JP2015131796A - アンギオテンシンi転換酵素抑制と血圧低下に用いる短鎖活性ペプチド - Google Patents
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Abstract
Description
このほか、ペプチドの分解生成物はアミノ酸であることから、その代謝物が引き起こす全身系統への毒性危険を低減させ(薬物どうしの相互作用の最小化)、わずかなペプチドの体内への蓄積を抑えることができる(ペプチド代謝物による併発症の危険の減少)。
しかし、captopril、enalapril、lisinoprilといった血圧降下剤は、せき、味覚障害、皮膚の発疹、不整脈という副作用をもたらす。
しかし、この加水分解酵素は調製の過程において、ペプシン、キモトリプシン、トリプシンという三種類の酵素を用いる必要があり、80℃及び95℃で加熱及び酸化処理しなければならない。また、アンギオテンシンI転換酵素の活性を抑える特定のペプチドを得るには、HPLC純化を経なければならず、この過程がかなり複雑である。よって既存の加水分解酵素は調製方法の改善が待たれている。
(1)スッポン卵白を緩衝剤に溶かしたスッポン卵白溶液を用意する。
(2)活性50〜100U/mgのサーモリシンを用意し、酵素質量比1/50〜1/900でサーモリシンとスッポン卵白を混合し、pH6〜9及び温度50〜7℃Cの条件で1〜10時間ほど加水分解反応させて水溶液を得る。この水溶液はSEQ ID NO.2に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを含む。
(3)酵素質量比1/20〜1/200でトリプシン及びSEQ ID NO.2を示すスッポン卵白ペプチドを混合し、温度20〜50℃の条件で10〜30時間ほど加水分解反応させ、SEQ ID NO.1に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを得る。
(1)スッポン卵白溶液を用意し、これを緩衝液に溶かし、ここにおいて緩衝液は、50mMの炭酸水素アンモニウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液、またはトリスヒドロキシメチルアミノメタン溶液とする。
(2)トリプシンを用意し、酵素質量比1/100でトリプシンとスッポン卵白を混合し、pH8.5及び温度37℃の条件で24時間ほど加水分解反応させて水溶液を得る。この水溶液はSEQ ID NO.1に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを含む。
剤形としては、液剤(solution)、乳剤(emulsion)、懸濁剤(suspension)、散剤(powder)、錠剤(tablet)、丸剤(pill)、ドロップ剤(lozenge)、トローチ剤(troche)、咀嚼剤(chewing gum)、カプセル剤(capsule)、及び類似の剤形または本発明に適する他の剤形が考えられるが、この限りではない。
「薬学的に許容可能な賦形剤」とは、重合物、樹脂、可塑剤、充填料、潤滑剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解共力剤、界面活性剤、防腐剤、甘味剤、調味剤、薬学クラスの染料または顏料、及び粘着剤のうち、一つ以上を指すが、この限りではない。
この加水分解溶液は、アミノ末端からヒドロキシ末端までのシーケンスがIle Val Arg Asp Pro Asn Gly Met Gly Ala Trp(IVRDPNGMGAW,IW−11,SEQ ID NO.2)であるスッポン卵白ペプチドを含む。前記(1)〜(2)の詳細手順は、中華民国専利申請案号第102140771号を参照のこと。
続くIVRペプチドの質量分析では、C18カラムと10%アセトニトリル(ACN)+0.1%ギ酸(formic acid)で溶離して分析後、このペプチドは、電荷質量比386.50m/z、分子量1215.41 Daという結果を得た(図2)。MS/MSシーケンス解析の結果、このペプチドのアミノ末端からヒドロキシ末端までのシーケンスはIle Val Arg(IVR,SEQ ID NO.1)(図3)、LC−MS分析の収率>95%、であった。
並びに、前記と同条件だが、標的であるペプチドを加えない対照群を用意し、HLL加水分解生成物(hippuric acid、HA)の含有量を計測する(対照群)。
アンギオテンシンI転換酵素抑制率(%)=[1−(ΔA実験群/ΔA対照群)]×100
スッポン卵白ペプチドのアンギオテンシンI転換酵素抑制効果を明らかにするため、濃度が異なる四組のIVR溶液(1.6、0.8、0.4、0.2μM)を用意し、アンギオテンシンI転換酵素抑制率について回帰曲線を計算してから、IVR溶液のアンギオテンシンI転換酵素抑制率IC50を得ることとした。この実験は三重重複実験である(図4)。
対照群(蒸留水)、Captopril群(2mg/kg、アンギオテンシンI転換酵素を抑制する血圧降下剤)、IVR群(1mg/kg)の三群に分けて実験した。一群当たり十匹の十分に生長したラットを用意し、4週間飼育し、約12〜13週齢になってから実験を行った。テールカフ(tail−cuff)法によるラットの収縮期血圧(systolic blood pressure;SBP)と拡張期血圧(diastolic blood pressure;DBP)の測定に当たり、餌を与えてから第0、2、4、6、8、24時間目の血圧を測定した。
Claims (11)
- SEQ ID NO.1に示すシーケンスを含むペプチド。
- SEQ ID NO.1に示すシーケンスを含み、アンギオテンシンI転換酵素を抑制するペプチド。
- SEQ ID NO.1に示すシーケンス、及び薬学的に許容可能なキャリアー剤を含む、高血圧治療用医薬組成物。
- アンギオテンシンI転換酵素抑制剤を調製するペプチドで、SEQ ID NO.1に示すシーケンスを含む、スッポン卵白ペプチド。
- 血圧降下剤を調製するのに用いるペプチドで、SEQ ID NO.1に示すシーケンスを含む、スッポン卵白ペプチド。
- 次の各項を含むペプチド調製方法。
(1)スッポン卵白を緩衝剤に溶かしたスッポン卵白溶液を用意する。
(2)活性50〜100U/mgのサーモリシンを用意し、酵素質量比1/50〜1/900でサーモリシンとスッポン卵白を混合し、pH6〜9及び温度50〜70℃の条件で1〜10時間ほど加水分解反応させて水溶液を得、この水溶液はSEQ ID NO.2に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを含む。
(3)酵素質量比1/20〜1/200でトリプシン及びSEQ ID NO.2を示すスッポン卵白ペプチドと混合し、温度20〜50℃の条件で10〜30時間ほど加水分解反応させ、SEQ ID NO.1に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを得る。 - 請求項6記載のスッポン卵白ペプチド調製方法で、(1)の緩衝液は、50 mMの炭酸水素アンモニウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液、またはトリスヒドロキシメチルアミノメタン溶液である調製方法。
- 請求項6記載のスッポン卵白ペプチド調製方法で、(2)のサーモリシンは、酵素質量比1/200でスッポン卵白と混合し、温度60℃で3時間ほど、スッポン卵白を加水分解させる調製方法。
- 請求項6記載のスッポン卵白ペプチド調製方法で、(3)のトリプシンは、酵素質量比1/50で、トリプシン0.02mgとスッポン卵白を混合し、温度37℃で18時間ほどかけてSEQ ID NO.2のアミノ酸を加水分解する調製方法。
- 請求項6記載のスッポン卵白ペプチド調製方法で、(2)において、加水分解溶液を濃縮して濃縮液を得ることができる調製方法。
- スッポン卵白ペプチド調製方法で、
(1)スッポン卵白溶液を用意し、これを緩衝液に溶かし、ここにおいて緩衝液は、50mMの炭酸水素アンモニウム溶液、炭酸水素ナトリウム溶液、またはトリスヒドロキシメチルアミノメタン溶液とし、
(2)トリプシンを用意し、酵素質量比1/100でトリプシンとスッポン卵白を混合し、pH8.5及び温度37℃の条件で24時間ほど加水分解反応させて水溶液を得、この水溶液がSEQ ID NO.1に示すシーケンスを含むスッポン卵白ペプチドを含む調製方法。
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