JP2015512637A - 反芻動物におけるメタン排出を低減するための飼料中のパラニトロアミノ誘導体の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、飼料と一緒に動物に投与されるパラニトロアミノ誘導体の種類に属する活性化合物またはその塩を使用することによって、反芻動物の消化活動から生じるメタンの生成を低減するため、および／または反芻動物の能力を改善するための方法に関する。また本発明は、プレミックス、濃縮物および完全混合飼料（ＴＭＲ）などの飼料および飼料添加物における、あるいは巨丸剤の形態におけるこれらの化合物の使用にも関する。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、反芻動物の消化活動から生じるメタンの生成を低減するため、および／または反芻動物の能力を改善するための、パラニトロアミノ誘導体の種類に属する少なくとも１つの化合物の使用に関する。

本発明はまた、上記の化合物を含む動物飼料または動物飼料組成物および飼料添加物に関する。飼料または飼料組成物という用語は、動物による摂取に適した、あるいは動物による摂取を目的とした任意の化合物、調製物、混合物、または組成物を意味する。

本文脈では、反芻動物は、植物ベースの食物を最初に動物の第１の胃（第一胃として知られている）の中で軟化させ、次に半消化塊（これは食い戻しとして知られている）を吐き戻し、これを再度噛み砕くことによって消化する偶蹄目の哺乳類である。食い戻しを再度噛み砕いて植物質をさらに分解し、消化を刺激する過程は、「反芻」と呼ばれる。

第一胃発酵はいくつかの不都合をもたらす。嫌気性発酵の自然の結果としてメタンが生成され、これは、宿主動物にとってエネルギー損失を意味する。典型的な乳牛飼料において炭水化物は乾物の７０〜８０％を構成するが、これにもかかわらず胃腸管からの炭水化物の吸収は通常、非常に限られている。この理由は、主生成物としてアセタート、プロピオナートおよびブチラートの生成をもたらす第一胃内での炭水化物の徹底的な発酵である。これらの生成物は、いわゆる揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）の一部である。

エネルギー損失に加えて、メタンは、ＣＯ_２よりも何倍も強力な温室ガスでもある。その大気中の濃度は過去１世紀の間に倍増し、不安をいだかせるほど増加し続けている。反芻動物は生物起源のメタン形成の主要原因であり、反芻動物からのメタン形成を防止すると、大気中メタンの濃度がほぼ安定化され得ると推定されている。

さらに、２００９年のコペンハーゲン気候サミット（ｃｌｉｍａｔｅ ｓｕｍｍｉｔ）によって追従される京都議定書のアセスメントは、マルチガス戦略の一環としてメタン排出を削減することをより一層優先している。メタンの形成を低減するために現在使用されている最も有効な添加剤は、メタン生成菌に水素（Ｈ_２）を提供する微生物の増殖を減少させる抗生物質を含有する。（Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ；７６：９０６−９１４）。しかしながら、メタン形成に対する抗生物質の効果は、短期間（２〜３週間）のうちに意図される効果の完全な損失をもたらす細菌叢の急速な適応および／または耐性の発現のために、そしてヨーロッパでは抗生物質の非治療的な用途での使用は禁止されているために、いくつかの不都合を有する。

生体外第一胃シミュレーションモデルを用いて試験したときにメタン排出の低減をもたらす非抗生物質製品（胆汁酸誘導体）が最近公開されている（国際公開第２０１００７２５８４号パンフレット）。しかしながら、メタン排出の適度な低減を生じるために必要とされる量は、反芻動物飼料産業のコスト制約と両立できない。

これらの状況下で、メタンの形成を低減し、信頼性のある一般に受け入れられた実施に適合し、医薬的性質を持たない新しい物質を開発することが依然として必要とされている。メタン排出の低減に加えて、このような物質は、飼料転換率（ｆｅｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｉｏ）を改善し、飼料摂取量を低減し、体重増加を改善し、かつ／あるいは屠体または乳の生産量を改善することによって、反芻動物の能力を改善することにも寄与し得る。

本発明者らはここで驚くことに、宿主動物に有害であり得るような形で微生物発酵に影響を及ぼすことなくメタン形成を本質的に低減するために、本明細書中で以下に規定される化合物が、動物飼料中で使用する大きな可能性を有することを見出した。さらに、本発明の化合物は、飼料転換率、飼料摂取量、体重増加、屠体生産量、または乳生産量によって測定される全体的な動物能力に関しても大きな利益を有する。また前記化合物は従来技術に記載されるものよりも安定であり、動物およびヒトにとって安全であり、持続的なメタン低減効果をもたらし、おいしさに影響を与えず、動物栄養産業に適合したコストにおいて工業規模で生産することが可能であり、そして中でも、前記組成物が補給された動物の乳または食肉中の任意の代謝産物の蓄積を誘発せず、第一胃内において非常に低濃度で活性である。

特に、本発明者らにより、少なくとも１つのパラニトロアミノ誘導体化合物の反芻動物への給餌は、ＶＦＡの全生成量に悪影響を与えることなく反芻動物の消化活動から生じるメタンの生成を低減するときに、かつ／あるいは反芻動物の能力を改善するために非常に有効であることが観察された。さらに、本発明者により、アミン官能基が置換されるか、あるいはニトロ基のパラ位がメタ位に変化されると、メタンの生成に対する技術的な効果が失われることが示された。

従って、本発明は、反芻動物の消化活動から生じるメタンの形成を低減するため、および／または反芻動物の能力を改善するための、動物給餌における活性化合物としての式（Ｉ）

で定義される少なくとも１つの化合物またはその塩の使用を提供し、式中、Ｒ^１およびＲ^２は互いに独立してＨ、−ＣＨ_３、または−ＣＨ_２Ｒ^３を表し、Ｒ^３は飽和または不飽和の線状、分枝状または環状Ｃ_１〜Ｃ_８−炭化水素基であって、場合により、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨから選択される１〜３個の基によって置換されていてもよく、Ｃ_１〜Ｃ_８炭化水素中の炭素原子の１つまたは２つは、場合により、窒素または酸素原子によって置換されていてもよい。

本発明はさらに、反芻動物の消化活動から生じるメタンの生成を低減するため、および／または反芻動物の能力を改善するための方法であって、十分な量の式（Ｉ）によって定義される少なくとも１つのパラニトロアミノ誘導体またはその塩を動物に経口的に投与することを含む方法を提供する。経口投与とは、単純な給餌、または手作業による巨丸剤投与であると理解されるべきである。

本発明のすべての実施形態において、式（Ｉ）の化合物またはその塩は、以下の式（Ｉ）

の化合物によって定義され、式中、Ｒ^１およびＲ^２は互いに独立してＨ、−ＣＨ_３、または−ＣＨ_２Ｒ^３を表し、Ｒ^３は飽和または不飽和の線状、分枝状または環状Ｃ_１〜Ｃ_８−炭化水素基であって、場合により、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨから選択される１〜３個の基によって置換されていてもよく、Ｃ_１〜Ｃ_８炭化水素中の炭素原子の１つまたは２つは、場合により、窒素または酸素原子によって置換されていてもよい。

別の実施形態では、本発明に従う式（Ｉ）の好ましい化合物は、Ｒ^１がＨまたは−ＣＨ_３である化合物である。式（Ｉ）のより好ましい化合物は、Ｒ^１がＨまたは−ＣＨ_３であり、Ｒ^２がＨ、−ＣＨ_３、または−ＣＨ_２Ｒ^３であり、Ｒ^３が飽和または不飽和の線状または分枝状Ｃ_１〜Ｃ_４−炭化水素基である化合物である。式（Ｉ）のさらにより好ましい化合物は、Ｒ^１がＨまたは−ＣＨ_３であり、Ｒ^２がＨ、−ＣＨ_３、または−ＣＨ_２Ｒ^３であり、Ｒ^３が飽和の線状または分枝状Ｃ_１〜Ｃ_３−炭化水素基である化合物である。

本発明に従う最も好ましい化合物は、表１に記載および描写されるように、（４−ニトロ−フェニル）−アミン、メチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミン、エチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミン、ジメチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミン、（４−ニトロ−フェニル）−プロピル−アミン、イソプロピル−（４−ニトロ−フェニル）−アミン、２−（４−ニトロ−フェニルアミノ）−エタノール、３−（４−ニトロ−フェニルアミノ）−プロパン−１−オール、４−ニトロ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）アニリン、４−（（４−ニトロ−フェニルアミノ）−メチル）−安息香酸、および３−（（４−ニトロ−フェニルアミノ）−メチル）−安息香酸を含む化合物の群から選択される。

本発明の全ての実施形態について、式（Ｉ）の化合物が任意の異性体形態であり得ることは理解されるべきである。

本発明の化合物は、式（Ｉ）の化合物の塩も含む。塩の調製のための好ましいカチオンは、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、リチウム（Ｌｉ＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、バリウム（Ｂａ２＋）、ストロンチウム（Ｓｒ２＋）、およびアンモニウム（ＮＨ４＋）からなる群から選択され得る。また塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属から調製されてもよい。

本発明の化合物は、原則として、当該技術分野においてそれ自体が既知である合成方法に従って、かつ／あるいは実施例において記載される方法に基づいて製造することができる。

全てのこれらの場合において、生成物（式（Ｉ）の化合物）を精製するために適切な方法は当業者により選択することができ、すなわちカラムクロマトグラフィによるか、あるいは、それ自体が既知である方法によって、式（Ｉ）の化合物を単離および精製することができる。

反芻動物によるメタン排出は、当該技術分野で既知の方法によって、代謝チャンバー内で個々の動物において容易に測定することができる（Ｇｒａｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ；９０：２７５５−２７６６）。さらに、レーザービームを用いる新たな技術によって、家畜小屋レベルで評価することもできる（ＭｃＧｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ；３８：１７９６−１８０２）。あるいは、酪農反芻動物によって生成されるメタンは、国際公開第２００９／１５６４５３号パンフレットに従って乳中のＶＦＡプロファイルの測定によって評価することもできる。

反芻動物の能力は当該技術分野において周知の方法によって評価することができ、通常、飼料転換率、飼料摂取量、体重増加、屠体生産量、または乳生産量によって特徴付けられる。

また本発明は、第一胃内のメタン形成に関して類似の効果を示し、ジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸およびこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの付加的な活性物質と組み合わせた、本発明に従う式（Ｉ）の化合物またはその塩の使用にも関する。

本発明に従う化合物と一緒に付与され得るさらなる成分は、例えば、酵母、精油、およびモネンシン、ルメンシン（ｒｕｍｅｎｓｉｎ）のようなイオノフォアである。

現在のところ、ジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸およびこれらの誘導体は、例えば、飼料１ｋｇあたり０．０１〜５００ｍｇの活性物質（ｐｐｍ）の用量範囲で独立して投与されることが考えられる。これらの化合物は市販されているか、あるいは従来技術において周知の過程および方法を用いて当業者により容易に調製することができる。

本発明に従う反芻哺乳類には、ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ヌー、レイヨウ、プロングホーン、およびニルガイが含まれる。

本発明の全ての実施形態のために、ウシ、ヤギ、ヒツジ、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、および水牛が好ましい種である。より好ましい種は、家畜のウシ、ヒツジおよびヤギであり、最も好ましい種は家畜のウシである。この用語は、全ての品種の家畜のウシ、および全ての生産種のウシ、特に乳牛および肉牛を含む。

また本発明は、本発明に従う式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物またはその塩の使用に関し、乾物摂取量１キログラムあたりのリットル数で計算される反芻動物のメタン生成量は、代謝チャンバー内で測定したときに少なくとも１０％低減される。好ましくは、メタンの低減は少なくとも１５％であり、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３０％である。レーザービームの使用、あるいは酪農反芻動物の場合にはメタン生成量と乳中のＶＦＡプロファイルとの相関のように、代替的なメタン排出測定が使用されてもよい。

また本発明は、本発明に従う式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物またはその塩の使用に関し、反芻動物の飼料転換率は、従来の能力試験で測定される場合に少なくとも１％低減される。好ましくは、飼料転換率は、少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％、さらにより好ましくは少なくとも３％、最も好ましくは少なくとも３．５％低減される。

また本発明は、本発明に従う式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物またはその塩の使用に関し、反芻動物に投与される式（Ｉ）の化合物の量は、飼料１Ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｇであり、好ましくは飼料１Ｋｇあたり１０ｍｇ〜１ｇ、より好ましくは飼料１Ｋｇあたり５０ｍｇ〜５００ｍｇである。しかしながら、動物飼料において使用する場合、式（Ｉ）の化合物またはその塩はそれほど純粋である必要はなく、例えば、他の化合物および誘導体を含んでいてもよい。

上記のように、本発明の化合物は、反芻動物の飼料添加物および動物飼料組成物のための化合物として有用であり、従って、動物の消化管におけるメタン形成を低減するため、および／または反芻動物の能力を改善するための、このような飼料中の活性成分として有用である。反芻動物の飼料のためのこのような成分としてのその使用を実現するために、飼料の配合および加工の分野においてそれ自体が既知である方法によって、化合物を飼料中に取り込むことができる。

従って、本発明のさらなる態様は、本明細書において上記で定義された化合物を含有する配合物、すなわち飼料添加物および動物飼料組成物である。従って、本発明は、少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物またはその塩とを含む飼料組成物または飼料添加物にも関する。好ましい実施形態では、組成物は、ミネラルプレミックス、ビタミンプレミックス（ビタミンおよびミネラルを含む）、または巨丸剤である。

飼料摂取によって動物に提供される本発明に従う化合物の通常の１日の投与量は、動物の種類およびその状態に依存する。通常、この投与量は、飼料１ｋｇあたり約１ｍｇ〜約１０ｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜約１ｇ、より好ましくは５０ｍｇ〜５００ｍｇの化合物の範囲内でなければならない。

式（Ｉ）の化合物またはその塩は、炭酸カルシウム、電解質、例えば塩化アンモニウム、タンパク質、例えば大豆ミール、小麦、デンプン、ヒマワリミール、コーン、肉骨粉、アミノ酸、動物性脂肪、ビタミンおよび微量ミネラルなどの、動物飼料組成物（食餌）中に存在する従来の成分と組み合わせて使用され得る。

本発明の組成物の特定の例は、以下の通りである：
− （ａ）表１から選択される少なくとも１つの化合物、および（ｂ）少なくとも１つの脂溶性ビタミン、（ｃ）少なくとも１つの水溶性ビタミン、（ｄ）少なくとも１つの微量ミネラル、および／または（ｅ）少なくとも１つの多量ミネラルを含む動物飼料添加物、
− 表１から選択される少なくとも１つの化合物を含み、粗タンパク質含量が５０〜８００ｇ／ｋｇ飼料である動物飼料組成物。

いわゆるプレミックスは本発明の動物飼料添加物の例である。プレミックスは、１つまたは複数の微量成分と、希釈剤および／またはキャリアとの好ましくは均一の混合物を示す。プレミックスは、より大きい混合物中での微量成分の均一な分散を容易にするために使用される。

本発明の活性成分は別として、本発明のプレミックスは、少なくとも１つの脂溶性ビタミン、および／または少なくとも１つの水溶性ビタミン、および／または少なくとも１つの微量ミネラル、および／または少なくとも１つの多量ミネラルを含有する。言い換えると、本発明のプレミックスは、脂溶性ビタミン、水溶性ビタミン、微量ミネラル、および多量ミネラルからなる群から選択される少なくとも１つの付加的な成分と共に、本発明に従う少なくとも１つの化合物を含む。

多量ミネラルは、単独で飼料に添加されてもよい。従って、特定の実施形態では、プレミックスは、脂溶性ビタミン、水溶性ビタミン、および微量ミネラルからなる群から選択される少なくとも１つの付加的な成分と共に、本発明の活性成分を含む。

以下は、これらの成分の例の非排他的なリストである：
− 脂溶性ビタミンの例は、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、およびビタミンＫ、例えばビタミンＫ３である。
− 水溶性ビタミンの例は、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸およびパントテナート（ｐａｎｔｈｏｔｈｅｎａｔｅ）、例えば、Ｃａ−Ｄ−パントテナートである。
− 微量ミネラルの例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン、およびコバルトである。
− 多量ミネラルの例は、カルシウム、リンおよびナトリウムである。

雌ウシなどの反芻動物のための飼料組成物およびその成分に関して、反芻動物の食餌は、通常、容易に分解可能な画分（濃縮物と命名）と、繊維が豊富であまり容易に分解されない画分（干し草、まぐさ、または食物繊維と命名）とから構成される。

干し草は、乾燥した牧草、マメ科植物または全穀物で作られている。牧草としては、とりわけ、オオアワガエリ、ドクムギ、フェスク（ｆｅｓｃｕｅ）が挙げられる。マメ科植物としては、とりわけ、クローバー、ムラサキウマゴヤシまたはアルファルファ、エンドウ豆、豆およびカラスノエンドウが挙げられる。全穀物としては、とりわけ、大麦、トウモロコシ（コーン）、オート麦、ソルガムが挙げられる。その他のまぐさ作物としては、サトウキビ、ケール、セイヨウアブラナ、およびキャベツが挙げられる。また、カブ、スウェーデンカブ、マングル（ｍａｎｇｌｅ）、飼料用ビート、および甜菜（甜菜パルプおよびビート糖蜜を含む）などの根菜作物も、反芻動物を育てるために使用される。またさらなる作物は、ジャガイモ、キャッサバおよびサツマイモなどの塊茎である。サイレージは、繊維の豊富な画分（例えば、牧草、マメ科植物または全穀物から）がサイロ発酵されたものであり、制御された嫌気性発酵プロセス（自然発酵または添加剤処理による）によって高含水量の材料が処理される。

濃縮物は、大部分は穀物（醸造穀類および蒸留穀類を含む大麦、トウモロコシ、小麦、ソルガムなど）で作られているが、大豆、菜種、パーム核、綿実およびヒマワリなどのタンパク質が豊富な飼料成分を含有することも多い。

また雌ウシには、全ての食餌成分、例えば、まぐさ、サイレージおよび濃縮物が供給前に混合された完全混合飼料（ＴＭＲ）が与えられてもよい。

上記のように、プレミックスは、本発明に従う活性化合物を含むことができる飼料添加物の一例である。化合物は、異なる他の形態で動物に投与されてもよいことが理解される。例えば、第一胃内に入れられて、明確に定義された投与量において規定量の活性化合物を特定の期間にわたって連続的に放出し得る巨丸剤中に、化合物が含まれることも可能である。

本発明はさらに、反芻動物の消化活動から生じるメタンの生成を低減するため、および／または反芻動物の能力を改善するための方法に関し、上記の好ましい実施形態による式（Ｉ）の十分な量の少なくとも１つの化合物またはその塩を経口的に投与することを含む。

その上、本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物が、ジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸およびこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの付加的な活性物質と組み合わせて動物に投与される、上記の方法にも関する。

また本発明は、反芻動物が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ヌー、レイヨウ、プロングホーン、およびニルガイからなる群から選択され、より好ましくは、ウシ、ヤギおよびヒツジからなる群から選択される、上記の方法にも関する。

また本発明は、反芻動物に投与される式（Ｉ）で定義される少なくとも１つの活性化合物の量が飼料１ｋｇあたり約１ｍｇ〜約１０ｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜約１ｇ、より好ましくは飼料１ｋｇあたり５０ｍｇ〜５００ｍｇの化合物である、上記の方法にも関する。

また本発明は、乾物摂取量１キログラムあたりのリットル数で計算される反芻動物のメタン生成が、代謝チャンバー内で測定したときに少なくとも１０％低減された、上記の方法にも関する。好ましくは、メタンの低減は、少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３０％である。レーザービームの使用、あるいは酪農反芻動物の場合にはメタン生成と乳中のＶＦＡプロファイルとの相関のように、代替的なメタン排出測定が使用されてもよい。

また本発明は、反芻動物の飼料転換率が従来の能力試験で測定される場合に少なくとも１％低減された、上記の方法にも関する。好ましくは、飼料転換率は、少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％、さらにより好ましくは少なくとも３％、最も好ましくは少なくとも３．５％低減される。

本発明は、本発明の範囲を限定すると解釈されてはならない以下の実施例によってさらに説明される。

［実施例］
［実施例１：メタン生成についての生体外試験］
この生体外システムによって模倣される第一胃の機能に対する特定の化合物の効果を試験するために、「Ｈｏｈｅｎｈｅｉｍ Ｆｏｒａｇｅ ｖａｌｕｅ Ｔｅｓｔ（ＨＦＴ）」の修正版を用いた。

［原理］
第一胃液の組成物および緩衝液の適切な混合物と共に、飼料をシリンジ内に供給する。溶液を３９℃でインキュベートする。８時間後に、生成したメタンの量（および組成）を測定し、転換のための式に入力する。

［試薬］
［質量要素溶液（ｍａｓｓ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）］
− ６．２ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ_２ＰＯ_４）
− ０．６ｇの硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ_４ ^＊７Ｈ_２Ｏ）
− ９ｍｌの濃リン酸（１ｍｏｌ／ｌ）
− 蒸留水に溶解させて１ｌにする（ｐＨ約１．６）

［緩衝溶液］
− ３５．０ｇの炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）
− ４．０ｇの炭酸水素アンモニウム（（ＮＨ_４）ＨＣＯ_３）
− 蒸留水に溶解させて１ｌにする

［微量元素溶液］
− １３．２ｇの塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ_２ ^＊２Ｈ_２Ｏ）
− １０．０ｇの塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ＭｎＣｌ_２ ^＊４Ｈ_２Ｏ）
− １．０ｇの塩化コバルト（ＩＩ）六水和物（ＣｏＣｌ_２ ^＊６Ｈ_２Ｏ）
− ８．０ｇの塩化鉄（ＩＩＩ）（ＦｅＣｌ_３ ^＊６Ｈ_２Ｏ）
− 蒸留水に溶解させて１００ｍｌにする

［ナトリウム塩溶液：］
− １００ｍｇのナトリウム塩
− 蒸留水に溶解させて１００ｍｌにする

［還元溶液］
− 最初に３ｍｌの水酸化ナトリウム（ｃ＝１ｍｏｌ／ｌ）、次に４２７．５ｍｇの硫化ナトリウム水和物（Ｎａ_２Ｓ^＊Ｈ_２Ｏ）を、７１．２５ｍｌのＨ_２Ｏに添加する
− 溶液は、媒体溶液に添加する直前に調製されなければならない

［手順］
［サンプルの秤量］
通常はＴＭＲ（４４％の濃縮物、６％の干し草、３７％のトウモロコシサイレージおよび１３％の牧草サイレージ）である飼料材料を１ｍｍのふるいにかけ、６４本のシリンジ内に正確に秤量する。これらのシリンジのうちの４本は基質対照であり、試験化合物の効果がない場合のガス生成を示す。別の４本のシリンジは正の対照であり、ブロモエタンスルホナートが０．１ｍＭまで添加されている。必要であれば、４本のシリンジはキャリア対照を含有する（試験化合物がキャリアを必要とする場合）。残りのシリンジは、４本のシリンジ群によって試験物質を含有する。

［媒体溶液の調製］
成分をＷｏｕｌｆｆボトル内で以下の順序で混合する：
− ７１１ｍｌの水
− ０．１８ｍｌの微量元素溶液
− ３５５．５ｍｌの緩衝溶液
− ３５５．５ｍｌの質量要素溶液
完成溶液を３９℃まで温めた後、１．８３ｍｌのナトリウム塩溶液を添加し、３６℃の還元溶液を添加する。指示薬が無色になったら第一胃液を添加する。

［第一胃液の抽出］
継続的に攪拌しながらＣＯ_２ガス処理の下、７５０ｍｌの第一胃液を約１，４００ｍｌの媒体溶液に添加する。

［シリンジの充填、インキュベーション、ならびにガス容積およびＶＦＡ値の決定］
希釈した第一胃流体（２４ｍｌ）をガラスシリンジに添加する。次に、シリンジを穏やかに攪拌しながら３９℃で８時間インキュベートする。８時間後に、生成したガスの容積を測定し、ガスクロマトグラフィによって気相中のメタンの割合を決定する。

［結果］
発酵される食物は、人工ＴＭＲ（４４％の濃縮物、６％の干し草、３７％のトウモロコシサイレージおよび１３％の牧草サイレージ）であった。実施例３〜１１に記載されるように生成された化合物を、乾物（ＤＭ）の１〜０．１％の濃度で発酵シリンジに添加した。生体外効果の結果は以下の表に示される。

［実施例２：比較例：メタンの生成の生体外試験］
いずれかのアミン基が置換されているか、あるいはアミン基がパラ位でない一連の分子を用いて、実施例１に記載されるものと同じ生体外アッセイを実施した。このデータにより、アミノ基が存在する場合、かつそれがパラ位である場合にのみ有意なメタン低減活性が観察されることが実証される（表２と表３を比較）。

この比較例のために、表３の化合物は、化学物質供給業者から購入するか、あるいは以下のプロセスに従って製造した。

［化合物Ｂ：３−ニトロ−フェニルアミン］

３−ニトロ−フェニルアミンは、Ｌａｎｃａｓｔｅｒから購入した。ＣＡＳ［９９−０９−２］。カタログ＃４０６３。バッチ＃００００８４１１１Ｈ。ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：□５．７９（ブロードｓ，２Ｈ）、６．８９−６．９６（ｍ，１Ｈ）、７．１９−７．３１（ｍ，２Ｈ）、７．３５（ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）。ＭＳ：１３９．０［Ｃ６Ｈ６Ｎ２Ｏ２＋Ｈ］^＋。

［化合物Ｄ：４−（４−ニトロ−フェノキシメチル）−安息香酸の合成］

［４−（４−ニトロ−フェノキシメチル）−安息香酸メチルエステル２：］
無水ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）中の水酸化カリウム（１．７０ｇ、２．０ｅｑ）の懸濁液に、４−ニトロフェノール（２．５３ｇ、１．２ｅｑ）および４−（ブロモメチル）安息香酸メチル１（３．４８ｇ、１．０ｅｑ）を添加した。反応混合物を１００℃で１８時間攪拌した。水の添加（２００ｍＬ）の後、混合物を酢酸エチル（３ｘ１００ｍＬ）で抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を真空下で蒸発させた。残存した懸濁液（ジメチルホルムアミド中）をろ過し、残留溶媒を真空で蒸発させて、化合物２を帯黄色の粉末として得た。収量２．９８ｇ（１０．３７ｍｍｏｌ、６８％）。

［４−（４−ニトロ−フェノキシメチル）−安息香酸３：］
アセトニトリル（２００ｍＬ）中の化合物２（２．９８ｇ、１．０ｅｑ）の溶液に、塩酸（３Ｎ）溶液（２００ｍＬ）を添加した。反応混合物を１００℃で７２時間攪拌した。得られた沈殿物をろ過して、化合物３を白色粉末として得た。収量１．３３ｇ（４．８７ｍｍｏｌ、４７％）。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：□５．３５（ｓ，２Ｈ）、７．２２（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．５６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．９６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ）、８．２１（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）、１２．９７（ブロードｓ，１Ｈ）。ＭＳ：２７４．１［Ｃ１４Ｈ１１ＮＯ５＋Ｈ］^＋。

［化合物Ｆ：４−（４−ニトロフェニル）モルホリン］

４−（４−ニトロフェニル）モルホリンは、ＡＢＣＲから購入した。ＣＡＳ［１０３８９−５１−２］。カタログ＃ＡＶ２４９３３／ＡＢ１４６７９４。バッチ＃１１９６１６５。

［実施例３：メチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミンの合成］

メチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミンは、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒから購入した。ＣＡＳ［１００−１５−２］。カタログ＃Ａ１５５４８。バッチ＃Ａ６９５０Ａ。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：□２．７７（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３Ｈ）、６．５８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．２７（ブロードｓ，１Ｈ）、７．９８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ：１５３．０［Ｃ７Ｈ８Ｎ２Ｏ２＋Ｈ］^＋。

［実施例４：エチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミンの合成］

エチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＣＡＳ［３６６５−８０−３］。カタログ＃３２８４９９。バッチ＃１０６１ＭＣ。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＨＣｌ３−ｄ）：δ１．１６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）、３．０７−３．２２（ｍ，２Ｈ）、６．６０（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．１５−７．２５（ｍ，１Ｈ）、７．９７（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ：１６７．０［Ｃ８Ｈ１０Ｎ２Ｏ２＋Ｈ］^＋。

［実施例５：ジメチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミンの合成］

ジメチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミンは、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒから購入した。ＣＡＳ［１００−２３−２］。カタログ＃Ｌ００４０Ｇ。バッチ＃１０１０７３１９。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＨＣｌ３−ｄ）：δ３．０７（ｓ，６Ｈ）、６．７５（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ）、８．０３（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ：１６７．０［Ｃ８Ｈ１０Ｎ２Ｏ２＋Ｈ］^＋。

［実施例６：（４−ニトロ−フェニル）−プロピル−アミンの合成］

７０ｍＬの無水エタノール中の４−ニトロアニリン１（３．００ｇ、１．０ｅｑ）の溶液に、プロピオンアルデヒド（１．９０ｇ、１．２ｅｑ）および氷酢酸（２．４８ｍＬ、２．０ｅｑ）を添加した。反応混合物を密封管中７０℃で２４時間加熱した。室温まで冷却した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（２．１８ｇ、１．６ｅｑ）を数回に分けて添加し、混合物を室温で１８時間攪拌した。水の添加（５０ｍＬ）の後、混合物を酢酸エチル（３ｘ１００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を真空下で蒸発させた。残渣をシリカゲルに吸着させ、フラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン／酢酸エチル１００／０から１００／０、続いてシクロヘキサン／酢酸エチル１００／０から８０／２０）により精製して、０．８７ｇの化合物２を黄色粉末として得た。収量０．７８ｇ（４．３３ｍｍｏｌ、２２％）。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ０．８９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）、１．５６（ｓｅｘｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）、３．０２−３．１５（ｍ，２Ｈ）、６．６１（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．２０−７．３２（ｍ，１Ｈ）、７．９６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ：１８１．０［Ｃ９Ｈ１２Ｎ２Ｏ２＋Ｈ］^＋。

［実施例７：イソプロピル−（４−ニトロ−フェニル）−アミンの合成］

イソプロピル−（４−ニトロ−フェニル）−アミンは、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒから購入した。ＣＡＳ［２５１８６−４３−０］。カタログ＃Ｈ５２３７５。バッチ＃Ａ０５Ｘ０２６。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＨＣｌ３−ｄ）：δ１．１５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ）、３．５８−３．７７（ｍ，１Ｈ）、６．６０（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．１３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ １Ｈ）、７．９６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ：１９１．０［Ｃ９Ｈ１２Ｎ２Ｏ２＋Ｈ］^＋。

［実施例８：２−（４−ニトロ−フェニルアミノ）−エタノールの合成］

４−ニトロアニリン１（２．００ｇ、１．０ｅｑ）を密封管内で２−ブロモエタノール（０．７１ｍＬ、０．７ｅｑ）中に混合した。反応混合物を９０℃で７２時間攪拌した。酢酸エチル（５０ｍＬ）および（１Ｎ）水酸化ナトリウム溶液（５０ｍＬ）で希釈した後、混合物を酢酸エチル（３ｘ１００ｍＬ）で抽出し、（１Ｎ）水酸化ナトリウム溶液（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄し、水（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を真空下で蒸発させた。残渣をシリカゲルに吸着させ、フラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン／酢酸エチル１００／０から１００／０、続いてシクロヘキサン／酢酸エチル１００／０から３０／７０）により精製して、化合物２を黄色粉末として得た。収量１．１３ｇ（６．２ｍｍｏｌ、６１％）。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ３．１５−３．２７（ｍ，２Ｈ）、３．４９−３．６０（ｍ，２Ｈ）、４．７８（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ）、６．６４（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．２０−７．３５（ｍ，１Ｈ）、７．９６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ：１８３．０［Ｃ８Ｈ１０Ｎ２Ｏ３＋Ｈ］^＋。

［実施例９：３−（４−ニトロ−フェニルアミノ）−プロパン−１−オールの合成］

４−ニトロアニリン１（５．００ｇ、１．０ｅｑ）を密封管内で３−ブロモプロパノール（２．６１ｍＬ、０．７ｅｑ）中に混合した。反応混合物を９０℃で１８時間攪拌した。酢酸エチル（５０ｍＬ）および（１Ｎ）水酸化ナトリウム溶液（５０ｍＬ）で希釈した後、混合物を酢酸エチル（３ｘ１００ｍＬ）で抽出し、水（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を真空下で蒸発させた。残渣をシリカゲルに吸着させ、フラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン／酢酸エチル１００／０から１００／０、続いてシクロヘキサン／酢酸エチル１００／０から３０／７０）により精製して、化合物２を黄色粉末として得た。収量３．２９ｇ（１６．７６ｍｍｏｌ、５８％）。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．６９（ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、３．１２−３．２４（ｍ，２Ｈ）、３．４１−３．５３（ｍ，２Ｈ）、４．５１（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ）、６．６１（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．２４（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．９６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ：１９７．０［Ｃ９Ｈ１２Ｎ２Ｏ３＋Ｈ］^＋。

［実施例１０：４−ニトロ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）アニリンの合成］

４−ニトロ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）アニリンは、ＡＵＲＯＲＡ ＦＩＮＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬＳから購入した。ＣＡＳ［４０８３６５−６７−３］。カタログ＃Ａ００．１９８．７６９。バッチ＃１１０８８９４。

［実施例１１：３−（（４−ニトロ−フェニルアミノ）−メチル）−安息香酸の合成］

１００ｍＬのエタノール（乾燥）中の３−カルボキシベンズアルデヒド１（２．１７ｇ、１．０ｅｑ）の溶液に、４−ニトロアニリン（２．００ｇ、１．０ｅｑ）および氷酢酸（１．６６ｍＬ、２．０ｅｑ）を添加した。反応混合物を５０℃で１８時間加熱した。室温まで冷却した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１．４６ｇ、１．６ｅｑ）を数回に分けて添加し、混合物を室温で１８時間攪拌した。真空下で溶媒を蒸発させた後、残渣を水（１００ｍＬ）中で粉砕し、ろ過し、ジクロロメタン／メタノール（９５／５）混合物（１０ｍＬ）で洗浄して、化合物２を黄色固体として得た。収量２．１８ｇ（８．０ｍｍｏｌ、５５％）。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ４．４８（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）、６．６６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．４６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．５８（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．７７−８．００（ｍ，５Ｈ）、１２．９５（ｓ，１Ｈ）。ＭＳ：２７３．１［Ｃ１４Ｈ１２Ｎ２Ｏ４＋Ｈ］^＋。

Claims (15)

1. 反芻動物の消化活動から生じるメタンの形成を低減するため、および／または反芻動物の能力を改善するための、動物の給餌における活性化合物としての式（Ｉ）
   

   

   
   
   （式中、Ｒ^１およびＲ^２は互いに独立してＨ、−ＣＨ_３、または−ＣＨ_２Ｒ^３を表し、Ｒ^３は飽和または不飽和の線状、分枝状または環状Ｃ_１〜Ｃ_８−炭化水素基であって、場合により、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨから選択される１〜３個の基によって置換されていてもよく、前記Ｃ_１〜Ｃ_８炭化水素中の炭素原子の１つまたは２つは、場合により、窒素または酸素原子によって置換されていてもよい）
   で定義される少なくとも１つの化合物またはその塩の使用。
2. Ｒ^１がＨまたは−ＣＨ_３である、請求項１に記載の使用。
3. Ｒ^１がＨまたは−ＣＨ_３であり、Ｒ^２がＨ、−ＣＨ_３、または−ＣＨ_２Ｒ^３であり、Ｒ^３が飽和の線状または分枝状Ｃ_１〜Ｃ_３−炭化水素基である、請求項１または２に記載の使用。
4. 前記式（Ｉ）の化合物が、（４−ニトロ−フェニル）−アミン、メチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミン、エチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミン、ジメチル−（４−ニトロ−フェニル）−アミン、（４−ニトロ−フェニル）−プロピル−アミン、イソプロピル−（４−ニトロ−フェニル）−アミン、２−（４−ニトロ−フェニルアミノ）−エタノール、３−（４−ニトロ−フェニルアミノ）−プロパン−１−オール、４−ニトロ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）アニリン、４−ニトロ−Ｎ−（ピリジン−２−イルメチル）アニリン、および３−（（４−ニトロ−フェニルアミノ）−メチル）−安息香酸を含む化合物の群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
5. 前記式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物またはその塩が、ジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸およびこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの付加的な活性物質と組み合わせられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
6. 前記反芻動物が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、および水牛からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
7. 乾物摂取量１キログラムあたりのリットル数で計算される前記反芻動物におけるメタン生成量が、代謝チャンバー内で測定したときに少なくとも１０％低減される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
8. 前記反芻動物に投与される前記式（Ｉ）で定義される少なくとも１つの活性化合物の量が、飼料１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｇである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
9. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物を含む、飼料組成物または飼料添加物。
10. ミネラルプレミックス、ビタミンプレミックス、またはビタミンおよびミネラルを含むプレミックス、または巨丸剤である、請求項９に記載の組成物。
11. 反芻動物の消化活動から生じるメタンの生成を低減するため、および／または反芻動物の能力を改善するための方法であって、十分な量の式（Ｉ）
    

    

    
    
    （式中、Ｒ^１およびＲ^２は互いに独立してＨ、−ＣＨ_３、または−ＣＨ_２Ｒ^３を表し、Ｒ^３は飽和または不飽和の線状、分枝状または環状Ｃ_１〜Ｃ_８−炭化水素基であって、場合により、−ＯＨ、−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨから選択される１〜３個の基によって置換されていてもよく、前記Ｃ_１〜Ｃ_８炭化水素中の炭素原子の１つまたは２つは、場合により、窒素または酸素原子によって置換されていてもよい）
    の少なくとも１つの化合物またはその塩を前記動物に経口的に投与することを含む方法。
12. 前記式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物が、ジアリルジスルフィド、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸およびこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの付加的な活性物質と組み合わせて前記動物に投与される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記反芻動物が、ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ヌー、レイヨウ、プロングホーン、およびニルガイからなる群から選択される、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 前記反芻動物に投与される前記式（Ｉ）の少なくとも１つの化合物の量が、飼料１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｇである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 乾物摂取量１キログラムあたりのリットル数で計算される前記反芻動物におけるメタン生成量が、代謝チャンバー内で測定したときに少なくとも１０％低減される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。