JP2015131796A

JP2015131796A - アンギオテンシンｉ転換酵素抑制と血圧低下に用いる短鎖活性ペプチド

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Publication number: JP2015131796A
Application number: JP2014227038A
Authority: JP
Inventors: 徐睿良; Jue Liang Hsu; 張誌益; Chi I Chang; 黄卓治; Tzou Chi Huang; 藍文卓; D S Rawendra Reynetha
Original assignee: National Pingtung University of Science and Technology
Current assignee: National Pingtung University of Science and Technology
Priority date: 2014-01-09
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2015-07-23
Anticipated expiration: 2034-11-07
Also published as: JP6018614B2; TW201526907A

Abstract

【課題】アンギオテンシンＩ転換酵素抑制率ＩＣ５０が０．８１μＭに達し、高血圧治療の医薬組成物に応用可能な短鎖活性ペプチドの提供。【解決手段】（１）スッポン卵白を緩衝剤に溶かし、（２）活性５０〜１００Ｕ／ｍｇのサーモリシンを用意し、酵素質量比１／５０〜１／９００でサーモリシンとスッポン卵白を混合し、ｐＨ６〜９及び温度５０〜７０℃の条件で１〜１０時間ほど加水分解反応させて、特定な配列からなるアミノ酸配列を含むスッポン卵白ペプチドを得て、（３）特定な配列からなるアミノ酸配列のスッポン卵白ペプチドを、酵素質量比１／２０〜１／２００でトリプシンと混合し、温度２０〜５０℃の条件で１０〜３０時間ほど加水分解反応させて得られる、ＩｌｅＶａｌＡｒｇからなる短鎖活性ペプチド。【選択図】図５

Description

本発明は、アンギオテンシンＩ転換酵素を抑制するペプチド、すなわち高血圧治療の医薬組成物を提供し、また、ペプチドの調製方法及びペプチドを用いた血圧降下薬の調製方法を提供する。

最近、生物活性ペプチドが研究者や製薬業界の注目を集めており、健康によいということで、潜在力をもつ薬物候補とされている。ペプチドが他の薬物候補に較べて優れている点は、その効力、選択性、特異性（所望の目標に比して等分子構造物はならない特異性結合に限る）にある。
このほか、ペプチドの分解生成物はアミノ酸であることから、その代謝物が引き起こす全身系統への毒性危険を低減させ（薬物どうしの相互作用の最小化）、わずかなペプチドの体内への蓄積を抑えることができる（ペプチド代謝物による併発症の危険の減少）。

高血圧は現代社会において普遍的な慢性病であり、既存の血圧降下剤としてはアンギオテンシンＩ転換酵素（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ）抑制剤が知られているが、これは不活性体のアンギオテンシンＩから、生理活性をもつアンギオテンシンIIへの転換を抑制する働きをして血管収縮による血圧上昇を緩和するというものである。
しかし、ｃａｐｔｏｐｒｉｌ、ｅｎａｌａｐｒｉｌ、ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌといった血圧降下剤は、せき、味覚障害、皮膚の発疹、不整脈という副作用をもたらす。

これまでの研究で、天然食材を用いた既存のアンギオテンシンＩ転換酵素抑制剤としては、卵白を用いた溶菌酵素であるリゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）の加水分解酵素がある。
しかし、この加水分解酵素は調製の過程において、ペプシン、キモトリプシン、トリプシンという三種類の酵素を用いる必要があり、８０℃及び９５℃で加熱及び酸化処理しなければならない。また、アンギオテンシンＩ転換酵素の活性を抑える特定のペプチドを得るには、ＨＰＬＣ純化を経なければならず、この過程がかなり複雑である。よって既存の加水分解酵素は調製方法の改善が待たれている。

以上を踏まえ、本発明は上述の加水分解酵素調製方法を改善して、スッポンの卵白からアンギオテンシンＩ転換酵素抑制剤を生成する方法を提供する。

本発明の目的は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含むペプチドを提供することにある。

本発明の別の目的として、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含み、アンギオテンシンＩ転換酵素を抑制するペプチドを提供することがある。

本発明の別の目的として、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンス、及び薬学的に許容可能なキャリアー剤を含む、高血圧治療用医薬組成物を提供することがある。

本発明の別の目的として、アンギオテンシンＩ転換酵素抑制剤を調製するペプチドで、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含む、スッポン卵白ペプチドを提供することがある。

本発明の別の目的として、次の各項を含むペプチド調製方法を提供することがある。
（１）スッポン卵白を緩衝剤に溶かしたスッポン卵白溶液を用意する。
（２）活性５０〜１００Ｕ／ｍｇのサーモリシンを用意し、酵素質量比１／５０〜１／９００でサーモリシンとスッポン卵白を混合し、ｐＨ６〜９及び温度５０〜７℃Ｃの条件で１〜１０時間ほど加水分解反応させて水溶液を得る。この水溶液はＳＥＱＩＤＮＯ．２に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを含む。
（３）酵素質量比１／２０〜１／２００でトリプシン及びＳＥＱＩＤＮＯ．２を示すスッポン卵白ペプチドを混合し、温度２０〜５０℃の条件で１０〜３０時間ほど加水分解反応させ、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを得る。

前記目的を達成するため、（１）の緩衝液は、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液、またはトリスヒドロキシメチルアミノメタン溶液とする。

前記目的を達成するため、（２）のサーモリシンは、酵素質量比１／２００でスッポン卵白と混合し、温度６０℃で３時間ほど、スッポン卵白を加水分解させる。

前記目的を達成するため、（３）のトリプシンは、酵素質量比１／５０で、トリプシン０．０２ｍｇとスッポン卵白を混合し、温度３７℃で１８時間ほどかけてＳＥＱＩＤＮＯ．２のアミノ酸を加水分解する。

前期目的を達成するため、（２）において、加水分解溶液を濃縮して濃縮液を得るのが望ましい。

サーモリシンとスッポン卵白溶液を混合して得た加水分解溶液は、別途濃縮し、溶液中のペプチド濃度を上げるのが望ましい。この加水分解溶液を濃縮するには、遠心濾過デバイス、冷風乾燥、冷凍乾燥などの方法があるが、この分野に通じていれば容易に実施できることから、ここでは詳述は避ける。

遠心濾過デバイスを使うのが望ましく、ペプチド回収率を上げるためには、フィルターメッシュ平均が３ｋＤａの遠心濾過デバイスを用い、温度４℃、１４０００×ｇで１０分間スピンして、この加水分解溶液を濃縮し、濃縮液を得る。

前記の方法（サーモリシンからトリプシンへの二段階加水分解）でＳＥＤＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを得る以外に、直接トリプシンを用いてスッポン卵白溶液を加水分解することによってＳＥＤＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを得ることができる。ここにおいて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果によると、サーモリシンからトリプシンへの二段階加水分解のほうが収率が高く、１ｇのスッポン卵白溶液から３．１４±０．１７ｍｇのＳＥＤＩＤＮＯ．１を調製することができるが、直接トリプシンを用いた場合の収率は１．３１±０．１２ｍｇにとどまる。ただし、後者は加水分解が一度だけなので、生産コストは低くなる。

直接トリプシンを用いてＳＥＤＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを得る調製方法を次に示す。
（１）スッポン卵白溶液を用意し、これを緩衝液に溶かし、ここにおいて緩衝液は、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液、またはトリスヒドロキシメチルアミノメタン溶液とする。
（２）トリプシンを用意し、酵素質量比１／１００でトリプシンとスッポン卵白を混合し、ｐＨ８．５及び温度３７℃の条件で２４時間ほど加水分解反応させて水溶液を得る。この水溶液はＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを含む。

ＩＷ−１１ペプチドがトリプシン分解を経てＩＶＲを形成するときのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ図。図１ａはＩＷ−１１分解前、図１ｂはＩＷ−１１分解後にＩＶＲとＤＷ−８という二種類のペプチド断片が形成されている。ＬＣ−ＭＳ図分析におけるトリプシン分解後のＩＶＲペプチド形成。ＭＳ／ＭＳシーケンス解析におけるＩＶＲペプチド形成の結果。ＩＶＲペプチドのアンギオテンシンＩ転換酵素抑制率ＩＣ_５０＝０．８１±０．０３ｕＭ、三重重複実験、統計は平均値±標準差。高血圧ラットの血圧値測定、図５ａ．収縮期血圧、図５ｂ．拡張期血圧。

本文書に用いる技術的、科学的用語は、別途定義されている場合を除き、その用語が属する領域で通常の技能を有する者が共有する認識に基づいて解釈する。

「治療」、「治療において」、及びこれらに類する言葉は、患者を煩わしている病状またはその病状によりもたらされるすべての症状を緩和、改善、減少または好転させる方法、及びその病状または現在の症状を予防する方法を指す。

「薬学的に許容可能」とは、物質または組成物が、調合される他の成分との間に相容性があり、患者に対し無害であることを指す。

本発明の組成物は、この技能に習熟した者が有している技術を用い、上述のラクトバチルス分離株と薬学的に許容可能な担体としてのキャリアー剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙａｃｃｅｐｔａｂｌｅｖｅｈｉｃｌｅ）を用いて、本発明組成物の剤形とする。
剤形としては、液剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、乳剤（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、懸濁剤（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）、散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、錠剤（ｔａｂｌｅｔ）、丸剤（ｐｉｌｌ）、ドロップ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅ）、咀嚼剤（ｃｈｅｗｉｎｇｇｕｍ）、カプセル剤（ｃａｐｓｕｌｅ）、及び類似の剤形または本発明に適する他の剤形が考えられるが、この限りではない。

そのうち、薬学的に許容可能なキャリアー剤は、溶媒（ｓｏｌｖｅｎｔ）、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、懸濁剤（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎａｇｅｎｔ）、分解剤（ｄｅｃｏｍｐｏｓｅｒ）、結着剤（ｂｉｎｄｉｎｇａｇｅｎｔ）、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）、安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇａｇｅｎｔ）、キレート剤（ｃｈｅｌａｔｉｎｇａｇｅｎｔ）、希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、ゲル化剤（ｇｅｌｌｉｎｇａｇｅｎｔ）、防腐剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）、潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）、表面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、及び類似のキャリアー剤または本発明に適する他のキャリアー剤から一つ以上を選択して用いる。

上述の組成物においては、製剤の領域で通常使用される溶解補助剤、緩衝剤、保存剤、着色剤、香料、風味剤を、一種類以上用いてもよい。

「薬学的に許容可能な賦形剤」とは、以下の実施例に示すごとく、この分野の技能に通じる者の認識に照らし、ＩＶＲペプチドの物理的化学的特性を維持してアミノ酸と相容性があり、生理的にも薬学的にも不活性の物質を指す。
「薬学的に許容可能な賦形剤」とは、重合物、樹脂、可塑剤、充填料、潤滑剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解共力剤、界面活性剤、防腐剤、甘味剤、調味剤、薬学クラスの染料または顏料、及び粘着剤のうち、一つ以上を指すが、この限りではない。

「医薬組成物」（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）とは、固体または液体の組成物で、その形式、濃度、純度が、患者（病気のヒトまたは動物）に投与するのに適合し、投与した後、生理的変化を誘発するものを指す。通常、医薬組成物は無菌及び／または非発熱性（ｎｏｎ−ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ）である。

「有効量」とは、所望の生物学的反応を起こさせるのに必要な量を指す。この分野における通常の技術者の認識に照らすと、複合物または生物活性剤の有効量は、エンドポイント、生物活性剤の体内送達システム、被包物の材質、目標となる組織などの要素によって異なる。

表題に掲げた方法により治療の対象となる「患者」、「個体」または「宿主」は、霊長類（ヒトなど）、牛、羊、馬、豚、げっ歯類動物、猫または犬を想定している。

以下に本発明の実施例を記述するが、これに限るものではない。本発明に用いる薬物、生物材料はいずれも市販されており、次に示す例はその代表例に過ぎない。

本発明における短鎖活性ペプチドＩＶＲ（ＩｌｅＶａｌＡｒｇ，ＳＥＱＩＤＮＯ．１）の調製方法は以下のとおりである。

（１）スッポン（Ｐｅｌｏｄｉｓｃｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）の卵の卵白溶液を用意し、緩衝液に溶かす。緩衝液は、炭酸水素アンモニウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液、またはトリスヒドロキシメチルアミノメタン溶液とする。５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム溶液を緩衝液が望ましく、１０ｍｇのスッポン卵白のパウダーを１ｍｌの５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液に溶かし、重量濃度１％のスッポン卵白溶液を得る。このとき、卵白濃度は１０ｍｇ／ｍｌである。

（２）活性５０〜１００Ｕ／ｍｇのサーモリシンを用意する。酵素質量比１／５０〜１／９００でサーモリシンとスッポン卵白を混合するが、このとき重量比１／２００が望ましい。ｐＨ６〜９（理想的にはｐＨ８．５）、温度５０〜７０℃（理想的には６０℃）の条件で、１〜１０時間（理想的には３時間）ほど加水分解反応させて加水分解溶液を得る。
この加水分解溶液は、アミノ末端からヒドロキシ末端までのシーケンスがＩｌｅＶａｌＡｒｇＡｓｐＰｒｏＡｓｎＧｌｙＭｅｔＧｌｙＡｌａＴｒｐ（ＩＶＲＤＰＮＧＭＧＡＷ，ＩＷ−１１，ＳＥＱＩＤＮＯ．２）であるスッポン卵白ペプチドを含む。前記（１）〜（２）の詳細手順は、中華民国専利申請案号第１０２１４０７７１号を参照のこと。

（３）シーケンスＩＶＲＤＰＮＧＭＧＡＷのペプチド１ｍｇを２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム（０．５ｍＬ）に溶かし、酵素質量比１／２０〜１／２００でトリプシンとスッポン卵白ペプチドを混合するが、このとき、重量比１／５０で０．０２ｍｇのトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）を加えるのが望ましい。温度２０〜５０℃（理想的には３７℃）の条件で、１０〜３０時間（理想的には１８時間）ほど加水分解反応させ、アミノ末端からヒドロキシ末端までのシーケンスがＩｌｅＶａｌＡｒｇ（ＩＶＲ，ＳＥＱＩＤＮＯ．１）のスッポン卵白ペプチドを得る。

前記の調製方法により得たＩＷ−１１ペプチドをＬＣ−ＭＳ分析にかけた結果、このスッポン卵白ペプチドのシーケンスを図１ａに示した。Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、充填粒径５μｍ）及びエレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、ＥＳＩ）による質量分析装置を用いており、ＩＷ−１１がトリプシンと加水分解されて、ＩＶＲとＤＷ−８の断片を形成しており（図１ｂ）、交換率＞９５％であった。
続くＩＶＲペプチドの質量分析では、Ｃ１８カラムと１０％アセトニトリル（ＡＣＮ）＋０．１％ギ酸（ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄ）で溶離して分析後、このペプチドは、電荷質量比３８６．５０ｍ／ｚ、分子量１２１５．４１Ｄａという結果を得た（図２）。ＭＳ／ＭＳシーケンス解析の結果、このペプチドのアミノ末端からヒドロキシ末端までのシーケンスはＩｌｅＶａｌＡｒｇ（ＩＶＲ，ＳＥＱＩＤＮＯ．１）（図３）、ＬＣ−ＭＳ分析の収率＞９５％、であった。

ＩＶＲペプチドのアンギオテンシンＩ転換酵素抑制活性についての実験。

アンギオテンシンＩ転換酵素の抑制活性の実験においては、実験群として、１０μｌのＩＶＲ溶液、２０μｌのアンギオテンシンＩ転換酵素（活性１００ｍＵ／ｍＬ）、３０μｌのＨＨＬ（Ｈｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、アンギオテンシンＩ転換酵素の基質、２．５ｍＭ）、及び３００ｍＭのＮａＣｌを含むホウ酸塩緩衝剤（ｂｏｒａｔｅｂｕｆｆｅｒ）（２００ｍＭ、ｐＨ８．３）１０μｌを混合して、７０μｌの実験群酵素反応液を作り、３７℃で３０分間放置した後、３０分間揺すり、７０μｌの１Ｍ塩酸を加えて反応を終止させ、ＨＬＬ加水分解生成物（馬尿酸、ｈｉｐｐｕｒｉｃａｃｉｄ、ＨＡ）の含有量をＨＰＬＣで計測する（実験群）。
並びに、前記と同条件だが、標的であるペプチドを加えない対照群を用意し、ＨＬＬ加水分解生成物（ｈｉｐｐｕｒｉｃａｃｉｄ、ＨＡ）の含有量を計測する（対照群）。

アンギオテンシンＩ転換酵素抑制率は、次の式による。
アンギオテンシンＩ転換酵素抑制率（％）＝［１−（ΔＡ実験群／ΔＡ対照群）］×１００

実験の結果、ＩＶＲペプチドによるアンギオテンシンＩ転換酵素抑制率は５４．１％であった。

ＩＶＲのアンギオテンシンＩ転換酵素特性率ＩＣ_５０をより深く理解するため、ＩＶＲペプチドを化学的に合成する。
スッポン卵白ペプチドのアンギオテンシンＩ転換酵素抑制効果を明らかにするため、濃度が異なる四組のＩＶＲ溶液（１．６、０．８、０．４、０．２μＭ）を用意し、アンギオテンシンＩ転換酵素抑制率について回帰曲線を計算してから、ＩＶＲ溶液のアンギオテンシンＩ転換酵素抑制率ＩＣ_５０を得ることとした。この実験は三重重複実験である（図４）。

実験の結果、ＩＶＲペプチドのアンギオテンシンＩ転換酵素抑制率ＩＣ_５０は０．８２μＭであった。過去の文書におけるペプチドのアンギオテンシンＩ転換酵素抑制効果を表１にまとめた。

高血圧ラット（ＳＨＲ）を用いてＩＶＲペプチドの動物実験を実施する。実験動物はプラスチックケージで飼育し、餌はＡＩＮ（ＡｍｅｒｉｃａＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ）基準による。飼育環境は、温度２４１ ℃、相対湿度６０３％の飼育室、明暗各１２時間、餌と水は自由摂取とした。
対照群（蒸留水）、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ群（２ｍｇ／ｋｇ、アンギオテンシンＩ転換酵素を抑制する血圧降下剤）、ＩＶＲ群（１ｍｇ／ｋｇ）の三群に分けて実験した。一群当たり十匹の十分に生長したラットを用意し、４週間飼育し、約１２〜１３週齢になってから実験を行った。テールカフ（ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ）法によるラットの収縮期血圧（ｓｙｓｔｏｌｉｃｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＳＢＰ）と拡張期血圧（ｄｉａｓｔｏｌｉｃｂｌｏｏｄｐｒｅｓｓｕｒｅ；ＤＢＰ）の測定に当たり、餌を与えてから第０、２、４、６、８、２４時間目の血圧を測定した。

実験の結果によると、収縮期血圧（図５ａ）は、ＩＶＲ群は第２、第４時間目に血圧が抑制されており、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ群に較べても効果があり、拡張期血圧（図５ｂ）は、ＩＶＲ群はＣａｐｔｏｐｒｉｌ群と較べてほぼ同程度の血圧降下作用を示した。

以上をまとめると、本発明におけるＩＶＲペプチド調製方法として望ましい実施例により、本発明のＩＶＲペプチドを取得でき、そのＩＶＲペプチドはＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含み、且つアンギオテンシンＩ転換酵素の活性を抑制する能力を具備する。

本発明のＩＶＲペプチドの抑制効果は、１１個のアミノ酸ペプチド（ＩＷ−１１）よりも優れ、また過去の論文に発表された他のペプチドよりも優れているとともに、既知の薬物Ｃａｐｔｏｐｒｉｌの動物実験により知られる抑制効果よりも優れている。

以上の効能、効果は、新規性、進歩性という特許発明の要件を満たしていると思われることから、ここに特許を出願する。

Claims

ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含むペプチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含み、アンギオテンシンＩ転換酵素を抑制するペプチド。
ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンス、及び薬学的に許容可能なキャリアー剤を含む、高血圧治療用医薬組成物。
アンギオテンシンＩ転換酵素抑制剤を調製するペプチドで、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含む、スッポン卵白ペプチド。
血圧降下剤を調製するのに用いるペプチドで、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含む、スッポン卵白ペプチド。
次の各項を含むペプチド調製方法。
（１）スッポン卵白を緩衝剤に溶かしたスッポン卵白溶液を用意する。
（２）活性５０〜１００Ｕ／ｍｇのサーモリシンを用意し、酵素質量比１／５０〜１／９００でサーモリシンとスッポン卵白を混合し、ｐＨ６〜９及び温度５０〜７０℃の条件で１〜１０時間ほど加水分解反応させて水溶液を得、この水溶液はＳＥＱＩＤＮＯ．２に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを含む。
（３）酵素質量比１／２０〜１／２００でトリプシン及びＳＥＱＩＤＮＯ．２を示すスッポン卵白ペプチドと混合し、温度２０〜５０℃の条件で１０〜３０時間ほど加水分解反応させ、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを得る。
請求項６記載のスッポン卵白ペプチド調製方法で、（１）の緩衝液は、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液、またはトリスヒドロキシメチルアミノメタン溶液である調製方法。
請求項６記載のスッポン卵白ペプチド調製方法で、（２）のサーモリシンは、酵素質量比１／２００でスッポン卵白と混合し、温度６０℃で３時間ほど、スッポン卵白を加水分解させる調製方法。
請求項６記載のスッポン卵白ペプチド調製方法で、（３）のトリプシンは、酵素質量比１／５０で、トリプシン０．０２ｍｇとスッポン卵白を混合し、温度３７℃で１８時間ほどかけてＳＥＱＩＤＮＯ．２のアミノ酸を加水分解する調製方法。
請求項６記載のスッポン卵白ペプチド調製方法で、（２）において、加水分解溶液を濃縮して濃縮液を得ることができる調製方法。
スッポン卵白ペプチド調製方法で、
（１）スッポン卵白溶液を用意し、これを緩衝液に溶かし、ここにおいて緩衝液は、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液、またはトリスヒドロキシメチルアミノメタン溶液とし、
（２）トリプシンを用意し、酵素質量比１／１００でトリプシンとスッポン卵白を混合し、ｐＨ８．５及び温度３７℃の条件で２４時間ほど加水分解反応させて水溶液を得、この水溶液がＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを含む調製方法。