JP2015221001A - 脂質の生体内沈着抑制剤、飼料および飼育方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、このような問題に対処するためになされたもので、廃棄されていた上記柚子の外果皮および抽出粕の有効利用を図る。また、この柚子外果皮および抽出粕を含む脂質の生体内沈着抑制剤の提供を目的とする。
本発明は、内臓脂肪を減少させることで肉質を改善することができる養魚用飼料、およびこの飼料を用いた飼育方法の提供を目的とする。
上記物質が上記柑橘類の果汁部分を除いた外果皮であり、特に冷凍乾燥後、粉末化して得られる外果皮であることを特徴とする。
上記物質が上記柑橘類の果汁部分を搾汁後、該搾汁粕を有機溶媒により抽出して得られる抽出物を除いた、抽出粕であることを特徴とする。該有機溶媒がn−ヘキサンであることを特徴とする。
上記柑橘類が柚子であることを特徴とする。
上記動物が養魚類であることを特徴とする。
本発明の飼料は上記脂質の生体内沈着抑制剤が配合されていることを特徴とする。特に養魚用飼料であることを特徴とする。
本発明の飼育方法は、血中中性脂肪濃度および内臓脂肪量を減少させることのできる動物の飼育方法であって、過剰給餌により肥満誘導を行なう工程と、上記脂質の生体内沈着抑制剤が配合されている飼料を給餌する工程とを含むことを特徴とする。
本発明の他の飼育方法は、飼育対象動物の脂肪量を所定の脂肪量に調節することができる動物の飼育方法である。この飼育方法は、飼育対象動物の脂肪量をモニタリングするモニタリング工程と、このモニタリング工程後に飼料を給餌する給餌工程とを備え、上記モニタリングされた脂肪量が上記所定の脂肪量より多い場合は、上記給餌工程において上記脂質の生体内沈着抑制剤が配合されている飼料の給餌量をモニタリング時より増加し、上記モニタリングされた脂肪量が上記所定の脂肪量より少ない場合は、上記給餌工程において上記脂質の生体内沈着抑制剤が配合されている飼料の給餌量をモニタリング時より減少させることを特徴とする。
例えば、柚子の外果皮または柚子を搾汁した後の搾汁粕を搾汁直後に冷凍する。冷凍温度としては−5℃〜−30℃、好ましくは−15℃〜−20℃である。冷凍することにより、搾汁粕の変質や腐敗を防ぐことができる。また、香り成分などの揮発性成分の揮散を防ぐことができる。
溶媒抽出前に冷凍物を粉砕して冷凍粉砕物とする。粉砕は撹拌ミルで行なうことができる。粉砕後の大きさは5mm以下が好ましい。搾汁粕の場合、搾汁粕自身が繊維状態であるので、冷凍後、粉砕しない場合もある。
また、ノルマルヘキサン100質量%の試薬を用いることができる。
上記柚子の外果皮、ノルマルヘキサン抽出粕を食事負荷による肥満モデルゼブラフィッシュに投与して、血中中性脂肪および内臓脂肪量を測定することにより、脂質沈着を抑制する効果について評価した。
上記外果皮および抽出粕は、凍結乾燥・粉砕して、篩目700μmの篩を通過する顆粒にして評価試験に供した。
また、オーラプテンを0.1質量%、0.2質量%それぞれ含有するグルテン顆粒を準備し、使用前に気密容器内に4℃で保存した。オーラプテンは柚子の外果皮に豊富に含まれるプレニルオキシクマリンの一種である。柚子の外果皮に含まれるこのオーラプテンが脂質の生体内沈着抑制に関与しているのかどうかを調べるためにオーラプテン入りグルテン顆粒を準備した。
オーラプテンの含有量は乾燥重量で、柚子の外果皮が0.1〜0.3mg/g、ノルマルヘキサン抽出粕が0.075〜0.1mg/gである。このため、柚子の外果皮に含まれている量の約5.5〜約16.7倍量に相当するオーラプテン量(0.1質量%)、同約11〜約33倍量に相当するオーラプテン量(0.2質量%)となる。
実験開始最初の4週間は給餌制限を行なった(図1のA領域)。ゼブラフィッシュは、2リットルの水槽にそれぞれ15匹ずつ無作為に入れられ、市販の乾燥ドライフードを1日に1回、2L水槽内の15匹のゼブラフィッシュに約50mg与えた。
(1)肥満誘導を行なわない群=コントロール群(non−DIO)、
(2)肥満誘導を行なう群(DIO)、
(3)肥満誘導を行なうと共に柚子の外果皮を給餌する群(DIO+yuzu peel)、
(4)肥満誘導を行なうと共に柚子のノルマルヘキサン抽出粕を給餌する群(DIO+yuzu pomace)、
(5)肥満誘導を行なうと共にオーラプテンを0.1質量%含有するグルテン顆粒を給餌する群(DIO+LA)、
(6)肥満誘導を行なうと共にオーラプテンを0.2質量%含有するグルテン顆粒を給餌する群(DIO+HA)。
図2〜図6は上記(1)(2)を比較対象とした、(3)柚子外果皮、(4)柚子のノルマルヘキサン抽出粕の結果を、図7〜図11は上記(1)(2)を比較対象とした、(5)オーラプテンを0.1質量%含有、(6)オーラプテンを0.2質量%含有の結果を示したものである。
同様に、上記(2)〜(6)の群には、新たに孵化したアルテミアを1日に3回(60mgcysts/fish/dayに相当する)給餌した。
アルテミア(Artemia) とは、節足動物 甲殻亜門 鰓脚綱 サルソストラカ亜綱 無甲目 ホウネンエビモドキ科 の属名である。1科1属であり、所属する9種の総称ともなっている。
上記(1)の群(non−DIO群)には、新たに孵化したアルテミアを1日に1回(5mgcysts/fish/dayに相当する)給餌した。
上記(2)の群(DIO群)には、新たに孵化したアルテミアを1日に3回(60mgcysts/fish/dayに相当する)給餌した。
上記(3)の群((DIO+yuzu peel)群)には、アルテミアを1日に3回(60mgcysts/fish/dayに相当する)給餌する20分前に、柚子の外果皮顆粒(6mg/g/dayに相当する)を給餌した。
上記(4)の群((DIO+yuzu pomace)群)には、アルテミアを1日に3回(60mgcysts/fish/dayに相当する)給餌する20分前に、柚子のノルマルヘキサン抽出粕顆粒(6mg/g/dayに相当する)を給餌した。
上記(5)の群((DIO+LA)群)には、アルテミアを1日に3回(60mgcysts/fish/dayに相当する)給餌する20分前に、オーラプテンを0.1質量%含有するグルテン顆粒(10μg/g/dayに相当する)を給餌した。
上記(6)の群((DIO+HA)群)には、アルテミアを1日に3回(60mgcysts/fish/dayに相当する)給餌する20分前に、オーラプテンを0.2質量%含有するグルテン顆粒(20μg/g/dayに相当する)を給餌した。
(a)ゼブラフィッシュの体重
体重はゼブラフィッシュを2-フェノキシエタノール500ppmを含む水槽中で麻酔させた後、体表面の水分を柔らかいティッシュペーパーで拭き取って測定した。体重測定結果を図2および図7に示す。non−DIO群およびDIO群と比較して、図2は(DIO+yuzu peel)群および(DIO+yuzu pomace)群の体重変化を示す図であり、図7は(DIO+LA)群および(DIO+HA)群の体重変化を示す図である。
血中中性脂肪濃度は、給餌6週後のゼブラフィッシュから採取された血液より和光L型TGキット(和光純薬)を用いて測定した。血中中性脂肪濃度測定結果を図3および図8に示す。non−DIO群およびDIO群と比較して、図3は(DIO+yuzu peel)群および(DIO+yuzu pomace)群の結果であり、図8は(DIO+LA)群および(DIO+HA)群の結果である。
肥満誘導開始後、アルテミアの給餌量を給餌前後の「アルテミア数」として測定した。新たに孵化したアルテミアを水容器内に均一に分散させて、次いでこの溶液の1mlに含まれるアルテミア数を実体顕微鏡で測定した。測定は3回繰り返し平均値を求めた。1つの水槽当たりこのアルテミア溶液を上記(1)の群に2.5ml、上記(2)〜(6)の群に10mlそれぞれ給餌した。それぞれの水槽の合計アルテミア数を計算した。アルテミアを給餌2時間後に、ゼブラフィッシュが食べ残したアルテミア量をアルテミア数として算出して、それぞれの水槽に最初に供給したアルテミア数から差し引いてアルテミアの給餌量を測定した。non−DIO群およびDIO群と比較して、図4は(DIO+yuzu peel)群および(DIO+yuzu pomace)群の結果であり、図9は(DIO+LA)群および(DIO+HA)群の結果である。
採血後のゼブラフィッシュを氷の上で死亡させて、3DマイクロCTスキャンにより、内臓脂肪量を測定した。測定は3DマイクロX線CT「R_mCT2」(株式会社リガク製)を用いて行なった。内臓脂肪量の測定は、腹腔に限定され、腹腔の初期点は擬鎖骨から肛門に設定した。結果を図5および図10に示す。non−DIO群およびDIO群と比較して、図5は(DIO+yuzu peel)群および(DIO+yuzu pomace)群の結果であり、図10は(DIO+LA)群および(DIO+HA)群の結果である。
脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化を確認するため、オイルレッドO染色を以下の方法で行なった。
内臓脂肪量測定後のゼブラフィッシュの腹壁を剥離して、ホルムアルデヒド溶オイルレッドO染色を行なった。400倍の顕微鏡で可視化した結果を図6および図11の左側にそれぞれ示す。non−DIO群およびDIO群と比較して、図6は(DIO+yuzu peel)群および(DIO+yuzu pomace)群の結果であり、図11は(DIO+LA)群および(DIO+HA)群の結果液で固定した。固定された肝臓組織を単離後凍結により切片を得て、常法によりである。また、図6および図11の結果を画像処理ソフトウェアであるImage Jで赤色の面積を測定する方法により定量化した結果を同時に図6および図11の右側に棒グラフでそれぞれ示す。棒グラフ内の数値はピクセル数を表す。
動物の体内において脂質代謝に関与する酵素群の遺伝子の発現量を定量的リアルタイムPCRにより測定した。結果を図12および図13に示す。図12は肝臓からのトータルRNAの結果であり、図13は内臓脂肪組織からのトータルRNAの結果である。mRNA発現量はDIO群におけるmRNA発現量を基準としてその相対値で表した。
遺伝子増幅に用いたフォーワードプライマーおよびリバースプライマーの配列をGenBankのアクセッション番号と共に表1に示す。
ターゲット遺伝子のCt値は18S rRNAに対して規準化し、ΔCt法により計算した。
図2に示すように、(DIO+yuzu peel)群および(DIO+yuzu pomace)群は、DIO群よりも明らかに体重増加が少なかった。DIO群と対比して、特に(DIO+yuzu pomace)群はスチューデントのt分布による統計的検定において5%の有意水準で有意であった。なお、肥満誘導を行なわないnon−DIO群は1%の有意水準で有意であった。*印は5%、**は1%の有意水準をそれぞれ表す。
柚子は、オーラプテン以外にも、食物繊維、フェノール、フラボノイドやカロチノイドなど異なる化学的および薬理学的機能を持ついくつかの成分を含有している。柚子の外果皮または抽出粕の脂質沈着を抑制する効果は、これら成分の相乗的な結果と考えられる。
図12に示すように、DIO群と対比して、(DIO+yuzu peel)群および(DIO+yuzu pomace)群の6週間給餌後の肝臓における遺伝子群は、脂肪分解関連遺伝子群の発現が活性化されていた。特に(DIO+yuzu peel)群は、ミトコンドリア脂肪酸β酸化経路に関与するACADM、ペルオキシソーム脂肪酸β酸化経路に関与するACOX1、β酸化を制御する核内受容体蛋白質であるPPARα遺伝子の発現量が統計的にも有意であった。このように、柚子の外果皮または抽出粕は脂肪酸β酸化に密接に関連しており、脂質沈着を抑制する効果が実証された。
以上、遺伝子解析において、(DIO+yuzu peel)群は、肝臓および内臓脂肪組織における脂質蓄積の減少をもたらすことが実証された。
適用にあたり、柚子の外果皮または抽出粕を含むことで、脂質の生体内沈着抑制剤を含む飼料とすることができる。
飼料としては、柚子の外果皮または抽出粕を直接養殖魚に与えてもよいが、魚粉、小麦粉、馬鈴薯澱粉、酵母、ミネラル、ビタミン類、アミノ酸などを併用することができる。
Claims (10)
- 柑橘類由来の物質を含むことにより、動物の生体内に沈着される脂質を抑制する脂質の生体内沈着抑制剤であって、
前記物質が前記柑橘類の果汁部分を除いた外果皮であることを特徴とする脂質の生体内沈着抑制剤。 - 前記外果皮は、冷凍乾燥後、粉末化して得られる外果皮であることを特徴とする請求項1記載の脂質の生体内沈着抑制剤。
- 前記物質が前記柑橘類の果汁部分を搾汁後、該搾汁粕を有機溶媒により抽出して得られる抽出物を除いた、抽出粕であることを特徴とする請求項1記載の脂質の生体内沈着抑制剤。
- 前記有機溶媒がn−ヘキサンであることを特徴とする請求項3記載の脂質の生体内沈着抑制剤。
- 前記柑橘類が柚子であることを特徴とする請求項1から請求項4のいずれか1項記載の脂質の生体内沈着抑制剤。
- 前記動物が養魚類であることを特徴とする請求項1から請求項5のいずれか1項記載の脂質の生体内沈着抑制剤。
- 動物の生体内に沈着される脂質を抑制する、脂質の生体内沈着抑制剤を含む飼料であって、
前記生体内沈着抑制剤が請求項1から請求項6のいずれか1項記載の脂質の生体内沈着抑制剤であることを特徴とする飼料。 - 前記飼料が養魚用飼料であることを特徴とする請求項7記載の飼料。
- 血中中性脂肪濃度および内臓脂肪量を減少させることのできる動物の飼育方法であって、
過剰給餌により肥満誘導を行なう工程と、
請求項7記載の飼料を給餌する工程とを含むことを特徴とする飼育方法。 - 飼育対象動物の脂肪量を所定の脂肪量に調節することができる動物の飼育方法であって、
飼育対象動物の脂肪量をモニタリングするモニタリング工程と、
前記モニタリング工程後に飼料を給餌する給餌工程とを備え、
前記モニタリングされた脂肪量が前記所定の脂肪量より多い場合は、前記給餌工程において請求項7記載の飼料の給餌量を前記モニタリング時より増加し、前記モニタリングされた脂肪量が前記所定の脂肪量より少ない場合は、前記給餌工程において請求項7記載の飼料の給餌量を前記モニタリング時より減少させることを特徴とする飼育方法。
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