JP2015502528A5

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Publication number: JP2015502528A5
Application number: JP2014540079A
Authority: JP
Filing date: 2012-11-01
Publication date: 2015-12-24
Anticipated expiration: 2032-11-01

Description

実施例２血清からの前立腺特異抗原（PSA）のアフィニティー抽出
実施例１の結果を実証するために、ヒトPSAを羊血清中に添加し、10ng／mLの濃度にし、1.0mLの試料を、コーティングされたシリカビーズ、磁気ビーズ（ダイナビーズ（Dynabeads））、及びアガロース（セファロース（Sepharose））ビーズにより抽出した。抽出したPSAを、25μLのトリフルオロ酢酸及びシナピン酸のアセトニトリル／水の溶液中に溶出した。マススペクトルをMALDIプレート上に配置された1μLのアリコートから測定した。３回の繰返し実験を実施した。図３のマススペクトルに示されているように、コーティングされたシリカビーズのみが、測定可能な量のPSAを首尾よく抽出した。マススペクトルは本発明の方法が高い選択性を有していることを示しており、分析されるタンパク質が約10ng/mLの濃度の場合、血清タンパク質からの干渉は微量であることを意味している。
本発明の実施形態として、例えば以下を挙げることができる。
(1) a.固体担体、及び
b.固体担体上の表面コーティング
を含むクロマトグラフィーマトリックスであって、
表面コーティングがコポリマー及び結合リガンドを含み、コポリマーがアクリルアミド及び第２のモノマーを含む、
クロマトグラフィーマトリックス。
(2) 第２のモノマーが、メタクリル酸；アクリル酸；アクリル酸のディールスアルダー付加体、メチル、エチル、ブチル、イソブチル、エチルヘキシル、ラウリル、ステアリル、ヒドロキシエチル、及びジメチルアミノエチルを含むメタクリレート；メチル、エチル、ブチル、イソブチル、t-ブチル、エチルヘキシル、ラウリル、ステアリル及びヒドロキシエチルを含むアクリレート；グリシジルメタクリレート；トリアルコキシシランメタクリレート；アクリロニトリル；2-イソプロペニル-2-オキサゾリン；スチレン；α-メチルスチレン；ビニルトルエン；ジクロロスチレン；N-ビニルピロリジノン、ビニルアセテート、メタクリルオキシプロピルトリアルコキシシラン、メタクリルオキシメチルトリアルコキシシラン、ビニルクロライド；2-（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート；無水マレイン酸；ジブチルマレエート；ジシクロヘキシルマレエート；ジイソブチルマレエート；ジオクタデシルマレエート；N-フェニルマレイミド；シトラコン酸無水物；テトラヒドロフタル酸無水物；ブロモマレイン酸無水物；クロロマレイン酸無水物；ナディック酸無水物；メチルナディック酸無水物；アルケニルコハク酸無水物；マレイン酸；フマル酸；ジエチルフマレート；イタコン酸；シトラコン酸；クロトン酸；及びこれらの混合物を含む、(1)に記載のマトリックス。
(3) 第２のモノマーが、グリシドキシルメタクリレート、メタクリレート、又は2-（ジメチルアミノ）エチルメタクリレートを含む、(1)に記載のマトリックス。
(4) コポリマー中の第２のモノマー：アクリルアミドの比率が、約20:1〜約1:200の範囲である、(1)に記載のマトリックス。
(5) 第２のモノマーがグリシドキシルメタクリレートであり、コポリマー中のグリシドキシルメタクリレート：アクリルアミドの比率が約1:20である、(1)に記載のマトリックス。
(6) 固体担体が、二酸化ケイ素を含む、(1)に記載のマトリックス。
(7) 固体担体が、二酸化ケイ素粒子又は二酸化ケイ素の多孔性モノリスを含む、(1)に記載のマトリックス。
(8) 固体担体が、無孔性二酸化ケイ素粒子である、(1)に記載のマトリックス。
(9) 固体担体が、2μm以下の直径を有する二酸化ケイ素粒子である、(1)に記載のマトリックス。
(10) 結合リガンドが、ストレプトアビジン、プロテインA、プロテインG、抗体、ヘキサヒスチジン及び金属親和性剤からなる群から選択される、(1)に記載のマトリックス。
(11) 結合リガンドが、ニッケルニトリロアミンである、(1)に記載のマトリックス。
(12) 混合物からターゲット分子を精製又は抽出する方法であって、
a.混合物を、固体担体及び固体担体上の表面コーティングを含むマトリックスと接触させる工程であって、表面コーティングはコポリマー及び結合リガンドを含み、コポリマーはアクリルアミド及び第２のモノマーを含み、結合リガンドがターゲット分子に結合する工程；及び
b. マトリックスを、リガンドからターゲット分子を放出させる溶離液と接触させることによりターゲット分子を回収する工程
を含む、方法。
(13) 工程aと工程bの間に、マトリックスを、結合していない物質をマトリックスから除去することができる洗浄溶液と接触させる工程を更に含む、(12)に記載の方法。
(14) 混合物が、血清、細胞溶解物、血清の抽出物、細胞溶解物の抽出物又はタンパク質医薬品である、(12)に記載の方法。
(15) ターゲット分子が、タンパク質、ペプチド、核酸、糖タンパク質及び糖を含む、(12)に記載の方法。
(16) 約500pM未満で存在する混合物からターゲット分子を精製又は抽出することができる、(12)に記載の方法。
(17) 約50fmol未満で存在する混合物からターゲット分子を精製又は抽出することができる、(12)に記載の方法。

Claims

a.固体担体、及び
b.固体担体上の表面コーティング
を含むアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであって、
表面コーティングがコポリマーを含み、コポリマーがアクリルアミドと、グリシドキシルメタクリレート、メタクリレート、又は2-（ジメチルアミノ）エチルメタクリレートを含む第２のモノマーとを含み、コポリマー中の第２のモノマー：アクリルアミドのモル比率が、約20:1〜約1:200の範囲である、前記マトリックス。
表面コーティングが、結合リガンドを更に含む、請求項1に記載のマトリックス。
結合リガンドが、ストレプトアビジン、プロテインA、プロテインG、抗体、ヘキサヒスチジン及び金属親和性剤からなる群から選択される、請求項2に記載のマトリックス。
第２のモノマーがグリシドキシルメタクリレートであり、コポリマー中のグリシドキシルメタクリレート：アクリルアミドのモル比率が約1:5〜約1:200である、請求項1に記載のマトリックス。
第２のモノマーがグリシドキシルメタクリレートであり、コポリマー中のグリシドキシルメタクリレート：アクリルアミドのモル比率が約1:20である、請求項1に記載のマトリックス。
固体担体が、二酸化ケイ素を含む、請求項1に記載のマトリックス。
固体担体が、二酸化ケイ素粒子又は二酸化ケイ素の多孔性モノリスを含む、請求項1に記載のマトリックス。
固体担体が、無孔性二酸化ケイ素粒子である、請求項1に記載のマトリックス。
固体担体が、2μm以下の直径を有する二酸化ケイ素粒子である、請求項1に記載のマトリックス。
固体担体が、約50nm〜約500nmの直径を有する二酸化ケイ素粒子である、請求項1に記載のマトリックス。
混合物からターゲット分子を精製又は抽出する方法であって、
a. 混合物を、固体担体及び固体担体上の表面コーティングを含むマトリックスと接触させる工程であって、表面コーティングはコポリマー及び結合リガンドを含み、コポリマーはアクリルアミドと、グリシドキシルメタクリレート、メタクリレート、又は2-（ジメチルアミノ）エチルメタクリレートを含む第２のモノマーとを含み、コポリマー中の第２のモノマー：アクリルアミドのモル比率は、約20:1〜約1:200の範囲であり、結合リガンドがターゲット分子に結合する工程；及び
b.マトリックスを、リガンドからターゲット分子を放出させる溶離液と接触させることによりターゲット分子を回収する工程
を含む、方法。
工程aと工程bの間に、マトリックスを、結合していない物質をマトリックスから除去することができる洗浄溶液と接触させる工程を更に含む、請求項11に記載の方法。
混合物が、血清、細胞溶解物、血清の抽出物、細胞溶解物の抽出物又はタンパク質医薬品である、請求項11に記載の方法。
ターゲット分子が、タンパク質、ペプチド、核酸、糖タンパク質及び糖を含む、請求項11に記載の方法。
約500pM未満で存在する混合物からターゲット分子を精製又は抽出することができる、請求項11に記載の方法。
約50fmol未満で存在する混合物からターゲット分子を精製又は抽出することができる、請求項11に記載の方法。