JP2015191041A - 蛍光キューブ及び光学顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】観察光路への励起光の入射を抑制する技術を提供する。【解決手段】蛍光キューブ１２は、蛍光観察機器において使用される。蛍光キューブ１２は、励起波長域の光を遮断して蛍光波長域の光を選択的に透過させるバリアフィルタ１６と、45度の入射角で入射した励起波長域の光を反射し、45度の入射角で入射した蛍光波長域の光を透過させるダイクロイックミラー１５と、バリアフィルタ１６の光学面とダイクロイックミラー１５の光学面のなす角度が45度よりも大きくなるように、バリアフィルタ１６とダイクロイックミラー１５とを支持する筐体１７と、を備える。【選択図】図５

Description

本発明は、蛍光キューブ及びそれを備えた光学顕微鏡に関する。

蛍光観察手法は、分子と結合した蛍光色素からの蛍光を検出することで細胞や組織などを観察する手法であり、生物や医学の分野において広く利用されている。また、近年では、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）などに代表される毒性の無い発光性の蛋白質（以降、蛍光蛋白質と記す）を細胞内に発現させることが可能となったため、生理的な活性が保たれた試料（つまり、生きた試料）を観察することも可能となっている。このため、現在では、蛍光観察手法は、生きた試料を用いた研究に盛んに利用されていて、例えば、一分子レベルで試料を可視化する研究などにも利用されている。

生きた試料を対象とした観察では試料に与えるダメージを極力抑えることが望ましい。その一方で、ダメージ抑制のため試料に照射する励起光のエネルギーを抑えると、試料から放出される蛍光も弱くなってしまう。特に、一分子レベルで試料を可視化する場合には、放出される蛍光は極めて微弱なものとなってしまう。

このような事情から、検出される蛍光が微弱な場合でも試料を正確に観察することができるように、蛍光とともに検出されるノイズ（励起光や自家蛍光など）を十分に減らして高いS/N比を実現する技術が求められている。これに関連する技術は、例えば、特許文献１に開示されている。

特開２００５−３２１７５３号公報

ところで、蛍光観察手法の中でも光学顕微鏡を用いた手法は多くの研究者が用いる主要な手法である。光学顕微鏡を用いた蛍光観察手法では励起光から蛍光を分離するためのキーパーツとして、蛍光キューブが用いられることが多い。蛍光キューブには、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、バリアフィルタから成る蛍光フィルタセットが組み込まれ、この蛍光フィルタセットの性能が、ノイズを減らしつつ蛍光を効率よく検出するために重要な役割を果たす。

このうち、ダイクロイックミラーは通常、一般的な顕微鏡光学系からの要請により、照明光路の光軸および観察光路の光軸に対して正確に45度傾けて配置される。このため、ダイクロイックミラーは45度の入射角で入射する光に対して所望の波長透過率特性（一般的には45度の入射角で入射する励起光を反射させて蛍光を透過させる特性）が得られるように、設計される。

しかしながら、ダイクロイックミラーに入射する光には、例えば、蛍光キューブの筐体で反射・散乱した励起光など45度とは異なる入射角で入射するものが含まれる。特許文献１には、このうちの光学面に対して垂直に近い角度（45度によりも小さな入射角）で入射する励起光をダイクロイックミラーで反射させる技術が記載されている。ただし、特許文献１の技術を用いても、ダイクロイックミラーに45度よりも大きな入射角で入射する励起光はダイクロイックミラーを透過して観察光路へ入射してしまう。

以上のような実情を踏まえ、本発明は、観察光路への励起光の入射を抑制する技術を提供することを目的とする。

本発明の一態様は、蛍光観察機器において使用される蛍光キューブであって、励起波長域の光を遮断して蛍光波長域の光を選択的に透過させる蛍光波長選択素子と、45度の入射角で入射した前記励起波長域の光を反射し、45度の入射角で入射した前記蛍光波長域の光を透過させる波長分離素子と、前記蛍光波長選択素子の光学面と前記波長分離素子の光学面のなす角度が45度よりも大きくなるように、前記蛍光波長選択素子と前記波長分離素子とを支持する筐体と、を備える蛍光キューブを提供する。

本発明の別の態様は、照明光路と観察光路の交わる箇所に、前記照明光路の光軸及び前記観察光路の光軸の各々と前記波長分離素子の光学面とのなす角度が45度となるように配置された、上記態様の蛍光キューブを備える光学顕微鏡を提供する。

本発明の更に別の態様は、照明光路と観察光路の交わる箇所に、前記照明光路の光軸及び前記観察光路の光軸の各々と前記波長分離素子の光学面とのなす角度が45度となるように配置された、上記態様の蛍光キューブと、前記励起波長域の光を出射するレーザ光源と、を備える光学顕微鏡を提供する。

本発明によれば、観察光路への励起光の入射を抑制する技術を提供することができる。

蛍光顕微鏡の光学系の概略図である。 蛍光フィルタセットの波長−透過率特性を説明するための図である。 蛍光キューブの構成と蛍光キューブで生じる散乱光を例示した図である。 本発明の一実施形態に係る蛍光顕微鏡の構成を例示した図である。 本発明の一実施形態に係る蛍光キューブの構成を例示した図である。 本発明の一実施形態に係る蛍光フィルタセットの正規の角度で入射する光に対する波長−透過率特性を示した図である。 入射角の異なる散乱光Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３に対する本発明の一実施形態に係るダイクロイックミラーの波長−透過率特性を示した図である。 散乱光Ｃ２に対する本発明の一実施形態に係るバリアフィルタの波長−透過率特性を示した図である。 散乱光Ｃ３に対する本発明の一実施形態に係るバリアフィルタの波長−透過率特性を示した図である。 正規の角度で入射する光に対する本発明の実施例１に係る蛍光フィルタセットの波長−透過率特性を示した図である。 正規の角度以下の角度で入射する光に対する本発明の実施例１に係るダイクロイックミラーの波長−透過率特性を示した図である。 正規の角度以上の角度で入射する散乱光Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３に対する本発明の実施例１に係るダイクロイックミラーの波長−透過率特性を示した図である。 バリアフィルタの配置角度を変更した場合における、入射角の異なる散乱光Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３に対する本発明の実施例１に係るバリアフィルタの波長−透過率特性を示した図である。 正規の角度で入射する光に対する本発明の実施例２に係る蛍光フィルタセットの波長−透過率特性を示した図である。 正規の角度以下の角度で入射する光に対する本発明の実施例２に係るダイクロイックミラーの波長−透過率特性を示した図である。 正規の角度以上の角度で入射する散乱光Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３に対する本発明の実施例２に係るダイクロイックミラーの波長−透過率特性を示した図である。 本発明の実施例２に係る蛍光顕微鏡の構成を例示した図である。

本発明の一実施形態である蛍光キューブについて説明する前に、一般的な蛍光キューブ２について説明する。

まず、蛍光顕微鏡１０を用いた蛍光観察手法において、蛍光キューブ２による蛍光分離がどのように行われるのかについて、図１から図３を参照しながら説明する。図１は、光学顕微鏡の一種である蛍光顕微鏡１０の光学系の概略図である。図２は、図１に示す励起フィルタ４、ダイクロイックミラー５及びバリアフィルタ６からなる蛍光フィルタセット３の波長−透過率特性を説明するための図である。図３は、蛍光キューブ２の構成と蛍光キューブ２で生じる散乱光を例示した図である。

白色光源１から出射した光（照明光）は、光学面が照明光路の光軸と直交するように配置された励起フィルタ４を透過する。その際、473-495nmの範囲の波長（励起波長域）の光が選択されることにより、励起光Ｅが作られる。励起フィルタ４を透過して作られた励起光Ｅは、光学面と照明光路の光軸（及び観察光路の光軸）とのなす角度が45度になるように配置されたダイクロイックミラー５で反射し、対物レンズ９によってＧＦＰにより蛍光標識された試料Ｓに照射される。

ＧＦＰは、図２に示す吸収スペクトルの光を吸収し図２に示す蛍光スペクトルの光を発する特性を有している。このため、励起光Ｅが照射された試料Ｓは、図２に示す蛍光スペクトルを有する蛍光Ｆを発する。この蛍光Ｆは、試料Ｓで散乱した励起光Ｅとともに対物レンズ９に入射する。その後、これらの光（蛍光Ｆ及び励起光Ｅ）は、対物レンズ９を経て入射するダイクロイックミラー５及びバリアフィルタ６で分離され、蛍光Ｆは観察光路に導かれる。

試料Ｓから生じた蛍光Ｆは、試料Ｓで散乱した励起光Ｅの10^-6又は10^-7程度の光量しかなく非常に微弱である。しかしながら、励起光Ｅは、図２に示すように、特にバリアフィルタ６によって十分なレベルまで（具体的には10^-6又は10^-7以下の光量まで）カットされる。このため、蛍光キューブ２は、観察光路への励起光Ｅの入射に起因するノイズを抑制することができる。

次に、本発明者が見出した一般的な蛍光キューブ２の課題について説明する。
蛍光キューブ２の上述した作用は予め設計された角度（例えば、ダイクロイックミラー５に対しては45度、バリアフィルタ６に対しては5度。以降、正規の角度と記す）で入射した光に対するものである。正規の角度で入射しない光、特に正規の角度とは大きく異なる角度で入射する光については上述した作用とは異なる作用が生じる可能性が高く、観察光路への励起光Ｅの入射を十分に抑制することができない。これは、ダイクロイックミラー５やバリアフィルタ６は一般に基板に光学多層膜が形成された多層膜フィルタであり、多層膜フィルタの波長−透過率特性は入射角によって異なるからである。

正規の角度で入射しない光には、図３に示すような蛍光キューブ２の筐体７で反射・散乱した励起光がある（以降では、これらの励起光を散乱光と記す）。白色光源１から出射した光はコリメータレンズによって平行光に変換されて蛍光キューブ２に入射する。このため、光軸と平行に入射する軸上光については予め光束径が適切に設計されていれば筐体７へ照射されないため散乱光は生じない。一方、軸外光については光軸に対して傾いた平行光として蛍光キューブ２に入射することになるため、特に軸外光の光束の周辺部分が筐体７に照射されやすく、散乱光が生じやすい。

軸外光の強度が弱いこと、散乱時に減衰することなどから、軸外光に起因する散乱光の影響は軽微であるとも考えられる。しかしながら、上述したように微弱な蛍光しか発しない一分子レベルの極小な試料や生きた試料を用いた研究などにも蛍光キューブ２が使用されることを考慮すると、観察系（又は観察光路）に入るノイズを極力減らして、散乱光の影響を積極的に除去することが望ましい。

そこで、蛍光キューブ２で生じる典型的な散乱光を取り上げて、それぞれの散乱光の影響を考察する。
蛍光キューブ２の筐体７の内面には、光の反射・散乱を抑えるため、黒アルマイト処理、黒植毛紙の貼付け処理、砂目処理などが施されているのが通常である。例えば、図３に示す反射防止シート８は、黒植毛紙からなる。ただし、黒アルマイトでも5-10%％、植毛紙でも0.5-1%程度の反射があり、反射・散乱を抑えるための処理には限界がある。特に、光学部品の取り付け部分には、その取り付け精度への要請から表面に凸凹や砂目を施すことが難しい。このため、励起フィルタ４の取り付け部分（図３に示す部分Ａ、部分Ｂ）やダイクロイックミラー５の取り付け部（図３に示す部分Ｃ）から生じる散乱光は強くなりやすく、その意味において蛍光キューブ２で生じる典型的な散乱光といえる。

このうち、図３に示す部分Ａから生じる散乱光が観察光路に入射するには、部分Ａでの散乱後、少なくとも１回以上の散乱が必要となる。鏡面反射の場合とは異なり散乱には、光量を数％以下程度にまで減衰させる効果があるため、部分Ａから生じる散乱光の影響は極めて小さく無視できると考えられる。

これに対して、図３に示す部分Ｂ、部分Ｃから生じる散乱光は、その後散乱することなく観察光路に入射し得るので、ダイクロイックミラー５又はバリアフィルタ６で十分に減衰させることが出来ない場合には、その影響は無視できない。

部分Ｂ、部分Ｃから生じる散乱光を比較すると、図３に示すように、部分Ｂから生じる散乱光はダイクロイックミラー５に垂直に近い角度（入射角が概ね0度から20度）で入射するのに対して、部分Ｃから生じる散乱光はダイクロイックミラー５に対して45度を越える入射角で入射する。

部分Ｂから生じる散乱光については、特許文献１に記載される技術をダイクロイックミラー５に適用することで、観察光路への入射を抑制しその影響を排除することが可能である。一方、部分Ｃから生じる散乱光については、特許文献１に記載される技術を適用するとむしろ効率よくダイクロイックミラー５を透過してしまう可能性がある。これは、良く知られているように、多層膜フィルタ（ダイクロイックミラー５）の波長−透過率特性は入射角が大きくなるほど短波長側にシフトするからである。

以下、図４及び図５を参照しながら、本発明の一実施形態である蛍光顕微鏡２０及び蛍光キューブ１２について説明する。図４は、本発明の一実施形態に係る蛍光顕微鏡２０の構成を例示した図である。図５は、本発明の一実施形態に係る蛍光キューブ１２の構成を例示した図である。

図４に示す蛍光顕微鏡２０は、試料Ｓからの蛍光を検出することで試料Ｓを観察する蛍光観察機器であり、照明光路上に、光源１１と、照明光学系２１とを備え、観察光路上に、結像レンズ２２と、検出装置２３とを備えている。蛍光顕微鏡２０は、さらに蛍光キューブ１２を備え、蛍光キューブ１２は照明光路と観察光路の交わる箇所に配置されている。また、蛍光顕微鏡２０は、蛍光キューブ１２と試料Ｓの間に対物レンズ１９を備えている。

光源１１は、例えば、白色光源であり、励起波長域を含む波長域の照明光を出射する。照明光学系２１は、光源１１からの照明光を所定の光束径の平行光に変換して蛍光キューブ１２に入射させる。対物レンズ１９は、蛍光キューブ１２からの励起光を標本Ｓに照射し、標本Ｓからの蛍光及び標本Ｓを反射・散乱した励起光を蛍光キューブ１２に入射させる。結像レンズ２２は、蛍光キューブ１２を透過した蛍光を検出装置２３の受光面に集光させる。検出装置２３は、例えば、光電変換素子が二次元に配列されたＣＣＤイメージセンサを含むＣＣＤカメラである。

一般的な蛍光キューブ２は、上述したように、軸外光に起因する散乱光を十分に遮断することができないといった課題を有している。中でも図３に示す部分Ｃから生じる散乱光のようにダイクロイックミラー５に45度を越える入射角で入射する散乱光の排除が困難である。本発明の一実施形態である蛍光キューブ１２は、この点に着目して改善がなされたものである。

蛍光キューブ１２は、図５に示すように、励起波長域の光を選択的に透過させる励起波長選択素子である励起フィルタ１４、波長分離素子であるダイクロイックミラー１５、及び、励起波長域の光を遮断して蛍光波長域の光を選択的に透過させる蛍光波長選択素子であるバリアフィルタ１６からなる蛍光フィルタセット１３と、蛍光フィルタセット１３を支持する筐体１７と、を備えている。さらに、筐体１７のダイクロイックミラー１５を介して励起フィルタ１４と対向する位置には反射防止シート１８が貼り付けられている。

ダイクロイックミラー１５は、入射角45度を正規の角度として設計されていて、少なくとも、45度の入射角で入射した励起波長域の光を反射し、45度の入射角で入射した蛍光波長域の光を透過させるように構成されている。また、励起フィルタ１４、バリアフィルタ１６は、それぞれ入射角0度、5度を正規の角度として設計されている。

筐体１７は、ダイクロイックミラー１５の光学面とバリアフィルタ１６の光学面とのなす角が45度よりも大きくなるように、ダイクロイックミラー１５とバリアフィルタ１６とを支持している。より具体的には、ダイクロイックミラー１５は、その光学面が照明光路Ｐ１の光軸及び観察光路Ｐ２の光軸の各々と45度の角度をなすように配置されるのに対して、バリアフィルタ１６は、その光学面が観察光路Ｐ２の光軸と直交するようには配置されず、ダイクロイックミラー１５の傾きとは反対の方向に5度傾けて配置される。また、励起フィルタ１４は、その光学面が照明光路Ｐ１の光軸と直交するように配置されている。

図３に示す一般的な蛍光キューブ２でも、バリアフィルタ６を反射した光がゴーストやフレアとなり観察像の解像を劣化させる事態を避けるため、筐体７は、観察光路の光軸に対して光学面が直交しないように、バリアフィルタ６を支持している。その傾き角は、通常は光学系の要請によって2-6度程度である。ただし、蛍光キューブ２では、蛍光キューブ２の小型化の要請から、ダイクロイックミラー５の傾きに近づくようにバリアフィルタ６が傾けられる。

図５に示す破線は、一般的な蛍光キューブ２におけるバリアフィルタ６の配置（つまり、従来の配置例）を示している。このように、蛍光キューブ１２は、バリアフィルタ１６を傾ける方向が従来の配置例とは逆であり、この点において蛍光キューブ２とは全く異なっている。このバリアフィルタの配置の違いによって、蛍光キューブ１２は、蛍光キューブ２では十分に減衰させることができない部分Ｃからの散乱光を減衰させることができる。

以下では、図５に示す異なる３つの方向に散乱した散乱光（散乱光Ｃ１、散乱光Ｃ２、散乱光Ｃ３）を例にして、部分Ｃからの散乱光の減衰が、バリアフィルタの配置の違いによってどの程度異なるかについて具体的に説明する。

表１は、図５に示す３つの散乱光が各光学素子（ダイクロイックミラー１５、バリアフィルタ１６）に入射する角度を示したものである。ここでは、ダイクロイックミラー１５の光学面とバリアフィルタ１６の光学面とのなす角θが40度である場合を従来の配置例として、ダイクロイックミラー１５の光学面とバリアフィルタ１６の光学面とのなす角θが50度である場合を本発明の配置例として、示している。

蛍光フィルタセット１３が正規の角度で入射する光に対して図６に示す波長−透過率特性を有しているとすると、散乱光Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３に対するダイクロイックミラー１５の波長−透過率特性は、図７に示すものとなる。散乱光が励起波長域の光であることを考慮すると、45度に近い角度で入射する散乱光Ｃ１の透過量はさほど多くないが、散乱光Ｃ２及び散乱光Ｃ３はその多くが透過してしまう。

図８、図９は、それぞれ、散乱光Ｃ２、Ｃ３に対するバリアフィルタ１６の波長−透過率特性を示した図である。図８を参照すると、本発明の配置例では、バリアフィルタ１６は励起波長域全体の平均で0.0001％以下の透過率を示しているため、ほとんど散乱光Ｃ２を通さない。これに対して、従来の配置例では、バリアフィルタ１６は495nm程度の波長域において最大30％を超える透過率を示し、励起波長域全体の平均でも4％を超える透過率を示している。このため、本発明の配置例の方がバリアフィルタ１６ではるかに多くの散乱光Ｃ２を遮断することができる。

図９を参照すると、本発明の配置例でも、バリアフィルタ１６は490-495nmの波長域で最大50％程度もの透過率を示し、励起波長域全体の平均でも4％程度の透過率を示す。しかしながら、バリアフィルタ１６は従来の配置例では、本発明の配置例よりも広い波長域（470-495nm）において高い透過率を示し、励起波長域全体の平均でも30％近い透過率を示す。このため、散乱光Ｃ２の場合と同様に、本発明の配置例の方がバリアフィルタ１６ではるかに多くの散乱光Ｃ３を遮断することができる。

表２は、部分Ｃからの散乱光（散乱光Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３を含む）がバリアフィルタ１６を透過する割合を、バリアフィルタ１６を本発明の配置例で配置した場合と従来の配置例で配置した場合とで比較して示したものである。表２から明らかなように、バリアフィルタ１６を本発明の配置例で配置することで、バリアフィルタ１６を従来の配置例で配置した場合に比べて、散乱光の透過を著しく抑えることができる。
以下、本発明の各実施例に係る蛍光キューブについて説明する。

本実施例に係る蛍光キューブは、図４に示す蛍光顕微鏡のような蛍光観察機器の照明光路と観察光路の交わる箇所に配置されて使用される蛍光キューブである。

本実施例に係る蛍光キューブは、励起波長域の光を選択的に透過させる励起波長選択素子である励起フィルタ、波長分離素子であるダイクロイックミラー、及び、励起波長域の光を選択的に透過させる蛍光波長選択素子であるバリアフィルタからなる蛍光フィルタセットと、蛍光フィルタセットを支持する筐体とを有している。

蛍光キューブは、ダイクロイックミラーの光学面が照明光路の光軸及び観察光路の光軸の各々と45度の角度をなすように配置される。バリアフィルタは、その光学面が観察光路の光軸と5度の角度をなし、かつダイクロイックミラーの光学面と50度の角度をなすように配置され、筐体によって支持されている。励起フィルタは、その光学面が照明光路の光軸と直交するように、つまり、その光学面がダイクロイックミラーの光学面と45度の角度をなし且つバリアフィルタの光学面と90度よりも大きな角度（ここでは95度）をなすように配置され、筐体に支持されている。これらの配置は、図５に示す上述した実施形態に係る蛍光キューブ１２と同様である。

蛍光フィルタセットを構成する各フィルタは、いずれも基板に光学多層膜が形成された多層膜フィルタであり、図１０に示す波長−透過率特性を有している。

励起フィルタ、バリアフィルタは、それぞれ、オリンパス製の蛍光フィルタBP470-495、BA510IFであり、上述した励起フィルタ１４、バリアフィルタ１６と透過帯域幅や光の遮断性能、光の入射角が変わった時の特性変化などに関して同等の特性を有している。なお、励起フィルタの基板とバリアフィルタの基板は、いずれも蛍光波長域の光及び励起波長域の光に対して透明な基板である。

本実施例に係るダイクロイックミラーは、上述したダイクロイックミラー１５と光学多層膜の構成は同じであるが、光学多層膜が形成される基板の材料（基材）が異なっている。基材は励起波長域の光を遮断するショット社製の色ガラスGG495であり、基板はこれを1mm厚に両面研磨した平行平板である。基板の表面（主反射面）には表３に示す構成（32層構成、基準波長＝500nm）の光学多層膜が形成され、一方、基板の裏面には反射防止膜が形成されている。

本実施例に係る筐体は、アルミにより作られていて、その表面には、その内部を含めて全面黒アルマイト処理が施されている。また、励起フィルタに対向する位置には、図５に示す蛍光キューブ１２と同様に、(株)ベルセード製0.35mm厚植毛紙からなる反射防止シートが貼り付けられている。これにより、筐体内部での光の反射・散乱の抑制が図られている。

図１１には、45度以下の入射角で入射する光に対する本実施例に係るダイクロイックミラーの波長特性が示されている。本実施例に係るダイクロイックミラーでは、光学多層膜の4〜27層目が45度の入射角で入射する励起波長域の光を反射する繰り返し層部分として寄与し、基材である色ガラスG495が0〜20度の入射角で入射した励起波長域の光の遮断に寄与する。

これにより、図１１に示されるように、少なくとも0度から20度（つまり、光学面に対して垂直に近い角度）及び45度（正規の角度）の入射角で入射した励起波長の光に対して低い透過率が実現される。即ち、本実施例では、上述した筐体の部分Ｂからの散乱光は、ダイクロイックミラーで遮断することができる。

なお、比較例として図１１に示される波長−透過率特性は、基材のみが異なる上述した実施形態に係るダイクロイックミラー１５の波長−透過率特性である。比較例では入射角度が浅くなると励起波長域で比較的高い透過率を示すことからも、0度から20度の入射角で入射する励起波長域の光の遮断が色ガラスに依存していることを確認することができる。

図１２には、45度以上の入射角で入射する光に対する本実施例に係るダイクロイックミラーの波長特性が示されている。図１２に示されるように、本実施例に係るダイクロイックミラーでは、正規の角度を上回る入射角で入射する励起波長の光を十分に遮断することは難しく、部分Ｃから生じる散乱光Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３を十分に遮断することができない。

しかしながら、本実施例に係るバリアフィルタは、上述した実施形態に係るバリアフィルタ１６と同じものである。そして、その光学面とダイクロイックミラーの光学面とのなす角度θが50度になるように配置されている点も、バリアフィルタ１６と同様である。従って、本実施例では、上述した実施形態と同様に、部分Ｃから生じる散乱光は、バリアフィルタで十分に遮断することができる。

以上のように、本実施例に係る蛍光キューブでは、従来の蛍光キューブでは難しかった筐体の部分Ｂからの散乱光と部分Ｃからの散乱光との両方を十分に減衰させることが可能であり、その結果、筐体の任意の部位で生じる散乱光を減衰させることができる。従って、軸外光の散乱に起因する光が観察光路に入ることを効果的に防ぐ事ができる。

また、本実施例に係る蛍光キューブでは、蛍光フィルタセットを構成する各フィルタに光学多層膜が形成されているため、波長選択や波長分離を高い効率で行うことができる。

また、本実施例に係る蛍光キューブでは、ダイクロイックミラーの基板に入射角に伴う波長シフトが少ない色ガラスを用いているため、より確実に散乱光を減衰させることができる。また、ダイクロイックミラーの光学多層膜の層数を抑えることもできる。

また、筐体内面に全面黒アルマイト処理が施されて、さらに反射防止シートも設置されているため、筐体内面での散乱光の発生自体を抑えることができる。

なお、本実施例では、バリアフィルタをその光学面とダイクロイックミラーの光学面とのなす角度θが50度になるように配置した例を示したが、この角度は50度に限られない。例えば、表４には、バリアフィルタの光学面とダイクロイックミラーの光学面とのなす角度θが46度と52度の場合における、バリアフィルタへの散乱光の入射角が示されている。

図１３には、表４に示されるそれぞれの角度で入射した光に対するバリアフィルタの波長−透過率特性が示されている。図１３と、従来の配置例におけるバリアフィルタの波長−透過率特性が示されている図８及び図９とを比較すると、角度θが46度と52度のいずれの場合であっても、従来の配置例よりも、部分Ｃから生じる散乱光を遮断することが出来ることを確認することができる。

従って、その光学面とダイクロイックミラーの光学面とのなす角度θが45度よりも大きな角度となるようにバリアフィルタを配置すれば、従来よりも励起波長域の光を遮断し、部分Cからの散乱光が観察光路に入ることを抑えることができる。

本実施例に係る蛍光キューブは、図４に示す蛍光顕微鏡のような蛍光観察機器の照明光路と観察光路の交わる箇所に配置されて使用される蛍光キューブである。

本実施例に係る蛍光キューブは、励起波長域の光を選択的に透過させる励起波長選択素子である励起フィルタ、波長分離素子であるダイクロイックミラー、及び、励起波長域の光を選択的に透過させる蛍光波長選択素子であるバリアフィルタからなる蛍光フィルタセットと、蛍光フィルタセットを支持する筐体とを有している。

本実施例に係る励起フィルタ、ダイクロイックミラー、バリアフィルタの配置は、実施例１に係る蛍光キューブと同様である。蛍光フィルタセットを構成する各フィルタは、いずれも基板に光学多層膜が形成された多層膜フィルタであり、図１４に示す波長−透過率特性を有している。なお、励起フィルタ、バリアフィルタが、それぞれ、オリンパス製の蛍光フィルタBP470-495、BA510IFである点も、実施例１に係る蛍光キューブと同様である。

本実施例に係るダイクロイックミラーは、合成石英からなる基材を1mm厚に両面研磨した平行平板である基板を備えている。この基板は、蛍光波長域の光及び励起波長域の光に対して透明である。そして、基板の表面（主反射面）には表５に示す構成（58層構成、基準波長＝500nm）の光学多層膜が形成され、一方、基板の裏面には反射防止膜が形成されている。

なお、58層構成の光学多層膜は、基板の端から1mmを除く基板表面全体に形成されていて、光学多層膜が形成された範囲全体で図１４に示す特性が保証されている。また、ダイクロイックミラーは光学多層膜が形成されていない基板の端から1mmの範囲で筐体に確実に密着して支持されている。このように、ダイクロイックミラーの光学多層膜は、筐体に基板が支持された状態で基板表面のうちの露出している部分全体に形成される。このため、本実施例に係る蛍光キューブでは、光学多層膜と筐体との間からの励起波長域の光の漏れが確実に防止される。

本実施例に係る筐体は、射出成形によって黒色の樹脂から作られていて、その表面には、外部は細かめのシボ加工が、内部は素子の取り付け基準面を除いて鏡面反射を防ぐための粗めのシボ加工が施されている。なお、励起フィルタに対向する位置には、(株)ベルセード製0.35mm厚植毛紙からなる反射防止シートが貼り付けられている点は、実施例１に係る蛍光キューブと同様である。

図１５には、45度以下の入射角で入射する光に対する本実施例に係るダイクロイックミラーの波長特性が示されている。本実施例に係るダイクロイックミラーでは、光学多層膜の26〜56層目が45度の入射角で入射する励起波長域の光を反射する繰り返し層部分として寄与し、光学多層膜の4〜25層目が0〜20度の入射角で入射する励起波長域の光を反射する繰り返し層部分として寄与する。これにより、図１５に示されるように、少なくとも0度から20度（つまり、光学面に対して垂直に近い角度）及び45度（正規の角度）の入射角で入射した励起波長域の光に対して低い透過率が実現される。即ち、本実施例では、上述した筐体の部分Ｂからの散乱光は、ダイクロイックミラーで遮断することができる。

なお、具体的には、ダイクロイックミラーは、0度で入射した光に対して励起波長域全体の平均で光学濃度（以降、ODと記す）4.5程度（透過率0.003％程度）を有し、20度で入射した光に対して励起波長域全体の平均でOD4.9程度（透過率0.0012％程度）を有している。本実施例に係るダイクロイックミラーは、0度から20度の間の入射角で入射する光に対する光学濃度が励起波長域全体の平均で３を越えていて、良好な性能を示している。

図１６には、45度以上の入射角で入射する光に対する本実施例に係るダイクロイックミラーの波長特性が示されている。図１６に示されるように、本実施例に係るダイクロイックミラーでは、正規の角度を上回る入射角で入射する励起波長域の光を十分に遮断することは難しく、部分Ｃから生じる散乱光Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３を十分に遮断することができない。

しかしながら、本実施例に係るバリアフィルタは、実施例１に係るバリアフィルタ１６と同じものである。そして、その光学面とダイクロイックミラーの光学面となす角度θが50度になるように配置されている点も、バリアフィルタ１６と同様である。従って、本実施例でも、実施例１と同様に、部分Ｃから生じる散乱光は、バリアフィルタで十分に遮断することができる。

以上のように、本実施例に係る蛍光キューブでは、従来の蛍光キューブでは難しかった筐体の部分Ｂからの散乱光と部分Ｃからの散乱光との両方を十分に減衰させることが可能であり、その結果、実施例１に係る蛍光キューブと同様に、筐体の任意の部位で生じる散乱光を減衰させることができる。従って、軸外光の散乱に起因する光が観察光路に入ることを効果的に防ぐ事ができる。また、蛍光フィルタセットを構成する各フィルタに光学多層膜が形成されているため、波長選択や波長分離を高い効率で行うことができる点も、実施例１に係る蛍光キューブと同様である。

また、本実施例に係る蛍光キューブでは、筐体内面に粗めのシボ加工が施されて、さらに、反射防止シートも設置されているため、筐体内面での散乱光の発生自体を抑えることができる。

また、本実施例に係る蛍光キューブでは、45度の入射角で入射する励起波長域の光に加えて、0〜20度の入射角で入射する励起波長域の光についても光学多層膜で遮断するように、ダイクロイックミラーが構成されている。これにより、ダイクロイックミラーの品質（光学特性、耐環境性）の安定及び向上、特にダイクロイックミラーにおける0〜20度の入射角で入射する励起波長域の光に対する光遮断性能の向上、が実現されるため、実施例１に係る蛍光キューブに比べてノイズレベルをさらに低減することができる。

また、本実施例に係る蛍光キューブでは、0〜20度の入射角で入射する励起波長域の光に対する光学濃度が励起波長域全体の平均で３を越えるようにダイクロイックミラーが構成されている点も、全体のノイズレベルをバランスよく抑えることに寄与する。さらに、筐体と光学多層膜とが隙間無く配置され、その結果、これらの隙間からの励起波長域の光漏れを完全に防止することができる点もノイズレベルの低減に寄与する。従って、本実施例に係る蛍光キューブによれば、実施例１に係る蛍光キューブよりもさらに高い蛍光観察性能を実現することができる。

図１７は、本実施例に係る蛍光顕微鏡の構成を例示した図である。図１７に示す蛍光顕微鏡３０は、走査型共焦点レーザ顕微鏡であり、試料Ｓからの蛍光を検出することで試料Ｓを観察する蛍光観察機器であるという点は図４に示す蛍光顕微鏡２０と同様である。

蛍光顕微鏡３０は、照明光路上に、レーザ３１と、照明光学系３２とを備え、観察光路上に、結像レンズ３９と、共焦点絞り４０と、検出装置４１とを備えている。蛍光顕微鏡３０は、さらに蛍光キューブ３３を備え、蛍光キューブ３３は照明光路と観察光路の交わる箇所に配置されている。蛍光顕微鏡３０は、蛍光キューブ３３と試料Ｓとの間に、ＸＹスキャナー３７と、対物レンズ３８と、を備えている。

レーザ３１は、例えば、励起波長域の光である488ｎｍのレーザ光を出射するアルゴンレーザである。照明光学系３２は、レーザ３１からのレーザ光を蛍光キューブ３３に入射させる。ＸＹスキャナー３７は、例えば、ガルバノミラーであり、対物レンズ３８の光軸と直交するＸＹ方向にレーザ光で標本Ｓを走査する。対物レンズ３８は、ＸＹスキャナー３７からのレーザ光を標本Ｓに照射し、標本Ｓからの蛍光及び標本Ｓを反射・散乱した励起光を、ＸＹスキャナー３７を介して蛍光キューブ３３に入射させる。結像レンズ３９は、蛍光キューブ３３を透過した蛍光を集光させる。共焦点絞り４０は、対物レンズ３８の焦点位置と光学的に共役な位置にピンホールが形成された絞りである。共焦点絞り４０が試料Ｓの焦点位置以外の位置から生じた蛍光を遮断することで、検出装置４１は試料Ｓの焦点位置から生じた蛍光のみを検出する。検出装置４１は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）である。

蛍光キューブ３３は、波長分離素子であるダイクロイックミラー３５及び蛍光波長選択素子であるバリアフィルタ３６からなる蛍光フィルタセット３４と、蛍光フィルタセット３４を支持する筐体とを有している。なお、蛍光キューブ３３は、励起波長選択素子である励起フィルタを有しない点を除き、実施例２に係る蛍光キューブと同様である。

即ち、本実施例では、励起フィルタを用いることなく、励起波長域の光が直接レーザ３１から出射される点が、実施例２と大きく異なっているが、本実施例に係る蛍光キューブ３３によっても、実施例２に係る蛍光キューブと同様の効果を得ることができる。

また、一般に非常に強い光が入射する励起フィルタでは散乱光が生じ得るが、本実施例に係る蛍光キューブ３３では、励起フィルタが省略されているため、励起フィルタで発生するはずの散乱光が発生しない。このため、蛍光キューブ３３で生じる散乱光自体を減らすことができる。これに対して、実施例１及び実施例２に係る蛍光キューブでは、励起フィルタで散乱光が生じるが、励起フィルタで生じる散乱光をその出射角度によらずダイクロイックミラー又はバリアフィルタで遮断することができる。このため、実施例１及び実施例２に係る蛍光キューブのような励起フィルタを有する蛍光キューブは、より多くの散乱光を遮断することができる。

また、本実施例に係る蛍光顕微鏡３０は、光源としてレーザ３１を備えている。一般的にレーザを用いる観察ではノイズ低減に対する要求が厳しい。この点においてノイズの低減に効果的な蛍光キューブ３３の使用は好適である。

上述した実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。上述した蛍光キューブ及び顕微鏡は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。例えば、上述した実施例では、励起波長域として473-495nmの波長範囲が例示されているが、蛍光フィルタセットに形成される多層膜フィルタの膜厚比率を変更することで励起波長域は変更可能であり、この点は蛍光波長域についても同様である。従って、本発明の励起波長域や蛍光波長域は特定の波長範囲に限られるものではなく、任意に変更可能である。

また、上述した実施例２及び実施例３において、ダイクロイックミラーの光学多層膜が、筐体に基板が支持された状態で基板表面のうちの露出している部分全体に形成される例を示したが、実施例１に係るダイクロイックミラーも同様に構成してもよい。

また、上述した実施例では、筐体内面での光の散乱を抑制するための処理として、黒アルマイト処理、植毛紙の貼付け処理、シボ加工処理などを例示したが、表面に凹凸をつけるサンドブラスト処理、黒色塗料による塗装処理などの他の処理によって散乱を抑制してもよい。

１ 白色光源
２、１２、３３ 蛍光キューブ
３、１３、３４ 蛍光フィルタセット
４、１４ 励起フィルタ
５、１５、３５ ダイクロイックミラー
６、１６、３６ バリアフィルタ
７、１７ 筐体
８、１８ 反射防止シート
９、１９、３８ 対物レンズ
１０、２０、３０ 蛍光顕微鏡
１１ 光源
２１、３２ 照明光学系
２２、３９ 結像レンズ
２３、４１ 検出装置
３１ レーザ
３７ ＸＹスキャナー
４０ 共焦点絞り
Ｓ 試料

Claims (12)

1. 蛍光観察機器において使用される蛍光キューブであって、
   励起波長域の光を遮断して蛍光波長域の光を選択的に透過させる蛍光波長選択素子と、
   45度の入射角で入射した前記励起波長域の光を反射し、45度の入射角で入射した前記蛍光波長域の光を透過させる波長分離素子と、
   前記蛍光波長選択素子の光学面と前記波長分離素子の光学面のなす角度が45度よりも大きくなるように、前記蛍光波長選択素子と前記波長分離素子とを支持する筐体と、を備える
   ことを特徴とする蛍光キューブ。
2. 請求項１に記載の蛍光キューブにおいて、
   前記波長分離素子は、0度から20度の間の入射角で入射する前記励起波長域の光を遮断するように、構成される
   ことを特徴とする蛍光キューブ。
3. 請求項２に記載の蛍光キューブにおいて、
   前記波長分離素子は、
   前記蛍光波長域の光及び前記励起波長域の光に対して透明な基板と、
   前記基板上に形成された光学多層膜と、を備える
   ことを特徴とする蛍光キューブ。
4. 請求項３に記載の蛍光キューブにおいて、
   前記光学多層膜は、
   0度から20度の間の入射角で入射する前記励起波長域の光を反射する繰り返し層部分と、
   45度の入射角で入射する前記励起波長域の光を反射する繰り返し層部分と、を備える
   ことを特徴とする蛍光キューブ。
5. 請求項２に記載の蛍光キューブにおいて、
   前記波長分離素子は、
   前記励起波長域の光を遮断する色ガラスからなる基板と、
   前記基板上に形成された光学多層膜と、を備える
   ことを特徴とする蛍光キューブ。
6. 請求項３乃至請求項５のいずれか１項に記載の蛍光キューブにおいて、
   前記光学多層膜は、
   前記筐体に前記基板が支持された状態で前記基板の少なくとも一面のうちの露出している部分全体に形成される
   ことを特徴とする蛍光キューブ。
7. 請求項２に記載の蛍光キューブにおいて、
   前記波長分離素子は、0度から20度の間の入射角で入射する光に対する光学濃度が前記励起波長域全体の平均で３を越えるように、構成される
   ことを特徴とする蛍光キューブ。
8. 請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の蛍光キューブにおいて、
   前記蛍光波長選択素子は、
   前記蛍光波長域の光及び前記励起波長域の光に対して透明な基板と、
   前記蛍光波長選択素子の前記基板上に形成された光学多層膜と、を備える
   ことを特徴とする蛍光キューブ。
9. 請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の蛍光キューブにおいて、
   前記筐体の内面に光の反射を抑える処理が施されている
   ことを特徴とする蛍光キューブ。
10. 請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の蛍光キューブにおいて、さらに、
    前記励起波長域の光を選択的に透過させる励起波長選択素子を備え、
    前記筐体は、前記励起波長選択素子の光学面と前記波長分離素子の光学面のなす角度が45度となり、且つ、前記励起波長選択素子の光学面と前記蛍光波長選択素子の光学面のなす角度が90度よりも大きくなるように、前記励起波長選択素子を支持する
    ことを特徴とする蛍光キューブ。
11. 照明光路と観察光路の交わる箇所に、前記照明光路の光軸及び前記観察光路の光軸の各々と前記波長分離素子の光学面とのなす角度が45度となるように配置された、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の蛍光キューブを備えることを特徴とする光学顕微鏡。
12. 照明光路と観察光路の交わる箇所に、前記照明光路の光軸及び前記観察光路の光軸の各々と前記波長分離素子の光学面とのなす角度が45度となるように配置された、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の蛍光キューブと、
    前記励起波長域の光を出射するレーザ光源と、を備える
    ことを特徴とする光学顕微鏡。