KR20150139769A

KR20150139769A - 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 지방간, 당뇨병 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20150139769A
Application number: KR1020150061809A
Authority: KR
Inventors: 이명식; 임유미; 김진영; 허규연
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2014-06-03
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2015-12-14

Abstract

본 발명은 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 지방간, 당뇨병 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 지방간 또는 당뇨병의 예방 또는 치료 활성을 나타낼 뿐만 아니라 공복시 혈당 및 혈중 인슐린 농도의 유의한 감소를 유도하여 제2형 당뇨병 또는 인슐린 저항성을 개선하는 효과 및 이와 밀접하게 관련된 대사질환을 개선하는 의약품으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

트레할로스를 유효성분으로 포함하는 지방간, 당뇨병 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating Fatty Liver, Diabetes or Insulin Resistance Syndrome Comprising Trehalose as an Active Ingredient}

본 발명은 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 지방간, 당뇨병 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 본 발명자들의 주도로 자가포식과 대사 질환, 대사 증후군, 당뇨병 간의 관계가 점점 더 명확히 드러나고 있다. 본 발명자들의 실험 결과 자가포식을 증가시키는 물질이 세포 및 체내 대사를 개선시키고 대사 증후군을 치료할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 특히 유전자 조작 동물 실험 또는 일반 동물 실험에서 비만과 관련된 지방간 치료에 효과를 보이고 있으며 비만 관련 당뇨병에도 뚜렷한 효과를 보이고 있다. 이중에서 지방간 치료 효과는 현재 임상적으로 사용 가능한 지방간 치료제는 없는 상태라는 점에서 매우 고무적인 결과이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 지방간, 당뇨병 및 인슐린 저항성 증후군 등을 포함하는 대사질환에 예방 또는 치료 활성을 갖는 화합물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 분자 샤페론으로 사용되고 있는 트레할로스가 상기 대사질환에 대한 개선효과를 갖는다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 지방간, 당뇨병 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 지방간, 당뇨병 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 지방간, 당뇨병 및 인슐린 저항성 증후군 등을 포함하는 대사질환에 예방 또는 치료 활성을 갖는 화합물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 분자 샤페론으로 사용되고 있는 트레할로스가 상기 대사질환에 대한 개선효과를 갖는다는 사실을 발견하였다.

본 발명에 따르면, 트레할로스는 제2형 당뇨병 실험동물 및 비만 동물에서 간 조직에 축적되는 중성지방량을 감소시켰을 뿐 아니라 고혈당을 개선하고 인슐린 저항성을 감소시켰다. 이러한 트레할로스의 지방간, 당뇨병 및 인슐린 저항성 증후군의 예방 및 치료 효과는 트레할로스에 의한 자가포식 활성 증가에 의한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “지방간”은 간의 지방대사 장애로 지방이 간세포에 과도한 양으로 축적된 상태를 말하며, 이는 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 동맥경화, 지방간 및 췌장염 등과 같은 다양한 질병의 원인이 된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “당뇨병”은 포도당-비관용(intolerance)을 초래하는 인슐린의 상대적 또는 절대적 부족으로 특징되는 만성질환을 의미한다. 용어 당뇨병은 모든 종류의 당뇨병을 포함하며, 예를 들어, 제1형 당뇨, 제2형 당뇨 및 유전성 당뇨를 포함한다. 제1형 당뇨병은 인슐린 의존성 당뇨병으로서, β-세포의 파괴에 의해 주로 초래된다. 제2형 당뇨병은 인슐린 비의존성 당뇨병으로서, 식사 후 불충분한 인슐린 분비에 의해 초래되거나 또는 인슐린 저항성에 의해 초래된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료되는 당뇨병은 제2형 당뇨병이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “인슐린 저항성”은 혈당을 낮추는 인슐린의 기능이 떨어져 세포가 포도당을 효과적으로 연소하지 못하는 것을 말한다. 인슐린 저항성이 높을 경우, 인체는 너무 많은 인슐린을 만들어 내고 이로 인해 고혈압이나 이상지방혈증은 물론 심장병, 당뇨병 등까지 초래할 수 있다. 특히 제2형 당뇨병에서는 근육과 지방조직에서 인슐린의 증가를 알아채지 못하여, 인슐린의 작용이 일어나지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “인슐린 저항성 증후군”은 상기 인슐린 저항성에 의하여 유발된 질환을 총칭하는 개념으로 인슐린 작용에 대한 세포의 저항성, 고인슐린혈증, 초저밀도지단백(very low density lipoprotein, VLDL)과 중성지방의 증가, 고밀도지단백(high density lipoprotein, HDL)의 감소 및 고혈압 등을 특징으로 하는 질환을 의미하며, 심혈관질환과 제2형 당뇨병의 위험인자로 인식되고 있는 개념이다(Reaven GM, Diabetes, 37: 1595-607, (1988)). 또한 인슐린 저항성은 고혈압, 당뇨, 흡연 등의 위험인자들과 함께 세포 내 산화스트레스를 증가시키고 신호전달체계를 변화시켜 염증반응을 유발하여 죽상경화증을 진행시킨다고 알려져 있다(Freeman BA et al, Lab Invest 47: 412-26, (1982)), Kawamura M et al, J Clin Invest 94: 771-8, (1994)).

본 명세서에서 사용되는 용어 “대사질환”은 각종 심혈관 질환과 제 2형 당뇨병의 위험 요인들이 서로 군집을 이루는 현상을 한 가지 질환군으로 개념화시킨 것으로 인슐린 저항성 및 이와 관련된 복잡하고 다양한 여러 대사 이상과 임상 양상을 모두 포괄하여 의미하는 개념이다. 1988년 Reaven은 이러한 증상들의 공통적인 원인이 체내의 인슐린 작용이 잘되지 않는 인슐린 저항성임을 주장하고 인슐린 저항성 증후군이라고 명명했으나 1998년 세계보건기구(WHO)는 인슐린 저항성이 이 증상들의 모든 요소를 다 설명할 수 없기에 대사증후군 또는 대사질환이라는 용어를 도입하였다.

본 발명의 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 조성물은 대사 질환의 다양한 질환, 예를 들어 비알콜성 지방간, 당뇨병 또는 인슐린 저항성 증후군을 개선하는 활성을 갖는다. 본 발명의 조성물은 트레할로스의 자가포식 활성에 의하여 대사질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인슐린 저항성 증후군은 인슐린 저항성에 의한 비만, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 고인슐린혈증, 비알콜성 지방간 및 제2형 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “고지혈증”은 중성 지방과 콜레스테롤 등의 지방대사가 제대로 이루어지지 않아 혈액 중에 지방량이 많아 유발되는 질환을 말한다. 보다 구체적으로 고지혈증이란 혈액내의 중성지방, LDL 콜레스테롤, 인지질 및 유리 지방산 등의 지질 성분이 증가된 상태로 발생빈도가 높은 고콜레스테롤혈증 또는 고중성지방혈증을 포함한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19 th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스 제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 트레할로스를 유효성분으로 포함하는 지방간, 당뇨병 또는 인슐린 저항성 증후군의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물은 지방간, 당뇨병에 치료 활성을 나타낼 뿐만 아니라 공복시 혈당 및 혈중 인슐린 농도의 유의한 감소를 유도하며, 자가포식을 증진시킴으로써 제2형 당뇨병 또는 인슐린 저항성을 개선하는 효과 및 이와 밀접하게 관련된 대사질환을 개선하는 의약품으로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 트레할로스의 지방간 및 당뇨병 치료 효과를 규명한 결과이다.
a. 제 2형 당뇨병 모델 마우스에 8주간 트레할로스를 복강 투여한 후, 간조직으로부터 중성지방량을 측정한 결과임(양측 스튜던트 T 검정, ###P < 0.001).
b. 트레할로스를 2 g/kg 용량으로 일주일에 3회, 8주간 복강에 투여하고 실험 시작 후, 1주일에 한번씩 꼬리에서 얻은 혈액에서 혈당 수치를 측정한 결과임(본페로니 포스트-테스트를 통한 이원분산분석, # P<0.05; ##P<0.01).
c. 16시간 이상 공복 상태에서 포도당 1 g/kg를 복강에 투여한 후 0 분, 15분, 30분, 60분, 120분 및 180분에 꼬리에서 얻은 혈액으로 혈당을 측정한 결과임(본페로니 포스트-테스트를 통한 이원분산분석, # P<0.05; ## P<0.01).
d. 6시간 이상 공복 상태에서 인슐린 0.75 U/kg를 복강에 투여한 후 0분, 15분, 30분, 60분 및 120분에 꼬리에서 얻은 혈액으로 혈당을 측정한 결과이다(본페로니 포스트-테스트를 통한 이원분산분석, ## P<0.01).
도 2는 자가포식 활성 능력 측정방법에 대한 모식도이다.
도 3은 트레할로스의 자가포식 활성 증과 효과를 규명한 결과이다.
a. 정상 마우스의 간세포로부터 트레할로스의 자가포식 활성을 면역 블롯팅을 통해 측정한 결과임.
b. 정상 마우스의 췌장소도로부터 트레할로스의 자가포식 활성을 면역 블롯팅을 통해 측정한 결과임.
도 4는 자가포식 관련 유전자(Atg7)가 절반이 존재하지 않는 마우스와 제2형 당뇨 모델 마우스를 교배하여 얻은 마우스(Atg7 ^+/- -ob/ob)에서 트레할로스의 항지방간 및 항당뇨병 효과를 측정한 결과이다.
a. Atg7 ^+/- -ob/ob 마우스에 8주간 트레할로스를 복강 투여한 후, 간조직으로부터 중성지방량을 측정한 결과임(양측 스튜던트 T 검정, ***P < 0.001).
b. 16시간 이상 공복상태에서 얻은 혈액에서 혈청만을 추출하여 간수치를 측정한 결과임(양측 스튜던트 T 검정, ***P < 0.001).
c. 트레할로스를 2 g/kg 용량으로 일주일에 3회, 8주간 복강에 투여하고 실험 시작 후, 1주일에 한번씩 꼬리에서 얻은 혈액에서 혈당 수치를 측정한 결과임(본페로니 포스트-테스트를 통한 이원분산분석, P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001).
d. 16시간 이상 공복 상태에서 포도당 1 g/kg를 복강에 투여한 후 0 분, 15분, 30분, 60분, 120분 및 180분에 꼬리에서 얻은 혈액으로 혈당을 측정한 결과임(본페로니 포스트-테스트를 통한 이원분산분석, ** P<0.01;***P<0.001).
e. 6시간 이상 공복 상태에서 인슐린 0.75 U/kg를 복강에 투여한 후 0분, 15분, 30분, 60분 및 120분에 꼬리에서 얻은 혈액으로 혈당을 측정한 결과이다(본페로니 포스트-테스트를 통한 이원분산분석, * P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001).
f. Atg7 ^+/- -ob/ob 마우스에 8주간 트레할로스를 복강 투여한 후, 류펩틴을 복강투여하고 3시간 후에 마우스에서 얻은 간 조직을 갈아서 면역 블롯팅을 실시한 결과임.
도 5는 hIAPP ⁺ 마우스의 글루코오스 프로파일에 있어서 자가포식 증진제로서 트레할로스의 효과를 평가한 결과이다.
a. 2주간 고지방식이를 제공한 12주령 GFP - LC3 ⁺ 마우스의 복강 내로 트레할로스(2 g/kg)를 투여하고, LC3 반점을 공초점 현미경으로 분석하기 위해 동결 췌장 섹션을 준비함. 스케일 바: 50 μm.
b. 고지방식이를 제공한 16-20주령의 hIAPP ⁺ 마우스의 복강 내로 트레할로스(2 g/kg)를 투여하고 비공복 혈당치를 모니터링함(n = 5).
c. 고지방식이를 제공한 hIAPP ⁺ 마우스에 4주간 트레할로스를 투여한 후 IPGTT를 실시함(n = 5).
d. 고지방식이를 제공한 hIAPP ⁺ 마우스에 4주간 트레할로스를 투여한 후 IGI를 측정함(n = 3).
e. A11 항체를 이용하여 면역형광 염색한 후, DAPI+ 췌도세포 가운데 A11에 의해 염색된 세포 비율을 공초점 현미경으로 확인함. 대표도를 나타냄. 스케일 바: 50 μm.
f. FSB 염색 후, 췌도 영역에서의 평균 형광강도를 NIS-Elements AR 3.0 소프트웨어(Nikon)를 이용하여 측정함. 대표도를 나타냄. 스케일 바: 100 μm. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001. (C, D에서 *, hIAPP ⁺ /HFD + 트레할로스 및 hIAPP ⁺ /HFD + PBS 그룹간 비교; #, hIAPP ⁺ /HFD + PBS 및 hIAPP/HFD + PBS 그룹 간 비교)

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 트레할로스의 지방간 치료 효과

트레할로스 파우더(Sigma Aldrich)를 멸균된 PBS에 녹여 2 g/kg로 일주일에 3번씩 제2형 당뇨 모델 마우스(ob/ob, 구입처:중앙실험동물, 주령:12-16주령) 복강에 투여하고 8주 동안 실험을 진행하였다.

1-1: 간에 축적된 중성지방 측정

트레할로스를 8주 동안 복강 투여한 후, 얻은 동량의 간 조직을 갈아서 클로로포름:메탄올을 2:1 비율로 넣어 준 후 잘 섞어준다. 그 후 상온에서 휘발성이 강한 메탄올은 증발시키고 클로로포름에 의해 녹은 중성지방만이 남게 된다. 이 방법으로 얻은 중성지방을 중성지방 발색 시약을 통해 측정한 결과, 간 조직에 축적된 중성지방도 감소되어 있는 것으로 보아 트레할로스가 지방간 치료에 효과가 있음을 확인하였다(도 1a).

실시예 2: 트레할로스의 당뇨병 치료 효과

1-2: 혈당 수치 측정

복강에 트레할로스를 투여한 후, 1주일에 한 번씩 꼬리에서 얻은 혈액을 혈당 시험지에 묻혀 측정기기에서 혈당 수치를 측정한 결과, 혈당이 개선되었고 이를 통해 트레할로스가 당뇨병 치료에 효과가 있음을 확인하였다(도 1b).

1-3: 당 부하 검사

트레할로스를 8주간 투여한 후 실험 전 날 저녁에 사료를 제거하여 16시간 이상 공복을 유지한 상태에서 포도당 1 g/kg를 복강에 투여한 후 0 분, 15분, 30분, 60분, 120분 및 180분에 꼬리에서 얻은 혈액으로 혈당 측정하여 당 부하 검사를 실시하였다. 투여한 포도당으로 인해 올라간 혈당을 얼마나 빠른 시간 안에 인슐린이 분비되어 혈당을 떨어뜨리는지 알아보기 위해 당 부하 검사를 실시한 결과, 대조군과 비교하여 트레할로스를 투여한 군에서 혈당 수치가 빠르게 감소하였다(도 1c).

1-4: 인슐린 저항성 검사

트레할로스를 8주간 투여한 후 실험 당일 아침에 사료를 제거하여 6시간 이상 공복을 유지한 상태에서 인슐린 0.75 U/Kg를 복강에 투여한 후 0분, 15분, 30분, 60분 및 120분에 꼬리에서 얻은 혈액으로 혈당을 측정하여 인슐린 저항성 검사를 실시하였다. 인슐린을 투여하면 혈당을 떨어뜨리는 작용을 하나 제 2 형 당뇨의 경우 인슐린 저항성 때문에 인슐린이 작용을 하지 못해 혈당 조절이 되지 않는다. 이러한 인슐린 저항성을 확인하기 위해 인슐린 저항성 검사를 실시한 결과, 트레할로스를 투여한 군에서 인슐린 저항성이 감소하였음을 확인하였다(도 1d).

실시예 3: 트레할로스의 자가포식 활성 증가 효과

트레할로스가 제2형 당뇨 모델 마우스의 당뇨병 개선에 효과가 있음을 확인하였는데, 이는 트레할로스가 자가포식 활성을 증가시켜 당뇨병을 개선시킨 것이 아닌지 확인하기 위해 다음 실험을 진행하였다.

자가포식은 각종 스트레스 및 세포사멸 기전에 의해 생긴 손상된 소기관이나 단백질 등을 없애기 위해 작동이 된다. 없애고자 하는 물질을 둘러쌓은(autophagosome) 후에 라이소좀과 융합하여 분해시켜 손상된 물질을 없애게 된다. 이때 자가용해소체(autolysosme)에 의해 자가포식 표지 유전자(LC3-II) 또한 분해되어 없어지기 때문에 대조군과 비교가 어렵게 된다. 따라서 자가포식 활성 정도를 확인하기 위해서는 라이소좀 억제제인 바필로마이신(bafilomycin) A1을 이용하여 자가용해소체와 라이소좀이 융합되는 것을 막아 자가용해소체에 의해 없어지는 자가포식 표지 유전자를 막아 줌으로서 대조군과 비교가 수월해져 자가포식 활성 정도를 확인 할 수 있다(도 2).

3-1. 간세포에서 자가포식 활성 평가

간세포를 하나씩 분리하기 위해 정상 마우스에 간문맥 관류(perfusion)을 시행한 후, 간 조직을 떼어 내어 핀셋으로 잡고 흔들어서 간세포를 수득하였다. 트레할로스가 자가포식 활성에 영향을 미치는지 알아보기 위해 분리한 간세포에 라이소좀 억제제인 바필로마이신 A1을 처리하고 1시간 뒤에 트레할로스 100 mM을 처리하고, 18시간 배양하였다. 자가포식 표지 유전자(LC3-II)를 확인하기 위해 약물을 처리한 세포를 모아 면역블롯팅을 실시하였다.

트레할로스를 처리한 세포를 모아 세포벽을 깨주는 용액(세포용해 용액)을 넣고 1시간 동안 냉장에 두어 세포내에 있는 단백질을 수득하였다. 얻은 단백질은 정량을 통해 각각의 실험군과 대조군에 동일한 단백질 농도를 만들어 10분간 끓여 시료를 준비하였다. 준비된 시료는 면역블롯팅 젤에 넣어주고 전압을 걸어 단백질 크기에 따라 분리되도록 하였다. 단백질의 크기별 분리가 다 되면 면역블롯팅 젤을 멤브레인으로 옮겨 확인하고자 하는 단백질의 크기에 맞게 멤브레인을 잘라 자가포식 표지 유전자(LC3, 제조사:Novus)와 베타엑틴(제조사:SantaCruz) 항체를 넣고 냉장에 하루 동안 두었다. 다음날 항체가 들어있는 멤브레인을 세척용액으로 10분에 한번씩 1시간 동안 세척하고 자가포식 표지 유전자와 베타엑틴 유전자를 인지하는 항체를 넣고 1시간 동안 상온에 정치하였다. 1시간 뒤 멤브레인을 세척용액으로 10분에 한번씩 1시간 동안 세척하고 암실로 이동하여 현상용액이 뿌려진 멤브레인에 인화지를 올려 누른 후 필름현상 기기에 넣어 유전자 밴드를 확인하였다.

바필로마이신 A1을 처리하지 않은 세포에서는 대조군과 비교하여 LC3-II가 증가되어 있는 것을 확인하기 어려웠으나, 바필로마이신 A1을 처리한 세포에서는 대조군과 비교하였을 때, LC3-II가 증가되어 있는 것으로 보아 트레할로스가 자가포식 활성을 증가시켰음을 확인 할 수 있었다(도 3a).

3-2. 췌장소도에서 자가포식 활성 평가

정상 마우스의 췌관에 콜라게나아제 P를 주입하고 부풀어 오른 췌장을 적출한 다음 37℃ 온수조에 넣고 췌장에서 췌장소도를 분리시켰다. 그 다음 피콜 농도구배를 통해 췌장소도가 있는 층을 걷어 내어 모은 후에 현미경을 통해 췌장소도 만을 골라내어 수득하였다. 트레할로스가 자가포식 활성에 영향을 미치는지 알아보기 위해 분리한 췌장소도에 라이소좀 억제제인 바필로마이신 A1을 처리하고 1시간 뒤에 트레할로스 100 mM을 처리하고, 18시간 배양하였다. 자가포식 표지 유전자를 확인하기 위해 약물을 처리한 세포를 모아 면역블롯팅을 실시하였다. 그 결과, 바필로마이신 A1을 처리하지 않은 세포에서 대조군과 비교하여 LC3-II가 조금 증가되어 있는 것을 확인하였으나, 바필로마이신 A1을 처리한 세포에서는 대조군과 비교하였을 때, LC3-II가 더 많이 증가되어 있는 것을 확인, 트레할로스가 자가포식 활성에 관여함을 확인 할 수 있었다(도 3b).

실시예 4: Atg7 ^+/- -ob/ob 마우스에서 트레할로스의 효과

자가포식 관련 유전자(Atg7)가 절반이 존재하지 않는 마우스와 제2형 당뇨 모델 마우스를 교배하여 얻은 마우스(Atg7 ^+/- -ob/ob)에서 트레할로스의 효과를 확인하였다.

4-1. 중성지방 측정

Atg7 ^+/- -ob/ob 마우스에 트레할로스를 8주 동안 복강 투여한 후, 얻은 동량의 간 조직을 갈아서 클로로포름:메탄올을 2:1 비율로 넣어 준 후 잘 혼합하였다. 그 후 상온에서 휘발성이 강한 메탄올은 증발시키고 클로로포름에 의해 녹은 중성지방만이 남게 된다. 이 방법으로 얻은 중성 지방은 중성지방 발색 시약을 통해 측정하였다. 트레할로스에 의해 간 조직에 축적된 중성지방도 감소되어 있는 것으로 보아 지방간 치료에 효과가 있음을 확인하였다(도 4a).

4-2. 간수치 측정

16시간 이상 공복상태 일 때 얻은 혈액에서 혈청만을 추출하여 혈당지에 혈청을 묻혀 측정기기에 넣고 간수치를 측정하였다. 트레할로스를 처리한 마우스에서 유의하게 간수치가 떨어져 있음을 확인하였다(도 4b).

4-3. 혈당 수치 측정

트레할로스를 복강에 투여한 후, 1주일에 한번씩 꼬리에서 얻은 혈액을 혈당 시험지에 묻혀 측정기기에서 혈당 수치를 측정하였다. PBS를 투여한 대조군과 비교하여 트레할로스를 투여한 군에서 혈액 내 글루코오스 수치가 효과적으로 감소하였다(도 4c).

4-4. 당 부하 검사

16시간 이상 공복 상태에서 포도당 1 g/kg를 복강에 투여한 후 0 분, 15분, 30분, 60분, 120분 및 180분에 꼬리에서 얻은 혈액으로 혈당을 측정하였다. PBS를 투여한 대조군과 비교하여 트레할로스를 투여한 군에서 포도당 투여에 의해 증가된 혈당 수치가 빠르게 감소하였다(도 4d).

4-5. 인슐린 저항성 검사

6시간 이상 공복 상태에서 인슐린 0.75 U/kg를 복강에 투여한 후 0분, 15분, 30분, 60분 및 120분에 꼬리에서 얻은 혈액으로 혈당을 측정하였다. PBS를 투여한 대조군과 비교하여 트레할로스를 투여한 군에서 인슐린 저항성이 효과적으로 감소하였다(도 4e).

4-6. 자가포식 활성 평가

Atg7 ^+/- -ob/ob 마우스에 트레할로스를 8주 동안 복강 투여한 마우스에 류펩틴(leupeptin)(바필로마이신 A1과 같은 라이소좀 억제제로 체내 투약 시 사용함)을 복강에 투여한 후, 3시간 뒤에 마우스에서 얻은 간 조직을 갈아서 면역 블롯팅을 실시하였다.

그 결과, 류펩틴을 처리하지 않은 실험군에서 LC3-II가 증가되어 있는 것을 확인하였고, 류펩틴을 처리한 실험군에서도 대조군과 비교하였을 때, LC3-II가 더 많이 증가되어 있는 것을 확인하여, 유전적으로 자가포식이 저하된 마우스에서도 트레할로스가 자가포식 활성을 증가시켰음을 확인 할 수 있었다(‘P’는 PBS는 투여한 대조군임)(도 4f).

실시예 5: hIAPP 축적과 연관된 당뇨병에 대한 트레할로스의 효과

5-1. 실험동물

hIAPP ⁺ 마우스(Jackson Laboratory)는 FVB/N 계통으로 유지시켰다. hIAPP 이식유전자를 확인하기 위해 마우스의 꼬리에서 DNA를 얻어 특별한 프라이머를 이용하여 PCR 분석을 하였다: 정방향, 5′-GTCATGTGCACCTAAAGGGGCAAGTAATTCA-3′ 역방향, 5′-CGAGTGGGCTATGGGTTTGT-3′). IPGTT는 하룻밤 동안 공복상태를 유지한 마우스에 1 g/kg 글루코오스를 복강 내 1회 주사하여 0분, 15분, 30분, 60분, 120분 그리고 180분 마다 원터치 글루코미터(Lifescan)를 이용하여 혈액 글루코오스 농도를 측정하였다(Jung HS, et al., Cell Metab. 2008;8(4):31824. Han MS, et al. Diabetes. 2009;58(2):32936). hIAPP⁺GFP-LC3⁺ 마우스를 제작하기 위해 GFP-LC3⁺ 마우스(일본 동경대학교 N. Mizushima로부터 제공받음)를 hIAPP ⁺ 마우스와 교배시켰다. hIAPP ⁺ GFP - LC3 ⁺ 마우스를 hIAPP ⁺ 마우스와 재교배시켜 동종접합 hIAPP ^+/+ GFP -LC3 ⁺ 마우스를 제작하였다. hIAPP ^+/+ 마우스는 hIAPP ⁺ 마우스를 상호교배시켜 제작하였다.

5-2. 웨스턴 블롯팅

웨스턴 블롯 분석은 농도구배 겔에 단백질을 분리한 후 LC3(Novus), p62(Progen), 그리고 β-액틴(Santa Cruz)에 특이적인 항체를 이용하여 실시하였다.

5-3. 공초점 현미경

동결조직 섹션 또는 Lab-Tak II 챔버 슬라이드(Thermo)에서 배양한 세포에서 hIAPP 올리고머 침적은 탈파라핀화된 조직섹션에 대하여 면역형광염색을 실시한 후 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 관찰하였다. GFP - LC3 ⁺ 마우스의 췌도에서 GFP 형광도 공초점 현미경으로 측정하였다.

5-4. 조직염색

탈파라핀화된 섹션에 10 μM FSB(Sigma-Aldrich)를 처리하고 1시간 동안 염색하였다. 올리고머를 염색하기 위해서 동결조직 섹션에 1:150으로 희석한 A11을 3시간 동안 염색하였으며, DAPI로 핵을 염색한 후에 마운팅하고 형광 현미경(Nikon) 상에서 관찰하였다.

5-5. 트레할로스 처리

16-20주령 hIAPP ⁺ 마우스에 고지방식이를 제공하면서 PBS에 녹인 2 g/kg 트레할로스(Sigma-Aldrich)를 주당 3회 복강 내 투여하였다. 4주간 트레할로스를 투여한 후 IPGTT를 실시하고 AUC 및 IGI(insulinogenic index)를 계산하였다.

5-6. hIAPP 축적과 연관된 당뇨병에 대한 자가포식 조절자의 효과

자가포식 부전이 hIAPP 올리고머 또는 아밀로이드 침적과 연관된 인간 제2형 당뇨병의 발병의 주요 원인일 수 있기 때문에 본 발명자들은 자가포식 활성화가 hIAPP ⁺ 마우스의 대사 프로파일을 개선시킬 수 있는지에 대하여 실험을 실시하였다. 췌도 기능장애 및 글루코오스 불내성을 촉진하기 위해(Hull RL, et al. Diabetes. 2003;52(2):37279. Matveyenko AV, et al., Diabetes. 2009;58(4):90616) 고지방식이를 실시한 16-20주령 GFP - LC3 ⁺ 마우스에 인 비보에서 자가포식 활성을 증진시키는 것으로 알려진 트레할로스(2 g/kg)(Rodriguez-Navarro JA, et al. Neurobiol Dis.2010;39(3):42338. Sarkar S, et al., J Biol Chem. 2007;282(8):5641652)를 복강 내에 2주간 투여하였다. PBS를 처리한 대조군 마우스와 비교하여 LC3 반점이 현저히 증가하였고 이러한 결과를 통해 인 비보 췌장 췌도세포에서 트레할로스에 의해 유도된 자가포식의 활성화가 확인되었다(도 5a).

글루코오스 프로파일을 분석한 결과, 트레할로스를 투여하지 않은 PBS-처리 HFD-식이 hIAPP ⁺ 마우스의 비공복 혈당치는 PBS-처리 HFD-식이 hIAPP ^- 마우스와 비교하여 전체 처리 기간 동안 현저히 높았으며(P < 0.05~0.01), 이러한 결과는 hIAPP 발현과 연관된 β-세포 기능장애 때문일 것이다(도 5b). 한편, 트레할로스 처리 1주 차에 HFD-식이 hIAPP ⁺ 마우스의 비공복 혈당치는 PBS 처리 대조군과 비교하여 현저히 감소하였다(P < 0.05~0.01)(도 5b). 4주간의 트레할로스 투여는 HFD-식이 hIAPP ⁺ 마우스의 손상된 글루코오스 내성을 현저히 개선시켰으며(P < 0.05~0.01)(도 5c), PBS 처리 대조군과 비교하여 IGI를 증가시켰다(P < 0.05~0.01)(도 5d). PBS-처리 HFD-식이 hIAPP ⁺ 마우스의 글루코오스 불내성, IGI는 PBS-처리 HFD-식이 hIAPP ^- 마우스와 비교하여 현저히 악화되었으며, 이는 hIAPP 발현과 연관된 β-세포 기능장애 때문일 것이다(P < 0.05~0.001)(도 5c, d). HFD 식이 동안 체중 변화 및 사료 섭취는 트레할로스 투여에 의해 영향받지 않았다(데이터 미기재).

또한, hIAPP 올리고머 침적 변화에 따른 대사 개선을 관찰하였다. 4주간 트레할로스를 투여한 경우, 대조군과 비교하여 HFD-식이 hIAPP ⁺ 마우스의 췌도에서 A11로 염색된 hIAPP 올리고머의 침적이 현저히 약화되었다(P < 0.001)(도 5e). 이러한 결과는 트레할로스 투여에 따른 대사 개선이 β-세포 기능 증진으로 이어지는 자가포식에 의한 hIAPP 올리고머 제거 증가에 기인한 것임을 의미한다. 또한, HFD-식이 hIAPP ⁺ 마우스의 췌도에서 FSB에 의해 염색된 아밀로이드의 침적은 4주간의 트레할로스 투여에 의해 현저히 감소하였다(P < 0.001)(도 5f).

hIAPP 축적과 연관된 대사 프로파일 악화에 대한 자가포식 증진제의 효과를 확인하기 위해 본 발명자들은 HFD-식이 hIAPP ⁺ 마우스를 이용하였다. HFD는 대사 스트레스 및 hIAPP ⁺ 마우스에서 β-세포의 기능장애에 관여하여(Hull RL, et al. Diabetes. 2003;52(2):37279. Matveyenko AV, et al., Diabetes. 2009;58(4):90616), 지질 손상은 췌장 β-세포의 자가포식 활성을 손상시킬 수 있다(Quan W, et al. Diabetologia. 2012;55(2):39203.). 본 발명자들은 인 비보에서 자가포식 활성을 증진시키기 위해 자가포식 증진제로 잘 알려진 라파마이신 대신에 트레할로스를 사용하였다(Klionsky DJ, et al. Autophagy. 2012;8(4):44544.). 그 이유는 트레할로스는 인 비보에서 자가포식 활성을 증진시킴으로써 신경학적 결손을 개선시킨다고 알려져 있으나(Rodriguez-Navarro JA, et al. Neurobiol Dis. 2010;39(3):42338. Sarkar S, et al., J Biol Chem. 2007;282(8):5641652.), 라파마이신은 부정적인 대사 효과를 갖는다고 알려져 있기 때문이다(Fraenkel M, et al. Diabetes. 2008;57(4):94557, Sarbessov DD, et al. Mol Cell. 2006;22(2):15968). 실제로 본 발명자들은 트레할로스가 인 비트로 및 인 비보에서 췌도세포의 자가포식 활성을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 트레할로스는 HFD-식이 hIAPP ⁺ 마우스의 대사 프로파일을 현저히 개선시켰으며, β-세포 기능의 향상 및 hIAPP 올리고머 축적 약화를 동반하였다. 자가포식 활성 증진을 통해 대사 프로파일을 개선하는 트레할로스의 효과는 아직 보고된 바 없다. 이러한 결과들은 트레할로스가 췌도 아밀로이드 침적과 관련된 인간 제2형 당뇨병 또는 노화, 비만 또는 유전적 소인으로 인한 감소된 자가포식 활성에 대한 잠재적인 치료제가 될 수 있음을 의미한다.

종합하면 이러한 결과들은 아밀로이드 형성 hIAPP 단백질이 자가포식에 의해 제거되며, 자가포식 부전이 hIAPP 올리고머 축적 및 아밀로이드 침적을 초래한다는 것을 의미한다. hIAPP 올리고머에 의해 매개되는 유사 세포 손상은 β-세포의 사멸 및 Ca² ⁺의 단기적인 감소 또는 인슐린 분비와 같은 β-세포의 기능적 손상을 초래할 수 있다. 유전적 소인 또는 노화와 연관된 자가포식 부전은 인간 당뇨병 발달에 있어서 주요 요인이 될 수 있다. 따라서, 대사에 악영향을 미치지 않으며 자가포식 활성을 증진시킬 수 있는 트레할로스는 인간 제2형 당뇨병 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

트레할로스(trehalose)를 유효성분으로 포함하는 지방간, 당뇨 및 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환(metabolic disease)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 인슐린 저항성 증후군은 인슐린 저항성에 의한 비만, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 고인슐린혈증, 비알콜성 지방간 및 제2형 당뇨병으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 자가포식(autophagy) 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 간 지방을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 지방은 중성지방을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 혈액의 포도당 수치를 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.