CN114343083A - 海藻糖作为自噬激活剂在水产养殖中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及海藻糖作为自噬激活剂在水产养殖中的用途，其将海藻糖作为自噬激活剂，用于缓解由高脂饲料喂养诱导的鱼类肝脏脂质沉积。本发明中将海藻糖作为自噬激活剂使用，使其可以激活鱼肝脏中脂滴自噬关键基因以及相关蛋白的表达表达量升高，从而降低肝脏中脂肪和胆固醇沉积，缓解由高脂饲料诱导的鱼类肝脏脂质沉积，并促进养殖鱼类的体重增加。

Description

海藻糖作为自噬激活剂在水产养殖中的用途

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，尤其涉及一种海藻糖作为自噬激活剂在水产养殖中的用途。

背景技术

近年来，水产养殖行业发展迅速，高能量饲料(高糖和高脂肪饲料)被广泛应用于水产养殖业。但是，高能量饲料往往会诱发鱼类代谢紊乱，造成肝脏大量脂质沉积，进而影响鱼类的正常生长和健康。

海藻糖是一种天然低分子量双糖，是可从海藻、真菌和昆虫等中提取得到的天然糖分。目前，海藻糖已经获美国FDA批准，可供人食用，且常被添加在药品中作为活性成分的保护剂。海藻糖可以通过增强植物的抗氧化能力、保护膜与蛋白质的稳定性、增强渗透调节作用、保护植物的光合能力、与植物激素相互作用以及作为信号通过信号转导等提高植物对非生物胁迫的耐受性。

但目前尚无通过海藻糖缓解由高脂饲料喂养诱导的水产(如大口黑鲈等鱼类)肝脏脂质沉积的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种海藻糖作为自噬激活剂在水产养殖中的用途，其通过添加海藻糖作为自噬激活剂使用，从而缓解由高脂饲料诱导的鱼类肝脏脂质沉积，并促进鱼体生长。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一方面，提供了一种海藻糖作为自噬激活剂缓解由高脂饲料喂养诱导的鱼类肝脏脂质沉积中的应用。

所述鱼类包括鲈鱼，优选的，所述鲈鱼为大口黑鲈。

另一方面，提供了一种海藻糖在制备鱼类保健品/饲料/饲料添加剂中的用途，且所述海藻糖作为自噬激活剂，用于缓解由高脂饲料喂养诱导的鱼类肝脏脂质沉积。

另一方面，提供了一种鱼类养殖组合物，按重量份数计，其包括：鱼粉400-500份、鸡肉粉80-150份、豆粕100-150份、小麦粉50-120份、小麦蛋白粉10-30份、豆油50-150份、木薯淀粉20-50份、预混料10-20份、海藻糖20-40份、微晶纤维素10-40份。

优选的，按重量份数计，所述鱼类养殖组合物还包括：墨鱼提取物30-50份、磷酸二氢钙Ca(H₂PO₄)₂10-25份。

优选的，所述鱼粉为进口鱼粉。

优选的，按重量份数计，所述预混料包括：2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(即BHT)0.1-0.5份、氯化胆碱2-10份、诱食剂1-5份。

优选的，按重量份数计，所述预混料还包括：维生素A 0.01-0.02份、维生素B10.03-0.05份、维生素B5 0.01-0.03份、维生素B12 0.01-0.02份、维生素D3 0.01-0.05份、维生素E 0.001-0.005份、维生素K3 0.01-0.02份、维生素C 0.02-0.1份。

优选的，按重量份数计，所述预混料还包括：无水硫酸铜0.01-0.05份、硫酸镁0.02-0.05份、硫酸亚铁0.01-0.03份、硫酸锌0.01-0.02份、亚硒酸钠0.005-0.01份。

另一方面，提供了一种上述鱼类养殖组合物的制备方法，其包括如下步骤：

S1、取上述重量份的各组分，混合均匀；

S2、将步骤S1中混合获得的物料通过调质器加热、熟化、制粒；

S3、将步骤S2中获得的物料烘干，冷却后包装，即获得所述鱼类养殖组合物。

本发明至少具备以下有益效果：

本发明中将海藻糖作为自噬激活剂使用，使其可以激活鱼肝脏中脂滴自噬关键基因以及相关蛋白的表达表达量升高，从而降低肝脏中脂肪和胆固醇沉积，缓解由高脂饲料诱导的鱼类肝脏脂质沉积，并促进鱼体的体重增长。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为养殖实验中大口黑鲈的体重变化；

图2为养殖实验中大口黑鲈脏体比、肝体比和脂体比的变化；

图3为养殖实验中大口黑鲈肝脏组织切片油红染色图；

图4为养殖实验中大口黑鲈肝脏中脂肪含量、甘油三酯和总胆固醇含量的变化；

图5为养殖实验中大口黑鲈脂滴自噬关键基因Beclin1和ATG7的相对表达量；

图6为养殖实验中大口黑鲈脂滴自噬关键蛋白LC3II/LC3I的相对表达量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

本实施例提供了一种鱼类养殖组合物，按重量份数计，其包括：鱼粉400份、鸡肉粉80份、豆粕100份、小麦粉50份、小麦蛋白粉10份、豆油50份、木薯淀粉20份、预混料10份、海藻糖20份、微晶纤维素10份、墨鱼提取物30份、磷酸二氢钙Ca(H₂PO₄)₂10份。

其中，所述预混料包括：2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(即BHT)0.1份、氯化胆碱2份、诱食剂1份、维生素A 0.01份、维生素B1 0.05份、维生素B5 0.01份、维生素B12 0.02份、维生素D3 0.01份、维生素E 0.001份、维生素K3 0.01份、维生素C 0.1份、无水硫酸铜0.01份、硫酸镁0.02份、硫酸亚铁0.01份、硫酸锌0.01份、亚硒酸钠0.005份。

其中，所述鱼类包括鲈鱼，优选为大口黑鲈，同时，所述鱼粉为进口鱼粉。所述海藻糖作为自噬激活剂，用于缓解由高脂饲料喂养诱导的鱼类肝脏脂质沉积。

且上述鱼类养殖组合物的制备方法包括如下步骤：

S1、取上述重量份的各组分，混合均匀；

S2、将步骤S1中混合获得的物料通过调质器加热、熟化、制粒；

S3、将步骤S2中获得的物料烘干，冷却后包装，即获得所述鱼类养殖组合物。

实施例2：

本实施例与实施例1的不同之处在于，按重量份数计，所述鱼类养殖组合物包括：鱼粉500份、鸡肉粉150份、豆粕150份、小麦粉120份、小麦蛋白粉30份、豆油150份、木薯淀粉50份、预混料20份、海藻糖40份、微晶纤维素40份、墨鱼提取物50份、磷酸二氢钙Ca(H₂PO₄)₂25份。

按重量份数计，所述预混料包括：BHT0.5份、氯化胆碱10份、诱食剂5份、维生素A0.02份、维生素B1 0.05份、维生素B5 0.01份、维生素B12 0.02份、维生素D3 0.05份、维生素E 0.005份、维生素K3 0.02份、维生素C 0.1份、无水硫酸铜0.05份、硫酸镁0.05份、硫酸亚铁0.03份、硫酸锌0.02份、亚硒酸钠0.01份。

其他与实施例1相同，不再赘述。

实施例3：

本实施例与实施例1的不同之处在于，按重量份数计，所述鱼类养殖组合物由以下重量份的组分组成：鱼粉450份、鸡肉粉120份、豆粕130份、小麦粉80份、小麦蛋白粉20份、豆油100份、木薯淀粉35份、预混料15份、海藻糖30份、微晶纤维素25份、墨鱼提取物40份、磷酸二氢钙Ca(H₂PO₄)₂18份。

按重量份数计，所述预混料包括：2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(即BHT)0.1-0.5份、氯化胆碱2-10份、诱食剂1-5份。

优选的，按重量份数计，所述预混料由以下重量份的组分组成：维生素A 0.015份、维生素B1 0.04份、维生素B5 0.02份、维生素B12 0.018份、维生素D3 0.03份、维生素E0.003份、维生素K3 0.015份、维生素C 0.08份、无水硫酸铜0.03份、硫酸镁0.04份、硫酸亚铁0.02份、硫酸锌0.016份、亚硒酸钠0.007份。

其他与实施例1相同，不再赘述。

实施例4：

本实施例提供了一种海藻糖作为自噬激活剂缓解由高脂饲料喂养诱导的鱼类肝脏脂质沉积中的应用。

所述鱼类包括鲈鱼，优选的，所述鲈鱼为大口黑鲈。

实施例5：

养殖试验：

挑选状态良好，并且体重在12.4±0.5g的大口黑鲈分成对照组、高脂组、实验组1、实验组2、实验组3，对照组、高脂组按照如表1所示饲料成分表饲喂，实验组1、实验组2、实验组3分别对应饲喂实施例1-3中的鱼类养殖组合物，每天按照鱼体重的4％进行饲喂，养殖周期共8周，每两周称重一次，调整投喂量并记录生长数据。

养殖8周结束时对鱼体的体重、内脏团、肝脏及腹腔脂肪进行称重，分析计算不同处理组脏体比、肝体比和腹脂率等。并对肝脏组织切片进行油红染色，检测不同处理组中鱼体肝脏的总脂肪含量，以及肝脏和血清中甘油三酯和总胆固醇的含量，分析海藻糖对缓解大口黑鲈肝脏脂肪沉积的功效，最后还根据自噬相关基因表达量和蛋白表达量结果分析海藻糖激活自噬的途径。

表1对照组、高脂组饲料成分表

1、体重计算

如图1所示，养殖8周后，高脂组大口黑鲈体重有所降低，但与对照组相比无显著性差异，实验组1-3中大口黑鲈的体重有所升高，特别是实验组2和实验组3中大口黑鲈的体重比对照组显著升高，说明本发明中的鱼类养殖组合物具有促进大口黑鲈生长的效果。

2、脏体比、肝体比、腹腔脂肪比计算

养殖实验结束后，每组取30尾鱼，用麻醉剂(MS-222，20mg/L)麻醉，测量体重，将每条鱼解剖后取肝脏、内脏团和腹腔脂肪组织并称重，脏体比、肝体比、腹腔脂肪计算公式如下：

脏体比(％)＝Wv/Wt×100

肝体比(％)＝Wh/Wt×100

腹腔脂肪比(％)＝Wm/Wt×100

式中，Wt为终末体质量(g)，Wv为鱼内脏团重(g)，Wm为鱼腹腔脂肪重(g),Wh为鱼肝脏重(g)，计算结果如图2所示。

从图2中可以看出，在高脂饲料喂养下大口黑鲈的内脏团、肝脏以及腹腔脂肪增多，而本发明的鱼类养殖组合物由于添加有海藻糖，因此上述指标均有不同程度地下降，表明海藻糖有降低大口黑鲈内脏脂肪沉积的作用。

3、肝脏切片油红染色

取肝脏组织用多聚甲醛溶液固定后,转移进蔗糖-PB溶液中进行脱水，将组织置于包埋剂中，然后-20℃下冰冻切片，切片干燥后用制备好的油红O染液进行染色,乙醇终止分化，苏木素复染核，润洗后用甘油明胶封片，然后在显微镜下观察，结果如图3所示。

结果显示高脂组大口黑鲈的肝脏中红色斑点增多(即脂肪增多)，而实验组1-3的红色斑点减少，表明脂肪减少，说明海藻糖有降低大口黑鲈肝脏脂质沉积的作用。

4、肝脏中脂肪、甘油三酯和总胆固醇含量检测

肝脏中脂肪提取采用氯仿-甲醇法，取0.5g肝脏样品于试管中，加入6mL的氯仿甲醇(氯仿：甲醇＝2：1)，振荡后于4℃冰箱中静置过夜，再加入1mL0.37mol/ml的氯化钾溶液振荡离心，取下层油相后进行真空干燥，即得到肝脏脂肪，同时肝脏和血清中甘油三酯和总胆固醇含量的测定采用南京建成工程生物研究所生产的试剂盒进行测定，其结果如图4所示。

结果显示高脂组大口黑鲈的肝脏中脂肪、甘油三酯和总胆固醇含量均升高，而饲喂本发明的饲料后，其脂肪、甘油三酯和总胆固醇含量均有不同程度地降低，表明鱼类养殖组合物中的海藻糖有降低大口黑鲈肝脏脂肪和胆固醇沉积的作用。

5、细胞自噬关键基因Beclin1、ATG7的相对表达量测定

采用RNA提取试剂盒(Aidlab,China)提取肝脏总RNA。用NANODROP 2000分光光度计(Thermo,USA)检测总RNA的浓度。使用反转录试剂盒(Takara,Japan)合成对应的cDNA。将生长因子1α(EF1α)和β-肌动蛋白(β-actin)作为不同处理的双内参基因，通过primer等引物序列设计工具以及现有基因序列数据库设计引物进行扩增，与合成的cDNA和荧光定量Ultra SYBR混合液(Aidlab，China)以混合后进行RT-qPCR，采用

法计算mRNA相对表达量，其结果如图5所示。

结果显示在高脂饲料喂养下大口黑鲈肝脏中自噬关键基因Beclin1和ATG7的相对表达量均升高，而加入海藻糖之后，上述两个基因表达量进一步升高，本发明中含有海藻糖的鱼类养殖组合物有促进肝脏脂滴自噬的作用，可使得肝脏分解脂肪能力增强。

6、细胞自噬关键蛋白表达量的相对定量测定

采用免疫印迹(Western Blot)的方法进行测定，即先提取出肝脏中的总蛋白，然后通过SDS-PAGE电泳使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带，接着进行转膜及抗体孵育，显影后可以得到目的蛋白条带，最后用imageJ软件进行灰度相对定量计算，其结果如图6所示。

结果显示在高脂饲料喂养下大口黑鲈肝脏中LC3II/LC3I蛋白的相对表达量升高，而加入海藻糖之后，上述蛋白表达量进一步升高，同样表明海藻糖有促进肝脏脂滴自噬，增强肝脏分解脂肪能力的作用。

综上所述，本发明中的鱼类养殖组合物具有海藻糖，且海藻糖作为自噬激活剂可以激活鱼肝脏中脂滴自噬关键基因以及相关蛋白的表达表达量升高，从而降低肝脏中脂肪和胆固醇沉积，因此可缓解由高脂饲料诱导的鱼类肝脏脂质沉积。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种海藻糖作为自噬激活剂缓解由高脂饲料喂养诱导的鱼类肝脏脂质沉积并促进生长中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鱼类包括鲈鱼。

3.一种海藻糖在制备鱼类保健品/饲料/饲料添加剂中的用途，其特征在于，所述海藻糖作为自噬激活剂，用于缓解由高脂饲料喂养诱导的鱼类肝脏脂质沉积。

4.一种鱼类养殖组合物，其特征在于，按重量份数计，其包括：鱼粉400-500份、鸡肉粉80-150份、豆粕100-150份、小麦粉50-120份、小麦蛋白粉10-30份、豆油50-150份、木薯淀粉20-50份、预混料10-20份、海藻糖20-40份、微晶纤维素10-40份。

5.如权利要求4所述的鱼类养殖组合物，其特征在于，按重量份数计，所述鱼类养殖组合物还包括：墨鱼提取物30-50份、磷酸二氢钙10-25份。

6.如权利要求4所述的鱼类养殖组合物，其特征在于，所述鱼粉为进口鱼粉。

7.如权利要求4所述的鱼类养殖组合物，其特征在于，按重量份数计，所述预混料包括：2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚0.1-0.5份、氯化胆碱2-10份、诱食剂1-5份。

8.如权利要求7所述的鱼类养殖组合物，其特征在于，按重量份数计，所述预混料还包括：维生素A 0.01-0.02份、维生素B1 0.03-0.05份、维生素B5 0.01-0.03份、维生素B120.01-0.02份、维生素D3 0.01-0.05份、维生素E 0.001-0.005份、维生素K3 0.01-0.02份、维生素C 0.02-0.1份。

9.如权利要求7所述的鱼类养殖组合物，其特征在于，优选的，按重量份数计，所述预混料还包括：无水硫酸铜0.01-0.05份、硫酸镁0.02-0.05份、硫酸亚铁0.01-0.03份、硫酸锌0.01-0.02份、亚硒酸钠0.005-0.01份。

10.一种如权利要求4所述鱼类养殖组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、取上述重量份的各组分，混合均匀；

S2、将步骤S1中混合获得的物料通过调质器加热、熟化、制粒；

S3、将步骤S2中获得的物料烘干，冷却后包装，即获得所述鱼类养殖组合物。

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