JP5786221B2 - 反芻動物のメタン排出を減少させ、および／または反芻動物の能力を改善するための、飼料中のニトロオキシアルカン酸およびその誘導体 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は、反芻動物の消化活動から生じるメタン産生を減少させ、および／または反芻動物の能力を改善するための、少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体の使用に関する。

本発明はまた、これらの前述の化合物を含んでなる、動物飼料または動物飼料組成物および飼料添加剤にも関する。飼料または飼料組成物という用語は、動物による摂取に適し、またはそれが意図される、あらゆる化合物、調製品、混合物、または組成物を意味する。

本文脈では、反芻動物は、植物ベースの食物を最初に反芻胃として知られている第一胃内で軟化して、次に反芻食塊として知られている半消化塊を吐き戻し、それを再度噛みくだくことで消化する偶蹄目の哺乳類である。反芻食塊を再度噛みくだいて植物材料をさらに分解し、消化を促進する過程は、「反芻」と称される。反芻哺乳類としては、畜牛、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ヌー、カモシカ、プロングホーン、およびニルガイが挙げられる。

本発明の全ての実施形態で、家畜牛、ヒツジ、およびヤギがより好ましい種である。本目的で最も好ましい種は、家畜牛である。本用語は、全ての系統の家畜牛、および全ての生産種の畜牛、特に乳牛および肉牛を含む。

反芻胃発酵は、いくつかの不都合をもたらす。嫌気性発酵の自然の帰結としてメタンが生成され、それは宿主動物のエネルギー損失を意味する。炭水化物は、典型的な乳牛飼料中において、乾燥物質の７０〜８０％を構成するにもかかわらず、胃腸管からの炭水化物の吸収は、常態では非常に限定的である。この理由は、主生成物として酢酸、プロピオン酸、および酪酸生成をもたらす、反芻胃内における炭水化物の徹底的発酵である。これらの生成物は、いわゆる揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）に属する。

エネルギー損失に加えて、メタンはまた、ＣＯ_２よりも何倍も強力な温室ガスである。その大気中濃度は過去１世紀間で倍加し、驚くほど増え続けている。反芻動物は生物起源メタン形成の主要原因であり、反芻動物からのメタン形成防止によって、大気中メタン濃度はほぼ安定化されると推定されている。

さらに京都プロトコルのアセスメントは、多成分ガス戦略の一環として、メタン排出削減により重きを置いている。メタン形成を減少させるために、目下使用されている最も効果的な添加剤は、メタン産生菌（ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｅｓ）に水素（Ｈ_２）供給する微生物増殖を減少させる抗生物質を含有する。しかし短期間（２〜３週間）で意図される効果の完全な損失をもたらす、細菌叢の迅速な適応および／または耐性発現のために、メタン形成に対する抗生物質の効果には、いくつかの不都合がある。

近年、動物飼料中における抗生物質使用に関する激しい議論があり、多くの国々では、飼料添加剤へのこの種の添加の禁止が検討されており、または既に禁止されている。

生体外反芻胃シミュレーションモデルを使用して試験した際にメタン排出減少をもたらす非抗生物質製品（胆汁酸誘導体）が、最近公開されている（国際公開第２０１００７２５８４号パンフレット）。しかしメタン排出に中程度の減少を生じるのに要する量は、反芻動物飼料産業の費用制約条件と両立し得ない。さらにいくつかの天然の植物抽出物（ニンニク（国際公開第２００９１５０２６４号パンフレット）、ユッカ、シナモン、ルーバーブなど）が、生体外実験に基づいて反芻動物のメタン排出を減少させる強力な解法として科学文献で記載されている。しかしこれらのいずれも副作用（ミルク中の残留）、または生体内試験時の有効性欠如のために、市販製品となるに至っていない。

このような状況下で、信頼できる一般に認められている慣例に沿った、医療用のものでない、メタン形成を減少させる新しい物質を開発する必要がある。メタン排出を減少させるのに加えて、このような物質はまた、飼料要求率を改善し、飼料摂取量を低下させ、体重増加を改善し、および／または屠体、または乳量を改善することで、反芻動物の能力改善に寄与し得る。

本発明者らは、宿主動物に有害な形で微生物発酵に影響を及ぼすことなく、メタン形成を本質的に減少させるために、下文中で規定される化合物を動物飼料中で使用する大きな可能性があることを、驚くべきことに発見した。さらに本発明の化合物はまた、飼料要求率、飼料摂取量、体重増加、屠体収率、または乳量によって測定される、総合的動物能力に関わる大きな利点も有する。前記化合物はまた、先行技術に記載されるものよりも安定しており、動物およびヒトに対してより安全であり、持続性のメタン減少効果をもたらし、美味性に影響を及ぼさず、動物栄養産業に適合する経費で工業規模で生産し得て、何よりもそれらは処置動物のミルクまたは肉にいかなる代謝産物の蓄積も引き起こさない。

特に、本発明に従った少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体の添加は、生体外実験で総ＶＦＡ生成に影響を及ぼすことなくメタン形成を減少させ、生体内で全体的メタン産生を減少させるのに高度に効果的であることが観察されている。

したがって本発明は、反芻動物の消化活動から生じるメタン形成を減少させるための、および／または反芻動物能力を改善するための、動物飼料中の活性化合物としての式（Ｉ）によって定義される少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体の使用を提供する。

本発明は、式（Ｉ）によって定義される十分な量の少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体を、動物に経口的に投与するステップを含んでなる、反芻動物の消化活動から生じるメタン産生低下させ、および／または反芻動物の能力を改善する方法をさらに提供する。

本発明の全ての実施形態で、ニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体は、式（Ｉ）、

によって定義され、
式中、
ｎは０〜２３、好ましくは０〜９であり、ｎ≠０であれば、炭素鎖は、一価または多価不飽和であってもあらゆる異性体形態であってもよい直鎖、環状鎖、または分枝直鎖または環式脂肪族炭素鎖であり、
Ｘは独立してＯ、ＮＨ、またはＮ−Ｒ３であり、Ｒ１≠Ｈであれば、Ｘ−Ｒ１−はエステルまたは二級アミド誘導体を表し、
Ｒ１は独立して、水素であるか、１〜１０個、好ましくは１〜５個の炭素原子を含有するアルキルまたはアルケニル基の飽和直鎖、環状鎖または分枝鎖であり、
Ｒ２は独立して、水素であるか、１〜２３個、好ましくは１〜９個の炭素原子を含有するアルキルまたはアルケニル基の飽和直鎖または分枝鎖であり、
Ｒ３は独立して、水素であるか、１〜１０個、好ましくは１〜５個の炭素原子を含有するアルキルまたはアルケニル基の飽和直鎖、環状鎖または分枝鎖である。

上の式（Ｉ）の化合物の定義では、ｎ＞２であれば、炭素鎖は直鎖であるか、炭素鎖に沿ったあらゆる位置で分枝し得るものとする。さらに炭素鎖は、炭素鎖に沿った異なる位置で多重分岐によって分枝し得る。さらにｎ＞４であれば、脂肪族炭素鎖は環状部分を形成してもよい。このシクロアルキル−カルボン酸部分は、位置２、３、４にニトロオキシ部分を有し得て、それはまたあらゆる脂肪族基によって多重位置で分枝し得る。分枝脂肪族基は、好ましくは、メチル、エチルまたはプロピルである。

上の式（Ｉ）の誘導体の定義では、好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、二級ブチル、イソブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、および２−エチル−ヘキシル、およびオクチルである。さらに３つ以上の炭素原子を含有するあらゆるアルキルまたはアルケニル基は、直鎖、分枝鎖、または環状鎖であり得る。さらに直鎖または分枝Ｃ_２〜Ｃ_１０−アルケニレン基では、これは、１つまたはそれ以上（Ｃ_４から）の二重結合があるアルケニレン基を包含するものとし；このようなアルケニレン基の例は、式−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ_２）_３−、および−（ＣＨ＝ＣＨ）_２−である。

特定の実施形態では、本発明に従った好ましいエステルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、二級ブチル、イソブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、２−エチル−ヘキシル、およびオクチルである。さらに、好ましいアミド誘導体は、メチル−アミド、エチル−アミド、プロピル−アミド、ブチル−アミド、ペンチル−アミド、ジメチル−アミド、ジエチルアミド、およびメチル−エチル−アミドである。

別の実施形態では、式（Ｉ）のより好ましい誘導体は、
ｎが０〜２３、好ましくは０〜９であり、ｎ≠０であれば、炭素鎖は、一価または多価不飽和であってもあらゆる異性体形態であってもよい直鎖、環状鎖、または分枝直鎖または環式脂肪族炭素鎖であり、
Ｘが独立してＯ、ＮＨ、またはＮ−Ｒ３であり、Ｒ１≠Ｈであれば、Ｘ−Ｒ１−はエステルまたは二級アミド誘導体を表し、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が３つとも全て独立して、水素、メチル、またはエチル基である、誘導体である。

別の実施形態では、さらにより好ましい化合物は、
ｎが０〜２３、好ましくは０〜９であり、ｎ≠０であれば、炭素鎖は、一価または多価不飽和であってもあらゆる異性体形態であってもよい直鎖、環状鎖、または分枝直鎖または環式脂肪族炭素鎖であり、
Ｘが独立してＯ、ＮＨ、またはＮ−Ｒ３であり、Ｒ１≠Ｈであれば、Ｘ−Ｒ１−はエステルまたは二級アミド誘導体を表し、
Ｒ２が水素である、誘導体である。

別の実施形態では、さらにより好ましい化合物は、
ｎが０〜２３、好ましくは０〜９であり、ｎ≠０であれば、炭素鎖は、一価または多価不飽和であってもあらゆる異性体形態であってもよい直鎖、環状鎖、または分枝直鎖または環式脂肪族炭素鎖であり、
Ｘが酸素（Ｏ）であり、Ｒ１≠Ｈであれば、Ｘ−Ｒ１−はエステルを表し、
Ｒ２が水素である、誘導体である。

さらに別の実施形態では、式（Ｉ）のより好ましい誘導体は、ニトロオキシエタン酸、３−ニトロオキシプロピオン酸、４−ニトロオキシブタン酸、５−ニトロオキシペンタン酸、６−ニトロオキシヘキサン酸、７−ニトロオキシヘプタン酸、２−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボン酸、３−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボン酸、４−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボン酸、８−ニトロオキシオクタン酸、９−ニトロオキシノナン酸、１０−ニトロオキシデカン酸、１１−ニトロオキシウンデカン酸、メチル−ニトロオキシエタノエート、メチル−３−ニトロオキシプロピオネート、メチル−４−ニトロオキシブタノエート、メチル−５−ニトロオキシペンタノエート、メチル−６−ニトロオキシヘキサノエート、メチル−７−ニトロオキシヘプタノエート、メチル−２−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボキシレート、メチル−３−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボキシレート、メチル−４−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボキシレート、メチル−８−ニトロオキシオクタノエート、メチル−９−ニトロオキシノナノエート、メチル−１０−ニトロオキシデカノエート、メチル−１１−ニトロオキシウンデカノエート、エチル−ニトロオキシエタエート、エチル−３−ニトロオキシプロピオネート、エチル−４−ニトロオキシブタノエート、エチル−５−ニトロオキシペンタエート、エチル−６−ニトロオキシヘキサエート、エチル−７−ニトロオキシヘプタエート、エチル−２−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボキシレート、エチル−３−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボキシレート、エチル−４−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボキシレート、エチル−８−ニトロオキシオクタエート、エチル−９−ニトロオキシノナエート、エチル−１０−ニトロオキシデカノエート、エチル−１１−ニトロオキシウンデカノエート、ニトロオキシ−Ｎ−エタン酸アミド、ニトロオキシ−Ｎ−メチル−エタン酸アミド、ニトロオキシ−Ｎ−ジメチル−エタン酸アミド、ニトロオキシ−Ｎ−エチル−エタン酸アミド、ニトロオキシ−Ｎ−ジエチル−エタン酸アミド、ニトロオキシ−Ｎ−メチル−エチル−エタン酸アミド、３−ニトロオキシ−Ｎ−プロピオン酸アミド、３−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−プロピオン酸アミド、３−ニトロオキシ−Ｎ−ジメチル−プロピオン酸アミド、３−ニトロオキシ−Ｎ−エチル−プロピオン酸アミド、３−ニトロオキシ−Ｎ−ジエチル−プロピオン酸アミド、３−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−エチル−プロピオン酸アミド、４−ニトロオキシ−Ｎ−ブタン酸アミド、４−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−ブタン酸アミド、４−ニトロオキシ−Ｎ−ジメチル−ブタン酸アミド、４−ニトロオキシ−Ｎ−エチル−ブタン酸アミド、４−ニトロオキシ−Ｎ−ジエチル−ブタン酸アミド、４−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−エチル−ブタン酸アミド、５−ニトロオキシ−Ｎ−ペンタン酸アミド、５−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−ペンタン酸アミド、５−ニトロオキシ−Ｎ−ジメチル−ペンタン酸アミド、５−ニトロオキシ−Ｎ−エチル−ペンタン酸アミド、５−ニトロオキシ−Ｎ−ジエチル−ペンタン酸アミド、５−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−エチル−ペンタン酸アミド、６−ニトロオキシ−Ｎ−ペンタン酸アミド、６−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−ペンタン酸アミド、６−ニトロオキシ−Ｎ−ジメチル−ペンタン酸アミド、６−ニトロオキシ−Ｎ−エチル−ペンタン酸アミド、６−ニトロオキシ−Ｎ−ジエチル−ペンタン酸アミド、６−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−エチル−ペンタン酸アミド、２−ニトロオキシプロピオン酸、メチル−２−ニトロオキシプロピオネート、エチル−２−ニトロオキシプロピオネート、２−ニトロオキシブタン酸、メチル−２−ニトロオキシブタノエート、エチル−２−ニトロオキシブタノエート、３−ニトロオキシブタン酸、メチル−３−ニトロオキシブタノエート、エチル−３−ニトロオキシブタノエート、２，２−ジメチル−３−ニトロオキシプロピオン酸、メチル−２，２−ジメチル−３−ニトロオキシプロピオネート、およびエチル−２，２−ジメチル−３−ニトロオキシプロピオネートからなる群から選択される。

上の式（Ｉ）の誘導体の定義で、本発明の全ての実施形態で、反芻動物によって産生されるメタンを減少させるそれらの諸特性の観点から、最も好ましい式（Ｉ）の誘導体、または式（Ｉ）は、その化学構造を表１に示す、エチル−ニトロオキシ−エタノエート、３−ニトロオキシプロピオン酸、メチル−３−ニトロオキシプロピオネート、エチル−３−ニトロオキシプロピオネート、エチル−２−ニトロオキシプロパノエート、４−ニトロオキシブタン酸、エチル−４−ニトロオキシ−ブタノエート、エチル−３−ニトロオキシ−ブタノエート、５−ニトロオキシペンタン酸、エチル−５−ニトロオキシペンタノエート、２，２−ジメチル−３−ニトロオキシプロピオン酸、６−ニトロオキシヘキサン酸、エチル−６−ニトロオキシヘキサノエート、８−ニトロオキシオクタン酸、エチル−８−ニトロオキシオクタノエート、１１−ニトロオキシウンデカン酸、エチル−１１−ニトロオキシウンデカノエート、エチル−４−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボキシレート、５−ニトロオキシ−Ｎ−ペンタン酸アミド、および５−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−ペンタン酸アミドからなる群から選択される。

さらにより好ましい式（Ｉ）の誘導体、または式（Ｉ）は、３−ニトロオキシプロピオン酸、メチル−３−ニトロオキシプロピオネート、エチル−３−ニトロオキシプロピオネート、エチル−４−ニトロオキシ−ブタノエート、エチル−３−ニトロオキシ−ブタノエート、５−ニトロオキシペンタン酸、エチル−５−ニトロオキシペンタノエート、６−ニトロオキシヘキサン酸、エチル−６−ニトロオキシヘキサエート、エチル−４−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボキシレート、８−ニトロオキシオクタン酸、エチル−８−ニトロオキシオクタノエート、１１−ニトロオキシウンデカン酸、エチル−１１−ニトロオキシウンデカノエート、５−ニトロオキシ−ペンタン酸アミド、および５−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−ペンタン酸アミドからなる群から選択される。

「その誘導体」という用語は、本明細書の用法では、ニトロオキシアルカン酸の塩もまた含んでなる。塩の調製に好ましいカチオンは、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、リチウム（Ｌｉ＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、バリウム（Ｂａ２＋）、ストロンチウム（Ｓｒ２＋）、およびアンモニウム（ＮＨ４＋）からなる群から選択されてもよい。塩はまた、アルカリ金属またはアルカリ土類金属から調製されてもよい。

本発明化合物は、原則として、それ自体が既知である、ニトロオキシアルカン酸の合成、エステル化またはアミド化方法に従って製造し得る。

これらの全例において、生成物（式（Ｉ）の化合物）を精製する適切な方法は、当業者によって選択され得て、すなわちカラムクロマトグラフィーにより、または式（Ｉ）の化合物は、例えば反応後にジエチルエーテルまたは酢酸エチルなどの溶剤を添加して混合物からの粗生成物分離を誘発し、収集された粗生成物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させることで、それ自体既知の方法によって単離精製し得る。

反芻動物によるメタン排出は、当該技術分野で知られている方法（Ｇｒａｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ；９０：２７５５−２７６６）によって、代謝チャンバー内の個々の動物において容易に測定し得る。さらにそれはまた、レーザー光線を使用した新たな技術によって家畜小屋レベルでも評価し得る（ＭｃＧｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ；３８：１７９６−１８０２）。代案としては、酪農反芻動物により産生されるメタンはまた、国際公開第２００９／１５６４５３号パンフレットに従った、ミルク中のＶＦＡプロフィールの測定によっても評価し得る。

反芻動物の能力は、当該技術分野で良く知られている方法によって評価し得て、通常、飼料要求率、飼料摂取量、体重増加、屠体収量、または乳量により特徴付けられる。

本発明はまた、二硫化ジアリル、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、反芻胃中のメタン形成に関して同様の効果を示す少なくとも１つの追加的活性物質と組み合わされた、少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体の使用にも関する。

本発明に従った化合物と共に与えることもあり得るさらなる構成要素は、例えば酵母、精油、そしてＭｏｎｅｎｓｉｎやＲｕｍｅｎｓｉｎなどのイオノフォアである。

二硫化ジアリル、ニンニク油、アリルイソチオシアネートデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体を、例えば飼料１ｋｇあたり０．０１〜５００ｍｇの活性物質（ｐｐｍ）の投与量範囲で、単独投与することが現在のところ考察される。これらの化合物は市販されているか、または先行技術で良く知られている工程と方法を使用して、当業者によって容易に調製され得る。

本発明はまた、乾物摂取量キログラムあたりリットルで計算される反芻動物におけるメタン産生が、代謝チャンバー内で測定すると少なくとも１０％減少する、少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体の使用にも関する。好ましくは、メタン減少は、少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３０％である。レーザー光線の使用、または酪農反芻動物では、メタン産生とミルク中ＶＦＡプロフィールの相関などの代案のメタン排出測定もまた使用してもよい。

本発明はまた、反芻動物飼料要求率が、従来の性能試験で測定すると少なくとも１％低下する、少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体の使用にも関する。好ましくは、飼料要求率は、少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％、さらにより好ましくは少なくとも３％、最も好ましくは少なくとも３．５％低下する。

本発明はまた、反芻動物に投与される式（Ｉ）で定義される少なくとも１つの活性化合物の量が、飼料１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは飼料１ｋｇあたり１０ｍｇ〜１ｇ、より好ましくは飼料１ｋｇあたり５０ｍｇ〜５００ｍｇである、少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体の使用にも関する。しかし動物飼料中での使用では、ニトロオキシアルカン酸およびその誘導体はそれほど純粋である必要はなく、それは例えば他の化合物および誘導体を含んでもよい。

上述の通り、反芻動物用の飼料添加剤および動物飼料組成物のための化合物として、本発明の化合物は有用であり、したがって動物消化管内のメタン形成を減少させ、または反芻動物の能力を改善する飼料中の活性成分として有用である。

反芻動物飼料のためのこのような成分としてのそれらの使用を実現するために、飼料配合および加工技術分野でそれ自体既知の方法によって、化合物を飼料中に組み込んでもよい。

したがって本発明のさらなる態様は、調合物、すなわち上で定義される化合物を含有する飼料添加剤および動物飼料組成物である。飼料摂取によって動物に提供される、本発明に従った化合物の通常の１日投与量は、動物種およびその状態に左右される。常態ではこの投与量は、１ｋｇの飼料あたり約１ｍｇ〜約１０ｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜約１ｇ、より好ましくは５０ｍｇ〜５００ｍｇの化合物の範囲内であるべきである。

少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体は、炭酸カルシウム、塩化アンモニウムなどの電解質、大豆ミールなどのタンパク質、小麦、デンプン、ひまわり油かす、コーン、肉骨粉、アミノ酸、動物性脂肪、ビタミン、および微量ミネラルなどの動物飼料組成物（食餌）中に存在する従来の成分と組み合わせて使用されてもよい。

本発明の組成物の特定例は、
−（ａ）表１から選択される少なくとも１つの化合物、および（ｂ）少なくとも１つの脂溶性ビタミン、（ｃ）少なくとも１つの水溶性ビタミン、（ｄ）少なくとも１つの微量ミネラル、および／または（ｅ）少なくとも１つのマクロミネラルを含んでなる動物飼料添加剤；
−表１から選択される少なくとも１つの化合物と、５０〜８００ｇ／ｋｇ飼料の粗製タンパク質含量とを含んでなる動物飼料組成物
である。

いわゆるプレミックスは、本発明の動物飼料添加剤の例である。プレミックスは、好ましくは１つまたは複数の微量成分と、希釈剤および／またはキャリアとの均質混合物を指す。プレミックスは、より多量の混合物中において、微量成分の均質分散を容易にするために使用される。

本発明のプレミックスは、本発明の活性成分の他に、少なくとも１つの脂溶性ビタミン、および／または少なくとも１つの水溶性ビタミン、および／または少なくとも１つの微量ミネラル、および／または少なくとも１つのマクロミネラルを含有する。換言すれば本発明のプレミックスは、本発明に従った少なくとも１つの化合物と共に、脂溶性ビタミン、水溶性ビタン、微量ミネラル、およびマクロミネラルからなる群から選択される少なくとも１つの追加的構成要素を含んでなる。

マクロミネラルは、飼料に別々に添加されてもよい。したがって特定の実施形態では、プレミックスは、本発明の活性成分と共に、脂溶性ビタミン、水溶性ビタミン、および微量ミネラルからなる群から選択される、少なくとも１つの追加的構成要素を含んでなる。

以下は、これらの構成要素例の非排他的一覧である。
−脂溶性ビタミンの例は、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、および例えばビタミンＫ３などのビタミンＫである。
−水溶性ビタミンの例は、ビタミンＢ１２、ビオチンおよびコリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸、および例えばＣａ−Ｄ−パントテネート（ｐａｎｔｈｏｔｈｅｎａｔｅ）などのパントテネート（ｐａｎｔｈｏｔｈｅｎａｔｅ）である。
−微量ミネラルの例は、マンガン、亜鉛、鉄、銅、ヨウ素、セレン、およびコバルトである。
−マクロミネラルの例は、カルシウム、リン、およびナトリウムである。

雌牛などの反芻動物用飼料組成物ならびにその成分に関して、反芻動物食餌は、通常、易分解性画分（濃縮物と呼ばれる）と、繊維に富む難分解性画分（乾草、茎葉飼料、または不消化食料と呼ばれる）から構成される。

乾草は、乾燥させた牧草、マメ科植物または穀物全体からできている。牧草としては、特にオオアワガエリ、ドクムギ、ウシノケグサが挙げられる。マメ科植物としては、特にクローバー、ムラサキウマゴヤシまたはアルファルファ、エンドウ豆、マメ、およびカラスノエンドウが挙げられる。穀物全体としては、特に大麦、トウモロコシ（コーン）、オート麦、ソルガムが挙げられる。他の茎葉飼料作物としては、サトウキビ、ケール、ナタネ、およびキャベツが挙げられる。カブ、スウェーデンカブ、マングル、飼料用ビート、および（甜菜パルプおよび甜菜糖蜜をはじめとする）甜菜などの根菜類菜作物もまた、飼料反芻動物を養うために使用されている。さらに他の作物は、ジャガイモ、キャッサバ、および甘藷などの塊茎である。サイレージは、それによって高水分含有の材料が制御された嫌気性発酵過程によって処理される、（例えば牧草、マメ科植物または全粒粉からの）繊維に富む画分の（自然発酵され、または添加剤処理された）サイロ貯蔵バージョンである。

濃縮物は、概して（醸造穀物および蒸留穀物をはじめとする大麦、トウモロコシ、小麦、ソルガムなどの）穀物で構成されるが、ダイズ、ナタネ、パーム核、綿実、およびヒマワリなどのタンパク質に富む飼料成分もまた含有することが多い。

雌牛はまた、例えば茎葉飼料、サイレージ、および濃縮物などの全ての食餌構成要素が給餌前に混合される、完全混合飼料（ＴＭＲ）を与えられてもよい。

上述したように、プレミックスは、本発明に従った活性化合物を含んでなってもよい飼料添加剤の一例である。化合物は、異なる他の形態で動物に投与してもよいものと理解される。例えば化合物はまた、反芻胃内に配置され、特定期間にわたり、明確に定義された投与量で規定量の活性化合物を連続的に放出する、大丸薬中に含め得る。

本発明は、十分な量の式（Ｉ）で定義される少なくとも１つの活性化合物を経口的に投与するステップを含んでなる、反芻動物の消化活動から生じるメタン産生を減少させ、および／または反芻動物の能力を改善する方法にさらに関し、好ましい実施形態は誘導体について記載される。

さらに本発明は、活性化合物が、二硫化ジアリル、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの追加的活性物質と組み合わされて動物に投与される、上述の方法にさらに関する。

本発明はまた、反芻動物が、畜牛、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ヌー、カモシカ、プロングホーン、およびニルガイからなる群、より好ましくは畜牛、ヤギ、およびヒツジからなる群から選択される、上述の方法にも関する。

本発明はまた、反芻動物に投与される式（Ｉ）で定義される少なくとも１つの活性化合物の量が、１ｋｇの飼料あたり約１ｍｇ〜約１０ｇ、好ましくは約１０ｍｇ〜約１ｇであり、より好ましくは１ｋｇの飼料あたり５０ｍｇ〜５００ｍｇの化合物である、上述の方法にも関する。

本発明はまた、乾物摂取量キログラムあたりリットルで計算される反芻動物におけるメタン産生が、代謝チャンバー内で測定すると、少なくとも１０％減少する上述の方法にも関する。好ましくは、メタン減少は少なくとも１５％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも３０％である。レーザー光線の使用、または酪農反芻動物では、メタン産生とミルク中ＶＦＡプロフィールの相関などの代案のメタン排出測定もまた使用してもよい。

本発明はまた、反芻動物飼料要求率が、従来の性能試験で測定すると少なくとも１％低下する上述の方法にも関する。好ましくは、飼料要求率は、少なくとも２％、より好ましくは少なくとも２．５％、さらにより好ましくは少なくとも３％、最も好ましくは少なくとも３．５％低下する。

本発明の範囲を制限するものではない以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。

［実施例］
［実施例１：メタン産生の生体外試験］
この生体外システムによって模倣される、反芻胃機能に対する特定の化合物の効果を試験するために、「Ｈｏｈｅｎｈｅｉｍ茎葉飼料値試験（ＨＦＴ）」の修正版を使用した。

［原理：］
飼料を反芻胃液組成物および適切な緩衝液混合物と共に、シリンジ内に供給する。溶液を３９℃でインキュベートする。８時間後、メタン生成量（および組成）が測定され、変換のために式に入れられる。

［試薬：］
［質量要素溶液：］
−６．２ｇカリウム二水素リン酸塩（ＫＨ_２ＰＯ_４）
−０．６ｇ硫酸マグネシウム七水和物（ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）
−９ｍｌ濃縮リン酸（１ｍｏｌ／ｌ）
−蒸留水に溶解して１ｌにする（ｐＨ約１．６）
［緩衝溶液：］
−３５．０ｇ炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）
−４．０ｇ炭酸水素アンモニウム（（ＮＨ_４）ＨＣＯ_３）
−蒸留水に溶解して１ｌにする
［微量ミネラル溶液：］
−１３．２ｇ塩化カルシウム二水和物（ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ）
−１０．０ｇ塩化マンガン（ｌｌ）四水和物（ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ）
−１．０ｇ塩化コバルト（ｌｌ）六水和物（ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）
−８．０ｇ塩化鉄（ｌｌｌ）（ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）
−蒸留水に溶解して１００ｍｌにする
［ナトリウム塩溶液：］
−１００ｍｇナトリウム塩
−蒸留水に溶解して１００ｍｌにする
［還元液：］
−最初に３ｍｌの水酸化ナトリウム（ｃ＝１ｍｏｌ／ｌ）、次に４２７．５ｍｇの硫化ナトリウム水和物（Ｎａ_２Ｓ・Ｈ_２Ｏ）を７１．２５ｍｌのＨ_２Ｏに添加する
−溶液は、媒体液にそれを添加するすぐ前に調製しなくてはならない

［手順：］
［サンプル秤量：］
通常はＴＭＲ（４４％濃縮物、６％乾草、３７％トウモロコシサイレージ、および１３％牧草サイレージ）である飼料を１ｍｍの篩に掛けて、６４本のシリンジ内に正確に秤量する。これらのシリンジの４本は、試験化合物の効果なしにガス生成を示す基質対照である。別の４本のシリンジは、ブロモエタンスルホネートが０．１ｍＭ添加される陽性対照である。必要であれば、４本のシリンジはキャリア対照を含有する（試験化合物がキャリアを要する場合）。残りのシリンジは、４本のシリンジを１群として試験物質を含有する。

［媒体液の調製：］
構成要素を以下の順にＷｏｕｌｆｆボトル内で混合する。
−７１１ｍｌの水
−０．１８ｍｌの微量ミネラル溶液
−３５５．５ｍｌの緩衝溶液
−３５５．５ｍｌの質量要素溶液
完成溶液を３９℃に加温し、１．８３ｍｌのナトリウム塩溶液の添加、３６℃の還元液の添加がそれに続く。指示薬が無色になったら、反芻胃液を添加する。

［反芻胃液の抽出：］
持続的撹拌とＣＯ_２ガス処理の下で、７５０ｍｌの反芻胃液をおよそ１，４００ｍｌの媒体液に添加する。

［シリンジ充填、インキュベーション、およびガス容積とＶＦＡ値の測定：］
希釈反芻胃液（２４ｍｌ）をガラスシリンジに添加する。次にシリンジを穏やかに撹拌しながら、３９℃で８時間インキュベートする。８時間後、生成ガス容積を測定し、ガスクロマトグラフィーによって気相中のメタン百分率を判定する。

［結果］
発酵された食物は、人工ＴＭＲ（４４％濃縮物、６％乾草、３７％トウモロコシサイレージ、および１３％牧草サイレージ）であった。実施例３〜２０に記載するようにして生成された化合物を、乾燥物質（ＤＭ）の２〜０．０１％の濃度で発酵シリンジに添加した。結果を以下の表に示す。

［実施例２：メタン抑制の生体内試験］
［１．材料と方法］
実験デザインは、各期間中の処置あたり２匹のヒツジを用いた、交差法からなった。試験は次の３連続期間からなった。チャンバー内における１４日間の用量への適応と、それに加えて３日間の連続的メタン測定。この１４日間の適応相は、連続期間中にアッセイされる異なる用量間の洗い出しに必要な期間として、確立された。チャンバー内でのメタン測定の最後の２日間、朝の給餌の２時間後に反芻胃内容物サンプルを収集し、副標本を採って、ＤＮＡの抽出および揮発性脂肪酸とアンモニア窒素濃度の測定前に、即座に凍結した。実験動物は、２匹ずつの３つの下位群に無作為に配分し、３種の処置（対照、用量１、および用量２）の１つを割り当てた。３つの下位群は、チャンバー内でのメタン測定に先だって同数の適応日を有するように、３日間間隔で適応期間を開始した。各動物はケージ内で飼育し、新鮮な水が常にあるようにした。動物に提供される食餌は、エネルギー必要量維持レベルのおよそ１．１倍である、１：１の比率の１５〜２０ｃｍに刻んだアルファルファ乾草と濃縮物（Ｐｒｉｅｔｏら，１９９０）に、ミネラル−ビタミン補給剤を加えたものからなった。試験全体を通じて、新鮮物摂取について各動物を毎日モニターした。食餌は、９時および１４時に、２回の等しい飼料で動物に提供された。

添加剤は、反芻胃カニューレを通じて、餌と同時に日に２回提供される。反芻胃内に入れる直前に、各用量の対応する量を１０グラムの粉砕濃縮物に添加し、セルロース紙に包んだ。活性分子の揮発減量を避けるために、双方の添加剤を４℃の低温室内に保ち、そこにおいてセルロースバッグ内へ定量供給する日課を実施した。

用量は毎日５０（用量１）および５００（用量２）ｍｇ／動物であった。より高い用量は、適応期間全体が結果的にさらに３日間延長するように、３日間の漸進的増大（５０、２００、および５００ｍｇ）後に達成された。

この実験で試験された添加剤は、式、

のエチル−３−ニトロオキシプロピオネートであった。

［メタン測定］
１４日目に、連続３日間のメタン測定のために、動物をチャンバー内に誘導した。各チャンバーは、幅１．８ｍ×奥行き１．８ｍ×高さ１．５ｍであった。チャンバーの気温は、１５〜２０℃に保った。各チャンバー内では、動物を適応期間と同一のケージ内で個別に拘束した。中断は、毎日チャンバー床が掃除されて動物が給餌される、８時３０分に起きた。流動は毎日３回計算してから平均し、２３時間排出値を導き出したので、これらの中断は、日々の排出にわずかな影響しか及ぼさない。各チャンバーの吸気および排気ダクトについて、気流とメタン濃度を測定した。各チャンバーの各吸気および排気ダクト内で、気流速度を連続的に１日中モニターした。３つの各ダクト中の気流（チャンバー１、チャンバー２、およびバックグラウンド）の副標本を採り、ガス分析器ＡＤＭ ＭＧＡ３０００（Ｓｐｕｒｌｉｎｇ ｗｏｒｋｓ，Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）を使用して、メタン濃度を連続的に測定した。双方のチャンバー（チャンバー１および２では３分間、バックグラウンドでは２分間）において、全ての吸気および排気ダクトで逐次、気流のサンプル採取をするのに８分かかった。要約すれば、各チャンバーのメタン流量は、新鮮吸気とチャンバー排気メタン濃度の差、および気流速度から、３日間の測定期間のそれぞれで計算した。

［反芻胃サンプル分析］
反芻胃内容物のサンプルを凍結乾燥して、ビーズビーター（Ｍｉｎｉ−ｂｅａｄ Ｂｅａｔｅｒ；ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ，ＵＳＡ）を使用して物理的破壊によって十分混合してから、溶解インキュベーションでより高い温度（９５℃）を使用する修正を加えて、製造業者の使用説明書に従ってＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｌｔｄ，Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）を使用し、およそ５０ｍｇのサンプルからＤＮＡを抽出した。ＤＮＡサンプルを定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅のテンプレートとして使用した。リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、総細菌数、総原生動物数、および総メタン産生古細菌数を定量化した。

異なるプライマーセットを使用して、１６Ｓ ｒＲＮＡ標的遺伝子組換え総細菌（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｉｎｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３９，８１−８６，２００３）、および原生動物（Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ．８８，２０８３−２０９５ ２００５）を増幅した。メタン産生古細菌を検出するために設計されたプライマーは、メチル補酵素Ｍ還元酵素（ｍｃｒＡ）遺伝子（Ｄｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｃｏｌｏｇｙ．６２，３１３−３２２，２００７）を標的とする。増幅混合物は、最終容積２３μｌ中に、１１．５μｌの２×ＲＴ−ＰＣＲ ｓｕｐｅｒｍｉｘ ＢｉｏＲａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、０．４μｌの各プライマー（５０ｐｍｏｌ）、および０．５μｌのサンプルを含有した。各プライマーペアについて、以下のプログラムによって増幅効率を評価した。９５℃で５分間のサイクル、９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で５５秒間の４０サイクル、および６秒間の蛍光放射測定中は７５℃。温度を５５℃から９５℃に増大させて融解曲線を構築し、５℃毎に読み取った。各標的群の増幅は、以下のプログラムで実施した。９５℃で５分間のサイクル、９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、および７２℃で４５秒間（蛍光放射測定を含む）の４０サイクル、および設定値温度４５℃で終了温度９５℃の融解曲線。ＤＮＡコピー数で表される細菌、原生動物、およびメタン産生古細菌の絶対量は、標準を使用して測定された。ｑＰＣＲ標準は、プラスミドｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）からなった。それぞれのプライマーセットを使用して得られるＰＣＲ産物を精製し、次にＰＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）にクローンして、組換えプラスミドを作成した。ＰＣＲを使用して予期される挿入断片について確認された単一コロニーを、抗生物質およびＸ−ｇａｌ添加固体培地で一晩培養した。その後、形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーのスクリーニングを実施して陽性コロニーのいくつかを無作為に選択した。ＰＣＲによってコロニー中の挿入断片存在についてチェックした後、陽性コロニーの大量培養を液体培地内で一晩行った。Ｐｕｒｅ Ｌｉｎｋ^ＴＭ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、これらの培養物に属するプラスミドを抽出し、次に配列決定して挿入断片の存在を確認した。プラスミドＤＮＡの濃度と、挿入断片のあるベクターの分子量とを使用して、プラスミド抽出物中に存在する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を計算した。濃縮プラスミドを連続的希釈（１０−ｆｏｌｄ）して、１０^８〜１０^２範囲のコピーを提供した。連続希釈サンプルを使用して、標準曲線を作成した。

揮発性脂肪酸をガスクロマトグラフィーによって分析し、アンモニアＮ濃度を（Ｃａｎｔａｌａｐｉｅｄｒａ−Ｈｉｊａｒ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．８７，６２２−６３１，２００９）に従って、比色定量で分析した。

［統計学的分析］
個別メタン排出、ＶＦＡプロフィール、酢酸とプロピオン酸の比率、アンモニアＮ濃度、および総細菌、総原生動物、およびメタン産生古細菌濃度のｌｏｇ_１０変換を以下の効果について分析した。添加剤用量、測定日、および実験の交差法配置下における分散の反復測定分析を使用した、それらの相互作用。各分析について標準誤差（ＳＥＭ）を計算した。測定日の顕著な効果、またはその添加剤用量との相互作用はいずれの実験でも検出されず、したがって用量の効果のみを表に含める。最小有意差（ＬＳＤ）手順を使用して、手段をさらに比較した。データ入力と統計学的分析のために、ＳＰＳＳ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ，ｖｅｒｓｉｏｎ １４．０（２００５；ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用した。

［２．結果］
新鮮物摂取は、試験動物の適応期間中に変化しなかった。同様に、体重（チャンバー測定前後の体重の平均としての）は、処置間で異ならなかった（表３）。統計的差違（Ｐ＜０．０５）は高用量を使用した場合にのみ達成されたが、エチル−３−ニトロオキシプロピオネート添加剤を食餌に組み込むと、正味のまたは重量／摂取単位当たりのメタン排出が顕著に減少した。観察された減少は、用量１および２でそれぞれ１８％および２９％であり、各期間の開始７日後に得られた中間値が、上述したのと同じ傾向を示したことから、適応の最初の数日間に起きたようであった。

反芻胃発酵パラメータの研究は、添加剤を与えた動物、特により高用量で処置した動物の反芻胃内で、プロピオン酸タイプのプロフィールに向かう、発酵経路中のシフト（表４）を示した。これは添加剤用量の増大に連動する、酢酸とプロピオン酸比率の低下（Ｐ＜０．０５）に反映された。アンモニアＮ濃度は、処置間で同様であった。

反芻胃内における主要微生物群の濃度の研究は、処置間の差を示さなかった。しかし動物に、より高用量の添加剤を与えると、総細菌およびメタン産生古細菌では、それぞれ数的増大と数的減少が観察された。

［３．結論］
エチル−３−ニトロオキシプロピオネートは、Ｈ_２転移に関与する代謝経路中にシフトを引き起こす、メタン産生の強力な阻害剤のようである。

［実施例３：エチル３−ニトロキシ−プロピオネートの合成］

１５０ｍｌのアセトニトリルに溶解した３０ｍｍｏｌのエチル３−ブロモプロピオネートと、７５ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で５時間撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で抽出した。水相をジクロロメタンで再度洗浄した。合わせた有機相を水および鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、４．８８ｇ（２９．９ｍｍｏｌ、９９．７％）が残った。

［実施例４：３−ニトロキシ−プロピオン酸の合成］

１２０ｍｌのアセトニトリルに溶解した１４．６ｍｍｏｌの３−ブロモプロピオン酸と、３６．５ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で７時間撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で抽出した。水相をジクロロメタンで再度洗浄した。合わせた有機相を水および鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、１．１７ｇが残った。

ヘキサン／酢酸エチル４：１を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：０．５１ｇ（３．７７ｍｍｏｌ、２５．８％）。

［実施例５：エチル４−ニトロキシ−ブタノエートの合成］

１２０ｍｌのアセトニトリルに溶解した１４．６ｍｍｏｌのエチル４−ブロモブタノネート（４−ｂｒｏｍｏｂｕｔａｎｏｎａｔｅ）と、３６．５ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で７時間撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で抽出した。水相をジクロロメタンで再度洗浄した。合わせた有機相を水および鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、２．６３ｇが残った。

ヘキサン／酢酸エチル４：１を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：１．９ｇ（１０．７ｍｍｏｌ、７３．５％）。

［実施例６：４−ニトロキシ−ブタン酸の合成］

１１５ｍｌのアセトニトリルに溶解した１４．１ｍｍｏｌの４−ブロモブタン酸と、３５．１ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で６時間撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で抽出した。水相をジクロロメタンで再度洗浄した。合わせた有機相を水および鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、１．０４ｇが残った。

ヘキサン／酢酸エチル４：１を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：０．５４ｇ（３．６ｍｍｏｌ、２５．４％）。

［実施例７：エチル５−ニトロキシ−ペンタノエートの合成］

１１５ｍｌのアセトニトリルに溶解した１４．１ｍｍｏｌの５−ブロモ吉草酸エチルと、３５．１ｍｍｏｌの亜硝酸銀を遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で６時間撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で抽出した。水相をジクロロメタンで再度洗浄した。合わせた有機相を水および鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、２．６６ｇが残った。

ヘキサン／酢酸エチル４：１を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：２．２３ｇ（１１．７ｍｍｏｌ、８３％）。

［実施例８：５−ニトロキシ−ｖペンタン酸（ｖｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）の合成］

７８．７ｍｍｏｌの５−ブロモ吉草酸２００ｍｌのアセトニトリル（７８．７ ｍｍｏｌ ５−ｂｒｏｍｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ ２００ ｍｌ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）と、１９６．７５ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で４時間３０分撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣を水に溶解し、ＴＭＢＥで２回抽出した。有機相を水および鹹水で洗浄し、合わせてＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、７．５４ｇが残った。

ヘプタン／酢酸エチル１：１を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：７．１９ｇ（４４．１ｍｍｏｌ、５６．０％）。

［実施例９：エチル２−ニトロキシ−プロピオネートの合成］

１１５ｍｌのアセトニトリルに溶解した１４．１ｍｍｏｌのエチル２−ブロモプロピオネートと、３６．１ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で６時間撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で抽出した。水相をジクロロメタンで再度洗浄した。合わせた有機相を水および鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、２．０２ｇ（１２．４ｍｍｏｌ、８８．１％）が残った。

［実施例１０：エチル６−ニトロオキシ−ヘキサノエートの合成］

１００ｍｌのアセトニトリルに溶解した４８．８０ｍｍｏｌのエチル６−ブロモヘキサノエートと、１２２．０ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で１９時間撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で抽出した。水相をジクロロメタンで再度洗浄した。合わせた有機相を水および鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、１０．０６ｇが残った。

ヘキサン／酢酸エチル４：１を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：９．７２ｇ（４７．４ｍｍｏｌ、９７．１％）。

［実施例１１：６−ニトロオキシ−ヘキサン酸の合成］

１９．１ｍｍｏｌのエチル６−ニトロオキシ−ヘキサノエートを２２２ｍｌのメタノール／ＴＨＦ１：１に溶解した。３７．５ｍｌの１Ｍ水酸化リチウム水溶液を反応に添加して、濁った溶液を５０℃で１８時間加熱した。室温への冷却後、溶液を真空内で濃縮した。溶液のｐＨレベルを２５％ＨＣｌで１に低下させ、ＴＭＢＥで２回抽出した。有機相を合わせて鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、３．４３ｇが残った。

ヘキサン／酢酸エチル１：１を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：２．９６ｇ（１６．７ｍｍｏｌ、８７．５％）。

［実施例１２：メチル３−ニトロキシ−プロピオネートの合成］

４０ｍｌのアセトニトリルに溶解した１０ｍｍｏｌのメチル３−ブロモプロピオネートと、２５ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で５時間撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で抽出した。水相をジクロロメタンで２回再度洗浄した。合わせた有機相を水および鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、１．３９ｇが残った。

ヘキサン／酢酸エチル５：１を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：０．４３ｇ（２．９ｍｍｏｌ、２８％）。

［実施例１３：エチル３−ニトロキシ−ブタノエートの合成］

８０ｍｌのアセトニトリルに溶解した１４．１ｍｍｏｌのエチル３−ブロモブタノエートと、３５．１ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で５時間撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で抽出した。水相をジクロロメタンで２回再度洗浄した。合わせた有機相を水および鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、２．０３ｇが残った。

ヘキサン／酢酸エチル５：１を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率１．３５ｇ（７．６ｍｍｏｌ、５３．３％）。

［実施例１４：８−ニトロオキシ−オクタン酸の合成］

６０ｍｌのアセトニトリルに溶解した２１．７５ｍｍｏｌの８−ブロモオクタン酸と、５４．４ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で２０時間３０分撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣を水に溶解し、ＴＭＢＥで抽出した。有機相を水および鹹水で洗浄し、合わせてＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、４．４４ｇが残った。

ヘプタン／酢酸エチル１：１を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：３．９９ｇ（１９．４ｍｍｏｌ、８９．４％）。

［実施例１５：エチル８−ニトロオキシ−オクタノエートの合成］

８０ｍｌのアセトニトリルに溶解した２０．０ｍｍｏｌのエチル８−ブロモオクタノエートと、５０．０ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で１８時間撹拌した。室温への冷却後、懸濁液をシリカゲル上で濾過して酢酸エチルで洗浄し、真空内で濃縮した。

ヘプタン／酢酸エチル４：１を使用して、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：４．３５ｇ（１８．６ｍｍｏｌ、９３．２％）。

［実施例１６：エチル１１−ニトロオキシ−ウンデカノエートの合成］

６０ｍｌのアセトニトリルに溶解した１３．８ｍｍｏｌのエチル１１−ブロモウンデカノエートと、３４．６ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を６０℃で１９．５時間撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を真空内で濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、水で抽出した。水相をジクロロメタンで再度洗浄した。合わせた有機相を水および鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、４．８６ｇが残った。

ヘプタン／酢酸エチル２０：１を使用してシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：３．６ｇ（１３．１ｍｍｏｌ、９５．０％）。

［実施例１７：１１−ニトロオキシ−ウンデカン酸の合成］

６０ｍｌのアセトニトリルに溶解した１８．７ｍｍｏｌの１１−ブロモウンデカン酸と、４６．６ｍｍｏｌの亜硝酸銀とを遮光したフラスコに入れた。この懸濁液を７０℃で２１時間３０分撹拌した。室温への冷却後、懸濁液を濾過して真空内で濃縮した。残渣を水に溶解し、ＴＭＢＥで抽出した。有機相を水および鹹水で洗浄した、合わせて、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させて溶剤を真空中で除去すると、４．３４ｇが残った。

ヘプタン／酢酸エチル２：１を使用してシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって粗生成物を精製した。収率：４．０１ｇ（１６．１ｍｍｏｌ、８６．２％）。

［実施例１８：５−ニトロオキシ−ペンタン酸メチルアミドの合成］

［５−ニトロオキシ−ペンタン酸２の合成：］
５０．０ｍＬの乾燥アセトニトリル中の５−ブロモ吉草酸１（５．００ｇ、１．０ｅｑ）溶液に、硝酸銀（５．１０ｇ、１．１ｅｑ）を添加した。反応混合物を暗下において、７０℃で２時間加熱した。得られた混合物をセライトを通して濾過し、濾液を真空下で濃縮した。残渣を塩酸（１Ｎ）（１００．０ｍＬ）水溶液に溶解し、ジクロロメタン（２×１００．０ｍＬ）で抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥させて溶剤を真空下で蒸発させ、化合物２を無色液体として得た（２．９２ｇ、収率＝６５％）。

５−ニトロオキシ−ペンタン酸メチルアミド３の合成：
０℃に冷却した乾燥ジクロロメタン（２０．０ｍＬ）中の化合物２（１．６０ｇ、１．０ｅｑ）の溶液に、トリエチルアミン（１．７０ｍＬ、１．２ｅｑ）、続いてクロロギ酸エチル（１．１０ｍＬ、１．１ｅｑ）を添加した。反応混合物を０℃で４５分間撹拌して、４０％水性メチルアミン（２０．０ｍＬ）を添加した。溶液を０℃からＲＴで１８時間撹拌し、硫酸ナトリウムを添加して反応混合物を乾燥させた。得られた混合物を濾過して、濾液を真空下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー［Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）、ジクロロメタン／メタノール１００／０→９７／３（１５ＣＶ^＊）］によって、残渣をシリカゲル上に吸着させて精製し、化合物３を無色の液体として得た（０．８４ｇ、収率＝４７％）。

最終化合物を減圧下６０℃で１８時間乾燥させた。分解を^１Ｈ ＮＭＲによって観察した。フラッシュクロマトグラフィー［Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）、ジクロロメタン／メタノール１００／０→９８／２（１５ＣＶ）、９８／２（４ＣＶ）］によって、分解化合物をシリカゲル上に吸着して精製し、化合物３を淡黄色液体として得た（０．５９ｇ、収率＝３３％）。

室温で１週間後に、さらなる分解は観察されなかった。
＊ＣＶ＝カラム体積

［実施例１９：４−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボン酸エチルエステルの合成］

０℃の発煙硝酸１００％（０．９７ｍＬ、２．０ｅｑ）に、濃硫酸９６％（１．２４ｍＬ、２．０ｅｑ）を滴下して添加した。０℃で１０分間撹拌後、ジクロロメタン（２０．０ｍＬ）中の１（２．００ｇ、１．０ｅｑ）の溶液を滴下して添加した。反応混合物を０℃〜ＲＴで３時間撹拌し、水（３０．０ｍＬ）でクエンチした。有機層を水（２０．０ｍＬ）および鹹水（２０．０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させて濾過し、真空下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー［Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）、ジクロロメタン／メタノール１００／０→９７／３（１０ＣＶ^＊）、９７／３（５ＣＶ）］によって、残渣をシリカゲル上に吸着して精製し、化合物２を無色の液体として得た（１．４７ｇ、収率＝５８％）。

［実施例２０：５−ニトロオキシ−ペンタン酸アミドの合成］

５−ニトロオキシ−ペンタン酸２の合成：
５０．０ｍＬの乾燥アセトニトリル中の５−ブロモ吉草酸１（５．００ｇ、１．０ｅｑ）の溶液に硝酸銀（５．１０ｇ、１．１ｅｑ）を添加した。反応混合物を暗下で７０℃で２時間加熱した。得られた混合物をセライトを通して濾過し、濾液を真空下で濃縮した。残渣を塩酸（１Ｎ）水溶液（１００．０ｍＬ）に溶解し、ジクロロメタン（２×１００．０ｍＬ）で抽出して、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶剤を真空下で蒸発させて、化合物２を無色の液体として得た（２．９２ｇ、収率＝６５％）。

５−ニトロオキシ−ペンタン酸アミド３の合成：
０℃に冷却した乾燥ジクロロメタン（２０．０ｍＬ）中の化合物２（１．３０ｇ、１．０ｅｑ）の溶液に、トリエチルアミン（１．３０ｍＬ、１．２ｅｑ）、続いてクロロギ酸エチル（０．８３ｍＬ、１．１ｅｑ）を添加した。反応混合物を０℃で４５分間撹拌し、３０％水性アンモニア溶液（１５．０ｍＬ）を添加した。溶液を０℃〜ＲＴで１８時間撹拌し、硫酸ナトリウムを乾燥混合物に添加した。得られた混合物を濾過して、濾液を真空下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー［Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）、ジクロロメタン／メタノール１００／０→９８／２（１２ＣＶ^＊）、９８／２（６ＣＶ）］によって、残渣をシリカゲル上に吸着して精製し、化合物３を白色固体として得た（１．１０ｇ、収率＝８５％）。

最終化合物を６０℃減圧下で１８時間乾燥させた。分解を^１Ｈ ＮＭＲによって観察した。フラッシュクロマトグラフィー［Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）、ジクロロメタン／メタノール１００／０→９８／２（１２ＣＶ）、９８／２（６ＣＶ）］によって、分解化合物をシリカゲル上に吸着して精製し、化合物３を白色固体として得た（０．９０ｇ、収率＝７０％）。

室温で１週間後に、さらなる分解は観察されなかった。

Claims (14)

1. 反芻動物の消化活動から生じるメタン形成を減少させるための、および／または反芻動物の能力を改善するための組成物であって、
   少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体を動物飼料中の活性化合物として含み、
   前記少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体が、３−ニトロオキシプロピオン酸、メチル−３−ニトロオキシプロピオネート、エチル−３−ニトロオキシプロピオネート、エチル−４−ニトロオキシ−ブタノエート、エチル−３−ニトロオキシ−ブタノエート、５−ニトロオキシペンタン酸、エチル−５−ニトロオキシペンタノエート、６−ニトロオキシヘキサン酸、エチル−６−ニトロオキシヘキサエート、エチル−４−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボキシレート、８−ニトロオキシオクタン酸、エチル−８−ニトロオキシオクタノエート、１１−ニトロオキシウンデカン酸、エチル−１１−ニトロオキシウンデカノエート、５−ニトロオキシ−Ｎ−ペンタン酸アミド、および５−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−ペンタン酸アミドからなる群から選択される、組成物。
2. 前記反芻動物の能力の改善が、飼料要求率の改善、飼料摂取量の低下、体重増加の改善、屠体収率の改善及び／又は乳量の改善である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ニトロオキシアルカン酸またはその誘導体が、二硫化ジアリル、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体からなる群から選択される、少なくとも１つの追加的活性物質と組み合わせられる、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記反芻動物が、畜牛、ヤギ、ヒツジ、キリン、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、ヌー、カモシカ、プロングホーン、およびニルガイからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 乾物摂取量キログラムあたりリットルで計算される反芻動物におけるメタン産生が、代謝チャンバー内で測定すると少なくとも１０％減少する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記反芻動物に投与される前記少なくとも１つのニトロオキシアルカン酸および／またはその誘導体の量が、飼料１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｇである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 飼料組成物または飼料添加剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. ミネラルプレミックス、ビタミンプレミックス、またはビタミンおよびミネラルを含むプレミックス、または大丸薬である、請求項７に記載の組成物。
9. 十分な量の少なくとも１つの活性化合物を経口的に投与するステップを含んでなる、反芻動物の消化活動から生じるメタン産生を減少させ、および／または反芻動物の能力を改善する方法であって、
   前記少なくとも１つの活性化合物が、３−ニトロオキシプロピオン酸、メチル−３−ニトロオキシプロピオネート、エチル−３−ニトロオキシプロピオネート、エチル−４−ニトロオキシ−ブタノエート、エチル−３−ニトロオキシ−ブタノエート、５−ニトロオキシペンタン酸、エチル−５−ニトロオキシペンタノエート、６−ニトロオキシヘキサン酸、エチル−６−ニトロオキシヘキサエート、エチル−４−ニトロオキシ−シクロヘキシルカルボキシレート、８−ニトロオキシオクタン酸、エチル−８−ニトロオキシオクタノエート、１１−ニトロオキシウンデカン酸、エチル−１１−ニトロオキシウンデカノエート、５−ニトロオキシ−Ｎ−ペンタン酸アミド、および５−ニトロオキシ−Ｎ−メチル−ペンタン酸アミドからなる群から選択される、方法。
10. 前記反芻動物の能力の改善が、飼料要求率の改善、飼料摂取量の低下、体重増加の改善、屠体収率の改善及び／又は乳量の改善である、請求項９に記載の方法。
11. 前記活性化合物が、二硫化ジアリル、ニンニク油、アリルイソチオシアネート、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１つの追加的活性物質と組み合わされて動物に投与される、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 前記反芻動物が、畜牛、ヤギ、およびヒツジからなる群から選択される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記少なくとも１つの活性化合物が、飼料中に組み込まれるものであり、前記反芻動物に投与される前記少なくとも１つの活性化合物の量が、飼料１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｇである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 乾物摂取量キログラムあたりリットルで計算される反芻動物におけるメタン産生が、代謝チャンバー内で測定すると少なくとも１０％減少する、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。