JP4607366B2 - 外用剤組成物 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの不快な体臭の発生を抑制する外用剤組成物に関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ヒトの不快な体臭の防除技術には、制汗機能を有する素材による汗の制御技術、抗菌機能を有する素材による不快臭発生原因菌の増殖の制御技術、発生した不快な体臭を消臭する技術及び香りによるマスキング技術等がある。
【0003】
制汗技術としては比較的強い収斂作用を有するパラフェノールスルホン酸亜鉛やクエン酸、各種のアルミニウムやジルコニウム塩を用いて発汗を抑制する方法が考案され、抗菌技術としては体臭の原因物質を作り出す原因菌(皮膚常在菌を含む)の増殖を抑制する機能を有するトリクロ酸、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩酸クロルヘキシジン、ハロカルバン等の抗菌剤を用いて臭気の発生を抑制する方法が考案されている。
【0004】
また、消臭技術としては不快な体臭の原因物質の―つである低級脂肪酸を亜鉛華(酸化亜鉛)などにより金属塩に変えることでその特異的な臭気の発生を抑制する方法やフラボノイドやクロロフィルなど消臭効果を有する素材の配合が考案され、マスキング技術としては、香水やオーデコロンにより程度の弱い体臭をマスキングする方法等が考案されている。
【0005】
しかしながら、従来の制汗技術、消臭技術及びマスキング技術は、効果の持続性という点で充分でなく、また抗菌技術は不快臭の発生原因菌以外に皮膚常在菌をも殺菌することで皮膚の一次バリアー機能を低下させるおそれが示唆されている。
【0006】
本発明は、皮膚の常在菌を殺すことなく、不快な体臭を持続的に抑制できる外用剤組成物を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトの不快な体臭の原因物質の一つとされるアポクリン臭に着目し、その生成抑制について検討したところ、システインプロテアーゼ阻害剤の一つであるシスタチンがアポクリン臭の生成を抑制し、皮膚常在菌を殺すことなく不快な体臭の発生を抑制できる外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤として使用できることを見出した。
【0008】
すなわち本発明は、シスタチンを含有する外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤を提供するものである。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明の外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤の有効成分であるシスタチンとは、システインプロテアーゼ阻害活性を有する蛋白性の物質であり、動物組織、細胞、血液中や尿中に見出され、これまでにラット表皮由来のシスタチンα、ラット肝臓由来のシスタチンβ、ヒト尿由来のシスタチンC、ヒト唾液由来のシスタチンS、卵白シスタチン、牛初乳由来シスタチン(特開平7−126294号公報)、サケ由来シスタチン(特開平5−247093)等が知られている。本発明においては、アポクリン臭抑制効果を有する限りこれらの何れをも包含するものであるが、効果の点からヒト唾液由来のシスタチンSが特に好ましい。
また、当該シスタチンは、天然型或いは遺伝子組換えにより産生された組換え体の何れでもよい。
【0010】
また、化粧料やデオドラント剤においては、皮膚のバリヤー機能の維持に関与する皮膚常在菌に対して抗菌性、望ましくは殺菌性を示さないものが好ましいが、皮膚常在菌に対して抗菌性を示さないシスタチンは、斯かる点においても好ましい。尚、ここでいう殺菌性を示さないとは、実施例1に示す方法によって調製した汗に被験物質を添加したものに皮膚常在菌を接種し、37℃、2時間反応後に、胞子形成菌(Bacillus subtilis)はコントロールに対し菌数が1/10以下に減少せず、通常細菌(Staphylococcus epidermidis、Corynebacterium minutissimumon及びBrevibacterium epidermidis)はコントロールに対し1/100以下に減少しないことをいう(図3参照)。
【0011】
斯かるシスタチンには、これまでに抗アレルギー作用(特開平2−223529号公報)、抗ウイルス作用(特開昭61−225130号公報)、ウイルスの増殖抑制作用(Biochem. Biopys. Res. Commun.127,1072(1985))、骨からのカルシウムの遊離抑制作用(特開平2−223529号公報)、破骨細胞による骨吸収抑制作用(特開平7−126294号公報)等が報告され医薬としての使用が示唆されているが、体臭の発生を阻止し、デオドラント効果を有する外用剤組成物として使用できるという報告はこれまでにない。
【0012】
天然型のシスタチンは、例えばヒト唾液よりアフィニティークロマトグラフィーやHPLCなどの既知方法に従って精製することにより取得することができ、遺伝子の組換えによって得られるシスタチンは、既知の遺伝子を組み込んだプラスミド或いはベクターを導入した大腸菌や既存細胞株の産生蛋白を同様に精製することにより得ることが可能である。
【0013】
かくして得られるシスタチンは、後記実施例1に示すように体臭の発生を抑制し、また皮膚の常在菌を殺すことがないため、これを有効成分として含有する組成物は、皮膚の一次バリアー機能を低下することなく、不快な体臭の発生を抑制することができる外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤として有用である。
【0014】
本発明の外用剤組成物及びデオドラント剤は、化粧料、外用医薬品又は医薬部外品等の製剤、例えばクリーム、乳液、ローション、パウダー、スプレー、スティック等として用いることができる。
【0015】
本発明の外用剤組成物及びデオドラント剤を化粧料、外用医薬品又は医薬部外品として用いる場合のシスタチンの含有量は、一般的に0.001〜10重量%とするのが好ましく、特に0.005〜1重量%とするのが好ましい。
【0016】
本発明の外用剤組成物及びデオドラント剤には、製剤化に通常用いられる各種成分、例えば化粧料成分として一般的に使用される油分、界面活性剤、アルコール類、キレート剤、pH調整剤、防腐剤、増粘剤、色素類、香料等の他、紫外線吸収剤、美白剤、しわ改善剤、保湿剤、皮脂分泌抑制剤、柔軟剤、角質保護剤、薬効剤、酸化防止剤、溶剤等の成分を任意に組み合わせ配合して、化粧料、外用医薬品、医薬部外品として製剤化することができる。
【0017】
本発明の外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤は、足、腋、頭部、陰部等不快臭の発生しやすい箇所に局所的に適用することにより、不快臭の発生を制御することができる。斯かる場合の製剤の使用量は、有効成分の含有量により異なるが例えば液状製剤の場合皮膚面1cm2当たり1〜20mg、固形状の製剤の場合、同じく1〜50mgとするのが好ましい。
【0018】
【実施例】
製造例1 シスタチンSの製造
(1)パパイン阻害活性の測定方法
シスタチンSのパパイン阻害活性はBarretら(Methods in enzymology Vol.80、pp771(1981))に準じて測定した。10mMベンゾイル−L−アルギニン−4−ニトロアニリド(Benzoil-L-arginine-4-nitroanilide)ジメチルスルホキシド溶液を基質とし、2mMのEDTAを含む、200mMリン酸緩衝液にDTTを終濃度8mMとなるように添加した。パパイン1mg/mLの濃度でDTTを含まない緩衝液に溶解した。また、反応停止用溶液として5%トリクロロ酢酸溶液を使用した。測定は以下の手順で行った。測定用チューブに1mL DTTを含む緩衝液と0.05mLのパパイン溶液、試料溶液0.5mLおよび全量2mLとなるよう蒸留水を入れ、25℃で5分間インキュベートした。ついで基質溶液0.05mLを加え攪拌した。25℃で15分反応後、1mLの反応停止液を加え、沈殿が生じた場合は10000rpm、10分間遠心分離を行い、上清の405nmの吸光度を測定した。相対阻害活性は次式(1)より求めた。
【0019】
相対阻害活性(%)=100−((A0−AI)/A0×100) (1)
A0:阻害剤フリーの吸光度
AI:サンプルの吸光度
【0020】
(2)シスタチンSの組み換え大腸菌による培養
ヒト唾液由来シスタチンSは斎藤ら(J.Biochem.116,399-405(1994))の方法に従って製造した。即ち、ヒトシスタチンSのcDNAを含む発現ベクターを大腸菌(Escherichia coli)JM109(宝酒造株式会社製)を宿主として組換え操作を行い、組換え体を作成した。組換え大腸菌の培養はアンピシリン(50μg/mL)添加LB培地50mLにて前培養を行った。本培養はM9最小培地にシュークロース(4g/L)、チアミン(2mg/L)、MgSO4(1mM)、CaCl2(0.1mM)とアンピシリン(50mg/L)を加えた培地16Lを用い30−L容ジャーファーメンターによって、前培養液16mLを添加後、培養温度37℃、通気量4L/min、攪拌数250rpmの条件で行った。培養4時間後(OD600=0.5)にイソプロピルチオガラクトシド(終濃度0.3mM)を添加してさらに4時間培養を行い、シスタチンSを発現した。培養後、Freijeら(J.Biol.Chem.268,15737-15744(1993))の方法によって菌体処理を行いペリプラズム画分を調製した。
【0021】
(3)シスタチンSの精製
シスタチンSの精製はDEAE−Toyopearl 650C(2.5cm×10cm)によるイオンクロマトグラフィーによって行った。ペリプラズム画分を10mM NH4HCO3(pH8)にて平衡化したDEAE−Toyopearl 650Cカラム(2.5cm×10cm)にロードする。10mM NH4HCO3(pH8)で溶出洗浄後、10mM NH4HCO3(pH8)(250mL)、4%NaCl溶解10mM NH4HCO3(pH8)(250mL)で形成されるグラジエントで溶出する。組換えシスタチンSを含むフラクションは(1)に示した方法によってパパイン阻害活性を測定することで検出した。
【0022】
パパイン阻害活性を有するフラクションを凍結乾燥後、再度60mLの蒸留水に溶解後、Centriprep3(MILLIPORE社製)にて20mLに脱塩濃縮を行った。さらに、40mLの蒸留水を添加して、同様に脱塩濃縮を2回行った。
【0023】
このようにして得られた組換えシスタチンSのSDS−PAGEの結果を図1に示した。得られたシスタチンSは単一のバンドを示し、分子サイズは約15kDaであることが確認された。また、プロテインアッセイ(バイオラッド社製)により牛血清アルブミンを標準として定量した結果、約16mgの組換えシスタチンSを得た。
【0024】
実施例1 シスタチンSによる体臭発生抑制効果の確認
(1)汗の調製方法
アポクリン臭を有する男性の脇の下を、蒸留水1.5mLを湿らせた脱脂綿で拭き取った。1日に1回、3日間採取した。脱脂綿を絞り、回収した液(57.5mL)を0.45μmのフィルターで濾過した後、MILLIPOREのセントリプレップ YM−10で濃縮をし、再度蒸留水を添加して同様にセントリプレップ YM−10で濃縮し、低分子を除去した。これを、濃縮汗とした。
【0025】
(2)官能評価
上記方法によって調製した濃縮汗3mLに精製組換えシスタチンS 0.34mgを添加した液にバッファー(pH7.2、20mMトリス−HClバッファー)で洗浄(3回)したBrevibacterium epidermidisを最終菌体量が約108cfu/mLになるように接種し、37℃、2時間インキュベートした後、菌数を測定すると共に反応液の臭い成分を抽出(エーテルで抽出後、N2で固化)し、臭いの官能評価をした。尚、比較としてシスタチンを添加しないもの及びシスタチンSの代わりにシステインプロテアーゼであるE−64(シグマ社製)を添加したものについて同様に試験し評価した。また、菌数測定は、生理食塩水で希釈後、SCDLP寒天培地に塗抹し、30℃、24時間培養し、コロニーをカウントすることにより行った。結果を図2及び図3に示す。
これより、シスタチンSを添加することにより、体臭の生成が抑制された。
【0026】
【発明の効果】
本発明の外用剤組成物、化粧料及びデオドラント剤は、皮膚の常在菌を殺すことなく、不快な体臭の発生を持続的に抑制できることから、優れた消臭効果と高い安全性を有する。
【図面の簡単な説明】
【図1】精製シスタチンSのSDS−PAGEの結果を示す図である。
【図2】シスタチンによる体臭生成抑制効果を示す図である。
【図3】シスタチンが皮膚常在菌に及ぼす影響を示す図である。
Claims (1)
- シスタチンを含有するデオドラント剤。
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