JP2015149904A - 含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】人体に対して使用しても安全であり、かつ優れた効果を発揮する含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤を提供する。【解決手段】ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースを有効成分として含有する含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤。【選択図】なし

Description

本発明は、ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースを有効成分として含有する含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤に関する。

含硫アミノ酸リアーゼは、システインやメチオニンなどの含硫アミノ酸を分解し、硫化水素やメチルメルカプタンを産生する酵素である。硫化水素を産生する酵素としてはシステインデスルフヒドラーゼ等が、メチルメルカプタンを産生する酵素としてメチオニンγリアーゼが報告されている（例えば、非特許文献１など）。

硫化水素は、皮膚粘膜への刺激や、ミトコンドリア内のシトクロムｃオキシダーゼを阻害することで生体組織に対して毒性を示す。低濃度の暴露を受けた場合、眼、皮膚、気道粘膜などの障害を起こし、高濃度では、低酸素症、中枢神経系細胞の直接障害を引き起こすほか、肺の酸素分圧が低下し昏倒に至ることが知られている（非特許文献２）。
メチルメルカプタンは、「毒物及び劇物取締法」で毒物に指定されている物質である。低濃度の暴露を受けた場合、眼刺激性を示すほか、高濃度では、中枢神経系や呼吸器に障害を起こすことが知られている（非特許文献３）。
また、硫化水素やメチルメルカプタンは「悪臭防止法」の特定悪臭物質に指定されており、生活環境の保全や健康保護の面からも、硫化水素やメチルメルカプタンの発生の抑制が望まれている。

一方、硫化水素やメチルメルカプタンは比較的安定な物質であるため、化学的吸着や分解による除去が困難とされている。そこで、含硫アミノ酸リアーゼを阻害することで、硫化水素やメチルメルカプタンの発生を抑制する試みがなされている。

例えば、特許文献１には揮発性硫黄化合物生成抑制剤、硫化水素を精製する酵素の抑制剤、及びメチオニンからメチルメルカプタンを生成する酵素の阻害剤が開示されている。
また、特許文献２には、カテキン類を有効成分とした硫化水素産生酵素阻害剤が開示されている。さらに、トマトやアセンヤク抽出物、藍草抽出物および水溶性ブドウ種子抽出物などの植物抽出物やミノルシン酸などを有効成分としたメチルメルカプタン産生酵素阻害剤が開示されている（例えば、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６）。

ところで、ラクトパーオキシダーゼは、乳や唾液中に含まれる酵素である。ラクトパーオキシダーゼは、生体内の組織や体内に幅広く存在するチオシアン酸を過酸化水素の存在下で酸化し、次亜チオシアン酸を生成する。この反応系はラクトパーオキシダーゼシステムと呼ばれている。なお、過酸化水素の発生源としては、グルコースオキシダーゼおよびその基質であるグルコースが利用できることが知られている。

ラクトパーオキシダーゼシステムの利用に関しては、パーオキシダーゼ−チオシアン酸イオン−過酸化水素システムを有する乳酸菌発酵食品の製造法（特許文献７）、ウレアーゼ不活性化阻害物（特許文献８）、二酵素系歯みがき（特許文献９）、口腔内殺菌剤（特許文献１０）など様々な用途への応用が開示されている。

特開２００８−１７３４４１号公報 特開２０１１−５１９４６号公報 特開２００２−３５５３号公報 特開２０１３−７５８６０号公報 特許第５０８９１００号公報 特公平４−８１４１７号公報 特開昭６２−２２８２２４号公報 特許第４３８２２９５号公報 特公平４−２５９２４号公報 国際公開第２００８／１０５１１３号パンフレット

Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ． Ｖｏｌ．１７９４， Ｐ．１４１４−１４２０， ２００９年 国際化学物質簡潔評価文書、Ｎｏ．５３硫化水素：ヒトの健康への影響、国立医薬品食品衛生研究所、２００７年 Ｔｈｅ ＭＡＫ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ． Ｖｏｌ．２０， Ｐ．２１８−２２６， ２０１２年

特許文献１に記載されている揮発性硫黄化合物生成抑制剤、及び揮発性硫黄化合物を生成する酵素の阻害剤の有効成分は特定のアルデヒド、ウンデセナール、脂環式ケトンなどの香料であり、用途がハウスホールド製品のため、人体に安全に使用できるものではない。

一方、特許文献２〜６に記載されている揮発性硫黄化合物を生成する酵素の阻害剤の有効成分は人体への害が少なく安全に使用できるものである。しかしながら、これらは有効性において必ずしも十分な効果が得られないことや、有効量を配合した場合に特有の味やにおいが生じて嗜好性に難があることなどの問題がある。

このような状況から、人体に対する安全性が高く、日常的に飲食品として摂取でき、且つ効果の高い含硫アミノ酸リアーゼの阻害剤が望まれていた。
したがって、本発明の解決しようとする課題は人体に対して使用しても安全であり、かつ優れた効果を発揮する含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤を提供することにある。

本発明者らは、食品として幅広く利用されている乳蛋白質に着目して検討した結果、ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびグルコースからなる組成物が、チオシアン酸の存在下において含硫アミノ酸リアーゼの酵素活性を阻害する作用があることを見出し、本発明を完成させるに至った。上記課題を解決する本発明は以下の通りである。

すなわち、本発明はラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースを有効成分として含有する含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤である。
本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、チオシアン酸又はその塩の存在下で、高い含硫アミノ酸リアーゼ阻害作用効果を有する。
本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、有効成分として含有する何れの成分も人体への悪影響は少ないため、安全に人体に使用することができる。

本発明の好ましい形態では、前記含硫アミノ酸リアーゼが硫化水素産生酵素及びメチルメルカプタン産生酵素である。
かかる形態の本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、硫化水素産生酵素及びメチルメルカプタン産生酵素の活性を阻害することで、硫化水素及びメチルメルカプタンの発生を阻害し、高い消臭作用を示す。

本発明の好ましい形態では、前記含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は微生物由来の含硫アミノ酸リアーゼの活性阻害のために用いられる。

微生物が繁殖した環境においては、揮発性硫黄化合物に由来する悪臭が発生する。これは、微生物が含硫アミノ酸リアーゼによって含硫アミノ酸から揮発性硫黄化合物を生成し、放出しているからである。
かかる形態の本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、微生物による揮発性硫黄化合物の産生を阻害し、微生物が繁殖した環境における高い消臭作用を示す。

本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤の好ましい形態では、前記微生物がポリフィロモナス属に属する細菌及び／又はフゾバクテリウム属に属する細菌である。
これらの細菌は揮発性硫黄化合物発生の原因菌として知られている。かかる形態の本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、これらの細菌の含硫アミノ酸リアーゼの活性を阻害することで、高い消臭効果を発揮する。

本発明は、チオシアン酸又はその塩の存在下で用いられる、前記の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤にもある。
また、本発明は、前記の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤を含有する消臭剤にもある。
本発明の消臭剤は、含硫アミノ酸リアーゼの活性を阻害することによって、高い消臭効果を発揮する。

また、本発明は対象物をラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースによって処理することを特徴とする消臭方法にもある。
そして、本発明の消臭方法の好ましい形態では、上述した本発明の消臭剤によって対象物を処理する。
本発明の消臭方法は、含硫アミノ酸リアーゼの活性を阻害することによって、高い消臭効果を発揮する。

本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、人体に対する安全性が高く、含硫アミノ酸リアーゼ阻害効果に優れる。
また、本発明の消臭剤は、消臭効果に優れる。

次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。

＜１＞含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤
本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤の有効成分は、ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースである。以下（１）〜（３）において、本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤の有効成分のそれぞれについて詳述する。また、以下（４）において、本発明の任意成分について詳述する。

（１）ラクトパーオキシダーゼ
本発明に使用するラクトパーオキシダーゼは、ほ乳類の乳等から得ることができ、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の乳等から得ることができる。例えば、特開平５−４１９８１公報（発明の名称：生菌含有液状組成物）に開示された方法のように、乳等未加熱のホエーまたは脱脂乳から、常法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って工業的に製造することが好ましい。更に、市販の天然物由来のラクトパーオキシダーゼ（例えばバイオポール社製等）、又は組換え型ラクトパーオキシダーゼ〔例えば、シンらの方法［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニュケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、第２７１巻、２０００年、ｐ．８３１−８３６］によって発現・精製された組換え型ラクトパーオキシダーゼ、又は市販の組換え型ラクトパーオキシダーゼ〕を使用することも可能である。

本発明に使用するラクトパーオキシダーゼは、ほ乳類の乳に由来するものを好適に使用可能である。本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤を人体に使用する場合には、その乳が伝統的に飲食用に用いられている牛、羊、山羊などの乳に由来するラクトパーオキシダーゼが好ましく、特に牛乳由来のものが好ましい。これらは歴史的な年月の間、ヒトの飲食に使用されていたために、ヒトに対する安全性が極めて高い水準で担保されているからである。

また、牛乳由来の未加熱のホエーは、乳製品製造の副産物として安定して大量に得ることができるために、本発明に使用するラクトパーオキシダーゼの原料として、特に好適である。

（２）グルコースオキシダーゼ
本発明に使用するグルコースオキシダーゼは、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）等の微生物の産生する酵素である市販品のグルコースオキシダーゼ（例えば、新日本化学工業社製等）を使用することができる。

（３）グルコース
本発明に使用するグルコースは、例えば、市販品の食品添加物用のグルコース（例えば、日本食品化工社製等）を使用することもできる。

（４）チオシアン酸又はその塩
本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、チオシアン酸又はその塩（以下、チオシアン酸等ともいう）の存在下で用いる。本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤を、チオシアン酸等が存在する対象に使用する場合には、別途チオシアン酸等を該対象に添加したり、チオシアン酸等を本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤に含有させたりする必要はない。

しかし、チオシアン酸等が存在しない対象に本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤を使用する場合には、別途チオシアン酸等を該対象に添加したり、チオシアン酸等を本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤に含有させたりする必要がある。この場合、投与するチオシアン酸としては市販のもの（例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いることができる。

本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤の有効成分であるラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースは、水溶媒中で含硫アミノ酸リアーゼの阻害作用を示す。

かかる反応系におけるラクトパーオキシダーゼの濃度は、好ましくは０．１〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜３００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１．２〜３０μｇ／ｍｌである。

また、かかる反応系におけるグルコースオキシダーゼの濃度は、好ましくは５〜５０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜３０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１５〜３００μｇ／ｍｌである。

また、かかる反応系におけるグルコースの濃度は、好ましくは５０〜１００００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００〜５０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２００〜１０００μｇ／ｍｌである。

そして、かかる反応系におけるチオシアン酸等の濃度は、好ましくは０．１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．２〜６０ｍＭ、さらに好ましくは０．３〜２０ｍＭである。

本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤におけるラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースの含有量は、使用時における各成分の濃度（反応系における濃度）が上述の濃度になるように調整することが好ましい。

また、本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤を使用する際には、使用時におけるチオシアン酸等の濃度が上述の濃度であることが好ましい。したがって、本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤の使用時のチオシアン酸等の濃度が上述の濃度に満たないときは、別途チオシアン酸等を該使用対象に添加したり、本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤にチオシアン酸等を含有させたりすることが好ましい。

本発明において、含硫アミノ酸リアーゼとは、リアーゼ（付加脱離酵素、ＥＣ．４．）のうち、炭素硫黄リアーゼ（ＥＣ．４．４．）に分類される酵素のことをいい、含硫アミノ酸を分解する酵素のことをいう。含硫アミノ酸リアーゼは大きく分けて硫化水素産生酵素とメチルメルカプタン産生酵素に分類される。

硫化水素産生酵素としてはシステインデスルフドヒドラーゼ（ＥＣ．４．４．１．１．）、シスタチオンβ−リアーゼ（ＥＣ．４．４．１．８．）、及びメチオニンγリアーゼ（ＥＣ．４．４．１．１１．）が知られている。

一方、上記メチオニンγリアーゼはメチルメルカプタン産生酵素でもある。

上述したように含硫アミノ酸リアーゼはその酵素反応によって硫化水素又はメチルメルカプタンのような悪臭の原因となる揮発性硫黄化合物を生成する。
したがって、硫化水素産生酵素及びメチルメルカプタン産生酵素の両方の活性を阻害する形態が、本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤の好ましい実施の形態である。

本発明の好ましい実施形態では、前記含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、微生物由来の含硫アミノ酸リアーゼ活性の阻害のために用いられる。
含硫アミノ酸リアーゼをコードする遺伝子は微生物において広く分布している。そして、含硫アミノ酸リアーゼを有する微生物は揮発性硫黄化合物を産生することで悪臭を発生させる。かかる形態の本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、微生物が原因である揮発性硫黄化合物の発生を防止し、高い防臭効果を発揮する。

ここで微生物とは、肉眼でその存在が判別できず、顕微鏡などによって観察できる程度以下の大きさの生物を指す。微生物には、真正細菌、古細菌のみならず、真核生物（藻類、原生生物、菌類、粘菌）や、ワムシのようなごく小型の動物も含まれる。

本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤の好ましい実施形態では、前記含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、ポルフィロモナス属に属する細菌及び／又はフソバクテリウム属に属する細菌に由来する含硫アミノ酸リアーゼの活性の阻害のために用いられる。
これらの細菌は揮発性硫黄化合物に由来する悪臭を発生する原因菌として代表的なものである。かかる実施形態の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、これらの細菌の含硫アミノ酸リアーゼの活性を阻害することで、高い消臭効果を有する。

＜２＞消臭剤
本発明は、上述の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤を含有し、チオシアン酸又はその塩の存在下で用いられる消臭剤にも関する。
排水、排水設備（排水口や排水溝）、排泄物、生ごみ、生乾きの衣類等は、繁殖した微生物によって産生される揮発性硫黄化合物に由来する悪臭を放つことがある。
本発明の消臭剤は、上述のような悪臭の発生源に使用することによって、微生物の含硫アミノ酸リアーゼを阻害し、揮発性硫黄化合物の産生を抑制することで消臭効果を発揮する。

上述のとおり、本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、項目＜１＞で説明した各成分の濃度範囲において高い含硫アミノ酸リアーゼ阻害作用を発揮する。そのため、本発明の消臭剤を使用した際の各成分の濃度が上述の濃度範囲内になることが好ましい。

すなわち、本発明の消臭剤は、使用時におけるラクトパーオキシダーゼの濃度が、好ましくは０．１〜５００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜３００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１．２〜３０μｇ／ｍｌ、グルコースオキシダーゼの濃度が、好ましくは５〜５０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜３０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１５〜３００μｇ／ｍｌ、グルコースの濃度が、好ましくは５０〜１００００μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００〜５０００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは２００〜１０００μｇ／ｍｌとなるように使用される形態であることが好ましい。

また、本発明の消臭剤は、好ましくは０．１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．２〜６０ｍＭ、さらに好ましくは０．３〜２０ｍＭの濃度のチオシアン酸等の存在下で用いることが好ましい。本発明の消臭剤の使用時におけるチオシアン酸等の濃度が上記の濃度未満となる場合は、別途チオシアン酸等を該使用対象に添加したり、本発明の消臭剤にチオシアン酸等を含有させたりすることが好ましい。

本発明の消臭剤は、水溶液組成物の形態としてもよいし、固形組成物の形態としてもよい。
水溶液組成物の形態とすれば、スプレーボトルなどに充填して使用対象に散布するような使用態様が可能となる。
また、固形組成物の形態とすれば、排水などの水溶液に投入し、該水溶液中で溶解させることで消臭効果を発揮させることができる。かかる場合には、本発明の消臭剤をタブレット形状に成形することが好ましい。

＜３＞消臭方法
本発明は対象物をラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースによって処理することを特徴とする消臭方法にもある。
上述のとおり、本発明の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤は、項目＜１＞で説明した各成分の濃度範囲において高い含硫アミノ酸リアーゼ阻害作用を発揮する。そのため、本発明の消臭方法においては、対象物を処理する際のラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースの各濃度が該項目で説明した濃度範囲内であることが好ましい。

対象物をラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースによって処理する際にチオシアン酸等の濃度が該項目で説明した濃度範囲を下回る場合には、別途チオシアン酸等を対象物に添加することが好ましい。

本発明の消臭方法において、対象物をラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースによって処理する時間は、好ましくは１分から１時間、より好ましくは５分から４５分、さらに好ましくは１０分から３０分である。

本発明の消臭方法においては、ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースの各成分を対象物に順次添加する形態としても良いし、各成分を含む混合物、すなわち本発明の消臭剤を対象物に添加するようにしても良い。
対象物が固形物である場合には、ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースの各成分は水溶液組成物の形態で対象物に付着させる。かかる場合には、該水溶液組成物をスプレーボトルなどに充填して対象物に噴霧することが好ましい。
また、対象物が水溶液である場合にはラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースを固形組成物の形態として対象物に投入することが好ましい。かかる場合には、ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースの各成分をタブレット形状に成形したものを用いることが好ましい。

＜試験例１＞
本試験は、ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびグルコースを含む組成物による、含硫アミノ酸リアーゼ阻害作用を調べるために行った。

（１）試料の調製
ラクトパーオキシダーゼ溶液、グルコースオキシダーゼ溶液、グルコース溶液および含硫アミノ酸リアーゼ溶液を以下の通り調製した。
ラクトパーオキシダーゼ（ＤＯＭＯ社製）を０．２ｍｇ／ｍｌになるように、ヒトの唾液と同じレベルの０．６６ｍＭチオシアン酸ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）に溶解し、ラクトパーオキシダーゼ溶液とした。

グルコースオキシダーゼ（新日本化学工業社製）を２．５ｍｇ／ｍｌになるように、０．６６ｍＭチオシアン酸ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）に溶解し、グルコースオキシダーゼ溶液とした。
グルコース（ナカライテスク社製）を２．８ｍｇ／ｍｌになるように、０．６６ｍＭチオシアン酸ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）に溶解し、グルコース溶液とした。

含硫アミノ酸リアーゼ溶液の調製は、Ｉｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，Ｖｏｌ．７２， Ｐ．２４１１−２４１４， ２００８年）を参考にした。
詳しくは、０．１％酵母抽出物、５ｍｇ／ｌヘミンおよび１ｍｇ／ｌメナジオンを添加したトリプチケースソイブロスにポリフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ５３９７８（Ｐ．Ｇ菌）、又はフゾバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆ．Ｎ菌）を植菌し、１日間、３７℃、嫌気条件（二酸化炭素１０％、水素５％、窒素８５％）で培養した。培養液を３，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心分離して培地成分を除去し、回収した菌体は４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄後、再度遠心分離し、４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）に懸濁した。

この懸濁液をマルチビーズショッカー（安井器械社製）で菌体破砕し（運転条件：２，５００ｒｐｍ、３０秒運転、３０秒休止、３サイクル）、１６，０００ｒｐｍ、０℃、３０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社）でタンパク濃度を定量し、１．５ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌになるように４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で希釈し、含硫アミノ酸リアーゼ溶液とした。

以下の（２）で述べる方法で含硫アミノ酸リアーゼ溶液のリアーゼ活性を測定したところ、硫化水素産生酵素活性は２．８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ（Ｐ．Ｇ菌の菌体破砕物中の蛋白質あたり）、７５．９ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ（Ｆ．Ｎ菌の菌体破砕物中の蛋白質あたり）、メチルメルカプタン産生酵素活性は１３．３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ（Ｐ．Ｇ菌の菌体破砕物中の蛋白質あたり）、４４．１ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ（Ｆ．Ｎ菌の菌体破砕物中の蛋白質あたり）であった。
なお、本発明において、硫化水素産生酵素活性は、菌体破砕物中の蛋白質あたり、単位時間（分）あたりのピルビン酸産生量（ｎｍｏｌ）としての値である。また、メチルメルカプタン産生酵素活性は、菌体破砕物中の蛋白質あたり、単位時間（分）あたりのα−ケト酪酸産生量（ｎｍｏｌ）としての値である。

（２）試験方法
硫化水素産生酵素は、システインを基質として硫化水素、ピルビン酸およびアンモニアを生成する。メチルメルカプタン産生酵素は、メチオニンを基質としてメチルメルカプタン、α−ケト酪酸およびアンモニアを生成する。反応生成物のうち、比較的安定であるピルビン酸およびα−ケト酪酸の生成量を測定し、硫化水素産生酵素とメチルメルカプタン産生酵素の活性を調べた。

ラクトパーオキシダーゼ溶液、グルコースオキシダーゼ溶液およびグルコース溶液を、０．６６ｍＭチオシアン酸ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中に、反応系で表１の濃度になるように混合し、試験試料１および対照試料１〜４を調製した。

試験試料１および対照試料１〜４について各々３４０μｌに、含硫アミノ酸リアーゼ溶液４０μｌと５ｍＭピリドキサール−５’−リン酸４μｌを添加し、３７℃で１０分間又は３０分間インキュベートした。
その後、１０ｍＭアジ化ナトリウム４μｌを添加して、ラクトパーオキシダーゼシステムの反応を停止した。その後、３３３ｍＭ Ｌ−システイン溶液１２μｌ、または３３３ｍＭ Ｌ−メチオニン溶液１２μｌを添加し、３７℃、９０分のインキュベート後、４．５％トリクロロ酢酸２００μｌを添加して含硫アミノ酸リアーゼの反応を停止し、３，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離して、上清を回収した。

９６穴マイクロプレートに、上清１００μｌおよび０．０５％ ３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）溶液１００μｌを添加し、５０℃でインキュベートした。インキュベートを開始してから３０分後に、３３５ｎｍにて吸光度を測定し、あらかじめ作成した検量線からピルビン酸量またはα−ケト酪酸量を求めた。

試験は２回、測定は４回実施して、平均値を計算した。酵素の残存活性は、下記計算式によって算出し、残存活性が５０％以下となるような効果を示した場合に有効であると判断した。
残存活性（％）＝試料の酵素活性／未処理の酵素活性×１００

未処理の酵素活性の測定は、試料に代えて０．６６ｍＭチオシアン酸ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）を使用して行った。

（３）試験結果
表２と表３にポリフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．Ｇ菌）及びフゾバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆ．Ｎ菌）の硫化水素産生酵素に対する阻害効果の結果を示し、表４と表５にＰ．Ｇ菌及びＦ．Ｎ菌のメチルメルカプタン産生酵素に対する阻害効果の結果を示す。

２０μｇ／ｍｌラクトパーオキシダーゼ、２５０μｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、および２８０μｇ／ｍｌグルコースからなる試験試料１は、Ｐ．Ｇ菌の硫化水素産生酵素の残存活性を、処理時間１０分において３５．５％に低下させ、処理時間３０分において１２．９％に低下させ、未処理との間に有意差がみられた（表２）。
また、試験試料１は、Ｆ．Ｎ菌の硫化水素産生酵素の残存活性を、処理時間１０分において６５．３％に低下させ、処理時間３０分において４９．５％に低下させ、未処理との間に有意差がみられた（表３）。

一方、ラクトパーオキシダーゼ（対照試料１）、グルコースオキシダーゼ（対照試料２）またはグルコース（対照試料３）のいずれかでは、Ｐ．Ｇ菌及びＦ．Ｎ菌において硫化水素産生酵素の阻害効果はみられなかった。さらに、グルコースオキシダーゼおよびグルコースからなる対照試料４では過酸化水素が発生するが、Ｐ．Ｇ菌及びＦ．Ｎ菌における硫化水素産生酵素の阻害効果はみられなかった。
したがって、ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびグルコースを含む組成物が、硫化水素産生酵素を阻害することが明らかとなった。

次に、Ｐ．Ｇ菌及びＦ．Ｎ菌のメチルメルカプタン産生酵素に対する阻害効果の結果を表４及び表５に示す。
試験試料１は、Ｐ．Ｇ菌のメチルメルカプタン産生酵素の残存活性を、処理時間１０分において１７．９％に低下させ、処理時間３０分において１７．０％に低下させ、未処理との間に有意差がみられた（表４）。
また、試験試料１は、Ｆ．Ｎ菌のメチルメルカプタン産生酵素の残存活性を、処理時間１０分において６．２％に低下させ、処理時間３０分において１．０％に低下させ、未処理との間に有意差がみられた（表５）。

一方、ラクトパーオキシダーゼ（対照試料１）、グルコースオキシダーゼ（対照試料２）、グルコース（対照試料３）のいずれかはＰ．Ｇ菌及びＦ．Ｎ菌のメチルメルカプタン産生酵素に対する阻害効果は認められなかった（表４及び５）。また、グルコースオキシダーゼとグルコースの組み合わせ（対照試料４）は、Ｆ．Ｎ菌のメチルメルカプタン産生酵素に対する阻害効果を示したが、Ｐ．Ｇ菌のメチルメルカプタン産生酵素には阻害効果を示さなかった（表４及び５）。

したがって、ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースを含む組成物が、メチルメルカプタン産生酵素を阻害することが明らかとなった。
なお、本試験例では、ラクトパーオキシダーゼシステムの基質として０．６６ｍＭチオシアン酸ナトリウムを試料の溶媒に添加した。これはヒトの唾液に含まれるものと同程度の濃度のため、本発明品を飲食品として使用する場合には、唾液をチオシアン酸の供給源として利用できる。

＜試験例２＞
本試験は、ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースおよびチオシアン酸を含む組成物による、含硫アミノ酸リアーゼを発生源とした硫化水素およびメチルメルカプタンの産生抑制効果を調べるために行った。

（１）試料の調製
試験例１と同様に、ラクトパーオキシダーゼ溶液、グルコースオキシダーゼ溶液、グルコース溶液および含硫アミノ酸リアーゼ溶液（Ｐ．Ｇ菌）を調製した。

（２）試験方法
ラクトパーオキシダーゼ溶液、グルコースオキシダーゼ溶液およびグルコース溶液を、０．６６ｍＭチオシアン酸ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中に、ラクトパーオキシダーゼ反応系で表１の濃度になるように混合し、試験試料１を調製した。
１５ｍｌの試験管に、試験試料１を３４０μｌ、含硫アミノ酸リアーゼ溶液を４０μｌおよび５ｍＭピリドキサール−５’−リン酸を４μｌそれぞれ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。

その後、１０ｍＭアジ化ナトリウム４μｌを添加して、ラクトパーオキシダーゼシステム反応を停止させた。反応後の各試料に、３３３ｍＭ Ｌ−システイン溶液１２μｌまたは３３３ｍＭ Ｌ−メチオニン溶液１２μｌを添加した後、ゴム栓で密封し、３７℃、１０分間インキュベートした。
ここへ３Ｍリン酸溶液２００μｌを添加し、硫化水素またはメチルメルカプタン産生反応を停止した。これを３７℃、１０分間インキュベート後、ヘッドスペースのガスをシリンジで１ｍｌ採取した。
このようにして採取したガスにおける硫化水素およびメチルメルカプタンの濃度の測定は、オーラルクロマ（ＡＢＩＬＩＴ社）を用いた。試験は２回実施して、平均値を計算した。
なお、コントロールとして、試験試料１に代えて０．６６ｍＭチオシアン酸ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）を使用した。

（３）試験結果
硫化水素およびメチルメルカプタンの産生抑制効果の結果を表６に示す。ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびグルコースからなる試験試料１は、コントロールに比べて、硫化水素およびメチルメルカプタンの産生を１０％以下に顕著に抑制した（表６）。

以上の結果から、ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースを含む組成物が、硫化水素産生酵素およびメチルメルカプタン産生酵素を阻害することで、人体には好ましくない硫化水素やメチルメルカプタンの産生を抑制することが明らかとなった。

＜試験例３＞
本試験は、ラクトパーオキシダーゼの濃度と含硫アミノ酸リアーゼに対する阻害作用との関係を調べるために行った。

（１）試料の調製
試験例１と同様に、ラクトパーオキシダーゼ溶液、グルコースオキシダーゼ溶液、グルコース溶液および含硫アミノ酸リアーゼ溶液を調製した。

（２）方法
ラクトパーオキシダーゼ溶液、グルコースオキシダーゼ溶液およびグルコース溶液を、０．６６ｍＭチオシアン酸ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）中で混合し、ラクトパーオキシダーゼ濃度が２０、１０、５、１．２、０．３、０．０８および０．０２μｇ／ｍｌになるように試験試料２ａ〜２ｇを調製した。グルコースオキシダーゼおよびグルコースの濃度は、試験試料１と同様にした。

本試験は、試験例１の試験試料１および対照試料１〜４を試験試料２ａ〜２ｇに変更した以外は、試験例１と同様に試験を行った。なお、本試験例においてはＰ．Ｇ菌由来の含硫アミノ酸リアーゼ溶液を使用した。

（３）試験結果
この試験の結果を表７と表８に示す。表７は、ラクトパーオキシダーゼの濃度と硫化水素産生酵素に対する阻害効果の関係を示す表である。その結果、硫化水素産生酵素を阻害する好ましい活性、すなわち、硫化水素産生酵素の残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、ラクトパーオキシダーゼの濃度は１．２μｇ／ｍｌ以上であればよいと考えられる。
表８は、ラクトパーオキシダーゼの濃度とメチルメルカプタン産生酵素に対する阻害効果の関係を示す表である。その結果、メチルメルカプタン産生酵素を阻害する好ましい活性、すなわち、メチルメルカプタン産生酵素の残存活性が５０％以下となる活性を得るためには、ラクトパーオキシダーゼの濃度は１．２μｇ／ｍｌ以上であればよいと考えられる。

＜実施例＞
次に実施例を示して本発明品を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤（タブレット）
ラクトパーオキシダーゼ（ＤＯＭＯ社製）５ｇ、グルコースオキシダーゼ（新日本化学社製）６２．５ｇ、グルコース（日本食品化工社製）７０ｇ、ポリデキストロース（光洋商会社製）２５０ｇ、クエン酸（扶桑化学工業社製）３０ｇ、エリスリトール（三菱化学フーズ社製）２００ｇ、キシリトール（三菱商事フードテック社製）６０ｇ、還元麦芽糖水飴（三菱商事フードテック社製）１８８．５ｇ、微結晶セルロース（旭化成ケミカルズ社製）１００ｇ、レモンフレーバー（長谷川香料社製）１０ｇ、微粉末シリカ（富士シリシア化学社製）４ｇ、ショ糖脂肪酸エステル（第一工業製薬）２０ｇの割合で含有する原料混合物を打錠して、１錠あたり１ｇからなるタブレット形態の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤を製造した。

＜実施例２＞
消臭剤
ラクトパーオキシダーゼ（ＤＯＭＯ社製）５ｇ、グルコースオキシダーゼ（新日本化学社製）６２．５ｇ、グルコース（日本食品化工社製）７０ｇ、チオシアン酸ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）０．０５ｇ、および水８６２．４５ｇを混合し、消臭剤を製造した。
当該消臭剤を前記試験例２と同様の方法で使用したところ、硫化水素やメチルメルカプタンのガスの産生を効果的に抑制することができ、消臭剤として利用することができた。

本発明は、硫化水素産生酵素阻害剤、メチルメルカプタン産生酵素阻害剤、および消臭剤に応用できる。

Claims (6)

1. ラクトパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコースを有効成分として含有する含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤。
2. 前記含硫アミノ酸リアーゼが硫化水素産生酵素及びメチルメルカプタン産生酵素である、請求項１に記載の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤。
3. 微生物由来の含硫アミノ酸リアーゼの活性阻害のために用いられる、請求項１又は２に記載の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤。
4. 前記微生物がポルフィロモナス属に属する細菌及び／又はフソバクテリウム属に属する細菌である、請求項３に記載の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤。
5. チオシアン酸又はその塩の存在下で用いられる請求項１〜４のいずれか一項に記載の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤。
6. 請求項５に記載の含硫アミノ酸リアーゼ阻害剤を含有する消臭剤。