は薬物を含み、1つの態様において、その薬物はCAR T細胞内へ内部移行される。本明細書中の他所に記載したように、結合体とCARとの結合が起こると、CARは結合体とともに内部移行される。1つの態様において、薬物はCAR T細胞の活性を調節する。本発明に用いられる薬物の種類は、いかなる特定の種類にも限定されない。そうではなくて、CAR T細胞の活性を調節するあらゆる薬物を用いることができる。例えば、1つの態様において、薬物はCAR T細胞の死滅を引き起こす。
結合体の作製
本発明の薬物-分子結合体は、当技術分野において利用しうる任意の適した様式で作製することができるが、特定の態様において、結合体は融合ポリペプチドとして作製されるか、または、リンカーの使用などによって化学的に結合される。
本発明の薬物-分子結合体は、当技術分野において利用しうる任意の適した様式で作製することができるが、特定の態様において、結合体は融合ポリペプチドとして作製されるか、または、リンカーの使用などによって化学的に結合される。
薬物-分子結合体が、化学結合などの結合、またはリンカーの使用によって作製される態様においては、個々の構成要素を用意するかまたは入手した上で、続いて化学的結合または連結法によって結びつける。
例えば、結合体の構成要素を、生物学的に解放可能な結合、例えば、選択的に切断可能なリンカーまたはアミノ酸配列を介して接続してもよい。例えば、腫瘍環境内に選好的に位置するかまたはその中で活性を有する酵素による切断部位を含むペプチドリンカーを想定している。そのようなペプチドリンカーの例示的な形態には、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、第IXa因子、第Xa因子またはメタロプロテイナーゼ、例えばコラゲナーゼ、ゼラチナーゼもしくはストロメライシンなどによって切断されるものがある。または、ペプチドまたはポリペプチドを補助剤によって接続することもできる。
さらに、当業者に公知である任意の他の連結剤/カップリング剤および/または機序、例えば、抗体-抗原相互作用、アビジン-ビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホエステル結合、ホスホルアミド結合、アンヒドリド結合、ジスルフィド結合、イオン性および疎水性相互作用、二重特異性抗体および抗体フラグメント、またはそれらの組み合わせなどを用いて、本発明の構成要素を組み合わせることもできる。
血液中で適度な安定性を有する架橋剤を用いることも想定している。結合体および治療薬/予防薬の標的化のために首尾よく使用しうる、多くの種類のジスルフィド結合含有リンカーが公知である。立体障害を受けるジスルフィド結合を含むリンカーは、そのためにインビボでの安定性がより高く、標的化ペプチドが作用部位に到達する前に放出されるのを防げることが明らかになっている。このため、これらのリンカーは連結剤の1つのグループとなる。
もう1つの架橋試薬は、4-スクシンイミジルオキシカルボニル-メチル-x-[2-ピリジルジチオ]-トルエン(SMPT)であり、これは隣接するベンゼン環およびメチル基による「立体障害」を受けるジスルフィド結合を含む二官能性架橋剤である。ジスルフィド結合の立体障害は、組織中および血液中に存在しうるグルタチオンなどのチオレート陰イオンによる攻撃から結合を保護する機能を果たし、それにより、結びつけられた作用物質が標的部位に送達される前に結合体が分離するのを防ぐのに役立つと考えられている。
SMPT架橋試薬は、他の多くの公知の架橋試薬と同様に、システインのSHまたは一級アミン(例えば、リジンのεアミノ基)などの官能基の架橋を容易にする。別の種類の架橋剤には、スルホスクシンイミジル-2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネートのような切断可能なジスルフィド結合を含むヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドが含まれる。N-ヒドロキシ-スクシンイミジル基は一級アミノ基と反応し、フェニルアジドは(光分解を受けると)あらゆるアミノ酸残基と非選択的に反応する。
障害性架橋剤のほかに、非障害性リンカーも本明細書に従って使用することができる。保護されたジスルフィドを含まないか生成しないと考えられる他の有用な架橋剤には、スクシンイミジルアセチルチオアセテート(SATA)、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネートSPDPおよび2-イミノチオラン(Wawrzynczak & Thorpe, 1987)が含まれる。そのような架橋剤の使用は、当技術分野において十分に理解されている。
米国特許第4,680,338号は、リガンドとアミン含有ポリマーおよび/またはタンパク質との結合体を作製するため、特にキレート剤、薬物、酵素、検出用標識などとの抗体結合体を形成させるために有用な二官能性リンカーを記載している。米国特許第5,141,648号および第5,563,250号は、種々の穏和条件下で切断可能な不安定結合を含む切断可能な結合体を開示している。このリンカーは、関心対象の作用物質がリンカーと直接的に結合し、切断によって活性作用物質の放出がもたらされる点で特に有用である。好ましい用途には、抗体などのタンパク質、または薬物に、遊離アミノ基または遊離スルフヒドリル基を付加することが含まれる。
米国特許第5,856,456号は、融合タンパク質、例えば単鎖抗体を作製する目的で、ポリペプチド成分を連結させるために用いられるペプチドリンカーを提供している。リンカーは最長で約50アミノ酸の長さであり、少なくとも1つの荷電アミノ酸(好ましくはアルギニンまたはリジン)およびそれに続くプロリンを含み、かつ、安定性の高さおよび凝集性の低さを特徴とする。米国特許第5,880,270号は、種々の免疫診断手法および分離手法において有用なアミノオキシ含有リンカーを開示している。
もう1つの態様は、柔軟なリンカーの使用を伴う。
キメラ分子の投与
1つの態様において、本発明は、CAR T細胞療法中の正常な非癌性細胞の枯渇を制限する方法を含む。本明細書中の他所に記載したように、CAR T細胞療法は腫瘍細胞を効果的に消失させることができるが、時には、腫瘍細胞は標的化されるが正常細胞はそれを逃れるように、CAR T細胞活性を制限することが必要である。1つの態様において、本方法は、CAR T細胞が正常組織を過度に枯渇させていると判定された場合に、CAR T細胞療法を受けている対象に薬物-分子結合体を投与する段階を含む。例えば、抗CD19 CAR T細胞が、安全ではない量の正常B細胞を枯渇させていると判定することができる。そのような判定は、熟練したあらゆる医師または医療提供者によって下されうる。
1つの態様において、本発明は、CAR T細胞療法中の正常な非癌性細胞の枯渇を制限する方法を含む。本明細書中の他所に記載したように、CAR T細胞療法は腫瘍細胞を効果的に消失させることができるが、時には、腫瘍細胞は標的化されるが正常細胞はそれを逃れるように、CAR T細胞活性を制限することが必要である。1つの態様において、本方法は、CAR T細胞が正常組織を過度に枯渇させていると判定された場合に、CAR T細胞療法を受けている対象に薬物-分子結合体を投与する段階を含む。例えば、抗CD19 CAR T細胞が、安全ではない量の正常B細胞を枯渇させていると判定することができる。そのような判定は、熟練したあらゆる医師または医療提供者によって下されうる。
いくつかの態様においては、本発明の結合体の有効量が細胞に投与される。他の態様においては、本発明の結合体の治療的有効量が、疾患または病状の治療のために個体に投与される。
「有効量」という用語は、本明細書で用いる場合、投与された細胞もしくは組織において生理的変化を生じさせるために必要な、本発明の結合体の量と定義される。
「治療的有効量」という用語は、本明細書で用いる場合、病状の有害作用(すなわち、CAR T細胞療法によって引き起こされる正常組織の過度の枯渇)を消失させる、減少させる、遅らせる、または最小限に抑える、本発明の結合体の量と定義される。当業者は、多くの事例では、結合体は治癒をもたらすのではなく、病状の少なくとも1つの症状の緩和または改善といった部分的有益性のみを与えることを容易に認識するであろう。いくつかの態様においては、何らかの有益性を有する生理的変化も、治療的に有益であると判断される。したがって、いくつかの態様において、生理的変化をもたらす結合体の量は「有効量」または「治療的有効量」であると判断される。
本発明のいくつかの態様において、かつ、当技術分野において公知である他の方法を上回る利点として、結合体は、翻訳されて所望のポリペプチドを産生する核酸分子としてではなく、タンパク質として送達される。さらなる利点として、いくつかの態様において、外来性ポリペプチドによる望ましくない免疫応答を避けるために、本発明の結合体にはヒト配列が利用される。
本発明の結合体は、対象にそれ自体で投与することもでき、または薬学的組成物の形で投与することもできる。本発明のタンパク質を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥の工程によって製造することができる。薬学的組成物は、薬学的に用いうる調製物へとタンパク質を加工処理することを容易にする、1つまたは複数の生理的に許容される担体、希釈剤、添加剤または助剤を用いて、従来の様式で製剤化することができる。適正な製剤は、選択される投与経路に応じて決まる。
局所投与のためには、本発明の結合体は、当技術分野において周知であるような、液剤、ゲル剤、軟膏、クリーム剤、懸濁剤などとして製剤化することができる。
全身用製剤には、注射、例えば皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射による投与のために設計されたもの、ならびに経皮的、経粘膜的、吸入、経口的または肺内投与のために設計されたものが含まれる。
注射のためには、本発明の結合体は、水性溶液、好ましくは生理的適合性のある緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液または生理的塩類緩衝液などの中にある状態で製剤化することができる。溶液が、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤といった製剤化用剤(formulatory agent)を含んでもよい。
または、結合体が、適した媒体、例えば、発熱性物質を含まない滅菌水などを用いて使用前に構成するための粉末形態にあってもよい。
経粘膜的投与のためには、透過させようとする障壁に適した浸透剤が製剤中に用いられる。そのような浸透剤は、当技術分野において一般に公知である。
経口投与のためには、結合体を当技術分野において周知の薬学的に許容される担体と配合することにより、結合体を容易に製剤化することができる。そのような担体は、本発明の結合体を、治療しようとする患者による経口服用のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。経口用固体製剤、例えば粉剤、カプセル剤および錠剤の場合、適した添加剤には、充填剤、例えば糖、例えばラクトース、スクロース、マンニトールおよびソルビトールなど;セルロース調製物、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど、および/またはポリビニルピロリドン(PVP);造粒剤;ならびに結合剤が含まれる。必要に応じて、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどを添加してもよい。
必要に応じて、固体剤形に、標準的な手法を用いて、糖衣または腸溶性コーティングを施してもよい。
または、他の薬学的送達システムを使用してもよい。リポソームおよびエマルションは、本発明の結合体を送達するために用いうる送達媒体の周知の例である。ある種の有機溶媒、例えばジメチルスルホキシドも使用しうるが、通常は、毒性が高まるという弊害がある。さらに、結合体を、結合体を含有する固体ポリマーの半透性マトリックスのような持続放出システムを用いて送達することもできる。さまざまな形態の持続放出性材料が確立されており、当業者に周知である。持続放出性カプセルは、その化学的性質に応じて、分子を数週間から最大100日間までにわたって放出することができる。結合体の化学性質および生物学的安定性によっては、分子安定化のためのさらなる戦略を使用することもできる。
本発明の結合体のタンパク質態様は、荷電した側鎖または末端を含みうる。すなわち、それらを遊離酸もしくは遊離塩基として、または薬学的に許容される塩として、上記の製剤の任意のものの中に含めることができる。薬学的に許容される塩とは、遊離塩基の生物活性を実質的に保ち、かつ無機酸との反応によって調製される塩のことである。薬学的塩は、水性溶媒および他のプロトン性溶媒への溶解性が、対応する遊離塩基形態よりも高い傾向がある。
本発明の結合体は一般に、意図する目的を達成するために有効な量で用いられることになる。病状を治療または予防するために用いる場合、本発明の結合体、またはその薬学的組成物は、治療的有効量で投与されるかまたは適用される。
全身投与の場合、治療的有効用量は、インビトロアッセイでまず推定することができる。例えば、ある用量を製剤化して動物モデルに用いて、細胞培養で判定されたIC50を含む流血中濃度範囲を達成することができる。そのような情報を用いることにより、ヒトにおける有用な用量を、より正確に判定することができる。
また、初期投与量を、インビボデータ、例えば動物モデルから、当技術分野において周知の手法を用いて推定することもできる。当業者は、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化しうるであろう。
投与量および投薬間隔は、治療効果を維持するために十分な血漿レベルの分子が得られるように、個別に調整することができる。注射による投与のための通常の患者投与量は、約0.001〜100mg/kg/日、好ましくは約0.5〜1mg/kg/日、およびそれらの間のいずれかおよびすべての全整数または一部の整数の範囲である。治療的に有効な血清レベルは、多回投与を毎日行うことによって達成することができる。
局所投与または選択的取り込みの場合には、タンパク質の有効局所濃度が血漿中濃度とは関係しないことがある。当業者は、治療的に有効な局所投与量を、必要以上の実験を行うことなく最適化しうるであろう。
投与される結合体の量は、当然ながら、治療される対象、対象の体重、病気の重症度、投与様式、および処方を行う医師の判断に依存すると考えられる。
治療法は、症状が検出可能な間は、または症状が検出可能でない場合であっても、間欠的に繰り返すことができる。治療法は単独で与えてもよく、または他の薬物と組み合わせて与えてもよい。
RNAトランスフェクション
1つの態様において、本発明の遺伝的に改変されたT細胞は、RNAの導入によって改変される。1つの態様においては、インビトロ転写RNA CARを一過性トランスフェクションの形式で細胞に導入することができる。もう1つの態様においては、RNA CARを、二重特異性抗体をコードするインビトロ転写RNAとともに導入する。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成されたテンプレートを用いるインビトロ転写によって生成される。任意の供給源からの関心対象のDNAを、PCRによって、適切なプライマーおよびRNAポリメラーゼを用いるインビトロmRNA合成のためのテンプレートに直接変換させることができる。DNAの供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列、または他の任意の適切なDNA供給源であってよい。インビトロ転写のための所望のテンプレートは、本発明のCARである。1つの態様において、RNA CAR用のテンプレートは、抗腫瘍抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外ドメイン;CD8aのヒンジドメインおよび膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン;ならびにCD3-ζのシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含む。もう1つの例として、テンプレートは、正常な健常組織に付随する抗原を対象とする抗体またはその一部分を含む細胞外ドメインを有する阻害性CARを含む。もう1つの例として、テンプレートは、複数の種類のCARを含む。場合によっては、テンプレートは、阻害性CARおよび少なくとも1つの種類の腫瘍指向性CARを含む。
1つの態様において、本発明の遺伝的に改変されたT細胞は、RNAの導入によって改変される。1つの態様においては、インビトロ転写RNA CARを一過性トランスフェクションの形式で細胞に導入することができる。もう1つの態様においては、RNA CARを、二重特異性抗体をコードするインビトロ転写RNAとともに導入する。RNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成されたテンプレートを用いるインビトロ転写によって生成される。任意の供給源からの関心対象のDNAを、PCRによって、適切なプライマーおよびRNAポリメラーゼを用いるインビトロmRNA合成のためのテンプレートに直接変換させることができる。DNAの供給源は、例えば、ゲノムDNA、プラスミドDNA、ファージDNA、cDNA、合成DNA配列、または他の任意の適切なDNA供給源であってよい。インビトロ転写のための所望のテンプレートは、本発明のCARである。1つの態様において、RNA CAR用のテンプレートは、抗腫瘍抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外ドメイン;CD8aのヒンジドメインおよび膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメイン;ならびにCD3-ζのシグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインを含む。もう1つの例として、テンプレートは、正常な健常組織に付随する抗原を対象とする抗体またはその一部分を含む細胞外ドメインを有する阻害性CARを含む。もう1つの例として、テンプレートは、複数の種類のCARを含む。場合によっては、テンプレートは、阻害性CARおよび少なくとも1つの種類の腫瘍指向性CARを含む。
1つの態様において、PCRのために用いられるDNAは、オープンリーディングフレームを含む。DNAは、生物のゲノム由来の天然のDNA配列に由来しうる。1つの態様において、DNAは、遺伝子の一部分の関心対象の完全長遺伝子である。遺伝子は、5'および/または3'非翻訳領域(UTR)の一部または全体を含みうる。遺伝子は、エクソンおよびイントロンを含みうる。1つの態様において、PCRのために用いられるDNAはヒト遺伝子である。もう1つの態様において、PCRのために用いられるDNAは、5'および3' UTRを含むヒト遺伝子である。DNAがあるいは、天然の生物において通常は発現されない人工DNA配列であってもよい。例示的な人工DNA配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するために一緒に連結される、遺伝子の部分を含むものである。一緒に連結されるDNAの部分は、単一の生物に由来しても、または複数の生物に由来してもよい。
PCRのためのDNAの供給源として用いうる遺伝子には、生物に治療的もしくは予防的な効果をもたらすか、または生物における疾患もしくは障害を診断するために用いうる、ポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。好ましい遺伝子は、短期治療のために、または投与量もしくは発現される遺伝子に関して安全性の懸念がある場合に有用な遺伝子である。例えば、癌、自己免疫障害、寄生虫感染症、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症または他の感染症の治療の場合、発現させようとする導入遺伝子は、免疫系の細胞にとってリガンドもしくは受容体として機能するか、または生物の免疫系を刺激もしくは阻害するように機能しうるポリペプチドをコードしてよい。いくつかの態様において、長期間にわたる免疫系の継続的な刺激があることは望ましくなく、かつ治療成功後に持続する変化を生じさせることも必要でないが、これはこのことが続いて新たな問題を誘発する恐れがあるためである。自己免疫障害の治療の場合、再燃時には免疫系を阻害または抑制することが望ましいと考えられるが、長期的には、患者が感染に過度にかかりやすくなる恐れがあるため、そうではない。
PCRは、トランスフェクションに用いられるmRNAのインビトロ転写のためのテンプレートを作製するために用いられる。PCRを行うための方法は、当技術分野において周知である。PCRに用いるためのプライマーは、PCRのためのテンプレートとして用いようとするDNAの領域に対して実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的な」とは、本明細書で用いる場合、プライマー配列中の塩基の大半もしくはすべてが相補的であるか、または1つもしくは複数の塩基が非相補的もしくはミスマッチ性である、ヌクレオチドの配列のことを指す。実質的に相補的な配列は、PCRのために用いられるアニーリング条件下で、意図したDNA標的とアニールまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、DNAテンプレートの任意の部分に対して実質的に相補的であるように設計することができる。例えば、プライマーを、5'および3' UTRを含む、細胞において通常転写される遺伝子の部分(オープンリーディングフレーム)を増幅するように、設計することができる。また、プライマーを、関心対象の特定のドメインをコードする遺伝子の一部分を増幅するように設計することもできる。1つの態様において、プライマーは、5'および3'UTRの全体または部分を含む、ヒトcDNAのコード領域を増幅するように、設計される。PCRのために有用なプライマーは、当技術分野において周知である合成法によって作製される。「順方向プライマー」とは、増幅させようとするDNA配列の上流にある、DNAテンプレート上のヌクレオチドに対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーのことである。「上流」とは、本明細書において、コード鎖を基準として、増幅させようとするDNA配列の5'側にある場所(location 5)を指して用いられる。「逆方向プライマー」とは、増幅させようとするDNA配列の下流にある、二本鎖DNAテンプレートに対して実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーのことである。「下流」とは、本明細書において、コード鎖を基準として、増幅させようとするDNA配列の3'側にある場所のことを指す。
PCRのために有用な任意のDNAポリメラーゼを、本明細書に開示された方法に用いることができる。試薬およびポリメラーゼは、いくつかの供給元から販売されている。
安定性および/または翻訳効率を高める能力を有する化学構造を用いることもできる。RNAは5'および3' UTRを有することが好ましい。1つの態様において、5' UTRは長さが0〜3000ヌクレオチドである。コード領域に付加される5'および3' UTR配列の長さは、UTRの異なる領域とアニールするPCR用のプライマーを設計することを非限定的に含む、異なる方法によって変化させることができる。このアプローチを用いて、当業者は、転写されたRNAのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するために必要な5'および3' UTRの長さを改変することができる。
5'および3' UTRは、関心対象の遺伝子の天然の内因性5'および3' UTRであってよい。または、UTR配列を順方向および逆方向プライマーに組み入れることによって、またはテンプレートの他の任意の改変によって、関心対象の遺伝子にとって内因性でないUTR配列を付加することもできる。関心対象の遺伝子にとって内因性でないUTR配列の使用は、RNAの安定性および/または翻訳効率を改変するために有用な可能性がある。例えば、3' UTR配列中のAUリッチエレメントはmRNAの安定性を低下させうることが知られている。このため、当技術分野において周知であるUTRの特性に基づき、転写されたRNAの安定性が高まるように3' UTRを選択または設計することができる。
1つの態様において、5' UTRは内因性遺伝子のKozak配列を含みうる。または、関心対象の遺伝子にとって内因性でない5' UTRを上記のようにPCRによって付加する場合には、5' UTR配列を付加することによってコンセンサスKozak配列を設計し直すこともできる。Kozak配列はある種のRNA転写物の翻訳の効率を高めることができるが、すべてのRNAについて効率的な翻訳を可能にするために必要であるわけではないように思われる。多くのmRNAに対するKozak配列の必要性は、当技術分野において公知である。他の態様においては、5' UTRを、そのRNAゲノムが細胞内で安定であるRNAウイルスから、導き出すことができる。他の態様においては、mRNAのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、さまざまなヌクレオチド類似体を3'または5' UTRに用いることができる。
遺伝子クローニングを必要とせずにDNAテンプレートからのRNAの合成を可能にするためには、転写のプロモーターが、転写させようとする配列の上流でDNAテンプレートに付着する必要がある。RNAポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの5'末端に付加すると、RNAポリメラーゼプロモーターが、転写させようとするオープンリーディングフレームの上流でPCR産物に組み入れられるようになる。1つの好ましい態様において、本明細書の他所に記載したように、プロモーターはT7ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターには、T3およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターが非限定的に含まれる。T7、T3およびSP6プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。
1つの好ましい態様において、mRNAは5'末端のキャップおよび3'ポリ(A)尾部の両方を有し、それらがリボソーム結合、翻訳の開始および細胞におけるmRNA安定性を決定づける。環状DNAテンプレート、例えばプラスミドDNA上では、RNAポリメラーゼは真核細胞における発現には適さない長いコンカテマー産物を生成させる。3' UTRの末端で線状化されたプラスミドDNAの転写では、転写後にポリアデニル化されたとしても真核生物トランスフェクションには有効でない、正常サイズのmRNAがもたらされる。
線状DNAテンプレート上で、ファージT7 RNAポリメラーゼは、転写物の3'末端をテンプレートの最終塩基を越えて伸長させることができる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985);Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。
DNAテンプレートへのポリA/T連鎖の従来の組み込み方法は分子クローニングである。しかし、プラスミドDNAに組み込まれたポリA/T配列はプラスミド不安定性を引き起こす恐れがあり、このことが、細菌細胞から得られたプラスミドDNAテンプレートに欠失および他の異常がしばしば高度に混入する理由となっている。このためにクローニング手順は面倒で時間がかかるだけでなく、往々にして信頼性も損なわれる。このためにクローニングを伴わずにポリA/T 3'連鎖を有するDNAテンプレートの構築を可能にする方法が非常に望まれている。
転写DNAテンプレートのポリA/Tセグメントは、ポリT尾部、例えば100T尾部など(サイズは50〜5000 Tでありうる)を含む逆方向プライマーを用いることによってPCR中に、またはDNA連結もしくはインビトロ組換えを非限定的に含む他の任意の方法によってPCRの後に、生成させることができる。ポリ(A)尾部はまた、RNAに安定性を与え、それらの分解も低下させる。一般に、ポリ(A)尾部の長さは、転写されたRNAの安定性と正の相関関係にある。1つの態様において、ポリ(A)尾部は100〜5000個のアデノシンである。
RNAのポリ(A)尾部は、インビトロ転写後に、ポリ(A)ポリメラーゼ、例えば大腸菌ポリAポリメラーゼ(E-PAP)などを用いることによって、さらに伸長させることができる。1つの態様においては、ポリ(A)尾部の長さを100ヌクレオチドから300〜400ヌクレオチドに増やすことにより、RNAの翻訳効率が約2倍に高くなる。さらに、異なる化学基を3'末端に付着させることもmRNA安定性を高める可能性がある。そのような付着物は、改変/人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含みうる。例えば、ポリ(A)ポリメラーゼを用いて、ATP類似体をポリ(A)尾部に組み入れることができる。ATP類似体は、RNAの安定性をさらに高めることができる。
5'キャップもまた、RNA分子に安定性を与える。1つの好ましい態様において、本明細書に開示された方法によって生成されたRNAは5'キャップを含む。5'キャップは、当技術分野において公知であって本明細書に記載された手法を用いて付与される(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001);Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
本明細書で開示された方法によって生成されたRNAはまた、配列内リボソーム進入部位(IRES)配列も含みうる。IRES配列は、mRNAに対するキャップ非依存的なリボソーム結合を開始させて翻訳開始を助長する、任意のウイルス配列、染色体配列または人工的に設計された配列であってよい。細胞の透過性および生存能力を高める因子、例えば糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化物質および界面活性剤などを含みうる、細胞エレクトロポレーションのために適した任意の溶質を含めることができる。
RNAは、いくつかのさまざまな方法の任意のもの、例えば、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II(BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを用いるカチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリマーカプセル封入、ペプチド媒介性トランスフェクション、または「遺伝子銃」などのバイオリスティック(biolistic)粒子送達システムを非限定的に含む市販の方法(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照)を用いて、標的細胞に導入することができる。
遺伝子改変されたT細胞
いくつかの態様において、CAR配列は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを用いて細胞内に送達される。CARを発現するレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、形質導入された細胞を担体として用いるか、またはカプセル封入された、結合された、もしくは裸のベクターの無細胞性の局所的または全身性の送達を用いて、さまざまな種類の真核細胞、さらには組織および生物全体の中に送達することができる。用いられる方法は、安定的な発現が必要であるかまたは十分である任意の目的に対するものでありうる。
いくつかの態様において、CAR配列は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを用いて細胞内に送達される。CARを発現するレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、形質導入された細胞を担体として用いるか、またはカプセル封入された、結合された、もしくは裸のベクターの無細胞性の局所的または全身性の送達を用いて、さまざまな種類の真核細胞、さらには組織および生物全体の中に送達することができる。用いられる方法は、安定的な発現が必要であるかまたは十分である任意の目的に対するものでありうる。
他の態様において、CAR配列および二重特異性抗体配列は、インビトロで転写されたmRNAを用いて細胞内に送達される。インビトロで転写されたmRNA CARは、トランスフェクトされた細胞を担体として用いるか、またはカプセル封入された、結合された、もしくは裸のmRNAの無細胞性の局所的または全身性の送達を用いて、さまざまな種類の真核細胞、さらには組織および生物全体の中に送達することができる。用いられる方法は、一過性発現が必要であるかまたは十分である任意の目的に対するものでありうる。
開示された方法は、遺伝子改変されたT細胞が標的癌細胞を死滅させる能力の評価を含め、基礎研究および治療法において、癌、幹細胞、急性および慢性感染症、ならびに自己免疫疾患の分野において、T細胞活性のモジュレーションのために適用されうる。
本方法はまた、例えばプロモーターまたは投入RNAの量を変化させることによって、発現のレベルを広範囲にわたって制御する能力も提供し、そのため発現レベルを個別に調節することが可能になる。その上、PCRに基づくmRNA生成の手法は、種々の構造およびそれらのドメインの組み合わせを有するキメラ受容体mRNAの設計を非常に容易にする。例えば、同じ細胞における複数のキメラ受容体上の種々の細胞内エフェクター/共刺激ドメインを変更することにより、多抗原標的に対する最高レベルの細胞傷害性、および同時に正常細胞に対する最も低い細胞傷害性を評価する、受容体の組み合わせの構造の決定が可能になる。
本発明のRNAトランスフェクション法の1つの利点は、RNAトランスフェクションが本質的に一過性であり、かつベクターを用いないことである:RNA導入遺伝子をリンパ球に送達し、短時間のインビトロ細胞活性化の後に、その中で、いかなる別のウイルス配列も必要としない最小発現カセットとして発現させることができる。これらの条件下では、宿主細胞ゲノム中への導入遺伝子の組み込みが起こる可能性は低い。RNAのトランスフェクションの効率の高さ、およびリンパ球集団全体を均質に改変させるその能力から、細胞のクローニングは必要でない。
インビトロで転写されたRNA(IVT-RNA)を用いるT細胞の遺伝子改変では、どちらもさまざまな動物モデルで継続的に検討されてきた、2種類の戦略を利用する。リポフェクションまたはエレクトロポレーションによって、細胞に、インビトロで転写されたRNAがトランスフェクトされる。好ましくは、移入されたIVT-RNAの長期間にわたる発現を達成するために、さまざまな改変を用いてIVT-RNAを安定化することが望ましい。
インビトロ転写のためのテンプレートとして標準化された様式で利用され、かつ、安定化されたRNA転写物が産生されるように遺伝子改変されている、いくつかのIVTベクターが文献で公知である。現在、当技術分野で用いられるプロトコールは、以下の構造を有するプラスミドベクターに基づく:RNA転写を可能にする5' RNAポリメラーゼプロモーターと、それに続く、3'および/または5'側に非翻訳領域(UTR)が隣接している関心対象の遺伝子と、50〜70個のヌクレオチドAを含む3'ポリアデニルカセット。インビトロ転写の前に、環状プラスミドはII型制限酵素(認識配列は切断部位に対応する)によってポリアデニルカセットの下流で線状化される。したがって、ポリアデニルカセットは転写物における後のポリ(A)配列に対応する。この手順の結果として、いくつかのヌクレオチドは、線状化の後に酵素切断部位の一部として残存し、伸長するか、または3'末端でポリ(A)配列を覆い隠す。この非生理的な突出部が、そのような構築物から細胞内で産生されるタンパク質の量に影響を及ぼすか否かは不明である。
RNAには、より従来的なプラスミドまたはウイルスによるアプローチを上回るいくつかの利点がある。RNA供給源からの遺伝子発現は転写を必要とせず、トランスフェクション後にタンパク質産物が迅速に産生される。さらに、RNAは核ではなく細胞質に到達しさえすればよく、そのため、典型的なトランスフェクション法によって、極めて高率でのトランスフェクションがもたらされる。加えて、プラスミドに基づくアプローチは、関心対象の遺伝子の発現を作動させるプロモーターが、試験中の細胞において活性があることを必要とする。
もう1つの局面において、RNA構築物はエレクトロポレーションによって細胞内に送達することができる。例えば、US 2004/0014645号、US 2005/0052630A1号、US 2005/0070841A1号、US 2004/0059285A1号、US 2004/0092907A1号に教示されているような、哺乳動物細胞への核酸構築物のエレクトロポレーションの処方物および方法を参照されたい。任意の既知の細胞型のエレクトロポレーションのために必要な電場強度を含むさまざまなパラメーターは、関連研究文献ならびに当技術分野における数多くの特許および出願において一般に公知である。例えば、米国特許第6,678,556号、米国特許第7,171,264号および米国特許第7,173,116号を参照されたい。エレクトロポレーションの治療適用のための装置は市販されており、これには例えば、MedPulser(商標)DNA Electroporation Therapy System(Inovio/Genetronics, San Diego, Calif)があり、米国特許第6,567,694号;米国特許第6,516,223号、米国特許第5,993,434号、米国特許第6,181,964号、米国特許第6,241,701号および米国特許第6,233,482号などの特許に記載されている;また、エレクトロポレーションを、例えばUS20070128708A1号に記載されたように、インビトロでの細胞のトランスフェクションのために用いることもできる。また、エレクトロポレーションを、インビトロで細胞に核酸を送達するために利用することもできる。このように、当業者に公知の多くの利用可能なデバイスおよびエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用した、発現構築物を含む核酸の細胞へのエレクトロポレーション媒介性投与は、関心対象のRNAを標的細胞に送達するための素晴らしい新たな手段となる。
実験例
ここで本発明を、以下の実験例を参照しながら説明する。これらの例は例示のみを目的として提供されるものであり、本発明はこれらの例に限定されるとは全くみなされるべきではなく、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意かつすべての変更も包含するとみなされるべきである。
ここで本発明を、以下の実験例を参照しながら説明する。これらの例は例示のみを目的として提供されるものであり、本発明はこれらの例に限定されるとは全くみなされるべきではなく、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意かつすべての変更も包含するとみなされるべきである。
それ以上の説明がなくても、当業者は、前記の説明および以下の例示的な例を用いて、本発明の化合物を作成して利用し、請求される方法を実施することができる。以下の実施例は、このため、本発明の好ましい態様を具体的に指摘しており、本開示の残りを限定するものとは全くみなされるべきでない。
実施例1:CAR形質導入T細胞の活性をモジュレートおよび/または無効化するための手法としてのCAR結合試薬の内部移行
これまでに試験したCAR構築物のすべてに共通する観察所見は、CAR複合体が、標的抗原を認識した後に一過性に内部移行されることである(図1、図2)。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、この内部移行は、CARにより作動される機能の最適化のために必要である可能性がある。CARのこの特徴は、標的細胞と結合した後のT細胞受容体複合体の内部移行とも、また、コグネイト抗体と結合した後の細胞表面抗原で観察されている内部移行とも類似している可能性がある。例えば、これは、血液悪性腫瘍の治療に用いられる臨床的に利用可能ないくつかの薬物-抗体結合体(抗CD33抗体ゲムツズマブオゾガマイシン(マイロターグ(Mylotarg));抗CD30抗体ブレンツキシマブベドチン(アドセトリス(Adcetris)))の作用機序でもある。腫瘍細胞は抗体-薬物結合体と結合し、結合体を内部移行させ、そして薬物(マイロターグの場合にはカリケアマイシン、アドセトリスの場合にはMMAE)が細胞内で放出されて、細胞死を導く。
これまでに試験したCAR構築物のすべてに共通する観察所見は、CAR複合体が、標的抗原を認識した後に一過性に内部移行されることである(図1、図2)。いかなる特定の理論にも拘束されることは望まないが、この内部移行は、CARにより作動される機能の最適化のために必要である可能性がある。CARのこの特徴は、標的細胞と結合した後のT細胞受容体複合体の内部移行とも、また、コグネイト抗体と結合した後の細胞表面抗原で観察されている内部移行とも類似している可能性がある。例えば、これは、血液悪性腫瘍の治療に用いられる臨床的に利用可能ないくつかの薬物-抗体結合体(抗CD33抗体ゲムツズマブオゾガマイシン(マイロターグ(Mylotarg));抗CD30抗体ブレンツキシマブベドチン(アドセトリス(Adcetris)))の作用機序でもある。腫瘍細胞は抗体-薬物結合体と結合し、結合体を内部移行させ、そして薬物(マイロターグの場合にはカリケアマイシン、アドセトリスの場合にはMMAE)が細胞内で放出されて、細胞死を導く。
CAR分子の細胞外ドメインは通常、標的細胞の表面に発現する分子に対して特異的な抗体に由来する結合ドメインからなる;典型的には、この結合ドメインは、標準的な分子生物学に基づく手法を用いて合成されており、標的分子を認識する免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域が短いリンカーペプチドを介して接続された融合物である単鎖可変フラグメント(scFv)からなる;このscFvは標的分子を認識する抗体に由来し、非ヒト種において作製されており、場合によっては、免疫原性を最小限に抑えるために「ヒト化」されている。これらのドメインが、CARの特異性の原因となる。
CARのscFvドメインは、それ自体が標的指向性である、かつ/または、他の分子、例えば、scFvに対して特異的な抗体、標的抗原それ自体に由来するエピトープ、またはscFvと結合する高次構造をとる他の分子などによる結合を受ける。
CARと特異的に結合し、結合した後に、表面CARを発現する細胞により内部移行される分子を開発したことを、本明細書で説明してきた。さらに、CARの結合と内部移行によって、CARを発現する細胞が能力を失う、かつ/または消失するように、CAR標的指向性物質を、細胞機能を破壊する他の分子と連結させている。この技術は、表面CARを発現する細胞を、特異的に、思いのままに消失または失活させることを可能にする。
細胞上の標的分子と結合すると、CARは内部移行されることが実証された。重要なこととして、この現象は、CAR T細胞による治療を受けた患者においてインビボでも起こることが示されている。内部移行誘導試薬を開発する中で、標準的な生化学的手法を用いて、CARと結合する抗体を、リンカーを用いて有糸分裂阻害剤と連結させる。これにより、薬物-抗体結合体の添加によって、残りの操作されていないT細胞に影響を及ぼすことなく、CARを発現するT細胞が特異的に溶解されることの実証が可能になる。
本明細書に引用された特許、特許出願および刊行物のそれぞれおよびすべての開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。具体的な態様を参照しながら本発明を開示してきたが、本発明の真の趣旨および範囲を逸脱することなく、本発明の他の態様および変形物も当業者によって考案されうることは明らかである。添付された特許請求の範囲は、そのようなすべての態様および等価な変形物を含むことを意図している。
Claims (10)
- 細胞の表面上に発現したCARと結合する、薬物および分子を含む薬物-分子結合体。
- 前記結合体と前記CARとの結合が、該結合体の前記細胞内への内部移行をもたらす、請求項1記載の結合体。
- 前記結合体と前記CARとの結合が、前記細胞の薬物媒介性死滅をもたらす、請求項1記載の結合体。
- 前記細胞がT細胞であり、前記結合体と前記CARとの結合が、該T細胞の活性化の薬物媒介性阻害をもたらす、請求項1記載の結合体。
- 前記分子が抗体、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、小分子、およびそれらの断片からなる群より選択される、請求項1記載の結合体。
- CAR T細胞療法中の健常組織の枯渇を阻害するための方法であって、CAR T細胞療法を受けている対象に、薬物および分子を含む薬物-分子結合体を投与する段階を含み、該分子が、T細胞の表面上に発現したCARと結合する、方法。
- 前記結合体と前記CARとの結合が、該結合体の前記細胞内への内部移行をもたらす、請求項6記載の方法。
- 前記結合体と前記CARとの結合が、前記細胞の薬物媒介性死滅をもたらす、請求項6記載の方法。
- 前記結合体と前記CARとの結合が、前記T細胞の活性化の薬物媒介性阻害をもたらす、請求項6記載の方法。
- 前記分子が抗体、タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、小分子、およびそれらの断片からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
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