CN111528368A - 杜仲发酵物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种杜仲发酵物的制备方法，包括：将杜仲叶粉与固体菌种混合后进行发酵的，其中，杜仲叶粉与固体菌种以质量比500：1的比例混合，混合后的混合物以g:ml计以3‑4：1的比例与水混匀。本发明还进一步公开了上述杜仲发酵物在制备水产饲料中的应用以及一种大黄鱼饲料。在饲料中添加低含量的杜仲发酵物可以通过增强大黄鱼的抗氧化能力、免疫力并改善肠道健康来提高大黄鱼的生长性能。

Description

杜仲发酵物的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种含有中药杜仲发酵物的制备方法及其在制备水产饲料中的应用。

背景技术

大黄鱼俗称“黄花鱼”，是我国养殖产量最多的海水鱼，2018年国内产量接近20万吨，具有巨大的经济价值。在实际生产中发现，养殖大黄鱼容易出现生长缓慢和免疫力下降等问题，而且在大黄鱼养殖过程中极易发生脂肪异常沉积、机体免疫力下降和炎性反应等诸多问题，产业上亟待要求解决。

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)属杜仲科、杜仲属，为我国特有树种。具有降血压、降脂肪和血糖、预防肥胖、安胎、强筋健骨、改善糖代谢、增强免疫力等功效，作为中药在中国已有上千年的历史。现代药理研究表明：杜仲叶中含有的有效成分约80多种，大致可分为环烯醚萜类、木脂素类、黄酮类、杜仲胶、苯丙素类、酚类等物质。动物实验表明，杜仲具有抗炎抑菌，增强免疫功能和抗氧化能力等作用，长期使用能够提高养殖动物采食量，改善肠道环境和菌群组成，促进养殖动物肠道健康、提高机体免疫力和改善养殖产品品质等显著优势。

已有研究表明，中药材药效的发挥需要合适的加工工艺，而微生物发酵作为一种现代药学的研究手段，已被证明是发挥杜仲药效的有效方式，不仅可以改良药物的适口性以及口感，提高其有效成分利用率，还可以除去其中有毒成分的毒害副作用，对杜仲的药效提升作用显著。同时，发酵过程中添加和产生的益生菌和其代谢物可以增加饲料的生长性能，调节肠道菌群。经发酵处理后杜仲叶可以使其达到最优添加条件，使杜仲叶中黄酮、绿原酸等有效活性物质损失较少，保留药材的功效，而且还能增加饲料的适口性。

国内将杜仲作为添加剂在猪、反刍动物、家禽及部分鱼类饲料有相关研究。杜仲叶粉应用于生长育肥猪饲料中，可以显著提高猪的生长性能和屠宰率；杜仲叶可增加牦牛对饲料的消化率，增强机体免疫力。促进山羊的增重率，并改善机体免疫机制；在獭兔养殖中也具有类似的功效；杜仲叶作为添加剂应用于蛋鸡生产中，可以提高鸡蛋和肉的生产品质,并且可以增加鸡的肌肉胶原蛋白含量，增强其免疫力。此外，杜仲在水产养殖动物也有相关研究的报道。粉碎杜仲叶可促进草鱼和鲤鱼的生长、免疫力和饲料利用率。饲料中添加0.15％杜仲提取物可分别提高罗非鱼、草鱼幼鱼、异育银鲫的增重率；添加6％杜仲叶粉提高了鲤增重率21％；在饲料中分别添加4％、2％杜仲能显著改善草鱼、凡纳滨对虾生产性能。杜仲及其提取物已被证实可提高鳗肌肉胶原蛋白水平。但有关于杜仲作为饲料添加剂在海水鱼养殖方面的研究却少有报道。

发明内容

本发明针对上述产业需要提供了一种能够有效改善养殖中的大黄鱼生长状态、提升大黄鱼机体免疫力的杜仲发酵粉。

一种杜仲发酵物的制备方法，包括：

将杜仲叶粉与固体菌种混合后进行发酵的，其中，杜仲叶粉与固体菌种以质量比500：1的比例混合，混合后的混合物以g:ml计以3-4：1的比例与水混匀；优选地，所述菌种为乳酸菌、酵母菌以及乳酸菌和酵母菌的混合菌种；进一步优选地，所述混合菌种中乳酸菌与酵母菌的比例为1：2-4。

本发明还提供了基于上述方法制备的杜仲发酵粉。

本发明进一步提供了一种大黄鱼饲料，其包含有上述的杜仲发酵物。

在根据本发明的一个实施方案中，所述杜仲发酵物在饲料中的添加量为1％-2％wt。

在根据本发明的一个实施方案中，所述大黄鱼饲料还包括：鱼粉、谷朊粉、大豆浓缩蛋白、鱼油、大豆磷脂、面粉和复合预混料。

本发明进一步提供了一种杜仲发酵物在制备水产饲料中的应用。

优选地，所述水产饲料为海鱼饲料。

本发明针对我国大黄鱼饲料应用推广中存在的问题，围绕杜仲这一新型植物型饲料添加剂开展研究，旨在开发出促进大黄鱼生长、免疫和抗氧化能力的营养调控策略。通过养殖实验，探究发酵杜仲叶对大黄鱼生长、抗氧化能力和免疫力的影响，确定其在大黄鱼配合饲料中适宜的添加量，为杜仲叶作为大黄鱼配合饲料添加剂提供理论支持，对保障我国大黄鱼养殖业健康绿色可持续发展具有重要意义。本发明在研究中发现，添加1％(10g/kg)发酵杜仲叶粉可以显著地增加大黄鱼幼鱼的生长性能，并对大黄鱼的摄食率没有影响。这个结果与以前的研究不同(Beili Zhang et al.,2004)，在该研究中认为，当发酵杜仲叶粉的添加剂量超过5.0g/kg时，杜仲叶粉降低了特定生长率(SGR)和饲料摄入量(FI)，从而对鱼体的正常生长作用产生抑制作用。而本发明对杜仲叶进行发酵处理后，可以有效改善添加杜仲饲料的适口性并减少苦涩味，从而对大黄鱼的采食量没有产生负面影响，避免产生厌食效应。而且，添加1％(10g/kg)发酵杜仲叶粉可以显著地增加大黄鱼幼鱼的特定生长率(SGR),原因是经过发酵处理后的杜仲叶不仅减少黄酮，绿原酸，桃叶珊瑚苷等有效成分的损失，而且丰富了益生菌，维生素、有机酸、氨基酸、肽、酶和促生长因子的含量，更利于动物对营养物质进行消化与吸收，从而改善生长性能，并且能够起到提高饲料利用效率的作用。此外，本研究还发现添加发酵杜仲叶粉可以显著改善肠道结构损伤并且减少肠道氧化应激保护肠道健康，同时减轻炎症反应对机体的损伤，这也是可以作为解释添加1％(10g/kg)发酵杜仲叶粉可以显著地增加大黄鱼生长性能的原因。

附图说明

图1为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼增重率的影响示意图；

图2为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼特定生长率的影响示意图；

图3为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼存活率的影响示意图；

图4为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼饲料系数的影响示意图；

图5为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼摄食率影响示意图；

图6为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼血清抗氧化酶和肝脏抗氧化酶的影响示意图；

图7为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼肠段抗氧化酶和肠段脂肪酶的影响示意图；

图8为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼肝损伤酶的影响示意图；

图9为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼肠段炎性基因表达量的影响示意图；

图10a和图10b分别为发酵仲叶粉对大黄鱼肠道粘膜褶皱高度的影响示意图；

图11a和图11b分别为发酵仲叶粉对大黄鱼肠道微绒毛厚度的影响示意图；

具体实施方式

以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。

下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

如无特殊说明，本发明中所用到的试剂均可以商购途径购买得到。

实施例1 杜仲叶粉最优发酵条件的确定

选择麦氏琼脂培养基:取麦氏琼脂粉末50g，加入装有1000mlL蒸馏水的锥形瓶中，加热煮沸溶解并搅拌，121℃高温灭菌15min后备用。未冷却凝固时分别倒入8个灭菌干燥的培养皿中，等待琼脂冷却凝固。冷却后放入4℃冷藏备用。

制备MH肉汤，称取MH肉汤粉末30g，加入装有1000mL蒸馏水的锥形瓶中加热煮沸溶解并搅拌，121℃高温灭菌15min后备用。冷却后4℃冷藏备用。

取冷冻保存的塑料冻存管，立即放置在38℃～40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰完全溶解为止，开启塑料冻存管，吸取菌液移植于麦氏琼脂培养基上，37℃恒温培养18～24h。挑取该麦氏琼脂培养基上的单个菌落接种至另一麦氏琼脂培养基上进行菌种复苏。采用麦氏比浊法进行细菌计数，勾取平板上菌落1～2个，置于MH肉汤中，37℃恒温振荡培养至对数生长期后进行细菌计数。菌液4℃冰箱保存备用，临用前稀释为10⁶CFU/mL。

根据下表1分别对杜仲叶粉进行发酵，其中，固体混合菌种由乳酸菌和酵母菌组成，乳酸菌和酵母菌组成比例是3：1。乳酸菌和酵母菌均购自青岛中德健联杜仲生物科技有限公司。

表1：杜仲叶粉发酵实验

实施例2 发酵杜仲叶粉在大黄鱼饲料中的最适添加量的确定

1)发酵杜仲叶粉添加剂饲料的制备

选择经粉碎干燥处理后的杜仲叶粉经发酵处理后形成发酵杜仲叶粉，根据大黄鱼生长营养需求设计实验配方制作实验基础材料，在饲料中梯度添加发酵杜仲叶粉，制备不同发酵杜仲叶粉添加量的大黄鱼饲料(发酵杜仲叶添加剂实验配方见表2)。实验用大黄鱼幼鱼体长为8-11cm。

表2：发酵杜仲叶添加剂实验配方

2)摄食生长实验

将不同添加量的发酵杜仲叶粉的大黄鱼饲料饲喂大黄鱼70d后，取整鱼样进行体重体长的测量，并计算出大黄鱼的存活率、增重率、特定生长率、饲料转化率等。图1所示为发酵杜仲叶粉对于增重率的影响，如图1所示的，在大黄鱼饲料中添加1％发酵杜仲叶粉可以显著地增加大黄鱼增重率。图2所示为发酵杜仲叶粉对于特定生长率的影响，由图1、图2和图3可知在饲料中添加低含量(1％～2％)的发酵杜仲叶粉可以提高大黄鱼的增重率、特定生长率和存活率，如图2所示的，在大黄鱼饲料中添加1％发酵杜仲叶粉可以显著地增加大黄鱼特定生长率，图3所示的，在大黄鱼饲料中添加1％～2％发酵杜仲叶粉有增加大黄鱼存活率的趋势，但是差异不显著。

3)生理生化指标

在饲喂不同添加量发酵杜仲叶粉大黄鱼饲料后，于实验结束后取血清样品、肝脏样品、肠道样品、全鱼，测定抗氧化指标(CAT、SOD、T-AOC)、血清生化指标(AST、ALT、ALP)等。

结果如图3、图4、图5和图6所示，其中图3为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼存活率的影响示意图；图4为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼摄食率和饲料系数的影响示意图，可见在大黄鱼饲料中添加2％发酵杜仲叶粉可以显著地降低大黄鱼饲料系数；图5为发酵杜仲叶粉对于饲料系数的影响示意图，可见在大黄鱼饲料中添加1％发酵杜仲叶粉并不会影响大黄鱼摄食率；图6为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼血清抗氧化酶和肝脏抗氧化酶的影响示意图，可见在大黄鱼饲料中添加2％发酵杜仲叶粉可以显著地增加血清中的过氧化氢酶活力以及超氧化歧化酶活力，并且饲料中在添加1％～2％发酵杜仲叶粉后对大黄鱼肝脏的过氧化氢酶活力有显著地提高；图7为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼肠段抗氧化酶和肠段脂肪酶的影响示意图，可见在大黄鱼饲料中添加2％发酵杜仲叶粉可以显著地增加肠道中的过氧化氢酶活力，并且饲料中在添加1％～2％发酵杜仲叶粉后对大黄鱼肠道的超氧化歧化酶活力有显著地提高。

4)免疫指标

测定饲料中添加不同梯度发酵杜仲叶粉的大黄鱼的溶菌酶活力、补体途径活力及免疫球蛋白含量探究其对大黄鱼机体免疫力的影响，通过检测肠道、肝脏等组织的炎性基因(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等)的表达量探究机体炎症反应的变化。

结果如图8、图9、图10a、图10b、图11a和图11b所示，其中，图8为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼肝损伤酶的影响示意图，可见在大黄鱼饲料中添加1％发酵杜仲叶粉可以显著地降低血清中的谷草转氨酶活力，并对血清中的谷丙转氨酶活力有降低的趋势；图9为发酵杜仲叶粉对于大黄鱼肠段炎性基因表达量的影响示意图，可见在大黄鱼饲料中添加1％发酵杜仲叶粉可以显著地降低前肠段中的促炎因子IL-8和IL-1β的表达量；图10a和图10b分别为发酵仲叶粉对大黄鱼肠道粘膜褶皱高度的影响示意图，其中，图10a前肠端的纵切放大图，标出长度部位为肠道粘膜褶皱，如图10b所示的，在大黄鱼饲料中添加1％～2％发酵杜仲叶粉可以显著地增加前肠段中肠道粘膜褶皱高度，增加大黄鱼的消化能力；图11a和图11b分别为发酵仲叶粉对大黄鱼肠道微绒毛厚度的影响示意图，图11a前肠端的纵切放大图，标出长度部位为肠道微绒毛；如图11b所示的，在大黄鱼饲料中添加1％发酵杜仲叶粉可以显著地增加前肠段中肠道微绒毛厚度，增加大黄鱼的吸收能力。

由以上可知发酵杜仲叶粉作为饲料添加剂还可以改善肠道结构，提高肠道脂肪酶活力，实现提高摄食率，降低饲料系数的目的。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种杜仲发酵物的制备方法，其特征在于，包括：

其特征在于，将杜仲叶粉与固体菌种混合后进行发酵的，其中，杜仲叶粉与固体菌种以质量比1：6的比例混合，混合后的混合物以g:ml计以1：16-20的比例与水混匀。

2.如权利要求1所述的杜仲发酵物的制备方法，其特征在于，所述菌种为乳酸菌、酵母菌以及乳酸菌和酵母菌的混合菌种。

3.如权利要求2所述的杜仲发酵物的制备方法，其特征在于，所述混合菌种中乳酸菌与酵母菌的比例为1：2-4。

4.一种杜仲发酵物，其特征在于，是通过如权利要求1-3中任一项所述的制备方法制备得到的。

5.一种大黄鱼饲料，其特征在于，所述大黄鱼饲料包含有如权利要求4所述的杜仲发酵物。

6.如权利要求5所述的大黄鱼饲料，其特征在于，所述杜仲发酵物在饲料中的添加量为1％～2％wt。

7.如权利要求1-3中任一项所述的大黄鱼饲料，其特征在于，还包括：鱼粉、谷朊粉、大豆浓缩蛋白、鱼油、大豆磷脂、面粉和复合预混料。

8.如权利要求4所述的杜仲发酵物在制备水产饲料中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述水产饲料为海鱼饲料。

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