JP2015168682A - 二光子吸収化合物 - Google Patents
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Abstract
【課題】水溶性に優れ、近赤外の波長領域で二光子を吸収し励起され、赤色の蛍光を発光する二光子吸収化合物の提供。【解決手段】式（１）で表される化合物。［式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は相異なっていてもよく下記式（２）を表し、（式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ３のアルキル基を表し、Ｚ−はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンを表し、波線はＹに対する共有結合を示す。）、Ｙは環数２〜４の縮合多環基を表す。］【選択図】なし
Description
本発明は、新規な二光子吸収化合物に関し、さらに詳しくは、水溶性に優れ、近赤外の波長領域で二光子を吸収し、赤色の蛍光を発光する化合物に関する。また、該二光子吸収化合物を含有する蛍光プローブ組成物、バイオイメージングに用いるための蛍光プローブ組成物に関する。
二光子吸収とは、光を光子として考えたとき、同時に２個の光子が吸収されることによって、分子の状態が励起され高いエネルギー準位に遷移することを意味する。二光子吸収は、その発生する確率が光の強度に対して二乗に比例する、非線形現象である。したがって、光強度の高いときにのみ光の吸収が観測されるので、光をレンズで集光した場合、光強度の高い焦点付近でのみ吸収を起こすことができる。また、エネルギーの低い光であっても高い遷移エネルギーに励起できるため、例えば、近赤外光をレンズで集光して二光子現象をつくり、近赤外光では励起されない分子に対して照射することによって励起状態にすることができる。
焦点付近のみで二光子吸収が起こる特徴は、例えば、バイオイメージングに応用される（非特許文献１）。バイオイメージングとは、細胞・組織又は個体レベルでタンパク質等の分布・局在を捉え、その動態を画像として解析する技術のことを指し、病体時の病理解明、診断等に有用な手段である。バイオイメージングにおいて、二光子吸収を利用すれば、測定試料に対して、焦点の位置を走査することによって、三次元的なイメージを得ることができる。
バイオイメージングで試料の深部のイメージを得るためには、可視光領域では試料内で光の吸収、及び散乱が大きく透過性が悪いので、近赤外付近の長波長領域の光が好ましいとされる。このため、長波長領域の光により励起される二光子吸収は試料の深部をイメージングするのに適する。
二光子吸収を利用したバイオイメージングでは、例えば、測定対象の試料に二光子吸収する蛍光物質を与え、標的の生体分子と蛍光物質とを相互作用させ、そこに近赤外光をレンズで集光した光を照射して、蛍光物質の発光を検出することによりイメージを得る方法が挙げられる。この方法は、二光子蛍光バイオイメージングとして知られている。
二光子蛍光バイオイメージングにより、試料の深部のイメージを得るためには、近赤外光で二光子吸収が起こることに加え、生じる蛍光についても、試料内を透過できるように、近赤外付近の発光であることが望まれる。そのため、近赤外付近領域の光により二光子吸収が効率よく起こり、近赤外付近領域の発光が起こる化合物が求められている。
二光子吸収が効率よく起こるようにするためには、その効率の良さを表す化合物の二光子吸収断面積（ＧＭ）が大きい化合物を選択する必要がある。そのためには、化合物のπ電子共役系が拡張しているもの等が良いと考えられるが、化合物のπ電子共役系を拡張すればするほど、水やアルコール等の極性溶媒への溶解性は悪くなり、バイオイメージングを行うとき、測定対象の生物試料に与え生体内に分布させることが困難となる。したがって、二光子吸収が効率よく起こる性質、赤色発光する性質、水溶性を示す性質を併せもつ二光子吸収化合物が求められている。
Biochemistry 46 (2007) 9674
水溶性に優れ、近赤外の波長領域で二光子を吸収し励起され、赤色の蛍光を発光する二光子吸収化合物を提供することを課題とする。
前記課題の解決のために鋭意研究の結果、２つのＮ−アルキルピリジニルエテニル基を置換基として有する、環数２〜４の縮合多環基化合物が、水溶性に優れ、近赤外の波長領域で二光子を吸収し励起され、赤色の蛍光を発光する二光子吸収化合物を見出した。
すなわち、本発明は、
（１）式（１）で表される化合物、
［式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は相異なっていてもよく下記式（２）を表し、
（式中、Ｒ１はＣ１〜Ｃ３のアルキル基を表し、Ｚ−はピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンを表し、波線はＹに対する共有結合を示す。）、Ｙは環数２〜４の縮合多環基を表す。］
（２）Ｙが以下の式で表される縮合多環基のいずれかであることを特徴とする前記（１）に記載の化合物、
（式中、Ｒ２は電子供与性基を表し、ａは０〜６の整数であり、ｂは０〜８の整数であり、ｃは０〜１０の整数である。ａ、ｂ又はｃが２以上の整数のとき、Ｒ２は同一又は相異なっていてもよい。波線はＸ１及びＸ２に対する共有結合を示す。）
（３）Ｙが以下の式で表される縮合多環基のいずれかであることを特徴とする前記（２）に記載の化合物、
（式中、Ｒ２は電子供与性基を表し、ａは０〜６の整数であり、ｂは０〜８の整数である。ａ又はｂが２以上の整数のとき、Ｒ２は同一又は相異なっていてもよい。波線はＸ１及びＸ２に対する共有結合を示す。）
（４）電子供与性基が、水酸基、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ基、アミノ基、エーテル結合を有するアルキル基及びエーテル結合を有するアルコキシ基から選ばれる１又は２以上であることを特徴とする前記（２）又は（３）に記載の化合物、
（５）カウンターアニオンが、ハロゲン化物イオン、スルホネートであることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物、
（６）６００〜１２００ｎｍの波長領域で二光子吸収を有することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物、
（７）６００〜９００ｎｍの波長領域の蛍光を発光することを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれかに記載の化合物、
（８）前記（１）〜（７）のいずれかに記載の化合物の１又は２以上を含有することを特徴とする蛍光プローブ組成物、
（９）前記（１）〜（７）のいずれかに記載の化合物の１又は２以上を含有することを特徴とするバイオイメージングに用いるための蛍光プローブ組成物、
（１０）前記（１）〜（７）のいずれかに記載の化合物が化学的に結合した生体分子を含んでなることを特徴とする蛍光性生体分子に関する。
（１）式（１）で表される化合物、
（２）Ｙが以下の式で表される縮合多環基のいずれかであることを特徴とする前記（１）に記載の化合物、
（３）Ｙが以下の式で表される縮合多環基のいずれかであることを特徴とする前記（２）に記載の化合物、
（４）電子供与性基が、水酸基、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ基、アミノ基、エーテル結合を有するアルキル基及びエーテル結合を有するアルコキシ基から選ばれる１又は２以上であることを特徴とする前記（２）又は（３）に記載の化合物、
（５）カウンターアニオンが、ハロゲン化物イオン、スルホネートであることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の化合物、
（６）６００〜１２００ｎｍの波長領域で二光子吸収を有することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の化合物、
（７）６００〜９００ｎｍの波長領域の蛍光を発光することを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれかに記載の化合物、
（８）前記（１）〜（７）のいずれかに記載の化合物の１又は２以上を含有することを特徴とする蛍光プローブ組成物、
（９）前記（１）〜（７）のいずれかに記載の化合物の１又は２以上を含有することを特徴とするバイオイメージングに用いるための蛍光プローブ組成物、
（１０）前記（１）〜（７）のいずれかに記載の化合物が化学的に結合した生体分子を含んでなることを特徴とする蛍光性生体分子に関する。
本発明の化合物は、近赤外の波長領域で二光子を吸収し励起され、赤色の蛍光を発光し、水溶性も併せ持つことから、蛍光プローブとして使用でき、細胞、組織、器官及び個体といった生体のバイオイメージングができる。また、生体を通過しやすい赤色の蛍光を発光することから、生体深部のイメージングも可能になる。
（化合物）
本発明の化合物は、式（１）で表される以下の化合物である。
本発明の化合物は、式（１）で表される以下の化合物である。
前記Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基とは、炭素数１〜３の直鎖又は分岐を有するアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等を表す。
前記ピリジニウムカチオンに対するカウンターアニオンとは、例えば、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン等のハロゲン化物イオン；メタンスルホネート、p−トルエンスルホネート、トリフルオロメタンスルホネート、トリフルオロエタンスルホネート等のスルホネート；ヘキサフルオロアンチモネート、ヘキサフルオロホスフェート、テトラフルオロボラート等を表し、好ましくは、ハロゲン化物イオン、スルホネートである。
前記環数２〜４の縮合多環基とは、以下の式で表される縮合多環基のいずれかを表す。
前記Ｙにおける縮合多環基の中で、以下の式で表される縮合多環基が好ましい。
（式中、Ｒ２、ａ、ｂ、波線は前記と同じ意味を表す。）
前記電子供与性基とは、縮合多環基の電子密度を増加させる効果をもつ基を意味し、例えば、水酸基、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ基、アミノ基、エーテル結合を有するアルキル基及びエーテル結合を有するアルコキシ基等が挙げられる。
前記Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基とは、炭素数１〜１０の直鎖又は分岐を有するアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプシル基、ｎ−オクチル基、ノニル基、イソノニル基、デシル基等を表す。
前記Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ基とは、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｎ−ヘプチルオキシ基、イソヘプチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ヘプチルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、イソオクチルオキシ基、ｔｅｒｔ−オクチルオキシ基、２−エチルヘキシルオキシ基等を表す。
前記アミノ基とは、−ＮＨ２、−ＮＨＲ３、−ＮＲ３Ｒ３'で表される官能基を意味する。ここでＲ３及びＲ３'は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプシル基、ｎ−オクチル基、ノニル基、イソノニル基、デシル基等のＣ１〜Ｃ１０アルキル基；シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等のＣ３〜Ｃ６シクロアルキル基；フェニル基等を表す。
エーテル結合を有するアルキル基及びエーテル結合を有するアルコキシ基とは、１又は２以上のエーテル結合を含むアルキル基及びアルコキシ基を意味し、例えば、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）２ＯＣＨ２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−（ＣＨ２）３Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３等を表す。
前記電子供与性基のうち、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、水酸基、−ＮＨ２、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＯＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３である。
式（１）で表される化合物は、可視領域から赤外領域で二光子吸収によって励起されるものが好ましく、該二光子吸収は６００〜１２００ｎｍで吸収される化合物が好ましい。また、式（１）で表される化合物のうち、二光子吸収によって６００〜９００ｎｍの波長領域の蛍光を発光する化合物が好ましい。また、式（１）で表される化合物のうち、二光子吸収断面積が、２００ＧＭ（１ＧＭ＝１０−５０ｃｍ４ｓｍｏｌｅｃｕｌｅ−１ｐｈｏｔｏｎ−１）以上であるものが好ましく、５００ＧＭ以上であるものがより好ましい。
式（１）で表される化合物は、具体的には、表１〜表３に示す化合物を例示することができる。芳香環上の数字は、芳香環の炭素番号を表す。
（化合物の合成）
本発明の式（１）で表される化合物の合成法は、特に制限されるものではないが、例えば、以下の方法１〜３に示すように、縮合多環部分とピリジン部分とを二重結合を介して連結する方法が挙げられる。
本発明の式（１）で表される化合物の合成法は、特に制限されるものではないが、例えば、以下の方法１〜３に示すように、縮合多環部分とピリジン部分とを二重結合を介して連結する方法が挙げられる。
方法１
縮合多環部分とピリジン部分とのカップリングは、ヘック反応により行うことができる。すなわち、式（３）のハロゲン化アリールと４−ビニルピリジンを、必要に応じて適当な反応溶媒中で、パラジウム触媒及び塩基の存在下反応し、式（４）の化合物を得る。その後、式（４）の化合物を必要に応じて適当な反応溶媒中で、Ｎ−アルキル化剤（Ｒ１Ｚ）によりピリジンの窒素をアルキル化することにより式（１）の化合物を合成することができる。
縮合多環部分とピリジン部分とのカップリングは、ヘック反応により行うことができる。すなわち、式（３）のハロゲン化アリールと４−ビニルピリジンを、必要に応じて適当な反応溶媒中で、パラジウム触媒及び塩基の存在下反応し、式（４）の化合物を得る。その後、式（４）の化合物を必要に応じて適当な反応溶媒中で、Ｎ−アルキル化剤（Ｒ１Ｚ）によりピリジンの窒素をアルキル化することにより式（１）の化合物を合成することができる。
前記ハロゲン化アリール及び４−ビニルピリジンは市販品を使用できる。また、前記ハロゲン化アリールと前記４−ビニルピリジン化合物の使用量比は、特に限定されないが、４−ビニルピリジンのハロゲン化アリールに対する当量比として、２．０〜４．０、好ましくは２．１〜３．０の範囲から適宜選択される。
前記パラジウム触媒は、通常ヘック反応に用いられるパラジウム触媒であれば特に限定されず、例えば、酢酸パラジウム、塩化パラジウム、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム、ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム、ビス（トリ−オルト−トリルホスフィン）パラジウムジクロリド、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウムジクロリド、パラジウムアセチルアセトナト、パラジウム炭素、ジクロロビス（アセトニトリル）パラジウム、ビス（ベンゾニトリル）パラジウムクロリド、（１，３−ジイソプロピルイミダゾール−２−イリデン）（３−クロロピリジル）パラジウムジクロリド、ビス（トリ−ｔｅｒｔ−ブチルホスフィン）パラジウム、ジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）、ジクロロビス（トリシクロヘキシルホスフィン）パラジウム等が挙げられる。触媒の使用量は、特に限定されないが、ハロゲン化アリールに対する当量比として、０．０１〜０．５、好ましくは０．０５〜０．３の範囲から適宜選択される。
前記塩基は、通常ヘック反応に用いられる塩基であれば特に限定されず、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、ピリジン等のアミン類；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化セシウム等の無機塩基類が挙げられる。塩基の使用量は、特に限定されないが、ハロゲン化アリールに対する当量比として、２〜２０、好ましくは３〜１０の範囲から適宜選択される。
前記ハロゲン化アリールと前記４−ビニルピリジンとのカップリング反応における溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒等挙げられる。これら反応溶媒は、それぞれ単独で用いても２種以上適宜組み合わせて用いてもよい。溶媒の使用量は、特に限定されないが、ハロゲン化アリールが、０．１〜２（ｍｏｌ／Ｌ）、好ましくは０．５〜１．５（ｍｏｌ／Ｌ）の濃度になる範囲から適宜選択される。
前記ハロゲン化アリールと前記４−ビニルピリジンとのカップリング反応時の温度は、通常０〜２００℃、好ましくは２０〜１３０℃であるが、使用する溶媒や塩基の沸点によって適宜選択される。反応は空気雰囲気下で行ってもよいが、通常は不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。不活性ガスとしてはアルゴン、ヘリウム、窒素ガス等が挙げられる。
前記カップリング反応で得られた反応溶液を必要に応じて濃縮した後、残渣をそのまま次の反応に使用してもよく、適宜な後処理を行った後に、式（４）で表される化合物として用いてもよい。後処理の具体的な方法としては、抽出処理及び／又は晶出、再結晶、クロマトグラフィー等の公知の精製が挙げられる。
前記アルキル化剤は、通常窒素のアルキル化に用いられるＮ−アルキル化剤であれば特に限定されず、例えば、ヨードメタン、ヨードエタン、１−ヨードプロパン、ジメチル硫酸、トリフルオロメタンスルホン酸メチル等が挙げられる。アルキル化剤の使用量は、特に限定されないが、式（４）で表される化合物に対する当量比として、１〜１０、好ましくは１〜５の範囲から適宜選択される。
前記アルキル化における溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等が挙げられる。これら反応溶媒は、それぞれ単独で用いても２種以上適宜組み合わせて用いてもよい。溶媒の使用量は、特に限定されないが、式（４）で表される化合物が、０．０１〜２（ｍｏｌ／Ｌ）、好ましくは０．０５〜１．０（ｍｏｌ／Ｌ）の濃度になる範囲から適宜選択される。
前記アルキル化反応時の温度は、通常０〜２００℃、好ましくは２０〜１３０℃であるが、使用する溶媒や塩基の沸点によって適宜選択される。反応は空気雰囲気下で行ってもよいが、通常は不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。不活性ガスとしてはアルゴン、ヘリウム、窒素ガス等が挙げられる。
前記アルキル化反応が終了後の反応溶液を必要に応じて濃縮した後、析出した結晶をそのまま、あるいは、適宜な後処理を行った後に、式（１）で表される化合物として用いてもよい。後処理の具体的な方法としては、抽出、晶出、再結晶、クロマトグラフィー等の公知の精製が挙げられる。
方法２
式（５）で表されるアルデヒドと式（６）で表されるＮ−アルキル−４−メチルピリジン−１−イウム化合物とを、触媒量の塩基の存在下、必要に応じて適当な反応溶媒中で反応することにより式（１）の化合物を合成することができる。
（式中、Ｒ１、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ、Ｚ−は前記と同じ意味を表す。）
式（５）で表されるアルデヒドと式（６）で表されるＮ−アルキル−４−メチルピリジン−１−イウム化合物とを、触媒量の塩基の存在下、必要に応じて適当な反応溶媒中で反応することにより式（１）の化合物を合成することができる。
前記アルデヒドは、公知の方法によって、アリール化合物から誘導することができる。例えば、市販のハロゲン化アリールをリチオ化した後、ホルミル化する反応により誘導する方法、市販のナフタレン、アントラセン、ピレン等のアリール化合物をフリーデル・クラフツ反応により誘導する方法、ビス（ヒドロキシメチル）アリール化合物を適当な酸化反応により誘導する方法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記Ｎ−アルキル−４−メチルピリジン−１−イウム化合物は、４−メチルヨードピリジンからZhang, Y.; Wang, J.; Ji, P.; Yu, X.; Liu, H.; Liu, X.; Zhao, N.; Huang, B. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 4582-4588に記載の方法にしたがって合成できるが、これに限定されるものではない。また、前記アルデヒドと前記Ｎ−アルキル−４−メチルピリジン−１−イウム化合物の使用量比は、特に限定されないが、Ｎ−アルキル−４−メチルピリジン−１−イウムのアルデヒドに対する当量比として、２．０〜４．０、好ましくは２．１〜３．０の範囲から適宜選択される。
前記塩基は、特に限定されず、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、ピリジン、ピペリジン等が挙げられる。塩基の使用量は、特に限定されないが、前記アルデヒドに対する当量比として、０．０１〜１．０の範囲から適宜選択される。
前記の反応における反応溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系溶媒、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等が挙げられる。これら反応溶媒は、それぞれ単独で用いても２種以上適宜組み合わせて用いてもよい。溶媒の使用量は、特に限定されないが、前記アルデヒドが、０．００１〜１．０（ｍｏｌ／Ｌ）の濃度になる範囲から適宜選択される。
前記の反応時の温度は、通常０〜２００℃、好ましくは２０〜１３０℃であるが、使用する溶媒や塩基の沸点によって適宜選択される。反応は空気雰囲気下で行ってもよいが、通常は不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。不活性ガスとしてはアルゴン、ヘリウム、窒素ガス等が挙げられる。
反応が終了後の反応溶液を必要に応じて濃縮した後、析出した結晶をそのまま、あるいは、適宜な後処理を行った後に、式（１）で表される化合物として用いてもよい。後処理の具体的な方法としては、抽出、晶出、再結晶、クロマトグラフィー等の公知の精製が挙げられる。
方法３
また、式（４）で表される化合物は、ホーナー・ワズワース・エモンズ反応により誘導できる。すなわち、リン酸エステル化合物（７）及び４−ピリジンカルボキシアルデヒドを、必要に応じて適当な反応溶媒中で、塩基の存在下反応し、式（４）の化合物を得る。その後、方法１と同様に、Ｎ−アルキル化剤によりピリジンの窒素をアルキル化することにより式（１）の化合物を合成することができる。
（式中、Ｙ、Ｘ１'、Ｘ２'は前記と同じ意味を表し、Ｒ４はエチル基又は２，２，２−トリフルオロエチル基を表す。）
また、式（４）で表される化合物は、ホーナー・ワズワース・エモンズ反応により誘導できる。すなわち、リン酸エステル化合物（７）及び４−ピリジンカルボキシアルデヒドを、必要に応じて適当な反応溶媒中で、塩基の存在下反応し、式（４）の化合物を得る。その後、方法１と同様に、Ｎ−アルキル化剤によりピリジンの窒素をアルキル化することにより式（１）の化合物を合成することができる。
前記式（７）で表されるリン酸エステル化合物は、Iwase, Y.; Kamada, K.; Ohta, K.; Kondo, K. J. Mater. Chem. 2003, 13, 1575-1581に記載の方法にしたがって、ビス（ハロメチル）アリール化合物を亜リン酸トリエチル又は亜リン酸トリス（２，２，２−トリフルオロエチル）と反応させることにより誘導する方法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。前記４−ピリジンカルボキシアルデヒドは、市販品を使用できる。また、前記リン酸エステル化合物と前記４−ピリジンカルボキシアルデヒドの使用量比は、特に限定されないが、４−ピリジンカルボキシアルデヒドのリン酸エステル化合物に対する当量比として、２．０〜４．０の範囲から適宜選択される。
前記塩基は、特に限定されず、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン、水素化ナトリウム、ナトリウムヘキサメチルジシラジド、カリウムヘキサメチルジシラジド、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド、ｔｅｒｔ−ブトキシカリウム等が挙げられる。塩基の使用量は、特に限定されないが、ハロゲン化アリールに対する当量比として、２．０〜４．０の範囲から適宜選択される。
前記の反応における反応溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶媒、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール系溶媒、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒等が挙げられる。これら反応溶媒は、それぞれ単独で用いても２種以上適宜組み合わせて用いてもよい。溶媒の使用量は、特に限定されないが、アルデヒドが、０．００１〜１．０（ｍｏｌ／Ｌ）の濃度になる範囲から適宜選択される。
前記の反応時の温度は、通常０〜２００℃、好ましくは２０〜１３０℃であるが、使用する溶媒や塩基の沸点によって適宜選択される。反応は空気雰囲気下で行ってもよいが、通常は不活性ガス雰囲気下で行うことが好ましい。不活性ガスとしてはアルゴン、ヘリウム、窒素ガス等が挙げられる。
前記反応が終了後の反応溶液を必要に応じて濃縮した後、析出した結晶をそのまま、洗浄、あるいは、適宜な後処理を行った後に、式（１）で表される化合物として用いてもよい。後処理の具体的な方法としては、抽出、晶出、再結晶、クロマトグラフィー等の公知の精製が挙げられる。
（蛍光プローブ組成物）
前記式（１）で表される化合物は蛍光プローブとしてそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して蛍光プローブ組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤等の添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤等適宜の形態の組成物として提供される。
前記式（１）で表される化合物は蛍光プローブとしてそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して蛍光プローブ組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤等の添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤等適宜の形態の組成物として提供される。
（バイオイメージング）
本発明のバイオイメージングは、以下のステップによって行われる。
１）式（１）で表される化合物又は前記化合物を含む蛍光プローブ組成物を細胞、組織、器官又は個体に投与するステップ
２）前記化合物を前記細胞、組織、器官又は個体中に分布させ、前記細胞、組織、器官又は個体内の生体分子と接触させるステップ
３）前記細胞、組織、器官又は個体に前記化合物が吸収できる波長の光に曝すステップ
４）前記化合物から放出される蛍光を検出するステップ
本発明のバイオイメージングは、以下のステップによって行われる。
１）式（１）で表される化合物又は前記化合物を含む蛍光プローブ組成物を細胞、組織、器官又は個体に投与するステップ
２）前記化合物を前記細胞、組織、器官又は個体中に分布させ、前記細胞、組織、器官又は個体内の生体分子と接触させるステップ
３）前記細胞、組織、器官又は個体に前記化合物が吸収できる波長の光に曝すステップ
４）前記化合物から放出される蛍光を検出するステップ
ステップ１）において、前記化合物又は蛍光プローブ組成物を細胞、組織、器官又は個体に投与する時、水やジメチルスルホキシドといった溶媒や緩衝液に溶解してもよい。例えば、投与される対象が細胞である場合、例えば、細胞が培養されている培地に前記化合物又は蛍光プローブ組成物を混合する方法が挙げられるが、これに限定されない。
ステップ２）において、前記生体分子とは、例えば、核、小胞体、ゴルジ体、エンドソーム、リソソーム、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシソーム、細胞膜、細胞壁等に存在する核酸、タンパク質、リン脂質等が挙げられる。また、前記化合物がこれらの生体分子と接触することによって、共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、ファンデルワールス結合等の化学的な結合が形成され、蛍光性を示す生体分子となる。また、ステップ２）において、前記化合物とミトコンドリアに存在する生体分子が化学的な結合の形成することを好適に例示できる。
ステップ３）において、前記化合物が吸収できる波長とは、紫外領域、可視領域、赤外領域であれば特に限定されないが、細胞、組織、器官又は個体の深部のイメージを得るために、それらへの透過性が良い６００〜１２００ｎｍの波長領域が好ましい。励起光の光源としては、市販の光源を用いればよい。また、光に曝す方法としては、前記化合物の二光子吸収を利用して細胞、組織、器官又は個体の三次元的なイメージを得るために、６００〜１２００ｎｍの波長領域の励起光をレンズ等で集光し焦点の位置を走査するのが好ましい。
ステップ３）及びステップ４）は、本発明の実施例５に示すように二光子励起蛍光顕微鏡によって行うことができる。
以下に、実施例において本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術範囲は、これらに限定されるものではない。
実施例１．ナフタレン誘導体（Ｉ）の合成
アルゴン雰囲気下のシュレンクチューブに、２，６−ジブロモナフタレン（０．２９ｇ，１ｍｍｏｌ）とジクロロビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）（Pd(PPh3)2Cl2，０．０７７ｇ，０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。そこに、４−ビニルピリジン（０．２６ｇ，２．５６ｍｍｏｌ）、ベンゼン１ｍＬ、トリエチルアミン１ｍＬを加え、１００℃で３日間加熱撹拌した。混合溶液をろ過し、濃縮した。その後、ジクロロメタンで抽出、有機層を水で洗浄、有機層に硫酸マグネシウム（無水）を加えて乾燥し、濃縮した。粗結晶をアセトンで再結晶し、４，４−（２，６−ナフタレンジイルジ−（１Ｅ）−２，１−エテンジイル）ビスピリジンを黄金色固体として得た。
４，４−（２，６−ナフタレンジイルジ−（１Ｅ）−２，１−エテンジイル）ビスピリジン（０．３３ｇ，１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１０ｍＬに溶解し、ヨードメタン（ＣＨ３Ｉ，１ｍＬ）を加え室温で２４時間撹拌した。析出した固体をジクロロメタンで洗浄し、ナフタレン誘導体（Ｉ）を黄色固体として得た。得られたナフタレン誘導体（Ｉ）の１ＨＮＭＲを図１に示す。
実施例２．アントラセン誘導体（II）の合成
フレームドライした二口フラスコに、２，６−ジブロモアントラセン（０．３４ｇ，１ｍｍｏｌ）を加え、容器内をアルゴンガスで満たした。無水テトラヒドロフラン（１５ｍＬ）を加え、混合溶液を−７８℃まで冷却した。そこに、ｎ−ブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ，２１．４ｍＬ，３４．２ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下し、−７８℃で１時間撹拌した。その後、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）をゆっくりと滴下し、１時間撹拌した。その後、室温までゆっくりと昇温し、水を加えてクエンチし、トルエンで抽出、有機層を水で洗浄、有機層に硫酸マグネシウム（無水）を加えて乾燥し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（展開溶媒＝クロロホルム９：アセトン１）で精製した。その後、トルエン／エタノール混合溶媒で再結晶し、アントラセン−２，６−ジカルボアルデヒドを黄色固体として得た。
１，４−ジメチルピリジン−１−イウムヨージド（1,4-dimethylpyridin-1-ium iodide）は既報の手法（Zhang, Y.; Wang, J.; Ji, P.; Yu, X.; Liu, H.; Liu, X.; Zhao, N.; Huang, B. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 4582-4588.）により合成した。
１，４−ジメチルピリジン−１−イウムヨージド（1,4-dimethylpyridin-1-ium iodide）は既報の手法（Zhang, Y.; Wang, J.; Ji, P.; Yu, X.; Liu, H.; Liu, X.; Zhao, N.; Huang, B. Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 4582-4588.）により合成した。
フラスコに、アントラセン−２，６−ジカルボアルデヒド（０．０４ｇ，０．１７ｍｍｏｌ）と１，４−ジメチルピリジニウムヨージド（０．０７ｇ，０．３ｍｍｏｌ）を加え、エタノール２０ｍＬに溶解した。ピペリジンを１０滴滴下し、８０℃で２４時間加熱撹拌した。析出した固体をろ過し、エタノールで洗浄することで、アントラセン誘導体（II）を橙色固体として得た。得られたアントラセン誘導体（II）の１ＨＮＭＲを図２に示す。
実施例３．ピレン誘導体（III）の合成
１，６−ジブチルピレンは、ピレンを出発物質として既報の手法（Minabe, M.; Takeshige, S.; Soeda, Y.; Kimura, T.; Tsubota, M. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1994, 67, 172-179. and Niko, Y.; Kawauchi, S.; Otsu, S.; Tokumaru, K.; Konishi, G. J. Org. Chem. 2013, 78, 3196-3207.）により合成した。
５ｍＬのジクロロメタンに１，６−ジブチルピレン（０．３３ｇ，１．０６ｍｍｏｌ）とジクロロメチルメチルエーテル（０．５０ｍＬ，５．３ｍｍｏｌ）を溶解させ、０°Ｃに冷却した。そこに、四塩化チタン（０．６ｍＬ，５．３ｍｍｏｌ）を２ｍＬのジクロロメタンに溶解させた溶液を加えた。反応溶液を室温で２４時間撹拌した。多量の氷水で反応をクエンチした後、クロロホルムで抽出を行った。得られた有機層を炭酸水素ナトリウム水溶液と食塩水により洗浄し、無水硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）にて乾燥させ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：ヘキサン＝３：１）とそれに続くメタノールによる再結晶で精製し、黄色の固体として３，８−ジブチルピレン−１，６−ジカルボアルデヒド（０．１６ｇ，収率４１％）を得た。
３，８−ジブチルピレン−１，６−ジカルボアルデヒド（０．１０ｇ，０．２７ｍｍｏｌ）と１，４−ジメチルピリジン−１−イウムヨージド（０．１６ｇ，０．６７ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬのクロロホルムと３０ｍＬのメタノールの混合液に溶解させ、そこに触媒量のピペリジンを５滴滴下した。反応液を１２時間還流した。反応液を濃縮し、得られた粗生成物を熱メタノールと熱クロロホルムで２回洗浄し、赤色の固体としてピレン誘導体（０．１３ｇ，収率５９％）を得た。得られたピレン誘導体（III）の１ＨＮＭＲを図３に示す。
比較例１．ベンゼン誘導体（IV）
ベンゼン誘導体（IV）は、Iwase, Y.; Kamada, K.; Ohta, K.; Kondo, K. J. Mater. Chem. 2003, 13, 1575-1581に記載の方法にしたがって合成した。
実施例４．紫外−可視吸収スペクトル、蛍光スペクトル、二光子吸収断面積の測定
実施例１〜３により合成された化合物及び比較例１の紫外−可視吸収スペクトル、蛍光スペクトル、二光子吸収断面積を下記の条件にしたがって測定した。
実施例１〜３により合成された化合物及び比較例１の紫外−可視吸収スペクトル、蛍光スペクトル、二光子吸収断面積を下記の条件にしたがって測定した。
紫外−可視吸収スペクトルは、V-670-UV-VIS-NIR spectrophotometer（Jasco Co.）を用いて測定した。測定結果は、図４〜図７に示す。
蛍光スペクトルは、C9920-03G（Hamamatsu Photonics. K. K.）を用いて測定した。蛍光量子収率は積分球を用いた絶対測定により決定した。濃度が１０−６ｍｏｌ／Ｌとなるように調整した試料を用いて測定した。測定結果は、図８〜図１１に示す。
二光子吸収断面積の決定を以下の手順で行った。一光子吸収挙動同様に二光子吸収挙動も分光学的な性質であるため、物質間の二光子吸収断面積の比較には、スペクトルを測定する必要がある。そのため、二光子吸収断面積をいくつかの波長において測定し、その値を波長を横軸にプロットすることで、二光子吸収スペクトルとした。それぞれの波長での二光子吸収断面積の値は、オープンアパーチャーＺスキャン法によって見積もった。光源としては、再生増幅器（Spectra-Physics, Spitfire）から出力されたレーザー光を差周波発生装置（Spectra-Physics, OPA-800C）によって波長変換したレーザー光を用いた。出力されるレーザー光の繰り返し周波数は１ｋＨｚでパルス幅は１５０−２００ｆｓであった。レーザー光を焦点距離１５ｃｍのレンズで集光し、その光軸にそってサンプルを動かした際に観察される透過率変化の度合いから二光子吸収断面積を見積もった。用いたレーザー光の平均パワーは０．０１から０．４ｍＷで、ピーク出力は６−２４０ＧＷ／ｃｍ２であった。二光子吸収断面積のスペクトルを図１２〜１５に示す。
実施例５．細胞の蛍光化実験と観察
細胞の培養
染色のモデル細胞としてヒト胎児腎細胞であるＨｅｋ２９３細胞を使用した。Ｈｅｋ２９３細胞は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、１％（ｖ／ｖ）のトリプシン及びストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
染色のモデル細胞としてヒト胎児腎細胞であるＨｅｋ２９３細胞を使用した。Ｈｅｋ２９３細胞は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、１％（ｖ／ｖ）のトリプシン及びストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
細胞の蛍光化
顕微鏡観察を行う準備のために、Ｈｅｋ２９３細胞を３５ｍｍガラスベースディッシュに細胞密度１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈとなるように継代した。継代して２４時間後、細胞がディッシュへ付着していることを顕微鏡観察により確認した。ディッシュより培地を除き、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回細胞を洗浄した。ナフタレン誘導体（I）、アントラセン誘導体（II）又はピレン誘導体（III）の１×１０−３ｍｏｌ／ｄｍ−３のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液２μＬを添加したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地２ｍＬ（ＰＹ最終濃度１μｍｏｌ ｄｍ−３、最終ＤＭＳＯ濃度０．１％（ｖ／ｖ））をディッシュに入れ、１２時間インキュベートすることにより染色を行った。顕微鏡観察の直前に、色素を含む培地をディッシュから取り除き、ＰＢＳを用いて２回細胞を洗浄し、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地２ｍＬをディッシュに加えた。
顕微鏡観察を行う準備のために、Ｈｅｋ２９３細胞を３５ｍｍガラスベースディッシュに細胞密度１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈとなるように継代した。継代して２４時間後、細胞がディッシュへ付着していることを顕微鏡観察により確認した。ディッシュより培地を除き、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回細胞を洗浄した。ナフタレン誘導体（I）、アントラセン誘導体（II）又はピレン誘導体（III）の１×１０−３ｍｏｌ／ｄｍ−３のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液２μＬを添加したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地２ｍＬ（ＰＹ最終濃度１μｍｏｌ ｄｍ−３、最終ＤＭＳＯ濃度０．１％（ｖ／ｖ））をディッシュに入れ、１２時間インキュベートすることにより染色を行った。顕微鏡観察の直前に、色素を含む培地をディッシュから取り除き、ＰＢＳを用いて２回細胞を洗浄し、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地２ｍＬをディッシュに加えた。
二光子励起蛍光顕微鏡観察
二光子励起蛍光顕微鏡は、オプティカルブロック（Hamamatsu Photonics K. K.）を用いて作成した。その光学系を図１６に示す。光源にはフェムト秒チタンサファイヤレーザー（Mira900、Coherent）を用いた。焦点を走査するためのガルバノスキャナ、カットオフ波長７５０ｎｍのショートパスダイクロイックミラー（FF750-SDi02-25×36、Semrock）と中心波長６５０ｎｍのバンドパスフィルター（FF01-650/60-25、Semrock）をセットしたミラーユニットを光学系に挿入した。蛍光の検出には光電子増倍管（R928、Hamamatsu Photonics K. K.）を用い、印加電圧１０００Ｖでプリアンプ（５ＭＨｚ）付きソケットを経てＤＣ検出した。ＤＡＱはUSB-6251 BNCを、制御プログラムのプラットフォームにはLab VIEW2011（National Instruments）を用いた。サンプルステージにはKZG0620-Gを用い、対物レンズは倍率４０倍、ＮＡ＝１．１５の無限遠補正対物レンズを用いた。観察により得られた画像を図１７〜１９に示す。
二光子励起蛍光顕微鏡は、オプティカルブロック（Hamamatsu Photonics K. K.）を用いて作成した。その光学系を図１６に示す。光源にはフェムト秒チタンサファイヤレーザー（Mira900、Coherent）を用いた。焦点を走査するためのガルバノスキャナ、カットオフ波長７５０ｎｍのショートパスダイクロイックミラー（FF750-SDi02-25×36、Semrock）と中心波長６５０ｎｍのバンドパスフィルター（FF01-650/60-25、Semrock）をセットしたミラーユニットを光学系に挿入した。蛍光の検出には光電子増倍管（R928、Hamamatsu Photonics K. K.）を用い、印加電圧１０００Ｖでプリアンプ（５ＭＨｚ）付きソケットを経てＤＣ検出した。ＤＡＱはUSB-6251 BNCを、制御プログラムのプラットフォームにはLab VIEW2011（National Instruments）を用いた。サンプルステージにはKZG0620-Gを用い、対物レンズは倍率４０倍、ＮＡ＝１．１５の無限遠補正対物レンズを用いた。観察により得られた画像を図１７〜１９に示す。
本発明のナフタレン誘導体（I）、アントラセン誘導体（II）及びピレン誘導体（III）は、それぞれジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、Ｈｅｋ２９３細胞を蛍光化することができた。また、二光子励起蛍光顕微鏡で前記細胞の赤色蛍光の発光が観察された。
本発明の化合物は、近赤外の波長領域で二光子を吸収し励起され、赤色の蛍光を発光し、水溶性も併せ持つことから、蛍光プローブとして使用できる。細胞、組織、器官及び個体に投与して、それらのバイオイメージングができる。また、生体を通過しやすい赤色の蛍光を発光することから、生体深部のイメージングも可能になる。
Claims (10)
- 式（１）で表される化合物。
［式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は相異なっていてもよく下記式（２）を表し、
- Ｙが以下の式で表される縮合多環基のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
- Ｙが以下の式で表される縮合多環基のいずれかであることを特徴とする請求項２に記載の化合物。
- 電子供与性基が、水酸基、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ基、アミノ基、エーテル結合を有するアルキル基及びエーテル結合を有するアルコキシ基から選ばれる１又は２以上であることを特徴とする請求項２又は３に記載の化合物。
- カウンターアニオンが、ハロゲン化物イオン、スルホネートであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
- ６００〜１２００ｎｍの波長領域で二光子吸収を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
- ６００〜９００ｎｍの波長領域の蛍光を発光することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
- 請求項１〜７のいずれかに記載の化合物の１又は２以上を含有することを特徴とする蛍光プローブ組成物。
- 請求項１〜７のいずれかに記載の化合物の１又は２以上を含有することを特徴とするバイオイメージングに用いるための蛍光プローブ組成物。
- 請求項１〜７のいずれかに記載の化合物が化学的に結合した生体分子を含んでなることを特徴とする蛍光性生体分子。
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