JP2015190837A - 細胞認識装置および方法並びにプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】複数の細胞を撮像した細胞画像から個々の細胞を高精度に認識する細胞認識装置および方法並びにプログラムを提供する。【解決手段】複数の細胞を撮像した細胞画像から細胞内の核小体を検出する核小体検出部３１と、核小体間の距離を示す情報を取得し、その距離を示す情報に基づいて、個々の細胞を認識する細胞認識部３２とを備える。【選択図】図１

Description

本発明は、複数の細胞を撮像した細胞画像内における個々の細胞の領域を認識する細胞認識装置および方法並びにプログラムに関するものである。

従来、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＳＴＡＰ細胞などの多能性幹細胞や分化誘導された細胞などを培養して顕微鏡で撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の状態を評価する方法が提案されている。

たとえば特許文献１においては、細胞画像から核小体の数を検出し、その核小体の数に基づいて細胞の分裂周期を判定することが提案されている。

ここで、上述したように培養された細胞を顕微鏡によって撮像する際、染色した細胞の画像を撮像する場合があるが、細胞を評価する上で、未染色の状態の細胞を観察することが重要な場合があったり、染色自体が細胞へ悪影響を及ぼす場合などがある。

また、細胞画像から細胞の状態を評価する際には、細胞画像に含まれる個々の細胞を正確に認識することが重要である。

特開２００７−３２７９２８号公報

しかしながら、たとえば位相差顕微鏡によって未染色な状態の細胞を撮像した場合、その細胞画像における核、核小体、細胞質を部分的に観察することはできるが、個々の細胞を正確に認識するのは困難である。

たとえば、細胞画像において個々の細胞の核小体は、図５において矢印で示すように高コントラストな黒い粒々として現れるが、どの核小体がどの細胞に属するものであるか明確ではないため、個々の細胞の領域を正確に認識することは困難である。また、たとえば細胞画像に含まれる細胞数を計測する場合、図５に示す核小体だけを認識したとしても、１つの細胞の核小体の保有数にはばらつきがあるため、核小体の数を計測するだけでは個々の細胞の数を正確に評価することができない。

なお、特許文献１においては、核小体を検出することは開示されているが、個々の細胞の領域を正確に検出する方法については何も提案されていない。

本発明は、上記の問題に鑑み、複数の細胞を撮像した細胞画像から個々の細胞を高精度に認識することができる細胞認識装置および方法並びにプログラムを提供することを目的とする。

本発明の細胞認識装置は、複数の細胞を撮像した細胞画像から細胞内の核小体を検出し、その核小体間の距離を示す情報を取得し、その距離を示す情報に基づいて、個々の細胞を認識する細胞認識部とを備えたことを特徴とする。

また、上記本発明の細胞認識装置において、細胞認識部は、核小体の大きさを示す情報を取得し、その大きさを示す情報および距離を示す情報に基づいて、個々の細胞を認識することができる。

また、細胞認識部は、細胞画像の輝度情報を取得し、その輝度情報に基づいて個々の細胞の境界を認識し、その認識した境界の情報および距離を示す情報に基づいて、個々の細胞を認識することができる。

また、細胞認識部によって認識された個々の細胞に基づいて、細胞画像内に含まれる細胞数、単位面積当たりの細胞数または細胞密度分布を取得する細胞情報取得部を備えることができる。

また、細胞密度分布をマッピングするマッピング部を備えることができる。

また、細胞画像に対して上記マッピングされた画像を重畳して表示させる表示制御部を備えることができる。

また、細胞認識部は、核小体間の距離が閾値以下の核小体群を同じ細胞に属するものとして認識することができる。

また、細胞認識部は、核小体の大きさに応じて上記閾値を変更することができる。

また、細胞認識部は、同じ細胞に属すると認識された核小体の重心位置を中心とした領域をそれぞれ設定し、その設定した領域に基づいて１つの細胞の領域を認識することができる。

本発明の細胞認識方法は、複数の細胞を撮像した細胞画像から細胞内の核小体を検出し、その核小体間の距離を示す情報を取得し、その距離を示す情報に基づいて、個々の細胞を認識することを特徴とする。

本発明の細胞認識プログラムは、コンピュータを、複数の細胞を撮像した細胞画像から細胞内の核小体を検出する核小体検出部と、核小体間の距離を示す情報を取得し、その距離を示す情報に基づいて、個々の細胞を認識する細胞認識部として機能させることを特徴とする。

本発明の細胞画像評価装置および方法並びにプログラムによれば、複数の細胞を撮像した細胞画像から細胞内の核小体を検出し、その核小体間の距離を示す情報を取得し、その距離を示す情報に基づいて個々の細胞を認識するようにしたので、同じ細胞に属する核小体群を高精度に判定することができ、これにより個々の細胞領域を高精度に認識することができる。

本発明の細胞認識装置の一実施形態を用いた細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図 同じ細胞に属すると予想される核小体群を説明するための図 個々の細胞の領域の認識方法を説明するための図 本発明の細胞認識装置の一実施形態を用いた細胞培養観察システムの作用を説明するためのフローチャート 細胞画像における核小体を説明するための図

以下、本発明の細胞認識装置および方法並びにプログラムの一実施形態を用いた細胞培養観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。本発明は、細胞を撮像した細胞画像における個々の細胞の認識方法に特徴を有するものであるが、まず、本実施形態の細胞培養観察システムの全体構成について説明する。図１は、細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図である。

本実施形態の細胞培養観察システムは、図１に示すように、細胞培養装置１、撮像装置２と、細胞認識装置３と、ディスプレイ４と、入力装置５とを備えている。

細胞培養装置１は、細胞の培養を行うための装置である。培養対象の細胞としては、たとえばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞やＳＴＡＰ細胞といった多能性幹細胞や、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋、肝臓などの細胞や、がん細胞などがある。細胞培養装置１内には、培養対象の細胞を培地に播種した培養容器が複数収容されている。そして、細胞培養装置１は、ステージ１０と搬送部１１と制御部１２とを備えている。

ステージ１０は、撮像装置２による撮像対象の培養容器が設置されるものである。また、搬送部１１は、細胞培養装置１内の所定位置に収容されている複数の培養容器の中から撮像対象の培養容器を選択し、その選択した培養容器をステージ１０まで搬送するものでる。また、制御部１２は、細胞培養装置１全体を制御するものであり、上述したステージ１０や搬送部１１の動作以外に、細胞培養装置１内の温度、湿度およびＣＯ_２濃度などの環境条件を制御するものである。なお、温度、湿度およびＣＯ_２濃度を調整するための構成については、公知な構成を用いることができる。

撮像装置２は、ステージ１０に設置された培養容器内における細胞コロニーの画像を撮像するものである。撮像装置２は、細胞コロニーを撮像して細胞画像を出力する位相差顕微鏡２０と、位相差顕微鏡２０を制御する制御部２１とを備えている。

位相差顕微鏡２０は、ＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）センサやＣＣＤ（charge-coupled device）センサなどの撮像素子を備えており、この撮像素子から細胞を撮像した細胞画像が出力される。なお、本実施形態においては、位相差顕微鏡を用いるようにしたが、これに限らず、たとえば明視野顕微鏡や微分干渉顕微鏡などを用いるようにしてもよい。

制御部２１は、撮像装置２全体を制御するものである。具体的には、制御部２１は、位相差顕微鏡２０の光学倍率、撮像素子の露光時間や解像度、照明光源の露光光量などを制御するものである。

細胞認識装置３は、コンピュータに対して本発明の細胞認識プログラムの一実施形態がインストールされたものである。

細胞認識装置３は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えており、ハードディスクに本発明の細胞認識プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、このプログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図１に示すような画像取得部３０、核小体検出部３１、細胞認識部３２、細胞情報取得部３３、マッピング部３４および表示制御部３５が動作する。

画像取得部３０は、撮像装置２によって撮像された細胞コロニーの細胞画像を取得して記憶するものである。本実施形態においては、位相差顕微鏡２０の光学倍率を４倍〜２０倍として撮像した細胞画像を取得する。光学倍率については、後述する個々の細胞認識の際に用いられる細胞画像を撮像する場合と、細胞コロニーの外観を観察する際に用いられる細胞画像を撮像する場合と異なる光学倍率としてもよい。具体的には、細胞認識に用いられる細胞画像を撮像する場合の光学倍率の方を高倍率に変更するようにしてもよい。光学倍率の変更は自動的に行ってもよし、手動で行うようにしてもよい。

細胞画像は、１つの細胞コロニーを撮像した１枚の画像でもよいし、１つの細胞コロニーを矩形の複数の領域で分割した複数の画像群でもよい。また、１枚の画像内に複数の細胞コロニーが含まれていてもよい。

画像取得部３０は、細胞コロニーを識別するための識別情報と細胞画像とを対応づけて記憶するものである。たとえば、１つの細胞コロニーを１枚の細胞画像で撮像した場合には、その細胞コロニーの識別情報と細胞画像とが１対１で対応づけられて記憶される。また、１つの細胞コロニーを複数の領域の細胞画像で撮像した場合には、その細胞コロニーの識別情報と複数の領域の細胞画像群とが対応づけられて記憶される。また、複数の細胞コロニーを１枚の細胞画像で撮像した場合には、その各細胞コロニーの識別情報と１枚の細胞画像とが対応づけられて記憶される。

このように細胞コロニーの識別情報と細胞画像とを対応づけて記憶して管理することによって、たとえばユーザが入力装置５から細胞コロニーの識別情報を入力した際、その識別情報に対応づけられた細胞画像を即座に読み出して表示等することができる。

核小体検出部３１は、画像取得部３０から読み出された細胞画像を取得し、その細胞画像内における核小体を検出するものである。核小体の検出方法としては、たとえば細胞画像を２値化画像に変換した後、フィルタ処理を行って核小体のエッジを検出し、そのエッジに対してパターンマッチングを行って検出するようにすればよい。ただし、このような方法に限らず、核小体は細胞画像内では周囲よりも暗く（黒く）、高コントラストな粒として現れるので、閾値判定を行うことによって核小体を検出するようにしてもよい。また、核小体の検出方法としては、その他の種々の公知な方法を用いることができる。

細胞認識部３２は、核小体検出部３１において検出された核小体間の距離を示す情報を取得し、その距離を示す情報に基づいて、細胞画像内に含まれる個々の細胞の領域を認識するものである。

ここで、本実施形態の細胞認識部３２における個々の細胞認識の方法について、詳細に説明する。

細胞認識部３２は、まず、上述したように核小体間の距離を示す情報を取得する。距離を示す情報としては、たとえば核小体間を直線で結んだ最短距離を取得するようにすればよい。そして、核小体毎について、その核小体とその核小体以外の全ての核小体との距離を示す情報が取得される。

次に、細胞認識部３２は、上記ようにして取得された距離を示す情報が、予め設定された閾値以下であるか否かを判定し、距離を示す情報が閾値以下である核小体群を同じ細胞に属するものとして認識する。図２は、細胞画像の一例を示すものであり、周囲よりも暗い（黒い）部分が核小体である。図２では、同じ細胞に属すると予想される核小体群を点線の円で囲んでいる。

なお、このとき、上記閾値は、核小体の大きさに基づいて変更するようにしてもよい。すなわち、核小体の大きさを示す情報を取得し、その大きさを示す情報に基づいて上記閾値を設定し、その閾値と距離を示す情報とを比較することによって、同じ細胞に属する核小体群を認識するようにしてもよい。

たとえば核小体の最大径を取得し、その最大径を上記閾値に設定するようにしてもよい。具体的には、核小体の最大径が５μｍである場合には、その核小体との距離が５μｍ以下の核小体を同じ細胞に属する核小体群とし、核小体の最大径が１μｍである場合には、その核小体との距離が１μｍ以下の核小体を同じ細胞に属する核小体群として認識するようにすればよい。核小体の大きさとしては、上述した最大径に限らず、たとえば平均径や最小径などを用いるようにしてもよい。

なお、これらの最大径、平均径または最小径などの核小体の大きさを示す情報は、細胞画像から自動的に計測するようにしてもよいし、ユーザが入力装置５を用いて入力するようにしてもよい。

また、核小体毎について、その大きさに基づいて上記閾値をそれぞれ設定するようにしてもよいし、細胞画像内における全ての核小体の大きさの平均値、最大値または最小値などの統計値を算出し、その統計値に基づいて１つの閾値を設定するようにしてもよい。

なお、核小体毎にその大きさに基づいて閾値を設定する場合、たとえば判定対象の２つの核小体の大きさが大きく異なる場合、一方の細胞から見て他方の細胞の距離が閾値以下であるが、逆に他方の細胞から見て一方の細胞の距離が閾値より大きい場合が生じる。この場合、同じ細胞に属するものとして認識するようにしてもよいし、同じ細胞に属さいないものとして認識するようにしてもよい。

また、上記説明では、核小体の大きさに応じて閾値を変更するようにしたが、たとえば位相差顕微鏡２０における光学倍率に応じて閾値を変更するようにしてもよい。たとえば、光学倍率が大きいほど閾値を大きくするようにすればよく、光学倍率と閾値とを対応付けたテーブルなどを設定してもよい。

次に、細胞認識部３２は、同じ細胞に属すると認識された核小体群に基づいて、１つの細胞の領域を認識する。具体的には、たとえば同じ細胞に属すると認識された核小体群が、図３に示す核小体Ｎ１〜Ｎ３である場合、その各核小体Ｎ１〜Ｎ３のそれぞれ重心位置ｇ１〜ｇ３を中心とした円領域Ｃ１〜Ｃ３を設定し、この円領域Ｃ１〜Ｃ３を含む円領域であって直径が最小の円領域を１つの細胞の領域として認識する。なお、ここでは各核小体の重心位置を中心としたが、これに限らず、核小体上のその他の点を中心としてもよい。また、ここでは重心位置を中心として円領域を設定するようにしたが、円領域に限らず楕円領域や矩形領域を設定するようにしてもよい。

また、上記説明では、各核小体について円領域を設定するようにしたが、これに限らず、各核小体について、周囲の画像を探索し、コントラストが同程度の領域をそれぞれ設定するようにしてもよい。そして、各核小体についてそれぞれ設定されたコントラストが同程度の領域を含む円領域であって直径が最小の円領域を１つの細胞の領域として認識するようにしてもよい。

なお、同程度とみなすコントラストの範囲については、予め設定するようにすればよい。また、細胞画像のコントラストは、光学倍率、照明光源、露光時間、顕微鏡の種類などによって異なるので、これらの撮像条件に基づいて同程度とみなすコントラストの範囲を変更して設定するようにしてもよい。

図１に戻り、細胞情報取得部３３は、細胞認識部３２において認識された個々の細胞の領域に基づいて、細胞画像内における単位面積当たりの細胞数、すなわち細胞密度を算出するものである。単位面積としては、たとえば細胞コロニーを複数の矩形領域に分割した１つの領域としてもよいし、撮像領域全体を複数の矩形領域に分割した１つの領域としてもよい。１つの矩形領域の大きさとしては、たとえば５０μｍ×５０μｍや１００μｍ×１００μｍとすればよい。

マッピング部３４は、細胞情報取得部３３において算出された単位面積の矩形領域毎の細胞密度に基づいて細胞密度分布を取得し、その細胞密度分布をマッピングして細胞密度画像を生成するものである。細胞密度画像としては、たとえば各単位面積の矩形領域に対して細胞密度の大きさに応じて異なる色相、彩度または明度を割り当てた画像とすればよい。

表示制御部３５は、画像取得部３０から読み出された細胞画像を取得するとともに、マッピング部３４において生成された細胞密度画像を取得し、細胞画像と細胞密度画像とを重畳してディスプレイ４に表示させるものである。細胞画像の重畳される細胞密度画像としては、細胞画像を透過して観察できるような半透明の画像としてもよいし、各単位面積の矩形領域の輪郭を、上述したように異なる色相などで表した画像としてもよい。

入力装置５は、マウスやキーボードなどを備えたものであり、ユーザによる設定入力を受け付けるものである。たとえば、入力装置５は、位相差顕微鏡２０の光学倍率などの撮像条件や、上述した核小体の大きさを示す情報などの設定入力を受け付け可能なものである。

次に、上述した細胞培養観察システムの作用について、図４に示すフローチャートを参照しながら説明する。

まず、細胞培養装置１において、搬送部１１によって、収容されている複数の培養容器の中から撮影対象の培養が選択され、その選択された培養容器がステージ１０に設置される（Ｓ１０）。

そして、撮像装置２の位相差顕微鏡２０によって培養容器内における細胞コロニーの画像が撮像され、その撮像された細胞画像は、細胞認識装置３の画像取得部３０によって取得される（Ｓ１２）。

次いで、画像取得部３０によって取得された細胞画像が核小体検出部３１によって読み出され、核小体検出部３１によって細胞画像に含まれる核小体が検出される（Ｓ１４）。

核小体検出部３１における核小体の検出結果は細胞認識部３２に出力され、細胞認識部３２は、入力された核小体の検出結果に基づいて、核小体間の距離を示す情報を取得する（Ｓ１６）。

そして、細胞認識部３２は、上述したように核小体間の距離を示す情報に基づいて、同じ細胞に属する核小体群を認識し（Ｓ１８）、その核小体群に基づいて個々の細胞領域を認識する（Ｓ２０）。

細胞認識部３２において認識された個々の細胞領域の情報は、細胞情報取得部３３によって取得され、細胞情報取得部３３は、入力された個々の細胞領域の情報に基づいて、細胞画像における単位面積の矩形領域毎の細胞密度を算出する。

細胞情報取得部３３において取得された細胞密度はマッピング部３４に出力され、マッピング部３４は、細胞密度分布をマッピングして細胞密度画像を生成する（Ｓ２４）。

そして、画像取得部３０によって取得された細胞画像と、マッピング部３４において生成された細胞密度画像が表示制御部３５に出力され、表示制御部３５は、細胞画像に対して細胞密度画像を重畳させてディスプレイ４に表示させる（Ｓ２６）。

上記実施形態の細胞培養観察システムによれば、複数の細胞を撮像した細胞画像から細胞内の核小体を検出し、その核小体間の距離を示す情報を取得し、その距離を示す情報に基づいて、個々の細胞を認識するようにしたので、同じ細胞に属する核小体群を高精度に判定することができ、これにより個々の細胞領域も高精度に認識することができる。

また、上記実施形態の細胞培養観察システムにおいては、核小体間の距離が閾値以下の核小体群を同じ細胞に属するものとして認識するようにしたが、たとえば核小体が細胞内の中央ではなく周縁部分に位置している場合には、異なる細胞に属する核小体同士であっても、その核小体間の距離が閾値以下となって誤認識する可能性がある。

そこで、たとえば細胞画像の輝度情報を取得し、細胞間の境界に現れるハロのような輝度の高い領域を抽出し、核小体間を結んだ直線上にその輝度の高い境界領域が存在する場合には、その核小体間の距離が閾値以下であっても、その核小体体同士は異なる細胞に属するものであると認識するようにしてもよい。なお、ハロとは、照明光が細胞間を通過する際に生じる高輝度なアーチファクトのことである。

また、上記実施形態の細胞培養観察システムにおいては、細胞認識部３２において認識された個々の細胞の領域に基づいて細胞密度を算出し、細胞密度分布をマッピングして細胞密度画像を生成するようにしたが、これに限らず、単に単位面積当たりの細胞数や細胞画像内に含まれる細胞数をカウントし、その細胞数を数値などのテキストで表示させるようにしてもよい。

１ 細胞培養装置
２ 撮像装置
３ 細胞認識装置
４ ディスプレイ
５ 入力装置
１０ ステージ
１１ 搬送部
１２ 制御部
２０ 位相差顕微鏡
２１ 制御部
３０ 画像取得部
３１ 核小体検出部
３２ 細胞認識部
３３ 細胞情報取得部
３４ マッピング部
３５ 表示制御部

Claims (11)

1. 複数の細胞を撮像した細胞画像から前記細胞内の核小体を検出する核小体検出部と、
   前記核小体間の距離を示す情報を取得し、該距離を示す情報に基づいて、個々の前記細胞を認識する細胞認識部とを備えたことを特徴とする細胞認識装置。
2. 前記細胞認識部が、前記核小体の大きさを示す情報を取得し、該大きさを示す情報および前記距離を示す情報に基づいて、個々の前記細胞を認識するものである請求項１記載の細胞認識装置。
3. 前記細胞認識部が、前記細胞画像の輝度情報を取得し、該輝度情報に基づいて個々の前記細胞の境界を認識し、該認識した境界の情報および前記距離を示す情報に基づいて、個々の前記細胞を認識するものである請求項１または２記載の細胞認識装置。
4. 前記細胞認識部によって認識された個々の前記細胞に基づいて、前記細胞画像内に含まれる細胞数、単位面積当たりの細胞数または細胞密度分布を取得する細胞情報取得部を備えた請求項１から３いずれか１項記載の細胞認識装置。
5. 前記細胞密度分布をマッピングするマッピング部を備えた請求項４記載の細胞認識装置。
6. 前記細胞画像に対して前記マッピングされた画像を重畳して表示させる表示制御部を備えた請求項５記載の細胞認識装置。
7. 前記細胞認識部が、前記核小体間の距離が閾値以下の核小体群を同じ細胞に属するものとして認識するものである請求項１から６いずれか１項記載の細胞認識装置。
8. 前記細胞認識部が、前記核小体の大きさに応じて前記閾値を変更するものである請求項７記載の細胞認識装置。
9. 前記細胞認識部が、同じ細胞に属すると認識された前記核小体の重心位置を中心とした領域をそれぞれ設定し、該設定した領域に基づいて１つの細胞の領域を認識するものである請求項１から８いずれか１項記載の細胞認識装置。
10. 複数の細胞を撮像した細胞画像から前記細胞内の核小体を検出し、
    前記核小体間の距離を示す情報を取得し、該距離を示す情報に基づいて、個々の前記細胞を認識することを特徴とする細胞認識方法。
11. コンピュータを、複数の細胞を撮像した細胞画像から前記細胞内の核小体を検出する核小体検出部と、
    前記核小体間の距離を示す情報を取得し、該距離を示す情報に基づいて、個々の前記細胞を認識する細胞認識部として機能させることを特徴とする細胞認識プログラム。